PPT Biokimia Kelompok 4

Pemicu 1 : Kinetika Pertumbuhan Sel

Kelompok 4 Angelina (1406533522) Mauhibah Yumna (1406577650) M Galih Utomo (1406533554) Wawan Irawan (1406544636) Woro Bismo (1406533472)

1. Bagaimana mekanisme biokimia secara umum dalam pertumbuhan sel? Bagaimana pula fase-fase yang dialami oleh sel dalam masa pertumbuhannya?

Apa itu Biokimia? Biokimia adalah ilmu yang mempelajari reaksi yang terjadi di dalam atau berhubungan dengan makhluk hidup. Reaksi biokimia umumnya mempelajari tentang reaksi makromolekul kehidupan (karbohidrat, lemak, protein, asam nukleat), dan molekul atau ion lain yang berhubungan dengan kehidupan makhluk hidup (contohnya air).

Bagaimana peranan biokimia dalam pertumbuhan sel? Reaksi-reaksi biokimia sangat berperan dalam siklus hidup sel, karena tanpa reaksi-reaksi tersebut sebuah sel tidak dapat bertahan hidup. Mempelajari reaksi-reaksi biokimia dapat membuat kita mengerti lebih jauh tentang siklus hidup dan pertumbuhan sel, serta memanfaatkan pengetahuan itu untuk diaplikasikan di bidang-bidang lain, seperti medis dan pertanian.

Sasaran Biokimia Mempelajari pertumbuhan sel baik kecepatan/produk dan waktu yang dapat direkayasa Mempelajari jalur-jalur metabolisme dalam pertumbuhan sel & mekanisme pengendaliannya Struktur kimia dari komponen makhluk hidup dan hubungan antara struktur kimia dengan fungsi biologis Mempelajari metabolisme, yaitu keseluruhan reaksi kimia dalam makhluk hidup Proses kimia dan substansi yang menyimpan dan mengirimkan informasi biologis Mempelajari aktivitas katalitik enzim

Kurva Pertumbuhan Sel

Kurva pertumbuhan sel (Sumber: www.exptec.com)

Fase Lag • Terlihat mendatar pada kurva karena tingkat pertumbuhan sel sangat sedikit. • Sel mulai beradaptasi dan mengumpulkan energi dengan memulai reaksi enzimatis untuk menguraikan substrat dan nutrien. • Lamanya bergantung pada medium tumbuh dan jumlah awal sel yang mempengaruhi waktu adaptasi.

Fase Akselerasi Fase dimana sel sudah selesai melakukan masa adaptasi namun tingkat pertumbuhannya masih rendah

Fase Eksponensial • Tingkat aktivitas sel mencapai kecepatan maksimum yang dapat terlihat dari bentuk kurva yang eksponensial. • Dipengaruhi oleh beragam faktor biologis dan nonbiologis, seperti sifat sel, asosiasi organisme di medium tumbuh, kandungan nutrien, dan lain-lain

Fase Pengurangan (reduction) Tingkat pertumbuhan sel mengalami penurunan, karena nutrien yang dibutuhkan sudah hampir habis atau sel-sel yang terdapat pada medium mati karena terpapar hasil metabolisme yang bersifat racun atau persaingan dengan organisme lain.

Fase Stasioner • Kurva mendatar menunjukan tingkat pertumbuhan sel sama dengan tingkat kematian sel. Pada fase ini sel mengalami resistensi yang lebih tinggi terhadap faktor eksternal seperti suhu dan zat kimia. • Nutrisi di medium sangat berkurang • Terbentuk senyawa penghambat • Lingkungan mulai tidak menguntungkan

Fase Kematian • Tingkat kematian sel sudah lebih banyak dibandingkan tingkat pertumbuhan sel. • Nutrien sudah habis sehingga sel tidak lagi dapat melakukan pertumbuhan, namun hasil metabolisme yang bersifat toksik semakin banyak dan persaingan antar organisme semakin ketat sehingga sel yang mati lebih banyak dari sel yang hidup.

2. Bagaimana Anda mengukur dan menganalisis pertumbuhan sel? (parameter pertumbuhan sel)

Jumlah Total Sel Pertambahan atau pengurangan banyaknya sel N dari sampel yang diambil berbanding lurus dengan jumlah total sebenarnya X(t) = µ (t) X(t)

di mana • µ = laju pertumbuhan spesifik per waktu • X(t) = jumlah total sel per waktu

Aktivitas Populasi Mikrobial dalam Biakan Sistem Tertutup ln X = ln Xo + μ(t)

di mana • Xo: jumlah sel pada waktu nol, • X: jumlah sel pada waktu t, • t: waktu pertumbuhan diamati.

Doubling Time Untuk memperkirakan kerapatan populasi pada waktu yang akan datang dengan μ sebagai konstanta pertumbuhan yang berlaku. Parameter penting untuk konstanta pertumbuhan populasi secara eksponensial adalah waktu generasi (waktu penggandaan). Penggandaan populasi terjadi saat X / Xo =2, sehingga: td = ln 2/µ

Laju Pertumbahan Sel Untuk mengukur pertumbuhan sel, kita dapat menentukannya dengan menggunakan persamaan laju pertumbahan sel (rx) rx = μ . CX dimana : • μ = konstanta kecepatan pertumbuhan • CX = konsentrasi sel kering per unit volum

Cara Mengukur dan Menganalisis Pertumbuhan Sel Aktivitas dari pertumbuhan sel dapat diukur secara kuantitatif, baik jumlah maupun perubahan laju dari massa sel. Terdapat dua kategori metode yang dapat digunakan:

Pengukuran Banyaknya Sel

Berat Sel

Pengukuran Mikroskopis Langsung Secara umum, metode yang dilakukan adalah menghitung sel pada slide kaca. Dengan slide Petroff-Hauser, dapat digunakan untuk menghitung banyaknya sel pada setiap kamar/kotak hemocytometer. Massa Jenis Sel =

Rata − rata sel per kotak Volume kotak

Diperlukan staining karena jumlah sel mati dan hidup tidak terlihat.

Mikroskop (Sumber: instr.bact.wisc.edu)

Plat Penghitung Sel Hidup • Teknik yang dilakukan pada metode ini adalah dengan membuat mikroba bertumbuh pada medium (kloning). Kemudian mikroba yang ada dihitung pada plat penghitung sel hidup dengan teknik pengukuran koloni yang terbentuk (CFU). • Dapat juga diaplikasikan pada mikroba pada lingkungan bebas. Namun, perlu diketahui bahwa mikroba yang terkandung pasti banyak sehingga pertumbuhan pada medium tertentu akan berbeda.

Plating and CFU Counting (Sumber: upload.wikimedia.org)

Penghitung Coulter Penghitung yang ditemukan oleh Coulter ini menggunakan arus listrik melaui sebuah lubang. Setiap mikroba yang melewati lubang, tahanan akan bertambah dan arus menurun. Jumlah arus ini dapat terekam pada suatu alat dan dapat menunjukkan pengurangan arus sebandung dengan volume sel. Instrumen ini dapat memberikan banyaknya sel dan distribusi ukuran sel tetapi tidak memberikan info tentang bentuk sel. Partikel yang dapat dihitung adalah partikel yang berukuran 0,5-200 µm.

Coulter Counter (Sumber: instr.bact.wisc.edu)

Aliran Cytometer (Flow Cytometri) Metode ini dilakukan dengan memanfaatkan sifat optis dari sel. Sampel yang telah dikultur di encerkan di aliran yang akan memisahkan sel secara membujur dari sel lain. Aliran melaui laser beam, absorption, flouresence, atau light diffusion untuk menyampaikan perhitungan sel. Selektifitas juga dapat ditingkatkan dengan melabel dengan flouresencent dye. Pengurutan sel selesai dengan memasukkan muatan pada tetes yang mengandung sel yang diinginkan. Muatan membuat tetes tersebut terbelokkan ke detektor.

Flow Cytometer (Sumber: www.biocompare.com)

Dry Cell Weight (Berat Sel Kering) Teknik ini dilakukan dengan mengeringkan sampel dengan proses sentrifugasi atau filtrasi, dicuci dengan air atau buffer, dan dikeringkan pada 80 derajat celcius. DCW sering digunakan pada fermentor. Sampel broth diambil dari fermentor kemudian ukur volumenya. Sel dipisahkan dengan sentrifugasi atau filtrasi, namum biasanya masih terdapat pengotor lain yang bukan merupakan sel sehingga perlu diperlakukan beberapa metode seperti penambahan buffer untuk menhilangkan asam. Kemudian sel dikeringkan dan ditimbang.

Packed Cell Volume (PCV) PCV sering digunakan pada industry plant untuk mengikuti kinerik fermentasi. PCV tergantung tidak hanya pada massa sel, tetapi juga pada kecepatan sentrifugal dan waktu, banyaknya padatan non-selular, mofologi kultur, dan osmolaritas dari medium. Kondisi sentrifugasi biasanya di set untuk mengurangi efek dari variabel lain. Banyaknya padatan nonselular akan berkurang seiring dengan pertambahan waktu. Padatan akan mengendap lebih dulu daripada sel sehingga dapat menghitung berat padatan yang ada.

Turbiditas (kekeruhan) Turbiditas adalah teknik yang paling sering digunakan pada pengukuran pertumbuhan mikroba.

Nephelometric method

Visual method

Spektrofotometer

Image Analysis • Khusus untuk kasus pertumbuhan filamentous dan pembentukan pellet, sulit untuk mengukur pertumbuhan dari sel atau massa total sel. • Analisis ini dapat menjadi alat berguna untuk mengklasifikasi biomassa. • Diambil gambar dari broth fermentasi dan diproses dengan software komputer.

3. Bagaimana substrat dan pembentukan produk dalam sel dapat menginhibisi pertumbuhan sel? Dapatkah anda menjelaskan faktor-faktor lainnya yang dapat menginhibisi laju pertumbuhan sel?

Faktor-faktor yang Menginhibisi Reaksi Pertumbuhan Sel • Senyawa Kimia • Pembentukan Produk • pH • Suhu • Cahaya • Air • Kelembaban

• Potensial Oksidasi – Reduksi • Keberadaan Gas • Keberadaan Antibiotik • Salinitas • Kondisi osmotik • Logam Berat

Inhibisi oleh Substrat • Inhibisi oleh substrat ini sering dianggap sebagai sifat biokimia dari substrat yang aneh dan menganggu proses berjalannya reaksi kimia.

Grafik pengaruh kadar substrat terhadap kecepatan pertumbuhan spesifik Sumber: Julianti, Elisa. 2013)

• Mekanisme inhibisi oleh substrat ditunjukkan pada Gambar 2. Terlihat substrat menyerang kompleks enzim substrat sehingga membentuk kompleks enzimsubstrat-substrat.

Inhibisi oleh Substrat (2)

Mekanisme inhibisi oleh substrat (Sumber:http://www1.lsbu.ac.uk/)

• Tahap Reaksi: 𝐸+𝑆 𝐸∙𝑆

𝐸∙𝑆 𝑆+𝐸∙𝑆

𝑘3

𝑘1

𝑘−1 𝑘2

𝐸∙𝑆

𝐸+𝑆

𝐸+𝑃

𝑆 ∙ 𝐸 ∙ 𝑆 (𝑖𝑛𝑎𝑘𝑡𝑖𝑓)

𝑆∙𝐸∙𝑆

𝑘−3

𝑆+𝐸∙𝑆

Inhibisi oleh Pembentukan Produk Gambar x. Mekanisme inhibisi oleh produk (Sumber: http://www.csun.edu/)

• Inhibisi oleh produk kadang disebut sebagai negative feedback atau inhibition feedback. • Inhibisi oleh produk adalah suatu tipe inhibisi enzim dimana produk dari suatu reaksi enzimatis menempel pada enzim dan menghambat aktivitasnya. • Hal ini penting pada regulasi metabolisme sebagai suatu bentuk negative feedback yang mengontrol siklus metabolisme.

Inhibisi oleh Pembentukan Produk (2) • Pada dasarnya, inhibisi oleh produk adalah suatu hal yang merugikan dan dalam bioteknologi selalu berusaha dihilangkan karena dapat meningkatkan yield produksi, contohnya dalam produksi antibiotik. • Pada inhibisi ini, produk secara struktur mirip dengan substrat sehingga akan berkompetisi dengan substrat untuk menempel pada sisi aktif enzim.

Contoh inhibisi oleh produk (Sumber: http://www.citruscollege.edu/)

Inhibisi oleh Faktor Lainnya • Faktor-faktor lainnya yang dapat menginhibisi reaksi enzimatis adalah inhibitor kompetitif, non-kompetitif, dan inkompetitif, serta isomerisasi kompleks EI menjadi EI* yang inaktif. • Inhibitor kompetitif mempunyai struktur yang mirip dengan substrat sehingga akan berkompetisi dengan substrat untuk menempel pada sisi yang sama pada enzim yaitu sisi aktifnya. • Inhibitor non-kompetitif tidak mirip secara struktural dengan substrat sehingga akan menempel pada sisi yang berbeda dengan sisi aktif enzim, namun mengubah bentuk enzim sehingga substrat tak dapat menempel dengan enzim. • Pada inhibisi inkompetitif, inhibitor dapat hanya dapat menempel pada enzim apabila enzim telah berikatan dengan suatu substrat atau lebih.

Inhibisi oleh Faktor Lainnya

Mekanisme inhibisi kompetitif (Sumber: http://www.csun.edu/)

Mekanisme Inhibisi Non-Kompetitif (Sumber: http://www.csun.edu/)

Inhibisi oleh Faktor Lainnya

Mekanisme inhibisi Inkompetitif (Sumber: http://www.csun.edu/)

4. Dengan adanya pertumbuhan sel ini, dapatkah anda menjelaskan mekanisme-mekanisme reaksi yang mungkin dijalani oleh sel dalam masa pertumbuhannya? Bagaimana menentukan laju reaksinya dari masing-masing mekanisme tersebut?

Mekanisme Reaksi Pertumbuhan Sel • Pertumbuhan pada sel melibatkan metabolisme energi, di mana Metabolisme adalah suatu proses komplek yang terjadi didalam sel dimana terjadi perubahan makanan menjadi energi dan panas melalui suatu proses kimia, berupa proses pembentukan dan penguraian zat. • Metabolisme bertujuan untuk menghasilkan energi yang berguna bagi kelangsungan hidup, baik untuk pembelahan sel maupun transpor molekul ke luar dan ke dalam sel. • Metabolisme sering disebut dengan reaksi enzimatis, karena metabolisme terjadi selalu menggunakan katalisator enzim.

Anabolisme • Anabolisme merupakan rangkaian reaksi kimia yang substrat awalnya adalah molekul kecil dan produk akhirnya adalah molekul besar, bertujuan untuk penyusunan atau sintesis molekul. • Contoh : Pada reaksi fotosintesis berikut.

Gelap

Terang

Fotosintesis

Fotosintesis Terang Proses Penyerapan Energi Cahaya Beratus- ratus pigmen fotosintesis (fotosistem) meyerap foton

Energi eksitasi dibawa oleh pigmen ke pigmen lainnya hingga ke klorofil a Klorofil a teraktivasi memberikan elektron ke molekul penerima elektron dalam sistem transpor elektron

Proses Penyerapan Energi Cahaya (Sumber: http://www.csun.edu/)

Fotosintesis Gelap (CalvinBenson) • Berlangsung dalam gelap, dan hanya dapat berlangsung jika ada ATP dan NADPH (yang dihasilkan proses terang) • Memerlukan ATP, hidrogen, dan elekton dari NADPH, karbon dan oksigen dari karbon dioksida, enzim yang mengkatalisis setiap reaksi, dan RuBP.

Karbon dioksida diikat oleh RuBP menjadi senyawa 6 karbon, yang lalu memecah menjadi 2 fosfogliserat (PGA) Masing masing PGA menerima gugus fosfat dari ATP dan menerima hidrogen serta elektron dari NADPH, menghasilkan PGAL Untuk setiap 6 molekul CO2 yang diikat menghasilkan 12 PGAL Dari 12 PGAL, 10 molekul kembali ke tahap awal menjadi RuBP, dan seterusnya RuBP akan mengikat CO2 yang baru

2 PGAL lainnya akan berkondensasi menjadi glukosa 6 fosfat

Katabolisme 𝐶6 𝐻12 𝑂6 + 6𝑂2

6𝐶𝑂2 + 6𝐻2 𝑂

 Merupakan rangkaian reaksi yang bertujuan untuk pembongkaran atau penguraian suatu molekul.  Bersifat eksergonik.  Berfungsi menyediakan bahan baku untuk sintesis molekul lain .  Menyediakan energi kimia yang dibutuhkan untuk melakukan aktivitas kehidupan.

Pemecahan polisakarida dan disakarida menjadi monosakarida Pati Ptialin Amilase

Maltosa dan polimer glukosa Maltase dan 𝛼 − 𝑑𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑖𝑛𝑎𝑠𝑒

Glukosa

Laktosa

Laktase

Glukosa dan galaktosa

Sukrosa

Sukrase

Glukosa dan fruktosa

Menentukan Laju Reaksi • Pertumbuhan sel merupakan salah satu dari rangkaian aktivitas sel yang fungsinya untuk mempertahankan kehidupannya. Setiap pertumbuhan sel mengikuti aturan-aturan berikut, 𝐶𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 + 𝑁𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 + 𝑝ℎ𝑜𝑠𝑝ℎ𝑎𝑡𝑒 + 𝑂2 𝐶𝑒𝑙𝑙 𝑚𝑎𝑠𝑠 + 𝐶𝑂2 + 𝐻2 𝑂 + 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡 + ℎ𝑒𝑎𝑡 • Bila pertumbuhan sel terjadi saat kondisi aerob, maka 𝑜𝑥𝑦𝑔𝑒𝑛 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛 𝑝ℎ𝑜𝑠𝑝ℎ𝑎𝑡𝑒 + + + 𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑢𝑟𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑑𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛 (𝑝𝐻,𝑇,𝑒𝑡𝑐.) 𝑚𝑜𝑟𝑒 +⋯ 𝐶𝑂2 + 𝐻2 𝑂 + 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡 + 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠 +

Persamaan Monod • Persamaan laju pertumbuhan sel mengikuti alur mekanisme sel sebagai berikut:

𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠 + 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑒

𝑚𝑜𝑟𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠 + 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡

• Persamaan Monod untuk pertumbuhan eksponensial (log phase) adalah sebagai berikut 𝑟𝑔 = 𝜇 𝐶𝑐 dimana 𝑟𝑔 adalah cell growth rate (g/dm3.s) 𝐶𝑐 adalah cell concentration (g/dm3) 𝜇 adalah specific growth rate (s-1).

Laju Pertumbuhan Spesifik • Laju pertumbuhan spesifik 𝜇 ditunjukkan dengan persamaan 𝐶𝑠 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑘𝑠 + 𝐶𝑠

dapat

• 𝜇𝑚𝑎𝑥 adalah laju reaksi pertumbuhan spesifik maksimum (s-1) • 𝑘𝑠 adalah konstanta Monod (g/dm3) • 𝐶𝑠 adalah konsentrasi substrat (g/dm3) • Nilai 𝜇𝑚𝑎𝑥 dan 𝑘𝑠 yang biasa digunakan, masing-masing, adalah 1,3 h-1 dan 2,2 x 10-5 mol/dm3.

Monod + Laju Pertumbuhan Spesifik • Apabila persamaan Monod dan laju pertumbuhan spesifik digabungkan maka didapatkan persamaan 𝐶𝑠 𝐶𝑐 𝑟𝑔 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑘𝑠 + 𝐶𝑠 • Apabila konstanta 𝑘𝑠 kecil maka 𝑟𝑔 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝐶𝑐 . • Inhibitor produk dapat mempengaruhi pertumbuhan sel sebagai contoh fermentasi glukosa yang memproduksi etanol dan diinhibisi oleh etanol itu sendiri. • Maka persamaan empirisnya adalah 𝑘𝑜𝑏𝑠 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝐶𝑠 𝐶𝑐 𝑟𝑔 = 𝑘𝑠 + 𝐶𝑠

Persamaan-Persamaan Laju Pertumbuhan Sel • Persamaan lain untuk menentukan laju pertumbuhan sel adalah persamaan Tessier, yakni 𝐶𝑠 𝑟𝑔 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 1 − exp − 𝐶𝑐 𝑘 • dan Persamaan Moser 𝐶𝑐 𝑟𝑔 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 1 + 𝑘𝐶𝑠 −𝜆 • dimana λ dan k adalah konstanta empiris. • Persamaan Moser dan Tessier sering digunakan karena keduanya menemukan data eksperimen yang tepat dan lebih baik pada awal atau akhir fermentasi.

Fase Kematian Sel • Pada fase kematian sel persamaan lajunya menjadi 𝑟𝑑 = 𝑘𝑑 + 𝑘𝑡 𝐶𝑡 𝐶𝑐 • dimana 𝐶𝑡 adalah konsentrasi racun yang mengenai sel • 𝑘𝑑 adalah kematian alami • 𝑘𝑡 adalah kematian yang disebabkan oleh racun • Nilai representatif 𝑘𝑑 berada di antara 0,1 h-1 hingga di bawah dari 0,0005 h-1, sedangkan 𝑘𝑡 merupakan racun alam.

5. Bagaimana Anda menghitung laju reaksi dari suatu data konsentrasi menggunakan diferensiasi grafis? Berikan contohnya!

Hukum Laju dari Grafik Konsentrasi Terhadap Waktu

• • •

[A] versus t Reaksi pada orde 0 Terbentuk garis yang linier Laju reaki (r) = d[A]/dt = k

ln [A] versus t • • •

Reaksi pada orde 1 Terbentuk garis yang linier Laju reaki (r) = d[A]/dt = k [A]

1 / [A] versus t • Reaksi pada orde 2 • Laju reaki (r) = d[A]/dt = k[A]2

(sumber: http://www.chem.purdue.edu/gchelp/howt osolveit/Kinetics/CalculatingRates.html#Top)

Metode Differensial Perubahan konsentrasi pereaksi dalam selang waktu tertentu

Metode untuk menentukan tingkat reaksi.

Penggunaan persamaan laju secara langsung.

Menentukan Laju Reaksi dengan Metode Diferensiasi Grafis

Menentukan Laju Reaksi dengan Metode Diferensiasi Grafis dengan mengukur laju perubahan konsentrasi reaktan terhadap waktu

aA

+

bB

perubahan konsentrasi reaktan terhadap waktu selama reaksi berlangsung

→

cC

+

dD

Diferensiasi grafis dari data konsentrasi dengan menggambar tangent

Langkah - Langkah

Menebak bentuk persamaan reaksi serta orde reaksinya

Metode Least Square

Menyusun neraca massa

Garis Lurus

Membuat grafik

Garis Tidak Lurus

Pada metoda diferensial, variable dalam bentuk derivatif yang besarnya dapat dicari dengan metoda numeris : dC A Limit  dt t  0

CA

t t

t

 CA

t 

CA

i1

 CA

t

i

Contoh Soal 100 ml larutan A dengan konsentrasi A 10 gmol/L dalam reaktor bereaksi membentuk B, selama terjadi reaksi diamati konsentrasi A, diperoleh data sebagai berikut : Waktu (menit)

CA(gmol/L)

5

6,8

10

4,9

15

4,0

20

3,2

25

2,9

30

2,5

Bagaimana bentuk persamaan kecepatan reaksinya, tentukan laju reaksi dan konstanta kecepatan reaksinya!

1. Menentukan orde reaksi Untuk menentukan, dilakukan percobaan terhadap orde reaksi, percobaan pertama terhadap reaksi orde 1 dengan persamaan kecepatan reaksi :

rA= kCA

2. Menyusun neraca massa Kecepatan Kecepatan Kecepatan Kecepatan − − = bahan masuk bahan Keluar bahan bereaksi akumulasi

dC AV 0  0  kC AV  dt Volume dianggap konstan, maka :

0  0  kC A

dC A  dt

Persamaan Derivatif linier

3. Membuat grafik Untuk membuat grafik tersebut diperlukan pengolahan data konsentrasi A dan waktu menjadi sehingga dihasilkan data sebagai berikut : Waktu (menit) 5 10

15 20 25 30

CA (gmol/L)

ĉA (gmol/L)

-

dCA dt

6,8 5,85

0,38

4,45

0,18

3,60

0,16

3,05

0,06

2,70

0,008

4,9

4,0 3,2 2,9 2,5

3. Membuat grafik Grafik - dCA/dt vs CA 0.4 y = 0.1114x - 0.2802 R² = 0.963

0.35 0.3

- dCA/dt

0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

CA

Grafik yang diperoleh telah mendekati garis lurus.

Kesimpulan • Dari grafik tersebut , hubungan mendekati garis lurus maka bisa disimpulkan bahwa reaksi tersebut merupakan reaksi orde satu dengan persaman kecepatan reaksi rA=kCA. Nilai konstanta kecepatan reaksi (k) adalah slope dari garis tersebut k = 0,118 (1/menit).

6. Bagaimana anda menjelaskan hubungan kinetik untuk reaksi-reaksi berorde nol, satu, dan MichaelisMenten?

Kinetika Orde Nol • Reaksi dalam kinetika orde nol, mempunyai laju reaksi yang tidak dipengaruhi oleh konsentrasi reaktan. Berikut adalah persamaannya. rA = k0 • Kita dapat menuliskan : 𝑘0 = 𝑘0′ 𝑒 atau 𝑘0 = 𝑘0𝑛 𝑥

Kinetika Orde Satu • Laju reaksi dalam reaksi kinetika orde satu dipengaruhi oleh konsentrasi reaktan, berikut adalah hubungan antara laju reaksi dan konsentrasi reaktan : 𝑟A = 𝑘1 𝐶A

Kita asumsikan suatu reaksi dalam suatu sistem tertutup, dan berada dalam volume konstan, dan kita akan mengukur konsentrasi reaktan A sebagai fungsi waktu. Dibawah kondisi −d𝐶A tersebut, 𝑟A = d𝑡

• Untuk menentukan apakah reaksi tersebut merupakan kinetika orde satu, pertama-tama kita mengintegrasi persamaan diatas dan −d𝐶A 𝑟A = lalu melakukan d𝑡 pengecekan terhadap data konsentrasi terhadap persamaan yang dihasilkan.

Memisahkan variabel dan mengintegrasi persamaan diatas dengan kondisi awal 𝐶A = 𝐶A0 dengan t = 0 : 𝐶A = 𝐶A0 𝑒 −𝑘1 𝑡 ln 𝐶A = ln 𝐶𝐴0 − 𝑘1 𝑡 Jadi, untuk reaksi orde satu, plot grafik dari ln 𝐶A terhadap waktu memberikan garis lurus dengan gradien −𝑘1 .

• Kinetika Michaelis-Menten Kinetika dari sebagian besar reaksi enzimatik menggunakan persamaan Michaelis Menten:

𝑟A =

𝑣max 𝐶A 𝐾m + 𝐶A

• Mekanisme Michaelis Menten biasanya digunakan untuk reaksi katalis enzim dengan persamaan sebagai berikut :

Pada saat kecepatannya maksimum sehingga:

menjadi

Enzyme Alcohol dehydrogenase α-Amylase

β-Amylase Aspartase β-Galactosidase Glucose oxidase Histidase Invertase

Lactate dehydrogenase Penicillinase Urease

Saccharomyces cerevisiae Bacillus stearothermophilus Porcine pancreas Sweet potato Bacillus cadaveris Escherichia coli Aspergillus niger Penicillium notatum Pseudomonas fluorescens

Ethanol

Km (mM) 13,0

Starch

1,0

Starch Amylose L-Aspartate Lactose D-Glucose D-Glucose L-Histidine

0,4 0,07 30,0 3,85 33,0 9,6 8,9

Saccharomyces cerevisiae Neurospora crassa Bacillus subtilis

Sucrose

9,1

Sucrose Lactate

6,1 30,0

Bacillus licheniformis Jack bean

Benzylpenicillin Urea

0,049 10,5

Source

Konstanta Michaelis untuk enzim tertentu. Sumber : B. Atkinson andF. Mavituna, 1991, Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd edn, Macmillan, Basingstoke

Substrate

• Michaelis-Menten, yang akan dibahasi disini adalah reaksi sederhana yang dari sifat kinetik dari banyak enzim adalah :

Michaelis-Menten (laju reaksi kimia penguraian substrat saat dipengaruhi oleh katalis enzim)

• Persamaan Michaelis-Menten adalah persamaan paling baik yang dapat mendeskripsikan kinetika dari berbagai enzim yang dipakai di industri, walaupun ada pengecualian terhadap enzim seperti glucose isomerase dan amyloglucosidase. • Saat konsentrasi substrat [S] jauh lebih kecil daripada konstanta Michaelis-Menten Km, laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi substrat. Ini merupakan laju reaksi orde satu sehubungan dengan substrat. • Saat konsentrasi substrat [S] jauh lebih besar daripada konstanta Michaelis-Menten Km, laju reaksinya konstan dan sama dengan laju maksimum (Vmax). Laju reaksi tidak bergantung pada konsentrasi substrat. Ini merupakan laju reaksi orde nol terhadap substrat.

Grafik laju reaksi orde 0 dan 1 (Richard A. Harvey : Biochemistry)

7. Bagaimana anda menentukan parameter kinetika enzimatik, Vmax dan Km dari suatu data konsentrasi? Berikan contoh!

Reaksi Enzimatik • Reaksi enzimatik merupakan suatu reaksi yang melibatkan enzim sebagai katalis. • Enzim berfungsi sebagai katalis yang akan membuat reaksi berlangsung lebih cepat untuk menghasilkan produk. • Peneliti yang bernama Leoner Michaelis k2 mengajukan suatu dan Maud kMenten 1 model untuk k1' suatu reaksi enzimatik. Berikut ini adalah reaksi yang digambarkan oleh Michaelis-Menten:

E  S  ES  E  P

Peneliti yang bernama Leoner Michaelis dan Maud Menten mengajukan suatu model untuk suatu raksi enzimatik. Berikut ini adalah reaksi yang digambarkan oleh Michaelis-Menten:

k1

k2

E  S  ES  E  P k1'

k1

k2

E  S  ES  E  P k1'

Dari reaksi diatas, kita dapat mendapatkan persamaan laju pembentukan produk dan kompleks substrat-enzim sebagai berikut:

d [ P]  v  k 2[ ES ] dt Laju Pembentukan Produk

d [ ES ]  k 1[ E ][ S ]  k 1' [ E ][ S ]  k 2[ ES ] dt Laju Pembentukan Kompleks Substrat-Enzim

Enzim berperan sebagai katalis, sehingga konsentrasi enzim itu tetap atau dapat dikatakan tidak terkonsumsi maka persamaan konsentrasi enzim dapat dituliskan menjadi sebagai berikut: [ E ]tot  [ E ]  [ ES ]  [ E ]  [ E ]tot  [ ES ]

Reaksi yang menggunakan enzim sebagai katalis, akan menghasilkan grafik seperti berikut ini jika kita lakukan plot antara laju pembentukan produk terhadap konsentrasi substrat:

Keterangan : Km adalah konstanta Michaelis Menten (Konsentrasi substrat dimana kecepatan sudah mencapai ½ kecepatan maksimal.

Plot Michaelis - Menten • Vmax dan Km dapat ditentukan dari grafik, Vmax adalah sebagai laju s~ dan Km nilai dari s saat V=Vmax/2. Pengakurasian metode ini memiliki kelemahan karena sulit untuk menentukan tmx.

Plot Lineweaver - Burk • Metode ini digunakan untuk langkah linearisasi untuk menghasilkan plot garis lurus yang bisa menentukan Vmax dan Km dengan persamaan: 1 𝐾𝑚 1 = + 𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑆 𝑉𝑚𝑎𝑥 • Sehingga plot dari 1/v vs 1/s harus menghasilkan garis lurus dengan slop Km/Vmax dan intercept 1/Vmax. Plot ini dikenal sebagai Lineweaver-Burk plot. Bagaimanapun juga, proses linearisasi yang digunakan pada data eksperimen error pada v, sehingga kesalahan ini diperkuat pada konsentrasi substrat yang rendah.

Plot Eadie - Hofstee • Jika persamaan 𝑉(

𝑉𝑚𝑎𝑥 ), 𝐾𝑚

1 𝑉

=

𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑆

+

1 𝑉𝑚𝑎𝑥

dikalikan dengan

dan kemudian disusun, bentuk linearisasi

lainnya dari persamaan Michaelis-Menten adalah 𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉 = − 𝑆 𝐾𝑚 𝐾𝑚 • Pada persamaan di atas, plot v/s versus Vmax/Km akan menghasilkan garis lurus dengan slop -1/Km dan intercept Vmax/Km yang dikenal dengan EadieHofstee plot. Seperti plot Lineweaver-burk, EadieHofstee linearisasi mendistorsi kesalahan dalam data, sehingga metode ini telah mengurangi akurasi.

Plot Langmuir • Dengan mengalikan persamaan 1 𝑉𝑚𝑎𝑥

dengan

S,

maka

bentuk

1 𝑉

=

𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑆

+

linearisasi

persamaan Michaelis-Menten menjadi Langmuir adalah: 𝑆 𝐾𝑚 𝑆 = + 𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥 • Sehingga sebuah plot Langmuir pada S/V versus S harus menghasilkan garis lurus dengan slop 1/Vmax dan intercept Km/Vmax. Linearisasi dari metode ini menghasilkan kesalahan yang kecil, sehingga metode Langmuir direkomendasikan metode untuk menentukan Km dan Vmax.

Direct Linear Plot Garis lurus dihasilkan pada (-s,v) akan mendapatkan titik yang unik (Km dan Vmax), yaitu dimana semua hasil garis lurus dari –S dan V akan menghasilkan titik potong yang banyak di suatu titik. Ketika data yang diplot mengandung kesalahan, maka akan diperoleh titik persimpangan. Setiap persimpangan akan memberikan suatu nilai perkiraan Vmax dan Km, kemudian median Vmax dan Km yang dijadikan sebagai parameter kinetik reaksi.

Contoh soal Laktosa yang juga dikenal sebagai β-galactosidase, yang mengkatalis hidrolisis laktosa untuk memproduksi glukosa dan galaktosa dari susu. Eksperimen dilakukan untuk menentukan parameter kinetik untuk enzim. Konsentrasi Laktosa

Initial reaction velocity

(mol/L)

(mol-1 min-1 x 103)

0,0250

1,94

0,0227

1,91

0,0184

1,85

0,0135

1,80

0,0125

1,78

0,00730

1,46

0,00460

1,17

• Untuk menentukan parameter kinetika enzim dengan metode Langmuir, Langmuir Plot dengan 1 𝐾𝑚 1 mengalikan persamaan = + dengan 𝑉

𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑆

𝑉𝑚𝑎𝑥

s, maka bentuk linearisasi persamaan MichaelisMenten menjadi Langmuir adalah : 𝑆 𝐾𝑚 𝑆 = + 𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥 • Sehingga sebuah plot Langmuir pada s/v versus s harus menghasilkan garis lurus dengan slop 1/vmax dan intercept Km/Vmax. Linearisasi dari metode ini menghasilkan kesalahan yang kecil, sehingga metode Langmuir direkomendasikan sebagai metode untuk menentukan Km dan Vmax.

Data Plot Langmuir

Hubungan S/V vs S dalam Reaksi Hidrolisis Laktosa 10

S/V (min)

8 6

s (mol/L)

s/v (min)

0,0250

12,89

0,0227

11,88

0,0184

9,95

0,0135

7,50

0,0125

7,02

0,00730

5,00

0,00460

3,93

0,00204

2,62

y = 444,8x + 1,702 R² = 0.9984

Gambar Grafik Plot Data Perhitungan Langmuir

4 2 0

0.00204 0.0046 0.0073 0.0125 0.0135 S (mol/L)

Persamaan garis pada grafik adalah y = 444,8x + 1,702 •

1 𝑉𝑚𝑎𝑥

= 445 mol-1 min

• Vmax = 2,25 × 10-3 mol min-1 •

𝐾𝑚 = 𝑉𝑚𝑎𝑥

1,70

• Km = 1,70 × 2,25 ×10-3 = 3,83 ×10-3 mol-1

• Jadi Km bernilai 3,83 ×10-3 mol-1 dan Vmax = 2,25 ×10-3 mol min-1

8. Bagaimana pengaruh suhu terhadap laju reaksi enzimatik? Berikan contoh!

Enzim • Enzim umumnya merupakan protein globular. Aktivitas enzim ditentukan oleh struktur tiga dimensinya (struktur kuaterner). Walaupun struktur enzim menentukan fungsinya, prediksi aktivitas enzim baru yang hanya dilihat dari strukturnya adalah hal yang sangat sulit. • Kebanyakan enzim berukuran lebih besar daripada substratnya. Enzim terdiri dari sisi aktif dan inaktif. • Enzim merupakan rantai asam amino yang melipat. Tiap-tiap urutan asam amino menghasilkan struktur pelipatan dan sifat-sifat kimiawi yang khas.

Reaksi Enzimatik Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi biokimia. Hal ini akan menyebabkan zat awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk. E + S  ES  E + P

Pengaruh Temperatur • Pada reaksi antara substrat dan enzim, saat terjadi pemanasan, aktivitas enzim meningkat, sehingga terjadi gerakan termodinamik atau tumbukan antara substrat dan enzim. • Pada suhu rendah, aktivitas enzim rendah, bahkan bisa berhenti sama sekali. • Pada suhu diatas suhu optimum, aktivitas enzim menurun karena terjadi denaturasi pada enzim. • Karena enzim tersusun dari protein maka enzim sangat peka terhadap temperatur. Temperatur terlalu tinggi dapat menyebabkan denaturasi protein.

Pengaruh Temperatur KIRI Molekul enzim & substrat bergerak lambat. Dengan naiknya suhu, energi kinetik mereka meningkat dan gerakan yang terjadi lebih cepat . Semakin tinggi suhu, semakin cepat gerakan dan lebih sering terjadi tabrakan dan menyebabkan reaksi berlangsung lebih cepat. TENGAH Suhu terbaik untuk reaksi, disebut suhu optimum. KANAN Setelah mencapai suhu optimum, laju reaksi mulai melambat. Hal ini karena enzim molekul mulai didenaturasi dan tidak lagi cocok menjadi situs aktif, sampai akhirnya tidak ada reaksi terjadi sama sekali.

Hampir semua enzim memiliki aktivitas optimum pada suhu sekitar 30oC & denaturasi dimulai pada temperatur 45oC (Winarno,1986).

Perhitungan Laju Reaksi Hubungan antara suhu dan laju reaksi secara empiris dinyatakan dengan ketetapan Arrhenius

k : Laju Reaksi A : Tetapan Arrhenius R : Konstanta gas (1,987 kal / g-mole K) T : Temperatur K EA : Energi Aktivasi ( J mol-1)

Perubahan nilai k terhadap perubahan suhu (T) yang dinyatakan dalam hubungan Arrhenius

Hubungan Arrhenius

Contoh • Dari data tabel di bawah ini terlihat bahwa beberapa enzim memiliki suhu optimal yang berbeda-beda dan bervariasi tergantung pada jenis enzim itu sendiri. • Dari tabel Hasil Pengamatan Pegaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase yang diambil dari hasil praktikum Biokimia Gizi (IPB 2013) di bawah ini, dapat terlihat bahwa enzim amylase memiliki suhu optimum dan bekerja efektif pada suhu 25oC.

Tabel Hasil Pengamatan Pegaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase (IPB, 2013) Suhu (oC)

∆A / menit (V)

0

0,106

25

0,146

Suhu Ruang

0,043

37

0,047

60

0,038

100

0,031

9. Bagaimana menghitung yields pada kultur sel dan peran pentingnya sebagai salah satu parameter kinetika reaksi?

Konsep Dasar Yield

(theoritical yield)

Faktor Yield

Nutrisi yang dibutuhkan Karakteristik produksi

Biaya Produksi

Definisi • Yield merupakan suatu koefisien yang berguna untuk menghubungkan substrat terkonsumsi, sel-sel baru yang dihasilkan, dan produk yang dihasilkan. • Ketika kita mengikutsertakan proses pertumbuhan sel pada perhitungan maka akan menggunakan banyak enzim dan konversi kimia. Meskipun kompleks, prinsip-prinsip yield dapat diterapkan untuk metabolisme yang berkaitan dengan aliran substrat untuk pembentukan biomassa. Yield terkespresikan dengan menggunakan koefisien yield atau faktor yield

Koefisien Yield YFG = faktor yield ΔF = massa yang diproduksi ΔG = massa yang dikonsumsi Pada kultur sel, nilai ΔF dan ΔG dihitung sebagai perbedaan antara nilai awal dan nilai akhir. Nilai ini merepresentasikan sebagai nilai ratarata seluruh yield dari keseluruhan langkah.

Instaneous Yield Yield akan bervariasi pada setiap periode, oleh karena itu selain harus menghitung nilai keseluruhan yield kita juga harus menghitung nilai yield pada titik waktu tertentu.

YFG Sebagai contoh, YXS pada suatu waktu tertentu:

Yxs

Macam-macam Yield X = biomassa S = substrat P = produk C = karbon dioksida (carbon dioxyde) O = oksigen

YXS

YPS

Massa atau mol biomassa yang dihasilkan per satuan massa atau mol substrat dikonsumsi.

Massa atau mol produk yang terbentuk per satuan massa atau mol substrat dikonsumsi.

YPX

Massa atau mol produk yang terbentuk per satuan massa atau mol biomasa terbentuk.

YXO

Massa atau mol biomasa yang terbentuk per satuan massa atau mol oksigen yang dikonsumsi.

YCS

Massa atau mol karbon dioksida yang terbentuk per satuan massa atau mol substrat dikonsumsi.

RQ

Respiratory Quotient. Mol karbon dioksida yang terbentuk per mol dikonsumsi oksigen. Hasil ini disebut hasil bagi pernafasan.

YATP

Massa atau mol biomassa terbentuk per mol ATP terbentuk.

YCAL

Massa atau mol biomassa yang terbentuk per kilo kalori panas yang berkembang selama fermentasi.

Biomass Yield Biomass yield dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti: - komposisi medium - sumber karbon dan nitrogen - pH - temperatur

MW cell = biomass formula-weight ditambah residu catatan: tidak terdapat extracellular product

Grafik

10. Bagaimana anda mengevaluasi proses kultivasi sel, mulai dari pertumbuhan sel, serapan substrat hingga laju produksinya?

Kultivasi Sel • Kultivasi adalah menumbuhkan sel/ bakteri dalam biakan murni • Hal yang perlu diperhatikan untuk mengevaluasi proses kultivasi sel: Laju Pertumbuhan Serapan Substrat Laju Produksi Biomassa

Laju Pertumbuhan Sel  Hal yang perlu diketahui: konsentrasi sel  Metode pengukuran konsentrasi sel:    

Metode pengukuran langsung jumlah sel Metode pengukuran berat kering sel Metode turbidity (tingkat kekeruhan kultur) Metode pengukuran produk yang terbentuk

 Terlepas dari metode di atas, terdapat suatu teknik pengukuran konsentrasi sel, yaitu diferensiasi grafik konsentrasi.

Diferensiasi Grafik Konsentrasi • Berguna untuk -> menyatakan laju pertumbuhan volumetrik (rx) dalam kultur batch.  Ketika rx diketahui, maka laju pertumbuhan spesifik (μ) dapat dihitung dengan membagi rx terhadap konsentrasi sel.

μ = rx /x • Laju volumetrik serapan substrat dan pembentukan produk, rS dan rP, juga dapat dievaluasi dengan metode diferensiasi grafik konsentrasi substrat dan produk.  Ketika rS dan rP diketahui, laju pembentukan produk spesifik qP dan laju serapan substrat spesifik qS dapat diperoleh dengan membagi laju volumetriknya masing-masing terhadap konsentrasi sel.

Diferensiasi Grafik Konsentrasi

Diferensiasi grafik pada sistem kultur batch.

(Sumber: Pauline M. Doran, 2002)

Kinetika Serapan Substrat Sel • Tidak hanya untuk pertumbuhan serta pembentukan (sintesis) produk, penambahan substrat juga ditujukan untuk mengenerasi energi untuk menjaga aktivitas selnya. • Laju spesifik serapan substrat untuk menjaga aktivitas sel dikenal sebagai maintenance coefficient (mS). • Dimensi untuk mS adalah T-1 dengan satuan (kg biomassa)-1s-1. Nilai koefisien ini berbeda pada organisme dan kondisi kulturnya.

Maintenance coefficient beberapa organisme dengan glukosa sebagai energi

(Sumber: Pauline M. Doran, 2002)

Kinetika Serapan Substrat Sel • Persamaan laju serapan substrat sebagai fungsi dari konsentrasi biomassa:

r s = qS x Keterangan: rs = laju volumetrik konsumsi substrat (kgm-3s-1) qS = laju spesifik serapan substrat x = konsentrasi biomassa.

Kinetika Serapan Substrat Sel • Pada kondisi dimana tidak terjadi pembentukan produk, diasumsikan jika seluruh substrat digunakan untuk pertumbuhan dan fungsi pemeliharaan (maintenance), persamaan laju aktivitas selnya adalah:

 Keterangan: rX YXS mS x

= laju volumetrik pembentukan biomassa = yield biomassa dari substrat = maintenance coefficient = konsentrasi biomassa

Kinetika Serapan Substrat Sel • Untuk kondisi dimana terjadi pembentukan substrat yang disertai dengan metabolisme energi, laju konsumsi substrat merupakan fungsi dari 3 faktor, yaitu laju pertumbuhan, laju pembentukan produk, dan laju serapan substrat untuk pemeliharaan (maintenance). Persamaannya, yaitu:

 Keterangan: rS =laju volumetrik konsumsi substrat rP =laju volumetrik pembentukan produk YPS = yield produk dari substrat.

TERIMA KASIH

Daftar Pustaka • Anonim. Inhibition of Enzyme Activity [pdf]. Terdapat pada diakses pada 17 April 2016. • Anonim.2009. Teknik Fermentasi. . [ONLINE]. Diakses pada tanggal 18 April 2016. • Doran, Pauline M., 1995. Bioprocess Engineering Principles. Elsevier Science & Technology Books • Fogler, H. Scott. 2006. Elements of Chemical Reaction Engineering 4th edition. USA: Pearson Education, Inc. • Julianti, Elisa., 2013. Kinetika Pertumbuhan Mikroba [pdf] Terdapat pada diakses pada 17 April 2016