PIGMEN Daun

PIGMEN-PIGMEN DALAM KLOROPLAS

LAPORAN PRAKTIKUM untuk memenuhi tugas mata kuliah Fisiologi Tumbuhan yang dibimbing oleh Prof., Dra. Herawati Susilo, M.Sc., Ph.D. dan Balqis, M.Si.

Offering B Kelompok 5 Astrid Amalia H.P. 130341603390 Dinar Valentin Dyah A.M.P.P 130341614791 Imroatun Hasana 130341614818 Maria Fransisca 130341603387 Sri Wahyuni Umar Lepaleng 130341603398

UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI Oktober 2014

A. Topik

: Pigmen-Pigmen dalam Kloroplas

B. Tujuan

:

Mahasiswa diharapkan terampil : 1. Mengekstrak pigmen-pigmen yang terdapat dalam kloroplas 2. Mengidentifikasi pigmen-pigmen yang terdapat dalam kloroplas 3. Mengidentifikasi pigmen yang terdapat pada tumbuhan yang diamati C. Dasar Teori Klorofil adalah pigmen hijau yang ada dalam kloroplastida. Pada umumnya klorofil terdapat pada kloroplas sel-sel mesofil daun, yaitu pada selsel parenkim palisade dan atau parenkim bunga karang. Dalam kloroplas, klorofil terdapat pada membrane thylakoid grana. Pada tumbuhan tingkat tinggi terdapat dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b. Pada keadaan normal, proporsi klorofil-a jauh lebih banyak daripada klorofil-b. Selain klorofil, pada membran tilakoid juga terdapat pigmen-pigmen lain, baik yang berupa turunan-turunan klorofil-a maupun pigmen lainnya (Campbell,1999). Kumpulan bermacam-macam pigmen fotosintesis disebut fotosistem, berperan menyerap energi cahaya (foton, kuantum) pada reaksi terang untuk menghasilkan energi kimia berupa ATP dan NADPH 2. Contoh turunan klorofil a yang berperan penting pada fotosintesis adalah feofitin (kloforil-a yang kehilangan inti Mg, menjadi salah satu komponen fotosintem II), pigmen yang peka terhadap λ 680 nm (P680 = sebagai pusat reaksi fotosistem II) , dan P700 (menjadi pusat reaksi fotosintem I). Pigmen yang lain antara lain carotenoida dan Xantofil (Taiz dan Zeiger, 1991). Pigmen daun dapat dideterminasi secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kualitatif, macam pigmen daun dapat dideteksi dengan metode kromatografi. Ada beberapa macam teknik kromatografi, dari teknik yang sederhana sampai teknik modern. Teknik sederhana dapat dilakukan dengan Kromatografi Kertas (KKt) dengan menggunakan kertas Watmann 3. Kromatografi yang lebih maju dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT), yaitu dengan silika gel pada pelat alumenium/ plastik. Untuk zat yang mudah menguap dilakaukan dengan teknik Kromatografi Gas. Teknik lain adalah dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Salisbury dan Ross, 1985). Deteksi

cara sederhana terhadap macam pigmen daun dengan teknik kromatografi kertas pada dasarnya melakukan pemisahan zat dengan menggunakan larutan pengembang (eluen) yaitu campuran pelarut organik dengan perbandingan tertentu yang sesuai sesuai sifat zat dalam ekstrak pigmen daun yang hendak dipisahkan. Setelah ekstrak pigmen daun yang ditotolkan pada kertas Watmann 3 dicelupkan dalam larutan pengembang dalam bejana tertutup yang jenuh uap larutan pegembang, zat yang paling larut akan merambat dengan lebih cepat pada kertas Watmann, begitu pula sebaliknya. Karena itu akan diperoleh jarak rambat golongan zat yang satu dengan golongan zat lain yang berbeda tingkat kelarutannya dalam larutan pengembang (Salisbury dan Ross, 1985). Tim Pengampu Fisiologi Tumbuhan (2010), menyatakan bahwa adanya perbedaan kelarutan macam pigmen dalam eluat pada saat elusi menyebabkan terjadinya pemisahan komponen-komponennya. Pigmen yang mempunyai kelarutan paling tinggi akan mengikuti eluat sampai jarak yang paling jauh. Selama pergerakan bersama fase gerak, solute (pigmen) akan dihambat oleh fase diam sebab solute berada dalam fase gerak tetapi juga sering berada dalam fase diam. Besar hambatannya tersebut dinyatakan dengan nilai Rf (Retardation Factor), dengan rumus :

Keterangan:

ds = jarak yang ditempuh senyawa (solute) de = jarak yang ditempuh eluat

Menurut Harborne (1984), nilai Rf standar untuk beberapa pigmen diantaranya :

Macam pigmen Feofitin a Feofitin b Klorofil a Klorofil b Feoforbida a Feoforbida b Klorofilida a Klorofilida b

Rf 0,93 0,80 0,60 0,35 0,18 0,07 0,03 0,02

Warna dibawah cahaya biasa Kelabu Coklat kekuningan Hijau biru Hijau kuning Kelabu Coklat kuning Hijau biru Hijau kuning

Bentuk senyawa jadian Klorofil bebas Mg

Klorofilida bebas Mg Klorofliida tanpa rantai samping fitil

D. Alat dan Bahan a. Alat: 1. Mortar dan pistil 2. Corong 3. Gelas piala 4. Aseton 5. Gelas Arloji 6. Kertas Saring

b. Bahan: 1. Daun Kersen (Muntingia calabura L.) 2. Daun Penitian Merah (Duranta erecta L.) 3. Daun Pucuk Merah (Syzygium oleana)

7. Pipa Kapiler

4. Daun Racunan (Euphorbia

8. Gelas Ukur

pulcherrima Willd. Et

9. Kertas Kromatografi

Klotzsch)

10. Corong pisah

5. Daun Nyctagina sp.

11. Pipet

6. Aquades

12. Tabung reaksi+sumbat gabus

7. Petroleum Eter

13. Rak tabung

8. Aseton

E. Cara Kerja 1. Membuat campuran eluat 1 ml Aseton + 1 ml Petroleum Eter

-

Dimasukkan pada tabung reaksi Dikocok sampai homogen

Larutan Eluat -

Diambil 1 ml Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditutup dengan rapat agar tabung jenuh

Hasil

2. Membuat pasta klorofil 5 gram daun -

Digerus dalam mortar sampai halus

-

Ditambahkan sekitar 30 ml aseton

-

Disaring ke dalam corong pemisah

-

Ditambah 10 ml pertroleum eter

-

Dikocok

-

Ditambahkan 10 ml petroleum eter dan 10-15 ml akuades

-

Dikocok dan didiamkan sampai memisah

-

Dikeluarkan air dari kran bawah

-

Diulangi penambahan air (pencucian) 3-4 kali sampai tidak berbau aseton

-

Dikeluarkan larutan pigmen dari mulut corong pisah

-

Dituangkan pada gelas arloji

-

Dibiarkan menguap Hasil

3. Mengukur jarak yang ditempuh eluat (ds) Kertas kromatografi

-

Diberi garis dengan jarak 1 cm dari ujung menggunakan pensil

-

Diberi garis 12 cm dari garis pertama

-

Dibuat spot pigmen dan dibiarkan hingga spot kering

-

Dimasukkan pada tabung reaksi yang jenuh eluat

Kertas kromatografi pada tabung reaksi -

Diletakkan pada rak tabung

-

Dibiarkan eluat bergerak pada kertas tersebut

-

Dihentikan elusi apabila sudah mencapai garis batas atas

-

Diambil kertas dan diangin-anginkan sebentar

-

Diamati warna yang terbentuk pada kertas kromatografi

-

Dihitung masing-masing Rf-nya

Hasil

F. Data Pengamatan Kelompok

Daun

Warna

de

ds

Rf

1

Kersen (Muntingia calabura L.)

Hijau muda

12 cm

6,5 cm

0,542

Hijau tua/ hijau 12 cm kebiruan

8,5 cm

0,708

Hijau kuning/ kuning muda

12 cm

10,5 cm 0,875

Hijau Kuning/ kuning tua

12 cm

11,9 cm 0,992

Penitian Merah (Duranta erecta L.)

Hijau

12 cm

0,58 cm 0,048

Kuning

12 cm

1 cm

0,083

3

Pucuk Merah (Syzygium oleana)

Kuning

9,5 cm

5 cm

0,526

4

Racunan (Euphorbia pulcherrima Willd. Et Klotzsch)

Kelabu

7,6 cm

0,7 cm

0,092

Hijau kuning

7,6 cm

4 cm

0,526

Penitian Merah (Duranta erecta L.)

Hijau kuning

12 cm

9,9 cm

0,825

Kelabu

12 cm

0,5 cm

0,042

Coklat kuning

12 cm

1,6 cm

0,133

Hijau

9,3 cm

2 cm

0,215

Kuning

9,3 cm

3,2 cm

0,344

2

5

6

Nyctagina sp.

G. Analisis Data Untuk mengetahui nilai dari besarnya hambatan solute oleh fase diam yaitu dengan menggunakan rumus

Keterangan: Rf = Nilai hambatan (Retardation Factor) ds = jarak yang ditempuh senyawa (solut) de = Jrak yang ditempuh eluat

a. Kersen (Muntingia calabura L.) -

Hijau muda

= 6,5/12 = 0,542 -

Hijau tua/ hijau kebiruan

= 8,5/12 = 0,708 -

Hijau kuning / kuning muda

= 10,5/12 = 0,875 -

Hijau Kuning / kuning tua

= 11,9/12 = 0,992 b. Penitian Merah (Duranta erecta L.) -

Hijau

= 0,58/12 = 0,048 -

Kuning

= 1/12 = 0,083 c. Pucuk Merah (Syzygium oleana) -

Kuning

= 5/9,5 = 0,526

d. Racunan (Euphorbia pulcherrima Willd. Et Klotzsch) -

Kelabu

= 0,7/7,6 = 0,092 -

Hijau kuning

= 4/ 7,6 = 0,526

e. Penitian Merah (Duranta erecta L.) - Kuning

= 9,9/12 = 0,825 -

Kelabu

= 0,5/12 = 0,042 -

Coklat kuning

= 1,6/12= 0,133 f. Nyctagina sp. -

Hijau

= 2/9,3 = 0,215 -

Kuning

= 3,2/9,3 = 0,344 Kersen (Muntingia calabura L.) memiliki nilai Rf 0,542, berdasarkan literatur macam pigmen yang terkandung yaitu Klorofil a dengan warna dibawah cahaya matahari hijau biru. Nilai Rf berikutnya

yaitu 0,708, berdasarkan literatur macam pigmen yang mendekati nilai Rf tersebut yaitu Feoftin b dengan warna dibawah cahaya biasa coklat kekuningan. Nilai Rf selanjutnya yaitu 0,875 dan jika dibandingkan dengan literatur maka macam pigmen yang paling mendekati yaitu Feofitin a dengan warna dibawah cahaya biasa yaitu kelabu. Nilai Rf terakhir yaitu 0,992 dan jika dibandingkan dengan literatur maka macam pigmen yang mendekati Rf tersebut yaitu Feofitin a dengan warna dibawah cahaya biasa yaitu kelabu. Berdasarkan pengamatan tersebut maka M. calabura mengandung pigmen Klorofil a, Feoftin b, dan Feofitin a. Penitian Merah (Duranta erecta L.) memiliki nilai Rf 0,048, berdasarkan literatur maka macam pigmen yang terkandung yaitu klorofilida b dengan warna dibawah cahaya biasa hijau kuning. Sedangkan nilai Rf berikutnya yaitu 0,083 yang juga termasuk klorofilidia b. Berdasarkan hal tersebut pada D. erecta hanya mengandung satu macam klorofil yaitu Klorofida b. Pucuk Merah (Syzygium oleana) pada kelompok 2 memiliki nilai Rf 0,526, jika dibandingkan dengan literatur macam pigmen yang sesuai (mendekati) dengan Rf tersebut yaitu klorofil a dengan warna dibawah cahaya biasa hijau biru. Berdasarkan hal tersebut, maka S. oleana mengandung pigmen klorofil a. Racunan (Euphorbia pulcherrima Willd. Et Klotzsch) memiliki niai Rf 0,092, berdasarkan literatur, macam pigmen yang mendekati dengan Rf tersebut yaitu Feoforbidia b dengan warna dibawah cahaya biasa coklat kuning. Nilai Rf yang selanjutnya yaitu 0,526 dan jika dibandingkan dengan literatur mendekati nilai Rf dari pigmen klorofil a dengan warna dibawah cahaya biasa hijau biru. Berdasarkan data tersebut maka E. pulcherrima memiiki dua macam klorofil yaitu Feoforidia b dan klorofil a. Penitian Merah (Duranta erecta L.) pada kelompok 5 memiliki nilai Rf 0,825 dan jika dibandingkan dengan literatur mendekati nilai Rf dari pigmen Feofitin b dengan warna dibawah cahaya biasa coklat

kekuningan. Nilai Rf berikutnya yaitu 0,042 yang mendekati nilai Rf dari klorofilidia a dengan warna dibawah cahaya biasa hijau biru. Nilai Rf lainnya yaitu 0,133 dan mendekati nilai Rf dari pigmen Feoforbidia a dengan warna dibawah cahaya biasa kelabu. Erdasarkan data tersebut maka D. erecta memiliki pigmen Feofitin b, Klorofidia a, dan Feoforbidia a. Nyctagina sp. memiliki nilai Rf 0,215 dan jika dibandingkan dengan literatur mendekati nilai Rf dari Feoforbidia a dengan warna dibawah cahaya biasa kelabu. Sedangkan Rf berikutnya yaitu 0,344, nilai Rf tersebut mendekati nilai Rf dari pigmen klorofil b dengan warna dibawah cahaya biasa hijau kuning.

Berdasarkan data tersebut maka

Nyctagina sp memiliki pigmen Feoforbidia b dan Klorofil b. Berdasarkan analisis diatas ternyata warna yang dihasilkan kurang sesuai dengan warna yang tertera pada literatur. Hal tersebut dapat terjadi karena kesalahan dalam mengamati warna yang dihasilkan. Ketidaktepatan tersebut juga mungkin dipengaruhi oleh keterbatasan alat. Mungkin dalam pengamatan warna dibutuhkan suatu alat atau metode yang mungkin dapat memunculkan warna yang sebenarnya. Mungkin warna tersebut tersembunyi dan tidak dapat dilihat secara langsung. Pada pemisahan pigmen digunakan eluat tertentu. Ruang eluat harus dijenuhkan dahulu dengan tutup gabus samapi tabung jenuh hal ini dikarenakan agar eluat mudah menguap. Lalu saat kertas kromatrografi dimasukan kedalam tabung reaksi yang berisi spot jangan sampai spot tersentuh eluat karena jika tersetuh eluat tidak terjadi pemisahan– pemisahan pigmen karena spot akan larut di dalam eluat.

H. Pembahasan Pada pengamatan macam pigmen pada suatu daun menggunakan teknik kromatografi kertas. Berdasarkan prinsipnya, zat yang paling larut akan merambat dengan lebih cepat pada kertas Watmann, begitu pula sebaliknya. Karena itu akan diperoleh jarak rambat golongan zat yang satu dengan golongan zat lain yang berbeda tingkat kelarutannya dalam larutan

pengembang (Suyitno, 2008). Pada praktikum ini tidak ditemukan nilai Rf yang tidak tepat dengan literatur jadi diambil niai Rf dari literatur yang terdekat dengan nilai Rf yang temukan. Disamping itu warna yang dicantumkan berdasarkan pengamatan tidak sesuai dengan literatur. Sebagian jenis pigmen tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Karena itu kadang membutuhkan alat bantu berupa penyemprot bercak supaya memberikan reaksi warna tertentu, dan kadang hanya akan terlihat di bawah sinar UV (Suyitno, 2008). Berdasarkan pernyataan tersebut, pengamatan langsung warna yang dihasilkan pada kertas kromatografi kurang efektif dalam menentukan warna dari rentang Rf tertentu. Muntingia calabura memiliki daun yang berwarna hijau, Duranta erecta memiliki daun dengan warna merah keunguan, Syzygium oleana daunnya berwarna merah, Euphorbia pulcherrima berwarna merah bela, dan Nyctagina sp. daunnya berwarna kuning. Berdasarkan perbedaan warna tersebut bisa diidentifikasi bahwa kandungan jenis klorofil pada masingmasing tanaman tersebut berbeda sehingga menghasilkan warna daun yang berbeda. Jenis klorofil tersebut bisa diidentifikasi dengan menggunakan kertas kromatografi. Kromatografi kertas merupakan teknik untuk memisahkan senyawa senyawa tertentu sesuai dengan tingkat kelarutannya pada suatu pelarut. Pada pengamatan macam pigmen pada suatu daun menggunakan teknik kromatografi kertas. Berdasarkan prinsipnya, zat yang paling larut akan merambat dengan lebih cepat pada kertas Watmann, begitu pula sebaliknya. Karena itu akan diperoleh jarak rambat golongan zat yang satu dengan golongan zat lain yang berbeda tingkat kelarutannya dalam larutan pengembang (Suyitno, 2008). Berdasarkan prinsip tersebut dapat diketahui kandungan jenis klorofil pada daun yang berbeda warna. Perbedaan warna tersebut diakibatkan oleh berbedanya kandungan jenis klorofil. Klorofil bersifat labil terhadap cahaya, suhu, dan oksigen sehingga mudah terdegradasi menjadi molekul-molekul turunannya. Molekul hasil degradasi atom Mg dari klorofil adalah feofitin dan molekul hasil degradasi rantai ekor fitol klorofil adalah klorofilida, sedangkan feoforbida terjadi ketika

klorofil telah terdegradasi atom Mg serta rantai ekor fitolnya (Arrohmah, 2007).

I. Kesimpulan Kesimpulan berdasarkan pembahasan tersebut yaitu 1. Pembuatan ekstrak dengan cara digerus untuk diambil ekstraknya yang dilanjutkan dengan

proses pencucian untuk memperoleh pigmen dan

penguapan untuk mendapatkan pasta klorofil. Pelarut yang digunakan yaitu aseton dan petroleum eter. 2. Proses mengidentifikasi jenis pigmen dilakukan dengan melakukan perhitungan nilai Rf dan hasilnya dibandingkan dengan literatur. 3. M. calabura mengandung pigmen Klorofil a, Feoftin b, dan Feofitin a, S. oleana mengandung pigmen klorofil a, E. pulcherrima memiiki dua macam klorofil yaitu Feoforidia b dan klorofil a, D. erecta memiliki pigmen Feofitin b, Klorofidia a, dan Feoforbidia a sedangkan pada kelompok 2 mengandung Klorofidia b, dan Nyctagina sp memiliki pigmen Feoforbidia b dan Klorofil b. J. Diskusi a. Mengapa ruang elusi harus dijenuhkan dahulu dengan eluat? Jawab: Kondisi ruangan yang jenuh dengan eluat akan mempermudah perambatan zat-zat warna dalam kertas Whatman. Penjenuhan ruang elusi bertujuan untuk memperkecil penguapan pelarut dan akan menghasilkan bercak lebih bundar dan lebih baik. b. Mengapa eluat tidak boleh menyentuh spot pada saat awal elusi? Jawab: Saat awal elusi, spot tidak diperbolehkan menyentuh larutan eluat. Hal ini disebabkan karena pigmen-pigmen dalam spot tadi sangat mudah larut dalam larutan eluat, sehingga ketika spot menyentuh larutan eluat, kemungkinan pigmen-pigmen justru bergerak ke arah eluat di bawah tabung, sehingga perambatan pigmen-pigmen tidak akan terjadi secara maksimal. c. Uraikan secara rinci jika saudara memperoleh harga Rf yang tidak dapat dibandingkan dengan literature!

Jawab: Harga Rf yang tidak dapat dibandingkan dengan literature mungkin dapat disebabkan karena d. Bandingkan hasilnya dengan pengukuran teman saudara yang lain. Bagaimana hasilnya? Jawab : e.

Masalah-masalah apa saja yang saudara jumpai dalam kegiatan pengamatan ini? 1. Penguapan larutan pigmen berjalan sangat lambat 2. Proses pemisahan pigmen yang berlangsung lama karena dihasilkan pigmen yang banyak 3. Keterbatasan peralatan yang digunakan sehingga proses ekstraksi berlangsung lama

K. Daftar Pustaka Arrohmah. 2007. Studi Karakteristik Klorofil pada Daun Sebagai Material Photodetector Organic. (Online), (http://core.kmi.open.ac.uk/download/pdf/11703559.pdf, diakses tanggal 6 Oktober 2014). Campbell, Neil A.; Jane B. Reece and Lawrence G.Mitchell. 1999. Biology. California: Addison-Wesley, Inc. Harborne. J.B., 1984. Metode Fitokimia. Bandung: Penerbit ITB. Salisbury, F.B. and C.W. Ross. 1985. Plant Physiology. USA: Wadsworth Publ.Comp. Inc. Suyitno, 2008. Klorofil dan Pigmen Fotosintesis. (Online), (http://staff.uny.ac.id/sites/default/files/pengabdian/suyitno-aloysiusdrs-ms/modul-praktikum-analaisis-klorofil.pdf, diakses tanggal 5 Oktober 2014). Taiz, Lincoln and Eduardo Zeiger. 1991. Plant Physiology. California: The Benjamin/ Cummings Publ.Comp.Inc. Tim Pengampu Fisiologi Tumbuhan. 2010. Petunjuk Praktikum Fisiologi Tumbuhan. Malang: Universitas Negeri Malang.