Pemisahan Dengan Cara Kromatografi

PEMISAHAN DENGAN CARA KROMATOGRAFI

I.

TUJUAN 

Mengenal dan memahami pemisahan dengan cara kromatografi



Menentukan nilai Rf (Rate of Flow) dengan teknik kromatigrafi

II. TEORI

Kromatografi adalah teknik pemisahan dimana suatu zat dalam campuran diuraikan berdasarkan kemampuannya untuk diserap oleh komponen lain yang ada di dalam kromatografi yang dikenal sebagai fasa diam. Dalam kromatograf, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dapat berupa zat cair atau padat. Sedangkan, fasa bergerak dapat  berupa cairan atau gas. Dengan demikian kromatografi dapat dibedakan atas dasar kombinasi antara fasa diam dan fasa bergerak. Kombinasi tersebut dapat berupa cair-gas, padat-cair, cair-cair, dan gas-padat. Transfer masa antara fasa gerak dan fasa diam terjadi bila molekul-molekul terserap pada permukaan fasa diam yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Kemampuan fasa diam untuk mengadopsi fasa bergerak sangat bergantung pada sifat-sifat fasa diam dan fasa bergerak. Untuk setiap zat, hal ini sangat spesifik sehingga teknik kromatografi di samping bertujuan untuk pemisahan dapat pula digunakan untuk mengidentifikasi suatu zat. Pada saat ini telah dikenal cukup  banyak teknik kromatografi, diantaranya kromatografi kertas, lapis tipis (TLC), gas (GC), kolom, dan eksklusi. Dengan berbagai cara tersebut, kegiatan prevaratif dan analitik semakain valid dan reliable hasil reliable hasil yang diperoleh. (Tim Kimia Analitik, 2014 : 36-37) Kromatografi adalah suatu metode analitik untuk pemurnian dan pemisahan senyawa-senyawa organik dan anorganik, metode ini berguna untuk fraksionasi campuran kompleks dan pemisahan untuk senyawa yang sejenis. Metode-metode kromatografi tidak dapat dikelompokkan dengan hanya meninjau satu macam sifat, artinya dapat dinyatakan teknik-teknik kolom seperti destilasi, ekstraksi  pelarut, penukar ion kedalam satuan gelas. Kromatografi bermanfaat untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusu dalam dua fase, fase diam dan

1

fase gerak. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran terserap pada permukaan partikel-partikel kedalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan. Laju perpindahan suatu molekul zat terlarut tertentu di dalam kolom atau lapis tipis zat penyerap secara langsung  berhubungan dengan bagian-bagian molekul tersebut di antara fase bergerak dan fase diam. Jika ada perbedaan penahanan secra selektif, maka masing-masing komponen akan bergerak sepanjang kolom dengan laju yang tergantung pada karakteristik masing-masing penyerapan. (Khopkar, 2008) Dengan menggunakan cara kromatografi, pemisahan dalam banyak keadaan lebih cepat dan efektif daripada sebelumnya dan banyak pemisahan, dapat berhasil yang tidak akan dapat diusahakan dengan teknik lain, pemdobrakan yang tidak ada bandingnya dalam biokimia mendapatkan pengertian dan fungsi enzim dan  protein yang lain telah berasal secara langsung dari penggunaan kromatografi dalam penelitian biologik. Hal yang penting dalam pengukuran atau penentuan pada kromatografi cair adalah kita pertama-tama meneliti proses distribusi fasa sebagai bentuk biasa yang terlihat dalam kromatografi cair. Jika dibayangkan adanya suatu zat padat dengan  permukaan yang bersih dan kering, lalu jika sekarang permukaan ini dialiri suatu fluida atau gas, cairan murni atau larutan, biasanya ada kecenderungan dari molekul gas, pelarut atau zat terlarut untuk mengadakan interaksi dengan  permukaan tadi. Jika zat padat adalah terbagi atau sangat berpori, atau dengan kata lain zat mempunyai luas permukaan besar, maka besarnya adsorpsi akan setara Sebagai contoh, jika suatu adsorben yang baik dimasukkan ke dalam bejana yang berisi gas, penurunan tekanan sebagai akibat penarikan molekul gas pada  permukaan mudah diukur. (Underwood, 1999) Dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan sebagai  berikut; (a) kecenderungan

molekul-molekul komponen untuk melarut dalam

cairan; (b) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melekat pada  permukaan padatan halus (adsorpsi=penyerapan); (c) kecenderungan molekulmolekul komponen untuk bereaksi secara kimia (penukar ion). Komponen yang

2

dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk  berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi, atau  bereaksi secara kimia (penukar ion). Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan untuk keperluan identifikasi

(analisis kualitatif), penetapan kadar (analisis

kuantitatif), dan pemurnian suatu senyawa (pekerjaan preparatif). Deteksi noda KLT terkadang lebih mudah dibandingkan dengan kromatografi kertas karena dapat digunakan teknik-teknik umum yang lebih banyak. Kerapkali, noda tidak berwarna atau tidak berpendar jika dikenai sinar ultra violet dapat ditampakkan dengan cara mendedahkan papan pengembang pada uap iod. (Soebagio, 2000: 54) Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada afinitas kepolaran analite dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar kromatografi kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase gerak yang non polar dengan begitu waktu retensi akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat  pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di dalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan kompresi (misalnya udara,nitrogen, argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom. Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke  bawah ( fasa mobil ) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben ( fasa stationer ). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi  berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan  bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. (Sastrohamidjojo, 2005)

3

III. PROSEDUR PERCOBAAN 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1

3.1.2

Alat 

Seperangkat alat gelas



Kertas saring whatmann



Plat TLC



Chamber 



Pipa kepiler 



Gunting



Seperangkat alat kromatografi gas



Seperangkat alat kromatografi kolom



Mistar 



Pensil



Lumpang porselin



Pipet tetes



Corong pisah

Bahan 

Butanol pa



Kristal iod



Sampel ekstrak daun



Kloroform



n-pentana



n-heptana



n-heksana



Asan nitrat



Anilin pialat



Etanol



Aseton



Kapas



Aseton dan natrium sulfat

4

3.2 Skema Kerja 3.2.1

Pemisahan dan Penentuan Karbohidrat dengan Kromatografi Kertas

Butanol, asam asetat dan air dicampurkan dengan perbandingan (4 : 1 : 5) sebagai fasa gerak disiapkan potongan kertas saring whatmann yang telah dijenuhkan dengan uap air disiapkan

larutan

sampel

yang

terdiri

dari

 beberapa macam karbohidrat disiapkan pola larutan penyemprot (anilin pialat) disiapakan larutan standar yang terdiri dari zat murni untuk glukosa, fruktosa, maltose dan amilum disiapkan perangkat kromatografi kertas diberi garis pada kertas +0,5 cm dari pingggir ditotolkan 3-4 larutan standar pada garis tersebut dimasukkan kertas dalam chumber berisi larutan standar pada posisi tegak dibiarkan beberapa lama sampai pelarut naik diangkat kertas dan dikeringkan disemprot zat penanda noda yang sesuai dengan larutan standar dihitung nilai Rf nya diulangi kegiatan ini untuk semua larutan standar dibandingkan

nilai

Rf

untuk

mengetahui

kandungan jenis karbohidrat

HASIL

5

3.2.2

Pemisahan Komponen Penyusun Daun Bayam secara TLC

1. Penyiapan kolom 10 mL PE ditambahkan pada klem dihilangkan

gelembung

pada

kapas

yang

ditempatkan pada kolom kering yang ditekan sampai dasar kolom dengan pengaduk ditambahkan pasir + 3 mm dari tinggi kapas HASIL

*Diperhatikan kolom harus berdiri tegak 20 mL alumina dan 40 gr PE dicampurkan dalam gelas kimia 100 mL diaduk dengan spatel dimasukkan ke dalam kolom secar perlahan dipadatkan dengan mengetuk dinding kolom dengan pensil dibiarkan lapisan alumina turun ditambahkan lagi pasir setinggi 5 mm di atas alumina tersebut ditambahkan eluen di atas lapisan pasir HASIL

*Perhatian! - Jangan sampai eluen melewati batas - Jangan ada gelembung udara dalam kolom - Kolom jangan sampai kering

6

-  Penambahan eluen dilakukan ekstra hati-hati dan perlahan

menggunakan pipet tetes serta zat dialirkan melalui dinding kolom 2. Pengerjaan kolom kromatografi Pelarut dibiarkan turun dan ditampung di dalam gelas Erlenmeyer 250 mL hingga permukaan pelarut tepat diatas lapisan eter ditambahkan 25 tetes zat yang telah diekstrak (percobaan TLC) dibuka kran hingga zat ini turun sebagian ditambahkan 5 mL PE dibiarkan

mengalir

melalui

kolom

dengan

membuka klem ditambahkan eluen pertama (PE : CH 2Cl2 = 4:1) dibuka klem dan dibiarkan pelarut turun dipisahkan setiap fraksi yang berbeda warna ke dalam tabung berbeda dilakukan penambahan eluen (CH 2Cl2 : methanol = 95 : 5) diulangi prosedur hingga fraksi berbeda warna diperoleh diberi label pada tabung yang berisi fraksi

HASIL

7

3.2.3

Pemisahan Zat dengan Kromatografi Kolom

Campuran standar disiapkan disiapkan pula campuran larutan sampel diset alat GC sesuai dengan kondisi percobaan digunakan syringe yang sesuai diambil kromatigrafi untuk tiap-tiap senyawa dibandingkan dengan kromatogram campuran larutan standard dan kromatogram dari tiap individu larutan standar HASIL

*Campuran standar = terdiri dari 5mL u-pentana, 10mL n-heksana,

dan 15 mL n-heptana

8

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN V. KESIMPULAN VI. DAFTAR PUSTAKA

9