Practica 2 USO de Micropipetas

MANEJO DE MICROPIPETAS MICROPIPETAS INTRODUCCION. La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas. Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plástico, que habitualmente son estériles. Existen varios tipos de puntas para los diferentes volúmenes de pipeteo. Identifique las Caracteristicas:

1. Botón pulsador 2. Tornillo del botón pulsador 3. Rueda dentada de graduación del volumen. 4. Cono de la pipeta. 5. Expulsor de punta. 6. Puntas o “tips” descartables 7. rack para tips

1. Graduación del volumen Para graduar el volumen de la micropipeta identifique la rueda, control y/o tornillo de graduación . 

Seleccione la micropipeta y las puntas que va a utilizar teniendo en cuenta el volumen de solución a pipetear:

Tipo de Micropipeta Volumen 0,5 μl - 10 μl P10 P20 0,5 μl - 20 μl P100 10 μl -100 μl  20 μl -200 μl  P200 100 μl -1000 μl P1000

Tipo de punta Amarillas o blancas Amarillas o blancas Amarillas Amarillas Azules o blancas

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Seleccione el volumen por medio de la rueda y/o tornillo de graduación, de forma firme pero suavemente de vuelta al tornillo mientras observa el cambio de la numeración del display. Teniendo cuidado de exceder los límites de la micropipeta.

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Ponga la punta correspondiente, presione la punta firmemente usando un movimiento de torsión ligero y tres golpes sobre el rack.

2. Operación del Equipo: Aspiración dispensación

y Figura

a. Presione el botón superior hasta el primer tope positivo,

b. Sostenga la pipeta verticalmente, sumerja la punta en el líquido. La profundidad a la que la punta se sumerge en la muestra depende del modelo; en general menos de 6 mm

c.

Suelte el botón despacio y fácilmente para aspirar, .Espere unos segundos y entonces retire la punta del líquido.

d. Ubique la punta de la pipeta en la pared interior del vaso en un ángulo de 10 a 40 grados. Presione el botón suavemente hasta el primer tope.. Espere unos segundo.

e. Presione el botón hasta el segundo tope para expeler cualquier remanente de líquido. Mantenga el botón presionado hasta el final, remueva la pipeta por arrastre sobre la superficie del vaso.

f. Libere el botón

g. Expulse la punta presionando el botón de eyección

Es necesario el cambio de la punta si el líquido es diferente al ya muestreado o si el volumen establecido es cambiado. Cuando se pipetean líquidos que tienen una viscosidad y densidad diferentes a la del agua, por ejemplo solventes orgánicos, una película de líquido se forma sobre las paredes internas de la punta. Esta película puede crear error. Desde que la película remanentes sea constante en sucesivas pipeteadas con la misma punta, este error puede ser evitado mediante la formación de la película antes de transferir la primera muestra; esto es hacer una aspiración de la muestra y dispensarla en el mismo vaso, cuando la película es formada ya todas las muestras siguientes tendrán mejor exactitud y repetibilidad. Esta operación de pre-enjuague deberá ser repetida cuando el volumen a ser aspirado cambia o cuando se usa una nueva punta.

3. Recomendaciones: 

No pipetear volúmenes que sobrepasen la capacidad de la micropipeta.

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Durante el uso y manejo las micropipetas deben permanecer en forma vertical.

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Ubicar las pipetas en soportes adecuados o en el embalaje original sin puntas.

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Mantener limpias las micropipetas.

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Si sus micropipetas son autoclavables y son sometidas a este proceso, estas deberán ser verificadas antes de su uso.

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Evite autoclavar las micropipetas si esta característica no se encuentra dentro de las especificaciones.

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Una vez terminado el uso de la micropipeta debe limpiarse el área de acoplamiento con una servilleta para evitar contaminación.

Posiciones de la micropipeta a la hora de medir un volumen específico.  A: Botón pulsador en el primer tope, B: la punta de la micropipeta es sumergida entre 1 mm y 3 mm en la muestra para luego liberar el botón pulsador suavemente hasta su posición original, C: Forma correcta de dispensar el líquido medido en el recipiente correspondiente, D: Posición de la micropipeta al apretar el botón pulsador hasta el segundo tope, E: Vuelta a la posición inicial, F: Expulsión de la punta, la cual debe ser descartada en un recipiente apropiado.

CALCULO DE LA EXACTITUD (E%) Y DEL COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV%) Cálculo del volumen medio Los valores de las pesadas del control gravimétrico son sólo la masa del volumen dosificado. Para obtener el volumen real se debe efectuar un cálculo corrector. El cálculo corrector se realiza por multiplicación del valor medio de los valores de las pesadas (x) con el factor Z (mL/g que es lo mismo que µl/mg), que toma en consideración la densidad del agua, la temperatura de control y la presión atmosférica. Z es igual a 1,0032 µl/mg, referido a 21,5 ° C, 1013 mbar (hPa) y a la utilización de agua destilada o z es igual a 1,0029 µl/mg, referido a 20 5 ° C y 1013 mbar (hPa). El factor Z es igual a 1/densidad. Valores del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032) Volumen controlado Vo (µl): 200,0000 Valor nominal (mg) = Volumen controlado/Z Valor nominal (mg): 199,3620 Ejm de 5 medidas: x1 =200,2000 x5= 199,7000

x2=199,6000

x3= 199,4900

x4= 199,7000

Exactitud (E%)

Desviación estándar

√ Σ(Xi  – X)2

S=Z.

n-1

Coeficiente de variación

Para el ejemplo calculado se obtiene el siguiente resultado: Volumen controlado (µL): 200,0000 Volumen medio (µL): 200,3772 E ¨ [%] 0,189 CV [%] 0,136 E [%] nominal* 0,500 CV [%] nominal* 0,200 * límites de tolerancia de las instrucciones de manejo Si los valores calculados de exactitud (E [%]) y coeficiente de variación (CV [%]) son menores que los valores de tolerancia o iguales a éstos, entonces el aparato está en orden.

Objetivo: Usar correctamente las micropipetas y calcular su exactitud

Material Micropipetas de 20, 200 y 1000 ul Tips Azules (1000 ul) Tips Amarillos (200 ul) Tips Blancos (20 ul) Gradillas con 5 Tubos de vidrio 5ml  Agua Destilada Buffer Laemmli HCl 1 N

PARTE EXPERIMENTAL 1. EXACTITUD (E%) Y EL COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV%) Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación (CV%) en todo el rango usando al menos dos volúmenes diferentes; por ejemplo:

Procedimiento: 1. Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas. 2. Colocar un trozo de papel parafilm (2x2 cm) en la balanza y tarar a cero. 3. Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo sobre el parafilm. Anote el peso del agua añadido. La densidad del agua es 1 g/mL a 25 º C, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a una masa de 1 g, 300 µL a 0.3 g, 200 µL a 0.2 g, 60 µL a 0.06 g, 10 µL a 0.01 g y 3 µL a 0.003 g. 4. Repita el procedimiento cinco veces para cada vol umen.

Para la micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 µL y 1000 µL. Volumen (ul) Peso (mg)

Volumen (ul) Peso (mg)

1000

300

1000

300

1000

300

1000

300

1000

300

Dibuje la micropipeta utilizada, anote sus características y Hacer los cálculos para encontrar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación (CV%). Cuál es el estado de su Micropipeta?

Para P200 revisar los volúmenes de 60 y 200 µL. Volumen (ul) Peso (mg)

Volumen (ul) Peso (mg)

60

200

60

200

60

200

60

200

60

200

Dibuje la micropipeta utilizada, anote sus características y Hacer los cálculos para encontrar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación (CV%). Cuál es el estado de su Micropipeta?

Para P20 revisar 3 y 10 µL. Volumen (ul) Peso (mg)

Volumen (ul) Peso (mg)

3

10

3

10

3

10

3

10

3

10

Dibuje la micropipeta utilizada, anote sus características y Hacer los cálculos para encontrar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación (CV%). Cuál es el estado de su Micropipeta?

2. ERRORES EN LA MEDICIÓN. Otro de los factores que influyen en el manejo es la forma correcta de pipetear. Procedimiento: 1) 2) 3) 4) 5)

Prepare una gradilla con 5 tubos Eppendorf conteniendo 1 ml de Agua Anadir a cada uno de los tubos 5 ul de buffer Laemmli 4X Mezclar los tubos, por inversión Anotar la absorbancia o intensidadi de color usando simbolos. Dibuje el experimento y comente los resultados..

Repetir el experimento, esta vez utilizando HCl 1N Procedimiento: 1) 2) 3) 4) 5)

Prepare una gradilla con 5 tubos Eppendorf conteniendo 1 ml de Agua Anadir a cada uno de los tubos 10 ul de HCl 1N Mezclar los tubos, por inversión Anotar el PH de cada uno de los tubos. Dibuje el experimento y comente los resultados..