Polymerase Chain Reaction

 

PCR Polymerase Chain Reaction

 

Real-Time PCR

 

Defnisi PCR •

•

•

•

•

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifkasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifk.  eknik ini mampu memperbanyak  eknik memperbanyak sebuah urutan urutan !"#$!"%$kali lipat dari ¨ah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada se'uence yang tidak relean (misalnya dari total DNA genomik). ebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan* urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifkasi* sehingga oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. diperoleh. +al ini tidak perlu tahu apa$apa tentang urutan interening antara primer primer.. produk PCR diamplifkasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil$panas dari hermus a'uaticus (a' (a' DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin$,lmer-Cetus) untuk menempatkan menempatkan reaksi sampai " atau lebih siklus denaturasi* anil primer* dan polimerisasi. etelah amplifkasi dengan PCR* produk ini dipisahkan dengan elektro/oresis gel poliakrilamida dan secara langsung diisualisasikan setelah pe0arnaan dengan bromida etidium.

 

•

•

•

PCR (Polymerase (Polymerase Chain Reaction) Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifkasi) potongan DNA secarain secarain vitro pada daerah spesifk yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersi/at semi konserati/. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer* hanya di dalam tabung reaksi* tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in ( in vivo). vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang ber/ungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA$target (yang akan diamplifkasi) untuk pembentukan molekul DNA D NA baru* enzim DNA polimerase* deoksinukleosida tri/os/at (dNP)* dan sepasanp23 id4more$5657 PCR melibatkan banyak siklus yang masing$masing terdiri dari tiga tahap berurutan* yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat* penempelan (annealing ( annealing)) pasangan primer pada DNA target dan peman&angan (extension (extension)) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase.

 

8,9:NAAN Polyme Polymerase rase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk; •

•

•

•

amplifkasi urutan nukleotida. menentukan kondisi kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi. bidang kedokteran /orensik. melacak asal$usul sesorang dengan membandingkan membandingka n ighty$small ?? ,$5#" ertical gel electrophoresis electrophor esis unit (+oe/er) Perkin$,lmer-Cetus hermal Cycler terile hin$0all ".# ml hermocycler micro/uge micr o/uge tubes; ( (C$#* C$#* >id0est cientifc)

 

R,A9,N 8+:: Pasangan primer oligonukleotida sintetik sintetik mengapit mengapit urutan yang akan akan !. Pasangan diamplifkasi 5. uBer PCR # (5#" (5#" m> 8Cl* 8Cl* #" m> ris$+Cl p+ ** E*# E*# m> >gCl5) . Campuran dari empat empat dNP (d9P* dA dAP* dP* dP* dCP) masing$masing masing$masing sebesar 5*# m> (ultra murni DNP set* Pharmacia F 5E$5"#$"!). DNP campuran dibuat dengan olume !" m> larutan dari masing$masing empat dNP terpisah yang digabung. @. a' DNA Polymerase (Amplia'>* Perkin$,lmer-Cetus) Perkin$,lmer-Cetus) #. >iny >inyak ak mine mineral ral rin ringan gan %. Akrila Akrilamida mida (grad (grade e elektr elektro/or o/oresis) esis) E. N* NG$>ethylenebisacrylamide NG$>ethylenebisacrylamide (grade (grade elektro/oresis* elektro/oresis* :ltra$Pure:ltra$Pure-RH* RH* F ##!%:) . Amonium Amonium persul/at persul/at (:ltra$P (:ltra$Pure ure-RH* -RH* F ##5:A) ##5:A) 6. ,>,D (N* N* NGN I Ietramethylethylened etramethylethylenediamine* iamine* :ltra$>urni :ltra$>urni - RH* F ##5@:)

 

8J>PJ?? PCR HA?NNKA •

•

1) Enzim DNA Polymerase Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragmen DNA Polimerase ! selama reaksi "olimerisasinya# "olimerisas inya# Enzime ini ernyaa idak akif se$ara ermal selama "roses denaurasi, sehingga "enelii harus menam%ahkan enzim di seia" siklusnya# &elain iu, enzim ini hanya %isa di"akai unuk "er"anjangan '(( %" dan hasilnya menjadi kurang s"esik# *nuk mengaasi kekurangan erse%u, dalam "erkem%angannya kemudian di"akai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keakifan "ada suhu inggi# leh karenanya, "enam%ahan enzim idak "erlu dilakukan di seia" siklusnya, dan "roses PCR da"a dilakukan dalam sau mesin

•

•

') Primer Primer meru"akan oligonukleoida oligonukleoida "endek ranai unggal yang mem"unyai uruan kom"leme kom"lemen n dengan DNA em"la yang akan di"er%anyak# Panjang "rimer %erkisar anara '(-.( %asa# *nuk meran$ang uruan "rimer, "erlu dikeahui uruannukleoida "ada awal dan akhir DNA arge# Primer oligonukleoida oligonukleoida di sinesis menggunakan suau ala yang dise%u DNA synthesizer #

•

•

.) Reagen lainnya &elain enzim dan "rimer, erda"a juga kom"onen lain yang iku menenukan ke%erhasilan reaksi PCR# Kom"onen erse%u adalah dN/P unuk reaksi "olimerisasi, dan %u0er yang mengandung gCl5# Konsenrasi ion g5Ldalam $am"uran reaksi meru"akan hal yang sanga kriis# Konsenrasi ion g 5L ini sanga mem"engaruhi "roses "rimer annealing, denaurasi, s"esisias "roduk, aki2ias enzim dan delias reaksi#

 

 A+AP   A+APAN AN PCR •

•

•

1) Denaturasi

&elama "roses denaurasi, DNA unai ganda akan mem%uka menjadi dua unai unggal# 3al ini dise%a%kan karena suhu denaurasi yang inggi menye%a%kan "uusnya ikaan hidrogen dianara %asa-%asa yang kom"lemen# Pada aha" ini, seluruh reaksi enzim idak %erjalan, misalnya reaksi "olimerisasi "ada siklus yang se%elumnya# Denaurasi %iasanya dilakukan anara suhu 4( oC 5 46 oC# 2) Penempelan primer

•

Pada aha" "enem"elan ), "rimer menujuini, daerah s"esik yang kom"lemen dengan"rimer uruan7 annealing "rimer# Pada "rosesakan ikaanyang hidrogen annealing akan er%enuk anara "rimer dengan uruan kom"lemen "ada em"lae# Proses ini %iasanya dilakukan "ada suhu 6( oC 5 8( oC# &elanjunya, DNA "olymerase akan %erikaan sehingga ikaan hidrogen erse%u akan menjadi sanga kua dan idak akan o

"uus kem%ali a"a%ila dilakukan reaksi "olimerisasi selanjunya, misalnya "ada 9' C#

 

 A+AP   A+APAN AN PCR •

•

•

3) Reaksi polimerisasi  extension) *mumnya, reaksi "olimerisasi aau "er"anjangan ranai ini, erjadi "ada suhu 9' oC# Primer yang elah menem"el adi akan mengalami "er"anjangan "ada sisi .:nya . :nya dengan "enam%ahan dN/P yang kom"lemen dengan em"la oleh DNA "olimerase#  ;ika siklus dilakukan %erulang-ulang maka maka daerah yang di%aasi oleh dua "rimer "rimer akan diam"likasi se$ara eks"onensial 7dise%u am"likon yang %eru"a unai ganda), sehingga men$a"ai jumlah $o"y yang da"a dirumuskan dengan 7'n)