PRACTICA 4 Potencial de Lesion y Difusion

INSTITUTO POLITÉCNICONACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA PRÁCTICA 4 POTENCIAL DE DIFUSION Y POTENCIAL DE LESIÓN INTRODUCCIÓN La membrana plasmática contiene canales proteicos que permiten a los principales iones celulares (Na+, K+, Ca2+ y Cl-) cruzar la membrana a favor de su gradiente de concentración a distintas velocidades. Los gradientes de concentración de iones y el movimiento de estos a través de la membrana crean una diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior de la membrana celular. A esta diferencia de potencial se la denomina Potencial de Membrana. En la mayor parte de las células el valor de dicho potencial suele ser de unos -60 o -70 mV (el signo negativo indica que el interior de la célula presenta carga negativa respecto al exterior) y se debe únicamente a un ligero exceso de cationes, de tan solo ppm, en el exterior celular. El potencial depende de:  La permeabilidad de la membrana para cada ion. Donde la permeabilidad es la capacidad que tiene un material de permitirle a un flujo que lo atraviese sin alterar su estructura interna. Se afirma que un material es permeable si deja pasar a través de él una cantidad apreciable de fluido en un tiempo dado, e impermeable si la cantidad de fluido es despreciable.  Las concentraciones de los respectivos iones en LEC Y LIC Potencial de difusión Se denomina como la diferencia de potencial generada a través de una membrana cuando un soluto con carga eléctrica se difunde y se opone al paso de nuevos iones hacia el lado de menor concentración. Sólo puede generarse si la membrana es permeable a ese ion. Cuando el flujo del ion, dado por la diferencia de concentraciones llega a ser compensado por el flujo de repulsión, dado por la diferencia de potencial eléctrico, se dice entonces que el ion esta en equilibrio electroquímico a través de la membrana (Alva et al., 2010). Este potencial está definido por la ecuación de Nerst:

Donde E(ion)= potencial de equilibrio (volts)

R= constante de los gases T= temperatura absoluta F= constante de Faraday z= valencia del ion [ION]i = concentración del ion en el interior de la célula [ION]o = concentración del ion en el exterior de la célula Es decir, que el potencial de equilibrio de Nerst relaciona la diferencia de potencial a ambos lados de una membrana biológica en el equilibrio con las características relacionadas con los iones del medio externo e interno y de la propia membrana semipermeable. La ecuación de Nerst se emplea para predecir la dirección del flujo iónico en los siguientes casos: 1.- Cuando la diferencia de potencial medida a través de la membrana es igual a la calculada mediante la ecuación de Nerst determinando para un ion determinado. En esta situación el ion se encuentra en equilibrio electroquímico y no habrá flujo neto del mismo a través de la membrana. 2.- Cuando el potencial de eléctrico medido es del mismo signo que el calculado por la ecuación de Nerst para un ion determinado, pero de mayor valor, la fuerza eléctrica es superior causada por el gradiente de concentración, por lo que habrá movimiento neto de dicho ion en la dirección determinada por la fuerza eléctrica. 3.- Cuando la diferencia de potencial eléctrico medida es del mismo signo, pero de menor cuantidad, que la calculada por la ecuación de Nerst , la fuerza debida al gradiente de concentración es superior a la eléctrica, y el movimiento neto de ion tiende a producirse en la dirección determinada por la diferencia de concentración. 4.- Cuando la diferencia de potencial eléctrico medida es de signo opuesto al predicho por la ecuación de Nerst, tanto la fuerza eléctrica como el gradiente de concentración se encuentran orientados en el mismo sentido y consiguiente el ion no se encuentra en equilibrio, por lo que tendría a fluir en dirección determinada por ambas fuerzas. Julius Bernstein fue el primero, en 1902, en proponer una hipótesis satisfactoria para explicar el origen del potencial de membrana en reposo en el nervio y en las fibras musculares. Mediante análisis químico determino que el interior es rico en K + y contiene poco Na+ y Cl-. Además comprobó que en el interior de la célula hay aniones a los que la membrana en reposo no es permeable; basándose en esos datos, Bernstein postulo la siguiente hipótesis: “El voltaje de transmembrana es consecuencia de una desigual distribución de iones K +, como puede predecirse mediante la ecuación de Nerst” (Martin, 2006) Bernstein cortó fibras musculares de un músculo de rana e insertó un electrodo en el área cortada, haciendo contacto eficaz con el líquido interno de las fibras musculares, pudiendo además modificar el liquido externo del musculo. Al registro que obtuvo se le llamo potencial de lesión. El potencial de lesión es el potencial desarrollado entre las partes lesionada y no lesionada de un nervio, debido a la exposición de la superficie interna con carga negativa de la membrana polarizada en el lugar de la lesión. En los tejidos excitables, la lesión produce despolarización en la zona lesionada (potencial de lesión), lo que origina un flujo de corriente

eléctrica entre ambas zonas (corriente de lesión). En la fibra muscular esquelética, la despolarización causada por una lesión es un proceso irreversible que se propaga gradualmente y despolariza finalmente a toda la célula. Asimismo, el potencial de lesión se aproxima al potencial transmembranal debido a que la superficie lesionada esta casi en el potencial del interior de la célula (Rothstein et al., 2005). Para la determinación del potencial de lesión, se utiliza musculo gastrocnemio de rana, por su función en la transmisión de impulsos nerviosos para la contracción del mismo. Los potenciales de electrodo se definen como potenciales de celda para una celda que consiste en el electrodo en cuestión que actúa como cátodo y el electrodo estándar de hidrogeno que lo hace como ánodo, el potencial de electrodo es de hecho el potencial de una celda electroquímica que implica un electrodo de referencia cuidadosamente definido. (Wilches, 2007). La ecuación de Goldman-Hodkin-Katz predice el potencial de membrana para múltiples iones. Esta se utiliza para calcular el potencial de membrana en reposo resultante de la contribución de todos los iones que pueden atravesar la membrana: Esta ecuación incluye los valores de permeabilidad de la membrana porque la permeabilidad de un ion influye en su contribución al potencial de membrana. Si la membrana en impermeable a un ion, ese ion no afectara el potencial de membrana. La contribución de cada ion al potencial de membrana es proporcional a su capacidad para atravesar la membrana. La ecuación de Goldman-Hodking-Katz:

Em=Potencial de membrana en reposo. R= Constante de los gases T=Temperatura absoluta F=Constante de Faraday P= Permeabilidad relativa de la membrana al ion indicado con el subíndice. [ion in], [ion out] = Concentraciones del ion dentro y fuera de la célula. Esta ecuación se puede simplificar en estas palabras: el potencial de membrana en reposo está determinado por las contribuciones combinadas del producto (gradiente de concentración) x (permeabilidad de la membrana) para cada ion. Si la membrana no es permeable aun ion el término de permeabilidad de este ion será cero y el ion abandonaría la ecuación. La ecuación de Goldman predice los potenciales de membrana sobre la base de concentraciones iónicas y permeabilidades de membrana dadas y explica porque la ligera permeabilidad de la célula al Na+ hace que el potencial de membrana en reposo sea más positivo que el E determinado con la ecuación de Nerst. La ecuación de Goldman también se puede utilizar para predecir lo que sucede con el potencial de membrana cuando cambian las concentraciones iónicas o las permeabilidades de las membranas. (Silverthorn, 2009)

Para obtener el potencial de difusión se utiliza la cascara de huevo que posee dos membranas: externa e interna. La membrana interna es de menor grosor que la externa (22mm), ya que su composición es de fibras proteicas más finas y de superficie homogénea y lisa teniendo cierta permeabilidad.

Se utilizo la membrana testácea interna de huevo ya que esta es altamente permeable al ion potasio; en esta se llevo a cabo un potencial de difusión generado a través de la membrana cuando un ion se difunde debido al gradiente de concentración.

OBJETIVOS -

Demostrar que la difusión de un electrolito a través de una membrana artificial con permeabilidad selectiva genera una diferencia de potencial (Potencial de difusión) Determinar el potencial de lesión de un musculo esquelético de rana y establecer si existe una relación entre la diferencia de potencial obtenida con las diferentes concentraciones de potasio y el predicho por la ecuación de Nernst.

FUNDAMENTOS Se utilizo la membrana testácea interna de huevo ya que es permeable al ion potasio. Donde se lleva a cabo un potencial de difusión generado a través de la membrana cuando un soluto con carga (ion) difunde debido al gradiente de concentración, es decir se debe a la difusión de los iones y sólo puede generarse por que la membrana testácea de huevo es permeable a ese ion. Se utilizo el nervio ciático de rana debido a que se hacen estudios en células musculares o nerviosas, y estas células muestran una notable especialización para este tipo de actividades. También, la rana suele utilizarse por la facilidad de disponer de estos animales, asi como por presentar muchos aspectos de su anatomía interna claramente visibles. Se utilizo KCl y K₂SO₄ ya que tanto el ion Cl- como el SO₂-- son impermeables a las membranas del huevo y del musculo gastrocnemio respectivamente.

DESARROLLO Metodología Resultados Concentra ción de K+ intracelula r (mM)

Concentra ción de K+ extracelul ar (mM)

Potencial del ion K+ teórico (mV)

Potencial Relación del ion K+ experimen C ext/C int tal (mV)

400

1

-153.41

-174.4

400 2.5 -129.95 Probar que sucede con la lectura del multimetro si se levanta el cascaron de la solución.

-159.7

Log de C ext/C int

Repetir elsolución paso anterior con K₂SO₄ Sustituir por solución soluciónyde K₂SO₄ en ordende 0.025M leer la diferencia creciente de concentraciones. potencial.

400

5

-111.22

-128.1

400

10

-94.45

-119.7

400

20

-76.70

-113.7

400

50

-53.24

-88.7

400

100

-35.49

-76.2

400

400

0

1

0

Tabla 1.-Efecto de las concentraciones milimolares (mM) del cloruro de potasio (KCl) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de difusión) en un huevo de gallina, se observan valores teóricos y experimentales de la diferencia de potencial (E°) en milivolts (mV).

POTENCIAL DE DIFUSION 0 1

2.5

5

10

20

50 100 400

-50 POTENCIAL DE DIFUSION Ek (mV)

Potencial de difusion experimental

-100 -150 -200 [¨K+]

Figura 1. Efecto de las concentraciones milimolares (mM) del cloruro de potasio (KCl) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de difusión) en un huevo de gallina. En el eje X se tiene la concentración de K+ extracelular (mM), en el eje Y la diferencia de potenciales en milivolts de color azul datos teóricos y en color rojo datos experimentales.

Concentra ción de K+ intracelul ar (mM)

Concentra ción de K+ extracelul ar (mM)

Poten cial del ion K+ teóric o (mV)

Potencial Relación Log de del ion C ext/C int C ext/C int K+ experime ntal (mV)

123

10

-64.26

-83.5

123

20

-46.51

-74.5

123

50

-23.04

-41.8

123

100

-5.30

-41.7

123

200

12.44

-31.4

123

Ringer188

Tabla 2. - Efecto de las concentraciones milimolares (mM) de sulfato de potasio (K₂SO₄) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de lesión) en musculo gastrocnemio de rana.

Potencial de lesión 20 0 -20 Ek+ (mV)

10

20

50

-40

100

200

POTENCIAL DE LESION TEORICO POTENCIAL DE LESION EXPERIMENTAL

-60 -80 -100 [K] LEC

Figura 2. Efecto de las concentraciones milimolares (mM) del sulfato de potasio (K2SO4) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de lesión) en musculo gastrocnemio de rana. (E°) representa la diferencia de potencial de membrana en milivolts.

DISCUSIÓN El potencial de difusión, debido a la composición de la membrana del huevo, al ser sumamente permeable al ion K+, genera una difusión a favor de su gradiente de concentración, esto se debe a que el ion K+ esta presente en gran concentración dentro de la célula y tiende a difundirse al exterior generando un equilibrio químico, esto se puede observar teórico y experimentalmente ya que la concentración extracelular se vuelve menos negativa por el ligero exceso de K+ y la intracelular se vuelve más negativa por la ligera deficiencia del K+. La difusión de los iones K+ fuera de la membrana del huevo origina una diferencia de potencial eléctrico, positiva afuera y negativa dentro. Mientras más K+ se difunda a favor de su gradiente de concentración mayor será la diferencia de potencial, a concentraciones milimolares pequeñas

de KCl extraceluar se genera mayor diferencia de potencial ya que se alcanzara más rápido el equilibrio disminuyendo la diferencia de potencial. Sin embargo llegara un punto cuando la diferencia de potencial será 0 la fuerza eléctrica que arrastra al K+ al interior de la célula es igual a la fuerza química que arrastra los iones de K+ fuera de la célula y este potencial recibe el nombre de potencial de equilibrio y este equilibrio se calcula mediante la ecuación de Nerst. En la figura 2 se observa el efecto de las concentraciones extracelular e intracelular sobre la diferencia de potencial, al comparar los resultados teóricos con los prácticos se observa que difieren mayormente en el dato 5, y al observar la ecuación de la recta difieren mucho, esto lo podemos a atribuir que al hacer el experimento no se contaba con la misma temperatura ya que nos encontrábamos aproximadamente a 24 °C este factor afectaría directamente a la pendiente de la recta, también otro factor influye a la pendiente es que la permeabilidad del huevo no es infinita. En la ordenada también se observa una gran diferencia los factores que pueden influir en esta son que el huevo a pesar de enjuagarlo muy bien quedan proteínas cargadas en la membrana, estas cargas afectan directamente la diferencia de potencial, otro factor influyente es el potencial de electrodo. En el potencial de lesión al musculo gastrocnemio de rana, contiene iones K+, Na+ y Cl- en su interior por la solución de LIC estos contribuirán al potencial de membrana pero en cuanto mayor es la concentración de una clase de ion en particular y mayor la permeabilidad de la membrana a este ion tanto mayor es su importancia en la determinación del potencial en este caso es al ion K+. Utilizamos soluciones extracelulares de K 2SO4 y el ion SO42- es un anión prácticamente impermeable, solo se considera la concentración del K+ extracelular, sin embargo, al utilizar la solución de Ringer extracelular la cual contiene iones K+, Na+ y Cl-el potencial no puede considerarse solo al ion K+ y esto se obtiene por la ecuación de Goldman. Sin embargo, al tener solo concentraciones del ion K+ extracelulares, y la membrana es más permeable a este que a los otros iones podría decirse que bajo estas condiciones se espera obtener el potencial de membrana en reposo. En la grafica podemos observar que los valores experimentales y los valores teóricos difieren esto se puede atribuir a la temperatura ya que no se trabajo a la temperatura absoluta, que el musculo gastrocnemio contiene células de tejido conectivo, vasos sanguíneos y nervios, si al manipular el musculo lo rompemos puede quedar expuesto el LIC y el LEC combinándose ambos estos factores afectaran directamente el potencial de lesión y con esto la pendiente de nuestra grafica. Conclusiones -

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Determinamos el efecto del cambio de gradiente de concentración del ion [K+] sobre el potencial de difusión de la membrana testácea de huevo de gallina. Comprobamos que la membrana testácea tiene una permeabilidad selectiva al ion K+. Observamos que entre mayor sea la concentración extracelular del ion K+ de la membrana testácea, la diferencia de potencial se hará menos negativa hasta que el ion K+ llegue a su potencial de equilibrio. Determinamos el efecto del cambio del gradiente de concentración el ion [K+] sobre el potencial de lesión del musculo gastrocnemio de rana. Comprobamos que la membrana del musculo gastrocnemio de rana permeabilidad al los iones K+.

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La diferencia de potencial de la membrana interna y externa del musculo gastrocnemio de rana por su potencial de lesión predice el potencial de membrana para múltiples iones que atraviesan la membrana.

Bibliografía 

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