Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

I.

Tujuan Menentukan kadar protein dalam sampel putih telur ayam ras dengan metoda Lowry.

II.

Prinsip Reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh asam amino aromatik dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan Fosfotungsat dan Fosfomolibdat dalam reagen Fenol membentuk warna biru sehingga dapat menyerap cahaya dan dapat diamati secara spektrofotometri.

III. Teori Pendahuluan Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalendalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai ke-20 asam amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein yang mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini organisme yang berbeda dapat membuat produk-produk yang demikian bervariasi, seperti enzim, hormon, lensa protein pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan sebagainya.

Protein yang ditemukan kadang-kadang berkonjugasi dengan makromolekul atau mikromolekul seperti lipid, polisakarida dan mungkin fosfat. Protein terkonjugasi yang dikenal antara lain nukleoprotein, fosfoprotein, metaloprotein, lipoprotein, flavoprotein dan glikoprotein. Protein yang diperlukan organisme dapat diklasifikasikan menjadi dua golongan utama, yang pertama adalah protein sederhana yaitu protein yang apabila terhidrolisis hanya menghasilkan asam amino dan protein terkonjugasi, yaitu protein 1

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

yang hidrolisis tidak hanya menghasilkan asam amino tetapi menghasilkan juga komponen anorganik yang disebut ”gugus prostetic”.

Langkah awal dalam pemurnian protein ialah menentukan bahan alam yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang ada didalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein yang tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan dimurnikan. Bila protein yang diinginkan tahan terhadap panas, campuran protein dapat dipanaskan sebentar untuk mengendapkan protein lain yang diinginkan. Disamping itu protein juga sensitif terhadap asam dan basa dengan konsentrasi tinggi, dan biasanya pemurnian protein dilakukan pada pH mendekati netral dengan menggunakan buffer tertentu. Setelah diperoleh larutan yang berisi beberapa macam protein maka proses selanjutnya ialah fraksionasi, yaitu memisahkan masing-masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi. Dua cara yang biasa digunakan untuk proses fraksionasi ini yaitu pengendapan dan kromatografi.

Sampel Putih Telur Putih telur merupakan komponen terbesar dari sebuah telur utuh, yang menyusun sekitar 58% dari sebuah telur, dibandingkan dengan kuning telur yang hanya 31% saja. Komponen putih telur terdiri dari air (87%), protein (12%), dan lemak (0,3%). Kuning telur memiliki komponen protein lebih tinggi (17%) namun juga memiliki lemak yang jauh lebih besar (32,2%). Putih telur juga dinilai sebagai sumber protein yang baik karena mampu diserap tubuh secara sempurna untuk digunakan sebagai bahan pembentuk otot. Putih telur juga kaya akan asam amino esensial seperti Lisin, Threonin, Valin, Isoleusin, Leusin, Metionin, Fenilalanin, Tryptophan, dan Histidin. Putih telur juga disarankan sebagai sumber asupan protein berkualitas tinggi dalam pola diet. Konsumsi asupan tinggi protein telur dapat merangsang pembentukan otot (muscle protein synthesis).

2

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

Penentuan Konsentrasi Protein Penentuan konsentrasi protein merupakan proses yang rutin digunakan dalam kerja Biokimia. Ada beberapa metoda yang biasa digunakan dalam rangka penentuan konsentrasi protein, yaitu metoda Biuret, Lowry dan lain sebagainya. Pemilihan metoda yang terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran bergantung pada beberapa faktor, seperti banyaknya material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran dan alat spektrofotometer yang tersedia (VIS atau UV).

a. Metoda Kjeldahl Metoda Kjeldahl merupakan metoda yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metoda ini telah banyak mengalami modifikasi. Metoda ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek. Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25; diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95; 5,71 dan 5,83. Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen. Prinsip cara analisis Kjeldahl adalah sebagai berikut: mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator. Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara makro dan semimakro. Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar dihomogenisasi dan besar contoh 1-3 g, sedang semimikro Kjeldahl dirancang untuk contoh ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen. Cara analisis tersebut akan berhasil baik dengan asumsi nitrogen dalam bentuk 3

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

ikatan N-N dan N-O dalam sampel tidak terdapat dalam jumlah yang besar. Kekurangan cara analisis ini ialah bahwa purina, pirimidina, vitamin-vitamin, asam amino besar, kreatina, dan kreatinina ikut teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein. Walaupun demikian, cara ini kini masih digunakan dan dianggap cukup teliti untuk pengukuran kadar protein dalam bahan makanan. Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses destruksi, proses destilasi dan tahap titrasi. 1. Tahap destruksi Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi CO, CO2 dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4dan HgO (20:1). Gunning menganjurkan menggunakan K2SO4 atau CuSO4. Dengan penambahan katalisator tersebut titk didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium dapat mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya. 2. Tahap destilasi Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar supaya selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan logam zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh asam khlorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan. Agar supaya kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indikator misalnya BCG + MR atau PP. 3. Tahap titrasi Apabila penampung destilat digunakan asam khlorida maka sisa asam khorida yang bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Akhir 4

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP.

%N = × N. NaOH × 14,008 × 100%

Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam khlorida 0,1 N dengan indikator (BCG + MR). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda.

%N = × N.HCl × 14,008 × 100 %

Setelah diperoleh % N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan.

b. Metoda Biuret Uji Biuret adalah tes yang digunakan untuk mendeteksi adanya ikatan peptida. Bersama peptida, ion tembaga (II) membentuk kompleks berwarna ungu dalam larutan alkali. Beberapa varian pada tes telah dikembangkan. Reaksi biuret dapat digunakan untuk uji konsentrasi protein karena ikatan peptida terjadi dengan frekuensi yang sama per asam amino dalam peptida. Intensitas warna, dan karenanya serapan pada 540 nm, berbanding lurus dengan konsentrasi protein, menurut hukum Beer-Lambert. Terlepas dari namanya, reagen tidak ternyata mengandung biuret ((H 2N-CO-) 2NH). Tes ini dinamakan demikian karena ia juga memberikan reaksi positif terhadap ikatan peptida dalam molekul biuret.

c. Metoda Bradfod Metoda Bradford didasarkan pada pengikatan zat warna Coomassie Blue G-250 ke protein, dimana zat warna ini memiliki empat formasi ion berbeda dengan nilai pKa 5

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

1,15; 1,82 dan 12,4. Bentuk kationik zat warna ini berwarna merah dan hijau dengan panjang gelombang serapan (absorbansi) maksimum pada 470 dan 650 nm. Sedangkan bentuk anioniknya berwarna biru dengan absorbansi maksimum 590 nm. Pengukuran proteinnya sendiri dilakukan dengan menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anionik (biru), dan biasanya hal ini dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan pada 595 nm. Zat warna Coomassie Blue G-250 bereaksi cepat dengan residu arginil dan lysil dari protein, sehingga hal ini menyebabkan adanya variasi hasil pengukuran untuk jenis protein yang berbeda-beda. Protein dengan residu arginil dan lysil yang lebih banyak tentu akan menghasilkan warna biru yang lebih intens dibanding protein yang residu arginil dan lysilnya lebih sedikit meskipun jumlah proteinnya sama. Namun secara umum metoda Bradford masih merupakan metoda yang paling sesuai dan paling umum digunakan. Ada dua jenis assay protein dengan metoda Bradford, yaitu Standard Assay , cocok untuk pengukuran kadar protein antara 10 sampai 100 µg dan Microassay yang dapat mendeteksi antara 1 sampai 10 µg protein. Konsekuensinya microassay lebih rentan terhadap interferensi senyawa nonprotein. Pereaksi yang digunakan dibuat dengan melarutkan 100 mg Coomassie Blue G-250 dalam 50 ml ethanol 95%. Larutan ini kemudian dicampurkan dengan 100 ml asam fosfat 85% dan diencerkan sampai volume 1 L dengan aquadest. Pereaksi ini harus difilter dengan kertas saring Whatman No. 1 dan disimpan dalam botol amber (gelap) di suhu ruang. Pereaksi ini stabil hingga beberapa minggu, namun jika terbentuk endapan ketika penyimpanan, maka harus difilter lagi saat hendak digunakan. Standar protein yang digunakan adalah Bovine γ-globulin dengan konsentrasi 1 mg/ml (atau 100 µg/ml untuk microassay) digunakan sebagai larutan stok (disimpan beku pada suhu -20°C). Konsentrasi protein larutan standar harus diukur sebelum digunakan dengan mengukur absorbansinya pada 280 nm. Absorbansi larutan Bovine γ-globulin 1mg/ml pada cuvet 1 cm adalah 1,35. Jika yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) atau Ovalbumin, maka absorbansinya masing-masing adalah 0,66 dan 0,75. 6

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

d. Metoda Dumas Metoda Dumas dalam bidang adalah metoda untuk penentuan kuantitatif dari zat nitrogen berdasarkan metoda pertama yang dijelaskan oleh Jean-Baptiste Dumas lebih dari satu abad setengah yang lalu. Teknik ini telah dikembangkan sehingga mampu dengan cepat mengukur konsentrasi crude protein sampel makanan dan mulai bersaing dengan metoda Kjeldahl sebagai metoda standar untuk analisis kandungan protein untuk beberapa bahan makanan. Metoda ini terdiri dari pembakaran sampel massa dalam suhu tinggi (sekitar 900° C) ruang dalam kehadiran oksigen. Hal ini menyebabkan pelepasan karbon, air dioksida dan nitrogen. Gas tersebut kemudian melewati kolom khusus yang menyerap karbon dioksida dan air. Sebuah kolom yang berisi detektor konduktivitas termal di akhir kemudian digunakan untuk memisahkan nitrogen dari sisa karbon dioksida dan air dan kandungan nitrogen yang tersisa diukur. Instrumen pertama harus dikalibrasi dengan menganalisis bahan yang murni dan memiliki konsentrasi nitrogen dikenal. Sinyal diukur dari detektor konduktivitas termal untuk sampel yang tidak diketahui kemudian dapat diubah menjadi kandungan nitrogen. Seperti dengan metoda Kjeldahl, konversi konsentrasi nitrogen dalam sampel dengan kandungan protein mentah dilakukan dengan menggunakan faktor konversi yang bergantung pada urutan asam amino tertentu dari protein diukur. Metoda Dumas memiliki keuntungan menjadi mudah digunakan dan otomatis. Metoda ini juga jauh lebih cepat daripada metoda Kjeldahl, mengambil beberapa menit per pengukuran, dibandingkan dengan jam atau lebih untuk Kjeldahl. Ini juga tidak menggunakan bahan kimia beracun atau katalis. Salah satu kelemahan utama adalah tingginya biaya awal. Juga, seperti dengan Kjeldahl, tidak memberikan ukuran protein yang benar, karena nitrogen nonprotein register, dan faktor koreksi yang berbeda diperlukan untuk protein yang berbeda karena mereka memiliki urutan asam amino yang berbeda. Akhirnya, ukuran sampel yang kecil meningkatkan risiko memperoleh sampel tidak representatif.

e. Metoda Lowry Uji protein Lowry adalah tes biokimia unutuk menentukan tingkat total protein dalam suatu larutan. Konsentrasi total protein ditunjukkan oleh perubahan warna 7

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

larutan sampel yang sebanding dengan konsentrasi protein, yang kemudian dapat diukur dengan menggunakan teknik kolorimetri. Oliver H. Lowry yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1940-an. Metoda ini menggabungkan reaksi ion basa (uji biuret) dengan

residu

tembaga dengan

ikatan peptida dalam

suasana

protein oksidasi aromatik. Metoda Lowry paling

baik digunakan dengan konsentrasi protein dari 0,01-1,0 mg / mL dan didasarkan pada reaksi Cu + yang dihasilkan oleh oksidasi ikatan peptida, dengan reagen Folin Ciocalteu (campuran asam fosfotungstat dan asam fosfomolibdat dalam reaksi Folin-Ciocalteu). Mekanisme reaksi melibatkan pengurangan reagen Folin dan oksidasi residu asam amino aromatik (terutama triptofan dan tirosin). Berkurangnya konsentrasi reagen Folin diukur dengan absorbansi pada 600 700 nm. Akibatnya, konsentrasi total protein dalam sampel dapat disimpulkan dari konsentrasi residu Triptofan dan Tirosin yang mengurangi reagen Folin. Adapun metoda lain yang dapat digunakan, yaitu Metoda Dumas, Radiochemical methods, Formol titration, Alkaline distilation, Dye-binding dan NIR.

Standar Bovine Serum Albumin Bovine serum albumin (BSA juga dikenal sebagai atau "Fraksi V") adalah protein albumin aserum yang berasal dari sapi. BSA sering digunakan sebagai standar konsentrasi protein. Julukan "Fraksi V" mengacu pada albumin yang menjadi fraksi kelima metodologi pemurnian Cohn oleh Edwin yang memanfaatkan karakteristik kelarutan diferensial dari protein plasma. BSA memiliki banyak aplikasi dalam biokimia, termasuk ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), immunoblots dan imunohistokimia. Hal ini juga digunakan sebagai nutrisi dalam sel dan kultur mikroba.

8

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

IV. Alat dan Bahan Alat: • Tabung reaksi • Pipet mikron • Spektrofotometer • Stop watch • Vortex • Sampel 2 g/50 mL putih telur ayam ras

Bahan: • Standar BSA (Bovine Serum Albumin) dengan konsntrasi 1000 µg/mL • H2O • Reagen Biuret • Reagen Folin – Ciocalteu (Fenol)

V.

Prosedur 1.

0,6 mL larutan standar BSA dilarutkan dalam 0,4 mL air. Dicampurkan pula sampel putih telur dengan air sehingga volume akhirnya 1,0 mL,

2.

Ditambahkan 5 mL larutan biuret yang telah disiapkan kedalam masing-masing tabung,

3.

Secara tepat 10 menit kemudian, dilakukan inkubasi pada suhu kamar. Selang waktu tersebut sangat kritis. Digunakan stopwatch (dinyalakan sebekum menambahkan larutan Biuret pada tabung 2). Setelah 10 menit, ditambahkan 0,5 mL reagen Fenol kedalam masing-masing tabung dan dikocok dengan segera dengan alat vortex,

4.

Dilakukan inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Waktu inkubasi ini dapat dimulai setelah penambahan/pencampuran reagen Fenol kedalam tabung terakhir,

5.

Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 700 nm dengan alat spektrofotometer dengan menggunakan tabung 1 sebagai blanko.

9

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

VI. Pengamatan a. Data

KURVA BAKU

1200 y = 1634.4x + 8.1099 R² = 0.9932

1000 800

Absorbansi (700 nm) 600

Konsentrasi Linear (Konsentrasi)

400 200 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

10

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

y = bx + a a = -5,063 x 10-3 b = 6,108 x 10-4 r = 0,995 r2 = 0,9909 Persamaan y = 6,108x10-4x - 5,053x10-3

Volume Sampel (mL) 0,3 0,3 0,5 0,5 0,6 0,6

Jumlah Sampel (mg) 12 12 20 20 24 24

Absorbansi (700 nm) 0,306 0,346 0,346 0,168 0,041 0,491

Kadar Protein (µg) 509,271 574,765 574,759 283,338 812,153

Rata-rata 542,018 429,049

812,153

b. Perhitungan • Pengambilan sampel

BSA 1000 µg/mL =

= 1000 µg/mL

Sampel putih telur 2 g/50 mL = 2000 mg/50 mL = 40 mg/mL • Kadar protein y = 6,108x10-4x - 5,053x10-3 x = Absorbansi y = Kadar protein

11

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

▪

Untuk sampel 12 mg: y = 6,108x10-4x - 5,053x10-3 0,306 = 6,108x10-4x - 5,053x10-3 6,108x10-4x = 0,306 + 5,053x10-3 6,108x10-4x = 0,311 x = 509,271 0,346 = 6,108x10-4x - 5,053x10-3 6,108x10-4x = 0,346 + 5,053x10-3 6,108x10-4x = 0,351 x = 574,765

x=

= 542,018

dalam 1 mg =

▪

= 45,168 µg

Untuk sampel 20 mg: y = 6,108x10-4x - 5,053x10-3 0,346 = 6,108x10-4x - 5,053x10-3 6,108x10-4x = 0,346 + 5,053x10-3 6,108x10-4x = 0,351 x = 574,765 0,168 = 6,108x10-4x - 5,053x10-3 6,108x10-4x = 0,168 + 5,053x10-3 6,108x10-4x = 0,173 x = 283,338

x= dalam 1 mg =

= 429,049 = 21,452 µg

12

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

▪

Untuk sampel 24 mg: y = 6,108x10-4x - 5,053x10-3 0,491 = 6,108x10-4x - 5,053x10-3 6,108x10-4x = 0,491 + 5,053x10-3 6,108x10-4x = 1,01 x = 812,152

dalam 1 mg =

= 33,84 µg

13

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

VII. Pembahasan

Pada percobaan kali ini, dilakukan penentuan kadar protein pada putih telur ayam ras

dengan

metoda

Lowry.

Penentuan

kadar

protein

dengan

metoda

ini

didasarkan pada reaksi antara Cu2+dengan ikatan peptida dan reduksi asam osfotungstat dan asam fosfomolibdat oleh tirosin dan triptofan yang merupakan residu protein yang akan memberikan warna biru. Warna yang diperoleh akan diukur absorbannya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum antara 600-700 nm. Pembanding yang digunakan adalah standar Bovine Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 100, 200, 400, 600, 800 dan 1000

g. Adapun tujuan dari pembuatan

larutan standar dengan berbagai konsentrasi adalah untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel (multi point method) dengan menggunakan persamaan garis lurus yang diperoleh dari grafik larutan standar.

Dari tujuh tabung BSA dengan satu tabung sebagai blanko, diperoleh angkaangka absorbansi yang menjadi sumbu y pada kurva baku dan konsentrasi BSA sebagai x. Kurva menunjukkan slop positif dengan gradien garis mendekati 1 (0,9909). Dengan regresi linear, diperoleh pula nilai a = -5,063 x 10-3 dan b = 6,108 x 10-4. Sehingga, untuk persamaan garis y = bx + a diperoleh persamaan y = 6,108x10-4x - 5,053x10-3.

Pengujian dilakukan pada tiga volume sampel yang berbeda, yaitu 0,3 mL (12 mg); 0,5 mL (20 mg) dan 0,6 mL (24 mL). Pada masing-masing volume, dilakukan pengujian secara duplo. Pada tabung sampel, ditambahkan reagen Biuret yang terdiri dari larutan Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N, Na-K-Tartrat 2,7% dan CuSO4 1%.5H2O dengan

perbandingan 100:1:1. Larutan Na2CO3 berfungsi sebagai garam yang

mengkoordinasikan reaksi dalam suasana basa bersama NaOH, larutan Na-K-Tartrat berfungsi mencegah terjadinya pengendapan kuprooksida dalam reagen Biuret, sedangkan larutan CuSO4 berfungsi untuk mereduksi fosfotungstat fosfomolibdat. Adapun reagen Biuret untuk memberi suasana basa. Sehingga akan menghasilkan warna biru dimana intensitas warna ini bergantung dari kadar protein yang akan ditentukan. 14

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

Larutan standar, sampel, dan blanko sebanyak 1 mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Biuret, dikocok agar homogen dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar agar reaksi berjalan sempurna. Reaksi yang terjadi adalah reduksi Cu2+ menjadi Cu+ pada reagen Biuret oleh asam amino aromatik dalam protein (Tirosin, Triptofan atau Fenilalanin)

Kompleks protein dengan ion Cu2+ dalam reagen Biuret

Setelah itu, ditambahkan reagen Fenol (folin ciocalteu) sebanyak 0,5 mL, dihomogenkan dengan vortex dan diinkubasi lagi selama 30 menit. Hal ini dilakukan agar kepekatan larutan tersebut lebih maksimal. Kompleks protein dengan ion Cu+ akan mereduksi fosfomoblidat dan fosfostungstat (fosfomolibdotungstat), menghasilkan tungsten dan heteropolimolibdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru yang dapat dideteksi secara kolorimetri, kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu Triptofan

dan

Tirosinnya.

Absorbansinya

kemudian

dapat

diukur

dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 700 nm.

15

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

Pembentukan heteropolimolibdenum blue dari reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat oleh komplek Cu+ dan protein.

Banyaknya produk tungsten dan heteropolimolibdenum blue sebanding dengan banyaknya residu protein, semakin tinggi konsentrasi protein, maka produk yang dihasilkan juga semakin banyak, ditandai dengan warna biru yang semakin pekat.

Hasil yang diperoleh untuk volume 0,5 mL menunjukkan selisih yang cukup besar antara absorbansi tabung 1 dengan absorbansi tabung 2, yaitu 0,346 dan 0,168. Hal ini dapat disebabkan karena pada pipet yang digunakan untuk memipet sampel ke tabung 1 volume 0,5 mL masih terdapat sisa detergen yang dapat mereduksi tungstat, sehingga absorbansi yang dibaca oleh spektrofotometer menjadi lebih besar.

Selisih nilai absorbansi terjadi pula pada volume 0,6 mL, dapat dikarenakan masih terdapat sisa detergen maupun kesalahan dalam teknik memipet sampel dengan pipet micron. Nilai absorbansi yang diperoleh pada kedua tabung adalah 0,041 dan 0,491. Karena selisih yang terlampau jauh, maka untuk volume 0,6 mL hanya digunakan satu nilai absorbansi, bukan nilai rata-ratanya, yaitu 0,346.

VIII. Kesimpulan Kadar protein dalam 0,6 mL putih telur ayam ras adalah sebanyak 33,84 g/mg.

16

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

DAFTAR PUSTAKA

Biuret Test. http://en.wikipedia.org/wiki/Biuret_test Dumas Methode. http://en.wikipedia.org/wiki/Dumas methode Girindra, A. 1986. Biokimia I. Jakarta: Gramedia. Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta : Bayu Media Publishing. Kjeldahl Methode. http://en.wikipedia.org/wiki/Kjeldahl methode Lowry Protein Assay. http://en.wikipedia.org/wiki/Lowry_protein_assay Poedjiyadi, Anna dkk. 2006. Dasar-DasarBiokimia. Jakarta : UI-Press.

17

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

LAMPIRAN

Tugas Pendahuluan

1.

Jelaskan prinsip percobaan ini! Reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh asam amino aromatik dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan Fosfostungsat dan Fosfomoblidat dalam reagen Fenol membentuk warna biru sehingga dapat menyerap cahaya dan dapat diamati secara spektrofotometri.

2.

Gambarkan • Struktur asam amino-asam amino penyusun protein yang mengandung gugus Fenolik

(Tirosin)

(Triptofan)

(Fenilalanin)

18

Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

• Kompleks Cu-protein hasil reaksi Biuret

3.

Mengapa metoda Lowry lebih peka dibandingkan dengan metoda Biuret dalam menganalisa protein? Karena pada metoda Lowry, warna yang terbentuk dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer, sehingga hanya memerlukan sedikit sampel.

19