Patologia e Inmunologia

GUÍA TÉCNICA

PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE CAMARONES PENAEIDOS PROGRAMA CYTED ÁREA DE AGROALIMENTACIÓN RED II-D: Red Vannamei Editores: Vielka Morales Q. Jorge Cuéllar-Anjel Autores: María José Almanza Abud Margherita Anna Barracco Jorge Cuéllar-Anjel Donald V. Lightner Emiko Shinozaki Mendes Alitiene Moura Lemos Pereira María Soledad Morales Covarrubias Carlos Pantoja Luciane María Perazzolo Rafael Diego Rosa Agnés Saborio Coze Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

La presentación y disposición en conjunto de: GUÍA TÉCNICA - PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE CAMARONES PENAEIDOS son propiedad de los editores. Ninguna parte de esta obra puede ser reproducida o transmitida, mediante ningún sistema o método, electrónico o mecánico (incluyendo fotocopiado, la grabación o cualquier sistema de recuperación y almacenamiento de información), sin consentimiento por escrito de los editores. Derechos reservados: © 2008 Vielka Morales Q. y Jorge Cuéllar-Anjel (507) 6671-8936 (507) 6616-0756 email: [email protected] email: [email protected] Panamá Primera edición en español Hecho en Panamá ISBN: 978-9962-661-02-3 Esta obra se citará de la siguiente manera: Todo el libro: Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.).  2008.  Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos.  Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp. Ejemplo para citar un capítulo: Pantoja, C. y D.V. Lightner.  2008.  Enfermedades virales pp. 55-114. En:  Morales, V. y J. CuéllarAnjel (eds.).  2008.  Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos.  Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp.

Diseño e impresión: New Concept Publications, Inc. (507) 226-7694 Panamá Daniel Ho - Fotografías de portada, contraportada, páginas 1, 55, 117, 135, 159, 169, 225, 243 y 254

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AGRADECIMIENTOS

Los editores agradecen la colaboración de Reinaldo Morales y Hugo Pérez Athanasiadis, por la traducción preliminar del portugués al español, de varios capítulos del libro, así como a Roberto Chamorro (Licencia de intérprete público autorizado del Ministerio de Gobierno y Justicia de Panamá, Resolución Nº 28, de 8 de marzo de 1984) por la revisión y perfeccionamiento de los documentos traducidos. De igual manera por la revisión y aportes de la Dra. Patricia Del Portillo (Métodos Moleculares), Dra. Margherita Barracco (Parámetros Inmunológicos), Dr. Carlos Pantoja y Kenneth W. Hasson (Parásitos en Camarones), Ing. Roberto Chamorro y Dra. María del Pilar Moyano (Métodos de Diagnósticos) y Oscar Olivares (glosario y correcciones de texto).

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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

IN MEMORIAM ELPIDIO BELTRAME, el hombre incansable y luchador por la camaronicultura en la región, hoy no se encuentra con nosotros, no obstante, su recuerdo permanecerá por siempre en el corazón de todos los que tuvimos la suerte de trabajar a su lado. El Grupo Técnico Asesor (GTA) de la Red Vannamei del CYTED y los autores de esta Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, deseamos dedicarla a nuestro amigo, hermano y compañero, ELPIDIO. El fue uno de nuestros pilares en el GTA de la Red Vannamei, con aportes de grandes ideas y colaboración desinteresada para el buen manejo y beneficio de la actividad camaronera no sólo en Brasil, su país natal, sino también en el resto de los países iberoamericanos que conforman esta importante familia CYTED. Gracias por tu contribución a una actividad que seguirá dando respuestas en la generación de empleos y divisas a diferentes países de iberoamerica.

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PRÓLOGO

La camaronicultura tiene sus inicios en la década del ‘60 incrementándose rápidamente en la del ‘70, surgiendo como una de las fuentes de mayores ingresos de divisas por sus elevadas producciones. En la actualidad y según estudios de la FAO, aún existen 18 países de América Latina que se dedican a la actividad específicamente con especies del género Penaeus (también llamado Litopenaeus). Para la década del ‘90, la reducción en el número de fincas de cultivo, se debió a enfermedades que se reportaron desde la aparición del Taura en los años 93-94 y el Síndrome de la Mancha blanca en los años 98-99, afectando grandemente las producciones y dando como resultado el cierre de muchas empresas, pérdidas de empleos y por ende de ingresos. La industria ha tenido que ir implementando innovaciones tecnológicas y mejoramiento en el manejo de los cultivos de camarón, observándose una lenta recuperación en sus producciones y en la productividad. Sin embargo, con la expansión territorial de esta actividad y el desarrollo de técnicas de diagnóstico de enfermedades, han sido identificados nuevos agentes patógenos. Es por ello que nos sentimos complacidos que un grupo de científicos, preocupados por la situación actual en los temas de enfermedades, haya querido compartir sus conocimientos y experiencias de muchos años, a través de esta importante Guía Técnica de Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, diseñada para productores, técnicos, estudiantes y cualquier otro entusiasta interesado en contar con un texto de apoyo que le signifique una herramienta útil y práctica en su actividad diaria. Como regente de un sector que vela por el desarrollo de las actividades acuícolas en la República de Panamá, nos sentimos honrados de poder expresar la importancia de esta Guía que consideramos un aporte significativo para el sector de la camaronicultura en Iberoamérica.

GUILLERMO A. SALAZAR N.

Ministro de Desarrollo Agropecuario Panamá, 2008

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INTRODUCCIÓN

El Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) es un programa internacional multilateral de cooperación científica y tecnológica de ámbito iberoamericano y carácter horizontal. En el marco del CYTED, hay una serie de acciones dentro de las cuales se encuentran las Redes Temáticas, que son asociaciones de grupos de I+D pertenecientes a entidades públicas o privadas de al menos seis países miembros del Programa y cuyas actividades científicas o tecnológicas están relacionadas con el tema de la red. En este caso en particular, la Red denominada FORO PARA LA GESTIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍAS SOBRE EL CULTIVO DE PENAEUS VANNAMEI: RED VANNAMEI, realizó una serie de actividades en beneficio de la industria camaronera de los países iberoamericanos que se dedican a la actividad. Entre los objetivos logrados por la Red, están las siguientes: constitución de un foro regional de convergencia para los grupos de investigación, productores y sector estatal; fomento de la investigación interdisciplinaria que coadyuva al desarrollo tecnológico en temas relativos al L. vannamei; la promoción en el intercambio de información científica y técnica con miras a favorecer la innovación y fomentar la sustentabilidad; el establecimiento de un sistema de información electrónico de divulgación periódica, el cual facilitó la transferencia de conocimientos; organización de actividades de capacitación para beneficio del personal científico y técnico vinculado a las actividades de investigación; la ayuda a la consolidación de grupos de investigación y desarrollo, lo mismo que la interacción con los diferentes grupos, a través de redes o foros nacionales para el análisis integral de la camaronicultura y, propiciar la movilidad de los científicos y miembros del sector productivo, quienes participaron en las actividades que coordinó la red. Entre los temas de mayor énfasis durante el desarrollo de las actividades de la red, están los relacionados con la genética, buenas prácticas de manejo y, patología e inmunología de los camarones, resultados que se ven reflejados en la hoja electrónica de la red: www.mida.gob.pa/CYTEDVANNAMEI. Como última actividad de la red, estuvo la realización de un curso teórico-práctico internacional sobre la patología e inmunología del camarón L. vannamei, donde participaron científicos de reconocida trayectoria en estos campos. Como producto final para el cierre de la red, los facilitadotes del curso acordaron contribuir con el desarrollo de cada capítulo a ellos asignados para la publicación de esta guía, la cual servirá de herramienta básica para estudiantes, empresas y entidades estatales que se dedican a la camaronicultura. Este compromiso desinteresado de parte de cada uno de ellos, es uno de los mejores aportes que quedará plasmado en las acciones que vienen desarrollándose a través del CYTED y a quienes les agradecemos por haber depositado su confianza para la coordinación de la Red Vannamei. A los autores, amigos y compañeros les extendemos un cordial agradecimiento por toda su colaboración. VIELKA MORALES Q. Coordinadora Red Vannamei

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ÍNDICE DE CONTENIDO Prólogo

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Introducción

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Reseñas de los editores y autores

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Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo (Jorge Cuéllar-Anjel)

1

1.1

Anamnesis

2

1.2

Examen clínico

2

1.3

Microscopía Directa

5

1.4

Montajes en Fresco (María Soledad Morales-Covarrubias)

8

1.5

Bacteriología

18

1.6

Histología

22

1.7

Pruebas con anticuerpos

29

1.8

Métodos moleculares

31

1.9

Parámetros inmunológicos

Capítulo 1

39

1.10 Microscopía electrónica de transmisión

45

1.11 Bioensayos

47

1.12 Referencias bibliográficas

52

Capítulo 2

Enfermedades Virales (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner)

55

2.1

Principales enfermedades y métodos de diagnóstico

58

2.2

Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (Infectious hypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV)

62

2.3

Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus, WSSV)

70

2.4

Virus del Síndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV)

79

2.5

Virus del síndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus, YHV)

87

2.6

Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV)

92

2.7

Mionecrosis infecciosa viral (IMNV) y sus implicaciones en los cultivos de camarones brasileños (Alitiene Moura Lemos Pereira, Emiko Shinozaki Mendes, Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira)

96

2.8

Penaeus vannamei nodavirus (PvNV)

104

2.9

Referencias bibliográficas

106

Enfermedades Bacterianas (María Soledad Morales-Covarrubias)

117

3.1

Vibriosis sistémica

120

3.2

Erosión bacteriana del caparazón

122

3.3

Síndrome de Zoea II

124

Capítulo 3

ix

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3.4

Enfermedad de luminiscencia

126

3.5

(NHP-B) Necrosis del hepatopáncreas bacteriana

126

3.6

Bacterias filamentosas (Leucothrix mucor)

130

3.7

Spiroplasma penaei (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner)

131

3.8

Referencias bibliográficas

134

Enfermedades por Parásitos (Jorge Cuéllar-Anjel)

135

4.1

Gregarinas

137

4.2

Microsporidios

142

4.3

Haplosporidios

147

4.4

Epicomensales

148

4.5

Metazoarios

154

4.6

Referencias bibliográficas

156

Capítulo 4

Capítulo 5

Enfermedades causadas por hongos (Carlos R. Pantoja y Donald Lightner)

159

5.1

Micosis

161

5.2

Fusariosis

164

5.3

Referencias bibliográficas

167

Inmunología del Camarón (Margherita Anna Barracco, Luciane María Perazzolo y Rafael Diego Rosa)

169

6.1

Sistema Inmune de los Crustáceos

172

6.2

Inmunoestimulantes

202

6.3

Parametros hemato-inmunológicos como indicadores de salud

204

6.4

Conclusiones y Perspectivas

209

6.5

Referencias bibliográficas

211

Buenas Prácticas De Manejo En La Camaronicultura (Agnés Saborío Coze y María José Almanza)

225

7.1

Código de Conducta para una camaronicultura responsable

229

7.2

Objetivos de un Código de conducta

229

7.3

Buenas Prácticas de Manejo

230

7.4

Características de las Buenas Prácticas de Manejo

230

7.5

Buenas Prácticas de Manejo en Laboratorios de larvas

231

7.6

Buenas Prácticas de Manejo en granjas camaroneras

231

7.7

Buenas Prácticas de Manejo en plantas procesadoras

241

7.8

Referencias bibliográficas

242

Glosario

243

Capítulo 6

Capítulo 7

x

RESEÑAS DE LOS EDITORES VIELKA MORALES Q. Coordinadora Red Vannamei-CYTED [email protected] Licenciada en Biología. Experiencia de 14 años en el tema de larvicultura, maduración, zooplancton y fitoplancton en laboratorio de camarones. Responsable del diseño y construcción de la Estación de Maricultura del Pacífico, Puerto Vacamonte en Panamá. Desde 1996 coordinadora técnica de la Organización del Sector Pesquero y Acuícola de Centroamérica. Consultora para FAO y PRADEPESCA-UE. Cuenta con 19 publicaciones (11 en temas de camarones). Ha participado en otras redes del CYTED relacionada a camarones y moluscos.

JORGE CUÉLLAR-ANJEL Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Aguadulce, Coclé, República de Panamá [email protected] Médico Veterinario, Máster en Microbiología. Experiencia de 18 años en las áreas de cultivo de camarón marino Litopenaeus vannamei; diseño y montaje de laboratorios de patología de camarones (microbiología, histopatología y biología molecular); docencia universitaria en pregrados y postgrados así como investigación aplicada en Producción, Patología, Inmunología y Nutrición de camarones penaeidos; manejo sanitario de cultivos de camarón (larvicultura, engorde y maduración) mediante clínica y pruebas de campo y de laboratorio (montajes en fresco, microbiología, histopatología y biología molecular); conferencista en Congresos Internacionales; miembro del Grupo Ad hoc de la OIE en crustáceos para las Américas. Ha tenido desempeño laboral en Ecuador, Colombia y Panamá.

RESEÑA DE LOS AUTORES MARÍA SOLEDAD MORALES COVARRUBIAS Centro de Investigaciones en Alimentación y Desarrollo, A.C. Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental México, [email protected] Maestría y Doctorado en Patología de crustáceos, Licenciatura en Biología Pesquera Investigadora en el área de acuicultura y manejo ambiental del CIAD. Sus principales trabajos de investigación están enfocados a histopatología, virología y fisiología de crustáceos; imparte cursos en sanidad acuícola y colabora en un programa de transferencia tecnológica, capacitación y consultoría en histopatología de crustáceos, con diferentes países de América Latina.

JORGE CUÉLLAR-ANJEL Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Aguadulce, Coclé, República de Panamá [email protected] La reseña de este autor ha sido citada previamente en “Reseña de los Editores” xi

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AGNÉS SABORIO COZE Universidad Centroamericana (UCA) Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos Managua, Nicaragua. [email protected] Maestría en Acuicultura, Licenciatura en Ecología y Recursos Naturales. Certificadora de la Global Alliance Aquaculture para plantas de proceso, granjas de acuicultura y laboratorios. Cultivos marinos y de agua dulce, Nutrición de peces, calidad de agua. Planificación y desarrollo de áreas costeras. Investigación de tensiones ambientales en cuencas hidrográficas. Investigadora en temas relacionados a la zonas costeras. Elaboración y gestión de proyectos acuícolas. Asistencia Técnica, capacitación y extensión a comunidades costeras. Docente universitaria. Consultora. Relaciones de trabajo con cooperantes de USA, JICA, UE, Universidades y Centros de Investigación como Universidad de Rhode Island, Universidad de Florida, Universidad de Hawai, Universidad de Puerto Rico entre otras, Organizaciones sin fines de lucro Internacionales como ACRA, GVC, OIKOS entre otras, las Naciones Unidas (FAO) y el Banco de Desarrollo Interamericano. Coordinadora de Redes Internacionales. Directora de Acuicultura. Directora de Centro de Investigación.

MARÍA JOSÉ ALMANZA ABUD Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos Universidad Centroamericana (UCA) Managua, Nicaragua [email protected] Máster en Ciencias Ambientales, Licenciada en Ecología y Recursos Naturales, curso de Postgrado en Sistema de Información Geográfica aplicada a los Recursos Naturales. Coordinador técnico del Proyecto SUCCESS, financiado por USAID a través del Centro de Recursos Costeros de la Universidad Rhode Island y Centro de Recursos Costeros y Acuacultura del Pacífico de la Universidad Hawai Hilo. Responsable del área de Físico-química de agua del Laboratorio CIDEA. Coordinador del área de Sistema de Información Geográfica. Coordinador del área de divulgación y Coordinador de Investigaciones del CIDEA.

CARLOS PANTOJA Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología Universidad de Arizona Tucson, Estados Unidos [email protected] Ingeniero Bioquímico en Explotación de Recursos Acuáticos (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México). Maestría en Acuacultura (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México). Doctorado en Patobiología (The University of Arizona). Actualmente es profesor investigador asociado en el laboratorio de patología acuícola de la Universidad de Arizona. Principales áreas de trabajo son patología morfológica, caracterización de nuevas enfermedades y agentes infecciosos de camarones peneidos, desarrollo de métodos de detección de agentes infecciosos y diagnóstico de enfermedades. Provee servicios de consultoría a la industria camaronícola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.

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DONALD V. LIGHTNER Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología Universidad de Arizona Tucson, Estados Unidos [email protected] PhD en Patología y Biología Pesquera, Maestría en Biología Pesquera y su Licenciatura en Biología Pesquera. Su experiencia está dirigida a la patología y enfermedades de los cultivos de crustáceos y peces, enfermedades de invertebrados, marinos y de agua dulce, enfermedades infecciosas, virología, histología, microscopio electrónico, desarrollo de métodos de diagnósticos, nutrición de animales acuáticos y toxicología acuática. Provee servicios de consultoría a la industria camaronicola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.

MARGHERITA ANNA BARRACCO Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA), Florianópolis, SC, Brasil [email protected] Doctorado en Inmunologia de Invertebrados y Licenciatura en Ciencias Biológicas. Profesora Titular de Biología Celular, con participación en los programas de Postgrado en Acuicultura y Biotecnología. Investigadora en el área de inmunología de crustáceos y moluscos de interés para la acuicultura, con implicaciones en la sanidad y en el monitoreo ambiental. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en el estudio de la respuesta inmunológica a infecciones, el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos para el monitoreo de condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en invertebrados acuáticos, con énfasis en camarones y bivalvos marinos.

LUCIANE MARÍA PERAZZOLO Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA), Florianópolis, SC, Brasil [email protected] Maestría en Inmulogía de Crustáceos y Doctorado en Vitelogénesis de Peces. Profesora Asociada de Biología Celular, con participación en el programa de Postgrado en Acuicultura. Investigadora en el área de inmunologia de crustáceos de interés para la acuicultura, con implicaciones en la sanidad. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en el estudio de la respuesta inmunológica a las infecciones, caracterización bioquímica y molecular de proteínas inmunes efectoras y/o reguladoras, el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos para el monitoreo de las condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en camarones.

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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

RAFAEL DIEGO ROSA Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAA), Florianópolis, SC, Brasil [email protected] Maestría en Biotecnología aplicada a la acuicultura y Licenciatura en Ciencias Biológicas. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en la inmunología de crustáceos y moluscos bivalvos, en especial en los péptidos antimicrobianos producidos por estos animales.

ALITIENE MOURA LEMOS PEREIRA Embrapa Meio-Norte, Parnaíba, PI, Brasil, [email protected] Tecnóloga en Acuicultura, con Maestría y Doctorado en Acuicultura. Investigadora de la Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa). Coordinadora del Núcleo de Investigación en Pesca y Acuicultura da Embrapa Meio-Norte. Responsable por el Laboratorio de Patología de Organismos Acuáticos (LAPOAq). Participa de La Red de Investigación en Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades. Responsable por proyectos en patología, diagnóstico y monitoreo sanitario de camarones cultivados.

EMIKO SHINOZAKI MENDES Universidade Fed. Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil [email protected] Médica Veterinaria, con Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Doctorado en enfermedades tropicales. Profesor Asociado del Departamento de Medicina Veterinária, y en los programas de pós-grado en Veterinária y de los Recursos Pesqueros y Acuicultura, ambos de la Universidad Federal Rural de Pernambuco. Responsable por el Laboratorio de la Salud de los Animales Acuáticos (LASAq) y Coordinadora actual de la Red de la Investigación en Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades, actuando principalmente en el área de la microbiología.

TEREZA CRISTINA VASCONCELOS GESTEIRA Universidade Fed. do Ceará, LABOMAR, CE, Brasil [email protected] Bióloga con maestría en Zoología por la Universidad Federal de Rio de Janeiro y PhD en Biología por la Universidad de New Brunswick – Canadá. Trabaja en el área de histología y en histopatología de camarones peneídos. Realiza investigaciones en el área de patologías de crustáceos marinos. Es responsable por la cátedra de Patología de Organismos Marinos y Estuarinos y directora de postgrado a nivel de maestría en el Curso de Ciencias Marinas Tropicales. Es miembro activo de la World Aquaculture Society (WAS) del Consejo Regional de Biología y de la Asociación Brasileña de Patología de Organismos Acuáticos (ABRAPOA).Participa de la “Red de Camarones Marinos del Nordeste” – RECARCINE, subred Enfermedades.

xiv

Capítulo 1

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

Capítulo 1 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Jorge Cuéllar-Anjel Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Coclé, Panamá Introducción Con base en las principales técnicas utilizadas en la actualidad para determinar enfermedades en camarones, la siguiente lista presenta los pasos básicos y métodos que sirven como herramienta para realizar diagnósticos y detectar agentes etiológicos en estos crustáceos de gran importancia comercial en la economía mundial. Aunque algunos de estos procedimientos pueden ser realizados por los mismos productores en los laboratorios de maduración y/o larvicultura o en las fincas camaroneras, la mayoría deben ser hechos por profesionales en sanidad acuícola o por Médicos Veterinarios especialistas. Se debe recordar siempre que el diagnóstico no consiste en una prueba de laboratorio como tal, sino en la interpretación que hace el especialista con base en sus conocimientos y en la información recopilada de las pruebas de campo y de laboratorio. Las citas bibliográficas utilizadas para la preparación de una parte de este Capítulo, no serán mencionadas a lo largo del texto para facilitar la lectura de los diferentes temas. A cambio, serán incluidas al final del Capítulo en las “Referencias bibliográficas”. Pasos para el diagnóstico: •

Anamnesis (información histórica del caso, datos relacionados con el evento)

•

Examen clínico

•

Microscopía (análisis con microscopio de luz directa, contraste de fase o campo oscuro, con montajes en fresco de tejidos teñidos o sin coloraciones, barridos o montajes en fresco de tiras fecales)

•

Bacteriología (de tejidos de camarones o de sustratos relacionados como agua, sedimento y otros organismos acuáticos)

•

Histología de especímenes fijados

•

Pruebas basadas en anticuerpos para la detección de patógenos utilizando anticuerpos policlonales (PAbs por sus siglas en inglés) o anticuerpos monoclonales (MAbs por sus siglas en inglés)

•

Métodos moleculares -

Sondas de ADN en pruebas de hibridación dot blot directamente con muestras frescas de tejido o con ADN extraído

-

Sondas de ADN o de ARN en pruebas de hibridación in situ con cortes histológicos de tejidos fijados

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

-

PCR, RT-PCR y PCR en tiempo real para pruebas directas con muestras de tejido fresco o con ADN o ARN extraído

•

Parámetros inmunológicos (hemogramas y medición de perfiles inmunes)

•

Microscopía electrónica de barrido o de transmisión

•

Bioensayos con portadores sospechosos o subclínicos, utilizando hospederos altamente susceptibles (estadios del animal o especies) como indicadores de la presencia del patógeno

1.1

Anamnesis

En la medida de lo posible, el técnico en sanidad responsable de realizar el diagnóstico de una enfermedad en una población de camarones, debe incluir una visita a la instalación afectada (maduración, larvicultura o finca de engorde). Durante esta visita, el técnico debe recopilar la información histórica previa a la aparición del brote de la enfermedad. Esto puede incluir cambios en parámetros ambientales o fisicoquímicos, tránsito inusual de personas o equipos por las instalaciones, presencia de animales foráneos al sistema como perros, aves, roedores o vacas, alteraciones en el régimen y tipo/calidad del alimento suministrado, cambios en los procedimientos o tipos de fertilizantes, uso de productos químicos o biológicos en el cultivo afectado, existencia de brotes similares con anterioridad en dicha empresa o en otras conocidas y, toda aquella información pasada o presente relacionada directa o indirectamente con la población en cuestión. Debe llevarse un registro de esta información obtenida en la empresa, para estudios de correlación con los hallazgos obtenidos en el examen clínico y en las pruebas de laboratorio complementarias que se harán luego de la visita de campo.

1.2

Examen clínico

Cuando se trate de un brote de una enfermedad, durante la visita a las instalaciones deben evaluarse las unidades de producción (tanques o estanques) que presenten problemas. Se deben realizar capturas de camarones in situ y hacer una revisión individual de animales, para formarse una idea aproximada de la proporción del problema: qué tanta población está afectada (prevalencia en %), grado de severidad de las afecciones observadas en los organismos enfermos y qué tipo de enfermedad puede estar causando el brote. El examen clínico debe incluir un recorrido manual y visual muy cuidadoso de los camarones que sean revisados, los cuales no deben ser capturados al azar, sino seleccionados por presentar alguna manifestación de enfermedad. Con base en los hallazgos de esta valoración clínica, es factible en algunos casos hacer un diagnóstico presuntivo, el cual se debe confirmar con pruebas complementarias de laboratorio. El número de animales que se debe tomar para realizar un estudio sobre la etiología de enfermedades, está afectado por la habilidad de reconocer camarones enfermos en exámenes generales, la naturaleza del problema presente y por la experiencia del profesional especialista en sanidad acuícola. Cuando se eligen camarones que presenten signos clínicos, 5 a 10 por población examinados individualmente, serán suficientes. La captura o colección de camarones para realizar un examen que busca determinar la presencia de enfermedad, debe realizarse procurando el mínimo de estrés durante la manipulación de los animales. 2

Jorge Cuéllar-Anjel

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

Si el examen clínico debe ser realizado en un lugar diferente al de la captura y los camarones deben ser transportados hacia otra parte, la movilización debe hacerse en recipientes con agua del mismo estanque, limpia (sin lodo ni trozos de vegetales), con adecuada aireación y teniendo una densidad baja (para evitar el estrés). Si los camarones van a permanecer un período de tiempo en el recipiente antes de ser examinados, deben tener buena aireación y, en lo posible, se debe bajar la temperatura a 25-27ºC mediante la adición de bolsas con hielo (selladas). En estudios de camarones presumiblemente enfermos, se deben seleccionar animales moribundos, descoloridos, con comportamiento anormal o que presenten otras anormalidades macroscópicas con las cuales se sospeche de una enfermedad. Las principales observaciones que se deben realizar en camarones enfermos durante una valoración clínica, son las siguientes: • • • • • • • • • • • • • • • •

Color del animal Tamaño del cuerpo comparado con el resto de la población (“enanismo”) Expansión de cromatóforos Deformidades en rostro, abdomen o apéndices Flexión del músculo abdominal (calambre) Color de las branquias (amarillas, marrón o negras) Color de los apéndices (pereiópodos, pleópodos y urópodos) Color de las antenas Edema (presencia anormal de líquido) en apéndices u otras partes del cuerpo Transparencia de los músculos del abdomen y del cefalotórax Repleción intestinal (porcentaje del intestino que se encuentra lleno) Textura del exoesqueleto (duro o blando) Tono del músculo abdominal (firme o flácido) Presencia de moco sobre la cutícula (resbaloso o áspero al tacto) Manchas, laceraciones, heridas, zonas oscuras u opacas, astillas clavadas Color del esófago y estómago (anaranjado sugiere canibalismo o mortalidad)

En cuanto a manifestaciones de enfermedad en condiciones naturales en los tanques o estanques, las siguientes son observaciones frecuentes en camarones enfermos: • • • • • • •

Nado errático Letargia y debilidad Pérdida del reflejo de huida (permiten ser capturados sin ejercer resistencia) Vulnerabilidad a predadores (aves) Nado superficial (“barbeo”) Susceptibilidad a la hipoxia Disminución en la alimentación

Cuando se realicen muestreos aleatorios intencionales para estimar la prevalencia de una enfermedad en una población, los camarones deben ser tomados al azar (no escogidos). El tamaño de la muestra para estudios de enfermedades en camarones, será revisado en detalle más adelante (Capítulo 2 “Enfermedades virales”) por Carlos Pantoja.

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MÉTODO DE EXAMEN CLÍNICO

Figura 1.1 Captura de camarones en un estanque de cultivo mediante el uso de una atarraya, para ser sometidos a un examen clínico.

Figura 1.2 Muestra de camarones P. vannamei sanos, enfermos y muertos observados en un recipiente de fondo blanco, después de su captura en un estanque de cultivo. Se observan algunos camarones muertos sin apéndices (pereiópodos o pleópodos), debido a que han sido canibalizados por otros camarones.

Figura 1.3 Camarones P. vannamei que están siendo observados luego de haber sido capturados en un estanque de cultivo, durante un procedimiento de examen clínico. En el caso de estos 5 camarones, no se observan manifestaciones clínicas de enfermedad.

4

Jorge Cuéllar-Anjel

1.3

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

Microscopía Directa (Análisis en fresco)

Esta técnica está basada en la observación bajo el microscopio de tejidos o partes de camarones afectados, con el fin de establecer en la medida de lo posible, un diagnóstico presuntivo. Las partes más comúnmente examinadas bajo el microscopio, son: hepatopáncreas, branquias, contenido intestinal (heces), músculo esquelético y contenido gástrico. Para una evaluación sanitaria con microscopía directa, deben examinarse las muestras lo más pronto posible después del muestreo y después de la preparación del montaje en un portaobjetos. Se deben utilizar organismos vivos siempre que sea posible, o usar muertos frescos que han sido mantenidos en frío (refrigerados o enhielados), o especímenes fijados en formalina 10% tamponada, cuando no sea posible trabajar con camarones vivos. Si se puede contar con un laboratorio de campo adecuado, debe usarse para procesar y examinar las muestras lo más cerca del sitio de muestreo. Una aplicación importante del método de microscopía, es el examen del contenido gástrico en camarones. Para ello, deben ser sacrificados al menos 10 animales capturados al azar en una población determinada (estanque o tanque). Se extrae cuidadosamente el estómago luego de hacer una disección del mismo utilizando tijeras y pinzas pequeñas. Se realiza una incisión por la línea media con las tijeras y se extrae el equivalente a una gota de contenido gástrico. Se ubica sobre una lámina portaobjetos y se añade una gota de solución salina. Se coloca luego una lámina cubreobjetos y se hace presión con la pinza cuidadosamente, con el fin de separar los componentes gástricos. Se observa luego la muestra bajo el microscopio utilizando los objetivos de 4X y 10X, registrando la proporción estimada de alimento artificial (pellets), microalgas, zooplancton, sedimento y otros componentes que se observen. Se promedian los porcentajes estimados en los 10 camarones para cada una de estas observaciones y se obtienen los valores para dicha población. Este método permite conocer factores que estén afectando el crecimiento, así como realizar correctivos en la dieta de los animales. Los detalles relacionados con la técnica de montajes en fresco, son estudiados más adelante (en este mismo Capítulo) por María Soledad Morales (Montajes en Fresco).

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MÉTODO DE MICROSCOPÍA (Montajes en fresco)

Figura 1.4 Camarones P. vannamei bajo observación durante un examen clínico. Nótese la presencia de una zona oscura en la parte media del cefalotórax y superior de las branquias (flechas). La opacidad generalizada del músculo abdominal puede deberse al tiempo que han estado fuera del agua (estrés por hipoxia). No se observan manifestaciones adicionales de enfermedad.

Figura 1.5 Camarón juvenil P. vannamei en el cual se está levantando la cutícula posterior del cefalotórax, para extraer muestras del hepatopáncreas, las branquias y heces del intestino medio, a partir de las cuales se va a preparar un montaje en fresco.

Figura 1.6 Preparación de un montaje en fresco de un camarón P. vannamei en donde ya se han colocado bajo el cubreobjetos muestras de hepatopáncreas (izquierda) y branquias (centro). Las heces están siendo extraídas del intestino medio con la ayuda del borde de unas tijeras.

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Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

MÉTODOS DE MICROSCOPÍA (Montajes en fresco)

Figura 1.7 Muestra de hepatopáncreas de un camarón subadulto P. vannamei preparada mediante un montaje en fresco. Se observa gran cantidad de vacuolas lipídicas (reservas de grasa) de colores amarillo y gris y con tamaños variados (todas normales). En el centro hay un proceso de melanización (color marrón) de un túbulo del hepatopáncreas, el cual está rodeado por varias capas de hemocitos (“halo” blanco alrededor del túbulo melanizado) y presenta una forma alargada siendo más ancho hacia la izquierda. Sin tinción. Amplificación 100X.

Figura 1.8 Muestra de branquias de un juvenil P. vannamei preparada mediante un montaje en fresco. Se observan 2 lamelas branquiales bifurcadas en su extremo (superior), las cuales presentan melanización de origen tóxico. Sin tinción. Amplificación 100X.

Figura 1.9 Montaje en fresco preparado a partir de una muestra de heces de un camarón subadulto P. vannamei. Se observan dos trofozoitos de gregarina Nematopsis sp., uno de ellos con el extremo posterior bifurcado. Estos protozoarios están formados por 3 células (arriba) y por 2 células (centro), respectivamente. Se puede diferenciar la célula anterior (protomerito) y la célula posterior (deutomerito). Sin tinción. Amplificación 200X.

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MÉTODO DE MICROSCOPÍA DIRECTA

Figura 1.10. Montaje en fresco preparado a partir de heces de una postlarva (pl-10) de P. vannamei, en la que se observan trofozoitos de la gregarina Paraophioidina sp. (probablemente P. scolecoides). Cada trofozoito está compuesto por una única célula con el núcleo visible. Este parásito tiene la particularidad de formar grupos en los cuales varios organismos se adhieren a uno. Sin tinción. Amplificación: 100X. Foto: Cuéllar-Anjel et al., 1998.

1.4

Montajes en fresco (María Soledad Morales-Covarrubias)

Introducción El diagnóstico implica un entendimiento de la causa y, si es posible, un conocimiento de los factores contribuyentes significativos que influyan en la aparición de la enfermedad. Con el diagnóstico aumenta la probabilidad de un control efectivo cuando se determina la causa exacta y se relaciona con sus factores contribuyentes efectivos. Sin embargo, debemos aceptar que el conocimiento de la salud y la enfermedad varía en diferentes animales acuáticos, incluidos los camarones y que en las granjas camaroneras y laboratorios aparecen nuevas enfermedades. Por tanto, en una situación particular, la precisión esperada y la calidad de un diagnóstico pueden ser directamente afectadas por el conocimiento disponible respecto a enfermedades de camarones, por el entrenamiento y experiencia de la persona encargada de realizar el diagnóstico, así como por las prácticas de manejo en los sistemas de cultivo. Uno de los objetivos principales en el diagnóstico de una enfermedad de un animal en producción, es la determinación de la causa (etiología). La identificación de los agentes etiológicos de la enfermedad se realiza (o debería realizarse) mediante la aplicación de métodos científicos de investigación. La observación de muestras de órganos y tejidos de camarones (para buscar bacterias, hongos, protozoarios, metazoarios e inclusiones de rickettsias y virus) a través de microscopía de luz e histopatología (respuesta del hospedero-patología), son métodos comúnmente empleados para establecer los agentes etiológicos, los cuales conllevan a determinar la causa de enfermedades en camarones. Los agentes patógenos se encuentran en el ambiente en forma natural y el medio acuático no es la excepción. Muchos de ellos son oportunistas; es decir que mientras los camarones se encuentren sanos y las condiciones de los parámetros de cultivo no se alteren, los patógenos no atacan. Este es un dato muy importante, pues el hecho de tener patógenos presentes en una granja o laboratorio no significa precisamente que los 8

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organismos se encuentren enfermos. La gravedad dependerá del nivel de incidencia, de la prevalencia, tipo de patógeno, de su virulencia, de su patogenicidad, de la especie cultivada, de la genética de la misma (ciclo cerrado o silvestres) y el nivel de estrés de los camarones al momento de estar expuestos al patógeno. El estrés es determinado por calidad del agua, tipo de alimentación, variación drástica en los parámetros como oxígeno disuelto, temperatura, salinidad, pH, etc., así como por las prácticas de manejo principalmente. El escenario anterior se complica con el traslado de organismos vivos, que se realiza de manera frecuente entre zonas y aún entre países. Esto ha propiciado la introducción y propagación de agentes patógenos exóticos a lugares donde no existían y que en algunos casos se diseminan a las poblaciones silvestres. Análisis en fresco El análisis en fresco, es la técnica que se utiliza para monitorear el estado de salud de los organismos y realizar diagnósticos presuntivos en laboratorio y campo. Consiste en la disección del camarón en todos sus estadios, para observar las alteraciones y patógenos que presenten sus órganos y tejidos. La capacitación para este tipo de análisis consta de un corto entrenamiento básico que profesionales (biólogos, ingenieros en acuicultura, médicos veterinarios etc.) pueden recibir en una granja o laboratorio. Para realizar el diagnóstico del estado de salud de una población se requiere de la selección y toma adecuada de la muestra, la cual es elegida de acuerdo al estado de salud de los organismos o a la sospecha de alguna enfermedad. La intensidad del muestreo (número de muestreos en el tiempo hasta la cosecha) dependerá de la necesidad de la información, de la historia de la granja, del origen de los organismos y de la densidad de organismos sembrados en el cultivo. Por lo tanto para una buena selección se tiene que tomar en cuenta lo siguiente: Muestreo aleatorio. Cuando solamente se quiere determinar el estado de salud o para buscar la prevalencia de patógenos, se toman los organismos y estanques al azar, lo cual debe realizarse de cuatro áreas diferentes del estanque (Figura 1.11). El tamaño mínimo de muestra o submuestra debe garantizar un 95% de confianza que de existir una infección, ésta se incluirá en la muestra y para la prevalencia su muestreo dependerá de la prevalencia estimada del patógeno y del nivel de confianza elegido (Tabla 1). Los camarones seleccionados se depositan en contenedores con aireación, procurando crearles el menor estrés posible y se trasladan de inmediato al laboratorio para su posterior análisis. Muestreo no aleatorio. Muestra que contiene solamente organismos enfermos. Este tipo de muestreo se realiza cuando se tiene la sospecha de la presencia en el estanque, de alguna enfermedad o síndrome. Se seleccionan por lo menos 10 organismos que presenten señales clínicas tales como: decoloración, melanización y necrosis en la cutícula, así como anorexia (falta de apetito), letargia (reducción de la actividad normal), coloración rojiza de los pleópodos y telson o cualquier otra alteración que se observe en ellos. Los organismos con estas características generalmente se encuentran en la compuerta de salida de los estanques (Figura 1.12). Las muestras deben procesarse inmediatamente, de acuerdo al procedimiento o procedimientos que se hayan elegido para la detección del agente causal de la enfermedad. Los organismos deben ser enviados vivos a los laboratorios de diagnóstico.

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Figura 1.11. Estanque de cultivo de camarón donde se observan las cuatro áreas diferentes para la toma de organismos en muestreo al azar.

Figura 1.12. Estanque de cultivo de camarón donde se observa la compuerta de salida para la toma de organismos en muestreo no aleatorio.

Tabla 1. Selección del tamaño de muestra y cálculo del porcentaje de prevalencia de un patógeno en una población determinada (Tomada de Lightner, 1996 y modificada de Amos, 1985). Tamaño de la población

Tamaño de la muestra necesaria para obtener el porcentaje de prevalencia** 2%

5%

10%

20%

30%

40%

50%

50

50

35

20

10

7

5

2

100

75

45

23

11

9

7

6

250

110

50

25

10

9

8

7

500

130

55

26

10

9

8

7

1,000

140

55

27

10

9

9

8

1,500

140

55

27

10

9

9

8

2,000

145

60

27

10

9

9

8

4,000

145

60

27

10

9

9

8

10,000

145

60

27

10

9

9

8

>/= 10,000

150

60

30

10

9

9

8

* *Prevalencia= Número de individuos de una especie de hospedero infectada con una especie particular de parásito/número de hospederos examinados (Margolis et al., 1982)

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Para la realización del análisis en fresco, se requiere contar con espacio limpio en donde se tenga el siguiente material: Microscopio compuesto con objetivos de 4, 20, 40, 60 y 100 X Portaobjetos Cubreobjetos Bisturí Navajas de disección Pinzas de disección Tijeras finas de disección Tabla de disección Cajas de petri Pizetas Guantes Agua de mar estéril o filtrada Resina Jeringas desechables de varias medidas (1 mL, 3 mL y 5 mL) Hematoxilina Eosina Y Solución de Davidson (AFA, Alcohol-Formaldehído-Ácido acético) Solución de Davidson modificada (AFA, Alcohol-Formaldehído-Ácido clorhídrico) Etanol absoluto Etanol al 70% Xileno Contenedores para muestras Hoja de reporte Manuales Desarrollo de la técnica: •

•

Los organismos se miden y pesan para obtener el peso y tamaño promedio. Se analiza tanto la superficie del organismo para detectar deformaciones en el rostro y en el sexto segmento abdominal, como cutícula delgada (o suave), epicomensales, decoloración, coloración rojiza, melanización, ampollas y necrosis de cutícula (Figura 1.13); pleópodos, pereiópodos y antenas. Se selecciona una pequeña porción de cada tejido u órgano (Figura 1.14). Las porciones se colocan individualmente en portaobjetos limpios (no mezclar porciones), se les adiciona unas gotas de agua de mar estéril y se pone el cubreobjetos; debe procurarse que en la muestra no se formen burbujas que puedan interferir (para ello hay que realizar una leve presión sobre el cubreobjetos con la pinza de disección). Las muestras que se tomarán son:

Branquias: con las tijeras finas se elimina el exoesqueleto que cubre las branquias. Se toma una pequeña porción y se coloca en el portaobjetos para buscar: cambios en la coloración de los filamentos branquiales (como melanización, necrosis, áreas blanquecinas bien definidas), presencia de protozoarios (Zoothamnium sp (Figura 1.15), Epistylis sp, Acineta, Ascophris, Bodo sp), bacterias filamentosas (Leucothrix mucor y Flexibacter sp), detritus del fondo de los estanques, restos de microalgas, hongos, bacterias, melanizaciones y deformaciones. Para detectar cuerpos de inclusión viral en las branquias por improntas, es necesario fijarlas en solución de Davidson modificada (AFA, Alcohol-Formaldehído-Ácido clorhídrico), si van a ser procesadas de manera 11

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inmediata; si este no es el caso, pueden fijarse en la solución de Davidson (AFA, AlcoholFormaldehído-Ácido acético), que se utiliza para fijar organismos para histología. Hepatopáncreas: se elimina todo el exoesqueleto del cefalotórax para descubrir el hepatopáncreas (Figura 1.16) y el estómago. Se observa la coloración, el tamaño del hepatopáncreas para decidir si hay atrofia (reducción de tamaño) o hipertrofia (aumento de tamaño) del órgano. Con unas pinzas, se retira la membrana que cubre

Figura 1.13. Camarón con melanización multifocal.

Figura 1.14. Pequeña porción de hepatopáncreas lista para ser analizada.

Figura 1.15 Muestra de branquias donde se aprecian las formas bien definidas de Zoothamnium sp.

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el hepatopáncreas y con un bisturí se parte por la mitad para observar la coloración del fluido, textura, melanización y necrosis tubular. Se toma una pequeña muestra y se coloca en un portaobjetos para buscar: Baculovirus penaei, Monodon baculovirus, gregarinas (trofozoitos y sicigias), bacterias, deformación tubular, nódulos hemocíticos, melanización y necrosis de los túbulos (Figura 1.17). También debe observarse la cantidad de lípidos presentes, desprendimiento de células del epitelio de los túbulos del hepatopáncreas y acumulación dentro de vacuolas citoplasmáticas de los hepatocitos de una sustancia de color verde oscuro “bolitas negras”. Para la realización de improntas e histología, es necesario fijar los órganos y/o tejidos del organismo seleccionado en el fijador adecuado para el diagnóstico elegido. Intestino: el abdomen, se separa del cefalotórax, del telson y de los urópodos para facilitar la extracción del intestino. Por la parte posterior se localiza el intestino (que puede o no contener hilo fecal); con ayuda de una pinza fina, se extrae con cuidado y se coloca en el portaobjetos, procurando extenderlo. Luego se vierten unas gotas de agua de mar y se presiona ligeramente al depositar el cubreobjetos (Figura 1.18). Al observar la muestra en el microscopio, se buscarán: gregarinas con sus diferentes estadios (Figura 1.19), distribución y porcentaje de adherencia en el intestino, inflamación, nemátodos, cuerpos de oclusión de Baculovirus penaei y Monodon baculovirus. Músculo y gónadas: se toma una pequeña muestra de músculo y de las gónadas (especialmente, aquel tejido que muestre opacidad de tipo lechoso). Se coloca en un portaobjetos y se presiona para facilitar la búsqueda de microsporidios (Figura 1.20), si estos órganos y tejidos fueron parasitados se deben observar masas de esporas de tamaño y forma uniformes. Las muestras ya preparadas se analizan en el microscopio, iniciando con el objetivo de menor aumento y finalizando con el de mayor. Debido a su rápida descomposición, la primera muestra que se analiza es la del hepatopáncreas; después se estudia la muestra de branquias, posteriormente el intestino y por último la muestra de músculo y gónadas. En la hoja de reporte (Tabla 2), se anota todo lo que se observa con cada objetivo. Luego se calcula el porcentaje de prevalencia y se determina el grado de severidad (Tablas 3, 4, 5 y 6) que presenten los organismos de la muestra analizada. Se finaliza con el diagnóstico y el reporte final.

Figura 1.16. Organismo con hepatopáncreas expuesto para tomar pequeña porción para su análisis.

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Figura 1.17. Muestra en fresco de hepatopáncreas con melanización y necrosis de las células y de los túbulos.

Figura 1.18. Muestra en fresco de intestino.

Figura 1.19. Muestra en fresco de intestino medio, donde se aprecian las sicigias de gregarinas de 2, 3, y 4 divisiones adheridas al epitelio y en el lumen del intestino.

Figura 1.20. Muestra en fresco de músculo donde se observan las cápsulas de Ameson nelsoni.

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Tabla 2. Formato de reporte para el análisis en fresco. No_________________________ Fecha._____________________________________________ Procedecia._ ____________________________________________________________________ Especie.________________________________________________________________________ Estanque No. _______________ Tamaño de la muestra._______________________________ No. de muertos.______________ No. de examinados._________________________________ Estado de vida.______________ Peso promedio.___________ Tamaño promedio._________ CARACTERÍSTICAS EXTERNAS

OBSERVACIONES

CARACTERÍSTICAS INTERNAS

Actividad de los camarones

HEPATOPÁNCREAS

Contenido del intestino

Atrofia

Presencia de heces en forma de cadena o discontinua

coloración

Presencia de epibiontes, bacterias y hongos en el camarón

Presencia de los virus: BP y MBV.

Deformidades en el rostrum, antenas abdomen, telson, urópodos y pleópodos

Deformación de los túbulos

Apéndices rotos

Color del fluido.

Melanización (color café claro)

Presencia de gregarinas en todos sus estadíos

Coloración anormal

Túbulos melanizados

Características de la cutícula

Presencia de masa de bacterias y cantidad de lípidos

BRANQUIAS

INTESTINO

Coloración

Presencia de gregarinas en todos sus estadíos.

Presencia de epibiontes

Masas melanizadas de hemocitos

Nódulos de bacterias en las lámelas branquiales

Cuerpos de oclusión de BP

Micosis (hifas, conidios)

MÚSCULO

Cuerpos de inclusión de WSSV

Textura

Materia orgánica

Color

Presencia de melanización y necrosis

Microsporidios

OBSERVACIONES

Síndrome del encalambramiento

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Tabla 3. Guía general para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la infección, infestación y síndrome (Lightner, 1996). GRADO DE SEVERIDAD

SIGNOS CLÍNICOS

0

No presentan signos de infección por el agente patógeno, parásito o epicomensal. No presentan lesiones características de síndromes.

1

Presencia muy baja del patógeno, parásito o epicomensal. En aquellos donde se tiene un número estándar permitido, éste se encuentra justo arriba del límite normal. Se observan muy pocas lesiones características del síndrome.

2

Se observa la presencia baja y moderada del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan lesiones ligeras o moderadas, características del síndrome. Incremento en la mortalidad si no se aplica tratamiento (cuando existe tratamiento).

3

Se observa la presencia moderada del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan lesiones moderadas a severas, características del síndrome. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento (cuando existe tratamiento).

4

Se observa gran cantidad del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan severas lesiones características del síndrome. Muy letal con altas mortalidades.

Tabla 4. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la deformación tubular en hepatopáncreas con análisis en fresco (Morales-Covarrubias, 2004). GRADO DE SEVERIDAD

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SIGNOS CLÍNICOS

0

No presentan signos de deformación tubular (0). No presentan lesiones características de síndromes.

1

Presencia muy baja de deformación tubular (1-5/campo/organismo). Se observan muy poco desprendimiento celular.

2

Se observa la presencia moderada de deformación tubular (6-10/ campo/organismo). Presencia de hemocitos y formación de nódulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento.

3

Se observa la presencia alta de deformación tubular (11-20/ campo/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas, como melanización, desprendimiento celular, atrofia tubular y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento.

4

Se observa gran cantidad de túbulos deformes (mas de 20/campo/ organismo). Se observan severas lesiones como melanización, necrosis, atrofia tubular, túbulos vacíos, formación de nódulos hemolíticos y presencia de granulomas. Muy letal con altas mortalidades.

Jorge Cuéllar-Anjel

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Tabla 5. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la infestación por gregarinas utilizando análisis en fresco. GRADO DE SEVERIDAD

SIGNOS CLÍNICOS

0

No presentan signos de infección por el parásito (0). No presentan lesiones causadas por el parasitismo.

1

Presencia muy baja del parásito (1-15/intestino/organismo). Se observan muy pocas lesiones causadas por el parasitismo como infiltración hemocítica.

2

Se observa la presencia moderada del parásito (16-50/intestino/organismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas por el parasitismo como infiltración hemocítica y formación de nódulos hemocítico Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento.

3

Se observa la presencia alta del parásito (51-100/intestino/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por el parasitismo, como infiltración hemocítica y áreas multifocales mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento.

4

Se observa gran cantidad del parásito (mas de 100/intestino/organismo). Se observan severas lesiones causadas por el parasitismo como infiltración hemocítica, melanización multifocal y necrosis. Muy letal con altas mortalidades.

Tabla 6. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la infestación por epicomensales en lamelas branquiales. GRADO DE SEVERIDAD

SIGNOS CLÍNICOS

0

No presentan signos de infección por protozoario (0). No presentan lesiones causadas por epicomensales.

1

Presencia muy baja de protozoarios (1-5/lámela/organismo). Se observan muy pocas lesiones causadas por los epicomensales, como infiltración hemocítica.

2

Se observa la presencia moderada de protozoarios (6-10/lámela/ organismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas por los epicomensales, como infiltración hemocítica y formación de n’odulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se toman las medidas de corrección.

3

Se observa la presencia alta de protozoarios (10-20/lámela/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por los epicomensales, como infiltración hemocítica y áreas multifocales mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se toman medidas de corrección

4

Se observa gran cantidad del parásito (mas de 20). Se observan severas lesiones causadas por los epicomensales, como infiltración hemocítica, melanización multifocal y necrosis. Muy letal con altas mortalidades.

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1.5

Bacteriología

Objetivo. El objetivo de la bacteriología en camarones, es cuantificar la cantidad y el tipo de las bacterias presentes en la hemolinfa, otros tejidos o larvas y postlarvas, así como en agua para / de cultivo. Descripción. La bacteriología es un conjunto de métodos que se utiliza como apoyo en el diagnóstico de enfermedades en camarones, cuando se sospecha que la causa de la enfermedad está relacionada con presencia de bacterias patógenas en el agua de cultivo o dentro del organismo de los animales. Consiste en la siembra de muestras en diferentes medios de cultivo, para determinar si hay crecimiento o no de bacterias potencialmente patógenas. Metodología. Después de definir qué poblaciones afectadas se van a examinar, se debe determinar el tipo de muestreo con base en el objetivo del estudio. El tamaño de muestra dependerá de si la captura es aleatoria o, de si se escogen sólo animales enfermos para la evaluación (ver el Capítulo 2 “Enfermedades virales” para más detalles sobre técnicas de muestreo). Los camarones que se van a someter a pruebas de bacteriología, deben estar siempre vivos; no debe realizarse ninguna prueba bacteriológica con camarones muertos, debido a que los resultados estarán sesgados por los cambios autolíticos (postmortem), con los cuales se alteran las poblaciones bacterianas presentes en los tejidos, así como su crecimiento. Antes de iniciar cualquier procedimiento bacteriológico, se deben tener previamente esterilizados todos estos elementos. El material de vidrio se envuelve en papel kraft y se esteriliza por la técnica de calor seco mediante un horno a una temperatura de 180oC durante un lapso de dos horas. El agua destilada y los medios líquidos de cultivo como el agua peptonada deben ser esterilizados por vapor húmedo mediante un autoclave a 15 libras de presión (121°C) durante quince minutos. Las asas de platino se esterilizan directamente por calor seco mediante la llama del mechero. El momento en el cual el asa se encuentra estéril sucede cuando ésta se torna de un color rojo incandescente. El colador con ojo de malla fino se debe desinfectar dejándolo inmerso en una solución de hipoclorito de sodio concentrado por 5 minutos. Posteriormente se lava con agua estéril hasta que desaparezca el olor producido por el hipoclorito. La toma de muestra para análisis bacteriológico tanto de agua de transporte de nauplios como de los mismos nauplios, se debe realizar, si es posible, en el momento de recibir los animales y directamente en las bolsas o cajas de transporte. La toma de muestra de agua en tanques de larvicultura, se debe realizar al menos en 2 puntos: la entrada del tanque y en el centro del mismo. En el caso de larvas o postlarvas, se debe tomar una cantidad conocida o estimada (lo más confiable posible) de animales, con el fin de emitir los resultados en función de unidades formadoras de colonia (UFC) por animal o por gramo de larvas¬/postlarvas. La muestra debe ser lavada con agua de mar estéril utilizando una malla fina o un colador pequeño de cocina, previamente desinfectado con yodo, formalina o etanol 70%. Las muestras deben ser luego maceradas en un recipiente esterilizado y agregando una cantidad conocida (en mL) de agua de mar estéril o solución salina estéril para la dilución del macerado. En el caso de camarones juveniles, subadultos o reproductores, se recomienda desinfectar el área de punción (seno cardíaco –dorsal– o seno hemolinfático –ventral–) con trozos de algodón impregnado con etanol 70%. Con una aguja de insulina (1 mL) nueva y estéril que tenga aguja hipodérmica (muy delgada), se extraen al menos 100 μL 18

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de hemolinfa. Es importante que si las posibilidades del laboratorio lo permiten, se utilice algún anticoagulante (ej.: citrato de sodio 10% en relación 1:1), cuyo volumen dentro de la jeringa se debe considerar antes de emitir los resultados de los conteos bacterianos en UFC. Tanto en el caso de macerado de larvas/postlarvas, hemolinfa de camarones mayores (anticoagulada o no) o agua de cuerpos de agua en estudio, se deben sembrar 100 μL en un medio sólido para el aislamiento de bacterias (cultivo primario). Esta siembra puede hacerse en agar TCBS (tiosulfato citrato bilis sal sacarosa), el cual es un medio selectivo principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae (género Vibrio), aunque también crecen especies bacterianas de los géneros Pseudomonas, Plesiomonas, Aeromonas, Flavobacterium y enterobacterias, entre otras. Para cultivos primarios existen medios no selectivos en los cuales crecen “bacterias totales” (la mayor parte de las bacterias presentes en agua o en los camarones), tales como TSA (agar tripticasa soya) y Agar Marino. Una vez se inoculan los 100 μL de muestra sobre el agar elegido y en condiciones asépticas (ambiente estéril con mecheros y/o en una cámara de flujo laminar), se extiende circularmente mediante el uso de un asa de Drigalski (varilla de vidrio tipo “stick de hockey”). De esta manera, se obtiene una distribución homogénea del inóculo. Seguidamente se invierte la caja de Petri y se incuba de esta manera a una temperatura de 30oC por 24-48 horas. Para determinar la morfología de las bacterias que han crecido, se realiza un extendido de una colonia representativa sobre una lámina portaobjetos, habiéndola diluido antes en solución salina estéril hasta obtener un grado de 0.5 en la escala de McFarland. Luego se deja secar y se colorea con tinción de Gram. Las bacterias del género Vibrio se observarán como bacilos Gram negativos bipolares. En caso de que haya crecimiento de bacterias, se deben contar las colonias para lo cual existen métodos de observación directa (a trasluz) o utilizando un equipo especial para conteo de colonias. Los valores se dan en UFC; en el caso de larvas o postlarvas será UFC/g o por cada “X” número de animales. En el caso de hemolinfa o de agua, el resultado se da en UFC/mL. Si las bacterias aisladas sugieren ser la causa de una enfermedad en los camarones (bacteriosis), se realizan pruebas de sensibilidad a antibióticos (antibiogramas), para establecer qué productos antibacterianos comerciales son capaces de eliminar dichas bacterias aisladas. Una vez determinado el antibiótico más efectivo, se puede realizar una prueba para medir la concentración mínima inhibitoria (MIC) de dicho antibiótico, capaz de matar la mayor parte de las bacterias. El resultado del MIC será utilizado como referencia para la medicación de la población afectada de camarones.

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MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA

Figura 1.21 Cabina de flujo laminar, utilizada durante la siembra de muestras de camarones, agua o sedimento en medios de cultivo, para evitar la contaminación con bacterias presentes en el ambiente. En su parte superior, la cabina posee un sistema que filtra el aire que ingresa al área de trabajo. Estos equipos están dotados con entradas de agua, gas y sistemas de vacío, así como luz blanca y luz ultravioleta.

Figura 1.22 Autoclave horizontal utilizado para esterilizar elementos, materiales y reactivos que se utilizan en bacteriología. Funciona con alta presión producida por vapor de agua, lo que eleva la temperatura a 121ºC, a la cual se exponen los materiales por 15 minutos.

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Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA

Figura 1.23 Siembra (inoculación) de hemolinfa anticoagulada de un camarón P. vannamei en agar TCBS. Se está utilizando un mechero de alcohol cerca del medio de cultivo, para procurar tener un ambiente estéril alrededor de la zona de siembra. El inóculo de 100 μL aplicado con una micropipeta graduada volumétricamente, será esparcido por todo el medio utilizando una barra metálica especial para tal fin.

Figura 1.24 Plato Petri con agar TCBS en el cual se observa crecimiento de bacterias Sucrosa positiva (colonias amarillas). La muestra pertenece a hemolinfa de un camarón P. vannamei y fue incubada durante 24 horas a 30ºC. El amarillo del medio (y no verde que es el original del agar TCBS) se debe al cambio de pH producido por el uso de la Sucrosa por parte de las bacterias predominantes.

Figura 1.25 Contador de colonias con pantalla digital, utilizado para la cuantificación de las colonias en los platos Petri donde se presentan crecimientos bacterianos. Cada colonia procede de una bacteria, la cual constituye una unidad formadora de colonia (UFC).

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1.6

Histología

Objetivo. La histología es la rama del saber científico que se ocupa del estudio de los rasgos morfológicos de los tejidos, por medio de instrumentos amplificantes. La histopatología es entonces la ciencia que estudia las modificaciones patológicas de las células y tejidos. En camarones, es una herramienta de diagnóstico que permite identificar cambios a nivel celular en cortes de tejidos que han sido sometidos a procesos físicos y tinciones rutinarias o especiales. Esta técnica permite detectar factores de mortalidad, bajo crecimiento, alteraciones de comportamiento y otros aspectos durante el cultivo en laboratorios de larvicultura, fincas de engorde e instalaciones de maduración de reproductores. Descripción. La histopatología permite identificar en la mayoría de los casos, la etiología de la enfermedad de la población de camarones bajo estudio; se logra generalmente hacer el diagnóstico de todas las enfermedades virales reportadas en camarones (por ejemplo las causadas por IHHNV, TSV, WSSV, HPV, YHV, BP, IMNV y PvNV), necrosis hepatopancreática (NHP), bacteriosis crónicas, gregarinas, protozoarios epicomensales, nemátodos, enteritis hemocítica y necrosis muscular idiopática, entre otras enfermedades. Para esto, se requiere que las láminas histológicas sean perfectamente preparadas y examinadas bajo el microscopio por el ojo de un patólogo entrenado. La autolisis es un proceso post-mortem que se presenta en los crustáceos extremadamente rápido y que consiste en la ruptura celular, salida de enzimas y componentes celulares, pérdida de la arquitectura de los tejidos y destrucción de los órganos. Por esta razón, los camarones deben morir por efecto de la inyección del fijador y por la inmersión en el mismo, el cual debe ofrecer una rápida penetración en los tejidos. El hepatopáncreas es el órgano más susceptible a la autolisis. Durante la fijación, la solución debe penetrar el órgano rápidamente o los cambios post-mortem conducirán a la pérdida de estructuras tisulares, eliminando zonas de tejido importantes para el diagnóstico. Si existe interés en estudiar problemas de morfología externa en camarones como es el caso de deformidades en post-larvas o presencia de epibiontes (epicomensales) adheridos a las branquias, también se obtienen buenos resultados si los animales son fijados vivos por inmersión en una solución de formalina al 10%. Metodología. El fijador de Davidson (Humason, 1979) es el más utilizado y sugerido para los procedimientos de rutina, cuando se van a preparar muestras de camarones para análisis histopatológico. Además de ofrecer buen nivel de detalle en el núcleo de las células, el ácido acético del fijador descalcifica la cutícula, evitándose así pasos adicionales de descalcificación del exoesqueleto durante el proceso histológico. La preparación del fijador de Davidson debe realizarse con base en la siguiente fórmula:

Para 1 litro de fijador de Davidson:

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Etanol 95%:

330 mL

Formaldehído 39%:

220 mL

Ácido acético glacial:

115 mL

Agua (corriente):

335 mL

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Para la realización de un estudio histológico en camarones, se requiere de un proceso sistemático que incluye fijación, deshidratación, inclusión en parafina, corte de segmentos ultradelgados (3 micras de espesor) y tinción. Cada etapa de éstas tiene sus propios pasos y tiempos cuya finalidad es preservar el tejido lo más intacto posible y obtener láminas de óptima calidad, las cuales permitan nitidez óptica en la organización celular de los tejidos, cuando sean estudiados bajo el microscopio. Fijación. Corresponde a la preservación de los tejidos en las mismas condiciones estructurales y morfológicas del momento de la muerte del camarón, lo cual como ya se mencionó, debe ser a causa de la inyección del fijador (Davidson). Los camarones deben ser fijados vivos o moribundos, nunca muertos. La fijación pretende desnaturalizar los componentes proteicos de las células. Durante la fijación, se debe inyectar abundante fijador de Davidson en el hepatopáncreas, resto del cefalotórax y en el músculo. Luego, el camarón se debe sumergir en el mismo fijador en relación 1:10 (10 veces el volumen del fijador respecto al de la muestra). En el caso de pls, se deben sumergir directamente en el fijador. Camarones con más de 12 g se deben someter a un corte lateral y longitudinal de la cutícula para facilitar el ingreso del fijador. El tiempo óptimo de fijación depende del tamaño del camarón, requiriéndose 12-24 horas para postlarvas y juveniles, 48 horas para pre-adultos y 72 horas para reproductores. Luego de estos tiempos, el fijador debe ser sustituido completamente por etanol 70%, el cual deberá reemplazarse a los 15 días si los camarones aún no han sido procesados. Deshidratación e inclusión en parafina. Consiste en eliminar la mayor parte del agua tisular y reemplazara con parafina líquida. Se realiza con un equipo automático y programable llamado “procesador de tejidos”. Durante el proceso, los tejidos pasan por 12 recipientes estando 1 hora en cada uno, los cuales contienen etanol 70% (2), etanol 80% (2), etanol 95% (2), etanol 100% (2), aclarante (2) (Xilol o “Hemo-De”) y finalmente parafina líquida a temperatura controlada (2). Bloqueo. Terminada la inclusión en parafina, los tejidos son ubicados en moldes (metálicos o plásticos) para formar un bloque el cual al enfriarse se solidifica, conteniendo el tejido en su interior. En la actualidad, existen “unidades de bloqueo” que consisten en equipos que manejan simultáneamente superficies con varias temperaturas diferentes, las cuales permiten tener parafina líquida, superficies de trabajo calientes y planchas con escarcha (hielo pulverizado) para el enfriamiento final de la parafina al terminar de hacerse el bloque. Los moldes plásticos disponibles para bloqueo, permiten además servir como base para el montaje de los tejidos en la unidad de corte (micrótomo). Corte. Esta es la parte del proceso histológico en la cual se utiliza un equipo altamente especializado llamado “micrótomo”, nombre dado debido a que permite realizar cortes de tejido con un espesor de 1 a 15 micras. Luego de ajustar el grosor deseado en este equipo, se realizan los cortes mediante giros de una manivela y cada vez que se le da una vuelta, el bloque de parafina avanza la cantidad de micras programada, hacia una cuchilla con un filo y calidad especial para histotecnia. Recuperación del corte. Las tiras de parafina que contienen el tejido cortado, son puestas sobre un equipo llamado “baño de recuperación de tejidos”, el cual contiene agua moderadamente caliente con temperatura controlada (40-50ºC aprox.), la cual puede contener una pequeña concentración de gelatina neutra. Las tiras se expanden al entrar en contacto con el agua caliente y así se elige la que presente una estructura más completa del tejido en cuestión. Separada de los segmentos no deseados mediante el uso de un pincel delgado, la porción seleccionada es recuperada con una lámina

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portaobjetos, en la cual quedará adherida de manera permanente y sobre la cual se hará la tinción final. Tinción. En camarones, el método de tinción más frecuente es el de Hematoxilina de Mayer-Bennett y Floxina/Eosina (H&E). Esta tinción involucra las siguientes soluciones y reactivos: Hemo De, etanol, agua destilada, hematoxilina, agua corriente, Floxina/Eosina y medio de montaje. Una vez teñidas las láminas histológicas, se sellan utilizando una gota de medio de montaje sobre el tejido y un cubreobjetos para proteger la muestra permanentemente. Los tiempos para cada paso pueden ser consultados en Lightner, 1996. Los colorantes (o tinciones) son sustancias químicas complejas, a menudo de comportamiento variable. Pueden ser de uso general para teñir tanto núcleo como citoplasma, o más específicos respecto a algún componente particular. Son sales neutras con radicales tanto ácidos como básicos. El colorante es básico cuando la propiedad de tinción está en el radical básico y las estructuras que tiñe se denominan Basófilas. Las estructuras basófilas son químicamente ácidas; tal es el caso de los ácidos nucleicos del núcleo (ADN) y los componentes ácidos del citoplasma (ARN). El colorante es ácido cuando la propiedad de tinción está en el radical ácido de la sal neutra; tal es el caso del citoplasma y en este caso las estructuras teñidas con colorante ácido son llamadas Acidófilas. La tinción H&E marca y define bien el núcleo, el citoplasma y la membrana celular por afinidad de electrones, resultando en la coloración azul oscuro del núcleo y la pared de las membranas por efecto de la hematoxilina y, el citoplasma de color rosado por efecto de la eosina. Los tejidos se tiñen para aumentar el contraste natural y hacer más evidentes los diversos componentes celulares, tisulares y material extrínseco. Además de ver la célula individualmente, la tinción H&E permite observar en conjunto las células de los órganos o tejidos, ofreciendo una buena diferenciación. Existen otras tinciones especiales que resaltan ciertas partes de los tejidos u organelos celulares, como el ácido periódico de Shiff (PAS) que resalta de rojo magenta el citoplasma de las células que contienen carbohidratos (músculo). Para teñir hongos de negro, se utiliza la tinción de Groccott ya que contienen sales de plata. Aunque las tinciones para hongos suelen tener sales de plata, también se utilizan para detectar bacterias como espiroquetas (Levaditi) y bacilos ácido-alcohol resistentes (Zihel-Neelsen). Otras tinciones para camarones incluyen la de Gram (bacterias), Brown & Brenn (rickettsias), Steiner & Steiner (espiroquetas y rickettsias), Giemsa (bacterias), Wright (rickettsias), Pinkerton (rickettsias), Kinyoun (bacterias ácido-alcohol resistentes), McManus´PAS (glicógeno y hongos), Feulgen (ADN) y Tricromo de Masson (contrastes especiales). Montaje. El exceso de colorante después de la tinción se elimina con agua o alcohol y se deshidrata el corte con alcoholes a concentraciones crecientes, pasando después de alcohol absoluto a una solución de agente aclarante. Posteriormente, se coloca una gota de bálsamo de Canadá (medio de montaje) y se cubre con el cubreobjetos dejándose secar. El corte obtenido, generalmente de no más de 3 micras de espesor, estará listo para ser observado a través de un microscopio óptico. Lectura e interpretación. Una adecuada interpretación de un corte observado al microscopio óptico, depende de factores como el plano del corte, la tinción utilizada y la interpretación funcional. Respecto al plano, es fundamental reconstruir la estructura tridimensional de células, tejidos y órganos a partir de cortes bidimensionales. La tinción es también fundamental ya que debe ser elegida correctamente con base en las estructuras microscópicas que queremos estudiar. En cuanto a la interpretación 24

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funcional, es importante establecer las correlaciones entre estructura y función de lo observado, tratando de transformar mentalmente las condiciones estáticas del corte en las dinámicas de la vida. Es fundamental para una correcta interpretación de hallazgos histopatológicos, que la observación sea hecha por un ojo entrenado en patología y, en particular, en los tejidos específicos de la especie que se va a estudiar. No es suficiente tener láminas preparadas con gran acierto y que ofrecen excelente calidad óptica bajo el microscopio, si quien las examina no tienen habilidad para diferenciar tejidos sanos de órganos o tejidos con lesiones. Durante la preparación de los cortes histológicos, pueden presentarse alteraciones denominadas “artefactos”, los cuales deben ser reconocidos y diferenciados de áreas conservadas de tejidos. Generalmente, se deben a errores en el empleo de sustancias en la preparación del tejido, defectos en la cuchilla que se traducen en muescas en la preparación, contaminación de los colorantes o, errores de montaje como pliegues.

MÉTODO DE HISTOLOGÍA

Figura 1.26 Fijación de un camarón juvenil P. vannamei. La solución que se está inyectando al animal aún vivo, es Davidson - AFA. Nótese el cambio de color del hepatopáncreas que pasó de amarillo (normal) a anaranjado, por efecto del fijador luego de haber sido inyectado. Se observa el uso indispensable de guantes para la manipulación de esta solución fijadora.

Figura 1.27 Cabina para extracción de gases, utilizada para la manipulación de muestras que han sido fijadas para procesamiento histológico. Se observa un vidrio de seguridad en el frente, a través del cual se pueden ver las muestras que se manipulan y el cual protege la cara de salpicaduras de reactivos irritantes. También cuenta con fuente de agua para lavado de elementos o partes del cuerpo en donde haya caído algún reactivo histológico.

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MÉTODO DE HISTOLOGÍA

Figura 1.28 Procesador de tejidos para histología. Este equipo cuenta con 10 vasos de 1 L cada uno, donde se hace la deshidratación de los tejidos y se incorpora parafina líquida a temperatura controlada (2 vasos con termostatos, de color blanco ubicados a la derecha). Cuando esta se enfría, da textura firme al tejido y permite realizar cortes con el micrótomo sin que se deformen por el paso de la cuchilla.

Figura 1.29 Central de bloqueo. Esta unidad posee superficies y compartimentos con temperaturas controladas electrónicamente (T1, T2 y T3) y permite preparar los bloques de parafina con los tejidos incluidos. Durante este proceso, el tejido en parafina es ubicado en un cassette plástico y cubierto con parafina líquida obtenida a través de un dispositivo especial (P), para formar un bloque. Este se solidifica luego de estar por unos minutos sobre una superficie con escarcha que posee el mismo equipo (E).

Figura 1.30 Corte de tejidos en el micrótomo. Se observa un cassette (blanco) con un corte de cefalotórax (anaranjado) siendo montado en la base móvil de un micrótomo, antes de que sean cortadas las secciones a 3 micras de grosor.

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MÉTODO DE HISTOLOGÍA

Figura 1.31 Baño de recuperación de tejidos, en el cual las tiras de parafina con tejido que se han obtenido con el micrótomo, son puestas en flotación en agua caliente. La parafina se expande con el calor y se elige el mejor corte, capturándolo con una lámina portaobjetos y ubicándolo sobre esta en la posición en la cual va a quedar de forma definitiva.

Figura 1.32 Batería de tinción con hematoxilina y eosina, en la cual se agregan los colorantes a los tejidos para obtener el contraste entre las diferentes células y entre las distintas partes de cada una. En la foto se observan los reactivos utilizados para la tinción de rutina, donde se puede apreciar la canasta con láminas siendo inmersa en eosina.

Figura 1.33 Lámina portaobjetos con cortes histológicos de un camarón juvenil P. vannamei, los cuales han sido teñidos con H&E. Se observa un corte longitudinal de cefalotórax (C), uno transversal de abdomen (A) y uno longitudinal de branquias (B).

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MÉTODO DE HISTOLOGÍA

Figura 1.34 Corte histológico de un segmento del corazón de un camarón subadulto P. vannamei. Se observa la válvula aórtica de un animal sano (flechas), en el lugar donde la hemolinfa ingresa a la arteria aorta (A). H&E. Amplificación 100X.

Figura 1.35 Corte histológico de hepatopáncreas de un camarón subadulto P. vannamei. Se observan túbulos normales compuestos por diferentes tipos de células y con un lumen en el centro. No hay evidencia de lesiones que sugieran presencia de una enfermedad degenerativa. H&E. Amplificación 200X.

Figura 1.36 Corte histológico de hepatopáncreas de un camarón juvenil P. vannamei, con inflamación a causa de la enfermedad NHP. Los principales hallazgos histopatológicos son agregación hemocítica severa (inflamación), melanización de varios túbulos, citolisis y pérdida de la arquitectura de la zona afectada. H&E. Amplificación 200X.

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1.7

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

Pruebas con anticuerpos

Objetivo. La prueba de ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) es una prueba rápida de laboratorio, en la cual un anticuerpo conocido se une a un antígeno (viral o bacteriano) presente en una muestra de camarón, con el fin de detectar la presencia o no de dicho agente patógeno en la muestra. Esta prueba que utiliza anticuerpos para el diagnóstico de enfermedades en camarones, se llama en español “inmunoanálisis ligado a enzimas” o también “enzimoinmunoanálisis de adsorción” (EIA). Descripción. La técnica de ELISA utiliza anticuerpos específicos para la identificación de antígenos también específicos, los cuales son componentes estructurales (usualmente proteínas) de agentes patógenos o, proteínas únicas producidas o inducidas por ellos. Esta prueba provee una estrategia de diagnóstico la cual es potencialmente muy rápida (en algunos casos sólo tarda 1 hora), de buena sensibilidad y adaptable a un gran número de muestras en un pequeño espacio tanto en laboratorio como en condiciones de campo. La prueba de ELISA puede ser realizada con base en anticuerpos policlonales o monoclonales. Metodología. La prueba de ELISA combina la especificidad de anticuerpos con la sensibilidad de pruebas enzimáticas simples, usando anticuerpos o antígenos acoplados a una enzima fácilmente detectable. La ELISA puede proporcionar un sistema útil para la medición de la concentración de un antígeno o de un anticuerpo. Hay dos variaciones principales en este método: la ELISA puede usarse para detectar la presencia de antígenos que son reconocidos por un anticuerpo o para detectar anticuerpos que reconocen un antígeno. Una prueba de ELISA es un procedimiento que involucra cinco pasos generales: 1) cobertura de los pozos de la microplaca con el antígeno; 2) bloqueo de todos los sitios no cubiertos por el antígeno, para evitar resultados falsos positivos; 3) adición de anticuerpos a los pozos de la microplaca; 4) adición de anticuerpos conjugados con una enzima; 5) reacción de un substrato con la enzima para producir un producto coloreado, indicando así una reacción positiva. Hay muchos tipos diferentes de ELISA. Uno de los tipos más comunes es la ELISA “sandwich”. La siguiente es la metodología general para realizar una prueba de ELISA. Algunos pasos, reactivos y cantidades podrán cambiar según se requiera para cada protocolo asociado con un antígeno en particular. Una microplaca para ELISA se debe cubrir con el antígeno apropiado, llenando los pozos con 100 μL del antígeno diluido. Se incuba toda la noche a 4ºC y se lava el antígeno no adherido en la microplaca mediante golpes suaves. Luego se llenan los pozos con agua destilada y se vacían de nuevo con un golpe suave; se repite esto 2 veces más utilizando PBS-Tritón. Se debe bloquear la unión no específica agregando 200 μL de BSA/PBS 1% y se incuba luego por 30-60 minutos a temperatura ambiente. Se lava la microplaca como se mencionó anteriormente y se agregan 100 μL de las muestras diluidas en los respectivos pozos de la microplaca. Hay que asegurarse de incluir siempre controles positivo y negativo y, si es necesario, una curva estándar. Se incuba por 1 hora a temperatura ambiente y se repite luego el paso del lavado. Luego se prepara la dilución apropiada del segundo paso del anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano (los anticuerpos deben ser titulados para buscar obtener una dilución óptima). Se deben agregar luego 100 μL del anticuerpo del segundo paso a los pozos y se incuba por 1 hora. Hay que repetir nuevamente el paso del lavado. Se prepara la solución 29

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del substrato y se agregan 100 μL a los pozos, incubando luego a temperatura ambiente por 60 minutos. Finalmente se agrega la solución de parada en cantidad suficiente y se leen las microplacas en un lector de ELISA.

MÉTODO DE PRUEBAS CON ANTICUERPOS Y PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS (ESPECTROFOTOMETRÍA)

Figura 1.37 Procedimiento de ELISA en microplaca de 96 pozuelos. Se fijan anticuerpos y se agrega el antígeno complementario. Esta unión se detecta agregando un segundo anticuerpo contra el mismo antígeno, marcado con una enzima. Esta, en contacto con un substrato, produce color cuya intensidad es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra. Foto: Cultek S.L.U.

Figura 1.38 Microplacas de ELISA con 96 pozuelos, utilizadas para pruebas con anticuerpos y en mediciones de parámetros inmunológicos de camarones. Son montadas en un lector de ELISA para detectar por colorimetría la cantidad existente de un antígeno de interés. Foto: Cultek S.L.U.

Figura 1.39. Lector de microplacas de ELISA con 96 pozuelos. Colorímetro que permite hacer lecturas de punto final, funcionando de manera independiente o conectado a un computador para registro y análisis de datos. Tiene capacidad para almacenar 100 ensayos y 20 microplacas de datos. Foto: Cultek S.L.U.

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1.8

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

Métodos moleculares

La hibridación es una de las principales metodologías que se utiliza actualmente en los laboratorios de biología molecular. Unas de estas técnicas se han diseñado para identificar secuencias específicas en los ácidos nucleicos. La hibridación se refiere al apareamiento específico que ocurre entre cadenas de ácidos nucleicos con secuencias complementarias, proceso que es análogo a la reacción antígenoanticuerpo, pero con la diferencia de que en la hibridación en lugar de anticuerpos se emplean sondas genéticas. Éstas son fragmentos cortos de ADN o ARN sintetizados in vitro y que se marcan con sustancias radiactivas, fluorescentes o de otro tipo, a fin de hacer posible su posterior detección y de esta manera la identificación de la secuencia de ADN o ARN de interés. En camarones, las principales técnicas de biología molecular utilizadas como apoyo para la detección de agentes patógenos en muestras de animales afectados, son: dot blot, hibridación in situ, PCR, RT-PCR y PCR en tiempo real (real-time PCR), esta última principalmente en investigación más que en diagnóstico. De éstas, las que presentan mayor sensibilidad y especificidad son las relacionadas con PCR.

Dot blot Objetivo. Detección de patógenos (ej.: virus) en una muestra de tejido de camarón, mediante el reconocimiento de la presencia de su ADN a través de un proceso de lisis (ruptura) celular, extracción del ADN, hibridación y revelado. En camarones existen sondas para detectar virus como WSSV o IHHNV y para detectar bacterias intracelulares como la alfa Proteobacteria causante de la NHP. Descripción. El dot blot es una técnica de hibridación en la cual el ADN se ubica directamente sobre una membrana de nylon o de nitrocelulosa. Su nombre se debe a que sobre la membrana donde se ubican las muestras del ADN extraído, se forman círculos o puntos. Esta técnica involucra sondas genéticas en su procedimiento, las cuales son pequeños fragmentos de ADN (oligonucleótidos), que son complementarios de regiones que nos interesan en el ADN que se está buscando en una muestra (ej.: virus). De esta manera, si en una muestra problema se produce la hibridación entre la sonda y el ADN viral, se puede concluir que el virus en cuestión se encuentra presente. Las sondas genéticas para camarones son marcadas utilizando moléculas como la biotina o la digoxigenina, las cuales son luego detectadas mediante enzimas como la fosfatasa alcalina, produciendo una reacción colorimétrica y de esta manera detectable por el ojo humano. Las sondas genéticas son específicas para un único tipo de microorganismo. En la actualidad, es factible conseguir sondas genéticas en kits comerciales. Este tipo de prueba es muy útil cuando se quiere estudiar un gran número de muestras, pero tiene la limitante de no ofrecer muy alta sensibilidad, además de que su revelado final es por colorimetría. Metodología. El procedimiento de dot blot en camarones, inicia con una muestra de hemolinfa o de otro tipo de tejido de un animal sospechoso de una enfermedad (ej.: virus WSSV). Cabe recordar que se debe utilizar una sonda específica para el tipo particular de microorganismo que se va a buscar. La muestra es macerada mecánicamente con un tampón (buffer) de lisis, con lo cual se busca romper las células y permitir la salida de las moléculas de ADN hacia la solución del macerado. Luego, una cantidad de macerado (inferior a una gota) es puesta sobre una membrana de nylon (o de nitrocelulosa). El ADN es luego desnaturado, es decir, se separan las

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cadenas de la doble hebra y luego se coloca la sonda previamente calentada. Dicha sonda ha sido modificada, habiéndosele unido una molécula de digoxigenina. Se incuban las muestras con la sonda y si esta encuentra regiones del ADN viral que sean complementarias (guardando el concepto de complementariedad de los nucleótidos A-T y C-G), se produce anillado o hibridación (unión entre la sonda y el ADN viral), que es una molécula estable de ADN híbrida de doble cadena. Luego de incubar, se realiza un lavado y se agregan anticuerpos anti-digoxigenina, que han sido previamente marcados con la enzima fosfatasa alcalina. Si la sonda está presente en las muestras, se formará un complejo “antígeno-anticuerpo” con la digoxigenina. Se hace un último lavado y se agrega una solución reveladora (BCIP-NBT), la cual reacciona con la fosfatasa alcalina y produce una reacción colorimétrica. La intensidad del color morado que se produce, es proporcional a la cantidad de microorganismos presentes en la muestra (partículas virales de WSSV en el caso de este ejemplo).

Hibridación in situ (HIS) Objetivo. Este método permite detectar el ADN o ARN problema en el interior de las células, permeabilizándolas de tal forma que se permita la entrada de una sonda. Entre las principales aplicaciones de la HIS, está la detección de ARN o ADN de origen viral o, ADN de origen bacteriano, en tejidos de camarones fijados y procesados mediante inclusión en parafina. Por lo tanto, también es útil para realizar estudios retrospectivos en material de archivo fijado e incluido en parafina varios años atrás. Los patógenos o enfermedades en camarones que pueden ser detectados en la actualidad mediante HIS, son IHHNV, TSV, YHV, WSSV y NHP Descripción. Es un método histoquímico que emplea la biología molecular, de la misma manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. Al igual que en el caso de la hibridación dot blot, la especificidad de la HIS se basa en la unión recíproca de una sonda (secuencia de oligonucleótidos), con un fragmento complementario de ARN o ADN dentro de una muestra de tejido. A diferencia que el dot blot, la HIS utiliza como matriz un corte histológico de un camarón previamente fijado y procesado mediante inclusión en parafina, el cual ha sido adherido (al igual que en la histología) sobre una lámina portaobjetos, pero en este caso la lámina debe tener una carga positiva. En vez de realizar el proceso de tinción como en histología, se realiza la aplicación de la sonda y los demás componentes para la detección genómica de un agente patógeno específico. Metodología. El procedimiento de hibridación in situ en camarones, se inicia a partir de un bloque de parafina con una muestra de camarón, igual al que es utilizado para histología de rutina. El bloque es ubicado en un micrótomo y se corta una sección no mayor a 4 micras de espesor, la cual debe ser recuperada por flotación en una lámina portaobjetos cargada positivamente. La lámina con la muestra en parafina debe ser calentada para eliminar la parafina y posteriormente re-hidratada utilizando xilol (o algún substituto), etanol en concentraciones descendentes (100%, 95%, 80% y 50%), agua destilada y buffer TNE. La lámina se incuba luego con proteinasa K en una cámara húmeda, se sumerje luego en formaldehído y se lava con un buffer. Se aplica entonces la solución de hibridación y se incuba en cámara húmeda. Si el ADN o ARN del patógeno que se está buscando se encuentra presente en la muestra, en este momento se realiza el anillado o hibridación que como ya se explicó en 32

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la técnica de dot blot, es una unión entre la sonda y fragmentos del genoma viral o bacteriano, que forma así una molécula estable. Para los virus IHHNV, HPV y TSV, la sonda se diluye en la solución de hibridación y es puesta directamente sobre la muestra. En el caso de BP, MVB, WSSV y NHP, se requiere de un calentamiento previo de la muestra para desnaturalizar el ADN baculoviral de doble cadena (dsDNA). La muestra se debe incubar en cámara húmeda toda la noche; para el caso de IHHNV y HPV a 37ºC, para BP, MVB, WSSV, NHP y TSV a 42ºC. Posteriormente las muestras deben ser sometidas a varios lavados con buffers distintos y luego se aplican los anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina. Se incuban y posteriormente se hacen nuevos lavados con soluciones buffer. Se aplica la solución de desarrollo y se frena luego la reacción cuando sea ya necesario de acuerdo con criterios colorimétricos, lavando con soluciones buffer y después con agua destilada. Las muestras se someten luego a tinción con el colorante “Bismark Brown Y” y se deshidratan posteriormente utilizando etanoles ascendentes (95% y 100%) y xilol (o algún substituto). Sin dejar secar la muestra en este momento (y en ninguno de los procesos anteriores), se pone una gota de medio de montaje sobre el tejido y se cubre con una laminilla o lámina cubreobjetos. Se deja secar y se observa luego en un microscopio de campo oscuro, para detectar depósitos intracelulares de precipitado negro o azul oscuro y/o alguna citopatología específica que haya sido marcada por la sonda. La interpretación de los resultados varía en cada muestra, según el patógeno que se está buscando y, por consiguiente, las células de los tejidos “blanco” que se espera hayan sido infectados por el agente viral o bacteriano. En el caso del virus TSV, debe considerarse que una manipulación incorrecta antes de la prueba, puede arrojar resultados falsos negativos. Adicionalmente, las muestras para TSV deben ser manejadas en ambientes y con reactivos libres de RNAsas; el personal debe ser entrenado en el manejo de muestras con patógenos cuyo genoma es ARN y en este tipo de ambientes libres de RNAsas.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Objetivo. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés - polymerase chain reaction), es un método enzimático de amplificación de secuencias específicas de ADN, que permite la síntesis in vitro de un fragmento de ADN de forma tal que, en cada ciclo del proceso, se duplica el número de moléculas. De esta manera, se utiliza para la detección genómica de ciertos microorganismos patógenos como virus (ADN y ARN) y bacterias, en muestras de camarones o de organismos relacionados. La PCR es utilizada en camarones para la detección de los virus WSSV, IHHNV, BP, MBV, SMV, YHV (grupo), IMNV, TSV y PvNV. Descripción. El principio de la PCR consiste en determinar la secuencia de interés y seleccionar pequeños segmentos de nucleótidos llamados iniciadores o cebadores (“primers” en Inglés), complementarios con la secuencia de nucleótidos de los extremos opuestos de las cadenas que flanquean a dicha secuencia, a partir de los cuales se inicia la elongación o síntesis de nuevas cadenas en el extremo 3’ de cada iniciador. La PCR se realiza en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta un millón de copias de un solo fragmento en pocas horas. Los elementos necesarios para llevarla a cabo se comercializan en forma de kits. 33

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En esta técnica se consideran importantes los siguientes parámetros: un suministro abundante de iniciadores y de desoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs); una fuente renovada de ADN polimerasa (enzima encargada de la síntesis de las cadenas complementarias) y los ciclos periódicos de cambios de temperatura. Estos últimos consisten en: desnaturalización del ADN a 100ºC, alineamiento de los iniciadores con las secuencias de interés entre 50 y 60ºC y, síntesis del ADN a 72ºC. Estas temperaturas pueden variar de acuerdo con las condiciones de la reacción. El poder de la amplificación con PCR es tan alto que los más pequeños contaminantes pueden dar resultados falsos positivos, por lo que el material y las soluciones a emplear deben ser muy cuidadosamente manipulados y almacenados. Metodología. La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación del ADN que ocurre de forma natural en las células vivas. El ADN es de doble cadena (es decir, cada cadena de ADN está apareada con otra complementaria). Durante la replicación, las dos cadenas se separan y una enzima especializada llamada polimerasa, hace una copia de cada una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par de cadenas hijas. La polimerasa necesita otros tres ingredientes para copiar ADN. El primero es una reserva de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de ADN, llamados nucleótidos o bases. El segundo es una fibra corta de ADN copiado, que se llama cebador oligonucleotídico o primer, el cual está formado por varios nucleótidos que inician la replicación. El tercero es el cofactor MgCl2, sin el cual la enzima no puede funcionar. La PCR utiliza estos mismos ingredientes para copiar ADN en un microtubo de ensayo. La reacción tiene lugar en tres fases. Durante la primera o desnaturalización, la plantilla o fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90 a 95ºC durante 30 segundos; esto provoca la separación de las dos cadenas. En la segunda fase, llamada anillaje, la temperatura de la mezcla se baja hasta 55ºC durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotídicos se enlacen con el ADN escindido. En la tercera fase o de polimerización, la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75°C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN. Estas tres fases tienen lugar en el mismo tubo de reacción y constituyen un ciclo completo de PCR, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores, deben renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir millones de copias de ADN. Cuando la muestra contiene un agente patógeno cuyo genoma es ARN, se debe utilizar antes de la PCR un paso adicional. Consiste en adicionar a la muestra (ARN extraído) una enzima llamada transcriptasa reversa, la cual transcribe el RNA en ADN complementario (cDNA), molécula que es un ADN de doble cadena y, por consiguiente, susceptible de ser amplificada mediante una reacción normal de PCR. Este proceso enzimático que se requiere para los virus ARN, ha hecho que la PCR que lo utiliza se llame “PCR con transcriptasa reversa” (RT-PCR). La polimerasa utilizada actualmente es termoestable, no se inactiva por las elevadas temperaturas de la primera reacción y es llamada Taq, debido a que proviene de Thermus aquaticus, una bacteria termófila. Debido a que la polimerasa Taq no resulta destruida por las elevadas temperaturas a las que transcurre la PCR, basta con añadirla una vez, al principio de la reacción. La polimerasa Taq se fabrica ahora con bacterias modificadas genéticamente.

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El uso de la PCR exige mucho cuidado. Lo más importante es evitar la contaminación de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar accidentalmente cantidades mínimas de ADN contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminación.

PCR en tiempo real (real time PCR, Q-PCR) Objetivo. La prueba de PCR en tiempo real se utiliza para determinar la cantidad de ADN en tiempo real durante el proceso de amplificación, usando sondas marcadas fluorescentes. Descripción. En biología molecular, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, también es llamada la reacción en cadena en tiempo real cuantitativa de la polimerasa (QRTPCR) o reacción en cadena cinética de la polimerasa. La PCR en tiempo real es una técnica de laboratorio que permite cuantificar y amplificar simultáneamente una parte específica de una molécula dada de ADN o ARN. Se utiliza para determinar si una secuencia específica está o no presente en una muestra; si está presente, la técnica permite conocer el número de copias en la muestra. Es la versión en tiempo real de la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (Q-PCR), así como una modificación de la tradicional reacción en cadena de la polimerasa. Para llevar a cabo la detección en tiempo real de un genoma de interés, existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte interna del ADN que queremos amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe esta fluorescencia (“quencher”), de tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa, la molécula fluorescente se libera de la acción del “quencher” y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser. La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR, será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. En general, para que sea válida esta técnica, requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones, para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando. Las diferentes formas de detección de la PCR en tiempo real como TaqMan o “Molecular Beacon”, se han vuelto herramientas populares para la detección de agentes infecciosos. Estas nuevas pruebas tienen varias ventajas sobre las PCR clásicas (un paso) o anidadas (2 pasos). Sólo es utilizado un par de iniciadores (primers), los cuales proporcionan con frecuencia una sensibilidad similar o igual a la de PCR anidada, pero con un mucho menor riesgo de contaminación. La fluorescencia que indica la presencia del producto amplificado, es medida en el mismo tubo de reacción, por lo que no es necesaria la manipulación post-PCR de los productos amplificados. La lectura de la fluorescencia es automatizada, por lo que se evitan resultados subjetivos. Estos procedimientos consumen una cantidad de tiempo considerablemente menor comparados con la PCR tradicional, ya que no es necesario detectar el fragmento amplificado mediante electroforesis en geles de agarosa, seguidos por la tinción con bromuro de etidio y, de nuevo, el riesgo de contaminación es reducido. El uso de un formato de bandeja con 96 pozuelos sin necesidad de hacer una PCR anidada, permite que el procedimiento sea automatizado. Metodología. Los equipos requeridos para realizar una PCR en tiempo real, son de forma combinada un termociclador, un fluorómetro y un monitor. El termociclador efectúa la PCR en muestras que contienen fluorocromo fluorescente proporcional a la cantidad de DNA, cantidad que dobla de ciclo en ciclo. Un rayo láser excitador es transmitido a la muestra por una fibra óptica. La emisión fluorescente inducida es enviada al fluorómetro que la analiza a diferentes longitudes de onda. A menudo, la misma fibra transmite el rayo excitador y recibe la fluorescencia. El monitor indica, después de cada ciclo, la fluorescencia leída dentro de la longitud de onda elegida para la muestra.

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A partir de este momento, la señal dobla de ciclo en ciclo. Se observará aparecer en el computador una curva creciente, ya que la fluorescencia de cada tubo es medida en cada ciclo. El número de ciclos a partir del cual la curva comienza a crecer, es proporcional a la concentración inicial de ADN.

PRUEBAS MOLECULARES - DOT BLOT

Figura 1.40 Resultados de una prueba de dot blot para WSSV sobre una membrana de nitrocelulosa. Cada cuadro pequeño (1 cm2) corresponde a un camarón. La intensidad de la mancha morada en cada cuadro, es proporcional a la cantidad de ADN viral presente en las células analizadas de cada camarón. En esta membrana se pueden observar muestras con severidad baja (círculo amarillo), media (círculo azul) y alta (círculo rojo). En la parte inferior (centro) se observan los resultados del control con 3 cuadros, siendo de izquierda a derecha “negativo” (ausencia de color), positivo leve (una “+”, color morado tenue) y positivo más fuerte (dos “++” y color morado más intenso).

PRUEBAS MOLECULARES - HIBRIDACIÓN IN SITU

Figura 1.41 Corte de tejido de epitelio cuticular de estómago de un camarón juvenil P. vannamei infectado con el virus WSSV. La sonda reaccionó fuertemente con el ADN viral presente en los cuerpos de inclusión intranucleares, mediante la prueba de hibridación in situ utilizando una sonda de ADN marcada con digoxigenina. La coloración obtenida es producto de la reacción entre la sonda marcada y Bismark Brown. Amplificación: 1000X (modificada de Lightner, 1996).

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PRUEBAS MOLECULARES – PCR

Figura 1.42 Procedimiento de extracción de ADN, mediante la utilización de un kit comercial con base en soluciones de lisis celular. Nótese el uso de puntas de micropipeta protegidas con un filtro (blanco) en su base, para evitar la contaminación de la micropipeta y el paso de ADN viral de una muestra a otra (contaminación cruzada).

Figura 1.43 Cámara de trabajo para PCR. Dentro de ella, circula aire ultrafiltrado y se utiliza para la preparación de los reactivos que se utilizarán en las pruebas de amplificación (PCR). Los elementos que se utilizan dentro de la cámara, no deben salir de la misma y deben estar marcados según sean utilizados en diferentes tipos de muestras o para diferentes tipos de agentes patógenos.

Figura 1.45 Cámara de electroforesis (izquierda) y fuente de poder (derecha), que permiten la migración del ADN amplificado en un gel de agarosa y mediante un flujo eléctrico continuo. Después de este proceso, las muestras migradas en el gel, están listas para ser observadas en un visor de luz ultravioleta (“transiluminador uv”).

Figura 1.44 Termociclador (“aparato de PCR”) con 96 pozos para igual número de tubos de 0.2 mL. En este equipo se realiza propiamente la PCR dentro de los tubos que contengan el ADN de la muestra y los reactivos de amplificación. Su función es realizar mediante un comando computarizado programable, muchos ciclos a diferentes temperaturas y con diferentes tiempos.

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PRUEBAS MOLECULARES – PCR

Figura 1.46 Transiluminador de luz ultravioleta utilizado para revelar la presencia de bandas de ADN, producto de la amplificación por PCR y que migraron en una cámara de electroforesis. La tapa que se observa color púrpura, posee un filtro que protege al operario de la luz uv. Nótese el uso de guantes por parte del operario, mientras manipula el gel de agarosa para ser puesto sobre el transiluminador.

Figura 1.47 Gel de agarosa con productos de amplificación de ADN obtenidos mediante PCR, vistos a través de un transiluminador de luz ultravioleta. La columna de la izquierda posee un marcador de peso molecular; las columnas siguientes (1 a 5) poseen muestras que fueron amplificadas. Las bandas blancas que se observan en éstas, corresponden a resultados positivos en la búsqueda de un agente patógeno de una muestra mediante PCR.

PRUEBAS MOLECULARES – PCR EN TIEMPO REAL

Figura 1.48 Vista panorámica de los equipos utilizados para realizar la prueba de PCR en tiempo real. A la izquierda se encuentra el módulo térmico o equipo de PCR en tiempo real (termociclador); a su derecha una fuente de poder, luego una CPU para el procesamiento de los datos suministrados por el termociclador y a la derecha el módulo de visualización (monitor) para la observación de los resultados que se van obteniendo en cada ciclo y en tiempo real.

Figura 1.49 Termociclador utilizado para la prueba de PCR en tiempo real. Se observa un panel de control con comandos (botones) verdes y azules para la programación del equipo, así como una pequeña pantalla para visualizar la información correspondiente a la programación y al avance de los ciclos de amplificación y cuantificación. Figura 1.50 Visualización de una gráfica con datos de productos amplificados durante una prueba de PCR en tiempo real. Cada línea de color corresponde a una muestra analizada y al control utilizado. La columna de la derecha indica la cantidad aproximada de copias de ADN que se encuentra en cada muestra.

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Parámetros inmunológicos

Este tema será tratado con mayor profundidad en el punto “3” (parametros hematoinmunológicos como indicadores de salud) del Capítulo 6 “Inmunología”. Por esta razón, sólo se hará en éste capítulo una mención general de las principales técnicas inmunológicas, como herramientas para el diagnóstico de enfermedades en camarones. La medición de algunos parámetros inmunológicos en los camarones, permite evaluar y determinar en un momento dado, las condiciones sanitarias de un grupo de animales o de una población en un sistema comercial de cultivo. Estos parámetros están relacionados con la capacidad de respuesta inmune de los organismos, frente a la invasión de agentes bioagresores (virus, bacterias y hongos), o elementos inertes que entran en contacto con los animales. Los principales parámetros inmunes de los camarones que se pueden medir en la hemolinfa, son los siguientes: Hemograma: los hemocitos constituyen la barrera celular del sistema inmune, que defiende al camarón de agresores que ingresan al organismo para causar infección celular y posteriormente enfermedad. El hemograma consiste en realizar un conteo total o diferencial de los hemocitos en la hemolinfa, para establecer una relación entre los valores obtenidos y las condiciones de salud de los camarones examinados (o de sus poblaciones de origen). Para realizar un hemograma, se extrae hemolinfa con un anticoagulante protector de hemocitos (por ejemplo solución de Alsever (AS) o “SSS”) conteniendo una concentración de NaCl apropiada para animales marinos (de 330 a 450 mM NaCl), o simplemente una solución de citrato de sodio o de EDTA) y se monta sobre una cámara de Neubauer para realizar el conteo. El valor final debe incluir los cálculos correspondientes a la dilución con el anticoagulante y la profundidad y área de la cámara utilizada. Los resultados se dan en hemocitos (totales, granulares, semigranulares o hialinos) por cada mm3 de hemolinfa. Los valores promedio de hemocitos totales/ mm3 más frecuentes en camarones preadultos sanos, se encuentran entre 25.000 y 35.000. Como se mencionará más adelante, deben tenerse en cuenta las condiciones propias del camarón (muda, sexo y edad) y del medio de cultivo (temperatura, salinidad y oxígeno disuelto, entre otras), ya que éstas afectan los valores obtenidos en los conteos de hemocitos. Concentración de proteínas plasmáticas: este parámetro es utilizado para evaluar el estado sanitario de los camarones. Sin embargo, entre el 60 y el 97% de las proteínas plasmáticas totales está compuesto por hemocianina (pigmento extracelular que transporta el oxígeno a los tejidos del camarón). Por esta razón, cambios importantes en la concentración de la hemocianina, afectan directamente los valores obtenidos para proteínas plasmáticas. Adicionalmente, la concentración de las proteínas plasmáticas puede verse influenciada por condiciones de tipo infeccioso, ambiental o fisiológico. Cuando el camarón está infectado, puede haber una lisis celular y destrucción de sus tejidos afectados, lo que genera un aumento en la concentración proteica de la hemolinfa. Todo lo anterior sugiere que deben realizarse estudios más profundos, para poder utilizar este parámetro inmunológico como un verdadero criterio para conocer el estado sanitario de los camarones. Para determinar las proteínas plasmáticas totales en una muestra de hemolinfa de camarón, se pueden utilizar métodos de rutina como el de Lowry, Biuret o Bradford. De manera general, el nivel de proteínas plasmáticas totales en camarones, se determina a partir de muestras de suero. Luego de extraer la hemolinfa, se deja coagular a 4ºC por al menos 12 horas y luego se centrifuga para recuperar el suero. Se agrega un 39

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volumen de suero a una microplaca y se hace reaccionar con el reactivo del método utilizado. De esta manera se obtiene la formación de un complejo coloreado el cual es medido con un lector de microplacas utilizando un filtro con una longitud de onda determinada para cada método (ej.: 546 nm para Biuret). Finalmente, se extrapola la concentración de proteínas totales en el plasma de la muestra, a partir de una curva de calibración con una solución stock de BSA estándar (1mg/mL). Capacidad de hemoaglutinación: con este método es posible determinar las condiciones sanitarias de los camarones, mediante la medición de la capacidad de las proteínas de reconocimiento de patrones (PRPs) (especialmente las de reconocimiento de lipopolisacáridos), presentes de manera natural en la hemolinfa. Sus funciones incluyen reconocer y aglutinar cuerpos invasores. Por comodidad, se usan en los ensayos eritrocitos de diferentes mamíferos, por ser células extrañas al camarón y, sobretodo, por ser células con coloración natural, facilitando así la observación a simple vista de la reacción. El estudio de estas proteínas y sus mecanismos de reconocimiento, comienza a ser una herramienta muy potente para las estrategias de selección de animales genéticamente resistentes a enfermedades. La actividad hemoaglutinante de la hemolinfa, podría constituirse en un indicador de salud y de adaptación del camarón, ya que por ejemplo existe una relación directa entre los títulos de hemoaglutinación y la calidad reproductiva de los machos (índice de espermatogénesis). Igualmente, la sensibilidad de la actividad hemoaglutinante ante el estrés, demuestra que los títulos de hemoaglutinación pueden ser usados tanto como indicadores sanitarios, como de adaptación de los animales a sus condiciones de vida. La prueba de hemoaglutinación se realiza utilizando eritrocitos humanos o de otros mamíferos (principalmente de roedores que son particularmente reconocidos por las aglutininas de camarón) en microplacas de 96 pozuelos con fondo en forma de “U” y en presencia de suero. Se determina así visualmente la presencia de aglutinación y el título aglutinante. Cuanto mayor es el título, mayor será la cantidad de PRP en la hemolinfa del camarón. Actividad de la fenoloxidasa: la enzima fenoloxidasa (PO por sus siglas en Inglés), se encuentra confinada en el interior de los hemocitos del camarón y juega un papel crucial en la cascada inmunológica que se activa cuando es reconocida una substancia como cuerpo extraño (antígeno). La PO se encuentra en forma de enzima inactiva (zimógeno) llamada profenoloxidasa (proPO). En condiciones de infección, esta enzima inactiva es exocitada de los hemocitos hacia el plasma del camarón y es convertida en PO mediante el efecto de la Enzima Activadora de la proPO (AEproPO), la cual es una serin-proteasa. Las reacciones que culminan con la transformación de proPO en PO y con la subsecuente melanización, son consideradas como un componente que integra los mecanismos de reconocimiento y de defensa de los crustáceos. En pruebas hechas in vitro, se ha observado que el paso de proPO a PO se produce incubando la muestra con Tripsina (serin-proteasa comercial). La actividad total de la PO se mide utilizando L-DOPA como sustrato. La determinación de la actividad de la PO, permite tener una idea de la capacidad de respuesta inmune de un camarón, frente a la presencia de agentes patógenos en el organismo. Para su medición, se parte de la reacción en la que se utiliza suero de los camarones o un lisado de sus hemocitos, que son la fuente de la enzima PO y se incuba con la L-DOPA y tripsina (activador de proPO). En presencia de oxígeno, se forma un compuesto colorido (rojo-coral) que presenta su máxima absorbancia a 490 nm y puede ser detectada espectrofotométricamente con un lector de microplacas. Actividad antibacteriana de los hemocitos por la producción de intermediarios reactivos de oxígeno (fagocitosis): en condiciones normales, las células fagocíticas de los camarones se encuentran en estado inactivo. La presencia de partículas extrañas sobre 40

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la superficie de estas células, cambia de inmediato su situación pasando a un incremento en la actividad metabólica; esta se llama choque respiratorio o metabolismo oxidativo. La transición celular de un estado inactivo a uno activo, involucra cambios característicos como incremento en el consumo de oxígeno por la enzima NADPH oxidasa, que se encuentra en la superficie celular y también en las membranas de vacuolas intracelulares (lisosomas). En este proceso que se inicia con la activación de la NADPH oxidasa, ocurre la producción de muchos reactivos intermediarios de oxígeno altamente tóxicos como el anión superóxido, peróxido de hidrógeno y oxígeno singlete (“singlet oxygen”). Estos productos resultantes del choque respiratorio, están relacionados con la actividad antimicrobiana en el camarón y con la destrucción de los agentes infectantes. La producción del anión superóxido puede ser medida a partir de una muestra de hemolinfa, mediante la estimulación de los hemocitos y la capacidad de este anión para reducir el nitro blue tetrazolium (NBT). Esta reacción produce un depósito de color azul que se puede cuantificar utilizando un lector de microplacas, con un filtro que tenga una longitud de onda de 620 nm. Actividad antibacteriana del plasma: existen en la hemolinfa del camarón diferentes péptidos con efectos antimicrobianos. Entre mayor sea la concentración y tipo distinto de éstos en un camarón cuando se presenta el ataque de bioagresores, mayores serán las posibilidades de defensa y, por ende, de supervivencia. La prueba de la actividad antibacteriana del plasma permite medir la inhibición del crecimiento bacteriano, por la acción de péptidos que poseen propiedades microbicidas y que están presentes en la hemolinfa de los camarones. Con base en lo anterior, medir la actividad antibacteriana del plasma/suero de camarones, permite estimar la capacidad de respuesta frente a una eventual infección por bacterias. Para realizar la evaluación, se deben tener cultivos de cepas bacterianas Gram positivas y negativas en pozos de una microplaca y se hacen diluciones seriadas del plasma/suero de camarones frente a estas bacterias. Se analiza la inhibición del crecimiento bacteriano causada por el plasma diluido seriadamente y se calcula luego el título de inhibición. La medición se hace por medio de un método turbidimétrico, cuyo principio está basado en la determinación espectrofotómetrica de la turbidez causada por las suspensiones bacterianas; si la turbidez de la muestra de bacterias disminuye en presencia de plasma, sugiere destrucción bacteriana por presencia de los péptidos antibacterianos. La cuantificación se realiza mediante comparación espectrofotométrica del cultivo control (sin plasma/suero) y del cultivo con la muestra de plasma/suero, utilizando un lector de microplacas. Cuantificación de la α2Macroglobulina plasmática: en invertebrados, se ha sugerido que esta enzima regula la activación del sistema de la proPO, inhibiendo a la Enzima Activadora de la proPO (EAproPO), razón por la cual se le considera mediador del sistema inmune. Los inhibidores de las proteasas no sólo participan en las acciones de protección contra microorganismos patógenos, sino que también juegan un papel importante en otros procesos de defensa como la coagulación. La cuantificación de la α2Macroglobulina plasmática, se realiza basándose en que reacciona con las proteasas sin bloquearles el sitio activo, siendo así protegidas las proteasas e impidiendo el acceso de substratos (proteínas) grandes. Sin embargo, péptidos pequeños como BAPNA, sí pueden ser degradados por las proteasas que han sido atrapadas. Esta degradación produce un compuesto de color amarillo, el cual puede medirse con un lector de microplacas usando un filtro con una longitud de onda de 415 nm.

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Cuantificación de BGBP en hemolinfa: la presencia de compuestos microbianos en el sistema inmune puede activar directamente las funciones celulares de defensa tales como fagocitosis, melanización, encapsulación y coagulación; las proteínas reconocedoras presentes en el plasma, amplían ese estímulo. La purificación de los componentes del sistema proPO de crustáceos, ha permitido demostrar la presencia de dos proteínas directamente relacionadas con la comunicación celular entre hemocitos. Una de ellas es la proteína de unión al ß-1,3-Glucano (BGBP del inglés ß-1,3-Glucan Binding Protein) presente en el plasma. La BGBP es una PRP tal como las aglutininas, capaz de reconocer componentes de la pared de los hongos. La BGBP fue identificada en el plasma del camarón Penaeus californiensis por Vargas-Albores et al. (1996). Esta proteína reacciona con los ß-glucanos y el complejo glucano BGBP induce a la degranulación y activación del sistema proPO. La otra molécula es la proteína de unión a los lipopolisacáridos de la pared de bacterias Gram negativas (LBP del inglés Lipopolysaccharide Binding Protein), la cual es una PRP que reconoce LPS. La proteína LBP ha sido descrita como aglutinina y se ha probado su capacidad para aglutinar bacterias. Una vez reacciona con el LPS o con bacterias, la proteína se une a los hemocitos y estimula la fagocitocis. La BGBP y la LBP estimulan las funciones celulares solamente después de reaccionar con los ß-glucanos y con los LPS, respectivamente. La cuantificación de estas PRPs plasmáticas del camarón, se realiza con el método de la inhibición de ELISA, el cual permite eliminar las reacciones inespecíficas observadas entre los inmuno-reactantes y la hemolinfa. Los anticuerpos comerciales contra BGBP producidos reaccionan en vertebrados, de manera específica con sus respectivos antígenos. Con base en esto, la prueba para su detección consiste en inmovilizar antígeno (dichas proteínas) en una microplaca de poliestireno, agregando luego los anticuerpos e incubando para que éstos reaccionen. Después se usa un sustrato revelador para detectar y cuantificar las PRPs. Si se ha presentado unión antígeno-anticuerpo, la aplicación del sustrato en presencia del anticuerpo producirá una reacción colorimétrica medible mediante espectrofotometría, utilizando un lector de microplacas con una longitud de onda apropiada según el método. Concentración de hemocianina en la hemolinfa: la hemocianina es una proteína presente en la hemolinfa de los camarones, responsable del transporte de por lo menos el 90% del oxígeno hacia los órganos y tejidos. Esta proteína también participa en las actividades inmunológicas del camarón, ya que los hemocitos pueden convertir porciones de la hemocianina en una enzima similar a la fenoloxidasa. Adicionalmente, posee homología con varias proteínas del sistema inmune. Es posible que estímulos antigénicos desencadenen reacciones donde la hemocianina genera varias moléculas inmunorreactivas. La medición de esta proteína a partir de muestras de hemolinfa, permite estimar las condiciones fisiológicas del camarón y, en parte, de su capacidad de respuesta inmune. La cuantificación de la hemocianina se puede realizar a través de métodos de espectrofotometría, utilizando un lector de microplacas. Concentración de óxido nítrico sintasa: una nueva prueba reportada en 2006 por Hernández et al., hace referencia a la medición de óxido nítrico sintasa (NOS) como criterio para medir la actividad de los hemocitos dentro de las acciones de defensa de un camarón. El óxido nítrico (NO) es el producto de la oxidación del aminoácido L-arginina a L-citrulina mediado por la NOS. Este gas transmisor de señales producido por una célula, penetra a través de la membrana celular y regula la función de otras células. El NO es altamente inestable transformándose rápidamente en nitritos (NO2) y nitratos (NO3). El NO es extremadamente tóxico y por lo tanto altamente microbicida. Su producción por 42

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los hemocitos le otorga un papel de gran importancia en el control de infecciones. El NO puede ser analizado por quimioluminescencia, aunque debe ser liberado de la muestra y la recuperación no siempre es adecuada. Un método para detectar y cuantificar NO, se basa en la transformación del NO a NO2 y NO3. Para medir la concentración total de nitratos y nitritos (NOx), se pueden usar dos métodos: la reducción química con cadmio o la reducción enzimática utilizando nitrato reductasa. Otra forma de detectar la presencia de NOS en muestras biológicas, es utilizando anticuerpos contra la proteína. Para ello se utilizan anticuerpos de conejo anti-iNOS (NOS inducible presente en los hemocitos), los cuales reconocen la NOS de camarón, pudiéndose así ser utilizados para implementar un método indirecto de ELISA. Se han probado diferentes diluciones de anti-NOS y combinaciones de conjugado anti-conejo, habiendo sido las mejores 1:1000 y 1:40000, respectivamente. Consideraciones generales sobre parámetros inmunológicos La interpretación de resultados obtenidos con todas las pruebas mencionadas anteriormente, debe hacerse considerando factores que interfieren directamente sobre cada uno de los parámetros inmunes. En los camarones, están principalmente la edad, sexo, estado de muda, estrés (ambiental, nutricional o séptico) y condiciones sanitarias (presencia o ausencia de enfermedad); en el agua de cultivo está principalmente la temperatura, salinidad, pH, oxígeno disuelto y presencia de substancias tóxicas (de origen químico o biológico).

PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS – HEMOGRAMA

Figura 1.51. Elementos para el montaje de hemolinfa cuando se hace conteo de hemocitos. De izquierda a derecha se observa una caja con puntas de micropipeta (20-200 μL), micropipeta con volumen graduable (20-200 μL), microtubos de 1.5 mL con tapa y contador de células.

Figura 1.52 Punción de un P. vannamei para la extracción de hemolinfa del seno hemolinfático ventral, ubicado en la unión entre el cefalotórax y el abdomen, ventralmente. Nótese el uso de una jeringa desechable de 1 mL (tipo insulina), la cual contiene una solución anticoagulante.

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PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS – HEMOGRAMA

Figura 1.53 Montaje de 20 μL de hemolinfa anticoagulada en una cámara de Neubauer (hematocitómetro). Debido a que esta cámara posee dos campos de conteo, se pueden montar muestras de 2 animales diferentes al mismo tiempo.

Figura 1.54 Observación de hemolinfa anticoagulada en cámara de Neubauer, utilizando un microscopio de contraste de fases y el objetivo de 40X.

Figura 1.55 Hemocitos de un camarón preadulto P. vannamei observados en cámara de Neubauer, utilizando microscopio de contraste de fases y objetivo de 40X. Se pueden observar encerradas en cuadros amarillos, 3 células características de los tipos diferentes de hemocitos que hay reportados: granulares (G), semigranulares (S) y hialinos (H). Sin tinción. Amplificación 400X.

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Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

Microscopía electrónica de transmisión

Objetivo. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) en camarones, tiene el propósito de acceder a lesiones microscópicas en tejidos afectados, con el fin de detectar la presencia o ausencia de agentes infecciosos muy pequeños. Su uso está indicado en la búsqueda de agentes patógenos o lesiones dentro de las células de tejidos afectados. Descripción. La TEM es una herramienta poderosa en el diagnóstico de virus específicos, rickettsias, bacterias intracelulares y otros muy pequeños microorganismos que están asociados y que causan lesiones particulares en las células. En las preparaciones para TEM, el patólogo examina las estructuras internas de las células y los organelos celulares, en busca de anormalidades. Una fijación o almacenamiento inadecuado de muestras para TEM, puede ocasionar grandes artefactos o cambios en las células estudiadas, con lo cual se afecta la calidad de la búsqueda y la obtención de resultados concluyentes. Por esta razón, la preparación, seccionamiento, tinción e interpretación de material mediante TEM, es una actividad altamente especializada y debe ser realizada por personal bien entrenado. Metodología. Durante el proceso de preparación del fijador así como durante los eventos de fijación de muestras y su manipulación, siempre deben usarse guantes y gafas protectoras. Para preparar una solución fijadora de trabajo aproximadamente al 6%, se utilizan 10 mL de glutaraldehído 50% grado microscopía electrónica (EM), los cuales se añaden a 76 mL de buffer fosfato 0.15M. Esta solución se debe almacenar a 4ºC y se debe utilizar dentro de los siguientes 90 días posteriores a la preparación. Luego de este tiempo, la solución fijadora que no se ha utilizado aún, se debe descartar. Se deben agregar sal y sucrosa a la solución, para ajustarla a la osmolaridad similar a la de los camarones (700 a 800 mmol/kg). Las soluciones de glutaraldehído comercial generalmente vienen en concentraciones de 25%, 50% y 70%. La de 25% es grado histológico y por eso es la más utilizada para TEM en camarones, consiguiéndose en botellas ámbar de 500 mL. Las concentraciones 50% y 70% se consiguen en ampollas de 5 mL. La siguiente tabla adaptada de Lightner (1996), sugiere las cantidades de glutaraldehído y buffer a utilizar, partiendo de las 3 concentraciones comerciales disponibles de glutaraldehído y según la concentración final de la solución fijadora que se quiera preparar: Glutaraldehído stock % activo

Actividad por ampolla

Actividad fijadora en % Volumen stock (mL) / Buffer requerido (mL) 1%

4%

6%

25%

n/a

4 / 96

16 / 84

24 / 76

50%

2.5 g/5 mL

5 / 245

5 / 57.5

5 / 42

70%

3.5 g/5 mL

5 / 345

5 / 82.5

5 / 53.5

Al igual que en muestras que se preparan para diagnóstico histopatológico, la preservación de los tejidos debe hacerse de manera rápida y a temperatura baja, para evitar cambios en las muestras a causa de la degradación. En el caso de larvas o postlarvas, éstas deben ser fijadas mediante inmersión directa en la solución fijadora de glutaraldehído al 6%, excediendo una relación de fijador-tejido de 10:1. Las muestras deben permanecer fijadas al menos por 24 horas antes de ser procesadas para TEM. En juveniles y camarones inferiores a 6 g, se debe inyectar fijador en diferentes partes cubriendo el hepatopáncreas, región del estómago, región del intestino medio y músculo abdominal. Con tijeras de disección y por debajo de la cutícula (sin atravesar tejido blando), se debe hacer un corte longitudinal por la línea media a los dos lados, para asegurar una adecuada penetración del fijador. 45

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Los tejidos de camarón se deben preservar mediante la inyección de solución fijadora de glutaraldehído al 6% en animales vivos, la cual se debe tener a una temperatura de 4ºC. No se deben fijar camarones muertos y los camarones vivos deben morir por el efecto del fijador en el momento de su inyección. En camarones de más de 6 g, se deben extraer los órganos o tejidos de interés, debiéndolos cortar rápidamente con una cuchilla y manteniéndolos inmersos en la solución fijadora de glutaraldehído 6% fría. Los cortes deben ser en trozos de pocos milímetros de espesor (máximo 1 x 2 mm). Los camarones o sus partes para TEM, deben ser fijados sin exceder un volumen de tejido mayor a 1 cm3. Los trozos deben ser luego transferidos a frascos rotulados y que contengan solución fijadora fría, buscando una relación de fijador-tejido de 10:1. Estos trozos fijados deben mantenerse por 24 a 48 horas antes de ser procesados para TEM. Luego, se debe eliminar la solución fijadora de glutaraldehído 6% y debe ser reemplazada por buffer fosfato 0.15M. Esta nueva fijación de tejidos se debe mantener a 4ºC. Los procedimientos posteriores pueden realizarse siguiendo los protocolos estándar para TEM. Las muestras de tejido de camarón pueden ser guardadas por varias semanas en una solución de glutaraldehído 6% con buffer fosfato, a temperatura de refrigerador. Se deben preparar nuevas soluciones de fijador y de buffer fosfato cada tres meses. Si se requiere mantener muestras de camarones fijadas por tiempo indefinido, se pueden preservar a 4ºC en soluciones de glutaraldehído de 0.5% a 1%.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (TEM)

Figura 1.57 Microfotografía de un corte de tejido de Penaeus monodon infectado con el virus YHV. Se observan inclusiones citoplásmicas de virus YHV envueltos de manera organizada. También se observan (aunque menos fácilmente) inclusiones virales muy delgadas parecidas a fibras con forma de bastón, de nucleocápsides sin envoltura del virus YHV cerca de la membrana. Ampliación: ~50.000X. Foto: Lightner, 1996 (Cortesía de T.W. Flegel, Bangkok, Tailandia).

Figura 1.56 Microscopio Electrónico de Transmisión (PHILIPS CM-12), gobernado por un microprocesador. Permite observaciones de 31X hasta 730.000X, con capacidad de resolución de 0,2 nm entre líneas y 0,3 nm entre puntos. Trabaja con distintos voltajes de aceleración: 20, 40, 60, 80, 100, y 120 kV. Tiene opciones de observación en campo claro, campo oscuro y difracción de electrones. Posee sistema fotográfico automático adaptado para película plana o película de 35 mm. Las principales aplicaciones son: organización de células y tejidos, estudio de organelos celulares, estudio de especialización celular: cilios, flajelos, sinapsis, uniones GAP, morfología de virus, estudios de micropartículas y nanopartículas y, estructura interna de láminas delgadas.

46

Jorge Cuéllar-Anjel

1.11

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

Bioensayos

Objetivo. Determinar si el agente causal de una enfermedad es de origen infeccioso (virus, bacterias, hongos, etc.), tóxico (toxinas químicas o biológicas) o, descartando lo anterior, de origen ambiental o por manejo. También se utilizan los bioensayos para evaluar la patogenicidad de una cepa viral o bacteriana inyectada o suministrada vía oral a camarones libres de dichos agentes patógenos. Descripción. Los bioensayos son estudios realizados con seres vivos, camarones en este caso, durante los cuales se busca reproducir una enfermedad detectada en camarones de una población determinada, utilizando como organismos “blanco” camarones sanos y susceptibles a dicha enfermedad. Éstos pueden ser “libres de patógenos específicos” (SPF por su sigla en inglés) o simplemente libres de la enfermedad que se pretende reproducir. La susceptibilidad de los camarones que se utilizan en los bioensayos, hacen referencia a la especie y talla de los animales. La manera de buscar su eventual infección es utilizando batido (macerado) de camarones enfermos y los cuales presentaban manifestaciones de la enfermedad (sacrificados en fase aguda). La aparición de la enfermedad en los camarones susceptibles utilizados en un bioensayo, deberá corresponder al tiempo estimado de aparición de los signos clínicos en los camarones que se enferman en condiciones naturales. Metodología. Los bioensayos son pruebas de desafío, en las cuales se utiliza tejido infectante para realizar de manera experimental, una infección per os (vía oral) en camarones susceptibles. El material infectante debe provenir de camarones vivos (enfermos avanzados o moribundos), que hayan presentado los mismos signos clínicos de la enfermedad en cuestión y procedentes de una misma población (edad y talla similar). La capacidad infectante de este batido de tejido de camarones enfermos, depende de la carga viral o bacteriana que tenga (cantidad de microorganismos por gramo de aquellos que causan la enfermedad) y de la cantidad de tejido que se suministre a los camarones “blanco”. Si existen pruebas moleculares disponibles para el agente etiológico del estudio, se puede establecer de manera semi-cuantitativa (PCR con diluciones seriadas del ADN extraído) o cuantitativa (PCR en tiempo real), la carga del patógeno presente en cada gramo de tejido infectante. Los camarones que van a ser infectados experimentalmente per os, deben estar libres de la enfermedad que se pretende reproducir. Para ello, deben proceder de una población libre de patógenos conocidos, SPF si es posible y que no hayan presentado o estén presentando signos clínicos de ninguna enfermedad (completamente sanos). Si existen herramientas moleculares de diagnóstico para la enfermedad en cuestión, se debe someter a prueba un grupo de camarones procedentes de la población de donde se utilizarán los animales “blanco” para el estudio. Éstos, deben ser negativos (“no detectado”) al patógeno del cual es objeto el bioensayo. Cuando el objetivo del bioensayo incluye trabajar con un patógeno desconocido y para el cual no existen en el momento pruebas de diagnóstico moleculares, los camarones “blanco” deben ser SPF para que los resultados de la prueba sean concluyentes. Los bioensayos deben realizarse en instalaciones cerradas, con condiciones controladas y con parámetros físico-químicos estables. Los principales factores que deben mantenerse bajo control durante un bioensayo, son los siguientes: •

Calidad del agua: filtrada, recambio constante o frecuente, condiciones bacteriológicas apropiadas 47

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

•

Temperatura: del agua y del aire de la sala de bioensayos

•

Luminosidad

•

Oxígeno disuelto

•

Salinidad

•

Metabolitos potencialmente tóxicos: nitritos, nitratos, amonio y fósforo

•

Materia orgánica: sedimentada y como partículas en suspensión

•

Unidades experimentales (UE): acuarios, tinas o tanques (tamaño, forma, transparencia)

•

Densidad experimental: camarones por L, sin exceder 2.8 g/L de biomasa

•

Material de las UE: plástico, vidrio, acrílico, fibra de vidrio, concreto, etc.

•

Volumen de las UE: capacidad de operación

•

Fuente del agua de recambio: reservorio de tierra, tanque sin o con filtración, recirculación, etc.

Antes de realizar un bioensayo, debe tenerse un plan de trabajo bien definido, con el protocolo de operación claramente comprendido por la o las personas que participarán en la prueba y definiendo los momentos para cada fase del estudio, tales como fecha de inicio, fecha de infección, pruebas confirmatorias de diagnóstico para la enfermedad en estudio, criterios de decisión para establecer las conclusiones finales y fecha (o condiciones particulares) para dar por terminada la prueba (ej.: luego de 2 días en los que se haya estabilizado la mortalidad). Las cantidades de camarones de cada UE deben ser conocidas el día de la infección experimental, ya que este valor será el 100% de la población de partida. Con base en estos datos, se podrá establecer al finalizar la prueba, la supervivencia en porcentaje. Los datos de mortalidad diaria deben ser observados con rigurosidad y registrados en un formato diseñado para tal fin. Éstos permitirán conocer la tasa de mortalidad diaria y el momento de mayor mortalidad de la prueba, entre otra información de interés.

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Jorge Cuéllar-Anjel

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

BIOENSAYOS

Figura 1.58 Vista de una sala de bioensayos, en la cual se utilizan tanques de vidrio con capacidad para 30 L. En las partes superior e inferior de los tanques, se observa la tubería de aire a través de la cual se conectan las mangueras de aireación para cada uno. Los tanques de arriba están con agua y tienen mangueras de aireación y piedras difusoras en sus extremos (dentro de cada tanque).

Figura 1.59 Revisión de parámetros físico-químicos en un tanque de vidrio durante la realización de un bioensayo. Se observa dentro del tanque el electrodo del equipo, con el cual se obtienen datos de temperatura, salinidad y oxígeno disuelto.

Figura 1.60 Alimentación dosificada de camarones P. vannamei durante la realización de un bioensayo. Nótese la presencia de una cubierta de malla que está siendo levantada para la alimentación y la cual evita pérdida de camarones por saltos hacia el exterior del tanque o hacia otros tanques vecinos.

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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Recomendación general Es de gran importancia hacer una eliminación adecuada de todos los productos de desecho procedentes de pruebas de diagnóstico, así como de camarones que han sido utilizados para extracción de muestras o para bioensayos. Esto, para evitar la contaminación de entornos acuáticos comerciales o silvestres y del propio ambiente.

Apéndice Métodos para la detección de los principales agentes virales en camarones penaeidos (modificado de Lightner y Pantoja, 2001. En: USDA-UCA, 2001). Método

WSSV

IHHNV

BP

MBV

BMN

SMV

YHV*

TSV

IMNV

PvNV

Directa BF / LM / PH / DF

++

-

+++

+++

++

-

++

+

-

-

Histopatología

++

++

++

++

++

++

+++

+++

++

++

Bioensayos

++

+

+

-

+

-

+

++

+

+

TEM / SEM

+

+

+

+

+

++

+

+

+

+

ELISA CON PAb / MAb

-

-

+

-

+

-

-

++

-

-

Sondas ADN / DBH / ISH

+++

+++

++

++

++

+++

+++

+++

+

+

PCR / RT-PCR

+++

+++

+++

+

-

+++

+++

+++

+++

+++

*Grupo YHV. La información sobre los virus IMNV y PvNV, fue suministrada por el Dr. Carlos Pantoja de la Universidad de Arizona, USA (2008).

Definiciones de aplicación de los métodos para cada virus -

= método desconocido o cuya aplicación no está publicada

+

= método cuya aplicación es conocida o está publicada, pero no frecuentemente practicada o difícilmente disponible

++

= método cuya aplicación provee suficiente exactitud de diagnóstico o sensibilidad en la detección de patógenos para la mayoría de las aplicaciones

+++

= método que provee un alto grado de sensibilidad en la detección de patógenos

Abreviaturas para los métodos

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BF

= microscopía de luz de campo brillante para el análisis de improntas de tejidos, montajes húmedos o montajes enteros teñidos.

LM

= microscopía de luz

PH

= microscopía con contraste de fases

DF

= microscopía de campo oscuro

Jorge Cuéllar-Anjel

EM

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

= microscopía electrónica de secciones o de virus purificados o semipurificados

ELISA = prueba de enzimas marcadas inmunoabsorbentes PAb

= anticuerpos policlonales

MAb

= anticuerpos monoclonales

DBH

= hibridación mancha-punto (dot blot)

ISH

= hibridación in situ

Métodos para vigilancia y diagnóstico de patógenos virales en camarones penaeidos (modificado de Lightner y Pantoja, 2001. En: USDA-UCA, 2001). Agente

Vigilancia

Diagnóstico

TSV

RT-PCR

RT-PCR, sondas de ADN, AB, histopatología

WSSV

PCR, AB

PCR, sondas de ADN, AB, histopatología, bioensayos

YHV

RT-PCR

RT-PCR, sondas de ADN, AB, histopatología, bioensayos

BMN

Histopatología

Microscopía directa, histopatología

BP/MBV

PCR, microscopía directa, histopatología

PCR, microscopía directa, histopatología

IHHNV

PCR, sondas de AND

PCR, sondas de ADN, histopatología

SMV

Sondas de ADN

Sondas de ADN, histopatología, bioensayos

IMNV

RT-PCR, sondas de ADN

RT-PCR, sondas de ADN, histopatología

PvNV

RT-PCR, sondas de ADN

RT-PCR, sondas de ADN, histopatología

La información sobre los virus IMNV y PvNV, fue suministrada por el Dr. Carlos Pantoja de la Universidad de Arizona, USA (2008).

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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

1.12

Referencias bibliograficas

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Jorge Cuéllar-Anjel

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

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C. R. Pantoja y D.V. Lightner

Enfermedades Virales

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Capítulo 2 Enfermedades Virales Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner Expertos en Patología Acuática México / USA

Introducción En poco menos de 40 años, la camaronicultura mundial se ha desarrollado desde sus inicios a nivel experimental hasta volverse una industria con ingresos de billones de dólares, proveyendo de empleo, directa e indirectamente, a cientos de miles de personas. Desde 1970 hasta 1990, la industria dependía completamente de la captura de postlarvas silvestres o de postlarvas producidas a partir de reproductores capturados en el océano. La mayoría de las veces, estos animales eran capturados cerca de la región en donde serían cultivados. Los sistemas de cultivo eran relativamente simples, se usaban tasas muy altas de recambio de agua y las medidas de bioseguridad eran mínimas o no existentes. En esa época se sabía de muy poco de las enfermedades del camarón y todavía menos sobre los mecanismos de defensa -humoral y celular- especialmente contra agentes virales. Había muy pocos especialistas en enfermedades de camarón y la capacidad de diagnóstico era muy pequeña en la mayoría de las regiones. El uso de antibióticos y agentes químicos era práctica común, tanto en los laboratorios de producción de postlarvas como en las granjas. No fue sino hasta 1987, cuando el aumento explosivo de la industria camaronícola fue acompañado de pandemias virales, que rápidamente se puso de manifiesto que las enfermedades ocasionadas por virus eran una de las mayores amenazas para la industria. También rápidamente se puso en evidencia que la dispersión de esas enfermedades fue el resultado del traslado sin control tanto de postlarvas como de reproductores. La industria camaronícola del presente ha sido transformada por la necesidad de un mejor control de las enfermedades. Como resultado de los cambios rápidos que comenzaron a principios de los 90’s, la dependencia de la industria sobre el suministro de postlarvas silvestres, o de postlarvas derivadas de reproductores silvestres, ha disminuido notablemente. Desde hace algunos pocos años hasta la fecha, poblaciones domesticadas de Penaeus vannamei (también llamado Litopenaeus vannamei) han reemplazado a P. monodon como la principal especie cultivada y se encuentran ya en progreso varios programas para la domesticación de otras especies. Se han descrito ya muchas enfermedades importantes y aunque se han desarrollado métodos para su diagnóstico, existen todavía algunos problemas relativos a su implementación y estandarización. Las medidas de bioseguridad aplicadas a los sistemas intensivos de cultivo se vuelven más comunes cada día. El uso de probióticos se ha vuelto también común tanto en los laboratorios de producción de postlarvas como en granjas y se investigan ya medidas sofisticadas de control biológico. Como resultado de esto, el uso de antibióticos ha disminuido y se ha vuelto más responsable. Estudios de biología molecular están ayudando a lograr un mejor entendimiento de la relación entre el camarón y los agentes patógenos que lo atacan. El resultado de todos estos avances ha sido un incremento continuo de la producción mundial de camarón cultivado.

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

En el futuro, se espera que la industria camaronícola mundial tenga acceso fácil a una variedad de especies domesticadas de camarón, genéticamente mejoradas y libres de los patógenos más importantes. Métodos para el diagnóstico de estas enfermedades, tanto en el laboratorio como en el campo, estarán disponibles en el mercado en forma de kits y se mejorarán los mecanismos para su estandarización. De la misma manera se espera una mejora en los métodos de bioseguridad, los cuales serán aplicados en todos los tipos de sistemas de cultivo, aunque aquellos con mayor control (sistemas intensivos y superintensivos) serán más competitivos que los sistemas más tradicionales y extensivos. En general, la eficiencia en la producción y el desarrollo de métodos intensivos de cultivo se verán facilitados a través del mejor entendimiento del camarón, sus patógenos, la ecología microbiana y el uso de agentes antibacterianos y antivirales ambientalmente seguros.

2.1

Principales enfermedades y métodos de diagnóstico

Las enfermedades que afectan a los camarones de cultivo incluyen síndromes con etiologías infecciosas y no infecciosas (Tabla 1 y Tabla 2). Dentro de las enfermedades infecciosas están aquellas ocasionadas por virus, bacterias, (incluyendo ricketsias), hongos, protozoarios y parásitos metazoarios y entre las no infecciosas están las de impactos ambientales, desbalances nutricionales, agentes tóxicos y desórdenes genéticos. Procedimientos de diagnóstico para la detección de agentes patógenos específicos En el caso del camarón, se cuenta con herramientas o procedimientos de diagnóstico de dos tipos. Métodos clásicos. Dependiendo del tipo de enfermedad, estos métodos pueden ser lo suficientemente específicos y/o sensitivos para alcanzar un diagnóstico definitivo. •

Historial del caso.

•

Apariencia externa y signos clínicos.

•

Exámen directo al microscopio.

•

Microbiología (aislamiento y cultivo).

•

Histología y pruebas histoquímicas.

•

Microscopía electrónica.

Métodos moleculares. Cuando los métodos clásicos no son lo suficientemente específicos y/o sensitivos, es necesario complementarlos con uno o más de los siguientes métodos moleculares. •

•

•

58

Pruebas serológicas con anticuerpos monoclonales o policlonales. o

Anticuerpos fluorescentes (AF).

o

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

Sondas genéticas (con agente localizador radioactivo o no-radioactivo). o

Hibridaciones tipo “dot blot” (en membrana de nylon).

o

Hibridaciones tipo in situ (en cortes histológicos).

Amplificación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles).

C. R. Pantoja y D.V. Lightner

Enfermedades Virales

Tabla 1. Enfermedades de mayor importancia en la camaronicultura del Indo-Pacifico y Este asiático. Enfermedades de origen viral WSSV (White spot syndrome virus disease) YHV (Yellow head virus disease) BMN (Baculoviral midgut gland necrosis virus disease)

Enfermedades de origen bacteriano/fúngico Vibriosis - sistémica/entérica - vibriosis larvaria

Otras enfermedades Epicomensales - Leucothrix mucor - Protozoarios peritrichidos

Rickettsia Gregarinidos

MBV (Monodon baculovirus disease) IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus disease) HPV (Hepatopancreatic parvovirus disease) IMNV (Infectious myonecrosis virus disease)

Microsporidios Micosis larvaria

Desbalances nutricionales

Fusariosis

Síndromes tóxicos Síndromes ambientales

Tabla 2. Enfermedades de mayor importancia en la camaronicultura de las Américas. Enfermedades de origen viral WSSV (White spot syndrome virus disease) TSV (Taura syndrome virus disease) BP (Baculovirus penaei disease) YHV (Yellow head virus disease) IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus disease)

Enfermedades de origen bacteriano/fúngico Vibriosis - sistémica/entérica. - vibriosis larvaria NHP (Necrotizing hepatopancreatitis disease)

Otras enfermedades Epicomensales - Leucothrix mucor - Protozoarios peritrichidos Gregarinidos

Espiroplasmosis

HPV (Hepatopancreatic parvovirus disease)

Microsporidios

IMNV (Infectious myonecrosis virus disease)

Micosis larvaria

Desbalances nutricionales

PvNV (Penaeus vannamei nodavirus disease)

Fusariosis

Síndromes tóxicos Síndromes ambientales Síndrome de Zoea II

59

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Muestreo Muestreo aleatorio Cuando se requiera muestrear al azar a una población para determinar el estado de salud o la prevalencia de algún patógeno, el número de camarones que será necesario colectar va a depender de la prevalencia estimada de dicho patógeno y del nivel estadístico de confianza deseado. En este aspecto, la Tabla 3 es usada con frecuencia como una guía para determinar el tamaño muestral. Muestreo no aleatorio En situaciones en las que los camarones presentan claramente signos externos de la enfermedad, el cálculo de la prevalencia es más fácil y la información provista en la Tabla 3 puede ser usada para verificar el tamaño muestral y el nivel estadístico de confidencia. Seleccione por lo menos 10 camarones que muestren signos característicos de la enfermedad de la que se sospecha o bien alguna otra anormalidad. Para asegurar un diagnóstico acertado, las muestras deben de ser procesadas de inmediato, o a la brevedad posible, de acuerdo al procedimiento o procedimientos que hayan sido seleccionados. Los especímenes deberán ser preservados con las soluciones fijadoras adecuadas o bien empacadas en hielo o congelados dentro de un contenedor estéril (por ejemplo, bolsas de plástico). Tabla 3. Tamaño muestral basado en una estimación de la prevalencia del patógeno en una población de camarón (modificado a partir de Amos 1985). Tamaño muestral requerido a una prevalencia estimada de:

Tamaño de la población

2%

5%

10%

20%

30%

40%

50%

50

50

35

20

10

7

5

2

100

75

45

23

11

9

7

6

250

110

50

25

10

9

8

7

500

130

55

26

10

9

8

7

1,000

140

55

27

10

9

9

8

1,500

140

55

27

10

9

9

8

2,000

145

60

27

10

9

9

8

4,000

145

60

27

10

9

9

8

10,000

145

60

27

10

9

9

8

>/=100,000

150

60

30

10

9

9

8

Preparación de las muestras. Al momento de tomar las muestras, también es necesario recabar cierta información y entregarla al laboratorio que examinará los especímenes. Esto, con el objeto de facilitar un diagnóstico acertado así como también para documentar apropiadamente la epizootiología de la enfermedad, la distribución geográfica y las especies de camarón afectadas. La información recabada debe incluir por lo menos lo siguiente:

60

C. R. Pantoja y D.V. Lightner

Enfermedades Virales

•

Historial del caso. Una explicación breve del porqué se está enviando las muestras. Esto deberá incluir una descripción de las anormalidades observadas tales como mortandades, crecimiento lento, comportamiento anormal de nado o de alimentación, lesiones externas, cambios de coloración en el exoesqueleto, etc. Si no hay problemas aparentes y las muestras se están colectando para hacer una evaluación de rutina, esto también se debería de mencionar.

•

Especie. Especie (o especies) de camarón

•

Estadío de vida, en el caso de muestras de larvas.

•

Origen de cada grupo de muestras. Esto se refiere al país de origen, nombre de la granja o laboratorio, número de tanque o estanque, etc.

•

Fecha en que la muestra fue colectada y fijada.

•

Fijación. Método de fijación o el nombre de la, solución fijadora (por ejemplo, Davidson, alcohol etílico al 90-95%, glutaraldehído, formalina al 10%, congelado, etc.).

Preparación de muestras para análisis histológico Las muestras destinadas para análisis histológico deberán ser de camarones vivos. Los camarones ya muertos son inservibles. Los camarones deberán de ser fijados por medio de inyección y/o inmersión cuando aun se encuentren vivos. Tabla 4. Esquema generalizado para la asignación de un valor numérico cualitativo a los grados de severidad de infecciones, infestaciones y síndromes. Grado de severidad 0

Observaciones clínicas o histológicas No se observan signos de infección por el agente patógeno, parásito o epicomensal. No se observan lesiones características del síndrome. El patógeno, parásito o epicomensal se encuentra presente pero en números o cantidades que apenas sobrepasan los límites mínimos de detección.

1

Se observan lesiones características del síndrome pero la manifestación de la “enfermedad” es insignificante. La prognosis es de efecto insignificante, excepto en casos tempranos de infección por un patógeno altamente virulento. El patógeno, parásito o epicomensal se encuentra en cantidades pequeñas o moderadas.

2

Se observan lesiones ligeras o moderadas, características del síndrome. La prognosis es de posibles pérdidas en la producción o incrementos ligeros en la mortandad si no se aplica ningún tratamiento (en el caso de que la enfermedad sea tratable). Se observan cantidades moderadas del patógeno, parásito o epicomensal.

3

Se observan lesiones moderadas a severas, características del síndrome. La prognosis es de un efecto potencialmente letal si no se aplica ningún tratamiento (en el caso de que la enfermedad sea tratable).

4

Se observan grandes cantidades del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan lesiones severas, características del síndrome. Prognosis letal. 61

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•

Muestras de larvas o postlarvas tempranas. Fijar por inmersión en un volumen de solución fijadora aproximadamente 10 veces la del volumen de la muestra (proporción de 10:1). En cuanto el tamaño del animal lo permita, el cefalotórax de las postlarvas deberá ser pinchado con aguja de jeringa de insulina para facilitar la penetración del fijador. Posteriormente fijar por inmersión por un lapso de 12 a 24 horas.

Grados de severidad Una forma de documentar de manera semicuantitativa las observaciones que servirán para alcanzar un diagnóstico, es a través de la asignación de grados de severidad. Dicha asignación puede referirse a una lesión en particular o al proceso infeccioso en general. La Tabla 4 ilustra el criterio que se utiliza para la asignación de los grados de severidad. El valor numérico asignado también es útil para determinar tendencias y para la toma de decisiones de manejo tales como: cuándo aplicar un tratamiento, cuándo cosechar, etc.

2.2

Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (Infectious hypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV).

Nombre de la enfermedad Necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (enfermedad IHHN); síndrome de la deformidad y enanismo (“runt deformity syndrome” o RDS). Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (IHHNV). Agente IHHNV es un pequeño parvovirus (diámetro promedio de 22 nm) constituido por una cadena sencilla de ADN. Métodos preferidos actualmente para la detección del patógeno •

-

Muestras histológicas fijadas en solución de Davidson (AFA) o en formalina al 10%.

-

Muestras histológicas tomadas después de 15 a 30 días de potenciamiento de la enfermedad.

-

Biopsias de apéndices tomados de camarones subadultos o reproductores.

•

Hibridación en formato de “Dot blot” con sondas marcadas con DIG (BS4.5, BA402), u otras sondas igualmente adecuadas

•

Histología de rutina, con tinción H&E, en especímenes que muestren signos de la enfermedad de IHHN.

•

62

Hibridación in situ con sondas marcadas con DIG (BS4.5, BA402) u otras sondas igualmente adecuadas aplicadas a:

-

Aplicado a muestras histológicas fijadas en solución de Davidson (AFA).

-

Aplicado a muestras histológicas tomadas después de 15-30 días de desarrollo de la enfermedad.

PCR usando hemolinfa u homogenizados de tejido tomados de camarones sospechosos u otro tipo de muestras.

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Enfermedades Virales

Rango geográfico de distribución y especies afectadas Rango geográfico •

Ampliamente distribuido en instalaciones de cultivo de América y Asia incluyendo: -

América: sureste de los Estados Unidos, México, América Central, Ecuador, Perú, Brasil y numerosas islas del Caribe.

-

Pacífico Central: Hawai, Guam, Tahití y Nueva Caledonia

-

Asia e Indo-Pacífico: Singapur, Filipinas, Tailandia, Malasia e Indonesia

•

Se presume que IHHN es endémico en camarones peneidos silvestres del IndoPacífico; ha sido detectado también en camarones silvestres del Ecuador, la costa occidental de Panamá y la costa occidental de México.

•

Se ha demostrado la existencia de diferencias a nivel de genoma entre cepas de IHHNV de distintas regiones geográficas (Tang, K.F.J., et al. 2003). Asimismo, se ha reportado la existencia de la integración de una porción del genoma de IHHNV al genoma de una población silvestre de Penaeus monodon en África (Tang, K.F.J. & Lightner 2006). En el caso del IHHNV integrado al genoma del camarón, la porción integrada no es infecciosa.

Especies afectadas •

Se han observado infecciones naturales en: Penaeus stylirostris, P. vannamei, P. occidentalis, P. californiensis, P. monodon, P. semisulcatus y P. japonicus.

•

Debido a que otras especies de camarones peneidos (P. setiferus, P. duorarum, y P. aztecus) han podido ser infectadas en condiciones de laboratorio, es probable que también ocurran infecciones naturales en otras especies.

•

Especies tales como P. indicus y P. merguiensis parecen ser refractarias a IHHNV.

•

Aparentemente los miembros sobrevivientes de poblaciones que han sido infectadas por IHHNV pueden volverse portadores del virus de por vida y transmitirlo a su progenie y a otras poblaciones por medio de transmisión de tipo vertical y horizontal.

Signos clínicos de importancia diagnóstica P. stylirostris IHHN es una enfermedad de tipo agudo que puede ocasionar altas mortandades en juveniles de esta especie. Larvas y postlarvas infectadas verticalmente no se muestran enfermas sino hasta alcanzar aproximadamente el estadío de PL35 o un poco después. Una vez alcanzada esta edad, es posible observar signos externos, los cuales son seguidos por mortandades masivas. En animales infectados horizontalmente, el período de incubación y la severidad de la infección dependen, hasta cierto punto, del tamaño/edad, siendo los juveniles pequeños los más severamente afectados. Los adultos raramente presentan signos de la enfermedad o mortandades. Los signos externos de la enfermedad no son específicos de IHHN, pero en la etapa aguda de la infección, los juveniles de P. stylirostris muestran una marcada reducción en el consumo de alimento, lo cual es seguido por cambios en el comportamiento y la apariencia. Durante la fase aguda, se ha observado que los camarones de esta especie nadan lentamente hacia la superficie en donde se quedan completamente quietos, se voltean con el vientre hacia arriba y luego se hunden lentamente hasta el fondo del 63

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tanque. Se ha visto que los camarones que muestran esta conducta pueden hacerlo por horas hasta que se vuelven demasiado débiles para continuar o hasta que son canibalizados por sus congéneres más sanos. En este estadío de la infección, P. stylirostris puede llegar a presentar una coloración blanquecina con manchas de color crema, lo cual le da al camarón una apariencia moteada. Este patrón moteado no es definitivo y tiende a desaparecer un poco más adelante. También se ha observado frecuentemente que en P. stylirostris y en P. monodon infectados por IHHNV, se tiende a adquirir una coloración azulosa bastante distintiva y una opacidad de la musculatura abdominal. Si la enfermedad progresa hasta alcanzar una fase crónica, P. stylirostris también puede sufrir de lo que se conoce como síndrome de las deformaciones y el enanismo. P. vannamei En esta especie, IHHN es típicamente una enfermedad de tipo crónico. El síndrome de las deformidades y el enanismo (“Runt Deformity Syndrome” o RDS) que afecta a esta especie ha sido ligado a IHHNV. Típicamente, los juveniles afectados por RDS exhiben rostros doblados o deformes, antenas arrugadas, caparazón áspero o rugoso, y otras deformidades. Las poblaciones de juveniles con RDS exhiben típicamente una distribución de tallas relativamente amplia con una proporción de tallas pequeñas (enanos) mucho mayor de lo normal. El coeficiente de variación (CV=La desviación estándar dividida entre el promedio de diferentes grupos de tallas dentro de una población dada) de una población con RDS es típicamente mayor de 30% y puede incluso llegar al 50%, mientras que en poblaciones de juveniles de P. vannamei libres de IHHNV (y por lo tanto sin RDS) los CVs son de entre 10% y 30%. Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad Diagnóstico presuntivo •

Presencia de signos clínicos.

•

Historial de las instalaciones de cultivo, de las especies cultivadas o de la región, que indique la posibilidad de infección por IHHNV.

Métodos para la detección y el diagnóstico definitivo del virus A través de los siguientes métodos es posible alcanzar un diagnóstico definitivo tanto a nivel individual como a nivel de poblaciones: -

Histopatología directa.

-

Potenciamiento seguido por histopatología o pruebas de hibridación in situ.

-

Bioensayos utilizando P. stylirostris libre de patógenos específicos (“Specific Pathogen Free”/SPF) como la especie indicadora.

-

Pruebas con sondas genéticas, u otras sondas adecuadas en los siguientes formatos:

-

64

o

Hibridación en “Dot-Blot”.

o

Hibridación “in situ” (histología).

El PCR también puede ser utilizado para la detección del virus en muestras de hemolinfa o de tejidos tomadas de camarones sospechosos.

C. R. Pantoja y D.V. Lightner

Enfermedades Virales

Método de histopatología directa para la detección de IHHNV Se basa en la demostración histológica de cuerpos de inclusión intranucleares tipo Cowdry A (CAIs), bastante prominentes, eosinofílicos (en preparaciones de especímenes fijados con soluciones que contengan ácido acético, tales como la solución de Davidson AFA y la solución de Bouin, y que han sido teñidas con H&E), los cuales a su vez están rodeados de un anillo de cromatina dentro de núcleos hipertrofiados en células de tejidos de origen ectodérmico (branquias, epidermis, epitelio hipodermal de la parte anterior y posterior del tracto digestivo, cordón nervioso ventral y ganglios asociados) y mesodérmico (órganos hematopoiéticos, glándula antenal, gónadas, órgano linfoide, tejido conectivo y músculo estriado). Cuando son teñidos con el método de Feulgen, estos cuerpos de inclusión son de coloración variable dependiendo del estado de virogénesis y de la cantidad de ADN presente. Por lo tanto, los CAIs en desarrollo pueden ser negativos utilizando la tinción de Feulgen, mientras que aquellos que han alcanzado la madurez mostrarán una reacción positiva. Durante los estadíos larvales de mysis o de postlarva temprana, es posible encontrar CAIs dentro de las células del epitelio del intestino. Es posible encontrar cuerpos de inclusión CAIs dentro de las células epiteliales de los túbulos del hepatopáncreas, pero esto ocurre muy raramente y es por lo general acompañado de infecciones severas en otros de los tejidos ya mencionados. Pruebas de hibridación con sondas genéticas específicas para IHHNV o

Hibridación tipo “Dot blot” usando sondas genéticas no radioactivas marcadas con DIG

En el procedimiento tipo “Dot-blot” para el diagnóstico de IHHNV, las muestras de tejido homogenizado son inmovilizadas por adsorción en una membrana de nitrocelulosa o nylon y luego hibridadas con sondas genéticas de ADN (por ejemplo la sonda BS4.5 u otras específicas para IHHNV) marcadas con DIG (digoxygenin-11-dUTP). Después de la hibridación y de la reacción de revelado, las muestras de tejido positivas se observan marcadas por la presencia de un precipitado de color azul-negro o púrpura, el cual varía en intensidad dependiendo de la concentración del virus en la muestra. La presencia de manchas de color rosado o salmón, son debido a la reacción no específica de la sonda con componentes desconocidos en el tejido del camarón. Para evitar confusión en la interpretación de los resultados de esta prueba, se deberán incluir siempre los controles apropiados. Tales pueden ser: tejido de camarón SPF (specific pathogen free) como control negativo, tejido de camarón IHHNV positivo (control positivo) y un grupo de muestras cuya condición IHHNV sea desconocida, así como un control negativo y uno positivo sujetos a una prueba de hibridación sin sonda, únicamente expuestos al anticuerpo y al substrato de revelado. o

Hibridación in situ

La prueba de hibridación in situ para la detección de IHHNV (en cualquier fase de la infección) puede aplicarse sin ningún problema a especímenes de camarón fijados en formalina o solución de Davidson (AFA) y bañados en parafina. Por medio de esta prueba, es posible observar la formación de un precipitado azul-negro o púrpura en cualquier lugar del cuerpo del camarón en donde el ADN del virus IHHN (y presumiblemente mARN) se encuentre presente.

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En una prueba típica de hibridación in situ, las células con CAIs muestran una intensa reacción nuclear a la sonda, especialmente en la cromatina marginada o en la superficie interna de la membrana nuclear. Mediante esta prueba se ha demostrado con frecuencia, que los núcleos picnóticos y núcleos de células aparentemente normales también pueden contener ácidos nucleicos de IHHNV. Muchas células positivas para IHHNV también muestran densas acumulaciones citoplasmáticas del virus. De la misma manera, se puede observar con frecuencia una reacción positiva a la sonda asociada a los fragmentos de células necróticas en el debris extracelular y en el contenido de los fagolisosomas de los fagocitos del corazón, branquias y otros tejidos. Comúnmente, la porción no celular de la cutícula del camarón (infectado o no por IHHNV) toma una coloración azul debido a la reacción no específica de la sonda. Esta coloración azul es debida a la presencia de la quitina, un polímero complejo de n-acetilglucosamina, el cual se adhiere (tal vez electrostáticamente) al ADN de la sonda. Procedimientos no letales para el análisis de reproductores Animales reproductores de las especies P. vannamei, P. stylirostris y P. monodon, pueden ser examinados individualmente para determinar la presencia de IHHNV por medio de una biopsia no letal. Muestra La muestra consiste de un apéndice, como el segundo o tercer pleópodo, un proceso branquial, o uno de los maxilípedos. Después de obtener el apéndice, este debe ser preservado ya sea por congelación, en solución de Davidson o en alcohol etílico al 95% y finalmente procesado de acuerdo al método de diagnóstico de preferencia. Las muestras de hemolinfa deben de ser procesadas ya sea inmediatamente o preservadas por congelación o fijación en alcohol al 95% y subsecuentemente procesadas. Pruebas de diagnóstico Dos de las pruebas más apropiadas para examinar este tipo de biopsias son PCR e hibridación in situ con la sonda genética BS4.5 específica para IHHNV (u otras sondas para IHHNV). Aunque menos sensitiva, la hibridación en formato “Dot blot” también puede utilizarse para analizar este tipo de muestras. Histología de rutina El diagnóstico de esta enfermedad está basado en la presencia de inclusiones intranucleares (CAI). El corte histológico del apéndice es hecho en el plano longitudinal medio para de esta manera poder proveer una panorámica tan amplia como sea posible de los tejidos presentes (epidermis, subcutis, y fibras nerviosas). El corte resultante es examinado para determinar la presencia de inclusiones intranucleares tipo CAI (las cuales aparecen como cuerpos elongados en las células de las fibras nerviosas). Mediante esta técnica es posible detectar muchos de los animales infectados en una población dada, sin embargo, se desconoce la sensibilidad del procedimiento y por lo tanto no es recomendable para certificar la condición SPF de una población.

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Enfermedades Virales

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL IHHNV

Figura 2.1 P. stylirostris durante la fase aguda de la enfermedad causada por IHHNV. Nótese el patrón anormal de coloración en los segmentos abdominales impartiéndole al camarón una apariencia bandeada o moteada. Tanto el camarón en la esquina superior izquierda (solamente se observan los pleópodos) como el de la esquina inferior derecha (solamente se observa la cabeza), se encontraban extremadamente letárgicos (postrados de lado) y posiblemente moribundos.

Figura 2.2 Se muestran varios ejemplos de rostro deformados en P. vannamei con IHHNV en fase crónica (síndrome de las deformaciones y el enanismo). El rostro puede llegar a mostrar desviaciones prácticamente en cualquier dirección.

Figura 2.3 Ejemplos adicionales de deformaciones corporales en P. vannamei a consecuencia de la enfermedad causada por IHHNV (síndrome de las deformaciones y el enanismo). Nótese la deformación del sexto segmento abdominal en 3 de los 4 camarones que se muestran.

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ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL IHHNV

Figura 2.4. Fotomicrografía a bajo aumento de un corte histológico de un juvenil de P. stylirostris en la etapa aguda de la enfermedad causada por IHHNV (G4=grado severo). Corte hecho a través del epitelio cuticular y el tejido conectivo subcuticular, en la parte dorsal del cuerpo, justo posterior al corazón. Se pueden observar numerosas células necróticas con núcleos picnóticos o con cuerpos de inclusión intranucleares eosinofílicos (inclusiones de Cowdry tipo A o CAI). Las flechas señalan algunos ejemplos. Tinción; H&E de MayerBennett. Magnificación 830X.

Figura 2.5. Fotomicrografía de una lamela branquial mostrando tres células adyacentes con cuerpos de inclusión intranuclear de IHHNV tipo CAI, dentro de los núcleos hipertrofiados (varios ejemplos marcados por las flechas). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 1,800X.

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Enfermedades Virales

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL IHHNV

Figura 2.6. Resultados de una prueba de hibridación en formato de punto-mancha (“Dotblot”) para IHHNV. Se utilizó una sonda de ADN, marcada con DIG, específica para la detección de IHHNV. Las muestras de hemolinfa positivas presentan la deposición de un precipitado de color azul o púrpura, mientras que las muestras negativas no muestran precipitado alguno.

Figura 2.7. Resultados de una prueba de hibridación in situ para IHHNV. Se utilizó una sonda de ADN, marcada con DIG, específica para la detección de IHHNV. Corte medio-sagital de un juvenil de P. vannamei con síndrome RDS (RDS= “Runt deformity syndrome” o Síndrome de las deformaciones y el enanismo). Se puede observar una reacción positiva de la sonda en varios CAIs y restos celulares así como también en la hemolinfa. Tinción: Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnificación 600X.

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2.3

Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus, WSSV)

Nombre de la enfermedad En la literatura (principalmente la referencia de los primeros reportes de esta enfermedad) se hace mención a por lo menos tres “virus” dentro del complejo del síndrome de la mancha blanca (WSSV). Hoy en día se sabe que todos son en realidad el mismo agente. Estos son:

4 HHNBV = “Hypodermal & hematopoietic necrosis baculovirus” (baculovirus de la necrosis hematopoiética e hipodérmica); SEED= “Shrimp Explosive Epidermic Disease” (enfermedad explosiva de la epidermis del camarón); “China virus disease” (enfermedad del virus de la China).

4 RV-PJ = “Rod-shaped nuclear virus of Penaeus japonicus” (virus intranuclear cilíndrico de Penaeus japonicus).

4 SEMBV = “Systemic ectodermal and mesodermal baculovirus” (baculovirus sistémico del ectodermo y del mesodermo); enfermedad roja; enfermedad de las manchas blancas. 4 WSBV = “White spot baculovirus” (baculovirus de la mancha blanca); síndrome de la mancha blanca; enfermedad de la mancha blanca.

Hoy en día también se sabe que no se trata realmente de un baculovirus sino de un virus completamente diferente, con características propias y para el cual se ha propuesto la creación de una nueva familia que llevará el nombre de familia Nimaviridae. WSSV es un virus de doble cadena de ADN; presenta forma elíptica a cilíndrica, membrana trilaminar y los viriones tienen un tamaño de 80-120 x 250-380 nm. En preparaciones teñidas negativamente, es posible observar la presencia de un apéndice o “cola”. El genoma tiene un tamaño aproximado de 290 kbp, lo cual lo hace uno de los virus más complejos que infectan al camarón. Métodos preferidos actualmente para el diagnóstico de WSSV:

4 4 4 4 4

Métodos histológicos de rutina con tinción de hematoxilina/eosina (H&E). Método rápido de campo para la tinción de improntas. Hibridación in situ con sondas genéticas específicas. Hibridación en formato “dot blot” con sondas genéticas específicas. Aplicación de anticuerpos monoclonales (MAbs) para la detección de WSSV en formato de ELISA de flujo lateral. Conocido en el mercado como “Shrimple®”.

4 PCR con pares de iniciadores específicos para la detección de WSSV (por ejemplo,

método reconocido por la OIE-Organización Mundial de Sanidad Animal- y kits comerciales).

Rango geográfico de distribución y especies afectadas Rango geográfico El virus del síndrome de la mancha blanca ha sido reportado en las regiones geográficas mencionadas más abajo. Sin embargo, debido a que la industria depende mucho del transporte regional e internacional de camarón vivo, es muy posible que 70

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Enfermedades Virales

la distribución de éste y otros virus sea mayor que lo indicado y probablemente en expansión. -

China, Japón, Korea, Tailandia, Indonesia, Taiwan, Vietnam, Malasia, India y Texas (U.S.).

Después de su aparición en 1992-1993 en el noroeste de Asia, este virus se ha dispersado rápidamente a través de la mayoría de las regiones cultivadoras de camarón en Asia y el Indo Pacífico. En noviembre de 1995, ocurrió el primer caso confirmado de WSSV en el hemisferio occidental. En este caso, se trataba de camarones cultivados (P. setiferus) en una granja del sur del estado de Texas. En la vecindad de la granja afectada se encontraba una planta procesadora de camarón, la cual se sospecha pudo haber sido el foco de la infección, ya que era uno de los mayores importadores y reprocesadores de camarón proveniente de zonas afectadas por WSSV en Asia. Más adelante, a finales del año 1999, ocurrió el primer caso confirmado de WSSV en América Central. Hoy en día, la enfermedad se ha dispersado a México, Nicaragua, Honduras, Costa Rica, Panamá, Ecuador, Perú, Colombia y Brasil. Especies afectadas Infecciones naturales. Se han observado infecciones naturales en las siguientes especies: Penaeus monodon, P. japonicus, P. chinensis (=orientalis), P. indicus, P. merguiensis, P. setiferus, P. stylirostris y P. vannamei. Infecciones experimentales. En estudios de laboratorio, una cepa de virus originaria de Tailandia resultó altamente patogénica para las siguientes especies: P. vannamei, P. stylirostris, P. aztecus, P. duorarum y P. setiferus. No se ha observado resistencia significativa en ninguna de las especies de camarones peneidos. Sígnos clínicos de importancia diagnóstica •

Se ha reportado que durante la fase aguda de la enfermedad, los camarones tienden a mostrar una reducción en el consumo de alimento, se vuelven letárgicos, la cutícula se desprende fácilmente y presenta manchas blancas (de ahí el nombre dado a la enfermedad) de aproximadamente 0.5 a 2.0 mm de diámetro, las cuales son más conspicuas en la parte interna del caparazón. Es posible que las manchas blancas representen depósitos anormales de sales de calcio en el epitelio cuticular.

•

En muchos casos, como sucede con los peneidos americanos, los camarones moribundos presentan una coloración rosada a rojiza (de ahí el nombre de la “enfermedad roja”) debido a la expansión de cromatóforos del epitelio cuticular. En estos casos, la presencia de manchas blancas es limitada o ausente.

Las poblaciones de camarón que presentan estos signos clínicos tienden a exhibir altas tasas de mortandad acumulada, alcanzando hasta el 100% de 3 a 10 días después de que se observan los primeros signos. Factores ambientales Se ha reportado la influencia marcada de la temperatura del agua en la manifestación de la enfermedad (Vidal, O.M. et al., 2001; Granja, C.B. et al., 2003). Camarones 71

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infectados con WSSV pueden permanecer asintomáticos a temperaturas arriba de 27ºC, pero la enfermedad de hace evidente si la temperatura del agua disminuye. Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad Diagnóstico presuntivo La presencia de signos clínicos tal y como se describió anteriormente. •

Historial de las instalaciones de cultivo, de la especie cultivada, o de la región, que indique la posibilidad de que haya una infección por WSSV (por ejemplo, la importación previa de camarones peneidos, ya sea PLs, reproductores, etc., desde una región en donde recientemente haya habido un brote de WSSV).

•

Demostración de núcleos hipertrofiados y vacuolizados, visibles en preparaciones o improntas de tejido epitelial y tejido conectivo del estómago y/o de las branquias, en camarones que presenten signos clínicos de la enfermedad tal y como se describió anteriormente.

Métodos para la detección y el diagnóstico definitivo Para llegar a un diagnóstico definitivo de WSSV, se pueden utilizar cualquiera de los siguientes métodos: Métodos histológicos de rutina •

El diagnóstico histológico de WSSV está basado en la demostración de inclusiones intranucleares prominentes, de color eosinófilo a basófilo pálido (con tinción de H&E), Feulgen positivas, las cuales se encuentran dentro de núcleos hipertrofiados, comúnmente en las células epiteliales y el tejido conectivo y con menos frecuencia en el epitelio de la glándula antenal, en las células parenquimales del órgano linfoide, en el tejido hematopoiético y en los fagocitos fijos localizados dentro del corazón.

•

Durante la fase temprana de desarrollo de la enfermedad, los cuerpos de inclusión de WSSV son eosinofílicos, centro-nucleares, rodeados de un halo claro y un anillo de cromatina, lo cual los hace muy parecidos a los cuerpos de inclusión de IHHNV. En este punto es difícil distinguir entre ambos, a menos que se utilize hibridación in situ con sondas genéticas específicas.

•

Sin embargo, durante la etapa más avanzada de la infección de WSSV, los tejidos infectados presentan cuerpos de inclusión más grandes y más desarrollados, no muestran un halo y son de un color basofílico pálido, lo cual los hace fácilmente distinguibles de los cuerpos de inclusión de IHHNV. Usualmente los núcleos de las células infectadas por WSSV presentan una sola inclusión, pero ocasionalmente se pueden llegar a observar inclusiones múltiples.

Método rápido de campo para la tinción de preparaciones en húmedo Este método esta basado en la visualización de cuerpos de inclusión intranucleares de WSSV, a partir de tejidos previamente fijados en solución de Davidson. Las piezas de tejido fijado son rehidratadas, teñidas con hematoxilina-eosina de Mayer-Bennet y examinadas con un microscopio compuesto. Este protocolo fue diseñado originalmente en China y luego modificado en la Universidad de Arizona para la detección rápida de WSSV. Con este método, el biólogo 72

C. R. Pantoja y D.V. Lightner

Enfermedades Virales

encargado de cualquier laboratorio de producción de postlarvas o granja, puede efectuar un diagnóstico definitivo si previamente se ha familiarizado con la apariencia microscópica de las lesiones causadas por WSSV (como se observan por medio de histología con tinción H&E). En el libro titulado “A handbook of pathology and diagnostic procedures for the major diseases of penaeid shrimp” (Lightner 1996) es posible encontrar referencias fotográficas, otros métodos de diagnóstico y una descripción de los signos clínicos y de las lesiones causadas por WSSV a nivel histológico. Materiales y equipo: A continuación se proporciona una lista del material necesario: - Microscopio compuesto - Pipetas Pasteur o gotero - Tijeras y navaja fina o bisturí - Pinzas de punta fina - Portaobjetos y cubreojetos de vidrio - Solución fijadora de Davidson - Papel filtro o bolsas de té vacias (para envolver las piezas de tejido) - Seis contenedores pequeños (25-100 ml de capacidad) o cajas de Petri - Etanol al 50 y 70% - Hematoxilina (de Mayer/Bennett) - Eosina “Y” al 2% (solución acuosa) - Agua corriente - Agua destilada Selección de la muestra: Para llevar a cabo esta prueba, se deben utilizar únicamente animales moribundos o que muestren signos agudos de la infección (por ejemplo, letárgicos, coloración café oscura o rojiza, altas tasas de mortandad, etc.). Al menos en el caso Penaeus vannamei o P. stylirostris no es común observar las manchas blancas que característicamente se observan en otras especies tales como P. monodon. Fijación: Este protocolo ha sido diseñado para su uso con camarones o partes de camarón que han sido previamente fijados con solución de Davidson AFA (4-24 horas) y luego transferidos a alcohol etílico al 70%. Procedimiento: -

Tome la muestra y fíjela con la solución de Davidson siguiendo el método usual.

-

Prepare seis contenedores con las siguientes soluciones: a) etanol 70% d) hematoxilina b) etanol 50% e) agua corriente c) agua destilada f) eosina “Y” al 2% (Para prevenir evaporación mantenga los contenedores cubiertos). 73

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

-

Después de un período mínimo de fijación de 4 horas para postlarvas y juveniles pequeños (o piezas de tejido) y de 24 horas para juveniles grandes y adultos, remueva el estómago y ambas cubiertas de las branquias (la capa de cutícula que recubre a la cámara branquial). Envuelva los tejidos en papel poroso o colóquelos dentro de una bolsa de té vacía para evitar perderlos durante los lavados.

-

Sumerja el paquete de tejidos en el alcohol al 70% por un período de 1 hora y media. Haga un cambio de alcohol fresco al 70% y deje los tejidos en el mismo por otra hora y media. Nota: no deje que los paquetes se sequen durante ninguna de las fases de este procedimiento.

-

Escurra bien el paquete al sacarlo del acohol al 70% y transfiéralo aún húmedo al alcohol al 50%, en donde deberá permanecer por 15 minutos.

-

Escurra el paquete y transfiéralo al contenedor con agua destilada por un período de 5 minutos. Reemplace el agua 6 veces durante este lapso de tiempo. Escurra el exceso de agua del paquete y transfiéralo a la hematoxilina por un período de 25 minutos.

-

Escurra la hematoxilina y sumerja el paquete en agua corriente por un período de 25 minutos. Reemplace el agua 6 veces durante este lapso de tiempo.

-

Escurra el exceso de agua y coloque el paquete en la solución de eosina al 2% por un período de 1-2 minutos.

-

Enjuague el paquete brevemente con agua destilada.

-

Coloque la muestra sobre una gota de agua destilada en un portaobjetos limpio. Examine por separado los tejidos de un solo animal.

-

Con la ayuda de unas pinzas de punta fina, desprenda de la cutícula del estómago (o de la cubierta de las branquias) la capa de epitelio y colóquela en el portaobjetos. Resulta un poco mas difícil desprender la capa de epitelio del estómago, pero éste es uno de los mejores órganos para la detección de los cuerpos de inclusión de WSSV. Usando una navaja de rasurar, es posible cortar el estómago en piezas pequeñas (en cuadros de 2-3 mm), las cuales son colocadas en el portaobjetos y con pinzas finas se les puede desprender la capa de epitelio.

-

Una vez que se han obtenido los fragmentos de tejido epitelial, se agrega un poco de agua si es necesario y se le coloca encima un cubreobjetos.

-

Examine los tejidos con la ayuda de un microscopio compuesto (con aumentos de 20X o 40X). Los organismos infectados por WSSV presentan cuerpos de inclusión bastante prominentes, de tinción variable (de eosinifílico a basofílico), los cuales son aproximadamente 2-3 veces más grandes que el tamaño normal del núcleo y generalmente muy numerosos. Los cuerpos de inclusión tempranos tienen un parecido muy grande con los cuerpos de inclusión tipo Cowdry A, que aparecen a consecuencia de la infección por IHHNV. Los cuerpos de inclusión de WSSV más tardíos o maduros, tienden a aparecer más basofílicos (generalmente de color morado) y de forma variable (de circular a irregular).

Diagnóstico de WSSV usando sondas genéticas

74

•

En varios países tales como China, Japón, Tailandia y los Estados Unidos, se han desarrollado sondas genéticas para la detección de WSSV.

•

Los detalles de los procedimientos para el uso de estas sondas están disponibles a través de las compañías o grupos distribuidores de las sondas o de los estuches (“kits”) completos para efectuar las pruebas.

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Enfermedades Virales

•

Las células de los tejidos infectados por WSSV se tiñen intensamente en los lugares en donde la sonda se ha hibridado con el material genético del virus.

•

El virus WSSV es “reconocido” únicamente por la sonda específica para WSSV. Ninguna de las otras sondas (por ejemplo para IHHNV, BP, HPV, etc.) reacciona con WSSV.

Detección de WSSV por medio de la reacción de anticuerpos monoclonales Recientemente se han desarrollado varios métodos para la detección y diagnóstico de WSSV utilizando anticuerpos monoclonales (B. Poulos et al., 2001; Y. Takahashi et al., 2003). Estos anticuerpos reaccionan con una de las proteínas estructurales del virus y pueden ser aplicados a muestras de especímenes fijados en solución de Davidson (Poulos et al., 2001) o en membranas a través de flujo lateral (Y. Takahashi et al. 2003). Para el uso de los anticuerpos de acuerdo al método desarrollado por Poulos et al., 2001, no es necesario impregnar los especímenes en parafina (aunque el método también funciona en cortes histológicos en parafina). En el caso del “Shrimple”, desarrollado por Y. Takahashi et al. 2003, se requiere de tejido fresco o congelado, pero no se puede usar tejido fijado. La firma “DiagXotics” puso en el mercado un estuche o “kit” que hace uso de estos anticuerpos mediante una técnica conocida como “Immunosquash”. De manera breve, la técnica del “Immunosquash” consistía de los siguientes pasos: •

Fijación de las muestras en solución de Davidson por 24-48 horas dependiendo del tamaño del camarón. Transferencia de las muestras a alcohol etílico al 70%.

•

Desmenuzamiento del tejido (generalmente branquias o estómago) en pequeños bloques de 2-4 mm.

•

Rehidratación del tejido.

•

Homogenización ligera del tejido.

•

Tratamiento de bloqueo.

•

Reacción con el anticuerpo contra WSSV (anticuerpo primario).

•

Lavados para eliminar el exceso de anticuerpo primario.

•

Reacción con un anticuerpo secundario.

•

Lavado para eliminar el exceso de anticuerpo secundario.

•

Reacción de detección.

•

Examen al microscopio.

Todas las reacciones se llevaban a cabo dentro de un tubo de plástico de microcentrífuga. La reacción para la visualización de los anticuerpos es la misma que se usa en el método de hibridación in situ; por lo tanto, en aquellas células en donde ocurría una reacción positiva se observaría la presencia de un precipitado azul oscuro o negro. La sensibilidad de la técnica del “Immunosquash” es por lo menos igual a la de la hibridación in situ. El “Immunosquash” presentaba las siguientes ventajas cuando se le compara con la hibridación in situ: •

No se requiere impregnar el tejido en parafina.

•

No se requiere equipo complejo o especializado para el procesamiento de las muestras.

75

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

•

El tiempo para la obtención de resultados es de tan sólo unas horas (si se parte de muestras ya fijadas).

Por otro lado, la sensibilidad del método del “Shrimple” es por lo menos similar a la del PCR de un paso (no anidado).

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL WSSV

Figura 2.8. Cuatro juveniles P. monodon mostrando signos de infección por WSSV. El camarón de la parte superior y el de la derecha casi no muestran manchas blancas, pero se puede distinguir una coloración rosada a café-rojiza causada por la expansión de los cromatóforos subcuticulares. Es posible que esta coloración rojiza sea más aparente durante la etapa aguda de la enfermedad. El camarón de la izquierda y el de la parte inferior muestran las manchas blancas que característicamente aparecen en esta especie al pasar la etapa aguda de la infección.

Figura 2.9 Caparazón de un juvenil de P. monodon con la enfermedad de la mancha blanca (WSSV). Las manchas blancas son depósitos calcáreos localizados en la porción interna del exoesqueleto. Fotografía cortesía P. Saibaba (S.K.B.R. College, Amalapuram, India).

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Enfermedades Virales

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL WSSV

Figura 2.10 Caparazón de un juvenil de P. vannamei con la enfermedad de la mancha blanca (WSSV). Se ha observado que en el caso de las especies de camarones peneidos americanos, la presencia de manchas blancas no es una característica muy común durante las epizootias de WSSV. Sin embargo, se pueden llegar a presentar, como se observa en el espécimen que se muestra en esta figura.

Figura 2.11. Microfotografía de un corte histológico a través del estómago de un juvenil P. chinensis infectado con WSSV. Se observa una abundancia de cuerpos de inclusión intranuclear prominentes, ubicados en el epitelio cuticular y el tejido conectivo sub-cuticular (algunos ejemplos son señalados por las flechas). Las células muestran cuerpos de inclusión intranuclear en diferentes fases de la infección. En esta fotografía se pueden observar cuerpos de inclusión en la fase temprana de la infección, los cuales están localizados en la parte central del núcleo, son eosinofílicos y rodeados de un halo claro creado por un artefacto de fijación que los separa de las membranas nucleares y la cromatina marginada (lo cual los hace muy similares a los cuerpos de inclusión de IHHNV). Tinción: H&E de MayerBennett. Magnificación 900X.

Figura 2.12. Corte histológico a través del estómago de un juvenil P. stylirostris infectado experimentalmente con WSSV. Se puede observar una abundancia (grado G4) de cuerpos de inclusión intranucleares característicos de WSSV (algunos ejemplos señalados con flechas). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 900X.

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ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL WSSV

Figura 2.13. Corte histológico a través del estómago de un juvenil P. vannamei infectado experimentalmente con WSSV. Se puede observar una abundancia (grado G4) de cuerpos de inclusión intranucleares característicos de WSSV Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 900X.

Figura 2.14. Corte histológico a través del estómago de un juvenil P. vannamei, el cual ha sido sometido a una prueba de hibridación in situ con una sonda de ADN, marcada con DIG, específica para la detección de este virus. La sonda ha reaccionado intensamente con cuerpos de inclusión intranucleares (los cuales contienen WSSV) en varios tejidos del camarón incluyendo el epitelio cuticular del estómago. Tinción Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnificación 900X.

Figura 2.15. Corte histológico a través de la glándula antenal de un juvenil P. vannamei, el cual ha sido sometido a una prueba de hibridación in situ con una sonda de ADN, marcada con DIG, específica para la detección de este virus. Se muestra una reacción bastante intensa a la sonda dentro de los núcleos de las células infectadas en el epitelio de la glándula antenal. Tinción Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnificación 450X.

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Enfermedades Virales

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL WSSV

Figura 2.16 Esta microfotografía ilustra el resultado final después de la tinción con H&E de Mayer-Bennett. El tejido que se muestra es epitelio cuticular de la cubierta de la cámara branquial. Se pueden observar claramente los cuerpos de inclusión intranuclear característicos de WSSV.

Figura 2.17. Ejemplo de los resultados obtenidos al usar anticuerpos monoclonales para la detección de WSSV por medio del método de “Immunosquash”. Esta fotomicrografía muestra una porción de una lamela branquial y la deposición de un precipitado azul oscuro dentro de los núcleos de las células infectadas por WSSV, en donde los anticuerpos han reconocido las partículas virales. Tinción: Bismarck Brown.

2.4

Virus del Síndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV)

Nombre de la enfermedad Virus del Síndrome de Taura (TSV); Síndrome de Taura (TS); enfermedad de Taura; enfermedad de la cola roja. Agente Debido a que presenta las siguientes características, el virus del síndrome de Taura (TSV) ha sido clasificado tentativamente como un miembro de la Familia Picornaviridae: tiene una morfología icosahédrica, las partículas tienen un diámetro promedio de 30-32 nanómetros, tienen una densidad de 1.337 g/mL, el tipo de replicación es citoplásmico, los sitios de replicación son Feulgen negativos, contiene ARN de una sola cadena con una longitud de aproximadamente 9 kb y la cápside está compuesta de tres proteínas estructurales principales (49, 36.8 y 23 kDa) y dos secundarias (51.5 y 52.5 kDa).

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Métodos preferidos actualmente para la detección y el diagnóstico • Histología de rutina con tinción de H&E. •

Hibridación in situ con sondas genéticas específicas para TSV.

•

Bioensayos en combinación con histología utilizando camarones juveniles SPF P. vannamei como indicadores de la presencia de TSV.

•

Detección del virus por medio de RT-PCR.

Rango geográfico de distribución y especies afectadas Rango geográfico • TSV se encuentra distribuido en países de Centro y Sudamérica. Recientemente fue detectado en Taiwan en granjas donde se habían introducido postlarvas de P. vannamei.

80

•

El síndrome de Taura fue reconocido por primera a vez como una enfermedad única en granjas camaroneras en la cercanía de la boca del río Taura en Guayaquil, Ecuador, en junio de 1992

•

Sin embargo, a través de un análisis retrospectivo de muestras de camarón tomadas en la región de Taura en Ecuador en septiembre de 1991, se demostró que la enfermedad ya estaba presente en esta región antes de 1992. De la misma manera, algunos granjeros de la región sospechan que la enfermedad ya estaba presente a mediados de 1990, cuando se observaron pérdidas inexplicables durante la fase de crianza de P. vannamei forzando a varios granjeros a abandonar el uso de estanques de crianza y adoptando en su lugar la práctica de “siembra directa” de postlarvas a densidades relativamente bajas en los estanques de engorda.

•

Análisis retrospectivos de muestras de P. vannamei tomadas en Colombia en febrero de 1990 también han revelado la presencia de lesiones similares a las observadas en casos de síndrome de Taura (Laramore 1995).

•

A partir de 1992, el síndrome de Taura se ha dispersado a muchas de las regiones del continente americano, en donde ha sido observado tanto en camarones silvestres como cultivados. Casos documentados de síndrome de Taura se han originado en: •

Regiones de cultivo a lo largo de las zonas camaroneras de Ecuador (1991 al presente).

•

La región de Tumbes, Perú (1993 al presente).

•

Costas del Pacífico y Caribe de Colombia (1993/94 al presente).

•

El Golfo de Fonseca en la región de Honduras y en El Salvador (1994 al presente).

•

Guatemala (1994).

•

Noreste del Brasil (1994).

•

Nicaragua (1995).

•

Estados de Sonora, Sinaloa, Chiapas y Guerrero en México (1995).

•

Texas (1995), Hawai (1994) y Florida (1994) en los Estados Unidos de Norteamérica.

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Enfermedades Virales

• TSV ha sido documentado en postlarvas y adultos silvestres de P. vannamei capturados cerca de la costa de Ecuador, El Salvador, y el estado mexicano de Chiapas, cerca de la frontera con Guatemala. •

Es posible que la distribución geográfica del síndrome de Taura continúe expandiéndose debido a que la industria depende en gran parte de las poblaciones silvestres de nauplios, postlarvas y reproductores, los cuales son transportados a diferentes regiones geográficas e incluso países.

Especies afectadas •

El rango de especies afectadas no se conoce completamente.

•

Se han documentado infecciones en poblaciones silvestres de P. vannamei, P. stylirostris y P. setiferus.

•

Se ha logrado infectar experimentalmente postlarvas y juveniles de P. setiferus, postlarvas de P. aztecus y juveniles de P. chinensis.

•

En el estadío de postlarva (de ~PL-12 en adelante) y de juvenil de P. vannamei, TSV causa infecciones serias y altas mortandades en poblaciones de camarón cultivado.

•

En contraste, aunque TSV puede infectar juveniles de P. stylirostris, esta especie parece ser menos susceptible a la infección.

•

Los estadíos de postlarva y de juvenil de P. aztecus y P. duorarum parecen ser resistentes a esta enfermedad.

Signos clínicos de importancia diagnóstica Signos del síndrome de Taura •

El síndrome de Taura es muy conocido como una enfermedad que se presenta durante la fase de crianza de P. vannamei, lo cual ocurre de los 14 a los 40 días después de la siembra de las postlarvas en los estanques. Por lo tanto, los camarones afectados tienden a ser típicamente juveniles de aproximadamente 0.05 g a menos de 5 g. Los camarones más grandes también pueden ser afectados, especialmente si nunca han sido expuestos al virus.

•

La enfermedad exhibe una fase aguda y otra de recuperación (crónica), las cuales pueden distinguirse a simple vista.

Fase Peraguda/aguda: en los camarones moribundos, durante la fase peraguda de la enfermedad, los signos observables a simple vista incluyen expansión de los cromatóforos rojos, lo cual le imparte al camarón una coloración general que va de rosada a rojiza y a los urópodos una coloración roja (de ahí el nombre de la enfermedad de la cola roja). Los animales en la fase peraguda tienden a morir durante la ecdisis (proceso de muda). En estos animales, cuando se examina con más detenimiento el epitelio cuticular, por ejemplo de un apéndice (en la punta de los urópodos o de los pleópodos, por ejemplo), es posible observar evidencia de necrosis multifocal del epitelio. Los camarones que muestran estos signos peragudos, generalmente también tienen la cutícula suave, el intestino vacío y se encuentran en el estadío “D” del ciclo de muda (ecdisis)

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Los animales con infección peraguda severa mueren típicamente durante la ecdisis, lo cual sugiere que el proceso de muda es una parte importante de la patogénesis del síndrome de Taura. Fase crónica/recuperación: en los estanques, cantidades bajas o moderadas de camarón tienden a presentar lesiones multifocales melanizadas del tipo de la enfermedad de la concha. Los camarones en esta fase de la enfermedad pueden o no presentar su cutícula blanda y expansión de los cromatóforos rojos. Es posible observar a tales camarones comportándose y alimentándose normalmente. Estos camarones son sobrevivientes de la etapa peraguda o aguda de la enfermedad, los cuales al haber mudado exitosamente muestran las lesiones melanizadas en vías de recuperación. Aunque una epizootia de síndrome de Taura puede resultar en mortandades acumuladas que van del 80% al 90% de la población en un estanque, los sobrevivientes típicamente muestran supervivencias de 60% o más al tiempo de la cosecha.

Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad Diagnóstico presuntivo •

La presencia de signos clínicos tal y como se describió anteriormente.

•

Un historial ya sea de las instalaciones de cultivo, de la especie cultivada o de la región, que indique la posibilidad de infección por TSV (por ejemplo la importación de P. vannamei originario de Ecuador o de otras regiones en donde se sabe que existe TSV).

•

Preparaciones húmedas de apéndices (urópodos, escalas antenales, pleópodos, etc.) que muestren necrosis multifocal del epitelio cuticular en animales juveniles durante la fase peraguda/aguda de la enfermedad.

Métodos para la detección y el diagnóstico definitivo del virus Para llegar a un diagnóstico definitivo de TSV, tanto en camarones individuales como en poblaciones enteras, se pueden utilizar cualquiera de los siguientes métodos: Métodos histológicos de rutina •

•

El diagnóstico histológico de la enfermedad (con tinción H&E), durante la fase aguda/peraguda, se basa en la demostración de áreas de necrosis multifocal en el epitelio cuticular del caparazón, apéndices, branquias, esófago, estómago e intestino posterior. •

Sólo muy raramente el epitelio de los túbulos de la glándula antenal se ve afectado.

•

Con frecuencia, el tejido conectivo subcuticular y las fibras adyacentes de músculo estriado también se ven afectadas.

Las lesiones cuticulares multifocales son muy conspicuas y consisten en lo siguiente: •

82

El citoplasma de las células afectadas muestra un incremento en la eosinofilia.

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Enfermedades Virales

•

La picnosis nuclear y cariorrexis son una característica común en las lesiones de síndrome de Taura.

•

En ocasiones es posible observar la presencia de inclusiones citoplásmicas y frecuentemente una abundancia extrema de cuerpos esféricos (de 1 a 20 µm de diámetro) que van de eosinofílicos a basofílico pálido.

•

Los núcleos picnóticos y cariorrécticos dan una reacción positiva con la tinción de Feulgen (para ADN), lo cual los distingue de las inclusiones citoplásmicas eosinófilas/basófilas pálidas que no contienen ADN.

•

La ausencia de infiltración hemocítica, o de otro tipo de respuesta inflamatoria, distingue la fase peraguda de la fase de recuperación o crónica de la enfermedad.

•

La presencia de núcleos picnóticos y cariorrécticos así como de las inclusiones citoplásmicas generalmente esféricas, le dan a las lesiones de la fase aguda/peraguda una apariencia “aperdigonada” o “apimentada”, lo cual es considerada como una característica patognomónica de la enfermedad.

•

Durante la fase de recuperación o crónica de la enfermedad, las lesiones cuticulares asemejan aquellas ocasionadas por infección bacteriana de la concha (“shell disease”).

•

•

Estas lesiones pueden llegar a presentar erosión de la cutícula, colonización bacteriana superficial e invasión de la cutícula por presuntas especies de Vibrio.

•

Una marcada infiltración hemocítica, la cual puede o no estar melanizada, se encuentra con frecuencia en posición basal con respecto a las lesiones cuticulares melanizadas.

Durante la fase de recuperación o crónica de la enfermedad, es común observar la presencia de estructuras dentro del órgano linfoide conocidas como “esferoides”. Se ha observado que en camarones durante esta fase crónica (los cuales pueden carecer de las lesiones cuticulares diagnósticas), estos esferoides muestran una reacción positiva a la sonda genética, sugiriendo una relación estrecha con el proceso de la enfermedad.

Diagnóstico de TSV usando sondas genéticas Se han desarrollado sondas genéticas de ADN complementario (cADN) las cuales proveen excelente sensibilidad diagnóstica en casos de infección por TSV. • La sonda genética, no radioactiva y marcada con DIG, puede ser usada en ensayos de hibridación in situ. •

La prueba de hibridación in situ puede ser aplicada a muestras de tejido fijadas de acuerdo al procedimiento explicado en la sección sobre toma y preparación de muestras.

•

Cuando son sujetas a la prueba de hibridación in situ con las sondas cADN, las lesiones de TSV muestran una reacción positiva bastante prominente en la forma de un precipitado que va de azul a negro y el cual está localizado en el citoplasma de las células afectadas.

•

Los fragmentos nucleares picnóticos y cariorrécticos que contribuyen a la apariencia “aperdigonada” o “apimentada” de las lesiones patognomónicas, no reaccionan con la sonda genética. 83

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Hibridación en formato “Dot blot” •

El ensayo de hibridación en formato de “dot blot” ha sido aplicado solamente a nivel experimental para el diagnóstico con sondas no radioactivas marcadas con DIG y usando muestras de hemolinfa y virus semipurificado.

•

Problemas relacionados con la estabilidad del ARN de una sola cadena (el cual constituye el genoma de TSV) durante la prueba de “dot blot”, han limitado el desarrollo y la aplicación de este tipo de estuches de campo basados en el uso de sondas cADN marcadas con DIG para la detección de este agente.

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL TSV

Figura 2.18. Figura esquemática mostrando el progreso hipotético de la enfermedad de TSV en P. vannamei. Inmediatamente después de la infección inicial, sobreviene una viremia que dispersa las partículas virales a través del hemoceloma del camarón. Durante los estadíos de muda previos a la ecdisis, las células altamente activas del epitelio cuticular proveen un blanco ideal para el virus y, una vez infectadas, TSV comienza a replicarse a expensas de las funciones normales de estas células (por ejemplo, la secreción de la cutícula, y la transferencia de calcio entre la cutícula nueva y la que será reemplazada). La etapa peraguda de la infección se manifiesta con mayor intensidad durante los estadíos críticos de la ecdisis y, debido a la interrupción resultante, muchos camarones mueren durante esta etapa. Los camarones que sobreviven a la muda entran en la etapa crónica o de recuperación y generalmente exhiben lesiones melanizadas de la cutícula en aquellos lugares en donde las lesiones de TSV se encuentran en vías de recuperación. Los camarones afectados de esta manera pueden sufrir otro episodio peragudo de la infección durante la siguiente muda o bien puede que lleguen a mudar normalmente y recuperarse. Durante esta etapa de recuperación los camarones pueden ser portadores del virus pero se ignora por cuanto tiempo.

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Enfermedades Virales

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL TSV

Figura 2.19. Dos ejemplares de camarón cultivado P. vannamei colectados en Ecuador. Ambos especímenes se encontraron moribundos y con signos de la fase peraguda del síndrome de Taura. Durante la etapa peraguda los camarones se encuentran generalmente letárgicos, tienen una cutícula blanda y los urópodos pueden llegar a tomar una coloración rojiza.

Figura 2.20. Fotografía, a mayor aumento, de los urópodos de uno de los camarones mostrados en la Figura 2. Usando una lupa, o una cámara fotográfica con lente de acercamiento, es posible observar la irregularidad de los bordes del epitelio cuticular de los urópodos (señalado por la flecha). Estas irregularidades en el epitelio son la manifestación de la necrosis causada en este tejido por el virus de TSV. Magnificación aproximadamente 10X.

Figura 2.21 Juvenil de P. vannamei capturado en un estanque de cultivo en Ecuador. Este ejemplar se encuentra en la etapa crónica, o de recuperación, de TSV. Se pueden observar múltiples focos de melanización que señalan los sitios de la cutícula en donde el epitelio necrosado por la infección de TSV se encuentra en vías de recuperación.

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ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL TSV

Figura 2.22. Corte histológico a través del estómago de un juvenil P. vannamei en la etapa peraguda de infección por TSV. Se muestran áreas necróticas prominentes (la flecha gruesa señala un ejemplo) en el epitelio cuticular, el cual normalmente secreta la parte acelular de la cutícula. Adyacente a las lesiones necróticas focales es posible observar células epiteliales aparentemente normales (la flecha delgada señala algunos ejemplos). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 300X.

Figura 2.23. Microfotografía de alto aumento mostrando una lesión clásica de TSV. Este tipo de lesiones consiste de necrosis del epitelio cuticular y del tejido conectivo sub-cuticular, con células mostrando núcleos picnóticos o cariorrécticos, así como también una marcada eosinofilia e inclusiones citoplasmáticas con propiedades variables de tinción. Las inclusiones citoplasmáticas y los núcleos picnóticos y cariorrécticos le imparten a la lesión su apariencia característica (patodiagnóstica) “aperdigonada” (“buckshot-riddled”) o “apimientada” (“peppered”). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 900X.

Figura 2.24. Corte histológico a través de uno de los apéndices de una postlarva de P. vannamei en la fase peraguda de infección por TSV. Este ejemplar ha sido sometido a una prueba de hibridación in situ con una sonda genética de cADN marcada con DIG, específica para la detección de TSV. La sonda ha reaccionado intensamente con células infectadas en donde es posible observar un precipitado azul oscuro o negro dentro del citoplasma de células del epitelio cuticular y del tejido conectivo subcuticular. La sonda no ha reaccionado con los núcleos picnóticos o cariorrécticos, lo cual es de esperarse ya que TSV es un virus citoplásmico. Los restos de los núcleos contribuyen a dar la apariencia apimientada típica de las lesiones de TSV. Tinción: Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnificación 900X.

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Enfermedades Virales

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL TSV Figura 2.25. Corte medio-sagital a través del órgano linfoide (OL) de un juvenil P. vannamei infectado experimentalmente con TSV. Al momento de la fijación, el espécimen se encontraba en la fase crónica o de recuperación de la enfermedad. A pesar de que las lesiones patognomónicas de TSV del tipo que se observan en el epitelio cuticular nunca ocurren en el OL, la infección por TSV sí induce lesiones de otro tipo en este órgano. Entremezclado con los cordones de tejido normal del OL, los cuales se caracterizan por su arquitectura de varias capas de células arregladas concéntricamente alrededor de un conducto central para la hemolinfa (se señala un ejemplo con una flecha delgada), se encuentran acumulaciones desorganizadas de células del OL, las cuales forman estructuras a las que se les ha llamado “esferoides” del OL (EOL). Los EOL carecen de un conducto central y consisten de células que muestran cariomegalia, vacuolas citoplasmáticas bastante prominentes e inclusiones citoplasmáticas de tamaño y forma irregular (la flecha gruesa muestra un ejemplo de un esferoide). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 450X.

Figura 2.26. Preparación en húmedo que muestra la porción de un urópodo de una postlarva de P. vannamei en la etapa peraguda de la infección por TSV. Este espécimen se encontraba en el estadío D4 del ciclo de muda (según la separación que se puede observar entre la cutícula “vieja” y la “nueva”). La flecha de la izquierda señala un área necrótica en el epitelio cuticular (área desorganizada y con una abundancia de pequeñas esferas refráctiles, las cuales son en realidad núcleos picnóticos y cariorrécticos) mientras que la flecha en la esquina superior derecha señala una porción de epitelio cuticular aparentemente normal. Se pueden observar también algunos cromatóforos rojos en el tejido conectivo sub-cuticular del urópodo. Tinción: Preparación en húmedo sin teñir. Magnificación 300X.

2.5

Virus del síndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus, YHV)

Nombre de la enfermedad Enfermedad de la cabeza amarilla, enfermedad (YH) o enfermedad de la cabeza amarilla de P. monodon. Agente Etiológico Virus de la cabeza amarilla (YHV).

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Inicialmente algunos investigadores tailandeses reportaron que YHV era un baculovirus citoplásmico Tipo B (virus de la granulosis) o un virus similar a un baculovirus y le asignaron el nombre de baculovirus de la cabeza amarilla o YHB. Sin embargo, al llevar a cabo una caracterización detallada se encontró que se trataba de un virus completamente nuevo, para el cual hubo necesidad de crear una nueva familia, conocida con el nombre de Roniviridae. Agente •

YHV no es un baculovirus ya que no contiene cdADN (cadena doble de ADN) sino csARN (cadena sencilla de ARN).

•

El virus de la cabeza amarilla es un virus de ARN de cadena sencilla (ssARN), tiene forma cilíndrica, presenta una envoltura y es de replicación citoplásmica.

•

Los viriones tienen forma cilíndrica y varían en tamaño en un rango de 150 nm a 200 nm de longitud por 40 nm a 50 nm de ancho. Las estructuras que posiblemente sean las nucleocápsides (y/o formas aberrantes de nucleocápsides) miden aproximadamente 15 nm de diámetro con longitudes variables de hasta aproximadamente 800 nm de largo.

Métodos preferidos actualmente para el diagnóstico •

Historial y signos clínicos de YHV.

•

Métodos histológicos de rutina con tinción H&E.

•

Tinción de hemocitos con el método de rutina de Wright-Giemsa.

•

Detección del virus por medio de RT-PCR.

•

Hibridación in situ con sondas genéticas específicas para la detección de YHV.

Rango geográfico de distribución y especies afectadas Rango geográfico Aparentemente YH es una enfermedad ampliamente distribuida en poblaciones de P. monodon. Aunque hasta hace relativamente poco la enfermedad de la cabeza amarilla fue reconocida y descrita por primera vez en camarones de Tailandia, es probable que YHV haya sido el mismo síndrome que ha venido afectando a la industria del cultivo de P. monodon por casi una década. Es posible que YHV haya sido responsable del hundimiento de la industria de Taiwán en 1986-1987 y de epizootias más pequeñas, pero serias, en regiones de Indonesia, Malasia, China y Filipinas que cultivan P. monodon. Hace relativamente poco, se reportó la presencia de YHV en el continente americano (Lo et al., 1998); sin embargo, el hallazgo nunca pudo ser confirmado y es probable que se haya tratado más bien de un diagnóstico erróneo. Especies afectadas • YHD es una enfermedad importante en sistemas intensivos de cultivo de P. monodon en el sureste de Asia e India.

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•

A través de biosensayos con P. monodon como especie indicadora, se encontró que camarones de agua salobre de las especies Palaemon styliferus y Acetes sp. (presentes en los estanques de camarón) son portadores de YHV (Flegel et al.,1995).

•

Aunque resistentes a la enfermedad cuando se encuentran en los estanques, se ha observado que P. merguiensis y Metapenaeus ensis pueden ser infectados experimentalmente durante pruebas de desafío (Flegel et al., 1995).

•

Se ha demostrado experimentalmente que YHV puede infectar y causar infecciones serias en los estadíos juveniles de los camarones peneidos americanos de las especies P. vannamei, P. stylirostris, P. setiferus, P. aztecus y P. duorarum. En estos mismos estudios, se observó que los estadios de postlarva de las mismas especies eran relativamente resistentes.

Signos clínicos de importancia diagnóstica Existen ciertos signos clínicos característicos que pueden ser observados en P. monodon cuando ha sido infectado por YHD. Durante varios días, los juveniles y los subadultos (especialmente durante los 50-70 días de cultivo) en estanques intensivos de cultivo, muestran un incremento anormal y abrupto en el consumo de alimento. Posteriormente, los animales dejan de alimentarse completamente y dentro de un plazo de un día es posible observar algunos camarones moribundos nadando lentamente cerca de la superficie en las orillas de los estanques. Estos camarones moribundos pueden llegar a exhibir una coloración amarillenta del cefalotórax. El número de camarones mostrando signos similares incrementa dramáticamente en el segundo día y para el tercero, después de haber cesado de alimentarse, comienza una mortandad masiva la cual típicamente resulta en la pérdida total del estanque. Los camarones moribundos pueden llegar a presentar con frecuencia uno o más de los siguientes signos: palidez corporal generalizada en combinación con una coloración amarillenta del cefalotórax; branquias blanquecinas o de color amarillo pálido a café; hepatopáncreas de color amarillo pálido. Se ha reportado que en una ocasión en que incidentalmente se encontraron postlarvas de P. merguiensis en el mismo estanque en que se hallaba una población de P. monodon infectado por YHV, las postlarvas de P. merguensis no presentaban ningún signo de la enfermedad.

Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad Diagnóstico presuntivo Historial y signos clínicos •

Presencia de los signos clínicos descritos previamente.

•

Un historial que indique la posible presencia de YHV en las instalaciones de cultivo, en la región o en las especies de camarón usadas para el cultivo.

Diagnóstico definitivo El diagnóstico definitivo se basa en el historial, la presencia de signos clínicos descritos anteriormente y la confirmación por medio de histopatología.

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Histopatología La histopatología se caracteriza por una necrosis generalizada, de multifocal a difusa, con presencia prominente de picnosis y cariorrexis. En los tejidos afectados es posible observar inclusiones citoplasmáticas perinucleares basofílicas, generalmente esféricas. Entre los tipos de células o tejidos afectados se incluyen los hemocitos, órgano linfoide, tejido hematopoyético, células pilar y epiteliales de las lamelas branquiales, tejido conectivo esponjoso del subcutis, músculo, intestino, glándula antenal, gónadas, cordón y ganglios nerviosos, entre otros. Entre los cambios celulares tempranos ocasionados por YHV se incluye la hipertrofia nuclear, disminución y marginación de la cromatina y desplazamiento lateral del nucleolo. Puede llegar a ocurrir una respuesta inflamatoria en forma de infiltración hemocítica, agrupamiento y encapsulación, pero es más bien difusa y no muy conspicua, a menos de que al mismo tiempo se presente una infección bacteriana secundaria. Existe un tipo único de célula que se presenta con frecuencia en camarones infectados con YHV y que puede servir como ayuda para el diagnóstico histológico de esta enfermedad. Este tipo de célula se presenta en cantidades muy variables, pero no es del todo rara. Generalmente se le puede observar en los espacios hemales existentes en varios tejidos tales como branquias, glándula antenal, hepatopáncreas, corazón etc.; este tipo de célula es generalmente esférica, presenta citoplasma de apariencia uniforme, pálidamente basofílico y con un núcleo esférico y central. Es probable que estas células sean en realidad hemocitos inmaduros liberados prematuramente por los órganos hematopoyéticos en respuesta a la hemocitopenia causada por la infección de YHV. Es importante tener en cuenta que infecciones severas de WSSV pueden llegar a ocasionar una necrosis del órgano linfoide casi idéntica a la ocasionada por YHV (Pantoja y Lightner, 2001). Esta similitud puede ocasionar confusión y resultar en un diagnóstico erróneo de YHV. Sin embargo, en el caso de WSSV dicha necrosis del órgano linfoide es acompañada por la presencia de los cuerpos intranucleares característicos de WSSV. De cualquier manera, si hay razón para sospechar la presencia de YHV en muestras de camarón procedentes de regiones afectadas por WSSV, se debe de recurrir a pruebas de hibridación in situ (con la sonda para YHV) y/o de RT-PCR para determinar el estatus real de YHV en los animales en cuestión.

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Enfermedades Virales

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL YHV

Figura 2.27. Los tres especímenes de P. monodon, del grupo de la izquierda muestran los signos externos de la enfermedad causada por YHV. Nótese la coloración amarillenta o café-amarillenta del cefalotórax en general, lo cual le dio el nombre a la enfermedad (fotografía cortesía del Dr. T.W. Flegel, Bangkok, Tailandia).

Figura 2.28. Corte histológico a través de las branquias de un juvenil P. monodon infectado por YHV. Se puede observar una necrosis generalizada y difusa en las células de las lamelas branquiales, dentro de las cuales es aparente la presencia de núcleos picnóticos y cariorrécticos (algunos ejemplos son señalados por las flechas). Dentro de las células señaladas también es posible observar un citoplasma bastante basofílico y la presencia de inclusiones citoplasmáticas basofílicas perinucleares. Dichas células son posiblemente hemocitos que han sido liberados prematuramente en respuesta a la hemocitopenia inducida por la infección con YHV. Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 1,000X.

Figura 2.29. Corte histológico a través del órgano linfoide (OL) de un juvenil P. monodon en la fase aguda de infección por YHV. Se puede observar una necrosis generalizada y difusa de las células del OL. Las células afectadas muestran núcleos picnóticos y cariorrécticos. Las flechas señalan algunas células con cuerpos de inclusión citoplasmáticos perinucleares, los cuales varían en coloración de basofílico pálido a oscuro. Esta marcada necrosis durante la fase aguda de la infección por YHV la distingue de TSV que causa lesiones similares en otros tejidos pero no en el OL. Recientemente se ha comprobado que infecciones severas por WSSV pueden causar también este tipo de necrosis en el OL, sin embargo, en el caso de WSSV se pueden observar los cuerpos de inclusión intranucleares en combinación con la necrosis severa del órgano. La necrosis severa del OL no debe tomarse por si sola como evidencia concluyente de infección por YHV. Para poder confirmar el diagnóstico de YHV, es necesario llevar a cabo pruebas adicionales (como por ejemplo, hibridación in situ con sondas específicas para la detección de YHV o RT-PCR). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 525X.

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ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL YHV

Figura 2.30. Corte histológico a través de las branquias de un juvenil P. duorarum infectado experimentalmente con YHV. Se puede observar una necrosis severa (grado G4), de multifocal a difusa, caracterizada por la presencia de células con un incremento en la eosinofilia del citoplasma y núcleos picnóticos. Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 1,000X.

Figura 2.31 Corte histológico a través del órgano linfoide de un camarón P. monodon infectado por YHV. El especimen fue sujeto a una prueba de hibridación in situ con una sonda genética marcada con DIG, específica para la detección del virus de la cabeza amarilla (YHV). Se puede observar una intensa reacción positiva (deposición de un precipitado azul oscuro o negro) a la sonda dentro del citoplasma de las células parenquimales de un esferoide en el órgano linfoide. Aparentemente las estructuras conocidas como “esferoides” del órgano linfoide (EOL) son una respuesta no específica del sistema inmunológico del camarón contra una variedad de agentes patógenos. Además de YHV, se han observado EOLs durante la fase crónica o de recuperación de TSV y también durante algunas enfermedades bacterianas. Los EOL no deben tomarse como una característica diagnóstica definitiva de ninguna enfermedad. La presencia de EOL debe ser interpretada dentro del contexto del histórico de las muestras y la sospecha de una determinada enfermedad viral debe ser confirmada por medio de otros métodos; por ejemplo, hibridación in situ con la sonda genética apropiada. Tinción: Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnificación 100X.

2.6

Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV)

Nombre de la enfermedad Mionecrosis infecciosa; Necrosis infecciosa del músculo. Agente Etiológico Virus de la mionecrosis infecciosa. Agente IMNV es un virus tentativamente clasificado como un totivirus (Familia Totiviridae). Los viriones son de forma icosaédrica, con un diámetro de aproximadamente 40 nm y 92

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una densidad de 1.366 en gradientes de cloruro de cesio. El genoma consiste de una sola molécula de ARN de doble cadena (dsRNA). El genoma consiste de 7,560 pares de bases. Rango geográfico y de especies afectadas IMNV infecta camarones peneidos. Infecciones naturales han sido observadas únicamente en Penaeus vannamei. Infecciones experimentales han sido logradas con P. stylirostris y P. monodon. IMNV es una enfermedad que se descubrió por primera vez en la costa del Nordeste de Brasil. Posteriormente se diseminó al sureste de Asia (Java, Indonesia) en donde se piensa fue introducido a través de la importación de camarones P. vannamei infectados. La transmisión de la enfermedad puede ocurrir horizontalmente a través del agua y canibalismo. Se piensa que la transmisión vertical es bastante probable, pero no ha sido demostrada experimentalmente. La enfermedad de IMN no es la misma que la conocida como “enfermedad de la cola blanca”. Ambas enfermedades resultan en la necrosis del músculo esquelético y aparentemente los signos son muy similares. Sin embargo, la enfermedad de la cola blanca es causada por un virus completamente diferente a IMNV. Los estadíos de vida del camarón afectados por IMNV incluyen postlarvas, juveniles y adultos.

Signos clínicos de importancia diagnóstica Tejidos/órganos afectados Típicamente se incluyen el músculo esquelético (y el cardiaco con menor frecuencia), tejido conectivo, hemocitos y las células parenquimales del órgano linfoide. Lesiones observadas a nivel macroscópico Los camarones infectados presentan áreas necróticas en el músculo estriado (esquelético) del abdomen (cola). Estas áreas necróticas son multifocales en sus inicios y posteriormente se vuelven más difusas, incrementando en tamaño hasta que se expandan abarcando casi la totalidad de la cola. En estadios avanzados de la enfermedad, las zonas necróticas adquieren una coloración rojiza-anaranjada. Los camarones continúan alimentándose a pesar de estar infectados severamente. Si estos camarones son estresados (por ejemplo, al ser capturados con una atarraya, o debido a cambios drásticos en la salinidad, temperatura, etc.) se pueden volver moribundos y la mortandad puede sobrevenir rápidamente y continuar por varios días. Si se hace una disección en fresco para exponer el órgano linfoide, se puede observar que ambos lóbulos se encuentran hipertrofiados, adquiriendo un tamaño 3-4 veces mayor de lo normal. Lesiones observadas a nivel microscópico Preparaciones de músculo en fresco ya sea teñidas o sin teñir, muestran la presencia de anormalidades (por ejemplo, ausencia de estriaciones, fibras deformes o fragmentadas, etc.). Preparaciones del órgano linfoide en fresco, pueden poner de manifiesto la presencia de masas esféricas (esferoides), entre los túbulos normales. 93

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Procedimientos de diagnóstico Diagnóstico presuntivo. Basado en historial del caso y signos clínicos descritos anteriormente. Diagnóstico confirmatorio. Basado en uno o más de los siguientes métodos: Histopatología. Utilizando técnicas de rutina con tinciones de hematoxilina-eosina (H&E), se puede observar que en los camarones infectados se presenta una necrosis de tipo coagulativo en las fibras musculares estriadas acompañada frecuentemente por edema. En algunos casos, es posible observar una combinación de lesiones “nuevas” o agudas y “viejas” o crónicas. El progreso de las lesiones parece ir de los niveles más agudos en donde predomina la necrosis coagulativa, hasta los estadios más crónicos en donde se observa primero infiltración hemocítica y posteriormente una matriz suelta de fibrocitos y fibras de tejido conectivo mezcladas con fibras musculares recién regeneradas. El análisis histológico también puede poner de manifiesto la hipertrofia del órgano linfoide ocasionada por la acumulación de esferoides. Esta lesión se presenta de manera muy consistente en camarones durante las fases agudas y crónicas de la enfermedad. Con frecuencia, estos esferoides se pueden observar también en otras partes del cuerpo del camarón, incluyendo el corazón, branquias, glándula antenal, cordón ventral nervioso, tejido conectivo, etc. El análisis histológico también puede poner de manifiesto la presencia de cuerpos de inclusión intracitoplásmicos en las células del músculo esquelético, órgano linfoide y/o tejido conectivo. RT-PCR. Utilizando los métodos descritos por Poulos et al. 2006, o bien alguno de los “kits” disponibles en el mercado (por ejemplo, IQ2000). Debido a la gran similitud entre las lesiones producidas por IMNV y por PvNV, es aconsejable combinar el análisis histológico con el RT-PCR, o con pruebas de hibridación in situ y sondas genéticas específicas, para poder obtener un diagnóstico confirmatorio confiable.

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ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL IMNV

Figura 2.32. Signos clínicos de la enfermedad causada por IMNV. Camarones Penaeus vannamei tomados de un estanque de cultivo. La necrosis del músculo es evidente en forma de áreas opacas de color blanquecino.

Figura 2.33. Signos clínicos de la enfermedad causada por IMNV. En estadíos más avanzados, el músculo necrosado puede adquirir una coloración anaranjada/rojiza, como se puede observar en el especimen superior.

Figura 2.34. Necrosis de tipo coagulativo acompañada de inflamación hemocítica y fibrosis. Como referencia, se puede observar una porción de músculo esquelético normal en la esquina superior derecha. Tinción: Hematoxilina/eosina-floxina de Mayer-Bennett. Barra= 50 µm.

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ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL IMNV

Figura 2.35. Las flechas muestran algunos ejemplos de cuerpos de inclusión intracitoplásmicos, de tipo basófilo, dentro de un grupo de células del músculo. Tinción: Hematoxilina/eosina-floxina de Mayer-Bennett. Barra= 20 µm.

Figura 2.36 Corte histológico de músculo esquelético sometido a una prueba de hibridación in situ con una sonda genética específica para la detección de IMNV. El precipitado de color azul oscuro indica los lugares en donde la sonda ha reaccionado con el virus. Tinción de contraste: Café de Bismarck. Barra= 50 µm.

2.7

Mionecrosis infecciosa viral (IMNV) y sus implicaciones en los cultivos de camarones brasileños

Alitiene Moura Lemos Pereira¹, Emiko Shinozaki Mendes², Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira³ ¹ Embrapa Meio-Norte, BR 343, km 35, C.P.341, Parnaíba, PI, Brasil, [email protected] ² Universidade Fed. Rural de Pernambuco, Av. Dom Manoel de Medeiros, s/n. Recife, PE, Brasil, esmendes@dmv. ufrpe.br ³ Universidade Fed. do Ceará, LABOMAR, Av. da Abolição, 3207, Fortaleza, CE, Brasil, [email protected]

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Introducción El cultivo de camarón brasileño concentró sus esfuerzos en el desarrollo de un sistema de producción con la especie Litopenaeus vannamei nativa del océano Pacífico, luego de problemas de baja productividad y adaptación al medio ambiente con especies nativas y exóticas en los años 90. Esta especie ampliamente estudiada, demostraba un buen desempeño zootécnico, rusticidad y adaptabilidad, además de que ya se conocía su tecnología de producción y formulación para alimento balanceado, con base en sus requerimientos nutricionales. El factor decisivo para la escogencia de esta especie, fue el incremento exponencial de producción obtenido en Brasil, permitiéndose así la importación de larvas y reproductores de otros países y resultando en aumento de divisas para el sector productivo (Figura 6). A pesar de las mejoras económicas y del crecimiento de la producción (70% al año), pasando de 2.880 toneladas en 1996 a 25.000 toneladas en 2000, el sistema de cultivo utilizado con esta nueva especie presentó fallas, debido a problemas de adaptación, ausencia de técnicas adecuadas de cultivo y aumento de la intensificación del sistema de producción, lo cual no fue acompañado de un aumento importante del área cultivada (MAPA, 2001). Figura 2.37. Producción y productividad del camarón Litopenaeus vannamei cultivado en Brasil. Fuente: Asociación Brasileña de Criadores de Camarón – ABCC.

El sistema intensivo de cultivo de camarón, fue empleado en muchos casos con instalaciones inadecuadas, sin el monitoreo y conocimiento técnico necesarios. La inexistencia de medidas de bioseguridad permitió el libre transito de larvas y reproductores entre los diversos estados, sin el mínimo control sanitario para el transporte de camarones. Considerando que las enfermedades infecciosas ocurren con frecuencia en los cultivos de todo el mundo y nuevas epizootias de origen viral son identificadas a cada año, ya habían sido registradas enfermedades causadas por virus, bacterias y protozoarias en las fincas camaroneras brasileñas, sin reportes de pérdidas importantes (Gesteira, 2006).

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Surgimiento de la Mionecrosis Infecciosa Viral El primer reporte de Mionecrosis Infecciosa viral (IMNV) en Brasil, se dio en septiembre de 2002 en una camaronera del Estado del Piauí, con registros de mortalidad diaria principalmente a partir de 7 g, en animales que presentaron como principal signo clínico opacidad en el músculo abdominal (Nunes et al., 2004). Existen dudas sobre una posible ocurrencia previa de esta enfermedad, debido a que signos semejantes habían sido reportados hace 35 años y diferentes autores ya relacionaban la necrosis muscular con factores climáticos o con situaciones de extremo estrés tales como lluvias intensas, elevaciones bruscas de temperatura y salinidad, reducción del nivel de oxígeno, alta densidad de población y la presencia de polución química en el agua (Lakshmi et al.,1978; Sindermann y Lightner, 1988). Esas enfermedades, en aquel momento llamadas Necrosis Muscular Idiopática, fueron diagnosticadas en Penaeus aztecus en EUA en 1970 (Rigdon & Baxter, 1970) y en México en 1978, y relaciona con cambios de temperatura y salinidad, mostrando similitud con la enfermedad observada en los EUA (Lakshmi et al., 1978). Fue también reportada en la especie nativa Farfantepenaeus subtilis en la zona costera del estado de Piauí en los años 80 (Lightner, 2004). Ninguno de los reportes anteriores presentaba una mortalidad de 70% y la ocurrencia de estos brotes fue considerada como una “enfermedad de manejo”, la cual sería solucionada con una mejora de las condiciones ambientales y la corrección de las eventuales fallas técnicas realizadas por los técnicos de campo. Así como otras enfermedades, esta también parecía ser multifactorial (Thrusfield, 2004), habiendo un agente principal en el caso del virus de la mionecrosis infecciosa. Fueron emitidas algunas hipótesis sobre la causa de esta mionecrosis, como por ejemplo la ocurrencia de la enfermedad del algodón causada por un microsporidio y que provoca pérdida de la transparencia del músculo abdominal; el síndrome del encalambramiento (CMS) o, desequilibrio mineral en el alimento. Debido a la falta de precisión para determinar la causa de la enfermedad, esta pasó a ser llamada Necrosis Muscular Idiopática (NMI); es decir, de causa desconocida. En los primeros meses de 2003 y durante el invierno, los estados del Ceará y Piauí, se vieron afectados por precipitaciones elevadas, con caídas bruscas de la salinidad (de 50 ppt a 10 ppt), temperaturas elevadas y elevada afloración de cianobacterias en los estanques. Estas condiciones ambientales agravaron la aparición de los signos clínicos observados anteriormente en camarones cultivados en Piauí y se hicieron los primeros registros de camarones enfermos en camaroneras del estado de Ceará. Se hicieron cambios en la metodología de cultivo y en los tratamientos para la mionecrosis, tales como incremento del recambio diario de agua (>20%), aplicación de cal en los estanques (150 a 300 kg/ha) y reducción de la densidad de cultivo. Sin embrago, a pesar de la utilización de esas medidas y la elevación de la salinidad por disminución de las lluvias, no se logró eliminar la mionecrosis del país. Según la Asociación Brasileña de Criadores de Camarón – ABCC, las pérdidas debido a IMNV fueron estimadas en 20 millones de dólares sólo durante 2004.

Diseminación de la enfermedad Varios profesionales y productores del Nordeste de Brasil, registraron las alteraciones más comunes en los ambientes de cultivos y su relación con la evolución de la enfermedad. Sin embargo, como se trataba de una nueva enfermedad, fue difícil su caracterización. A pesar de lo anterior, el intercambio de información entre el sector 98

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científico y productivo del país fue mínimo y la mayoría de los productores no sabía lo que estaba ocurriendo. Para agravar la situación, la ausencia de barreras sanitarias en la actividad acuícola del país, permitió la rápida diseminación de la enfermedad entre las camaroneras de la Región Nordeste de Brasil, mucho antes de que se conociera la verdadera dimensión del problema. Con la diseminación de la enfermedad en ambientes adversos, el rango de los brotes se fue ampliando llegando a afectar sistemas de producción con las siguientes condiciones: •

Fases de pre-cría con densidades de 35 a 120 pls/litro

•

Fase de engorde con camarones de 3 g promedio

•

En densidades de 15 a 80 camarones/m2

•

Camarones procedentes de diferentes laboratorios de producción de postlarvas

•

Cultivos que utilizan variadas marcas de alimentos comerciales

•

En cultivos con la variables físicas y químicas aceptables para la especie

•

La supervivencia promedio obtenida fue de 30 a 40% con un FCA > 2:1

Algunos productores cultivaron L. vannamei en agua dulce durante el período de gran incidencia de mionecrosis y no reportaron problemas con la enfermedad. Pero el virus puede presentarse también en animales cultivados en agua dulce y afectar todos los estadios de desarrollo. Etiología •

Bioensayos realizados en laboratorio, por Graf et al. (2003), exponiendo individuos presumiblemente saludables a tejidos de camarones con signos clínicos de mionecrosis, mostraron que el mayor vector de transmisión de esa patología, fue la ingestión directa de los tejidos contaminados, caracterizando por tanto, su transmisión horizontal.

•

Después de la confirmación de la naturaleza infecciosa, a través de desafíos por inyecciones y preparación de tejidos contaminados en individuos SPF, el agente causante de IMN fue identificado como un virus perteneciente a la familia Totiviridae (Lightner y Pantoja, 2004). La purificación y caracterización del virus denominado virus de la mionecrosis infecciosa, fueron efectuadas por Poulos et al. (2006). La partícula viral tiene forma icosahédrica y mide 40 nm de diámetro. Su genoma está formado por una molécula de ARN de doble cadena (dsRNA) de 7.560 bp.

•

Esta enfermedad conocida como IMNV (Necrosis Infecciosa Muscular o Mionecrosis Infecciosa Viral), tuvo su primer registro en los estados del Nordeste de Brasil y más recientemente en L. vannamei cultivado en Indonesia (Senapin et al., 2007). La detección fue hecha utilizando un kit comercial de RT-PCR y análisis subsecuentes revelaron que la muestra del IMNV de Indonesia tenía 99,6% de similitud con la secuencia del ácido nucleico del IMNV brasileño registrado en GeneBank. Según algunos autores y como información extra oficial, hubo entrada irregular de reproductores provenientes del Brasil, en la Isla de Java.

•

Además del diagnóstico de la enfermedad en todas las fases de cultivo (post-larva, juvenil y adulto) de la especie L. vannamei, también se han mostrado susceptibles al virus IMNV camarones de las especies L. stylirostris y Penaeus monodon, presentando signos clínicos y alteraciones en los tejidos característicos de la enfermedad (Tang et al., 2005). 99

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Métodos de diagnóstico El diagnóstico puede ser presuntivo con base en la sintomatología observada macroscópicamente, siendo el foco principal la pérdida de transparencia del músculo abdominal. También se puede detectar la enfermedad a través de estudios histopatológicos, cuando son investigadas posibles alteraciones en los órganos internos y tejidos. La hibridación in situ fue desarrollada y optimizada como una herramienta de diagnóstico por Tang et al. (2005). Otro método molecular para la detección del virus es la RT-PCR. Andrade et al. (2007) mostraron que el RT-PCR usado con sondas TaqMan resulta ser un método de diagnóstico de alta sensibilidad. Signos clínicos En el inicio del brote de la IMN, los camarones presentaban opacidad focal o multifocal del músculo del abdomen y en casos de mayor severidad, se tornaban rojizos, principalmente en el último segmento. Los individuos quedaban aletargados, presentaban baja conversión alimenticia, abdomen encalambrado (en algunos casos), expansión de los cromatóforos, reducción de la tasa de crecimiento y tiempo elevado de coagulación de la hemolinfa (Figura 6.1a y 6.1b). De acuerdo con lo reportado por Gesteira (2006), los grados de infección pueden cambiar y presentar cuadros clínicos diversos: •

De leve a moderado – baja mortalidad y menos de 10% de los camarones cultivados presentan signos clínicos.

•

Aguda - elevada mortalidad, más de 10% de la población cultivada presenta signos clínicos con nivel de severidad de medio a alto.

•

Crónica – mortalidad baja, pero persistente y signos clínicos perceptibles en menos de 5% de los individuos. En ese estado se pueden presentar signos agudos, cuando se presentan fallas de manejo o cualquier otro evento que produzca en los camarones una condición de inmunosupresión.

Aparentemente, la mionecrosis es una enfermedad que surge como consecuencia de fallas de manejo, o en sistemas sobrecargados de materia orgánica. Todos los eventos han tenido en común el desequilibrio de condiciones de cultivo, denominadas “detonantes” por muchos autores, las cuales desencadenan la enfermedad e incluyen el exceso de lluvias, presencia elevada de plancton, infestación elevada de parásitos como gregarinas o, acción de bacterias oportunistas como los vibrios. Como consecuencia de la enfermedad, las fincas camaroneras han adoptado buenas prácticas de manejo que incluyen bajar las densidades de siembra y buen tratamiento de suelo entre los ciclos de cultivo, entre otras. Con éstas, se obtienen buenos resultados de producción final, a pesar que se detecten lesiones sugestivas de mionecrosis durante el análisis presuntivo o confirmatorio durante el ciclo. La presencia de putrefacción en el último segmento abdominal que se observó al principio de los brotes en Brasil (2003), prácticamente no se observan en la actualidad. Histopatología: Los exámenes histopatológicos muestran diferentes alteraciones en órganos y tejidos afectados por el IMNV, dependiendo del grado de severidad de la enfermedad. El aumento en la talla del órgano linfoide es común y también es frecuente observar esferoides en este órgano (lymphoid organ spheroids- LOS) (Figura 6.2). Pueden ser encontrados los ectópicos en tejido conjuntivo, músculo del corazón y próximos a los túbulos de la glándula antenal (Figura 6.3a y 6.3b). Las lesiones del tejido muscular dependen 100

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Enfermedades Virales

del grado de severidad de la infección, pudiéndose presentar en la fase inicial una infiltración hemocítica. La fase aguda se caracteriza por ser una necrosis de coagulación, con presencia de edema y un elevado daño en las fibras musculares, muchas veces substituidas por tejido conjuntivo. En esta fase, se observan cuerpos de inclusión típicos de enfermedades virales, detectados en células musculares, tejido conectivo y hemocitos (Figura 6.4a y 6.4b). La necrosis de licuefacción (Figura 6.5), con infiltración hemocítica en músculo afectado (inflamación) y fibrosis, ocurre en camarones en fase crónica de la enfermedad, cuando los LOS ectópicos son más comúnmente visualizados (Lightner y Pantoja, 2004; Lightner et al., 2004; Gesteira, 2006).

Figura 2.38 Camarón portador de IMNV presentando opacidad del músculo abdominal Autor: Pereira, A.

Figura 2.39 Camarones mostrando diferentes grados de lesión muscular . Autor: Pereira, A.

Figura 2..40 – Órgano linfoide mostrando la presencia de esferoide (seta). H & E. Autor: Gesteira, T.C.V.

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Figura 2.41 – (a) Foto de micrografías mostrando la presencia de LOS ectópicos en la región cardiaca (setas); (b) detalle mayor. H &E. Autor: Pereira, A. M.

Figura 2.42 – (a) Mionecrosis acompañada de infiltración hemocítica y fibrosis ; (b) lesiones coagulativas musculares resultantes de la acción del virus de la mionecrosis H & E. Autor: Gesteira, T.C.V.

Figura 2.43 - Necrosis de licuefacción resultante de la acción del virus de la mionecrosis infecciosa. H & E. Autor: Pereira, A. M.

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Enfermedades Virales

Diagnóstico diferencial La necrosis muscular en el abdomen de los camarones, es una lesión que puede ocurrir como consecuencia de estrés, bajas de oxígeno, alta densidad de siembra, cambio brusco de temperatura o salinidad (Lakshmi et al., 1978; Rigdom & Baxter, 1970) y también puede ser resultante de la acción de un agente infeccioso, como el caso de la IMNV. Lesiones similares se observan en la enfermedad de la cola blanca causada por un Nodavirus. A pesar de la importancia de la histopatología como herramienta de diagnóstico confirmatorio, el uso de sondas geonómicas, como hibridación in situ o PCR, garantizan una mayor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico. Un ejemplo es la necrosis muscular detectada en camarones de la especie L. vannamei procedentes de Belice. Según Tang et al, (2007), los individuos presentaban la misma opacidad muscular en el abdomen, con características histopatológicas similares a aquellas observadas en portadores de IMNV. Después del examen utilizando las técnicas de hibridación in situ y RT-PCR, los resultados fueron negativos para IMNV, sugiriendo que la enfermedad era causada probablemente por otro virus RNA. Los autores encontraron 69% de similitud de este virus de Belice con el nodavirus del Macrobrachium rosenbergii, adoptando este nuevo virus la denominación de PvNV (Penaeus vannamei nodavirus). Además de agentes virales, las bacterias también pueden causar opacidad muscular que se asemeja a la observada en IMNV (Lightner, 1996), como por ejemplo los vibrios y las pseudomonas. La diferencia puede ser vista a través de histopatología (ausencia de cuerpos de inclusión) o mediante pruebas moleculares como RT-PCR. Tratamientos Considerando las características del sistema inmune de los camarones, no existe un tratamiento específico para la IMNV. Como cualquier enfermedad, las medidas preventivas son las más económicas y eficaces. Un buen manejo de los cultivos debe incluir la adopción de normas de bioseguridad para evitar la entrada y establecimiento de nuevos patógenos y permitir una mejor supervivencia en la presencia de enfermedades. Consideraciones finales Actualmente, en muchas fincas camaroneras algunas de las prácticas de manejo de cultivos fueron cambiadas principalmente por reducción de la densidad de siembra (10 a 40 camarones/m2), tratamientos del suelo entre los cultivos, preparación y fertilización de los estanques y vaciado sanitario entre los ciclos de cultivo. En algunos laboratorios productores de pls, fueron implementados programas de mejoramiento genético, inclusive con importación de reproductores SPF y SPR que podrían proporcionar pls de buena calidad y con menores posibilidades de enfermedad por IMNV. En otros laboratorios, a pesar de no tener implementada esas prácticas, han sido cuidadosos con la bioseguridad y por ello, en cultivos que son bien manejados, no se detecta una incidencia elevada de IMN. En la actualidad, a pesar de que en Brasil se pueden observar lesiones sugestivas de mionecrosis durante análisis presuntivos o confirmatorios en camarones, la supervivencia promedio es de 70%.

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2.8

Penaeus vannamei nodavirus (PvNV)

Nombre de la enfermedad: Enfermedad de la cola blanca. Nombre del agente: Penaeus vannamei nodavirus. Agente PvNV es un virus tentativamente asignado a la Familia Nodaviridae. Los viriones son de forma icosaédrica, con un diámetro de aproximadamente 22 nm. El genoma consiste de dos moléculas de ARN de cadena sencilla (ssRNA). Rango geográfico y especies afectadas Infecciones naturales han sido observadas únicamente en Penaeus vannamei. Infecciones experimentales han sido logradas con P. monodon. PvNV fue descubierto por primera vez en Belice y aunque se sospecha que pueda estar presente en otros países de Centro y Sudamérica, hasta la fecha no se sabe de brotes en otros países los cuales hayan sido debidamente confirmados. La transmisión de la enfermedad puede ocurrir horizontalmente a través de canibalismo y posiblemente a través del agua. Existe la posibilidad de transmisión vertical, pero no ha sido demostrada experimentalmente. Hasta el momento, los estadios de vida del camarón que se sabe son afectados por PvNV, incluyen juveniles y sub-adultos. Se ignora el efecto de la enfermedad en adultos reproductores y estadios larvales.

Signos clínicos de importancia diagnóstica Tejidos/órganos afectados Típicamente se incluyen el músculo esquelético, tejido conectivo, hemocitos y las células parenquimales del órgano linfoide. Lesiones observadas a nivel macroscópico Al igual que con IMNV, los camarones infectados presentan áreas necróticas en el músculo estriado (esquelético) del abdomen (cola). En sus inicios, las áreas necrosadas son relativamente pequeñas y multifocales, posteriormente aumentando su tamaño hasta coalescer abarcando casi la totalidad de la cola. Aunque no muy frecuentemente, en estadíos avanzados de la enfermedad, las zonas necrosadas pueden volverse rojizas. Los camarones continúan alimentándose a pesar de estar infectados severamente. Si estos camarones son estresados (por ejemplo, al ser capturados con una atarraya, o debido a cambios drásticos en la salinidad, temperatura, etc.), pueden pasar a la condición de moribundos y la mortandad puede sobrevenir rápidamente continuando por varios días. Si se hace una disección en fresco para exponer el órgano linfoide, es posible observar hipertrofia en ambos lóbulos, adquiriendo un tamaño 3-4 veces mayor de lo normal. Lesiones observadas a nivel microscópico Preparaciones de músculo en fresco ya sea teñidas o sin teñir, muestran la presencia de anormalidades (por ejemplo, ausencia de estriaciones, fibras deformes o fragmentadas, etc.). Preparaciones del órgano linfoide en fresco, pueden poner de manifiesto la presencia de masas esféricas (esferoides), entre los túbulos normales. 104

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Enfermedades Virales

ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL PvNV

Figura 2.44. Signos clínicos de la enfermedad causada por PvNV. Camarones Penaeus vannamei mostrando focos de necrosis en el músculo esquelético, causada por Penaeus vannamei nodavirus, PvNV (ejemplos marcados con flechas).

Figura 2.45. Lesiones observadas a nivel histológico. A) Necrosis del músculo esquelético, acompañada de infiltración hemocítica. B) Cuerpos de inclusión intracitoplásmicos, de tipo basofílico, en células del músculo esquelético. C) Cuerpos de inclusión intracitoplásmicos, de tipo basofílico, en células del órgano linfoide. Tinción: Hematoxilina/eosina-floxina de MayerBennett. Barras= 25 µm.

Procedimientos de diagnóstico Diagnóstico presuntivo. Basado en historial del caso y signos clínicos descritos anteriormente. Diagnóstico confirmatorio. Basado en uno o más de los siguientes métodos:

Histopatología. Utilizando técnicas de rutina con tinciones de hematoxilina-eosina (H&E), se puede observar que en los camarones infectados se presenta una necrosis de tipo coagulativo en las fibras musculares estriadas acompañada frecuentemente por edema. En algunos casos, es posible observar una combinación de lesiones “nuevas” o agudas y “viejas” o crónicas. El progreso de las lesiones parece ir de los niveles más agudos en donde predomina la necrosis coagulativa, hasta los estadios más crónicos en donde se observa primero infiltración hemocítica y posteriormente una matriz suelta de fibrocitos y fibras de tejido conectivo mezcladas con fibras 105

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musculares recién regeneradas. El análisis histológico también puede poner de manifiesto la hipertrofia del órgano linfoide ocasionada por la acumulación de esferoides. Esta lesión se presenta de manera muy consistente en camarones durante las fases agudas y crónicas de la enfermedad. Es posible también observar cuerpos basófilos intracitoplásmicos dentro de las células del músculo esquelético, el órgano linfoide y el tejido conectivo.

2.9

RT-PCR. Utilizando los métodos descritos por Poulos et al. 2006, o bien alguno de los “kits” disponibles en el mercado (por ejemplo, IQ2000). Debido a la gran similitud entre las lesiones producidas por IMNV y por PvNV, es aconsejable combinar el análisis histológico con el RT-PCR, o con sondas genéticas específicas por medio de hibridación in situ, para poder obtener un diagnóstico confirmatorio confiable.

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Capítulo 3

Enfermedades Bacterianas

Capítulo 3 Enfermedades Bacterianas María Soledad Morales-Covarrubias Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C Unidad Mazatlán, Sinaloa, México.

Introducción La creciente demanda en el consumo del camarón, la drástica declinación de sus reservas naturales y la sobrepesca del mismo, trajo consigo el surgimiento de la camaronicultura. La industria del cultivo de camarón en América Latina, ha surgido como una de las fuentes de mayor generación de divisas en la región. Sin embargo, las enfermedades principalmente de origen viral y bacteriano, han ocasionado pérdidas de los cultivos, empleos e ingresos por caídas de las exportaciones. Especialmente desde la aparición de la enfermedad de la mancha blanca; la producción ha disminuido significativamente en muchos países y los productores de camarón están encontrando serias dificultades para continuar el negocio. Los patógenos se encuentran en el medio ambiente acuático generalmente en forma natural, muchos de ellos son oportunistas, es decir que mientras los camarones se encuentren en buenas condiciones, los patógenos no atacan, de tal manera que su presencia no necesariamente significa que los organismos se encuentren enfermos. Sin embargo, factores como los genéticos, contaminación del medio ambiente e intensificación de los métodos de producción, estresan a los camarones reduciendo o perturbando el funcionamiento normal del organismo, haciéndolos altamente sensibles a las enfermedades y reduciendo las oportunidades de supervivencia. El estrés en los organismos provoca cambios en todos sus sistemas, produciendo respuestas adversas en el metabolismo, regulación inmunológica, regulación hormonal y osmorregulación, haciendo al organismo más susceptible al ataque de cualquier agente patógeno, afectando la capacidad de supervivencia, reproducción y crecimiento. Actualmente, en organismos cultivados por los diferentes métodos de acuacultura, se observan camarones con características externas de organismos sanos, durante y después de un periodo de estrés, pero esto no significa que el organismo este sano, ya que después de un cierto tiempo se puede manifestar la replicación alta de un patógeno produciendo una enfermedad donde se observen porcentajes altos de mortalidad, o en otras ocasiones los organismos son portadores asintomáticos de diferentes agentes patógenos y no manifiestan características externas de animales enfermos mientras las condiciones de cultivo sean las óptimas para su desarrollo, pero si estas condiciones se tornan desfavorables, el sistema de defensa que los tenía protegidos, se suprime y la multiplicación del patógeno se desarrolla de tal manera que sobrepasa los mecanismo de defensa, causando en muchas ocasiones mortalidad al hospedero. En un estanque de cultivo existen factores como son: temperatura, salinidad, oxígeno, pH, nutrientes orgánicos e inorgánicos, los cuales influyen en las comunidades

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bacterianas presentes en los estanques, ya que éstas son susceptibles a las fluctuaciones que ellos tienen en el desarrollo del cultivo, dando como resultado en muchas ocasiones un aumento en el número o haciendo que proliferen patógenos nocivos dando como resultado mortalidades en los organismos cultivados. Para que las poblaciones bacterianas se mantengan estables en un sistema de cultivo, es necesario mantener los parámetros óptimos, así como también es indispensable la aplicación correcta de la alimentación y el mantenimiento del florecimiento de algas para una buena calidad del agua y de los fondos de los estanques y mantener un equilibrio en la población microbiana. Las bacterias en un estanque son necesarias para mantener el suelo y el agua en óptimas condiciones, ya que algunas de ellas se encargan de la degradación de los detritos y otras del reciclamiento de nutrientes; por tal motivo, la bacterias no solamente son sinónimo de enfermedad cuando se encuentran presentes en los estanques. Actualmente, el movimiento de organismos vivos que se realiza de manera frecuente en diversos países para mejorar la producción de algunas especies, ha propiciado la introducción y propagación de patógenos exóticos en lugares donde no existían, diseminándose en algunos casos a las poblaciones silvestres; es por esto que es de vital importancia conocer qué enfermedades son las de mayor presencia en la región donde se desarrolla la camaronicultura y qué patógenos las ocasionan para poder dar seguimiento a los organismos que serán cultivados por sus diversos métodos en acuicultura, así como también para la aplicación de las medidas de bioseguridad ya que éstas requieren de capacitación del personal, trabajo en equipo, organización y registro de la medidas aplicadas. Las enfermedades de origen bacteriano son unas de las principales en camarones de cultivo en el continente americano, siendo las bacterias Gram negativas las que predominan en el ambiente marino y usualmente constituyen la mayoría de las bacterias que normalmente se presentan en la microflora asociada a los camarones silvestres y de cultivo. En el presente capítulo se hace una revisión de las enfermedades bacterianas presentes en los laboratorios de producción de larvas comercial y en los cultivos de engorda de camarón de América Latina. Enfermedades producidas por bacterias Las bacterias principalmente las del género Vibrio, son consideradas como patógenos oportunistas, localizadas principalmente en el tracto digestivo, branquias y cutícula de camarones penaeidos y ocasionalmente en hemolinfa, ya que en presencia de otros factores estresantes, pueden desencadenar el desarrollo de infecciones en los organismos tales como vibriosis, hepatopáncreas edematoso y necrótico con un alto grado de vacuolización en las células B en larvicultura y engorda. Este tipo de bacterias causa infecciones letales al interactuar con factores nutricionales, bióticos, abióticos, genéticos e inmunológicos. Las especies causantes de altas mortalidades en las granjas camaronícolas son: Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, y Photobacterium daunselae y las especies que tienen cepas patógenas reportadas en los laboratorios causantes de mortalidades en larvas y postlarvas son: V. harveyi, V. splendidus y Vibrio sp. Aunque también son reportadas pero de manera ocasional en laboratorios y granjas de camarón Photobacterium damsela, V. fluvialis y Vibrio sp.

3.1

Vibriosis sistémica

La Vibriosis sistémica en algunas regiones de América Latina también se le conoce como el “Síndrome de la Gaviota”; esto, debido a la presencia de gaviotas en los estanques 120

María Soledad Morales-Covarrubias

Enfermedades Bacterianas

de engorda. Esta enfermedad se encuentra ampliamente distribuida en las instalaciones de cultivo alrededor del mundo. La vibriosis afecta a todas las especies de camarón usadas en acuicultura ya que estas pueden ser susceptibles a la infección cuando se encuentran en condiciones de estrés. Esta enfermedad se considera una infección generalizada, ya que involucra a la cutícula, hepatopáncreas, órgano linfoide, glándula antenal, corazón, hemolinfa y músculo. Los agentes causales son Vibrio parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, Photobacterium daunselae, V. campbellii, V. sp y V. harveyi. Signos Clínicos Se observan mortalidades altas (hasta un 90%), en postlarvas y juveniles tempranos. Los camarones moribundos son encontrados en la superficie y nadando en las orillas de los estanques, con presencia de aves alimentándose de ellos. Cuando la enfermedad se encuentra en fase inicial se observan algunos organismos con opacidad muscular y tracto digestivo vacío y en la fase grave es posible observar organismos con expansión de los cromatóforos, hepatopáncreas inflamado y en algunos camarones luminiscencia. Diagnóstico y Control Para el diagnóstico de esta enfermedad se utilizan diferentes análisis como son: el análisis bacteriológico, el cual consiste en tomar organismos con expansión de los cromatóforos, intestino vacío y presencia de opacidad muscular para cuantificar las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en hepatopáncreas (UFC/g) y en hemolinfa (UFC/mL), ya que estos poseen una carga bacteriana regular (tabla 1), por lo que es posible diferenciar cuando se encuentran alterados. Tabla 1. Interpretación de resultados de crecimiento bacteriano en agar TCBS en camarones juveniles y adultos (Gómez-Gil 2006). Hemolinfa (UFC/mL) >103

Análisis histológico. El análisis con tinciones de H&E revela la presencia de lesiones granulomatosas bastante prominentes, acompañadas de una multitud de nódulos hemocíticos con centros melanizados. Tinciones especiales (por ejemplo, PAS y tinciones de plata basadas en la técnica de PAS) demuestran claramente la presencia de las hifas y de las macroconidias, las cuales se tiñen de color rosa o rojo (PAS) o negro (tinciones de plata basadas en la técnica de PAS). Información adicional Fusarium solani es un patógeno oportunista que ataca camarones debilitados por otras enfermedades, por exposición a agentes químicos irritantes o a ciertos metales pesados, o por amontonamiento a densidades altas. El principal mecanismo para el establecimiento de la infección es la presencia de lesiones (pequeñas o grandes) en la cutícula. La infección puede comenzar en varias partes del cuerpo al mismo tiempo y pueden llegar a cubrir hasta un 10% de la superficie corporal. Una vez hecha su aparición, la enfermedad progresa con un porcentaje de recuperación de solo un 30% aproximadamente. Las lesiones producidas por Fusarium también sirven como puerta de entrada para otros patógenos oportunistas, tales como Vibrio spp.

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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

ENFERMEDADES CAUSADAS POR HONGOS FUSARIOSIS

Figura 5.3. Lesiones melanizadas (negras) dentro de la cámara branquial de un camarón Penaeus sp. causadas por infestación con Fusarium solani.

Figura 5.4. Preparación en fresco, sin teñir, de un raspado obtenido de una lesión causada por F. solani. Las hifas del hongo son bastante evidentes dentro de la masa de tejido necrosado, inflamado y melanizado. Magnificación: 1,000X.

Figura 5.5. Fotografía a bajo aumento de un corte histológico a través de una lesión causada por F. solani. Se muestra una porción de la pared corporal y el músculo subyacente. Masas de hemocitos han infiltrado la zona y encapsulado las hifas de Fusarium. Algunas de las hifas encapsuladas, principalmente cerca de la pared corporal han sido melanizadas (ejemplos señalados con flechas). Tinción: Hematoxilina/eosina-floxina de Mayer-Bennett. Magnificación: 300X.

Figura 5.6 Fotografía de gran aumento de un corte histológico a través de una lamela branquial de un camarón juvenil Penaeus stylirostris, la cual ha sido infectada por F. solani. Las hifas y las conidias (ejemplos señalados con flechas) son bastante evidentes. Tinción: PAS de McManus y verde claro. Magnificación 600X.

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Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner

5.3

Enfermedades causadas por hongos.

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Capítulo 6

Inmunología del Camarón

Capítulo 6 Inmunología del Camarón

Margherita Anna Barracco, Luciane María Perazzolo y Rafael Diego Rosa Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAA), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, SC, Brasil

Introducción Los crustáceos pertenecen a un antiguo y exitoso grupo zoológico, constituido por más de 40 mil especies, muchas de las cuales son muy apreciadas para consumo humano, como son los camarones, langostas, langostas de agua dulce, cangrejos y jaibas. El cultivo de crustáceos, principalmente de camarones (camaronicultura), sobresale en este contexto como una importante alternativa para la producción rápida y en gran escala de alimento para consumo humano, contribuyendo además con la protección de las poblaciones naturales de una excesiva extracción. Actualmente, cerca del 30% de los camarones consumidos en el mundo son provenientes del cultivo y las especies marinas más cultivadas son los penaeidos Litopenaeus vannamei (40,66%), Penaeus monodon (37,41%) y Fenneropenaeus chinensis (10,97%) (FAO, 2007). La camaronicultura es responsable hoy día de millones de empleos emergentes en países tropicales, siendo los principales productores mundiales China y Tailandia en Asia y Ecuador, México y Brasil en América Latina. El principal factor limitante para el éxito de la camaronicultura mundial, consiste actualmente en el control de las infecciones, principalmente las de origen viral. Las altas densidades poblacionales usualmente utilizadas en los cultivos, propician la rápida propagación de los agentes infecciosos, resultando generalmente en mortalidades masivas y ocasionando, como consecuencia, perjuicios económicos incalculables. Actualmente, la profilaxis y el control de las enfermedades en los cultivos se circunscriben básicamente a la práctica adecuada del manejo y la disminución de las condiciones de estrés, una vez que los factores que determinan el estado de salud de los camarones, todavía son muy poco conocidos. En este contexto, el estudio del sistema inmunológico de los crustáceos sobresale como una estrategia reciente y promisoria, pues permite conocer las bases de la susceptibilidad y de la resistencia de estos animales a los microorganismos patógenos y parásitos, además de proporcionar aportes valiosos para el establecimiento de parámetros de salud e inmuno marcadores para la selección genética de animales más resistentes a las infecciones.

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6.1

Sistema Inmune de los Crustáceos

Los invertebrados marinos están en constante contacto, en su ambiente natural, con una gran diversidad de microorganismos, incluyendo múltiples virus, que pueden constituir una seria amenaza a su sobrevivencia. No obstante, el evidente éxito de este grupo zoológico a lo largo de más de 500 millones de años de su historia evolutiva, confirma la presencia de un sistema inmunológico eficiente y capaz de protegerlos contra la invasión de los agentes causantes de enfermedades. La primera línea de defensa de estos animales es proporcionada por la presencia de un caparazón externo rígido o exoesqueleto, que funciona como una barrera físicoquímica protectora. Además de ello, todo el tracto digestivo de estos animales, que es la principal vía de entrada de los microorganismos, también está revestido por una capa quitinosa y aún ofrece un ambiente ácido y lleno de enzimas, capaz de inactivar y digerir la mayoría de los microorganismos que no son parte de su microbiota natural. Cuando estas barreras son traspasadas, no siendo suficiente para impedir la penetración de los patógenos, se desencadenan en el hospedero una serie de reacciones inmunológicas complejas con el objetivo de neutralizar y eliminar los agentes invasores. A ejemplo de otros invertebrados, los crustáceos disponen solamente de un sistema inmune innato, diferente de los vertebrados que además de esto, tienen también un sistema inmune adaptativo. El sistema inmune innato de los crustáceos filogenéticamente más antiguo, es encontrado en todos los organismos multicelulares, incluyendo invertebrados y plantas, mientras que el sistema inmune adaptativo sólo se encuentra en los vertebrados. Este último se caracteriza por la presencia de una infinidad de receptores y anticuerpos altamente específicos y por la inducción de células de memoria, que garantizan una respuesta de defensa altamente eficiente y específica para los más diversos patógenos. Esta respuesta transcurre de la presencia de una línea celular linfocítica, presente solamente en los vertebrados, donde se apoyan todos los mecanismos de especificidad y de memoria inmunológica. De esta forma, su ausencia en los invertebrados inviabiliza cualquier tentativa de desarrollo de vacunas, en su concepto clásico de la palabra, disminuyendo así de manera sustancial, la posibilidad de la prevención y control de infecciones en los crustáceos. El sistema circulatorio de los crustáceos es de tipo abierto o semi-abierto, por donde transita un tejido fluido denominado hemolinfa, correspondiente a la sangre de los vertebrados (Figura 6.1). En la hemolinfa son transportados continuamente nutrientes, excretas, oxígeno, hormonas y otras moléculas importantes para los diferentes órganos de esos animales. Debido a su fluidez y por la capacidad de llegar directamente a todos los tejidos de los crustáceos, la hemolinfa contiene además todos los componentes del sistema inmunológico. La hemolinfa está compuesta por una fracción celular, representada por las células circulantes o hemocitos y por una fracción líquida constituida por el plasma que contiene diferentes factores humorales. Las respuestas inmuno celulares y humorales actúan de forma integrada en los crustáceos, protegiéndolos contra la invasión de microorganismos y parásitos, garantizando así su integridad corporal y homeostática. Los principales sistemas de defensa actualmente reconocidos en los crustáceos son: (1) coagulación de la hemolinfa; (2) melanización mediada por el sistema Pro-fenol oxidasa (proPO); (3) reconocimiento y aglutinación celular mediados por las lectinas; (4) sistemas antibacterianos, antifúngicos y antivirales mediados por los péptidos antimicrobianos, RNA de interferencia y por proteínas de reconocimiento patrón; (5)

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producción de formas reactivas de oxígeno y nitrógeno y (6) sistema fagocítico y de encapsulamiento (revisión de Iwanaga e Lee, 2005). Células Inmuno competentes o Hemocitos Las respuestas inmuno celulares de los crustáceos están básicamente relacionadas con las células de la hemolinfa o hemocitos e incluyen la fagocitosis de microorganismos y la formación de cápsulas y nódulos en torno a los invasores y a los mecanismos citotóxicos y/o degradativos intracelulares, utilizados para degradar y eliminar a los patógenos. Muchas de estas moléculas microbicidas se encuentran almacenadas dentro de las vesículas o de los gránulos de ciertas poblaciones de hemocitos, mientras que otras son constitutivamente liberadas a la hemolinfa, actuando en diferentes cascadas inmunológicas. Además de actuar en las respuestas de defensa, los hemocitos también participan en la reparación de heridas, esclerotización de la cutícula y se cree que también están relacionados con el metabolismo y transporte de carbohidratos (Jiravanichpaisal et al., 2006). La comprensión de las reacciones inmuno celulares de los crustáceos depende de manera crucial, de la identificación y la caracterización de sus células inmuno competentes. A pesar de no haber una homogeneidad en la clasificación de los hemocitos, tres tipos de células son usualmente reconocidos y descritos en los crustáceos (Figuras 6.2A-F): hemocitos hialinos (HHs), hemocitos semi-granulares o con gránulos pequeños (HGPs) y hemocitos granulares o con gránulos grandes (HGGs) (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Johansson et al., 2000). La falta de uniformidad en la identificación de los hemocitos se debe principalmente al hecho de que esas células son muy frágiles y reactivas, alterando rápidamente sus características morfofisiológicas in vitro, lo que torna su estudio más difícil, que en el caso de los leucocitos de los vertebrados. La activación de los hemocitos de los crustáceos resulta generalmente en su extendimiento y degranulación, ocurriendo la liberación de una gran variedad de efectores inmunológicos para el plasma. En los últimos años han ocurrido grandes progresos en el estudio de estas células, debido al desarrollo de varias soluciones anticoagulantes específicas y medios de cultivo capaces de estabilizar adecuadamente los hemocitos in vitro. Además, la separación de las diferentes poblaciones de hemocitos por gradientes de Percoll, la producción de anticuerpos monoclonales, la clonación y caracterización de genes que codifican efectores inmunológicos en los diferentes tipos de células, vienen contribuyendo para tener una mejor comprensión del funcionamiento de las diferentes poblaciones hemocíticas. De una manera general, los HHs de los crustáceos son usualmente descritos como los menores hemocitos, con una alta relación núcleo-citoplasma y conteniendo pocos o ningún gránulo (Figuras 6.2A,D). De acuerdo con algunos autores, los HHs pertenecen a una línea celular distinta de los hemocitos granulares y están esencialmente relacionados con los mecanismos de coagulación (Hose et al., 1990). Otros autores consideran que los HHs son las principales células fagocitarias (Johansson et al., 2000) y que ese tipo celular es una forma intermedia de la línea de hemocitos granulares (van de Braak et al., 2002a).

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Figura 6.1: Sistema circulatorio abierto/semi-abierto de camarón y órganos asociados. C: corazón; HP: hepatopáncreas; OHA: órgano hematopoyético antenal; OHD: órgano hematopoyético dorsal; OHV: órgano hematopoyético ventral; OL: órgano linfoide; VD: vaso dorsal (adaptado de Bachère et al., 2004).

Figura 6.2: Tipos de hemocitos (A-F) y reacciones celulares de defensa en crustáceos (G-J). A, D: hemocitos hialinos (HHs) de camarones observados al microscopio de contraste de fase y eletrónico de transmisión, respectivamente; B, E: hemocitos con gránulos pequeños (HGPs); C, F: hemocitos con gránulos grandes (HGGs). G: fagocitosis de una levadura por un hemocito de Litopenaeus vannamei; H: encapsulamiento in vitro de nemátodo Panagrellus redivirus por hemocitos de Macrobrachium rosenbergii; I: encapsulamiento in vitro de hifas del hongo Ganoderma sp. por hemocitos de Farfantepenaeus paulensis, con fuerte reacción de melanización; J: nódulo hemocítico en el hepatopáncreas de L. vannamei con agregados bacterianos en el centro (reproducido de Covarrubias, 2004).

Por otra parte, los hemocitos granulares (HGPs y HGGs) son descritos como células de citoplasma más abundante y ricos en gránulos de diversos tamaños y contenidos (Figuras 6.2B, C, E, F). Algunos autores señalan los HGPs como formas intermedias, que luego de su maduración se transforman en HGGs (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Söderhäll y Cerenius, 1992; Gargioni y Barracco, 1998). En cuanto a la función de los hemocitos granulares, esta parece estar relacionada principalmente con la fagocitosis de microorganismos, en la formación de cápsulas y nódulos y también con la producción de moléculas tóxicas y microbicidas (Hose et al., 1990; Gargioni y Barracco, 1998; van de Braak et al., 2002b). 174

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En cangrejos y langostinos se sugiere que los HGPs actúan en los procesos de encapsulación, los HGGs en el almacenamiento de moléculas inmuno efectoras y los HHs en la fagocitosis de microorganismos (Johansson et al., 2000). Reacciones inmuno celulares: fagocitosis y formación de cápsulas y nódulos Luego de la invasión por microorganismos, los hemocitos migran a los sitios de infección generando una respuesta inflamatoria clásica. En estos sitios de infección ocurre entonces la fagocitosis de los microorganismos y/o la formación de agregados celulares densos en torno de las partículas invasoras, pudiendo culminar con la liberación de diferentes moléculas inmuno efectoras, capaces de neutralizar y degradar los agentes patógenos. En el proceso de fagocitosis, el agente extraño es envuelto e interiorizado dentro de un fagosoma, que luego se funde con las vesículas/gránulos presentes en el citoplasma (Figura 6.2G). Una vez unidas las dos estructuras, una variedad de compuestos degradativos y antimicrobianos son liberados en las vacuolas fagocíticas, llevando a la neutralización/degradación de las partículas endocitadas (Martin et al., 1996). La fagocitosis de microorganismos fue bien demostrada en diferentes especies de crustáceos (Hose et al., 1990; Martín et al., 1996; Gargioni y Barracco, 1998; Muñoz et al., 2002). Aunque todavía existan controversias en la literatura en lo que se refiere a los tipos de hemocitos relacionados con los procesos de fagocitosis en los crustáceos, se sabe que ese mecanismo, extremadamente importante, constituye la primera línea de defensa celular contra la invasión de microorganismos. Cuando la cavidad corporal de los crustáceos es invadida por una cantidad masiva de microorganismos o por partículas/patógenos de gran tamaño, cuya fagocitosis no es posible, se desencadena entonces la formación de nódulos y cápsulas celulares, respectivamente. La formación de cápsulas se caracteriza por la agregación de varias capas de hemocitos alrededor del patógeno de gran tamaño, como hifas de hongos, nemátodos y determinadas formas de protozoarios, promoviendo que sea atrapado en los tejidos del hospedero, para su posterior destrucción (Figuras 6.2H,I). La formación de nódulos, por otro lado, ocurre alrededor de una gran cantidad de microorganismos invasores, que también son capturados dentro de agregaciones celulares (Figura 6.2J), semejantes a las cápsulas. Esta reacción evita su diseminación y la producción de una septicemia. En las regiones más centrales de los nódulos, es común observar la fagocitosis de microorganismos por los hemocitos que están en contacto más próximo de los microorganismos (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Söderhäll y Cerenius, 1992). Ambas reacciones, la de encapsulamiento y la formación de nódulos, no solamente llevan a la captura de los patógenos, sino también limitan las respuestas inmunológicas solamente a la región invadida. Esta respuesta inmune localizada durante las reacciones inmunológicas, ayuda a proteger los tejidos del hospedero de los daños causados por las moléculas tóxicas y degradativas producidas durante el proceso inflamatorio. En las regiones más centrales de esas agregaciones de hemocitos, ocurre también la presencia de una pigmentación oscura o melanización, como resultado de la liberación de los compuestos inmuno efectores presentes en las células hemocíticas (Figura 6.2I) que serán discutidos más adelante (Cerenius y Söderhäll, 2004). El número de hemocitos libres en la hemolinfa puede disminuir drásticamente durante una infección como resultado de su infiltración en los tejidos infectados y su utilización en la formación de los nódulos y cápsulas. De este modo, nuevos hemocitos requieren 175

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ser producidos y liberados en la circulación a partir de los tejidos hematopoyéticos (Johansson et al., 2000; van de Braak et al., 2002a; Söderhäll et al., 2003; Jiravanichpaisal et al., 2006). Esos tejidos son generalmente constituidos por lóbulos densos, situados en la región dorsal y dorso-lateral del estomago y del intestino anterior (región epigástrica), así como en la base de los maxilípedos en el caso de los camarones penaeidos (van de Braak et al., 2002a) (Figura 6.1). Los tejidos hematopoyéticos presentan una alta tasa de proliferación celular y son los responsables por la diferenciación y la maduración de los hemocitos que serán liberados en la hemolinfa (van de Braak et al., 2002a; Söderhäll et al., 2003). La identificación de uno o más progenitores celulares, así como la diferenciación de las líneas hemocíticas producidas, es todavía controvertido (van de Braak et al., 2002a; Söderhäll et al., 2003; Bachère et al., 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). A pesar de que los tejidos hematopoyéticos son los principales responsables por la producción de los hemocitos, hay algunas evidencias reportadas de división de esas células en la hemolinfa de camarones penaeidos, como en Marsupenaeus japonicus (Sequeira et al., 1996) y Farfantepenaeus paulensis (Gargioni y Barracco, 1998), aunque la frecuencia de división es muy baja. Otro órgano bastante irrigado e importante en las reacciones celulares es el órgano linfoide (Figura 6.1). Este órgano, ausente en muchas especies de crustáceos decápodos, se localiza en la parte anterior del hepatopáncreas de los camarones y parece participar en los procesos de eliminación y depuración de agentes patógenos, ocurriendo en muchos casos la formación de cuerpos esferoidales durante las infecciones. No esta claro si el proceso de la fagocitosis ocurre principalmente en ese órgano o si los hemocitos conteniendo los microorganismos ya fagocitados migran a dicho lugar, para realizar la depuración (van de Braak et al., 2002b). Mecanismos líticos y degradativos Enzimas lisosomales y especies intermediarias reactivas al oxígeno (ROIs) y de nitrógeno (RNIs) Como se ha mencionado anteriormente, luego de la fagocitosis de los microorganismos, estos son capturados en las vacuolas fagocíticas intracelulares que se unen con los gránulos lisosomales. Estos se caracterizan por su pH ácido y por la presencia de una amplia variedad de enzimas hidrolíticas, capaces de matar y degradar a la gran mayoría de los microbios invasores (Figura 6.3). Debido a la fagocitosis, puede ocurrir la liberación del contenido enzimático de los lisosomas hacia el plasma, a partir de la degranulación de los hemocitos granulares. Entre las enzimas liberadas se destaca la lisozima, capaz de romper polisacáridos complejos o peptidoglicanos (PGs) de las paredes bacterianas, reacción que será mejor discutida más adelante, en la próxima sección. Además de la destrucción de los microorganismos invasores por las enzimas lisosomales, se observa, durante las reacciones inmuno celulares, en especial en la fagocitosis, la producción y liberación de moléculas altamente tóxicas, que auxilian en la muerte y degradación del agente invasor. En ese momento, ocurre un importante aumento en el consumo de oxígeno a nivel intracelular, llamado choque respiratorio, que resulta en la producción de una variedad de radicales intermediarios altamente reactivos, tanto de oxígeno (en inglés ROIs) como de nitrógeno (en inglés RNIs) (ver revisiones de Anderson, 1996; Roch, 1999 y Bogdan et al., 2000). Los ROIs son radicales de Oxígeno que poseen electrones libres o no pareados en su órbita más externa, lo 176

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que les confiere una elevada capacidad de reaccionar con las estructuras y compuestos próximos, tales como las membranas celulares, proteínas y ácidos nucleicos (ADN). Siendo así, funcionan como agentes microbicidas potentes, destruyendo o inhibiendo el crecimiento de los microorganismos invasores (Anderson, 1996; Bogdan et al., 2000). La producción de esos radicales está ligada a la activación de un complejo enzimático denominado NADPH oxidasa, localizado en la membrana celular y en la superficie de los gránulos lisosomales (Figura 6.4). Este complejo es activado por componentes microbianos, tales como los lipopolisacáridos (LPS), lipoproteínas de bacterias y β-glucanos de hongos (Bogdan et al., 2000). La activación de la NADPH resulta en la reducción del oxígeno molecular al anión superóxido (O2-), que puede disputarse, espontáneamente o a través de la enzima intracelular superóxido dismutasa (SOD), en peróxido de hidrogeno (H2O2). El H2O2 es un compuesto igualmente tóxico y, si no es destruido por la catalasa del peroxisoma, puede difundirse y llegar al medio extracelular (Warner, 1994). El O2- puede también ser convertido en otros componentes citotóxicos, como en el radical hidroxilo (-OH) y en aniones hidroxilo (OH-) por la reacción de Haber-Weiss o, luego de la dismutación en H2O2, en ácido hipocloroso (HOCl), oxígeno singlet (1O2) y en cloraminas por la acción de la mieloperoxidasa (MOP) (Bogdan et al., 2000) (Figura 6.4). Además de las ROIs, ocurre también la producción intracelular de especies reactivas de nitrógeno (RNIs), como el óxido nítrico (NO) y el peroxinitrito (ONOO-), compuestos altamente citotóxicos y microbicidas (Kröncke et al., 1997). El peroxinitrito es resultante de la reacción entre el NO con el anión superóxido (Anderson, 1996; Murphy et al., 1998) (Figura 6.4). Es importante resaltar que la producción de estas moléculas altamente tóxicas, importantes en la destrucción de los patógenos invasores, puede también provocar graves daños a los tejidos del hospedero. Para evitar esta autoagresión, el hospedero cuenta básicamente con tres mecanismos de protección o defensa antioxidantes. Los primeros dos mecanismos son endógenos e incluyen la presencia de enzimas intracelulares, como las enzimas antioxidantes SOD, catalasa y la glutationa peroxidasa, capaces de degradar/neutralizar a las ROIs y, también las enzimas de reparación que pueden restablecer los daños provocados por las ROIs en el DNA, membranas y proteínas del hospedero (Warner, 1994). El tercer mecanismo comprende la acción de compuestos antioxidantes de origen exógeno, como el ácido ascórbico (vitamina C), la glutationa y el α-tocoferol (vitamina E), que pueden interactuar directamente con los radicales libres neutralizándolos o interactuando directamente con los radicales libres (Warner, 1994). Es conveniente resaltar que los antioxidantes de origen exógeno, asumen especial importancia en los cultivos de camarones, una vez que pueden ser adicionados a las dietas en dosis apropiadas. La producción in vitro de ROIs por los hemocitos inmuno estimulados por componentes microbianos, ya fue descrita en el cangrejo Carcinus maenas (Bell y Smith, 1993), en Macrobrachium rosenbergii (Sierra et al., 2005) y en varias especies de penaeidos, como en P. monodon (Song e Hsieh, 1994; Sung et al., 1996), L. vannamei (Muñoz et al., 2000) y en las especies nativas brasileñas, F. paulensis y L. schmitti (Guertler, 2007). La cuantificación in vitro de la producción del anión superóxido por los fagocitos es usualmente realizada a través del método de reducción del NBT (del inglés, nitroblue-tetrazolium), o por la técnica de la quimioluminiscencia. Esta evaluación permite determinar el grado de estrés oxidativo de los animales, como consecuencia de diferentes 177

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Figura 6.3: Mecanismos degradativos y microbicidas asociados a los hemocitos de crustáceos durante el proceso de fagocitosis. ROI: especies reactivas de oxígeno; RNI: especies reactivas de nitrógeno; AMPs: péptidos antimicrobianos.

Figura 6.4: Producción de especies reactivas de oxígeno (ROIs) y nitrógeno (RNIs) por los hemocitos de crustáceos durante el proceso de fagocitosis y otras reacciones celulares. CAT: catalasa; iNOS: óxido nítrico sintasa inducible; SOD: superóxido dismutasa. Las especies reactivas tóxico-microbicidas están representadas en rojo.

Figura 6.5: Respuestas inmunológicas inducidas en los hemocitos, después del reconocimiento de patógenos, vía PRPs plasmáticas o celulares y subsecuente activación (1) desgranulación, con liberación de diferentes inmunoefectores e inmunoreguladores; (2) inducción y/o represión de genes inmunológicos; (3) activación de respuestas celulares como fagocitosis y formación de nódulos y cápsulas.

factores de estrés como infecciones, destacándose como un valioso inmuno parámetro para la determinación del estado inmunológico de los camarones (Song y Hsieh, 1994; Muñoz et al., 2000; Campa-Córdova et al., 2002 a, b; Chang et al., 2003; Guertler, 2007). La producción del anión superóxido también viene siendo muy utilizada en los camarones para evaluar el efecto de substancias consideradas inmunoestimulantes, como los β-glucanos de hongos y los polisacáridos sulfatados de algas, que pueden ser adicionados a la dieta o en el agua a través de baños de inmersión (Campa-Córdova et al., 2002 a, b; Chang et al., 2003). 178

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Por otro lado, la producción de RNIs tiene origen en la enzima óxido nítrico sintasa (del inglés, NOS), presente en el citoplasma de varios tejidos animales, incluyendo las células del sistema inmunológico. En estas últimas, la NOS es inducida por situaciones de estrés (iNOS, del inglés inducible nitric oxide synthase) y produce NO y en seguida el peroxinitrito (ONOO-), ambos compuestos altamente tóxicos (Figura 6.4). En los otros tejidos, la NOS es expresada de forma constitutiva. En los vertebrados, están bien documentadas las actividades antivirales, antibacterianas y antiparasitarias de las RNIs, que igual que las ROIs causan daños al DNA, a varias enzimas y a las membranas de los patógenos, directa o indirectamente (ver revisión de Kröncke et al., 1997; Chakravortty y Hensel, 2003). Lamentablemente, existen todavía muy pocas referencias sobre la participación del NO y sus derivados en las respuestas de defensa de los crustáceos. Entre éstos, se destacan los trabajos de Jiang et al. (2006) que mostraron una actividad de la NOS en los hemocitos de los camarones F. chinensis y M. japonicus y el de Yeh et al. (2006), en el cangrejo rojo Procambarus clarkii. La actividad de la NOS en estos animales es particularmente estimulada por LPS bacterianos, sugiriendo que en los crustáceos, las RNIs deben actuar como agentes microbicidas. Es importante resaltar que la utilización de la producción de RNIs como inmuno parámetros para evaluar el estado inmunológico de los camarones de cultivo, es una herramienta muy poco utilizada, a pesar de su potencial promisorio. Se espera que en un futuro próximo, se de un mayor progreso en las técnicas de detección de RNIs en los camarones, para permitir su utilización como un parámetro inmunológico y/o como indicador de inmuno estimulación. Proteínas y péptidos antimicrobianos (AMPs) Las proteínas y péptidos antimicrobianos o AMPs (del inglés, antimicrobial proteins/ peptides) son componentes esenciales del sistema inmune innato, pudiendo presentar una actividad microbicida rápida y potente contra un amplio espectro de microorganismos. En los crustáceos, que no cuentan con un sistema inmune adaptativo como el de los vertebrados, la presencia de AMPs en la hemolinfa asume una gran importancia para el control y prevención de infecciones por microorganismos. Esas moléculas están ampliamente distribuidas entre los diferentes reinos de los seres vivos, siendo encontradas desde bacterias hasta en mamíferos, incluyendo protozoarios, invertebrados y plantas. Los AMPs fueron inicialmente identificados por Steiner et al. (1981) en la hemolinfa de la mariposa Hyalophora cecropia y desde entonces, más de mil diferentes péptidos han sido aislados y caracterizados (Bulet et al., 2004). Son moléculas relativamente pequeñas, con menos de 150-200 residuos de aminoácidos. La gran mayoría de los AMPs se destacan por sus características anfipáticas, presentando una región altamente catiónica y una región hidrofóbica, lo que facilita su interacción e inserción en los fosfolípidos aniónicos presentes en la cara externa de las membranas de muchos microorganismos (Bulet et al., 2004). De acuerdo con su composición amino acídica y su estructura tridimensional, los AMPs son clasificados en cuatro grandes clases: (1) péptidos α-hélice linear anfipáticos, (2) péptidos cíclicos o cíclicos con extremidades abiertas con uno o más puentes de cisteína, (3) péptidos ricos en un tipo particular de aminoácido y (4) péptidos generados a partir de la hidrólisis de una proteína precursora (Bulet et al., 2004). El sitio de síntesis de estas moléculas, es variable entre los diferentes organismos. En muchas especies de insectos, los AMPs son sintetizados en los cuerpos grasos en el momento de una 179

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infección y segregados a la hemolinfa donde actúan de forma sistémica (Hoffmann et al., 1996). En contrapartida, en otros invertebrados como en limúlidos, arañas, moluscos y camarones, los AMPs son sintetizados constitutivamente en los hemocitos y almacenados en sus gránulos (Bachère et al., 2004). Los diferentes AMPs, caracterizados hasta el momento, tienen una actividad inhibitoria rápida y potente contra un amplio espectro de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos filamentosos, levaduras y en algunos casos también contra virus y protozoarios (Bachère et al., 2004; Reddy et al., 2004). El mecanismo de acción de los AMPS se manifiesta generalmente a nivel de la membrana del microorganismo, provocando su desestabilización. Presentan en general una actividad detergente, a través de la interacción electrostática con los fosfolípidos aniónicos de la membrana, llevando a un desequilibrio de sus funciones. También pueden insertarse en la bicapa lipídica, formando grandes poros, lo que lleva a un flujo descontrolado de solutos y extravasación del contenido citoplasmático, resultando en la muerte del microorganismo. Otras clases de AMPs pueden ser interiorizadas e interferir con diferentes vías metabólicas esenciales al ciclo de vida de los microorganismos (Bulet et al., 2004; Toke, 2005). Es importante señalar que la inducción de mecanismos de resistencia contra esas moléculas por parte de los microorganismos, es muy rara, dado que los componentes afectados (membranas) son esenciales para la sobrevivencia de esos microorganismos. Por esta razón, es prácticamente inviable pensar en que ocurran mutaciones en las estructuras de sus membranas, para escapar de los efectos dañinos de los AMPs. Solamente a mediados de la década de los años 90 fueron identificados los primeros péptidos con actividad microbicida en los crustáceos. El primer AMP aislado y parcialmente caracterizado de un crustáceo fue un péptido catiónico de 6,5 kDa en el cangrejo C. maenas. Este péptido, rico en residuos de prolina, presentó un amplio espectro de actividad, incluyendo bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Schnapp et al., 1996). Estos mismos autores identificaron también otro AMP de 11,5 kDa con actividad restringida a bacterias Gram-positivas marinas, que más tarde fue caracterizado como una molécula hidrofóbica rica en residuos de cisteína y denominado crustina/ carcinina (Relf et al., 1999; Bartlett et al., 2002; Brockton et al., 2007). En camarones penaeidos, tres familias de AMPs fueron descritas y caracterizadas a partir de los hemocitos: peneidinas (Destoumieux et al., 1997), crustinas (Gross et al., 2001; Bartlett et al., 2002) y factores anti-lipopolisacáridos (ALFs) (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2002) (Tabla 1). Las peneidinas son péptidos antimicrobianos de 5 a 8 kDa, inicialmente aislados y caracterizados a partir de la hemolinfa del camarón L. vannamei. Son moléculas altamente catiónicas, compuestas por una región N-terminal rica en residuos de prolina y una región C-terminal conteniendo seis residuos de cisteína unidos por tres puentes disulfídicos (Destoumieux et al., 1997). Las peneidinas están subdivididas en varios subgrupos (peneidinas 2 a 5), siendo que cada una contiene varias isoformas distintas (Gueguen et al., 2006). Algunas isoformas tienen un motivo molecular de unión a la quitina en su región C-terminal, que también es encontrado en algunas lectinas de plantas y en varios péptidos antifúngicos (Destoumieux et al., 2000). Esa familia de AMP es expresada de forma constitutiva en los hemocitos y presenta una actividad potente contra bacterias Gram-positivas y hongos filamentosos (Destoumieux et al., 1999; 2000). De forma interesante, la presencia de peneidinas parece estar restringida a camarones penaeidos. Varios subgrupos e isoformas de peneidinas fueron identificados 180

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Inmunología del Camarón

Tabla 1: Familias de péptidos antimicrobianos (AMPs) constitutivamente expresados en los hemocitos de camarones penaeidos. AMP

Actividad Antimicrobiana

ALF

bacterias Gram+ y Gramhongos filamentosos

Gross et al., 2001 Supungul et al., 2002 Supungul et al., 2004 Somboonwiwat et al., 2005

Crustina

bacterias Gram+ y Gram-

Gross et al., 2001 Bartlett et al., 2002 Zhang et al., 2007 Amparyup et al., 2007a

Peneidina

bacterias Gram+ hongos filamentosos

Estructura

nd

Referencias

Destoumieux et al., 1997 Destoumieux et al., 1999 Gueguen et al., 2006

nd = no determinada.

y caracterizados en diferentes especies de penaeidos de diferentes océanos (Gueguen et al., 2006). La expresión de las peneidinas se inicia en las primeras fases del desarrollo ontogenético de los camarones (nauplios IV y V) (Muñoz et al., 2003; Jiravanichpaisal et al., 2007a). Las peneidinas se presentan en grandes cantidades, en comparación con otras AMPs producidas en los hemocitos de penaeidos (cerca de 36% de los AMPs de P. monodon y 75% de L. vannamei y L. setiferus), en especial las isoformas del subgrupo 3 (PEN3) (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2002). Las crustinas son AMPs homólogos a los péptidos de 11,5 kDa inicialmente aislados de los hemocitos granulares del cangrejo C. maenas (Relf et al., 1999), que posteriormente fueron denominadas carcininas (Brockton et al, 2007). Las crustinas de camarones penaeidos incluyen varias isoformas y son moléculas compuestas por una región N-terminal rica en residuos de glicinas y por una porción C-terminal conteniendo doce residuos conservados de cisteína, donde se encuentra un dominio WAP (del inglés, whey acidic protein), con posible función de inhibir a las proteasas (Bartlett et al., 2002). La actividad antimicrobiana de las crustinas abarca esencialmente bacterias Gram-positivas (Zhang et al., 2007), además, una acción contra vibrios marinos (Gramnegativos) fue también descrita muy recientemente para algunas isoformas (Amparyup et al., 2007a). Esa familia de AMPs (crustinas/carcininas) es constitutivamente expresada en hemocitos y parece estar distribuida en diferentes grupos de crustáceos, como camarones penaeidos (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2002; Rattanachai et al., 2004a; Zhang et 181

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al., 2007; Rosa et al., 2007) y también en cangrejos, langostas y otros camarones (Relf et al., 1999; Hauton et al., 2006; Christie et al., 2007; Jiravanichpaisal et al., 2007b). En el crustáceo Pacifastacus leniusculus y en los penaeidos L. setiferus y L. vannamei, las crustinas representan cerca de 3, 4 y 9% de los AMPs transcritos en sus hemocitos, respectivamente (Gross et al. 2001; Jiravanichpaisal et al., 2007b). En contraposición, en el camarón P. monodon estos AMPs pueden alcanzar cerca de 26% de los expresados (Supungul et al., 2004). La expresión de crustinas, así como de las peneidinas, se inicia en las fases tempranas del desarrollo de los camarones (nauplios IV) (Jiravanichpaisal et al., 2007a). Los factores anti-lipopolisacáridos (ALFs: del inglés, anti-lipopolysaccharide factors) son moléculas de 10 a 14 kDa, inicialmente aisladas y caracterizadas en los hemocitos granulares del limúlido Limulus polyphemus (Tanaka et al., 1982). En los camarones penaeidos, los ALFs fueron primeramente detectados en las especies L. setiferus (Gross et al., 2001) y P. monodon (Supungul et al., 2002) y mostraron contener dos residuos conservados de cisteína comprometidos en la formación de una estructura terciaria en forma de grapa (ß-hairpin) como en los ALFs de limúlidos. Esa estructura concentra una región altamente hidrofóbica con un dominio de unión a LPS. Los ALFs incluyen varias isoformas y son moléculas constitutivamente expresadas en los hemocitos (cerca de 26% de los transcritos de AMPs de P. monodon) con actividad antimicrobiana potente y de amplio espectro, siendo activas contra bacterias Gram-positivas y negativas y hongos filamentosos, con la propiedad de unirse y neutralizar LPS (Somboonwiwat et al., 2005; Nagoshi et al., 2006). Todavía no es conocido cuando se da el inicio de la producción de los ALFs durante el desarrollo ontogenético de los camarones. Secuencias codificadoras para esos péptidos han sido ampliamente detectadas en los hemocitos de diferentes especies de penaeidos y de otros crustáceos (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2004; Liu et al., 2005; Liu et al., 2006a; Nagoshi et al., 2006; Towle y Smith, 2006; Imjongjirak et al., 2007). Además de estas tres principales familias de AMPs, otros grupos de moléculas antimicrobianas fueron recientemente caracterizados en crustáceos, la calinectina de Callinectes sapidus (Khoo et al., 1999), las astacidinas de P. leniusculus (Lee et al., 2003; Jiravanichpaisal et al., 2007b), la armadilidina de Armadillidium vulgare (Herbinière et al., 2005) y la cigonadina de Scylla serrata (Wang et al., 2007). Otras importantes moléculas con potente actividad antimicrobiana son también encontradas en los hemocitos de crustáceos. Entre estas se destaca la lisozima, enzima mencionada anteriormente, que representa aproximadamente 4% de las proteínas totales de los hemocitos del camarón (Sotelo-Mundo et al., 2003). Las lisozimas poseen una actividad lítica potente contra un amplio espectro de bacterias Gram-positivas y negativas, incluyendo especies de vibrios marinos, debido al clivaje de los peptidoglucanos de las paredes bacterianas (Hikima et al., 2003; De La Vega et al., 2006). En adición a las familias de AMPs constitutivamente producidas en los hemocitos, otros grupos de moléculas antimicrobianas, como los péptidos originados a partir de la hidrólisis de proteínas precursoras, también fueron encontrados en camarones. Entre éstos se destaca el péptido derivado de la porción C-terminal de la proteína plasmática hemocianina. Este fragmento, de características aniónicas, presenta actividad restringida a los hongos filamentosos y puede funcionar como molécula inmunoseñalizadora (Destoumieux-Garzón et al., 2001). Péptidos antifúngicos originados a partir de la hidrólisis de la hemocianina fueron también referenciados en la langosta de agua dulce P. leniusculus (Lee et al., 2003). En los camarones penaeidos, fue demostrado que péptidos

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Margherita Anna Barracco et al.

Inmunología del Camarón

generados a partir del clivaje de proteínas histónicas, presentan actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas (Patat et al., 2004). Durante infecciones causadas por diferentes tipos de patógenos, ocurre la modulación de la expresión de diferentes familias de AMPs, así como de otras moléculas microbicidas importantes como la lisozima (Supungul et al., 2004; de Lorgeril et al., 2005; Somboonwiwat et al., 2006). En camarones desafiados con LPS o con bacterias Gram-negativas del género Vibrio, ocurre una disminución significativa de los niveles de expresión de peneidinas y crustinas en las primeras horas luego de la inyección (3 y 6 h). Esta disminución es seguida por el retorno a los niveles basales de esas moléculas luego de 12 horas y por un aumento significativo en los niveles de expresión luego de 72 horas de inyección, sugiriendo interesantemente, una inducción tardía de estas moléculas durante las infecciones (Destoumieux et al., 2000; Bachère et al., 2004; Okumura, 2007). Fue demostrado, que en las primeras horas de la infección, cuando el nivel de expresión de las peneidinas disminuye drásticamente, ocurre simultáneamente un aumento en sus concentraciones plasmáticas (Destoumieux et al., 2000). Se cree que este aumento sea proveniente de la liberación de estos AMPs por los hemocitos que se encuentran próximos a los sitios de infección (Bachère et al., 2004). Por otro lado, la expresión de ALFs parece mostrar una cinética contraria a las otras dos familias de AMPs de camarones. En P. monodon, los niveles de expresión de ALFS aumentan significativamente en las primeras horas luego de la infección con bacterias Gram-negativas (3 y 6 h) y vuelven a sus niveles basales cerca de 48 horas después del inicio del proceso inflamatorio (Supungul et al., 2004; Somboonwiwat et al., 2006). La presencia de diferentes familias de AMPs en crustáceos, junto a la ocurrencia de innumerables isoformas de un mismo subgrupo, probablemente con actividades antimicrobianas distintas, sugiere una actuación sinérgica de estas diferentes moléculas inmuno efectoras, que pueden así eliminar un amplio espectro de agentes patógenos simultáneamente. La modulación de la expresión de las diferentes familias de AMPs de camarones durante una infección, señala la gran importancia de estas moléculas en el combate contra agentes patógenos. De esa forma, la cuantificación de la expresión de los genes codificantes para esos péptidos, puede ser una importante herramienta para evaluar las condiciones de salud de estos animales en cultivo y, además, un interesante parámetro para la selección de reproductores que estén consecuentemente más protegidos contra infecciones. Esos compuestos pueden todavía representar una nueva generación de agentes terapéuticos, con aplicaciones no sólo en la acuicultura, sino también en la salud humana y veterinaria, en el sentido de constituir una alternativa biotecnológica para el problema del creciente número de linajes de microorganismos resistentes a los antibióticos actualmente utilizados. Proteínas de Reconocimiento Patrón (PRPs) El mecanismo de reconocimiento de lo no-propio es ciertamente uno de los mecanismos centrales en el desencadenamiento de una respuesta inmunológica. Como se dijo anteriormente, los invertebrados, incluyendo los crustáceos, no producen moléculas de reconocimiento altamente específicas como los anticuerpos, ni contienen las células antígeno-específicas como los linfocitos de los vertebrados. Sin embargo, ellos poseen moléculas capaces de diferenciar eficientemente lo propio de lo no-propio y, así, desencadenar mecanismos que resultan en la neutralización y/o destrucción de los microorganismos y parásitos invasores.

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Las respuestas de defensa en los crustáceos son desencadenadas a partir del contacto con el patógeno, a través de sus componentes, o hasta con antígenos ambientales. Esas reacciones son iniciadas por el reconocimiento del agente invasor por proteínas de reconocimiento patrón, presentes en el hospedero. El término “proteínas de reconocimiento patrón” o PRPs (del inglés, pattern-recognition proteins), hace alusión al hecho de que el sistema inmunológico reconoce primariamente patrones moleculares presentes específicamente en los microorganismos o PAMPs (del inglés, pathogenassociated molecular patterns) (Medzhitov y Janeway, 1997; Janeway y Medzhitov, 2002). Las PRPs son moléculas producidas por el hospedero, secretadas hacia el plasma o localizadas en la superficie de las células, principalmente las del sistema inmune, que reconocen y se unen a los PAMPs. En los invertebrados, los principales PAMPs reconocidos por PRPs son los lipopolisacáridos (LPS) de la superficie de las bacterias Gram-negativas y los peptidoglucanos (PGs) de la pared de las Gram-positivas, los β-1,3-glucanos de la pared de hongos y el dsRNA (del inglés, double-stranded RNA) producido durante la replicación de varios virus (Lee y Söderhäll, 2002). Estos PAMPs, característicos de microorganismos y ausentes en el hospedero, son esenciales para la supervivencia de los microorganismos, lo que significa que estos blancos de la inmunidad innata no pueden ser evolutivamente descartados por los microbios, para evadirse del reconocimiento por el hospedero. Una vez dentro del hospedero, los patrones moleculares del patógeno son reconocidos y unidos a sus respectivas PRPs y en el caso de los crustáceos, inician la activación principalmente de los hemocitos, desencadenando una respuesta inmune celular o la producción/liberación de una serie de moléculas inmuno efectoras/ inmuno reguladoras por degranulación o, aún más, por modular la expresión de genes inmunológicos específicos (Figura 5). Varias PRPs fueron identificadas y caracterizadas en la hemolinfa de los crustáceos, tales como la proteína que se une a los LPS o LBP (del inglés, LPS-binding protein), las proteínas que se unen a los β-1,3-glucanos o βGBP y GBP (del inglés, β-glucan binding proteins), la proteína que se une a ambos LPS y β-1,3-glucanos o LGBP, la proteína “mas-like” (del inglés, masquerade-like protein) que reconocen varios microorganismos y varias clases de lectinas (Lee y Söderhäll, 2002). Las diferentes PRPs identificadas en los crustáceos hasta el momento se presentan en la Tabla 2. Proteínas que se unen a los β-1,3-glucanos: βGBP y GBP Las proteínas que reconocen exclusivamente los β-glucanos tienen la capacidad de unirse a los componentes de la pared celular de los hongos y fueron caracterizadas en muchas especies animales, denominándose de manera general como βGBP y GBP. En los crustáceos existen por lo menos dos clases diferentes de proteínas que reconocen y se unen a los β-glucanos. La primera está representada por una lipoproteína de alta densidad, la βGBP (Hall et al., 1995; Yépiz-Plascencia et al., 1998), sintetizada en el hepatopáncreas (Cerenius et al., 1994; Romo-Figueroa et al., 2004) y constitutivamente presente en la hemolinfa de estos animales. La segunda clase está compuesta por pequeñas proteínas, como la GBP (Sritunyalucksana et al., 2002) y la LGBP (Lee et al., 2000; Roux et al., 2002; Cheng et al. 2005; Du et al., 2007), sintetizadas por los hemocitos y/o el hepatopáncreas de los crustáceos. La βGBP ya fue aislada y caracterizada en varios crustáceos, como en las langostas de agua dulce P. leniusculus (Duvic y Soderhäll, 1990; Cerenius et al., 1994), Astacus astacus y P. clarkii (Duvic y Soderhäll, 1993), en el cangrejo C. maenas (Thörrnqvist 184

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Tabla 2: Identificación y caracterización de las principales proteínas de reconocimiento patrón en crustáceos hasta el momento. PRPs (PAMPs)

Año

Status

Tamaño

Referencias

BGBP (β-glucanos) P. leniusculus A. astacus P. clarkii C. maenas F. californiensis L. stylirostris L. vannamei L. vannamei F. californiensis L. vannamei P. leniusculus L. vannamei

1990 1993 1993 1994 1996 1997 1997 1998 1998 2002 1994 2004

Purificada Purificada Purificada Purificada Purificada Purificada Purificada Purificada Purificada Purificada Clonada Clonada

100kDa 95-105kDa 100kDa 110kDa 100kDa 100kDa 100kDa 112kDa 112kDa 100kDa 4679pb 6379pb

Duvic y Söderhäll Duvic y Söderhäll Duvic y Söderhäll Thörnqvist et al. Vargas-Albores et al. Vargas-Albores et al. Vargas-Albores et al. Yépiz-Plascencia et al. Yépiz-Plascencia et al. Jiménez-Vega et al. Cerenius et al. Romeo-Figueroa et al.

GBP (β-glucanos) P. monodon

2002

Purificada/clonada

31 kDa/1314pb

Sritunyalucksana et al.

LGBP (LPS e β-glucanos) P. leniusculus L. stylirostris L. vannamei F. chinensis

2000 2002 2005 2007

Purificada/clonada Clonada Clonada Clonada

40 kDa/1650pb 1352pb 1272pb 1253pb

Lee et al. Roux et al. Cheng et al. Du et al.

Purificadas/clonadas

varias

Marques y Barracco (2000)

1993 1993 2002 2006

Purificada Purificada Purificada Purificada/clonada

175kDa 65-80kDa 31+34kDa 18kDa/709pb

Lee et al. Kopacék et al. Cominetti et al. Luo et al.

2000 2001 2007

Clonada Purificada Clonada

3277pb 134+129kDa 1572pb

Huang et al. Lee y Söderhäll Amparyup et al.

Lectinas (Azúcares) Varias especies LBP (LPS) F. californiensis P. leniusculus L. schmitti P. monodon Mas-like (LPS e β-glucanos) P. leniusculus P. leniusculus P. monodon

et al., 1994), y en los camarones Farfantepenaeus californiensis (Vargas-Albores et al., 1996) y L. vannamei (Yépiz-Plascencia et al., 1998; Jiménez-Vega et al., 2002; RomoFigueroa et al., 2004). Bioquímicamente, las βGBPs son glicolipoproteínas monoméricas (95 a 112 kDa), conteniendo en su estructura oligosacáridos ricos en manosa y un alto porcentaje de lípidos (aproximadamente 50%), siendo los fosfolípidos la clase lipídica predominante (RuizVerdugo et al., 1997). Estas proteínas presentan dominios semejantes a las glucanasas bacterianas, pero sin actividad catalítica, además de contener un motivo de adhesión celular RGD (arginina-glicina-asparagina) que, probablemente, se une a los hemocitos a través de una proteína transmembranal semejante a la integrina (Sritunyalucksana y Söderhäll, 2000). Lubzens et al. (1997) demostraron que la βGBP del cangrejo señal era idéntica a una lipoproteína de alta densidad (LP1) presente en la hemolinfa de los machos y hembras del camarón Penaeus semisulcatus y que estaba relacionada con el transporte de lípidos hacia el ovario, en el caso de las hembras. También fue demostrado en camarones, que la βGBP y la HDL (del inglés, high density lipoprotein) eran de hecho la misma proteína 185

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(Yépiz-Plascencia et al., 1998). Así, se considera actualmente, que las βGBP de los crustáceos tienen una doble función: transportar lípidos como una HDL y participar en el sistema inmune como una PRP. La interacción de la βGBP con los β-1,3-glucanos lleva a la formación de un complejo que se une a (los) receptor(es) de membrana en los hemocitos (Duvic y Söderhäll, 1990; 1992). Luego de esta unión, ocurre la activación celular, que resulta en el estiramiento y degranulación parcial de los hemocitos granulares (Barracco et al., 1991). La exocitosis del material granular promueve la liberación de las moléculas del sistema proPO, entre otras moléculas, ocurriendo una posterior activación de este sistema por los mismos β-1,3-glucanos (Cerenius et al., 1994; Vargas-Albores et al., 1996; Perazzolo y Barracco, 1997). Fue también demostrado que la βGBP puede actuar como una opsonina, aumentando la fagocitosis in vitro de levaduras por los hemocitos de los cangrejos señal (Cerenius et al., 1994). El complejo βGBP-β-1,3-glucanos del cangrejo señal P. leniusculus se puede unir en la superficie de los hemocitos granulares a través del motivo RGD, lo que sugiere que esta unión sea mediada por una proteína semejante a la integrina, presente en la membrana del hemocito, como se mencionó anteriormente. Efectivamente, una proteína de la familia de las β-integrinas fue aislada de los hemocitos del cangrejo y es una candidata a receptor de la βGBP (Holmblad et al., 1997). Entre tanto, un receptor de la membrana para βGBP fue aislado de los hemocitos del cangrejo señal por Duvic y Söderhäll (1992), siendo caracterizado como un heterodímero proteico de 230 y 90 kDa. La interacción con el hemocito ocurre solamente si la βGBP estuviera integrada a los β-1,3-glucanos. Curiosamente, este receptor es el mismo que se une a la proteína de adhesión celular peroxinectina (tratada adelante), que es una superóxido dismutasa (SOD) que contiene CuZn (Johansson et al., 1999a), no perteneciendo por lo tanto a la familia de las integrinas. Otra proteína que se une a los β-glucanos, es la GBP, recientemente clonada de los hemocitos del camarón P. monodon (Sritunyalucksana et al., 2002). Esta proteína (39,5 kDa) es constitutivamente expresada en los hemocitos y se une a los β-1,3-glucanos presentes en curdlan y zymosan, pero no se une a los LPS bacterianos, demostrando su especificidad en el reconocimiento de los hongos. Proteínas que se unen a LPS y β-1,3-glucanos: LGBP PRPs que se unen a ambos, LPS y β-1,3-glucanos (LGBPs), fueron identificadas en crustáceos e insectos y presentan un importante papel en las respuestas inmunes innatas. Las LGBPs de los crustáceos son proteínas pequeñas (36-46 kDa) producidas en los hemocitos (Lee et al., 2000; Cheng et al., 2005; Du et al., 2007) y/o en el hepatopáncreas de estos animales (Roux et al., 2002; Cheng et al., 2005). La primera LGBP aislada y caracterizada en los crustáceos, fue en el cangrejo señal P. leniusculus (Lee et al., 2000). Esta LGBP (36 kDa) está presente en los hemocitos, pero ausente en el plasma y tiene la propiedad de unirse tanto a los LPS como a los β-1,3-glucanos, pero no a los peptidoglucanos mostrando su especificidad para bacterias Gram-negativas y hongos. Una vez unida a sus respectivos PAMPs, la LGBP así como la βGBP, lleva a la activación del sistema proPO del cangrejo. En los camarones penaeidos, existen tres referencias sobre la clonación del gen de la LGBP: en Litopenaeus stylirostris (Roux et al., 2002), L. vannamei (Cheng et al., 2005) y F. chinensis (Du et al., 2007), con masas moleculares deducidas de 40, 46 y 44 kDa, respectivamente (Tabla 2).

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Análisis de las secuencias aminoacídicas de las LBGPs y GBPs de crustáceos, revelaron que estas proteínas, a ejemplo de las βGBPs, tienen dominios semejantes a las β-glucanasas bacterianas, a pesar de no tener actividad enzimática y poseen también el dominio RGD de adhesión celular (Lee et al., 2000; Roux et al., 2002; Cheng et al., 2005; Du et al., 2007). Se cree que esas proteínas han evolucionado a partir de proteínas semejantes a las glucanasas bacterianas y que durante la evolución han perdido su actividad catalítica. Entretanto, la propiedad de unirse al patrón molecular fue conservado, garantizando así su participación en el sistema inmune de estos animales (Lee et al., 2000). De forma interesante, recientemente fue demostrado en L. vannamei que la región de la LGBP, necesaria para la unión con los LPS y los β-1,3-glucanos, es justamente el sitio β-1,3-glucanasa (Cheng et al. 2005). Así como las otras PRPs descritas anteriormente, las LGBPs participan también en la activación del sistema proPO de cangrejo señal (Lee et al., 2000) y del L. stylirostris (Roux et al., 2002). Sin embargo, la proteína del cangrejo señal debe estar simultáneamente unida a los dos PAMPs para que ocurra una completa activación del sistema proPO (Lee et al., 2000). El análisis de la expresión diferencial de la LGBP de L. stylirostris infectados con el virus de la mancha blanca (WSSV), demostró que ocurre una súper expresión del gen en respuesta a la infección viral, sugiriendo que la LGBP sea una proteína inducible de fase aguda, importante no solamente para las infecciones bacterianas, sino también en las infecciones virales (Roux et al., 2002). A pesar de que todas las proteínas, LGBP, GBP y βGBP tienen dominios RGD de adhesión celular y sitios semejantes a las glucanasas bacterianas (Cerenius et al., 1994; Lee et al., 2000; Sritunyalucksana et al., 2002; Romo-Figueroa et al., 2004), las dos primeras difieren de la βGBP por no ser lipoproteínas y por presentar un menor tamaño. A pesar de esto, todas esas PRPs activan el sistema proPO de los crustáceos luego de unirse a los β-1,3-glucanos. Proteínas “mas-like” (del inglés, masquerade-like proteins) La “mas-like” es una proteína de reconocimiento patrón multifuncional descrita en insectos y crustáceos. En el cangrejo señal P. leniusculus la “mas-like” se une a las bacterias Gram-negativas y levaduras y, consecuentemente, a los LPS y β-1,3-glucanos, semejante a la LGBP. Luego del reconocimiento de lo no-propio, esta PRP promueve la activación del sistema proPO, la adhesión celular y el aumento de la fagocitosis (Huang et al., 2000; Lee y Söderhäll, 2001). La “mas-like” de P. leniusculus fue así denominada debido a su similitud con la masquerade de la Drosophila, presente durante su embriogénesis, en el desarrollo larval y el estadio de pupa (Murugasu-Qei et al., 1995). La “mas-like” existe en los hemocitos del cangrejo señal bajo una forma inactiva, como un heterodímero y presenta homología con serino-proteasas, aunque sin actividad catalítica. La “mas-like” es exocitada de los hemocitos en su forma inactiva y tras unirse a microorganismos es clivada por una proteasa desconocida, produciendo así varios fragmentos peptídicos. Uno de ellos promueve la adhesión celular en el cangrejo señal (Lee y Söderhäll, 2001). Por otro lado, in vitro la “mas-like” funciona como una opsonina, estimulando la fagocitosis por los hemocitos del cangrejo señal. Otra clase de “mas-like”, homóloga a las serino-proteasas, fue más recientemente identificada también en P. leniusculus (Sricharoen et al., 2005) y en P. monodon (Amparyup et al., 2007b). Estas proteínas hemocitarias tienen una menor masa molecular (42 y 52 kDa, respectivamente) y presentan homología con los factores de activación de la proPO 187

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(del inglés, FAPPs) de insectos, a diferencia de la “mas-like” descrita anteriormente, que parece ser una PRP. Además de esas PRPs, existen otras en invertebrados, destacándose las proteínas que se unen a los peptidoglucanos (del inglés, PGRPs) que fueron bien descritos en insectos (Kang et al., 1998; Ochiai y Ashida, 1999), pero no han sido todavía encontradas en los crustáceos. Ya fue demostrado en P. monodon que las PGs pueden inducir la activación del sistema proPO, lo que sugiere la presencia de una PGRP en camarones (Sritunyalucksana et al., 1999a). Aglutininas y lectinas Las lectinas son proteínas sin actividad catalítica, con capacidad de unirse específicamente a los carbohidratos de la superficie de diferentes células, incluyendo microorganismos, causando su aglutinación. Esa propiedad deriva del hecho de que estas moléculas son por lo menos bivalentes, presentando dos o más sitios de unión. Debido a esta característica, inicialmente se consideró que las lectinas de los invertebrados eran análogas funcionales de las inmunoglobulinas de los vertebrados, pero hoy se sabe que son estructural y funcionalmente distintas (Marques y Barracco, 2000). Debido al hecho que las lectinas, tanto de vertebrados como de invertebrados, son capaces de reconocer y unirse a los azucares específicos de la superficie de patógenos, estas moléculas son también definidas como PRPs. Además de actuar como PRPs en los invertebrados, las lectinas están también relacionadas con varios procesos biológicos, debido a su interacción con carbohidratos, como la adhesión celular, opsonización y formación de nódulos (Lee y Söderhäll, 2002). Algunas lectinas de invertebrados parecen todavía estar implicadas en la activación del sistema proPO de insectos (Yu et al., 1999) y tener actividad antibacteriana en tunicados y limúlidos (Suzuki et al., 1990; Kawabata e Iwanaga, 1999). La mayoría de las lectinas relacionadas con el sistema inmune pertenece a la superfamilia de las lectinas del tipo-C, cuya actividad biológica es Ca2+-dependiente y presentan dos dominios para el reconocimiento de carbohidratos (del inglés, CRD) (Drickamer y Taylor, 1993). Las lectinas de crustáceos son mucho menos conocidas e investigadas que las de otros artrópodos, como insectos y limúlidos. En estos dos últimos grupos zoológicos, ya se describió la ocurrencia de lectinas múltiples en la hemolinfa, específicamente para diferentes tipos de microorganismos. Algunas de esas lectinas presentan un amplio espectro de reconocimiento, se unen tanto a bacterias Gram-positivas como Gramnegativas, mientras que otras son altamente específicas, reconociendo configuraciones químicas específicas de azúcares de la superficie de un determinado microorganismo (Marques y Barracco, 2000). En los crustáceos, las lectinas son proteínas plasmáticas constitutivas, sintetizadas generalmente por el hepatopáncreas (Gross et al., 2001; Luo et al., 2006) y que reconocen principalmente azúcares N-acetilados, en especial derivados del ácido siálico y sialoglicoconjugados (Marques y Barracco, 2000). La ocurrencia de lectinas múltiples fue descrita inicialmente en la hemolinfa de la langosta Homarus americanus, hace más de 30 años (Hall y Rowlands, 1974) y desde entonces, otras varias lectinas han sido identificadas y aisladas en diferentes crustáceos. Sin embargo, la mayoría de esos trabajos están restrictos a caracterizar una única lectina

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y hay muy pocas referencias de lectinas múltiples en la hemolinfa de otros crustáceos (Marques y Barracco, 2000). A pesar de los esfuerzos realizados en el aislamiento y caracterización de lectinas en diferentes crustáceos, poco ha sido el progreso obtenido en cuanto a su papel inmunológico. Entre los pocos ejemplos se pueden citar las lectinas de P. monodon (monodina y PmLec) (Ratanapo y Chulavatnanol, 1992; Luo et al., 2006), de F. californiensis (Vargas-Albores et al., 1993), de Parapenaeus longirostris (Fragkiadakis y Stratakis, 1995) y de M. rosenbergii (Vázquez et al., 1997), todas capaces de aglutinar diferentes especies de bacterias, siendo algunas capaces de aglutinar especies patogénicas del género Vibrio. Sin embargo, la mayoría de los estudios se dirigen al análisis de la capacidad de las moléculas en aglutinar diferentes tipos de bacterias, pero poco se conoce sobre su actuación como opsoninas o en otros aspectos de las respuestas inmunológicas. Recientemente, una lectina del tipo-C, denominada Fclectin (31.8 kDa), fue identificada en los hemocitos del camarón F. chinensis (Fclectina) (Liu et al., 2007). A diferencia de la mayoría de las lectinas, esta es sintetizada en el hepatopáncreas. Interesantemente, la Fclectina es súper-expresada luego de 3 a 12 h de inoculación con WSSV o bacterias Gram-negativas respectivamente, lo que sugiere una cinética de expresión distinta, según el agente infeccioso (Liu et al., 2007). Un grupo de aglutininas que se une a los LPS bacterianos del tipo LBP fue aislada y caracterizada en el cangrejo señal P. leniusculus (Kopácek et al., 1993a) y en los camarones F. californiensis (Vargas-Albores et al., 1993), L. schmitti (Cominetti et al., 2002) y P. monodon (Luo et al., 2006) (Tabla 2). Todas ellas se unen a los LPS, sugiriendo que tienen un importante papel en el control de infecciones causadas por bacterias Gram-negativas como las del género Vibrio, que pueden ser patogénicas para camarones. Es importante resaltar que las LBPs se diferencian funcionalmente de otras PRPs, como las LGBPs que también reconocen LPS, porque no solamente actúan en el reconocimiento de PAMPs, sino también causan la aglutinación de las células portadoras de LPS, fenómeno que no ocurre con las LGBPs. La LBP de P. leniusculus es una proteína plasmática formada por varias subunidades (de 65 a 80 kDa) que aglutina fuertemente varias cepas bacterianas Gram-negativas (Escherichia coli, Salmonella spp., Serratia marcescens) y eritrocitos que en los vertebrados exponen el ácido siálico (Kopácek et al., 1993a). La LBP del camarón F. californiensis es una aglutinina plasmática de mayor tamaño (175 kDa) que reconoce y aglutina diferentes cepas de Vibrio y también eritrocitos de varios vertebrados (VargasAlbores et al., 1993). Para ambas LBPs la actividad hemoglutinante es específicamente inhibida por LPS bacterianos. Muy recientemente, una LBP fue purificada y caracterizada de la hemolinfa de P. monodon y su gen clonado (Luo et al., 2006). Esta proteína fue identificada como una lectina tipo-C (PmLec, 18 kDa), presentando una acentuada actividad aglutinante contra varias bacterias Gram-negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Aeromonas hydrophila y Vibrio alginolyticus), además de una fuerte capacidad de opsonización durante la fagocitosis de E. coli. Es interesante observar que la PmLec no presenta actividad antibacteriana, ni capacidad de inducir al sistema proPO (Luo et al., 2006). Receptores Toll y TLR (del inglés Toll-like receptor) Las proteínas o receptores “Toll” fueron inicialmente identificados en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y revelaron tener una importante función en la determinación del eje dorso-ventral en el desarrollo embrionario de este insecto (Anderson 189

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y Nussleinvolhard, 1984). Además de su importante papel en la embriogénesis, los receptores “Toll” mostraron estar crucialmente implicados en las respuestas inmunológicas de D. melanogaster (Lemaitre et al., 1996). Más tarde, proteínas semejantes a los receptores “Toll” de D. melanogaster fueron también identificados en vertebrados y denominados TLRs (del inglés, Toll-like receptors). Los TLRs están implicados en el sistema inmune innato de los vertebrados y actúan de forma esencial en el reconocimiento de PAMPs. Los receptores Toll y TLRs son glicoproteínas transmembranales caracterizadas por presentar un dominio extracelular rico en residuos de leucina o LRR (del inglés, leucinerich repeat) y por un dominio de señalización citoplasmático homólogo al del receptor de interleucina 1, denominado de TIR (del inglés, Toll/interleucin-1 receptor domain). Los TLRs de mamíferos tienen regiones de unión a los PAMPs en su dominio LRR y luego de la activación, inducen a la expresión de citocinas inflamatorias importantes como los interferones (revisar sección 1.7.1) y otras moléculas activas de la respuesta inmune adaptativa (Akira et al., 2006). En mamíferos, ya fueron identificados doce TLRs distintos, todos implicados en el reconocimiento directo de PAMPs, como LPS (TLR4), lipoproteínas (TLR2), dsRNA (TLR3), flagelina (TLR5), DNA CpG (TLR9) y varios componentes virales (TLR7) (ver revisión de Akira et al., 2006). En D. melanogaster, diferentes receptores “Toll” fueron también identificados, como el dToll, el d18W y los dToll3 a dToll9. Sin embargo, apenas los dToll y dToll5 parecen estar relacionados con la activación de respuestas inmunológicas (Tauszig et al., 2000). A diferencia de los TLRs de mamíferos, los dToll y dToll5 no tienen regiones de unión con los PAMPs en el dominio LRR, indicando que estas proteínas de D. melanogaster no funcionan directamente como proteínas de reconocimiento patrón o PRPs. Sin embargo, estos Tolls de D. melanogaster son activados indirectamente por proteínas PRPs como las PGRPs circulantes en la hemolinfa, que reconocen PGs de bacterias Gram-positivas y componentes de la superficie de hongos. Después de reconocer sus PAMPs, las PGRPs de la hemolinfa inician una cascada proteolítica que culmina con el clivaje de una proteína circulante denominada Spätzle. Una vez clivada, la Spätzle se une directamente al receptor “Toll”, que inicia una cascada de transducción de señal, que culmina con la transcripción del péptido antimicrobiano drosomicina (Lemaitre et al., 1996). Además de actuar en las respuestas contra bacterias Gram-positivas y hongos, la vía “Toll” de Drosophila parece ser todavía requerida para inhibir la replicación y propagación del virus DXV (Drosophila X Virus) (Zambon et al., 2005). Respecto a los camarones, apenas muy recientemente fueron identificados receptores del tipo “Toll” en las células de los penaeidos L. vannamei (lToll) (Yang et al., 2007) y P. monodon (PmToll) (Arts et al., 2007). Esos receptores presentan una alta homología con los “Tolls” de D. melanogaster (dToll y dToll5), del mosquito Anopheles gambiae (AeToll), de la abeja Apis mellifera (AmToll) y del limulídeo Tachypleus tridentatus (tToll). Así como las demás secuencias de “Tolls” y TLRs, los “Tolls” de camarones también tienen dominios LRR y TIR conservados. Los “Tolls” de camarones identificados hasta el momento, no tienen regiones de unión para los PAMPs en el dominio LRR, como los TLRs de vertebrados, pareciéndose una vez más a los “Toll” conocidos de otros artrópodos. Las proteínas “Toll” de camarones son expresadas constitutivamente en diferentes tejidos y su expresión no parece ser afectada durante las infecciones virales (Arts et al., 2007). La similitud de estos receptores de camarones con los “Toll” de insectos, que inducen la transcripción del AMP drosomicina (dToll y AeToll), lleva a la suposición de que esas proteínas pueden estar también implicadas en la inmunidad innata de los camarones penaeidos, inclusive en sus respuestas antivirales como en Drosophila. Nada 190

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se conoce todavía sobre la actividad funcional de los recién identificados “Tolls” de crustáceos. En un futuro próximo, se espera tener una mejor comprensión de su relación con en el sistema inmune innato de los camarones y su potencial como inmuno marcador durante las infecciones. Cascada Proteolítica: sistema de activación de la pro-fenol oxidasa (proPO) Como se dijo anteriormente, la formación de nódulos y capsulas hemocíticas en crustáceos es frecuentemente acompañada por una reacción de melanización en la región más central. La melanización es también observada durante la cicatrización de heridas, donde la coagulación de la hemolinfa y la migración de los hemocitos al lugar de la lesión permiten la formación de un tapón celular hasta que una nueva cutícula sea reconstituida (Figura 6.6). La biosíntensis de la melanina en los artrópodos es un proceso complejo que comprende una serie de reacciones químicas en cascada, denominadas “sistema de activación de la Pro-fenol oxidasa o sistema proPO. Este sistema está compuesto por varios zimógenos de proteasas, por la Pro-fenol oxidasa, además de PRPs asociadas (Lee y Söderhäll, 2002) (Figura 6.6). El sistema proPO es reconocido como una de las principales respuestas inmunoefectoras de los crustáceos desencadenada por componentes de la superficie de microorganismos, como los LPS de bacterias Gram-negativas y los β-1,3glucanos de hongos (Cerenius y Söderhäll, 2004). Durante las infecciones, estos compuestos se unen a receptores de los hemocitos granulares directamente o a través de PRPs plasmáticas e inducen una degranulación o exocitosis regulada, con la liberación de varias moléculas inmuno efectoras, entre las cuales están las moléculas del sistema proPO. Una vez liberadas, ocurre la activación de este sistema por los propios componentes de los microorganismos presentes en la hemocele. La presencia del sistema proPO y de algunas moléculas asociadas en los gránulos de los hemocitos granulares (HGPs y HGGs) fue especialmente estudiada en el cangrejo señal P. leniusculus (Cerenius y Söderhäll, 2004) y también en varios camarones como P. monodon (Kondo et al., 1992), F. californiensis (Hernández-López et al., 1996), L. stylirostris (Le Moullac et al., 1997) y F. paulensis (Perazzolo y Barracco, 1997). Análisis moleculares y bioquímicos de la proPO de crustáceos revelaron que esta proteína (76-78 kDa) presenta similitud con la hemocianina, una vez que también presentan sitios de unión para el cobre (Sritunyalucksana y Söderhäll, 2000). Además de ello, las proPOs de camarones presentan una región tiol-éster (GCGWPRHM), como las proteínas C3 y C4 del sistema del complemento de los vertebrados y las α2macroglobulinas (Aspán et al., 1995; Sritunyalucksana et al., 1999b; Lai et al., 2005; Liu et al., 2006b). La activación de la forma inactiva o proPO hacia la enzima activa o fenol oxidasa (PO), ocurre por la acción de serino-proteasas denominadas enzimas activadoras de la proPO (del inglés, proPO-activating-cascade enzymes o PPAEs), iniciando una cascada proteolítica cuyo producto final es la melanina (Figura 6.7). En crustáceos, una PPAE llamada ppA fue purificada (Aspán y Söderhäll, 1991) y posteriormente clonada (Wang et al., 2001) a partir de los hemocitos de P. leniusculus. La ppA es sintetizada y mantenida como un zimógeno (pro-ppA) en los hemocitos, siendo activada luego de su exocitosis, como consecuencia de una lesión o infección microbiana. Su activación ocurre por un clivaje proteolítico, por parte de una proteasa aún desconocida (Cerenius y Söderhäll, 2004). 191

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La forma PO es una óxido reductasa que cataliza dos reacciones sucesivas: la primera, de hidroxilación de un monofenol a ο-difenol (actividad monofenoloxidásica) y, la segunda, de oxidación del ο-difenol a ο-quinona (actividad difenoloxidásica) (Figura 6.7). La producción de o-quinonas resulta en la síntesis de la melanina a través de una cascada de reacciones químicas intermedias, siendo la mayoría espontánea, no mediadas por enzimas (Figura 6.7). La producción de quinonas lleva también a la esclerotización de la cutícula de los crustáceos, fenómeno esencial en los períodos de muda (Söderhäll y Cerenius, 1998). Con relación al papel inmunológico del sistema proPO, se conoce que esta vía genera transitoriamente moléculas altamente tóxicas, como las quinonas, hemiquinonas (Figura 6.7) y radicales libres de oxígeno, como las propias ROIs, una vez que ocurre consumo de oxígeno molecular y que llevan a una destrucción de los patógenos invasores. El pigmento oscuro e insoluble o melanina parece tener una actividad fungistática (Cerenius y Söderhäll, 2004) y puede todavía funcionar como “scavenger” de radicales libres (Nappi y Vass, 1993; Nappi y Ottaviani, 2000), minimizando así los efectos deletéreos de estas moléculas altamente tóxicas para el organismo del hospedero. Debe ser resaltado que la melanina, per se, no es la molécula inmunoefectora más importante durante la activación del sistema proPO, siendo los compuestos citotóxicos intermedios los más efectivos (Nappi y Vass, 1993). De esta manera, la melanización representa, más específicamente, el final de un potente proceso inmunoefector. Cabe resaltar que concomitantemente la liberación de los componentes del sistema proPO, otras varias moléculas son también exocitadas por los hemocitos inmunoestimulados (Figura 6.6). Una de ellas es la peroxinectina (76 kDa) que es una peroxidasa, homóloga a la mieloperoxidasa humana y que actúa en la adhesión celular manteniendo su actividad peroxidásica. Esta proteína gana su actividad biológica concomitantemente la activación del sistema proPO en el plasma y promueve el encapsulamiento de parásitos invasores de gran tamaño, luego de unirse al receptor SOD de la membrana de los hemocitos, mencionado anteriormente (Johansson, 1999b). Por otro lado, la peroxinectina induce además una fuerte degranulación de los hemocitos, llevando a la liberación de más compuestos inmuno efectores y consecuentemente a una acentuada amplificación de la respuesta inmunológica del hospedero. Otras moléculas son también exocitadas durante la activación hemocítica, como la enzima transglutaminasa (TGasa) que induce el proceso de coagulación, diferentes inhibidores de proteasas, PRPs como la “mas-like”, AMPs y otras moléculas inmunoefetoras/inmunoreguladoras (Lee y Söderhäll, 2002; Cerenius y Söderhäll, 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). La activación del sistema proPO debe, por consiguiente, ser estrictamente regulada para evitar una activación no deseada o generalizada en el organismo del crustáceo. Para eso, los animales poseen inhibidores de proteasas en el plasma y/o hemocitos. Entre ellos podemos destacar la pacifastina (Liang et al., 1997), los inhibidores de la familia Kazal (Johansson et al., 1994; Jiménez-Vega y Vargas-Albores, 2005; Somprasong et al., 2006), la serpina (Liang e Söderhäll, 1995) y la α2-macroglobulina (Hergenhahn et al., 1988). El inhibidor más eficiente de la ppA del cangrejo señal, es la pacifastina, una proteína plasmática heterodimérica (155-kDa), formada por una cadena leve con nueve subunidades (inhibidoras de proteasa) y una cadena pesada conteniendo tres transferinas (Liang et al., 1997). Esta molécula dio origen a una nueva clase de inhibidores de serinoproteasas denominada “pacifastina-like”, que fue recientemente identificada también regulando el sistema proPO de insectos (Simonet et al., 2002).

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Figura 6.6: Liberación de diferentes efectores inmunológicos y moléculas inmunoreguladoras, después de la activación de los hemocitos por patógenos. Todavía no está confirmado si la TGase es liberada por hemocitos granulares o hialinos.

Figura 6.7: Reacción de melanización en crustáceos. A: Herida melanizada (flecha) en el camarón Farfantepenaeus paulensis; B: Principales pasos de la biosíntesis de melanina desencadenados por la enzima fenoloxidasa (PO) en presencia de substratos fenólicos (adaptado de Nappi y Vass, 1993).

Otro importante inhibidor de proteasas en crustáceos es la proteína plasmática α2macroglobulina (α2M), que es constitutivamente sintetizada por los hemocitos de estos animales (Gross et al., 2001; Rattanachai et al., 2004b). La α2M es un inhibidor de proteasas de amplio espectro (serino, aspartato, cisteína y metalo-proteasas) que inhibe tanto las proteasas del propio hospedero, como aquellas producidas por el patógeno durante el proceso infeccioso (Armstrong y Quigley, 1999; Armstrong, 2006). Una característica fundamental de estos inhibidores es la presencia en la molécula de una región tiol-éster, como ocurre en las proteínas C3 y C4 del sistema del complemento de los vertebrados. 193

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La α2M de los crustáceos es una glicoproteína homodimérica (380-400 kDa), siendo aislada y caracterizada en la langosta H. americanus (Spycher et al., 1987), en el cangrejo señal P. leniusculus (Hergenhahn, et al., 1988) y en el camarón L. vannamei (GóllasGalvan et al., 2003). La secuencia codificante para la α2M de penaeidos fue determinada muy recientemente en M. japonicus, P. monodon, L. vannamei, L. schmitti y F. paulensis (Rattanachai et al., 2004b; Lin et al. 2007; 2008; Rosa et al., 2008). El papel inmunomodulador de la α2M en los crustáceos, todavía no está bien establecido. No obstante, se conoce que la α2M inhibe parcialmente las serino-proteasas activadoras del sistema proPO del cangrejo señal (Hergenhahn et al., 1988; Aspán et al., 1990) y proteasas producidas por el hongo Aphanomyces spp., un patógeno conocido para los cangrejos (Dieguez-Uribeondo y Cerenius, 1998). Análisis de la expresión génica de la α2M de crustáceos a través de la técnica de PCR en tiempo real, revelaron que su expresión es aumentada en las primeras 48 horas de infección con virus (Tonganunt et al., 2005) o luego del tratamiento de los animales con LPS (Vaseeharan et al., 2007) o PGs bacterianos (Lin et al., 2007; 2008). Estos hallazgos son relevantes, ya que sugieren que la α2M participa de las respuestas inmunológicas, siendo tal vez capaz de inhibir proteasas de patógenos y/o regular la activación del sistema proPO con sus moléculas tóxicas, minimizando así la agresión del patógeno y/o los daños causados a los tejidos del hospedero. Sistema de Coagulación La coagulación de la hemolinfa es un mecanismo inmunológico esencial para la supervivencia de animales invertebrados con un sistema circulatorio abierto o semiabierto como los crustáceos. Ella previene tanto la pérdida de la hemolinfa, como la diseminación de los patógenos por la cavidad corporal del animal. En los invertebrados son reconocidos dos diferentes mecanismos de coagulación (Theopold et al., 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). El primero es una cascada proteolítica activada por componentes microbianos, como LPS y β-1,3-glucanos, ocurriendo en limulídeos, como en T. tridentatus (Kawabata et al., 1996) y el segundo es una reacción de coagulación dependiente de la enzima transglutaminasa (TGasa), ocurriendo en insectos y crustáceos. En el caso de la coagulación de los crustáceos, un componente clave en el proceso de gelificación del plasma es la proteína de coagulación (CP), que forma coágulos estables por medio de una reacción de unión cruzada entre sus moléculas, mediadas por la TGasa (Figura 6.6) (Martin et al., 1991; Muta e Iwanaga, 1996). Las TGasas son enzimas Ca2+-dependientes, usualmente compartimentalizadas dentro de los hemocitos de los crustáceos (Lorand et al., 1979; Greenberg et al., 1991), capaces de formar uniones covalentes γ-glutamil-ε-lisina (Figura 6.8) entre ciertas proteínas, como la proteína de coagulación presente en el plasma (Lorand y Conrad, 1984). En crustáceos, la CP fue aislada y caracterizada en varias especies, entre ellas la langosta Panulirus interruptus (Fuller y Doolittle, 1971; Doolittle y Riley, 1990), en los cangrejos P. leniusculus (Kopácek et al., 1993b) e Ibacus ciliatus (Komatsu y Ando, 1998) y en los camarones P. monodon y M. japonicus (Yeh et al., 1998), L. vannamei (MontañoPérez, et al., 1999) y F. paulensis (Perazzolo et al., 2005). Las CPs de los crustáceos son lipoproteínas homodiméricas (200 kDa) (Sritunyalucksana y Söderhäll, 2000). Secuencias aminoacídicas completas de la CP fueron determinadas en P. leniusculus (Hall et al., 1999), P. monodon (Yeh et al., 1999) y M. japonicus (Cheng 194

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et al., 2008), siendo que el RNAm correspondiente es expresado en el hepatopáncreas de los camarones y en varios otros tejidos (Yeh et al., 2007; Cheng et al., 2008), con excepción de los hemocitos y de los músculos de los penaeidos. Interesantemente, el tejido epidérmico sub-cuticular de M. japonicus demostró ser el principal sitio de la síntesis de la CP, justamente resaltando la importancia de la coagulación durante la muda del animal, cuando eso se vuelve potencialmente más expuesto a las lesiones y ataques microbianos (Cheng et al., 2008). Excepto por la similitud funcional, las CPs de los crustáceos no tienen ninguna característica molecular en común con el fibrinógeno de los mamíferos, o con el coagulógeno de los limúlidos, lo que sugiere que la CP de los crustáceos representa un tipo distinto de proteína formadora de coágulos (Hall et al., 1999). Curiosamente, las CPs pertenecen a la clase de las lipoproteínas de densidad muy alta (VHDL) (Hall et al., 1995; Yépiz-Plascencia et al., 2002) y están evolutivamente relacionadas con las vitelogeninas (VTG) (Hall et al., 1999; Yeh et al., 1999). La VTG es la principal precursora de vitelo en hembras ovíparas y no está relacionada con reacciones de coagulación. Sin embargo, tanto la CP como la VTG, tienen una región similar en lo dominio D del factor von Willebrand, implicado en la coagulación de la sangre de los mamíferos (Sadler, 1991). Defensas antivirales Como se mencionó anteriormente, las enfermedades virales constituyen actualmente, la más seria amenaza para la industria de la camaronicultura a nivel mundial y el principal riesgo para la sostenibilidad de la actividad. La principal enfermedad viral que afectó la industria del camarón, ocurrió en las Américas a inicios de los años 80, causada por el virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y hematopoyética (del inglés IHHNV), que resultó en mortalidades masivas. Otros brotes graves de enfermedades virales siguieron al IHHNV, destacándose el virus de la cabeza amarilla (del inglés, YHV) en Asia, el virus del síndrome del Taura (del inglés, TSV) en las Américas y más recientemente el virus del síndrome de la mancha blanca (del inglés, WSSV) que alcanzó proporciones catastróficas principalmente en Asia (a inicio de los años 90) y enseguida en las Américas (al final de los años 90) (Flegel, 2007). El WSSV parece ser uno de los virus más desastrosos de la historia de la camaronicultura, causando un índice altísimo de mortalidad que ocurre hasta el presente y que ha llevado a pérdidas económicas incalculables (Flegel, 2007). La contribución más urgente y esperada en la industria de la camaronicultura es indiscutiblemente el control de las infecciones virales. En los vertebrados, las infecciones virales inducen a varias respuestas inmunológicas, que en última instancia buscan controlar la duplicación y propagación de los virus y los daños celulares causados por ellos. Entre estas respuestas se destacan, (1) la destrucción de las células infectadas por las células NKs (del inglés, natural killer) y linfocitos T citotóxicos (CTLs), (2) la producción de anticuerpos neutralizantes para virus, (3) la inducción de proteínas del sistema interferón (IFN) que activan la trascripción de diversos genes que protegen las células de los daños causados por los virus, generando un estado antiviral y, (4) el silenciamiento de genes virales por la vía del RNA de interferencia (RNAi). Los crustáceos tienen apenas un sistema inmune innato, como ya se mencionó anteriormente y por tanto, están desprovistos de una línea celular linfocítica. Siendo así, sólo pueden contar eventualmente con los dos últimos mecanismos antivirales descritos, 195

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una vez que los dos primeros son relacionados con los linfocitos. La ocurrencia de estos dos últimos mecanismos en crustáceos se presenta a continuación. Sistema interferón Vertebrados En los vertebrados, los interferones (IFNs), son conocidos principalmente por su capacidad de interferir en la replicación viral y en inducir un estado antiviral en el hospedero. En la realidad, los IFNs son más que simples proteínas antivirales y ejercen un amplio espectro de otras funciones biológicas, siendo la mayoría relacionada con el sistema inmune. En lo referente a la defensa antiviral, apenas los interferones tipo I, IFN-α e IFN-β, son de real importancia (Samuel, 2001). En mamíferos las infecciones virales inducen a la producción de IFN-α/β, que a su vez estimulan la expresión de una serie de genes participantes en las respuestas antivirales. En las infecciones virales, las células del hospedero reconocen PAMPs específicos a través de receptores celulares específicos, principalmente las proteínas de la familia Toll o TLRs, ya comentadas anteriormente, que tienen un papel crucial en la inmunidad innata, iniciando la primera línea de defensa contra los patógenos (Uematsu y Akira, 2006; 2007). Los TLRs de mamíferos son homólogos a la proteína Toll inicialmente identificada en Drosophila y que induce una respuesta inmunológica contra los hongos (Lemaitre et al., 1996). Entre los diferentes TLRs de mamíferos, algunos reconocen particularmente PAMPs de virus, siendo TLR3 uno de los mas importantes, por reconocer el dsRNA, producido durante la replicación de muchos virus de RNA y DNA. Recientemente, fue descrito que las enzimas citoplasmáticas del tipo RNAhelicasa RIG-I (del inglés, retinoic acid inducible gene I) y Mda5 (del inglés, melanoma differentiation-associated gene 5) también son capaces de reconocer dsRNA (Fujita et al., 2007; Andrejeva et al., 2004). Luego de la internalización de los virus en la célula, sus ácidos nucleicos son liberados por el sistema endósomo/fagolisósomo y reconocido por los diferentes TLRs. Los TLRs activan una compleja cascada de señalización intracelular, induciendo la transcripción de una variedad de genes, incluyendo los IFN-α/β (Uematsu y Akira, 2006; 2007). Por su parte, los IFN-α/β, desencadenan la activación de múltiples vías intracelulares que interfieren con muchas de las etapas del ciclo de vida de los virus, limitando la amplificación y el extendimiento de los virus, atenuando así el proceso infeccioso (Guidotti y Chisari, 2001). Los IFNs secretados participan en el ciclo de activación autocrina/paracrina, mediante la activación de la señalización intracelular JAK/STAT (del inglés, kinase/signal transducer and activator of transcription), que resulta en la inducción de múltiples genes que codifican diversas proteínas implicadas en las respuestas antivirales. Entre ellas se destacan la PKR (del inglés, serine/threonin protein kinase), la OAS (del inglés, 2´-5´-oligoadenylate synthetase), la RNase L, la ADAR (del inglés, RNA-specific adenosine desaminase) y la Mx (del inglés, myxovirus-resistance protein GTPase). Estas proteínas afectan principalmente la multiplicación de los virus en la célula infectada, generando un estado antiviral inespecífico en las células del hospedero (Samuel, 2001). Camarones Hasta muy recientemente, las proteínas del sistema IFN eran consideradas moléculas presentes desde los cordados inferiores hasta los mamíferos (Krause y Pestka, 2005), no encontrándose en los invertebrados, principalmente en el ramo de los protostomios 196

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que incluye los crustáceos. Además, en los genomas completos disponibles de varios invertebrados, como el del nemátodo Caenorhabditis elegans (TCSC, 1998), de la mosca de la fruta D. melanogaster (Adams et al., 2000), del mosquito de la malaria A. gambiae (Holt et al., 2002) y de la abeja A. mellifera (THGSC, 2006), no fueron encontradas secuencias génicas homólogas para IFNs. Sin embargo, recientemente la expresión de una proteína homologa al IFN-α de los mamíferos fue reportada por primera vez en un invertebrado, en los hemocitos del penaeido M. japonicus (He et al., 2005). Interesantemente, esta proteína denominada IntlP (del inglés, interferon-like protein; GenBank AY695938) sólo se expresa en camarones supervivientes a la infección por WSSV y no en camarones sanos. La determinación de este producto génico en 2005 provocó gran optimismo, una vez que implicaba en la presencia de un sistema antiviral en crustáceos basado en IFN, como en los vertebrados. Los autores produjeron IntlP en un sistema recombinante y mostraron que esta proteína tenía de hecho una actividad antiviral, una vez que confería protección celular contra los efectos citopáticos causados por el virus del pez SGIV (del ingles, Singapore grouper iridovirus). Infelizmente, los resultados obtenidos por He et al. (2005) parecen no corresponder a la realidad una vez que en los análisis moleculares recientes realizados por nuestro grupo fue demostrado que el IntlP corresponde de hecho a una cadena β de la porción F0 de la ATP sintetasa mitocondrial y no a una proteína del sistema interferon. Se trata por consiguiente de una proteína expresada constitutivamente, independiente o no de la presencia de infecciones virales y que fue detectada en varios penaeidos (Barracco y Rosa, in press). Se debe resaltar, que a pesar de la aparente ausencia de moléculas homólogas a los IFNs de mamíferos en penaeidos, la inducción de un estado antiviral inespecífico fue inequívocamente mostrado en los camarones L. vannamei, un poco antes (Robalino et al., 2004) del reporte de la IntlP por He et al. (2005). Robalino et al. (2004) demostraron que la inyección de secuencias inespecíficas de dsRNA en camarones, causaba un aumento significativo de su resistencia a la infección por dos virus no relacionados, el TSV y el WSSV. Estos resultados mostraron, por primera vez en crustáceos, la inducción de un estado antiviral inespecífico, independiente de la secuencia de dsRNA inyectada y por tanto muy semejante al estado antiviral producido por los IFNs de mamíferos. Poco después, Westenberg et al. (2005) demostraron que también pequeños RNAs de doble cadena de interferencia (siRNA: del inglés, small interference RNA) eran capaces de inducir una protección antiviral. Estos resultados, aliados a la existencia de receptores Toll en los hemocitos de camarones L. vannamei (Yang et al., 2007) y P. monodon (Arts et al., 2007) llevaron a la suposición natural de la existencia de citocinas semejantes a IFNs en camarones. En contraposición a esta idea, está el hecho de la ausencia de secuencias génicas con homologías para IFNs en los genomas completos de insectos, filogenéticamente relacionados con los crustáceos. Ante estos resultados, es razonable suponer que citocinas análogas y no homólogas a los IFNS de vertebrados, deben existir en camarones y serían las responsables por la producción del estado antiviral inespecífico relatado por los autores citados. La identificación de estas citocinas todavía no descritas en crustáceos, llevará ciertamente a una mayor comprensión de los mecanismos antivirales de los camarones y puede abrir nuevas perspectivas para la estimulación de un estado antiviral general en camarones de cultivo, buscando un mayor control de las apariciones de infecciones virales.

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Sistema RNA de interferencia (RNAi) Además de inducir al sistema IFN en los vertebrados, el patrón molecular dsRNA viral es también capaz de desencadenar otras vías múltiples intracelulares que también llevan a otras respuestas antivirales. Entre ellas, se destaca el mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes, conocido por RNA de interferencia o RNAi (Hannon et al., 2002, Robalino et al., 2007a). En este proceso el dsRNA desencadena la destrucción de RNAm homólogos a su secuencia. El RNAi representa un mecanismo de defensa natural contra virus y transposones, presente en los diferentes seres vivos desde plantas hasta mamíferos (Hannon, 2002). En animales, este mecanismos fue primeramente descrito en el nemátodo C. elegans. (Fire et al., 1998). De forma resumida, la activación de estos sistemas se inicia por el procesamiento de precursores largos de dsRNA en RNAs pequeños de 21-25 pb (siRNAs y miRNAs) por la enzima Dicer semejante a la RNase III (Hamilton y Baulcombe, 1999). Estos pequeños RNAs proporcionan las secuencias específicas para un complejo de silenciamiento multiprotéico inducido por el RNA (RISC), que dirige una degradación específica o la represión de la traducción de RNAm con regiones complementarias a la secuencia de dsRNA desencadenante (Robalino et al., 2007a). Diferente del sistema IFN, que es inducido inesperadamente por cualquier secuencia de dsRNA (patrón molecular), la protección antiviral basada en la vía RNAi es de secuencia específica. Interesantemente, los ensayos realizados en C. elegans muestran que el silenciamiento post-transcripcional vía RNAi, puede ser inducido experimentalmente tanto por inyección de dsRNA, como por suministro vía oral o por expresión transgénica (Grishok, 2005). De acuerdo con Robalino et al. (2007a), la capacidad de la célula en detectar e interiorizar dsRNA, como fue demostrado en C. elegans, se extiende también a otros invertebrados como D. melanogaster (Goto et al., 2003) y el camarón L. vannamei. En L. vannamei, Robalino et al. (2005) demostraron en un trabajo elegante e inequívoco, la ocurrencia de una protección antiviral, prácticamente completa contra infecciones por WSSV y por TSV, mediante inyección de secuencias específicas de dsRNA para ambos tipos de virus. De forma semejante, secuencias específicas de dsRNA fueron también capaces de suprimir la replicación del virus YHV en células en cultivo de P. monodon (Tirasophon et al., 2005). Con base en lo anterior, el mecanismo antiviral mediado por RNAi viene asumiendo un papel especial en las respuestas antivirales de los crustáceos, una vez que su eficiencia y especificidad fueran claramente demostradas en penaeidos infectados por diferentes virus. Además, su inducción por dsRNA vía sistémica (Robalino et al., 2005) y eventualmente por vía oral, implica una atrayente posibilidad de desarrollar terapias antivirales basadas en dsRNA, de forma compatible con la camaronicultura. Apoptosis celular: ¿mecanismo antiviral o pro-viral? La muerte celular programada o apoptosis, es un proceso bien conocido, con implicaciones variadas en la regulación de la homeostasis de un organismo, actuando tanto en el desarrollo embrionario, como en el control de los tejidos en general y también en las respuestas inmunológicas contra los virus. Es en sí un mecanismo filogenéticamente antiguo y bien conservado entre los diferentes grupos de seres vivos. La inducción de apoptosis se inicia en respuesta a una variedad de estímulos, incluyendo las infecciones virales y envuelve varias alteraciones morfológicas celulares, como la condensación de la cromatina, la fragmentación del núcleo, el blebbing de 198

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FIgura 6.8: Reacción de coagulación en crustáceos, mediada por la formación de ligaciones cruzadas entre resíduos de lisina y glutamina de las proteínas de coagulación, a través de la acción de la TGase y calcio

Figura 6.9: Apoptosis celular. Representación de la apoptosis de una célula, con la formación de cuerpos apoptóticos endocitados por una célula saludable (A). Núcleos apoptóticos (B) y no-apoptóticos (C) de hemocitos de L. vannamei infectados con el virus de la mionecrosis infecciosa (IMNV), teñidos con bis-benzimida.

la membrana, el achicamiento celular y finalmente la fragmentación de la célula en pequeñas vesículas revestidas por la membrana, denominadas cuerpos apoptóticos, que son en general rápidamente fagocitados por las células vecinas (Figura 6.9). Las alteraciones bioquímicas subyacentes a estas alteraciones morfológicas, incluyen la activación de enzimas nucleasas y proteasas, dentro de las cuales se destaca la familia de las caspasas. Éstas tienen un papel crucial en el proceso apoptótico, pues catalizan muchos de los diferentes pasos en la muerte celular. Muchas proteínas virales alteran la fisiología celular y proporcionan señales celulares que inducen la muerte celular. Debe ser resaltado que la simple inducción de la apoptosis en estadio precoz de la infección viral, puede limitar la producción de partículas virales y reducir o eliminar la propagación de la progenie viral para otros tejidos. Sin embargo, muchos virus consiguen retardar el proceso apoptótico, matando las células apenas en el final del ciclo infeccioso (Roulston et al., 1999). La apoptosis celular en estadio final del ciclo de la replicación viral, ofrece muchas ventajas a los virus. Durante este proceso, todo el contenido celular, incluyendo la 199

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progenie del virus, es empacado en los cuerpos apoptóticos. Los virus son así indetectables para el sistema inmune, estando protegidos dentro de los cuerpos apoptóticos. Evitan de esta manera las respuestas inflamatorias y su inactivación por anticuerpos y proteasas del hospedero. Estos cuerpos apoptóticos, alojando innumerables virus replicados, son enseguida rápidamente fagocitados por las células vecinas e irónicamente garantizan la propagación y la infección viral. O sea, la inducción de una apoptosis tardía parece ser una óptima estrategia de propagación para el virus que evolutivamente no desarrollaron todavía defensas anti-apoptóticas u otros mecanismos de evasión inmunológica (Roulston et al., 1999). En camarones, la inducción de la apoptosis en infecciones virales viene siendo activamente descrita en estos últimos años. En P. monodon infectados por WSSV (Sahtout et al., 2001; Wongprasert et al., 2003) o por YHV (Khanobdee et al., 2002) ocurre un aumento progresivo de la apoptosis hasta niveles muy altos, comprometiendo así varios tejidos y pareciendo ser la principal causa de la muerte de los camarones. También en M. japonicus infectados por WSSV, la incidencia de la apoptosis se mostró muy alta, resultando en elevadas mortalidades de los animales (Wu y Moroga, 2004). Estas referencias sugieren que en las infecciones virales severas en los camarones, ocurre la inducción de una apoptosis tardía, llevando una fuerte propagación de la progenie viral y resultando en la muerte del camarón por exceso de apoptosis en sus tejidos. Muy recientemente, fueron identificadas y clonadas caspasas en los camarones Penaeus merguiensis (Phongdara et al., 2006) y P. monodon (Wongprasert et al., 2007) y en ambos animales estas proteasas son inducidas durante las infecciones de WSSV. La relación apoptosis-infección viral en camarones será mejor explorada más adelante, en el ámbito del concepto de acomodación viral. Concepto de acomodación viral en camarones Una forma alternativa para enfrentar los brotes virales y el control de infecciones virales en camarones, se refiere al concepto de la acomodación viral propuesto por Flegel en 1998 y recientemente actualizado por el mismo autor (2007). Este concepto propone que los crustáceos se adaptan a los nuevos virus patógenos que surgen, desarrollando una especie de memoria específica que impide el mecanismo de apoptosis inducido por el virus. La propuesta se basa en el hecho que luego de brotes virales graves en los cultivos de camarones, la severidad del problema regularmente se atenúa de forma rápida, en términos evolutivos (cerca de 1 a 2 años) a pesar de haber una alta prevalencia de estos virus en camarones de apariencia saludable. Todo indica que los camarones supervivientes desarrollan una tolerancia a los virus y se vuelven portadores de infección persistente, sin ningún efecto negativo aparente o signo de enfermedad. Esta situación contrasta con el concepto de resistencia viral de los vertebrados, que implica en una eliminación/depuración del agente causante de la infección por los supervivientes que se vuelven resistentes a una nueva re-infección. La condición de tolerancia adquirida por los camarones supervivientes, permanece por toda su vida y es transferida en baja dosis para toda su progenie que también desarrolla infecciones virales persistentes, sin todavía desencadenar la enfermedad. Este concepto encuentra soporte en el hecho de que las infecciones dobles, triples y múltiples son frecuentemente detectadas en camarones de apariencia saludable. Flegel (2007) sugiere que las infecciones persistentes actúan como una especie de “memoria”, que lleva a una disminución específica de la severidad de la enfermedad a través de la reducción de la apoptosis inducida por el virus. Esta hipótesis se basa en el hecho ya mencionado que los niveles de apoptosis aumentan drásticamente en camarones 200

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Inmunología del Camarón

moribundos durante los brotes virales, pudiendo llegar a valores muy altos (hasta 40% de muerte celular, Sahtout et al., 2001) y que la muerte del camarón sería una consecuencia de este exceso de apoptosis. El concepto de acomodación viral propone que el camarón coexiste con los virus sin haber efectos negativos, debido a un proceso combinado virus-hospedero, que comprende la reducción del proceso apoptótico en el hospedero inducido por el virus. Este concepto fue reforzado, al ser evidenciado que los camarones sin signos de la enfermedad, pero con infección viral persistente, no presentan apoptosis en las células infectadas (Wongprasert et al., 2003). Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a la tolerancia a los virus patógenos por el camarón, son todavía desconocidos y probablemente distintos de la tolerancia inmunológica de los vertebrados. Por otro lado, falta también confirmar si esta aparente tolerancia adquirida es efectivamente provocada por una reducción/supresión de apoptosis, o si es debida a otros procesos celulares/moleculares de control viral todavía desconocidos. Otros mecanismos antivirales Además de las defensas antivirales presentadas, otros mecanismos antivirales fueron también descritos en crustáceos, siendo algunos mencionados a continuación. Recientemente, una proteína con propiedad antiviral fue descrita en la hemolinfa de P. monodon y denominada PmAV (Luo, 2003; 2007). La PmAV mostró una fuerte actividad contra el virus de peces SGIV ya mencionado anteriormente, siendo su expresión inducida en respuesta a la infección por el WSSV en P. monodon. Fue también recientemente referenciado, que el silenciamiento del ALF en el cangrejo señal P. leniusculus, vía RNAi, resulta en un aumento significativo de su susceptibilidad al WSSV. Estos resultados resaltan el papel de este AMP de amplio espectro también en las defensas antivirales de crustáceos, todavía de forma desconocida (Liu et al., 2006a). Por otro lado, Pan et al. (2000) reportaron que extractos de varios tejidos de crustáceos (cangrejos y camarones) presentaban actividad antiviral significativas contra diferentes virus de interés médico. Estas moléculas y su mecanismo de acción no son todavía conocidos, así como su papel antiviral en los propios crustáceos. Finalmente, fue descrito recientemente que la hemocianina purificada de la hemolinfa de P. monodon tiene actividad antiviral contra virus de peces (Zhang et al., 2004). Estos resultados, parecen bastante inconsistentes, una vez que la hemocianina es la molécula más abundante de la hemolinfa de los crustáceos, pudiendo representar 90-95% del total de proteínas hemolinfáticas y a pesar de esta abundancia, las infecciones virales ocurren en los camarones. Mecanismos de evasión viral En vertebrados, luego de la entrada de los virus en el organismo, éstos son generalmente reconocidos como partículas extrañas e inician una serie de respuestas inmunológicas que tratan de impedir su entrada en las células, su replicación y su propagación. Luego de su reconocimiento, ocurre en el hospedero una cascada de respuestas celulares y humorales que incluyen la activación de células NK y de linfocitos T citotóxicos (CTLs), la producción de anticuerpos específicos neutralizadores, la producción de varias citocinas señalizadoras, como los IFNs, que interactúan con los linfocitos y suprimen o expanden sus funciones inmunológicas. Los virus pueden utilizar diferentes mecanismos para evadirse de las defensas inmunológicas del hospedero en el caso de los vertebrados, siendo las principales: (1) 201

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la modulación de las funciones del complejo mayor de histocompatibilidad (del inglés, MHC) que presenta los antígenos virales, (2) la inhibición/modulación de diferentes quimiocinas y citocinas señalizadoras incluyendo los IFNs, (3) la evasión de los CTLs y NK, (4) la inhibición de la apoptosis y (5) la interferencia con la vía RNAi (Abbas et al., 2007). En los crustáceos, los mecanismos de evasión viral no son todavía conocidos, aunque deben incluir la inhibición/modulación de varias respuestas inmunológicas como la activación del sistema proPO, la expresión de citocinas implicadas en la respuesta antiviral (todavía desconocida), la expresión de moléculas antivirales como la PmAV y ALF, la expresión de PRPs o otros receptores celulares utilizados en la interiorización del virus y la interferencia con la vía RNAi. Entre los mecanismos de evasión viral en los camarones, los más destacados actualmente son el retardo/supresión del proceso apoptótico en la célula infectada y el silenciamiento de los productos génicos virales, vía-RNAi, como se explicó anteriormente. El conocimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a estos dos procesos que se encuentran en estudio actualmente, deberán proporcionar en un futuro próximo, herramientas útiles para el control de las infecciones virales en los camarones.

6.2

Inmunoestimulantes

El gran interés en compuestos inmunoestimulantes surgió de la necesidad de tratar el cáncer en los humanos, buscando compuestos capaces de activar las células del sistema inmunológico (macrófagos, células NK, linfocitos B y T), para aumentar su capacidad de destruir los tumores. Por otro lado, además de proporcionar una mayor protección contra los tumores, la activación de las células inmunológicas lleva todavía a una mayor resistencia a las infecciones por diferentes microorganismos, como virus, bacterias, hongos y otros parásitos. Sustancias inmunoestimulantes están siendo obtenidas a partir de varias fuentes naturales y también por síntesis química con base en la estructura molecular de los propios productos naturales. Entre estos compuestos, se encuentran muchos derivados de microorganismos o de algas, destacándose los componentes de la pared celular de diferentes bacterias, hongos, microalgas y macroalgas. Los principales principios activos de estos componentes capaces de generar una inmunoestimulación son: fragmentos de peptidoglucanos (PGs), lipopolisacáridos (LPS), lipopéptidos, polisacáridos sulfatados, β-glucanos, acil-oligopéptidos y péptidos bacterianos específicos (revisión de Song y Huang, 2000). Con relación a los camarones, muchas sustancias descritas como inmunoestimulantes han sido utilizadas con el propósito de aumentar la resistencia natural, en vista de la imposibilidad de vacunar estos animales. Sin embargo, existe una falta casi completa de información sobre el mecanismo de acción de estos compuestos a nivel del sistema inmune de los camarones, además de no haber consenso sobre su real eficacia y sobre la reproducibilidad de los resultados. Está bien establecido que la mejor forma de prevenir las infecciones en los cultivos de camarones, depende esencialmente de las buenas prácticas de manejo, que incluyen una buena calidad del agua, adecuada densidad poblacional, buena nutrición y reducción de los factores ambientales potencialmente estresantes (principalmente las variaciones bruscas de salinidad, temperaturas y oxígeno). El uso de sustancias capaces de aumentar la inmunocompetencia de los camarones, en paralelo a un buen manejo

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Inmunología del Camarón

del cultivo, apunta ciertamente como una herramienta promisoria en la búsqueda de una mayor protección inmunológica contra el desarrollo de infecciones. Existe una real necesidad de maximizar la inmunocompetencia de los camarones cultivados, minimizando el uso de agentes terapéuticos químicos, como antibióticos, que contaminan la carne del animal y el ambiente y también inducen el aparecimiento de microorganismos resistentes. Muchas sustancias consideradas inmunoestimulantes han sido utilizadas en los cultivos de camarones, para aumentar su resistencia inmunológica y sería imposible cubrir en este capítulo, la infinidad de referencias que existen a este respecto. Entre los compuestos más utilizados en los cultivos se destacan los β-1,3/1,6-glucanos de hongos o algas, PGs de bacterias Gram-positivas, LPS de bacterias Gram-negativas, polisacáridos sulfatados de algas y algunas proteínas virales (Song y Huang, 2000 y Smith et al., 2003). Entre estos inmunoestimulantes, los β-glucanos son tal vez los más ampliamente utilizados para camarones y los presumiblemente más inmuno efectivos y compatibles con la práctica de la camarinocultura (revisión de Smith et al., 2003). Además de estos compuestos de la superficie de microorganismos y de algas, otros productos también se muestran aparentemente inmuno efectivos para los camarones, como los extractos de diferentes hierbas (Citarasu et al., 2006), bacterinas (bacterias, principalmente vibrios, inactivadas por calor, formol o liofilizadas), probióticos y suplementos nutricionales (astaxantina y ácido ascórbico polifosfatado) (Song y Huang, 2000). Varios de estos compuestos son actualmente vendidos comercialmente, otros están en fase experimental y otros todavía no cuentan con financiamiento para una producción comercial (Smith et al., 2003). Los inmunoestimulantes son usualmente utilizados en los cultivos de camarones sobre formas de baño (inmersión de los animales), como suplemento en la dieta o, más raramente, sobre forma de inyección (aparentemente más eficaz). Se torna evidente, que entre estos métodos, la adición del inmunoestimulante en la ración, es más viable para la utilización en las granjas de cultivo. Las otras dos formas de administración (inyección y baños) son menos viables, pero pueden ser útiles para el tratamiento de larvas y reproductores, o para experimentos en laboratorio cuyo principal objetivo sea comprender el mecanismo de acción de estos compuestos. Se debe resaltar que el efecto inmunoestimulante real de estos productos, es todavía bastante controvertido y poco fundamentado, dado que varios trabajos relatan resultados opuestos sobre el efecto de un mismo inmunoestimulante. Los buenos resultados obtenidos en algunos casos, no son muchas veces reproducibles. Como ejemplo entre muchos, se puede citar el uso de los β-glucanos, que en algunos casos confieren efectos benéficos para los camarones tratados (aumento del desempeño e inmuno estimulación) (Sung et al., 1996) y en otros, no afecta o hasta perjudica a los animales (Schlolz et al., 1999; Sritunyalucksana et al., 1999a). La comprensión del mecanismo de acción de estos productos, es por lo tanto de crucial importancia para que su uso pueda ser efectivamente validado. Otro punto importante que debe ser considerado, es referente a la administración de los inmunoestimulantes en la dieta de los camarones. La cuestión es: ¿Cómo explicar la resistencia de estos compuestos a la digestión por las enzimas del tracto digestivo o su absorción aparentemente intacta por el epitelio/cutícula del intestino para llegar a la hemolinfa a fin de activar el sistema inmunológico del camarón? Alternativamente, ¿existen receptores específicos o moléculas señalizadoras presentes en el intestino/

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cutícula capaces de reconocer específicamente patrones moleculares en estos inmunoestimulantes y transmitir la señalización para la hemolinfa? Debe ser claramente observado, que la búsqueda de una activación de las respuestas inmunológicas en el camarón tratado con inmunoestimulantes, no es deseable como forma de prevenir infecciones. ¿Cual sería el propósito de activar el sistema inmune del camarón, induciendo una lisis y/o degranulación de sus hemocitos, con liberación de todo su arsenal inmunológico en un momento inoportuno, en la ausencia de patógenos? La presencia de tantas moléculas tóxicas potentes, como las quinonas/hemiquinonas y los radicales libres (ROIs y RNIs) en la ausencia de un proceso infeccioso, lleva ciertamente a una sobrecarga energética dispendiosa e inútil para los animales, además de provocar serios daños a sus propios tejidos. Siendo así, las referencias que reportan la activación de estos parámetros hemato-inmunológicos en camarones tratados con diferentes inmunoestimulantes en la ausencia de infecciones, deben ser observadas con reserva. Lo que se busca de hecho en el cultivo de camarones, no es un sistema inmunológico continuamente activado como parece querer ser demostrado en varios relatos, sino un estado de mayor inmunocompetencia de los animales, que les proporcione mayor capacidad y rapidez en la respuesta, cuando se presenta una invasión por patógenos. Otro punto crucial y cuestionable se refiere al momento y al tiempo de la administración de los inmunoestimulantes y al período de protección inmunológica (“memoria”) otorgado. ¿Qué sería lo más apropiado: administrar los inmunoestimulantes desde fases más tempranas del desarrollo de camarones y/o inmediatamente antes de un desafío, o aún luego de iniciado el desafío? Aquí también, muchas publicaciones reportan resultados contradictorios y poco convincentes (Smith et al., 2003). Algunos trabajos muestran que la administración de inmunoestimulantes por períodos prolongados, lleva a un aumento del desempeño de los camarones y a una mayor inmunocompetencia por un cierto período de días (Sung et al., 1994; Takahashi et al., 2000); entre tanto, otros refieren efectos contrarios (Scholz et al., 1999; Chang et al., 2000). En nuestra opinión, lo que sería deseable en la inmunoestimulación, es poder potencializar las defensas naturales del camarón sin costo fisiológico importante, elevando, por ejemplo, el número de células inmunológicas (hemocitos) y modulando los niveles de las moléculas inmuno efectoras e inmuno reguladoras, de forma tal que permita dejar los animales en una condición óptima de inmunocompetencia para reaccionar con eficiencia a una eventual invasión por los patógenos. En este sentido, la posibilidad actual de cuantificar, con precisión, los niveles de expresión de diferentes inmunomarcadores por PCR en tiempo real, deberá traer ciertamente una importante contribución en la evaluación del estado de inmunocompetencia de los animales, mediante el tratamiento con inmunoestimulantes.

6.3

Parametros hemato-inmunológicos como indicadores de salud

Una práctica común, en la medicina humana y veterinaria, es la utilización de parámetros hematológicos y bioquímicos para evaluar las condiciones de salud de los individuos y también para auxiliar en el diagnóstico de diferentes enfermedades. En la camaronicultura, estas herramientas vienen siendo utilizadas como indicadores de salud, a pesar de la gran variedad en los valores de referencia de estos parámetros, en una misma población, sexo y estadio de desarrollo. Los parámetros hemato-inmunológicos más comúnmente empleados en crustáceos son: (1) hemogramas (conteo total y diferencial de hemocitos), (2) tiempo de coagulación 204

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de la hemolinfa, (3) actividad de la enzima PO, (4) índice de fagocitosis, (5) producción de ROIs, (6) actividad antimicrobiana, (7) título hemoglutinante del plasma y (8) concentración de proteínas totales de la hemolinfa. Otros parámetros comienzan a ser implementados como la actividad de la lisozima hemolinfática, la producción de RNIs y la actividad del inhibidor de la proteasa α2M (Tabla 3). Entre los parámetros citados, las alteraciones más evidentes en los animales (principalmente camarones) infectados/estresados se refieren a la modulación del número total de hemocitos o THC (del inglés, total hemocyte count) y la disminución de la capacidad coagulante de la hemolinfa (Lightner, 1996; Lee et al., 1999). Es bien conocido, en la práctica de los cultivos, el aumento en el tiempo de coagulación de la hemolinfa en crustáceos sobre estrés fisiológico o durante infecciones (Jussila et al., 2001; Song et al., 2003). La técnica clásica para evaluar este parámetro, es la obtención de la hemolinfa con un capilar de vidrio (Sarathi et al., 2007) siendo muy simple; si es bien efectuada, puede generar información útil sobre el estado de salud de los animales. Como se explicó anteriormente, el proceso de coagulación envuelve varios factores: la proteína de coagulación, la enzima hemocitaria TGase y la concentración plasmática de Ca2+. No se conoce claramente cual de estos factores es el responsable por el aumento en el tiempo de coagulación en animales estresados/infectados. Los estudios Tabla 3: Principales parámetros hemato-inmunológicos utilizados en la evaluación del estado de salud de camarones y otros crustáceos. Parámetro hemato-inmunológico

Utilidad

Determinación en campo*

Hemogramas

Esencial (muy variables)

Sí

Índice fagocítico

Buena

No

Producción de ROI

Esencial

No

Produción de RNI

Análisis todavía iniciales

No

Núcleos apoptóticos

Buena (para virus)

Sí

Tiempo de coagulación

Buena (para animales muy estresados/enfermos)

Sí

Proteína total del plasma

Razonable (para animales muy estresados/enfermos)

Posible Posible

Actividad de la PO

Esencial (muy variable)

Actividad de otras enzimas/ proteínas (SOD, lisozima, α2M, etc.)

Razonable a buena (muy variable)

No

Actividad antibacteriana

Buena

No

Actividad aglutinante del plasma

Razonable (no varía mucho)

Expresión de proteínas inmunológicas (PCR-tiempo real)

Esencial

Posible No

* Los análisis viables mostrados en esta tabla pueden ser realizados por funcionarios entrenados, de las propias fincas de cultivo, necesitando de infraestructura media (microscopios, espectrofotómetro, reactivos, entre otros). Los análisis que aparecen como no viables necesitan del apoyo de laboratorios externos (equipos y reactivos especiales) con profesionales calificados.

205

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

recientes sugieren que hay una interacción de estos factores. Camarones L. vannamei infectados con TSV tienen una capacidad disminuida de coagulación y presentan una actividad significativamente reducida de TGasa en los hemocitos, además de una caída de 16 a 20% en la concentración de calcio plasmático (Song et al., 2003). El conteo total de hemocitos circulantes (THC), de por sí es uno de los inmunoparámetros más utilizados para expresar las condiciones de salud de los crustáceos. La modulación de la THC es utilizada en diferentes especies sobre condiciones de estrés ambiental y/o fisiológico y durante las infecciones (Rodríguez y Le Moullac, 2000). La THC puede aumentar o disminuir sus valores, dependiendo del tipo y tiempo de exposición a los agentes causantes del estrés. Es común que se observe una disminución de la THC durante las primeras horas de un proceso infeccioso y un aumento del número de células en fases mas tardías (Rodríguez y Le Moullac, 2000). Esta disminución inicial se debe probablemente a una migración e infiltración de los hemocitos en los tejidos infectados, mientras que el aumento posterior probablemente sea debido a la liberación de nuevas células a partir de los órganos hematopoyéticos (van de Braak et al., 2002b). La mayoría de los autores concuerda que un aumento en el THC debe proporcionar una mayor protección de los crustáceos contra infecciones, una vez que los hemocitos son los principales responsables por las diferentes reacciones inmuno-celulares (Jiravanichpaisal et al., 2006) y son los sitios de expresión de las diferentes moléculas inmunológicas (Gross et al., 2001). Curiosamente, la alteración en la proporción de los tipos de hemocitos en crustáceos, no es muy usual durante situaciones de estrés o durante infecciones (Rodríguez y Le Moullac, 2000; Vogan y Rowley, 2002). La producción de ROIs por los hemocitos de crustáceos, medida principalmente por la producción de aniones superóxido (O2-), se ha constituido en uno de los inmunoparámetros más consistentes para evaluar el estado de inmunocompetencia de los camarones. La evaluación de la producción intracelular de O2- por los hemocitos fagocitarios, es usualmente determinada por el método de reducción del NBT, o por la técnica de la quimioluminicencia, utilizando componentes de la superficie de microorganismos, como LPS y ß-1,3-glucanos (laminarina, zymosan, curdlan) para estimulación de los hemocitos in vitro. Este inmunoparámetro es también muy utilizado para evaluar el efecto de sustancias inmunoestimulantes en camarones (Song y Hsieh, 1994; Muñoz et al., 2000; Campa-Córdova et al., 2002 a, b; Hou y Cheng, 2005; Yeh et al., 2006; Fu et al., 2007). La primera referencia de producción de ROIs en camarones, fue publicada por Song y Hsieh (1994) en P. monodon, siendo realizados desde entonces estudios con otras especies, cuyas metodologías fueron adaptadas. Existen sin embargo diferencias fundamentales entre los protocolos experimentales utilizados por los diferentes grupos que estudian los crustáceos, lo que resulta frecuentemente en resultados dispares y poco comparables. Como ejemplo, se puede citar el trabajo de Muñoz et al. (2000) en L. vannamei, que indica un porcentaje muy bajo de estimulación de los hemocitos por el zymosan (30%), luego de 2 horas de incubación, mientras que en nuestro laboratorio ocurre una alta estimulación hemocitaria (80%) en la misma especie, en apenas 15 minutos de incubación con el mismo inductor (Guertler, 2007). En camarones P. monodon (Sung et al., 1996) y L. vannamei (Muñoz et al., 2000) infectados con bacterias del genero Vibrio, se observa un aumento de la producción de ROIs. Apenas las especies V. alginolyticus y V. anguillarum fueron capaces de estimular la producción del anión superóxido, mientras que el V. harveyi no causó ninguna alteración en la producción de este radical (Muñoz et al., 2000), lo que podría explicar la patogenicidad de esta bacteria para los camarones. 206

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Inmunología del Camarón

Con relación a las infecciones causadas por virus, ocurre una disminución significativa en la producción de ROISs en L. vannamei infectados con WSSV, así como la alteración de otros inmunoparámetros como la THC, la actividad fagocítica, la actividad de la PO y la actividad de la SOD (Chang et al., 2003). De manera semejante, infecciones con TSV, también resultan en la disminución significativa de los valores de la THC, la concentración de proteínas totales, de hemocianina, de la proteína de la coagulación y de iones Ca2+ y Cu2+ en el plasma de L. vannamei (Song et al., 2003). Además, la producción de ROIs y la actividad de la PO aumentan en los camarones infectados con TSV (Song et al., 2003). Estos resultados parecen indicar que algunos parámetros hemato-inmunológicos pueden efectivamente reflejar el estado de salud de los camarones. La actividad antimicrobiana de la hemolinfa de los crustáceos viene también siendo utilizada como un potencial inmunoparámetro durante las infecciones y otras situaciones de estrés (Sritunyalucksana et al., 1999a; Tsvetnenko et al., 2001; Vogan e Rowley, 2002). Como se mencionó anteriormente, la mayoría de los AMPs no es constituida por moléculas rápidamente inducidas. Éstas, se encuentran almacenadas en los gránulos de los hemocitos y pueden ser utilizadas intracelularmente o exocitadas mediante estímulos apropiados. Muchas familias de AMPs, pueden ser inducidas en fases más tardías de la infección o pueden ser inhibidas en situaciones de estrés. Como ejemplo se puede citar la inducción tardía de las crustinas y peneidinas, luego de 48 horas de la infección, como se mencionó anteriormente. Siendo así, la modulación de los niveles de AMPs puede también representar un importante inmunoparámetro en el monitoreo del estado de salud de los crustáceos. En relación a la capacidad aglutinante de la hemolinfa, es conocido el hecho que las infecciones y otras situaciones de estrés, pueden resultar en la alteración de los títulos aglutinantes de la hemolinfa de los crustáceos. Como ejemplo, podemos citar, que en P. monodon infectados por Vibrio vulnificus ocurre un aumento de la actividad aglutinante de su plasma (Ratanapo y Chulavatnatol, 1992). Mientras que en las hembras adultas de L. vannamei, sometidas al proceso de ablación unilateral para la maduración ovariana, ocurre una reducción significativa del título aglutinante de su hemolinfa, probablemente en respuesta a esta práctica mutiladora (Maggioni et al., 2004). Es importante resaltar que los niveles de la actividad aglutinante no varían siempre de forma significativa en respuestas a las infecciones o situaciones de estrés. En F. paulensis, por ejemplo, no hubo alteración de los títulos aglutinantes en animales mantenidos a bajas salinidades o luego de la ablación (Perazzolo et al., 2002). Por otro lado, estudios recientes sobre la expresión de una lectina tipo-C de F. chinensis (Fclectin) muestran una super-expresión de esas moléculas luego de 3 a 12 horas de infección con WSSV y bacterias Gram-negativas, respectivamente, sugiriendo que esta lectina sea expresada de manera diferenciada según el agente infeccioso (Liu et al., 2007). La concentración de proteínas totales del plasma de crustáceos es también un parámetro utilizado para evaluar el estado de salud de los camarones. A pesar de este parámetro ser afectado por factores ambientales y fisiológicos (Chen y Cheng, 1995; Rosas et al., 2000; Sánchez et al., 2001) o durante infecciones y lesiones (Hennig et al., 1998; Perazzolo et al., 2002; Vogan y Rowley, 2002), el significado de esta variación necesita ser todavía mejor comprendido. Debemos considerar que el pigmento respiratorio hemocianina representa cerca de 90-95% de las proteínas totales del plasma de crustáceos (Rochude y Fine, 1978) y las fluctuaciones en su concentración se refleja directamente en este tipo de parámetro 207

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

hematológico. A pesar de la hemocianina estar relacionada con la inmunología de crustáceos, una vez que su clivaje pueda generar fragmentos con función de PO o de péptido antimicrobiano, como se mencionó anteriormente, la utilización de los niveles de esta proteína como inmunoparámetro debe ser todavía mejor investigada. La modulación de la actividad de la PO constituye uno de los principales inmunoparámetros utilizados para evaluar el estado de salud de los crustáceos. Sin embargo, la actividad de esta enzima no siempre es alterada en situaciones de estrés o infecciones. Algunas referencias muestran la modulación de la actividad de la PO durante un estrés ambiental y/o fisiológico (Le Moullac y Haffner, 2000; Hsu et al., 2007), o durante infecciones y lesiones (Vogan y Rowley, 2002; Chang et al., 2003; Song et al., 2003; Sarathi et al., 2007). Por otro lado, existen también referencias que muestran que la actividad de la PO no se altera durante las infecciones, como en el cangrejo Cancer pagurus afectado por el síndrome del oscurecimiento de la cutícula (Vogan y Rowley, 2002) y en P. monodon inyectados con componentes de la superficie de bacterias y hongos (Sritunyalucksana et al., 1999a). De forma semejante, la actividad de la PO no mostró diferencia significativa cuando camarones F. paulensis fueron sometidos a un estrés osmótico o luego de la ablación (Perazzolo et al., 2002). Lo mismo fue verificado en hembras de L. vannamei sometidas a la ablación (Maggioni et al., 2004). Recientemente, la utilización de técnicas de biología molecular ha auxiliado de forma crucial la comprensión de las respuestas inmunológicas desencadenadas en crustáceos y los mecanismos relacionados con la interacción patógeno-hospedero, todavía poco conocidos. Estas técnicas relacionan básicamente la identificación y cuantificación de la expresión génica de diferentes moléculas inmunológicas e incluyen en especial: (1) la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, (2) la SSH (del inglés, suppression subtractive hybridization), (3) la DD-PCR (del inglés, differential display PCR) y (4) análisis de cDNA por microarrays. La infección por WSSV, por ejemplo, parece modular la expresión de varios genes en camarones, incluyendo proteínas antimicrobianas y antivirales, transductores de señal intracelulares, componentes del sistema RNAi, factores de transcripción, reguladores de apoptosis, proteasas e inhibidores de proteasas, proteínas de estrés oxidativo y moléculas de adhesión celular (Leu et al., 2007; Robalino et al., 2007b; Zhao et al., 2007). En un estudio con L. vannamei, se verificó la ocurrencia de inducción de la expresión de dos proteínas antibacterianas, la lisozima y el ALF, luego de la infección con WSSV (Robalino et al., 2007b). Mientras que en P. monodon infectado con el mismo virus, se constató el aumento de la expresión de una proteína que se une a la quitina, una peritrofina de matriz (Leu et al. 2007), que parece formar una barrera preventiva contra la invasión por bacterias, virus y parásitos (Lehane, 1997). En un trabajo interesante, se analizó recientemente la expresión diferencial de genes en camarones L. vannamei seleccionados genéticamente, en cuanto a su susceptibilidad y resistencia a la infección por WSSV (Zhao et al., 2007). Varios genes fueron expresados diferencialmente en el hepatopáncreas de los camarones resistentes al WSSV. Hubo una mayor expresión constitutiva de hemocianina, lectinas del tipo C, lisozimas, proteínas apoptóticas, enzimas oxidativas, proteínas reguladoras de la ecdisis, quitinasas, lacasas, catepsina L y zinc-proteinasas, en estos animales en relación a los camarones susceptibles. Es interesante notar que la infección experimental de animales resistentes con WSSV, aumenta mucho más la expresión de algunos de estos genes, relacionados

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Inmunología del Camarón

directa o indirectamente a las respuestas inmunes, como la hemocianina, catepsina, lacasa, lectinas y lisozimas. Infecciones bacterianas también parecen modular la expresión génica de algunas moléculas inmunológicas. Camarones P. monodon infectados con V. harveyi presentaron un aumento en la expresión de lisozima y ALF y una disminución de la expresión de serpinas (Somboonwiwat et al., 2006). Mientras que en juveniles de L. vannamei inyectados con LPS, ocurre una disminución de los niveles de RNAm para varios AMPs (PEN2, PEN3, PEN4 y crustina), siendo esta disminución dosis-dependiente (Okumura, 2007). Contrariamente, la expresión de la proPO no es alterada (Okumura, 2007). Factores ambientales estresantes también pueden modular la expresión de ciertos genes inmunológicos en camarones. La hipertermia parece inhibir la expresión de proPO y lisozima en juveniles de P. monodon, lo que puede implicar una menor resistencia a las infecciones en aguas más calientes (De-la-Vega et al., 2007). La expresión de la lisozima en esta especie, también es inhibida cuando los camarones son sometidos a estrés osmótico. Por otro lado, la hemocianina es súper-expresada en estos animales con estrés osmótico y su expresión es disminuida en condiciones de hipertermia e hipoxia (De La Vega et al., 2007). En resumen, el establecimiento de parámetros hemato-inmunológicos como indicadores de salud en crustáceos y los análisis moleculares de la expresión génica de moléculas inmunológicas, pueden proporcionar en conjunto, informaciones valiosas del estado de salud de los crustáceos cultivados, así como de los mecanismos relacionados en la interacción patógeno-hospedero. A pesar de representar todavía un campo nuevo, esta área merece ser desarrollada y mejor utilizada en la camaronicultura. En los últimos años ha ocurrido un considerable progreso en el estudio del sistema inmune de los crustáceos, a pesar de no contarse todavía con un grupo de parámetros hemato-inmunológicos seleccionados, realmente sensible y de respuesta inequívoca, capaces de expresar con precisión las condiciones de salud de estos animales. Estudios de este tipo deberían ser fuertemente estimulados, en especial para crustáceos de interés económico, que no pueden ser vacunados. Conviene resaltar, que varios factores limitan una interpretación segura e inequívoca de los análisis de los parámetros hemato-inmunológicos en crustáceos. Uno de los principales factores se refiere a las enormes diferencias en los valores fisiológicos considerados “normales” o de referencia para una determinada especie. Estas diferencias están posiblemente relacionadas al tipo de ambiente en los que los animales se encuentran, la salinidad, temperatura, estado nutricional, edad y estados de muda (Noga, 2000). Por otro lado, no existe todavía una estandarización de las técnicas utilizadas para evaluar estos parámetros en crustáceos y esto también lleva a los resultados muchas veces discrepantes lo que dificulta los análisis comparativos dentro de la misma especie o entre especies. Sería de fundamental importancia, buscar una patronización de estas técnicas entre los diferentes grupos de investigación que estudian a los crustáceos, para que se obtengan resultados más homogéneos y comparables.

6.4

Conclusiones y Perspectivas

Como se ha mencionado varias veces, el principal factor limitante que amenaza la sostenibilidad de la camaronicultura a nivel mundial, son las enfermedades y principalmente las de origen viral. Se ha logrado mucho progreso últimamente, en llegar a una mejor comprensión de los mecanismos inmunológicos en crustáceos, destacándose la identificación de varias proteínas de reconocimiento patrón (PRPs), la producción de 209

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varias familias de antibióticos naturales (AMPs) y los mecanismos de defensa antiviral, como la vía RNAi. Falta todavía aclarar muchos otros aspectos importantes, como las bases moleculares de la señalización celular y de la transducción de la señal, así como mecanismos ya razonablemente aclarados en algunos artrópodos como Drosophila y limulídeos, pero prácticamente desconocidos en crustáceos. Las respuestas inmunológicas contra infecciones bacterianas y hongos, ya son relativamente bien conocidas en crustáceos, como la activación del sistema proPO, sistema de coagulación y la producción de ROIs. Por otro lado, la reciente identificación de diferentes AMPs de amplio espectro antimicrobiano, esta abriendo nuevas perspectivas con relación a los programas de selección genética (o transgénesis) de reproductores que expresan preferencialmente determinados tipos de AMPs, así como en el desarrollo de nuevos antibióticos para camaronicultura, capaces de evitar la inducción de resistencia en microorganismos y eliminar el riesgo de contaminación ambiental. En lo que se refiere a las respuestas antivirales, la detección reciente de un sistema RNAi y de citocinas semejantes a interferones en camarones, deberá en un futuro próximo orientar nuevas estrategias de terapia antiviral (basadas en dsDNA, por ejemplo) y en un control más eficiente de infecciones. Paralelamente, una mayor comprensión de los mecanismos de inducción de la apoptosis celular como respuesta a las infecciones virales, permitirá verificar si el concepto de acomodación viral resulta efectivamente de la reducción del proceso de apoptosis en animales con infección viral persistente sin señales de enfermedad, o si este fenómeno se debe a otros mecanismos genéticos/ moleculares todavía no conocidos que podrán ser explorados. Cabe resaltar, que la ausencia de líneas celulares permanentes de crustáceos, limita seriamente la realización de muchos análisis experimentales importantes, en especial los ensayos in vitro de infección y de actividad antiviral. Infelizmente, los esfuerzos para el desarrollo de estas líneas celulares de crustáceos, no han todavía alcanzado el éxito esperado. Se espera que en un futuro próximo esta limitación pueda ser superada y que líneas celulares de crustáceos puedan venir a sustituir definitivamente a las de peces marinos, actualmente empleadas en ensayos biológicos de crustáceos, siendo inapropiadas. La utilización de sustancias inmunoestimulantes para llegar a un estado de mayor inmunocompetencia en crustáceos de interés económico, sobresale como una herramienta valiosa, una vez que estos animales no pueden ser vacunados. Sin embargo, el mecanismo de acción de estos compuestos es todavía pobremente comprendido y su efecto no es siempre reproducible. Se espera que en un futuro próximo la acción inmunológica de estos compuestos sea mejor comprendida y que la camaronicultura pueda contar con una variedad de sustancias inmunoestimulantes realmente eficaces y desprovistas de efectos colaterales. Como se ha mencionado, la evaluación del estado de salud de los crustáceos, a través del examen de su hemolinfa, no suele ofrecer resultados claros y seguros, como ocurre con el examen de sangre de mamíferos. En estos últimos, existe un patrón preciso y confiable de normalidad, asociado con los valores de referencia para los diferentes parámetros hemato-inmunológicos. Contrariamente, en los crustáceos, los valores de referencia de los parámetros hemolinfáticos son de un modo general muy variables, hasta dentro de una misma población, mismo sexo o mismo estadio de desarrollo. Esto dificulta de sobremanera, el establecimiento de índices de referencia o de un patrón de normalidad en crustáceos, aún en el caso de simples hemogramas, tan utilizados en mamíferos. Como consecuencia, la comparación de los índices hemato-inmunológicos 210

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Inmunología del Camarón

de los crustáceos saludables e infectados y/o estresados, no presenta muchas veces significancia estadística, lo que es frecuentemente observado en varias publicaciones. La reciente posibilidad de poder cuantificar la expresión génica de inmunomarcadores en crustáceos a través de PCR en tiempo real, puede ofrecer, a pesar de su alto costo, un cuadro más claro y confiable del estado de salud de los camarones de interés económico durante la aparición de brotes infecciosos o situaciones de estrés. Desde un punto de vista aplicado, el conocimiento del sistema inmune de los crustáceos puede traer importantes subsidios y abrir nuevas perspectivas para: (1) desarrollar técnicas de diagnóstico para diferentes patologías; (2) establecer marcadores inmunológicos que indiquen precozmente la presencia de infecciones o de contaminantes ambientales; (3) desarrollar compuestos inmuno-estimulantes y (4) auxiliar programas de selección genética de reproductores, a través de la identificación de animales más resistentes a las infecciones. Finalmente, vale resaltar, que no existe actualmente ningún genoma completo disponible de algún invertebrado marino. Sería verdaderamente interesante que el camarón L. vannamei pueda ser seleccionado como especie modelo de invertebrado marino para la secuenciación genómica completa, al ver su importancia económica en la camaronicultura mundial.

6.5

Referencias bibliográficas

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211

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Capítulo 7

Buenas Prácticas de Manejo en la Camaronicultura

Capítulo 7 Buenas Prácticas de Manejo en la Camaronicultura

Agnés Saborío Coze y María José Almanza Centro de Investigaciones de Ecosistemas Acuáticos Universidad Centroamericana Managua, Nicaragua

Introducción En el año de 1976 se dio la conferencia técnica de la FAO sobre Acuicultura, la cual fue celebrada en Kyoto, Japón y en el año 2000 se celebró la conferencia sobre la Acuicultura en el Tercer Milenio, en Bangkok, Tailandia. Ambas conferencias trataban de perfilar las oportunidades y funciones de la acuicultura dentro de la sociedad y recomendar estrategias para responder a las expectativas y exigencias de desarrollo sostenible de la acuicultura en los dos o tres próximos decenios. La Conferencia de Kyoto examinó las oportunidades ofrecidas por la tecnología y la ciencia y las posibilidades de establecimiento de redes, desarrollo del capital humano y fortalecimiento institucional para el desarrollo de la acuicultura. Además de estos aspectos, la Conferencia de Bangkok examinó el papel que la acuicultura desempeñará en el contexto general del desarrollo en todos los planos, desde el local al mundial. La Conferencia de Kyoto adoptó dos estrategias amplias: aproximar la ciencia a la acuicultura, sector que era hasta entonces casi exclusivamente tradicional y, ampliar el desarrollo de la acuicultura mediante la cooperación regional. Estas estrategias se tradujeron en políticas e iniciativas de los gobiernos, con asistencia inicial de varios organismos multilaterales y bilaterales. En diciembre de 1997, la FAO realizó la Consulta Técnica sobre Políticas para el Cultivo Sustentable del Camarón en Bangkok, Tailandia. Esta “Consulta de Bangkok” llevó a la reunión de delegados de gobierno y observadores de 12 países de Asia y América, que sumaban cerca de 90% de la producción global del camarón cultivado, a la que también acudieron los principales países consumidores y observadores de cinco organizaciones intergubernamentales y de cuatro organizaciones no gubernamentales (ONGs). La consulta destacó que el alcance de la sustentabilidad en el cultivo del camarón depende de políticas de gobierno efectivas y acciones regulatorias, así como de la cooperación del sector de cultivadores de camarón, utilizando tecnologías apropiadas en su planeación, desarrollo y operaciones. En este sentido, la Consulta consideró pertinente que la FAO realizara reuniones de expertos para elaborar las mejores prácticas (el Reporte de la Consulta Técnica de Bangkok de la FAO se refiere a “buenas prácticas”. El término “Buenas Prácticas de Manejo” (BPM) fue adoptado por la FAO para esta Consulta de Expertos) para el cultivo del camarón y elementos de interés legales y otros instrumentos regulatorios para la acuicultura costera.

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Por otra parte, la Red de Centros de Acuicultura de Asia-Pacífico (NACA), en conjunto con el Banco Mundial (WB), la Fundación Mundial para la Naturaleza (WWF) y la FAO, están implementando un Programa Asociado sobre el Cultivo de Camarón y el Medio Ambiente. Los objetivos centrales del Consorcio son identificar mejores prácticas de manejo para el cultivo del camarón bajo diversas condiciones ambientales, económicas y sociales y, para analizar el costo-beneficio para los camaroneros al adoptar estas prácticas de manera individual y en coordinación con otros granjeros. Se espera que esta información ayude a los gobiernos y al sector privado a desarrollar estrategias de apoyo y medidas de asistencia específica, a fin de auxiliar a los granjeros a sobrellevar los problemas que les impiden la adopción de mejores prácticas de manejo. Estas estrategias pueden conducir a la adopción de códigos de prácticas, mejorando los servicios de extensión, incentivos económicos y otros. El Programa Asociado es tomado de forma primaria mediante una serie de estudios de caso que cubren las principales regiones que producen camarón cultivado. Se han desarrollado lineamientos para el cultivo de camarón y códigos de prácticas, o están bajo preparación, en varios países (ejemplo, Australia, Belice, Ecuador, Malasia, Sri Lanka y Tailandia). En el contexto internacional se ha elaborado un código por parte de una organización industrial, la Alianza Global de la Acuicultura (GAA: Global Aquaculture Alliance), que intenta brindar las bases para un programa futuro de eco-etiquetado. Los lineamientos también están en desarrollo para la producción de camarón producido de manera orgánica. En Nicaragua, el Código de Buenas Prácticas para una Camaronicultura Responsable fue elaborado bajo la Asesoría del organismo certificador Aquaculture Certification Council bajo los lineamientos de la Alianza Global de la Acuicultura. Un área de preocupación especial es el manejo de las enfermedades del camarón. A este respecto, la FAO ha brindado asistencia a varios países miembros sobre manejo sanitario en el cultivo de camarón y ha tomado el liderazgo en conducir revisiones bajo el Programa Asociado. En cooperación con diversas agencias y organizaciones, la FAO actualmente lleva a cabo varios programas cuyo objetivo es desarrollar BPM para el manejo sanitario del camarón en Asia y América. La Oficina Legal de la FAO trabaja actualmente en una encuesta comparativa de las leyes nacionales y regulaciones que rigen el cultivo del camarón. El propósito de ésta es examinar y comparar las legislaciones nacionales relevantes, particularmente los requerimientos legales concernientes al impacto ambiental del cultivo de camarón y las medidas aplicables para el desarrollo de instalaciones en el cultivo de camarón, los controles operativos continuos, los requerimientos legales que aplican a la clausura de actividades y aspectos relativos a la vigilancia de la legislación de importancia. Esta información se espera ayude a identificar buenos arreglos legales e institucionales y los problemas actuales para que los países los adopten. En seguimiento a las recomendaciones de la Consulta de Bangkok y en apoyo a las actividades citadas, se realizó una Consulta de Expertos por la FAO y el gobierno de Australia del 4 al 7 de diciembre del año 2000. Los objetivos fueron: 1. Proporcionar un foro internacional con reconocimiento para la discusión de los aspectos que están relacionados con la promoción de las prácticas sustentables para el cultivo de camarón, así como los relacionados con los instrumentos institucionales y legales.

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Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura

2. Continuar facilitando el proceso de construcción de consenso entre los principales usuarios a quienes interesa el desarrollo y manejo del cultivo del camarón. 3. Identificar/determinar los caminos, así como los beneficios y limitaciones específicos, para el desarrollo e implementación de BPM y Buenos Arreglos Legales e Institucionales (BALIs) (GLIAs Good Legal and Institutional Arrangements), llevando a mejoras en las prácticas de manejo para el cultivo de camarón a niveles de granja e institucionales. La Consulta de Expertos produjo los siguientes resultados:

7.1

•

Un conjunto de BPM “genéricas” que son ampliamente aplicables en el cultivo de camarón en todo el mundo.

•

Lineamientos para el desarrollo e implementación de BPM para situación específica a nivel nacional o subnacional; estos lineamientos podrían referirse a: inter alia, la identificación de temas de situación específica, la metodología para el análisis de costo-beneficio de las BPM, participación de usuarios, etc.

•

Análisis de los problemas para la adopción de BPM y cómo superarlos incluye estrategias para apoyar a los granjeros y organizaciones de granjeros en la aplicación de mejores prácticas de manejo.

•

Un conjunto de BALIs “genérico” que es aplicable de manera extensa en el cultivo del camarón en el mundo.

•

Lineamientos para el desarrollo y aplicación de BALIs de país específico, que tienen en cuenta las condiciones legales e institucionales características de un país.

•

Análisis de las limitantes para la adopción de BALIs y cómo superarlos, incluso las estrategias para apoyar la aplicación de buenos arreglos institucionales y legales.

Código de Conducta para una camaronicultura responsable

Un código de conducta debe establecer los principios y normas internacionales, para la aplicación de prácticas responsables que aseguren la conservación, gestión y desarrollo eficaces de los recursos acuáticos, considerándose el ecosistema y la biodiversidad. El Código de conducta debe reconocer la importancia nutricional, económica, social, cultural y ambiental de la pesca y, los intereses de todos aquellos que se relacionan con el sector pesquero. El Código toma en cuenta las características biológicas de los recursos y su medio ambiente y, los intereses de los consumidores y otros usuarios.

7.2

Objetivos de un Código de conducta Los objetivos de un código de conducta se deben basar en: a. Establecer principios, de conformidad con las normas del derecho internacional pertinentes, para que la acuicultura y las actividades relacionadas con ella se lleven a cabo de forma responsable, tomando en cuenta todos los aspectos biológicos, tecnológicos, económicos, sociales, ambientales y comerciales pertinentes. 229

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b. Establecer principios y criterios para elaborar y aplicar políticas nacionales encaminadas a la conservación, la ordenación y el desarrollo de la camaronicultura de forma responsable. c. Servir como un instrumento de referencia para ayudar a establecer y mejorar el marco jurídico e institucional necesario para la realización de una acuicultura responsable. d. Proporcionar orientaciones que puedan utilizarse, cuando sea oportuno, en la formulación y aplicación de acuerdos internacionales y otros instrumentos jurídicos obligatorios y voluntarios. e. Promover la contribución de la acuicultura a la seguridad alimentaria y a la calidad de la alimentación otorgando prioridad a las necesidades nutricionales de las comunidades locales. f.

Promover la protección de los recursos acuáticos vivos y sus ambientes acuáticos, así como de las áreas costeras.

g. Promover la comercialización de conformidad con las normas internacionales y evitar el uso de medidas que constituyan obstáculos encubiertos a dicho comercio. h. Promover la investigación en el área de la Camaronicultura. i.

7.3

Ofrecer normas de conducta para todas las personas involucradas en el sector acuícola.

Buenas Prácticas de Manejo

Las BPM deben ser una guía de fácil comprensión sobre las actividades específicas a desarrollarse en un laboratorio de larvas, granja camaronera y planta procesadora de camarón y deben estar orientadas de tal manera que sean fáciles de entender, operar y ejecutar, siguiéndose las orientaciones generales contenidas dentro del Código de Conducta. Las BPM están contenidas dentro del Código de Conducta y deben incluir la implementación de mecanismos para una mejora continua, la aplicación de las mejores tecnologías disponibles como una orientación muy general y sencilla, la aplicación y cumplimiento de las normativas ambientales y la responsabilidad empresarial técnica, social y ambiental de cada sector de la industria.

7.4

Características de las Buenas Prácticas de Manejo 1. Son códigos voluntarios de práctica. 2. El grado de especificidad en la aplicación de estas recomendaciones estará determinado por el grado de desarrollo técnico alcanzado por la industria. 3. Están orientadas a guiar y no a restringir arbitrariamente a los productores. 4. Requieren un alto grado de flexibilidad y buen juicio por parte de los técnicos y productores, quienes tienen que reaccionar a constantes cambios ambientales, económicos y condiciones sociales.

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7.5

Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura

Buenas Prácticas de Manejo en Laboratorios de larvas

Las BPM en laboratorios de larvas (Figuras 7.1 y 7.2) deben estar encaminadas a producir postlarvas de alta calidad y libres de enfermedades; para ello, se requieren mayores niveles de higiene, bioseguridad, control y manejo del proceso. Para reducir el riesgo de enfermedades y aumentar la viabilidad de las postlarvas de laboratorio se recomienda: 1. Aislar los reproductores y someterlos a exámenes de laboratorio para asegurar que estén libres de enfermedades (Mancha blanca y otros). 2. Certificar las postlarvas de laboratorio por parte de la autoridad competente. 3. Preferiblemente, realizar los análisis en laboratorios acreditados y que cumplan con todos los requisitos de gestión de la calidad. 4. Utilizar los productos químicos y soluciones internacionalmente aprobados para su uso en la acuicultura y registrados en el país a emplear. 5. Instalar sistemas de desinfección para equipos, materiales y personal que labora en el laboratorio. 6. Tratar el efluente procedente del laboratorio de larvas antes de ser descargado al cuerpo de agua.

7.6

Buenas Prácticas de Manejo en granjas camaroneras

Las Buenas Prácticas de manejo en granjas camaroneras deben estar dirigidas a producir un producto inocuo, a aplicar medidas de bioseguridad durante todo el período de cultivo y a garantizar un buen manejo acuícola y responsable con el ambiente. Las decisiones que afectan al ambiente y a la productividad, son tomadas día a día por individuos con un rango amplio de capacidades técnicas. Por lo que los productores juegan un papel importante en la formulación e implementación de las mejores prácticas de manejo del cultivo. Construcción y Medio ambiente 1. Las granjas camaroneras no deben estar dentro de los bosques de manglar; si son granjas establecidas, se debe contar con un programa de resiembra de manglares en áreas cercanas a las granjas, por lo general deben sembrarse 3 árboles por cada manglar cortado. 2. Identificar una fuente disponible de agua dulce de buena calidad (para beber, procesos sanitarios o para transportarla). 3. El estudio topográfico del sitio deberá revelar las variaciones anuales de las temporadas lluviosa y seca. 4. La planeación se consultará con un ingeniero calificado y un constructor experimentado deberá encargase de la construcción. (Figura 7.3) 5. Los canales de abastecimiento no deberán crear barreras a las corrientes naturales de agua. Si los canales pasan a través de zonas de agua dulce o áreas agrícolas, no deberá haber filtración ni deberán causar la introducción de agua salina. (Figura 7.4) 6. Deberán evitarse las áreas con suelos potencialmente ácidos y con sulfatos.

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7. Los suelos orgánicos no deberán ser usados para la construcción de estanques. 8. Los estanques deberán situarse en terrenos planos con pendientes suaves entre un 2% a un 3% o menos. 9. La orientación de los estanques deberá considerar los vientos predominantes para reducir la erosión. 10. Los puntos de descarga finales deberán estar localizados lejos de los puntos de toma de agua y colocados en áreas donde permita una rápida dilución. 11. Los canales de entrada al sistema de distribución, deberán ser diseñados para permitir que el agua fluya por gravedad. 12. Los bordes deberán ser compactados de acuerdo al tamaño y características de las partículas del terreno, para reducir la erosión, filtración y deslizamiento. 13. Para facilitar la cosecha, deberá ser construida una compuerta de concreto en la parte exterior del borde del estanque, en su parte más profunda. 14. Durante la etapa de construcción, los desechos generados no deben botarse en el bosque de manglar y se debe contar con un plan de manejo de desechos. 15. Cuando sea posible, las estaciones de bombeo deberán estar retiradas de la orilla y con cierta estética. 16. Contar con un sedimentador en las granjas camaroneras para acumular las partículas en suspensión y reducir la descarga de sedimentos al efluente durante los recambios de agua y drenaje de los estanques. 17. El sedimento no deberá contener contaminantes. 18. Se debe mantener la vegetación ribereña y una zona de amortiguamiento. 19. Deberán mantenerse los accesos tradicionales usados por la población del lugar y los corredores de animales migratorios. 20. El tamaño de la granja deberá ser proporcional al abastecimiento de agua y su demanda y a la capacidad estimada del cuerpo de agua receptor para diluir, transportar y asimilar las descargas. 21. Los accesos a rutas terrestres o acuáticas, muelles y áreas de estacionamiento, deberán ser localizados donde sean mitigables los impactos ambientales. 22. Los puntos de descarga finales deberán estar localizados lejos de los puntos de toma de agua y colocados en áreas donde permita una rápida dilución. 23. Las estaciones de bombeo deberán estar localizadas donde la calidad de agua sea máxima y evitando áreas donde pueda ocurrir un daño ambiental. Instalaciones 1. Poseer instalaciones sanitarias de sistema abonera (letrina) con aplicación de cal para los desechos humanos. 2. Las instalaciones sanitarias deben estar situadas lejos de los estanques o de los suministros de agua y se deben someter a mantenimiento rutinariamente para prevenir la posible filtración en los estanques o en los suministros de agua. 3. Poseer vivienda para los trabajadores y que sean adecuadas sanitariamente (Figura 7.5)

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Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura

Figura 7.1. Laboratorio de larvas de camarón.

Figura 7.2. Laboratorio de microalgas.

Figura 7.3. Construcción de estanques de camarón.

Figura 7.4. Canales de drenaje de agua.

Figura 7.5. Instalaciones en una granja camaronera.

Figura 7.6. Preparación de estanques.

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4. Proteger con mallas el área destinada para almacenamiento de alimentos para evitar la entrada de plagas y roedores. 5. Evitar la presencia de animales de corral en la granja camaronera. 6. Evitar las prácticas de proceso al producto cosechado en la granja, dado que no existen las condiciones de manufactura. 7. Los muros deberán tener la altura suficiente para prevenir daños por inundaciones, tormentas y oleaje, pero la parte libre del borde debe permitir que los vientos mezclen las aguas del estanque. 8. Los estanques deberán ser lo bastante someros como para facilitar su manejo y la buena circulación del agua, pero lo bastante profundos como para prevenir el crecimiento de plantas (microalgas). 9. Para controlar el flujo debe instalarse en cada estanque una estructura de alimentación y cosecha. 10. Los combustibles y lubricantes deben ser almacenados y usados de modo que se prevengan derrames. 11. Implementar un plan HACCP en la granja. 12. Los efluentes nunca deberán descargarse en cuerpos de agua dulce o áreas agrícolas. Preparación de estanques Los fondos de los estanques deben ser secados completamente cuando menos después de tres o cuatro ciclos de producción y con más frecuencia si es necesario (Figura 7.6) Densidad de siembra La densidad de siembra debe determinarse con base en la supervivencia y la capacidad de carga. Para estanques semi intensivos sin aireación mecánica, las densidades de carga en la cosecha deberán estar generalmente en el rango de 10 a 15 camarones/m2. Fertilización 1. Los fertilizantes químicos se deben usar solamente cuando sea necesario incrementar la abundancia de fitoplancton. 2. Se debe evitar aplicaciones excesivas de fertilizantes como urea y amonio. 3. Se prefiere el uso de fertilizantes líquidos, pero si se utilizan fertilizantes granulados, asegurarse que sea la dilución correcta. 4. Si es necesario utilizar fertilizantes orgánicos, se debe evitar el uso de estiércol a menos que sea confirmada su calidad. 5. Los fertilizantes deben ser almacenados en lugares limpios y secos, lejos de chispas y se debe evitar su derrame.

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Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura

Encalado 1. La cal agrícola, más que cal viva o la cal hidratada, debe ser utilizada para neutralizar la acidez del fondo. 2. La cal viva y la cal hidratada se usan en el fondo del estanque, sólo cuando es necesario romper los ciclos de patógenos. 3. Las aguas con alcalinidades mayores a 60 mg/L no deben ser encaladas. 4. Los materiales para encalar deben aplicarse uniformemente sobre la superficie del fondo del estanque y arar a una profundidad de 5 a 10 cm. Esto acelera la reacción del material calizo. 5. Los materiales calizos deben ser aplicados de acuerdo con las pruebas de suelo. 6. Los fondos de los estanques con enfermedad deben ser secados dos o tres semanas, tratados con 2 ó 3 toneladas de cal viva por hectárea para elevar el pH y desinfectar el estanque. 7. El uso de los antibióticos y otros agentes debe ser limitado a las ocasiones en que se sospeche la presencia de patógenos que sean susceptibles al producto seleccionado y con base en el criterio de un especialista. 8. Las granjas de camarón deben enfocar sus planes de salud animal en la prevención de enfermedades mediante una buena alimentación, buen manejo de los estanques y reducción del estrés. Manejo del fondo y del sedimento del estanque 1. Después del secado de los estanques, el sedimento acumulado deberá ser regresado a las áreas de donde fue erosionado en el estanque. 2. Los sedimentos deben ser extraídos del estanque solamente cuando sea absolutamente necesario. 3. Si el pH del fondo es menos de 7, se debe aplicar cal agrícola entre cosechas. 4. Los fondos se deben secar por dos o tres semanas con una distancia máxima de tres cosechas. 5. Si los fondos de los estanques que usan aireación mecánica son arados entre cosechas, deben ser compactados antes de llenarlos con agua. 6. Si debe ser extraído el sedimento de los estanques, el material debe ser dispuesto de una forma ambientalmente responsable. Establecer diseños para reducir la erosión. 8. Las zonas de tierra descubiertas, se deben recubrir con zacate o piedra. 9. Los sedimentos de los estanques, canales y pilas de sedimentación, deben ser puestos de vuelta de los lugares de donde fueron erosionados. Equipos y materiales 1. Garantizar que los equipos y materiales empleados en la cosecha sean de un material fácil de lavar para la buena desinfección de los mismos. 2. Controlar que los equipos a utilizar en la cosecha estén limpios y que hayan sido debidamente desinfectados con cloro.

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3. Desinfectar todos los utensilios, equipos e insumos de cosecha. 4. Colocar y almacenar los equipos y materiales debidamente lavados y desinfectados en un área seca y segura. Calidad de agua 1. Clorinar el agua utilizada para el personal y que sea proveniente de pozo. 2. Las aguas de baños, cocinas y otras instalaciones deben ser tratadas en tanques sépticos. Estos tanques deben ser diseñados para que las aguas negras no se filtren al medio y causen problemas ambientales. 3. No mezclar agua dulce de pozo con agua del estanque para mejorar salinidad. 4. Las necesidades de aireación mecánica deberán ser estimadas para que se evite la aireación excesiva. 5. Usar aireadores con buena eficiencia en la transferencia de oxígeno. Deben usarse aireadores grandes (2 HP) porque causan menos erosión por unidad de esfuerzo que aireadores más pequeños. La aireación deberá ser usada durante el ciclo de producción para regular la biomasa del camarón en el estanque (Figura 7.7) 6. Cuando el estanque tiene varios aireadores, deben operar menos aireadores en el día que en la noche. Los aireadores deben ser colocados tres o cuatro metros lejos de los bordes para evitar la erosión. 7. Considerar si el recambio de agua mejorará la calidad de agua del estanque o si deberán ser consideras otras alternativas. 8. El agua debe ser descargada de los estanques tan despacio como sea práctico, para minimizar la erosión. 9. El itinerario de descarga de los estanques debe ser escalonado para minimizar el flujo del agua en los canales de descarga y reducir la erosión. 10. La descarga de agua a través de los bosques de manglar u otras tierras anegadas salobres, debe ser considerada y probada experimentalmente. 11. Reducir el flujo para incrementar el tiempo de retención hidráulica, tanto como sea posible, para incrementar la sedimentación (6 horas según Haws et al., 2001). 12. Implementar monitoreos de calidad de agua dentro de la granja como en el afluente-efluente, para determinar si la implementación de las BPM está dando resultado (Figura 7.8). Insumos 1. Mantener la identificación de la fuente de agua, así como del sistema de drenaje. 2. Mantener actualizada la lista de los proveedores de semilla, alimentos y productos químicos utilizados. 3. Controlar la “semilla” (postlarvas) y el alimento libre de sustancias prohibidas (cloramfenicol, nitrofuranos). Uso de químicos y medicamentos 1. El uso de antibióticos permitidos debe estar sujeto a concentraciones menores a los Límites Máximos de Residuos (LMR) impuestos por naciones importadoras de 236

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Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura

camarón. Los camarones deben ser examinados para determinar la concentración de pesticida, PCBs y metales pesados. 2. El uso de medicinas o químicos deben seguir las especificaciones del fabricante con respecto a la dosis, período de vencimiento, almacenamiento, disposición, manipulación y tiempo de retiro. 3. Contar con procedimientos para la detección de enfermedades de los camarones. Los procedimientos así como los resultados deben quedar documentados y archivados en las granjas camaroneras. 4. Todo medicamento o químico que no se vaya a utilizar o esté vencido, debe ser dispuesto de una manera que no contamine el ambiente. 5. Los medicamentos o químicos deben estar bien etiquetados y almacenados en un sitio seco y seguro. 6. Los trabajadores deben contar con los instrumentos necesarios para aplicar cualquier tipo de químico para que su salud no se vea afectada. 7. No se recomienda el uso de sustancias que contengan Bifenilos policlorinados. 8. Los suplidores de alimentos y postlarvas deben certificar que no se utilizaron medicamentos, antibióticos y/o químicos no permitidos en su producción. 9. El combustible utilizado para las bombas de agua debe ser almacenado y usado de modo que se prevengan los derrames. Los tanques de combustibles deben estar dentro de un área diseñada de tal modo que cuando haya un derrame, el combustible caiga sobre un contenedor que permita recogerlo para ser reutilizado y que no se filtre al ambiente. Control de alimentos y aditivos 1. Usar alimento de alta calidad, peletizado con mínimo de finos y buena estabilidad. 2. El pescado no debe ser usado como alimento. 3. El alimento debe ser guardado en instalaciones frescas, secas y a salvo de plagas (Figura 7.9) 4. Los niveles de nitrógenos y fósforos en el alimento deberán ser tan bajos como sea posible, sin sacrificar la calidad del alimento. Se debe tener precaución porque los límites inferiores de estos elementos no son conocidos. 5. Los alimentos deben ser usados de tal manera que rindan el máximo beneficio a la vez que reduzcan los costos e impactos potenciales. 6. Considerar el uso de bandejas o charolas para monitorear el consumo del alimento por parte de los camarones en cultivo. 7. No alimentar cuando las concentraciones de oxígeno disuelto son menores de 2.5 mg/L. Control de fármacos 1. Mantener actualizada la lista de fármacos utilizados, registrados y autorizados oficialmente en el país.

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2. Utilizar solamente fármacos aprobados por regulaciones nacionales e internacionales para su uso en la camaronicultura. 3. Controlar mediante un programa de residuos, el uso y aplicación de fármacos. Control de contaminantes 1. Monitorear a través de un programa de control, los contaminantes tales como los siguientes metales pesados: Mercurio, Plomo, Cadmio, Arsénico y Cromo 2. Manejar adecuadamente los combustibles, lubricantes, otros. Control de patógenos en el camarón 1. Realizar análisis oficiales de PCR para las enfermedades de declaración obligatoria a la OIE. 2. Sembrar semilla certificada y libre de enfermedades. 3. Eliminar los camarones muertos en las orillas de los estanques. Personal 1. No permitir personas con indicios clínicos de enfermedades infectocontagiosas o con heridas durante la cosecha. 2. Utilizar zapatos y ropa adecuada (botas, gabachas) (Figura 7.10) 3. Facilitar medios de desinfección de manos al personal que labora durante la etapa de cosecha. Cosecha El camarón es un organismo perecedero que si no se trabaja con la temperatura adecuada, puede descomponerse muy rápido. Es por ello que la manipulación durante la cosecha y el transporte debe ser la óptima para evitar daños a la salud humana. 1. El camarón debe ser lavado y enhielado continuamente durante la cosecha. 2. El camarón cosechado debe ir directamente a la planta procesadora. 3. El camarón debe ser cosechado y transportado de una manera que se asegure que la temperatura del tejido, no aumentará entre la cosecha y la entrega en la planta procesadora. 4. Los equipos y los envases usados para cosechar y transportar el camarón, deben estar limpios para prevenir la contaminación (Figura 7.11) 5. Los camarones de estanques diferentes serán identificados por escrito y mantenidos por separado hasta la entrega a la planta procesadora. 6. El camarón cosechado debe recibir un número de lote único que servirá para remontar a los expedientes de la producción correspondiente. 7. Controlar que el agua utilizada en los procedimientos de cosecha sea agua potable, acorde con los estándares internacionales establecidos por FAO/WHO. 8. Controlar que el hielo utilizado en el producto haya sido elaborado con agua potable y que no presente ninguna alteración en sus propiedades físicas.

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Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura

Figura 7.7. Aireadores en estanques de cultivo de camarón.

Figura 7.8. Toma de muestras de agua para análisis de laboratorio.

Figura 7.9. Buenas prácticas en plantas formuladoras de alimento para camarón.

Figura 7.10. Vestimenta adecuada para el personal.

Figura 7.11. traslado.

Preparación del camarón cosechado para su

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9. Controlar que las cestas, tinas o compartimientos para manejar y transportar el camarón, estén limpios. 10. Registrar en formatos los parámetros ambientales y el cloro residual del producto cosechado. 11. Realizar análisis microbiológico oficial al agua y producto dirigidos a la detección de bacterias patógenas (Vibrio, Salmonella, Escherichia coli, etc.). 12. Realizar al producto cosechado análisis oficial de residuos biológicos y de cloramfenicol y nitrofurazonas. Control de plagas Los depredadores pueden crear problemas en la productividad de las granjas camaroneras, ya que pueden entre otros problemas, consumir los camarones, propagar y difundir enfermedades, consumir el alimento de los camarones y, en casos donde los depredadores son caimanes o cocodrilos, se pueden perder vidas humanas. Para controlar a los predadores, se deben utilizar los mecanismos más inofensivos para el ambiente. 1. Utilizar mallas de filtración en las compuertas de entrada y salida. 2. Utilizar apropiadamente los plaguicidas. 3. La depredación por pájaros debe ser minimizada por métodos no letales, si es posible, como ruidos repelentes, luces repelentes. 4. El uso de trabajadores para espantar a los pájaros también es recomendable. Transporte Se debe garantizar un transporte confiable antes del comienzo de la cosecha, se deben utilizar vehículos aislados y cubiertos. 1. Para cada estanque cosechado, se debe registrar: número y fecha del estanque cosechado, área del estanque y fecha de la siembra, número de postlarvas sembradas, fuente de las postlarvas, antibióticos y drogas usados, herbicidas, alguicidas y pesticidas usados, tipo de alimento usado y porcentaje de proteína, tipo y cantidad de fertilizante usado, nombre de la planta procesadora usada para el proceso. 2. Realizar un buen enhielado del producto cosechado, se recomienda la relación hielo–producto de 1:1. 3. Registrar en formatos de cosecha la aplicación de meta-bisulfito en el producto cosechado, se recomienda una dosis de1.5 kg/ 1000 lb de camarón. 4. El producto cosechado enhielado debe ser enviado lo más pronto posible a la planta procesadora. 5. El producto debe ser supervisado para evitar la contaminación química provocada por generadores, camiones, etc., utilizados durante la cosecha. 6. El productor debe mantener controlados los animales y las plagas durante la cosecha, para prevenir la contaminación por suciedad. 7. Los envases asignados para transportar el camarón de la granja a la planta procesadora, no deben tener contacto con el suelo. 240

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Figura 7.12. Selección de producto en planta de proceso.

Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura

Figura 7.13. Producto cosechado.

Figura 7.14. Empacado en planta procesadora.

7.7

Buenas Prácticas de Manejo en plantas procesadoras

Las Plantas Procesadoras deben establecer estándares y principios de HACCP para asegurar que se reducen al mínimo los peligros microbiológicos, químicos y físicos, previniendo así problemas de inocuidad alimentaria. Las prácticas de manejo recomendadas son para asegurar el cumplimiento de estándares de seguridad alimentaria nacionales e internacionales, la trazabilidad del camarón certificado, políticas y condiciones justas y seguras para los empleados de la planta. 1. La producción de un estanque debe ser procesada y empacada por separado (Figuras 7.12, 7.13 y 7.14) 2. Se debe procesar y congelar puntualmente el producto. 3. Todos los productos de limpieza, sanitizantes, desinfectantes, etc. deben ser internacionalmente aprobados para el uso en plantas procesadoras de camarón, utilizados en la manera prescrita y para el propósito señalado. 4. El agua de la descarga debe ser tratada y cumplir con los estándares internacionales. 5. Los desechos sólidos, incluyendo las cabezas del camarón, se deben disponer de una manera aprobada y ambientalmente sostenible. 6. Los empleados deben recibir chequeos médicos. 7. Disponer de equipos y suministros de primeros auxilios para emergencias, así como un plan de acción para las emergencias médicas. 241

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7.8

Referencias bibliográficas

Aquaculture Certification Council, INC. 2007. Código de Conducta Técnico, Social y Ambiental Responsable para la Camaronicultura en Nicaragua. 64 páginas. Bolaños, M. A. 2004. Buenas Prácticas de Manejo en el Cultivo del Camarón Cultivado. Fondo Mundial para la Naturaleza (WWF) PROARCA. 38 páginas. FAO/Gobierno de Australia. 2001. Consulta de Expertos sobre: Buenas Prácticas de Manejo y Buenos Arreglos Legales e Institucionales para el Cultivo Sustentable del Camarón. 77 páginas. Haws, M.C. y C.E. Boyd. 2001. Métodos para mejorar la camaronicultura en Centroamérica. Universidad Centroamérica (UCA). Managua, Nicaragua. 296 páginas. Haws, M.C. C.E. Boyd, B.W. Green. 2001. Buenas prácticas de manejo en el cultivo de camarón en Honduras. Una guía para incrementar la eficiencia y reducir los impactos ambientales de acuicultura del camarón. Coastal Resources Center, University of Rhode Island. Rhode Island. 96 páginas. Naturland. 2002. Naturland Standards for Organic Aquaculture. Naturland, Germany. 20 páginas. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO). 2001. Informe de la Conferencia sobre la Acuicultura en el Tercer Milenio. Bangkok, Tailandia. Saborío, Agnes; et al. 2007. Manual de Buenas Prácticas de Manejo en el cultivo de en Nicaragua. 22 páginas.

Camarón

Saborío, Agnes. 2005. Buenas Prácticas de Manejo. Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos. Universidad Centroamericana, Conferencia Red Vannamei, CYTED. Managua, Nicaragua. 60 páginas.

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GLOSARIO

GLOSARIO Abiótico

Agente no biológico.

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Ácido

Compuesto orgánico o inorgánico que reacciona con un metal desprendiendo hidrógeno; reacciona con una base para formar una sal; se disocia en disolución acuosa dando iones hidrógeno (hidrogeniones); tiene un pH menor que 7 y neutraliza medios básicos o alcalinos aceptando un par de electrones de la base y formando un enlace covalente entre el ácido y la base. Se dividen en ácidos orgánicos e inorgánicos minerales; orgánicos son aquellos que presentan carbono (C) en su estructura

Aflatoxinas

Son toxinas producidas por el hongo Aspergilus flavus.

Agar

Medio de cultivo sólido que se utiliza para el aislamiento de bacterias..

Agente patógeno

Es toda aquella entidad biológica capaz de producir enfermedad o daño en la biología de un hospedero (humano, animal, vegetal, etc.) sensiblemente predispuesto

Agudo

Proceso patológico o aparición de enfermedad que se presenta poco tiempo después de la infección.

Alcalino

Compuesto cuyo pH es superior a 7.

Aldehído

Son compuestos orgánicos caracterizados por poseer el grupo funcional -CHO

Aleatorio

Realizado al azar, sin hacer escogencia o selección de organismos

Alícuota

Es el volumen o cantidad de masa que se va a emplear en una prueba de plataforma o de laboratorio. Se suele medir en mililitros (mL) o gramos diluidos (g).

Aminoácido

Los aminoácidos son los elementos con los que se construyen las proteínas. Son moléculas que contienen un grupo Carboxilo (-COO) y un grupo amino (-NH2) libre.

Anaeróbico

Organismo capaz de sobrevivir, crecer o funcionar en ambientes que no tienen oxígeno.

Anamnesis

Parte del examen clínico que reúne todos los datos históricos de la enfermedad, anteriores al brote en estudio. Es suministrada por el personal técnico de campo o por el granjero.

Antibiótico

Medicamento que se utiliza para tratar una infección bacteriana, y que por su efecto, mata o impide el crecimiento de ciertas clases de bacterias, pero que normalmente es inofensivo para el hospedero.

Anticuerpo conjugado

Anticuerpo marcado con una enzima que le ha sido adherida como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina.

Antiséptico

Son sustancias antimicrobianas que se aplican a un tejido vivo o sobre la piel para reducir la posibilidad de infección, sepsis o putrefacción.

Apéndice

En los artrópodos, se denomina apéndice a las estructuras anatómicas pares formadas por elementos articulados entre sí, que se insertan en todos o algunos de los metámeros del cuerpo

Apoptosis

Función que controla la muerte de las células, de forma programada

Aséptico

Es la “condición libre de microorganismos que producen enfermedades o infecciones”. El término puede aplicarse tanto a situaciones quirúrgicas como médicas. La práctica de mantener en estado aséptico un área, se denomina técnica aséptica.

Atrofia

En términos biológicos consiste en una disminución importante del tamaño de la célula y del órgano del que forma parte, debido a la pérdida de masa celular

Autoclave

Dispositivo que sirve para esterilizar material médico o de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura.

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Bacilo

Son bacterias con forma de bastón cuando son observadas en un microscopio.

Bacterias Gram negativas

Las que se tiñen de rosa o rojo con la tinción de Gram (violeta de metilo-safranina).

Bacterias patógenas

Las que causan enfermedades tanto a los animales, vegetales y al hombre.

Bacterias

Microorganismos unicelulares en forma de filamentos, cocos y estructuras espirales. No poseen clorofila.

Bactericida

Sustancia que tiene la propiedad de destruir las bacterias

Bacteriemia

Presencia de bacterias en la hemolinfa.

Bioensayo

Experimento que se hace utilizando organismos vivos, bajo condiciones y ambientes controlados

Biopsia

Toma y examen de una pequeña parte del tejido o liquido corporal del organismo para completar un diagnóstico sobre su estado de salud.

Biótico

Organismos que comparten un mismo ambiente en un tiempo determinado.

Biotipo

Forma típica de organismos vivos que puede considerarse modelo de su especie, variedad o raza

Brote

Aparición de dos o más casos de una misma enfermedad, en los que se observa una relación con un agente etiológico común, estableciéndose esta relación en términos de tiempo, lugar y tipo de organismos afectados.

Calambre

Proceso de fatiga muscular que implica una contracción rígida del músculo esquelético, producida por un período de hipoxia prolongado.

Calidad del agua

Complejo de variables fisicoquímicas del agua relacionadas con la acuicultura.

Camaronicultura

Cultivo de camarones

Cápside

Estructura proteica formada por una serie de monómeros llamados capsómeros. En el interior de esta cápside se encuentra siempre el material genético del virus.

Cariorrexis

Fragmentación de la cromatina y su distribución por el citoplasma como resultado de la desintegración nuclear.

Cefalotórax

“cabeza” del camarón; estructura que contiene órganos y tejidos propios del tórax y de la cabeza.

Citopático

Efecto dañino o destructivo que un tóxico químico o biológico ejerce sobre las células

Coagulación

Mecanismo fisiológico utilizado por los organismos para evitar perdida de sangre o hemolinfa, mediante la activación de factores que detienen su salida a través de una herida.

Contingencia

Posibilidad de que algo suceda o no suceda.

Control

Muestra que se excluye de un análisis experimental, para que sirva de referencia en la evaluación de resultados de la parte analizada.

Copépodo

Son una subclase de crustáceos maxilópodos de tamaño muy pequeño, muchas veces microscópicos, que se encuentran abundantemente, tanto en agua dulce como salada

Cromatina

Es el conjunto de ADN, histonas y proteínas no histónicas que se encuentra en el núcleo de las células eucariotas y que constituye el cromosoma eucariótico

Cromatóforos

Son células con pigmentos en su interior que reflejan la luz.

Crónico

Se llama enfermedad crónica a aquella patología de larga duración, cuyo fin o curación no puede preverse claramente o no ocurrirá nunca.

Cuarentena

Es la acción de aislar o apartar a animales durante un período de tiempo, para evitar o limitar el riesgo de que extiendan una determinada enfermedad contagiosa.

Glosario

Cutícula

Es la capa más exterior del tegumento, inmediatamente por encima de la epidermis (epitelio cuticular) y segregada por ésta. Es una formación rígida, acelular (sin células), de estructura compleja y compuesta por quitina y calcio entre otras sustancias.

Degradación

Transformación de una sustancia compleja en otra de estructura más sencilla.

Desinfectante

Bactericida y germicida o agente que mata organismos, generalmente microscópicos.

Diagnóstico

Conocimiento y estudio de los signos de una enfermedad, para la determinación del carácter y causa de la misma.

Diagnóstico definitivo o confirmatorio

Conocimiento final sobre la o las causas de una enfermedad, obtenido después de realizar y analizar información histórica y de campo, pruebas de campo y pruebas de laboratorio.

Diagnóstico presuntivo

Es la causa probable de una enfermedad, cuyo conocimiento debe aún profundizarse más mediante pruebas adicionales para llegar a un diagnóstico definitivo o confirmatorio.

Digestión

Proceso de transformación de los alimentos que son ingeridos en sustancias más sencillas para ser absorbidos.

Ectodermis

Es el comienzo de un tejido que cubre las superficies del cuerpo. Emerge primero y forma la capa externa de las capas germinativas.

Ectoparásito

Parásito que vive sobre la superficie del hospedero

Edema

Es la acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o intersticial y también en las cavidades del organismo, debido al incremento en la transudación de los líquidos capilares.

Encapsulación

Formación de una cápsula aislante alrededor de un cuerpo extraño. Se puede dar a nivel celular o tisular

Endémico

Una enfermedad que se presenta sistemáticamente, de manera regular y sin variaciones apreciables de población afectada dentro de un segmento demográfico.

Endoparásito

Parásito que se encuentra en el interior de los animales

Enfermedad

Proceso mórbido definitivo, el cual tiene una cadena de signos característicos que pueden afectar el cuerpo entero o alguna de sus partes y su etiología, patología y pronóstico, pueden ser conocidos o desconocidos

Enfermedad aguda

Aquellas enfermedades que tienen un inicio y un fin claramente definidos. Generalmente son de corta duración, aunque no hay un consenso en cuanto a que plazos definen a una enfermedad como aguda y cual como crónica

Enzima

Son sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas siempre que sea termodinámicamente posible (si bien no pueden hacer que el proceso sea más termodinámicamente favorable). Las enzimas sirven para controlar las reacciones químicas, acelerándolas

Eosina

Es un colorante ácido de color rosado oscuro usado en preparaciones histológicas, cuya propiedad está basada en su polaridad negativa lo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva (alcalinos).

Epicomensal

Parasito que se adhiere a la parte externa de las hospederos, utilizándoles como sustrato

Epidemia

En su definición tradicional, es una enfermedad ampliamente extendida que afecta a muchos individuos en una población.

Epitelio

Es el tejido formado por una o varias capas de células yuxtapuestas que recubren todas las superficies libres del organismo, y constituyen el recubrimiento interno de las cavidades y órganos. Los epitelios también forman el parénquima de muchos órganos.

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Epizootia

Es una enfermedad contagiosa que ataca a un número inusual de animales al mismo tiempo y lugar y se propaga con rapidez. El término epizootia está cayendo gradualmente en desuso puesto que en la actualidad se prefiere el término epidemia.

Epleción

Cantidad de eses que se encuentra en el intestino medio de un camarón.

Esclerotización

Es el endurecimiento y oscurecimiento de la quitina en el exoesqueleto

Especificidad

Capacidad de una prueba de diagnóstico para determinar de confiable un agente infeccioso específico, sin riesgos mayores de reacción cruzada con otro patógeno distinto

Espécimen

Es aquel individuo o parte de un individuo que se toma como muestra, especialmente el que se considera representativo de los caracteres de la población a la que pertenece.

Espermatóforo

Es una cápsula o masa creada por los especimenes macho de varios invertebrados, que contienen espermatozoides, siendo integralmente introducida al órgano sexual femenino durante la cópula.

Esterilización

Procesos físicos o químicos mediante los cuales se elimina el 100% de los microorganismos contaminantes presentes en un sustrato

Estrés

Es toda demanda física o fisiológica que se le haga al organismo. Puede ser causada por enfermedades o ser de origen séptico, nutricional o ambiental.

Estuario

Es la parte más ancha y profunda en la desembocadura de los ríos, en los mares abiertos o en los océanos, en aquellas zonas donde las mareas tienen mayor amplitud u oscilación. La desembocadura en estuario está formada por un solo brazo o curso fluvial muy ancho y profundo, aunque también suele tener a modo de playas a ambos lados en las que la retirada de las aguas permite crecer algunas especies vegetales que soportan aguas salinas.

Etiología

Agente o parámetros que de manera individual o conjunta, causan una enfermedad.

Exoesqueleto

Es el esqueleto externo continuo que recubre toda la superficie de los animales del filo artrópodos (arácnidos, insectos, crustáceos y otros grupos relacionados), donde cumple una función protectora y otra mecánica, proporcionando el sostén necesario para la eficacia del aparato muscular. También se llama exoesqueleto a la base.

Fagocitosis

Es un tipo de endocitosis por el cual algunas células rodean con su membrana citoplasmática a una sustancia extracelular (un sólido generalmente) y la introducen al interior celular. Esto se produce gracias a la emisión de pseudópodos alrededor de la partícula o microorganismo hasta englobarla completamente y formar alrededor de él una vacuola, la cual fusionan posteriormente con lisosomas para degradar la sustancia fagocitada, la cual recibe el nombre de fagosoma.

Fagocitosis

Proceso por le cual un cuerpo extraño o un desecho celular es ingerido por células especiales (fagocito) mediante invaginación.

Farmacoterapia

Tratamiento de las enfermedades mediante fármacos (medicamentos).

Fijación

Preservación de tejidos de un organismo, mediante la inyección y/o inmersión del mismo en una solución que evita cambios autolíticos.

Genoma

Es todo el material genético contenido en las células de un organismo en particular. Por lo general, al hablar de genoma en los seres eucarióticos nos referimos sólo al ADN contenido en el núcleo, organizado en cromosomas.

Giemsa

Es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos y otro tipo de muestras biológicas, que permite la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial.

Glutaraldehido

Fijador utilizado para microscopía electrónica de transmisión

Gram

Coloración para diferenciar bacterias.

Glosario

Hematopoyético

Proceso de formación de las células sanguíneas.

Hematoxilina

Materia colorante del palo campeche muy utilizada en histología.

Hemocele

Canales intersticiales a través de los cuales circula la hemolinfa Irrigando los órganos y tejidos del cuerpo del camarón.

Hemocitopenia

Disminución en el número de hemocitos circulantes

Hemocitos

Células plasmáticas de los crustáceos (como el camarón), encargadas de funciones relacionadas con el sistema inmune

Hemograma

Determinación del número total o diferencial de hemocitos en un camarón

Hemolinfa

Tejido sanguíneo de los camarones que irriga los órganos y tejidos llevando oxígeno y nutrientes

Hepatopáncreas

Glándula digestiva del camarón, encargada de producir enzimas y hormonas, principalmente.

Hiperplasia

Es el aumento de tamaño de un órgano o de un tejido, provocado debido a que sus células han aumentado en número. Puede producirse en los tejidos cuyas células se pueden multiplicar.

Hipertrofia

Es el nombre con que se designa un aumento del tamaño de un órgano cuando se debe al aumento correlativo en el tamaño de las células que lo forman; de esta manera el órgano hipertrofiado tiene células mayores, y no nuevas.

Hipoxia

Es un trastorno en el cual el cuerpo por completo (hipoxia generalizada), o una región del cuerpo (hipoxia de tejido), se ve privado del suministro adecuado de oxígeno.

Histología

Es la ciencia que estudia todo lo referente a los tejidos orgánicos su estructura microscópica, su desarrollo y sus funciones. La Histología se identifica a veces con lo que se ha llamado anatomía microscópica.

Histopatología

Estudio de las lesiones celulares y tisulares mediante el uso de la histología

Hospedero

Es aquel organismo que alberga a otro en su interior o lo porta sobre sí, ya sea un parásito, un comensal o un mutualista.

Hospedero definitivo

Designa un ser vivo que es imprescindible para el parásito ya que este desarrollará principalmente su fase adulta en el anfitrión.

Hospedero intermediario

Designa a un hospedador igualmente imprescindible en el ciclo vital del parásito, donde este desarrolla alguna o todas las fases larvales o juveniles. A veces se confunde con el término vector y se considera como hospedador intermediario al invertebrado que participa en el ciclo vital, siendo en muchas ocasiones el hombre y los vertebrados los anfitriones intermedios, y los invertebrados los definitivos.

Huésped

Agente invasor que vive a expensas de un hospedero, parasito externo (ectoparásito) o parasito interno (endoparásito).

In situ

Que se realiza en el mismo sitio.

Infección

Estado o condición en que el cuerpo o una parte de éste es invadido por un agente infeccioso, como bacterias, virus u hongos La infección no implica necesariamente que el organismo esté enfermo, puesto que enfermo se refiere a mostrar signos clínicos.

Infestación

Es la invasión de un organismo vivo por agentes parásitos externos (piel), es decir, ectoparásitos. El término infección debe restringirse a la acción de bacterias , virus y parásitos internos (endoparásitos) mientras que infestación puede utilizarse para otros patógenos y especialmente para parásitos externos (ectoparásitos)Hongos, Artrópodos, Nematelmintos.

Infiltración hemolítica

Migración de hemocitos a un tejido en donde hay presencia de un agente patógeno.

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Inflamación

Reacción de los tejidos a daños caracterizados por tumefacción, enrojecimiento y dolor; se manifiesta por dilatación, hiperhemia, acumulación de hemocitos, exudación del fluido y depósito de fibrina.

Inmune

Protegido contra ciertas enfermedades

Inmunología

Es una rama amplia de la biología y de las ciencias biomédicas que se ocupa del estudio del sistema inmunitario en todos los organismos, entendiendo como tal al conjunto de órganos, tejidos y células que en los vertebrados o invertebrados tienen como función biológica el reconocer elementos extraños o ajenos dando una respuesta inmune.

Integumento

Es el sistema orgánico más extenso de un animal ya que lo recubre por completo, tanto externamente, como numerosas cavidades internas. Su función es la de separar, proteger e informar al animal del medio que le rodea; en ocasiones actúa también como exoesqueleto.

Intracitoplasmático

Cuya ubicación es dentro del citoplasma.

Invaginación

Es doblar hacia adentro los pseudópodos luego de estar envuelto en un cuerpo extraño. Esto ocurre en las células. Como ejemplo tenemos las crestas mitocondriales.

Lamela

Ramificación secundaria de los branquias de los camarones.

Larva

Animal en estado de desarrollo, cuando ha abandonado las cubiertas del huevo y es capaz de nutrirse por sí mismo o de su vitelo, pero aún no ha adquirido la forma y la organización propia de los adultos de su especie.

Larvicultura

Fase del cultivo de camarón relacionado con el desarrollo de larvas y postlarvas.

Lesión

Daño o detrimento corporal causado por una herida, un golpe o una enfermedad.

Letargia

Condición presente en varias enfermedades nerviosas, infecciosas o tóxicas, caracterizada por un estado de somnolencia profunda y aletargamiento. Conduce en camarones a perdida del reflejo de huída

Lipopolisacárido

Azúcar propio de la membrana celular de las bacterias.

Lisis

Ruptura de las células a causa de agentes químicos o físicos

Macerado

Es un proceso de extracción sólido-líquido. El producto sólido (materia prima) posee una serie de compuestos solubles en el líquido extractante que son los que se pretende extraer.

Macroscópico

Hallazgo que se puede observar a simple vista

Maduración

Término utilizado en camaronicultura para hacer referencia a los procesos de manutención de reproductores en cautiverio y obtención de larvas de camarón a partir de cruces controlados o indiscriminados entre éstos.

Melanina

Pigmento de color negro o pardo negruzco en forma de gránulos que existe en el protoplasma de ciertas células de los vertebrados; en invertebrados es producto de la activación del sistema inmune (cascada proPO) y se da para encapsular a un agente agresor (melanización).

Metabolismo

Es el conjunto de reacciones y procesos físico-químicos que ocurren en una célula. Estos complejos procesos interrelacionados son la base de la vida a nivel molecular y permiten las diversas actividades de las células crecer, reproducirse, mantener sus estructuras, responder a estímulos, etc.

Microbiología

Ciencia que estudia los microorganismos y su organización.

Microscópico

Es un objeto que por su tamaño, es imposible verlo a simple vista, se necesitan aparatos como microscopios para poder verlo o detectarlo.

Micrótomo

Es un dispositivo mecánico que permite la elaboración de cortes finos de muestras para su observación al microscopio.

Glosario

Muda

Desprendimiento periódico de la cubierta externa, como el exoesqueleto en Artrópodos (camarones, cangrejos, langostas), para permitir el crecimiento (aumentar en tamaño) de los tejidos blandos internos. Después de la muda, los especimenes son especialmente vulnerables a la depredación.

Mysis

Estado intermedio de larva pelágica entre la protozoea (zoea) y los estados de postlarva.

Nauplio

Primeros estados larvales de un crustáceo; exhibe el tipo más simple de región anterior con tres pares de apéndices, primera antena unirrama, segunda antena birrama y mandíbulas. Aunque la larva nauplius es típica, no aparece en todos los crustáceos. Es común en las formas inferiores, pero en muchas de las formas superiores ocurre durante el desarrollo en el huevo, y los juveniles eclosionan ya diferenciados y larvas más avanzadas

Necrobiosis

Muerte natural y fisiológico del los célula de un organismo, por envejecimiento de las mismas.

Necrosis

Es la muerte patológica de un conjunto de células o de cualquier tejido del organismo, provocada por un agente nocivo que ha provocado una lesión tan grave que no se puede reparar. Una vez que se ha producido y desarrollado la necrosis, es irreversible.

Nódulo

Pequeña protuberancia situada en diversos tejidos.

Nucleocápside

Material genético envuelto en su cápside. La cápsida o cápside vírica es una estructura proteica formada por una serie de monómeros llamados capsómeros. En el interior de esta cápside se encuentra siempre el material genético del virus. Puede estar rodeada por una envoltura. Cada capsómero puede estar constituido por una o varias proteínas distintas.

Osmorregulación

Capacidad de los seres vivos para mantener en sus tejidos y fluidos corporales una determinada presión osmótica, mediante un proceso fisiológico que regula el equilibrio del agua y los electrolitos.

Patogénesis

Origen y evolución de una enfermedad con todos los factores que están involucrados en ella.

Patogenicidad

Capacidad de un agente patógeno, de causar daño en órganos y tejidos.

Patógeno

Es toda aquella entidad biológica capaz de producir enfermedad o daño en la biología de un hospedero (humano, animal, vegetal, etc.) sensiblemente predispuesto. El mecanismo de la patogenicidad ha sido muy estudiado y tiene varios factores, algunos de los cuales son dependientes del agente patógeno y otros del hospedero.

Patognomónico

Signo clínico que caracteriza y define una determinada enfermedad, diferenciándolo del resto de patologías

Patología

Es la parte de las ciencias médicas, humanas y animales encargada del estudio de las enfermedades en su más amplio sentido, es decir, como procesos o estados anormales de causas conocidas o desconocidas.

Patólogo

Especialista en patología o enfermedades.

Penaeido

Nombre común para los miembros de la familia de crustáceos Penaeidae, comúnmente denominados camarones o gambas. Un cultivo económicamente importante originario de aguas marinas y salobres de áreas tropicales o subtropicales. Ciclo vital caracterizado por varias etapas iniciales del desarrollo de las cuales nauplios (5 etapas sucesivas), zoea (3), mysis (3) y postlarva (hasta 22).

Pereiópodos

Apéndices motrices (“patas”) de los camarones utilizados para caminar sobre superficies sólidas; debido a que el camarón tiene 10, se le llama decápodo.

Picnosis

Compactación de la cromatina nuclear como parte del proceso de necrosis (muerte celular)

Polisacáridos

Son biomoléculas formadas por la unión de muchos monosacáridos. Se encuadran entre los glúcidos, y cumplen funciones diversas, sobre todo de reserva energética y estructural.

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Postlarva

Estado que ocurre después del estado larval, parecido al juvenil pero aún le faltan algunas características. Para crustáceos el estado siguiente a la metamorfosis de larva zoea a juvenil. En camarones penaeidos, normalmente se cuentan los días después de la aparición de las características de postlarva. Ej., PL12 indica que la postalarva ha vivido 12 días desde su metamorfosis desde el estado de mysis.

Post-mortem

Cambios naturales que ocurren a nivel bioquímico y morfológico en un organismo después de su muerte

Postmuda

Fase del proceso de muda de los crustáceos que sigue a la ecdisisi o “muda”

Prevalencia

Es la proporción de individuos de un grupo o una población que presentan una característica o evento determinado en un momento, o periodo de tiempo (“prevalecía de periodo”), determinado.

Primers

Indicadores, fragmentos de ADN usados en biología molecular.

Probiótico

Microorganismos vivos presentes en un alimento que permanecen activos en el intestino y ejercen importantes efectos fisiológicos. Ingeridos en cantidades suficientes tienen efecto muy beneficioso, como contribuir al equilibrio de la flora bacteriana intestinal del hospedero y potenciar el sistema inmunológico. Son capaces de atravesar el tubo digestivo, recuperarse vivos en las heces y adherirse a la mucosa intestinal. No son patógenos.

Profilaxis

Procedimientos que buscan prevenir una infección.

Pseudópodos

Elongaciones de la membrana de las células que se asemejan a “extremidades”.

Quitinosis

Melanización multifocal de la cutícula de origen bacteriana.

Repleción

Cantidad de heces que se encuentran en el intestino medio de un camarón.

Respiración

Se entiende al proceso fisiológico indispensable para la vida de organismos aeróbicos, consistente en capturar O2 del medio y en eliminar CO2.

Sensibilidad

Capacidad de una prueba de diagnóstico para detectar un agente (microorganismo) de interés que está presente en mínimas cantidades en una muestra.

Septicemia

Síndrome clínico caracterizado por un proceso infeccioso severo que incluye la invasión del sistema sanguíneo (hemolinfa) por los microorganismos patógenos.

Séptico

Que produce putrefacción o es causado por ella, por presencia de bacterias.

Signo

Se entiende por signo clínico a cualquier manifestación objetivable consecuente a una enfermedad o alteración de la salud, y que se hace evidente en la biología del organismo enfermo.

Síndrome

Es un cuadro clínico o conjunto sintomático con cierto significado y que por sus características posee cierta identidad; es decir, un grupo significativo de síntomas y signos, que concurren en tiempo y forma, caracterizando un estado morboso determinado o enfermedad.

Síntoma

Es la referencia subjetiva que da un organismo enfermo por la percepción o cambio que puede reconocer como anómalo o causado por un estado patológico o enfermedad.

Sistémico

Enfermedad que se encuentra en todo el cuerpo.

Sonda genética

Fragmento de ADN que es complementario a una parte del genoma de un organismo y es utilizada para la detección genómica de dicho organismo en una muestra.

Taxonomía

En su sentido más general, la ciencia de la clasificación. Por lo general, se emplea el término para designar la taxonomía biológica, la ciencia de ordenar a los organismos en un sistema de clasificación compuesto por una jerarquía de taxones anidados.

Tóxico

Es toda sustancia química que, administrada a un organismo vivo, tiene efectos nocivos. El estudio de los venenos es conocido como toxicología.

Transmisión horizontal

Forma de transmisión de un a enfermedad mediante el canibalismo entre organismos o ingesta de alimento infectado.

Glosario

Transmisión vertical

Transmisión de una enfermedad de padres a sus progenitores.

Trófico

El lugar que ocupan los seres vivientes en una cadena alimentaría.

Trofozoito

Es la forma vegetativa activada que se alimenta -generalmente por fagocitosis- y se reproduce, a diferencia del quiste, el cual es la forma vegetativa infectante y de resistencia, en el ciclo de vida de los parásitos protozoarios, como los gregarinas.

Urópodos

Son la parte final del cuerpo de los crustáceos; están a continuación del abdomen o pleon y normalmente son laminares o aplanados, presentando forma de abanico por lo que se le denomina abanico caudal.

Vacuolas lipídicas

Glóbulos de grasas almacenados en el hepatopáncreas de crustáceos y utilizados como reserva de energía.

Vibriosis

Enfermedad bacteriana causada por especies del género Vibrio, que afecta a los crustáceos y que es favorecida en condiciones de estrés.

Viremia

Condición donde virus entran al torrente sanguíneo (hemolinfa) y logran así una fácil diseminación por todo el organismo.

Virión

Partícula vírica morfológicamente completa e infecciosa.

Virulencia

Designa el carácter patogénico, nocivo y violento de un microorganismo, como una bacteria, hongo o virus, o en otras palabras, la capacidad de un microbio de causar enfermedad. Virulencia deriva del latín virulentus que significa «lleno de veneno».

Virus

Es una entidad biológica capaz de autorreplicarse utilizando la maquinaria celular. Es un agente potencialmente patógeno compuesto por una cápside (o cápsida) de proteínas que envuelve al ácido nucléico, que puede ser ADN o ARN.

Zooplancton

Es la fracción del plancton constituida por seres que se alimenta de materia orgánica ya elaborada, por ingestión. Está constituido por protistas diversos, fagótrofos que engloban el alimento fagocitándolo. También por larvas de esponjas, gusanos, equinodermos, moluscos, crustáceos y de otros artrópodos acuáticos, así como pequeño

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