Practica 02 Espectrofotometria

E.A.P Farmacia Farmacia y Bioquímica Curso: Analisis Instrumental Instrumental

PRÁCTICA NUMERO 02 ESPECTROFOTOMETRIA I.

OBJETIVOS : Determinación cuantitativa de la concentración de una sustancia coloreada, en una muestra problema.

•

•

II.

Elaboración de una curva de calibración de los colorantes a utilizar.

FUNDAMENTO TEORICO: La Espectrofotometría se incluye dentro de la Espectroscopia, ciencia que estudia los fenómenos de absorción y de dispersión de la luz. Los espectros pueden ser de:

Emisión, cuan cuando do los los átomo átomoss pierd pierden en ener energí gíaa radian radiante te,, emite emiten n una una radiac radiació ión n electromagnética.

Absorción: cuando captan energía radiante, aumentan su energía interna. Esta energía que los átomos de una sustancia emiten o absorben constituye una radiación electromagnética o REM. Las radiaciones electromagnéticas tienen doble naturaleza: corpúsculo y de onda: Corpusc Corpuscula ular: r: porqu porquee la luz está está constitu constituida ida por pequeñ pequeñas as partícul partículas as llamada llamadass fotones. Onda; nda; porq porque ue viaj viajan an en las las tres tres dire direcc ccio ione ness del del espa espaci cio o con con movi movimi mien ento to ondulatorio. Cada REM lleva una energía asociada que se calcula por la conocida ecuación de Max Planck:

E=h.ν Donde nde: E: Ener Energ gía. ía. h: Constante de Planck = 6,626 x 10-34 Joule seg.  ν: Frecuencia Frecuencia de la radiación en seg-1. La frecuencia de la radiación ν es inversamente proporcional a su longitud de onda λ.

 ν = C / λ  C=Velocidad de la luz (300 000 Km/seg) Muchos experimentos en bioquímica dependen de la medición de absorción de luz monocromática de una sustancia en solución en la región visible y ultravioleta del espectro electromagnético. Diversos compuestos sean o no coloreados tienen la capacidad de absorber luz de una determinada longitud de onda, pero en otros casos, es nece necesar sario io transf transform ormar ar la luz luz en un deriv derivad ado o colo colorea reado do usan usando do reacti reactivo voss apropiados.

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Las moléculas de interés biológicos absorben luz en la longitud de onda comprendida entre 200 y 8000 nanómetros (nm), como las purinas, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas y otros. Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una solución pueden usarse como medida de su concentración. Para realizar las medidas de concentración se utiliza un instrumento llamado ESPECTROFOTOMETRO, el cual contiene un prisma de dispersión entre la fuente de luz y la muestra para poder seleccionar la longitud de la onda analítica adecuada. La espectrofotometría consiste en comparar la transmisión de la luz a través de una solución que contiene muestra. La ley de Lamber – Beer nos manifiesta que la fracción incidencia absorbida por la solución a una determinada longitud de onda esta relacionada con el espesor de la capa absorbente y concentración de la especie que absorbe. Por la fórmula:

A = a.b.c Donde: A: Absorbancia. Capacidad de una solución para absorber luz. a: Coeficiente de extinción molar.  b: Espesor de la cubeta (1cm) c: Concentración de la muestra (g/l; mg/ml, μg/ml).

Anaranjado de metilo Naranja de metilo es un colorante azoderivado, con cambio de color de rojo a naranja-amarillo entre pH 3,1 y 4,4. La fórmula molecular de la sal sódica es C 14H14 N3 NaO3S y su peso molecular es de 327,34 g/mol Se empezó a usar como indicador químico en 1878. En la actualidad se registran muchas aplicaciones desde preparaciones farmacéuticas, colorante de teñido al 5%, y determinante de la alcalinidad del fango en procedimiento petroleros. También se aplica en citología en conjunto con la solución de Fuschin También es llamado heliantina. Se usa en una concentración de 1 gota al 0.1% por cada 10 ml de disolución.

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Naranja de metilo (Indicador de pH )  Inferior a pH 3,1

Rojo

Sobre pH 4,4 ↔

Naranja-amarillo

Anaranjado de metilo

Viraje del Naranja de Metilo

Azul de metileno

3,7-bis (dimetilamino) Nombre químico Cloruro d fenazationio Cloruro de tetrametiltionina Fórmula química C16H18 N3ClS Masa molecular 319,85 g/mol  Número CAS [61-73-4]  Número EC 200-515-2 Punto de fusión 100 °C Punto de ebullición Se descompone CN(C)c3ccc2nc1ccc(N(C) SMILES C)cc1[s+]c2c3.[Cl-] El azul de metileno , cuyo nombre científico es Cloruro de Metilionina, es un colorante que se usa para tratar una enfermedad llamada metahemoglobinemia. Es un compuesto químico heterocíclico aromático con fórmula molecular: C16H18ClN3S.

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MATERIALES Y REACTIVOS:

III.

REACTIVOS Anaranjado de metilo Verde malaquita Agua destilada

IV.

MATERIALES DE LABORATORIO 12 tubos de ensayo grandes. 12 tubos de ensayo pequeños. 04 gradillas. 04 varillas de vidrio. 02 probetas de 50ml. 02 fiola de 100ml. 02 pipetas de 2ml. 02 pipetas de 5ml. 02 pipetas de 10 ml 02 pipetas pasteur 

PARTE EXPERIMENTAL: 1.

Espectro de Absorción y Longitud de máxima absorción:

El presente experimento tiene por objetivo encontrar la curva de un colorante y determinar su longitud de onda analítica en una solución coloreada. El proceso consiste en aplicar el método de absorción en el espectro visible. Procedimiento: a) En un tubo de ensayo de 10ml de capacidad colocar 2ml de los colorantes anaranjado de metilo y azul de metileno. Diluir cada uno con 1ml de agua destilada.  b) En otro tubo de ensayo colocar 3ml de agua destilada para calibrar el espectrofotómetro a cero absorbancia. c) Determinar la longitud de onda analítica de mayor absorbancia. Medir a 300; 340; 360; 420; 460; 500; 540; 580nm.

2.

Curva de Calibración para un colorante:

El objetivo del presente experimento es poner en evidencia la ley de LambertBeer, mediante la construcción de la curva de calibración para el anaranjado de metilo y verde malaquita, usando las concentraciones progresivas de este colorante y las absorbancia obtenidas mediante el uso del espectrofotómetro. Se utiliza el método de absorción visible, que considera longitudes de onda comprendidas entre 380 y 700nm. Procedimiento: a) Establecer el siguiente sistema de tubos de ensayo. Componentes

1

2

3

4

5

6

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Colorante(10μg/ml)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

Agua destilada

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0,0

 b) Medir la absorbancia de cada uno de los tubos de ensayo contiendo la solución colorante.

Componentes

1

2

3

4

5

6

Concentración del Colorante

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

Absorbancia a …….nm

3.

Determinar Concentraciones desconocidas:

El objetivo del presente experimento es determinar la concentración de una sustancia desconocida mediante el uso de la curva de calibración y del factor de calibración. Procedimiento: a) Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la muestra problema.  b) Medir la absorbancia de la muestra utilizando la longitud de onda analítica. c) Determinar la concentración de la muestra problema usando la curva de calibración o el factor de calibración.

V.

RESULTADOS: Describir las observaciones realizadas en cada procedimiento, anotar los cambios respectivos y esquematizar los resultados. Realizar todas las reacciones químicas, si hubiera.

DISCUSIÓN : VII. CONCLUSIONES : VIII. CUESTIONARIO : VI.

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Que entiendes por coeficiente de extinción molar. La densidad óptica es igual a la absorbancia. Que entiendes por factor de calibración. Formula matemática de factor de calibración. Explique las desviaciones a la ley de Lambert-Beer  Qué es un fotocolorímetro.

7. Cuál es la longitud de onda para las bases nitrogenadas. 8. Qué longitudes de onda podríamos utilizar en la Absorbancia de sustancias no coloreadas como ácidos nucleicos, nucleótidos, proteínas, aminoácidos.

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IX.

BIBLIOGRAFIA : Q.F Verónica Amanda Apaza Coronel