Practica 3. Produccion de Tetraciclina

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P r á c t i c a N o . 3 . Pr P r o d u c c i ó n d e t e t r a c i c l i n a e n cu cu l t i v o l í q u i d o p o r S t r e p t o m y c e s a u r e o f a c i en e n s   e n m e d i o si si n t é t i c o . El a b o r ó : I B T . Ka Ka r e n G i s e l a Mo Mo r e n o G u e r r e r o

1. Introducción

Desde tiempos remotos el hombre ha sacado provecho de los microorganismos, utilizándolos en su beneficio para producir alimentos y bebidas principalmente. Sin embargo, desde el descubrimiento de la penicilina en 1929, también se han utilizado y cada vez en mayor medida para producir antibióticos. Los antibióticos son sustancias producidas naturalmente por los microorganismos pero que no son esenciales para su crecimiento. Su función en la naturaleza es la de brindar al microorganismo productor una ventaja competitiva sobre otra u otras poblaciones microbianas al contar con un “arma” que las elimine del medio por el que compiten. Su uso terapéutico y medicinal en seres humanos, plantas y animales es destruir o detener el crecimiento de microorganismos infecciosos que afecten al organismo vivo. Fue la imperiosa necesidad de antibióticos durante la Primera Guerra Mundial lo que llevó primero a la búsqueda de métodos más eficaces para la producción de penicilina, el primer antibiótico usado masivamente y descubierto por Alexander Flemming en 1929. Posteriormente, la investigación se encaminó también a la búsqueda de nuevos antibióticos, siendo la mayoría obtenidos de bacterias aisladas del suelo, principalmente de las pertenecientes al género streptomyces . Así por ejemplo, tenemos a la actinomicina, descubierta por Waksman Waksman en 1940, la estreptomicina, estreptomicina, estreptotricina, tetraciclina y clortetraciclina, por mencionar solo algunos de los l os más conocidos. Las tetraciclinas son un grupo de antibióticos de amplio espectro que se pueden obtener por síntesis química o bien por síntesis microbiana a partir de cultivos de Streptomyces aureofaciens , aunque se prefiere ésta última sobre la síntesis química por su bajo costo. Básicamente, Básicamente, la estructura estructura química de los tres derivados de tetraciclina es un sistema de anillos de naftaceno al que se añaden diferentes átomos constituyentes. Así, la clortetraciclina tiene un átomo de cloro mientras que la oxitetraciclina un grupo oxhidrilo. Evaluación de la actividad actividad de un antibiótico. antibiótico. El método más utilizado para evaluar la actividad de un antibiótico o bien la sensibilidad de uno o más microorganismos a éste es el antibiograma. Existen dos métodos comunes para realizar un antibiograma: por difusión en placa y por dilución en caldo. El primer método, también conocido como como método Kirby-Bauer, Kirby-Bauer, consiste en sembrar sembrar sobre una placa de agar agar al microorganismo microorganismo de prueba y exponerlo a la acción del del o los antibióticos a probar, que se se colocan sobre el medio sólido en discos de papel filtro o cilindros metálicos para localizar su difusión. Al cabo de cierto periodo de incubación (comúnmente 24 horas) aparecerá un halo de inhibición alrededor del disco del o los antibióticos que indica la resistencia del microorganismo. En el segundo, en tubos con caldo de cultivo se colocan distintas diluciones del antibiótico de concentración conocida. Los tubos se inoculan con el microorganismo de prueba y al término del periodo de incubación se descartaran aquellos tubos en los que haya turbiedad en el medio debida al crecimiento microbiano. El tubo que contenga ausencia de microorganismos microorganismos contendrá la concentración adecuada del antibiótico.

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2. Objetivos General •

Utilizar un cultivo del actinomiceto Streptomyces aureofaciens para producir el antibiótico tetraciclina por fermentación líquida en un medio sintético.

Particulares •

Evaluar la diferencia en la producción de la tetraciclina al utilizar dos medios de cultivo sintéticos de diferente composición.

•

Evaluar la actividad antimicrobiana y el rendimiento en la producción del antibiótico en el medio de cultivo contra un estándar comercial de tetraciclina realizando un antibiograma.

3. Desarrollo experimental

1.1.

Materiales 

Cepas microbiológicas Streptomyces aureofaciens  Escherichia coli  Staphylococcus aureus 

Para la preparación de la cepa de Streptomyces  Reactivos 

Glucosa Peptona KH2PO4 MgSO4*7H2O Agar-agar Agua destilada Materiales 

1 caja Petri de 100x15 mm 1 matraz Erlenmeyer 250 mL 1 espátula de acero inoxidable 1 probeta graduada de 100 mL 1 vaso de precipitados de 100 mL

Charolas de polipropileno o aluminio para pesar Encendedor Equipo 

Autoclave Balanza analítica Campana de flujo laminar Incubadora a T=30ºC Lámparas de alcohol

Para la preparación del inóculo Reactivos 

NaCl Sucrosa Harina de soya Citrato de sodio Ácido acético (NH4)2SO4

MgSO4*7H2O KH2PO4 K2HPO4 CaCO3 MnSO4*4H2O ZnSO4*7H2O K2Cr2O7

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Agua destilada Materiales 

3 tubos de ensaye roscados de 16x150 mm 1 matraz Erlenmeyer de 125 mL 3 Pipetas graduadas de 10 mL 1 probeta graduada de 100 mL 1 vaso de precipitados de 100 mL 1 espátula de acero inoxidable Algodón

Charolas de polipropileno o aluminio para pesar Encendedor 1 clip Propipeta Equipo 

Autoclave Balanza analítica Campana de flujo laminar Incubadora con agitación reciprocante o rotatoria a T=30ºC Lámparas de alcohol

Para la fermentación líquida Reactivos 

Sucrosa Ácido acético Ácido cítrico Citrato de sodio*5H2O (NH4)2SO4 MgSO4*7H2O KH2PO4 K2HPO4 CaCO3 MnSO4*4H2O ZnSO4*7H2O K2Cr2O7 Agua destilada Materiales 

1 matraz Erlenmeyer de 125 mL

1 probeta graduada de 50 mL 1 pipeta de 5 mL 1 propipeta 1 espátula de acero inoxidable Algodón Charolas de polipropileno o aluminio para pesar Encendedor 1 clip Equipo 

Autoclave Balanza analítica Campana de flujo laminar Incubadora con agitación rotatoria a T=30ºC y 200 rpm Lámparas de alcohol

Para el antibiograma Reactivos 

Medio para antibióticos No.1 y 2 o Agar Mueller-Hinton Caldo Luria o Caldo nutritivo Estándar de tetraciclina comercial Agua destilada Materiales 

Embudo Buchner de ∅ 4.5 cm Matraz Kitazato de 125 mL Desecador Papel filtro Whatman No. 4 de ∅ 4.5 cm 5 tubos Eppendorf 

Puntas azules estériles 1 hisopo 6 círculos de papel filtro de penicilindros 1 tapa de caja Petri Pinzas de disección Encendedor Plumón indeleble Vernier o regla milimétrica Equipo 

Balanza analítica Bomba de vacío

∅

4.5 cm o 6

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Campana de flujo laminar Estufa de secado Micropipeta de volumen variable de 1001000 µL

1.2.

Incubadora Lámparas de alcohol

Métodos  1.1.1.

Preparación de la cepa para iniciar el cultivo

Preparar las cajas Petri de 15 x 100 mm conteniendo cada una por lo menos 30 mL de Agar Waksman, de acuerdo con la siguiente formulación: Componente Glucosa Peptona KH2PO4 MgSO4*7H2O Agar agar

g/L 10.0 5.0 1.0 0.5 20

Inocular las cajas Petri con suspensión de esporas o micelio de Streptomyces aureofaciens . Incubar a 30ºC por un periodo de 10 días para favorecer la esporulación. 1.1.2.

P r e p a r a ci ó n d e l i n ó c u l o p a r a l a f e r m e n t a c i ó n

Preparar el medio para el inóculo de acuerdo con la siguiente formulación: Componente Cantidad/L Sucrosa 30.0 g Harina de soya 5.0 g Citrato de sodio (Na3C6H5O7*5H2O) 1.0 g (NH4)2SO4 3.3 g MgSO4*7H2O 0.25 g KH2PO4 0.10 g K2HPO4 0.10 g CaCO3 1.00 g MnSO4*4H2O 0.01 g ZnSO4*7H2O 0.04 g K2Cr2O7 0.016 mg Ácido acético (CH3COOH) 0.40 mL Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Inocular con suspensión de esporas o suspensión miceliar (hechas con solución salina) de Streptomyces aureofaciens  obtenidos de la cepa inoculada en el agar Waksman. Incubar a 30ºC de 48 a 72 hr con agitación reciprocante con 3 ½ in a 97 ciclos/min o agitación rotatoria a 200 rpm. 1.1.3.

Fe r m e n t a c i ó n l í q u i d a

Preparar el medio A o B, según la siguiente formulación:

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Componente Sucrosa Ácido cítrico (H3C6H5O7*H2O Citrato de sodio (Na3C6H5O7*5H2O) (NH4)2SO4 MgSO4*7H2O KH2PO4 K2HPO4 CaCO3 Ácido acético (CH3COOH) MnSO4*4H2O ZnSO4*7H2O K2Cr2O7

Medio A

Medio B

Cantidad/L 30 g

Cantidad/L 40 g

--------

12.8 g

2.5 g

--------

3.3 g 0.25 g 0.10 g 0.10 g 1.0 g 0.40 g 0.01g 0.04 g 0.016 mg

6.0 g 0.25 g 0.15 g -------11.0 g -------0.01 g 0.04 g 0.016 mg

Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Inocular el medio para fermentación con 2.5 mL del inóculo. Incubar a 30ºC durante 4 a 6 días con agitación rotatoria a 200 rpm. 1.1.4.

Antibiograma para la evaluación de la actividad antimicrobiana y c o n c e n t r a c i ó n d e l a t e t r a c i cl i n a e n l o s m e d i o s d e c u l t i v o A y B .

a) Preparación de las placas para el antibiograma. Preparar 1 caja Petri con 20 mL de medio para antibióticos 1 y 2 o agar Mueller-Hinton. Paralelamente, preparar un cultivo de 24 horas de Escherichia coli  en caldo Luria o Staphylococcus aureus  en caldo nutritivo. Empapar un hisopo estéril en la suspensión del cultivo cuidando de retirar el exceso presionando y rodando el hisopo sobre las paredes del tubo antes de retirarlo. Extender de forma homogénea (ver el esquema) en tres direcciones sobre toda la superficie de la placa de agar, cuidando de no dejar sitios sin cubrir. Incubar en posición invertida a 37ºC durante 24 horas una vez que han sido colocados los discos con el antibiótico. 1

2

3

Fi g u r a 1 . Es q u e m a p a r a l a si e m b r a d e l i n ó c u l o e n l a s p l a c a s p a r a a n t i b i o g r a m a .

b) Determinación de la biomasa (en peso seco) y clarificación del medio de cultivo Retirar el matraz de fermentación de la incubadora y filtrar el medio al vacío a través de un disco de papel filtro Whatman No. 4 (previamente tarado a peso constante) para retener la

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biomasa. NO DESECHAR EL MEDIO FILTRADO. Posteriormente, colocar el papel filtro en un horno de secado a 60ºC durante 1 hora. Dejar enfriar en un desecador y determinar la biomasa producida en peso seco. c) Antibiograma para determinar la actividad y concentración de la tetraciclina Preparar una solución madre de 1000 µg/mL a partir de un estándar comercial de tetraciclina. De la solución madre preparar las siguientes diluciones: 125 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL y 750 µg/mL. Colocar sobre las placas de agar Mueller-Hinton o medio para antibióticos 1 y 2 previamente inoculadas con el microorganismo de prueba cinco círculos de papel filtro como lo muestra el esquema, previamente embebidos en 200 µL de cada una de las diluciones del estándar de tetraciclina, incluida la dilución madre. En el centro de la caja Petri colocar un sexto círculo de papel filtro embebido en 200 µL del medio de cultivo filtrado. Marcar sobre la tapa de la caja las concentraciones correspondientes de tetraciclina. Incubar las cajas en posición invertida a 37ºC durante 24 horas.

250 µg/mL

125 µg/mL

500 µg/mL Medio de cultivo

1000 µg/mL

750 µg/mL

Figura 2. Esquema para la colocación de los círculos de papel filtro en la caja Petri. Al término de la incubación, medir el diámetro de los halos de inhibición en los estándares de tetraciclina y el medio de cultivo. Para calcular la concentración del antibiótico en el medio de cultivo, graficar el logaritmo de la concentración de las diluciones de tetraciclina contra el diámetro del halo de inhibición. Interpolar en el gráfico el diámetro del halo en el papel embebido con el medio de cultivo para conocer la concentración de antibiótico en el mismo. La ausencia de halo de inhibición en el sexto círculo indicará que no hubo producción de antibiótico. 4 . Resultados

Reportar los periodos reales y temperaturas de incubación durante la fermentación y en el ensayo del antibiograma. Reportar la biomasa producida en el medio de cultivo de fermentación en peso seco. Esquematizar o fotografiar los resultados de los antibiogramas para cada antibiótico obtenido con los medios A y B.

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Trazar la gráfica de ∅ del halo de inhibición vs. Log [antibiótico] y reportar la concentración para el antibiótico en los medios A y B. Reportar el diámetro del halo de inhibición para los antibióticos obtenidos en los medios A y B. 5 . A n á l i si s d e r e s u l t a d o s

Hacer un comparativo de las diferencias obtenidas en cantidad de biomasa, actividad y producción de antibiótico entre los medios A y B, sustentando de manera concisa y comprobable las respuestas con la bibliografía consultada. Explicar si las diferencias obtenidas se deben a solo unos constituyentes del medio de cultivo en particular o toda la formulación en conjunto. Explicar también el efecto de los componentes del medio de cultivo sobre la producción del antibiótico. Explicar también si el antibiótico obtenido es tetraciclina, oxitetraciclina o clortetraciclina y por qué. 6 . Conclusiones

Concluya de manera clara y concisa sobre el cumplimiento de los objetivos. Incluya también perspectivas o puntos de vista. 7 . Cuestionario

1. Describe las características del genero streptomyces . 2. ¿Qué otro microorganismo es utilizado para producir tetraciclina además del Streptomyces aureofaciens ? 3. Esquematiza la molécula base de la tetraciclina con los diferentes átomos constituyentes para obtener los derivados oxitetraciclina y clortetraciclina. 4. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la tetraciclina? 5. ¿A que se refiere el término “espectro” de un antibiótico? 6. ¿Qué otros géneros microbianos son productores de sustancias antibióticas? 7. ¿Cuál es la diferencia entre un agente bacteriostático, bacteriolítico y bactericida? 8. ¿Cuáles son los metabolitos primarios y secundarios? ¿A cuál de ellos pertenece la tetraciclina? 9. ¿Qué son un medio sintético y uno no sintético? 10. Describe al menos un método empleado para la purificación de antibióticos. 11. ¿Por qué otro método, aparte de la fermentación líquida, es posible producir antibióticos? Descríbelo.

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12. Explica al menos un método para la obtención y selección de cepas mutantes sobreproductoras de antibióticos. 13. Menciona al menos tres microorganismos comúnmente empleados en los antibiogramas. Menciona también las características del Agar Mueller-Hinton, que lo hacen un medio ideal para las pruebas de sensibilidad a antibióticos. 14. ¿Cuáles son las otras aplicaciones de los antibiogramas, además de utilizarse para cuantificar un antibiótico? 15. Describe el procedimiento que comúnmente se utiliza para aislar nuevas cepas productoras de antibióticos.

8 . Referencias bibliográficas 

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Brock D.T., Madigan T.M. Microbiología. 6a ed. Prentice Hall. México 1993 Darken, Berenson, Shirk, Sjolander. Production of tetracycline by Streptomyces  aureofaciens in synthetic media. Applied Microbiology. 1960 January; 8(1): 46–51 Scragg, A. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas Biológicos en Procesos Tecnológicos. Ed. Limusa. México 1992 ENCB-IPN. Microbiología Práctica. 2ª ed. México 1998 ENCB-IPN. Manual de Prácticas de Bacteriología Médica. México 2003