Pewarnaan Gram

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PEWARNAAN GRAM

Oleh : Kelompok 2 1. Erfitra Rezqi P

2073414120

2. Evi Ayu Candra

2073414120

3. Jihan Mawaddah

207341412048

4. Rina Dwi A

207341412049

UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI Februari 2010

BAB I PENDAHULUAN a. Latar Belakang Pengamatan bentuk dan ukuran sel bakteri akan tampak jelas jika dilakukan pewarnaan terhadap sel. Metode pewarnaan sel bakteri ini pertama kali dikembangkan oleh Christian Gram pada tahun 1884 yaitu seorang ahli bakteriologi Denmark. Dia mengembangkan prosedur pewarnaan ini selagi mencari suatu metode untuk memperlihatkan bakteri pneumokokus pada jaringan paru-paru pasien yang mati karena pneumonia. Selain itu dia melihat bahwa beberapa spesies bakteri dapat dibedakan dengan prosedur pewarnaan ini. Pewarnaan gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Terutama amat berarti dii laborotarium diagnostic rumah sakit karena informasi yang diperoleh dari pengamatan specimen yang diwarnai dengan pewarnaan gram dengan cepat dapat memberi petunjuk akan organisme penyebab suatu infeksi. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang membedakan bakteri dalam dua kelompok yaitu bakteri Gram positif yang mengikat zat warna pertama, dan bakteri Gram negative yang melepas zat warna pertama dan mengikat zat warna kedua. Ada dua teknik untuk membkukan prosedur warna Gram yang hasilnya setara ialah teknik Hucker dan teknik Burke. Teknik Burke dalam prosedur ini dikenakan pada sel bakteri yang telah difiksasi, hasil pewarnaan pada bakteri Gram positif berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram negative berwarna merah. b. Tujuan a. Agar mahasiswa dapat melakukan pewarnaan Gram b. Agar mahasiswa dapat mengidentifikasi bakteri biakan, berdasarkan sifat pewarnaan Gram c. Dasar Teori Mikroba adalah prokariot dengan dinding sel yang terdiri dari struktur khusus yang disebut dengan peptidoglikan. Struktur ini mempunyai mekanisme

tertentu dalam hal penyerapan bahan-bahan dari lingkungan di luar, termasuk zat warna gram. Zat pewarna adalah garam yang terdiri dari atas ion positif dan ion negatif, salah satu diantaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna itu berada pada ion positif (yaitu zat pewarna+ Cl-), sedangkan pada zat pewarna asam warna itu pada ion negatif (yaitu Na+ dan zat pewarna-). Hubungan bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. Lembayung kristal, safranin, dan biru metilen adalah beberapa zat pewarna basa yang lazim dipakai. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai olesan bakteri dengan zat pewarna asam menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna, teknik ini sangat berguna untuk mengamati bentuk keseluruhan sel yang sangat kecil. Proses pewarnaan ini disebut pewarnaan negatif. Perbedaan tebal tipisnya struktur peptidoglikan menentukan mekanisme yang spesifik terhadap penyerapan zat warna. Sifat ini dipergunakan untuk membantu identifikasi suatu bakteri, sehingga dikenal adanya bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan dalam hal penyerapan zat warna ini, juga menghasilkan perbedaan-perbedaan atau ciri-ciri yang lain yang sangat berbeda, misalnya sifat patogenitas, dan sebagainya. d. Alat dan Bahan a. Biakan murni bakteri dalam media agar lempeng yang berumur 3x24 jam b. Lampu spirirtus c. Kaca Benda d. Reagen pewarna gram e. Prosedur

1. Menyiapkan kaca benda bersih, kemudian dipanaskan di atas nyala api spiritus dengan menggunakan pinset, kemudian dibiarkan dingin dengan cara meletakkannya di atas kertas tissue. 2. Meneteskan akuades steril 1 kolong jarum inokulasi. 3. Mengambil bakteri dari biakan murni dengan menggunakan akuades dan meratakannya sebanyak satu ujung jarum, kemudian diletakkan pada akuades dan diratakan menggunakan ujung kawat inokulasi. 4. Membiarkan sediaan bakteri mengering sendiri, hal ini berarti kita telah membuat sediaan bakteri secara olesan kering udara. 5. Melakukan fiksasi dengan panas, caranya dengan melewatkan sediaan di atas api lampu spirirtus. 6. Melakukan pewarnaan dengan menggenangi sediaan dengan menggunakan reagen ammonium oksalat kristal violet selama 1 menit. 7. Membilas dengan air kran yang mengalir perlahan, kemudian dikeringkan dengan menekankan kertas hisap. 8. Menggenangi sediaan di dalam etanol 95% selama 1 menit sambil menggoyang-goyangkan dan kemudia ditekan dengan kertas penghisap. 9. Menggenangi sediaan dengan pewarna safranin selama 30 detik. Kemudian dibilas dengan air kran sampai tidak tampak lagi adanya warna di dalam air bilasan, kemudian dikeringkan dengan kertas penghisap. 10. Mengamati sediaan yang telah kering di bawah lensa mikroskop, mula-mula dengan perbesaran lemah, kemudian dilanjutkan dengan pembesaran kuat.

BAB II DATA DAN PEMBAHASAN a. Data Pengamatan Ciri Warna

Koloni 1 Kuning pucat

Koloni 2 Putih

•

•

Bentuk Tepi Elevasi Kepekatan Diameter Jumlah

Bundar dgn tepian timbul Licin seperti tombol Pekat 3 mm

Bundar Licin seperti tombol Pekat 4 mm

koloni Permukaan Bentuk sel

2 Mengkilat coccus

3 Mengkilat coccus

Pewarnaan Gram : -

Koloni 1 : ungu (positif) ~> bentuk sel = coccus

-

Koloni 2 : ungu (positif) ~> bentuk sel = coccus

Pengukuran sel bakteri : -

Perbesaran 10x10 : 10 skala m.o = 10 skala “

= 0,001 mm

1 skala okuler = 0,01 mm/10 = 0,01 mm = 10 μm -

Perbesaran 40x10 : 4 skala m.okuler = 1 skala m.objek = 0,01 mm 1 skala

= 0,01/4 = 2,5 μm

-

Perbesaran 100x10 = 1 = 0,01 mm 1 skala ok

= 10 = 0,01/10 = 0,1 mm

1 skala ok * Koloni 1 :

= 0,1 μm

- U1 = 2,5 μm - U2 = 2 μm - U3 = 2,3 μm rata2 = 2,3 μm * Koloni 2 : - U1 = 2,75 μm - U2 = 2,6 μm - U3 = 2,5 μm - rata2 = 2,62 μm

b. Pembahasan Pewarnaan Gram atau metode Gram merupakan suatu metode atau teknik pewarnaan diferensial yang penting untuk membedakan atau mencirikan bakteri. Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi diberi larutan tertentu yaitu ungu kristal, iodium, alkohol dan safranin. Bakteri yang sudah diberi warna dengan menggunakan metode pewarnaan ini dapat dibedakan menjadi dua kelompok yaitu gram positif dan gram negatif. Berdasarkan praktikum yang telah kami lakukan diketahui bahwa baik koloni satu maupun koloni dua yang diambil dari hasil biakan pada media lempeng merupakan gram positif. Ini didasarkan pada hasil akhir pewarnaan yang menghasilkan warna ungu. Hal tersebut dikarenakan zat pewarna lembayung dan iodine membentuk senyawa kompleks. Pada beberapa marga, bakteri melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci menggunakan alcohol dan zat pewarna akan tetap bertahan pada bakteri yang lain. Ini dimungkinkan karena antara gram positif dan gram negatif memiliki perbedaan yang mendasar dalam hal ketebalan dinding selnya. Pada bakteri positif atau gram positif dinding selnya memiliki struktur yang lebih tebal sehingga tetap berwarna ungu, sedangkan pada gram negative memiliki struktur dinding sel yang lebih tipis sehingga warnanya akan pudar ketika dicuci dengan alkohol.

Selanjutnya, penambahan safranin berguna sebagai pewarna pada pengamatan bakteri ini. Hal ini terkait dengan hubungan antara bakteri dan zat pewarna basa yang menonjol yang disebabkan asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel bakteri. Jadi, jika bakteri diberi warna, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif dalam zat pewarna basa. Sebaliknya, zat pewarna asam akan ditolak oleh muatan negative bakteri secara menyeluruh. Jadi, ketika bakteri diolesi dengan zat pewarna, asam akan menghasilkan pewarnaan pada daerah latar belakang saja.

BAB III PENUTUP a. Diskusi 1. Bagaimana mekanisme penyerapan warna gram pada bakteri? 2. Sifat apalagi, selain kemampuan menyerap warna gram yang ditemukan pada bakteri gram positif dan negatif? Jawab : 1. Mekanisme penyerapan warna gram pada bakteri : Pada dasarnya dinding sel bakteri golongan gram negatif umumnya lebih tipis dari dinding sel bakteri golongan gram positif. Yang pertama mengandung presentasi lipid (lemak) yang lebih banyak daripada yang dimiliki dinding sel bakteri golongan gram positif. Selama perlakuan dengan alkohol ternyata lemak ini tertarik ke luar sehingga memperbanyak porositas/menaikkan permeabilitas dinding sel, akibatnya kristal violet iodin keluar dan bakteri tidak berwarna. Pada bakteri golongan gram positif yang dinding selnya sedikit mengandung lemak akan mengalami dehidrasi karena perlakuan dengan alkohol sehingga ukuran pori-pori dan permeabilitas dinding sel berkurang dan CV-1 tidak tercuci. Beberapa marga bakteri melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci ; pada bakteri lain, zat pewarna tetap bertahan walau cuci dengan alkohol 95 persen. Organisme yang tidak dapat menahan zat pewarna telah

dicuci dengan alkohol 95% disebut organisme Gram-negatif ; sedangkan yang dapat menahan zat pewarna disebut gram-positif. 2. Sifat-sifat yang dimiliki bakteri gram positif dan negatif selain kemampuan menyerap warna : - Kebanyakan bakteri gram-positif mudah dimatikan oleh penisilin, gramisidin, atau lembayung gentian berkadar rendah, sedangkan bakteri gram-negatif lebih tahan terhadap senyawa-senyawa tersebut diatas, namun cukup peka terhadap streptomisin.

b. Kesimpulan Dari praktikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan sebagai berikut : -

Organisme yang tidak dapat menahan zat pewarna setelah dicuci dengan alkohol 95% disebut organisme gram negatif. Dimana indikasinya menunjukkan warna merah pada bakteri itu sendiri.

-

Organisme yang yang dapat menahan zat pewarna setelah dicuci dengan alkohol 95% disebut organisme gram positif. Dimana indikasinya menunjukkan warna ungu pada bakteri itu sendiri.

DAFTAR PUSTAKA Volk,A.Wesley; Adisoemarto, S(editor). 1984. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Gelora Aksara Pratama Erlangga. Pelczar, Michael; Siri Ratna,dkk (penerjemah). 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Penerbit Universitas Indonesia.

LAMPIRAN Koloni 1 :

Koloni 2 :