Parasitologia Diagnostico en Perros y Gatos I

Clinical Handbook Series

Nestlé Purina PetCare Company Checkerboard Square St. Louis, Missouri

Parasitología: Diagnósticos en perros y gatos Dwight D. Bowman, MS, PhD Elizabeth A. Fogarty, BA

Clinical Handbook Series

Publicado por The Gloyd Group. Inc. Wilmington, Delaware ©2003 por Nestlé Purina PetCare Company Todos los derechos reservados. Impreso en Argentina Nestlé Purina PetCare Company: Checkerboard Square. St. Louis, Missouri, 63188 Primera impresión 2003

Este libro está protegido por las leyes de propiedad intelectual. ISBN 0-9678005-9-5 Parasitología: Diagnósticos en perros y gatos Dwight D. Bowman, MS, PhD Elizabeth A. Fogarty, BA Clinical Handbook Series

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Contenido Introducción

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Parte I Capítulo 1: Análisis de materia fecal Frotis fecal directo Flotación con sulfato de zinc Métodos de flotación estacionaria Flotación centrífuga de azúcar Análisis de sedimentación Aparato de Baermann Pruebas de antígenos fecales Métodos de cultivo de materia fecal

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Capítulo 2: Muestras de orina

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Capítulo 3: Muestras de sangre Preparación húmeda para Microfilarias y Tripanosomas Técnica de Knott Técnicas de membrana Equipos para pruebas de antígenos Frotis de sangre teñida

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Capítulo 4: Muestras de tejido Raspaje de piel Frotis de piel y aspirados de médula ósea

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Parte II Capítulo 5: Parásitos detectados en las heces — Estudio de casos

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Capítulo 6: Parásitos detectados en la orina — Estudio de un caso

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Capítulo 7: Parásitos detectados en la sangre — Estudio de casos

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Capítulo 8: Parásitos detectados en muestras de tejido— Estudio de casos

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Parte III Glosario Lecturas sugeridas Índice de figuras

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Introducción Los veterinarios en su consultorio hacen exámenes de rutina de muestras de materia fecal, orina, sangre y tejidos para detectar parásitos y diagnosticar parasitosis en perros y gatos. Sin embargo, no hay un solo método que sea apropiado para todos los tipos de parásitos. Por ejemplo, si bien un frotis fecal directo puede ser el mejor método para detectar los trofozoitos de ciertos flagelados, con frecuencia este método no tiene la sensibilidad suficiente para detectar el extraño huevo de helminto que puede estar presente. Una muestra de sedimento de orina teñido probablemente no sea la mejor forma de detectar los huevos de distintos helmintos que pueden estar presentes en el tracto urinario porque existen altas posibilidades de que los huevos no se adhieran al portaobjetos durante el teñido. De manera similar, el teñido de portaobjetos con material de lavado traqueal puede no ser la mejor forma de determinar si hay larvas de Metastrongylidae o huevos de Paragonimus en la muestra, mientras que el examen directo del sedimento es más probable que de resultados positivos. Cuando se conservan las muestras, la densidad flotante de los huevos con frecuencia cambia y, por lo tanto, la misma prueba que funciona bien en heces frescas puede resultar inapropiada en materia fecal conservada.

Cryptosporidium o larvas de Mesocestoides, pero, la mayoría de las veces, las parasitosis pueden desaparecer con relativa facilidad. El diagnóstico correcto permite administrar a tiempo un producto que curará a la mascota de su infección. Existen dos tipos de exámenes parasitológicos: aquellos que se realizan como parte de un examen físico de rutina y aquellos que se realizan porque se sospecha de un agente o tipo de agente específico. Cuando se realiza un análisis de materia fecal como parte de un estudio físico de rutina, se elige una técnica que de resultados uniformes y confiables para la mayoría de los parásitos más comunes. Se utilizan técnicas especiales cuando existe la necesidad de buscar una causa subyacente de una enfermedad inesperada o para verificar una sospecha clínica en base a un examen clínico u otros métodos diagnósticos como las radiografías. Los métodos especializados, como por ejemplo los cultivos de sangre y cultivos de piel o las biopsias de médula ósea para detectar infecciones causadas por flagelados, a veces los utilizan los laboratorios especiales. Estas pruebas no se tratarán en detalle en este manual porque se asume que la mayoría de dichas muestras serán entregadas después de consultar con el laboratorio que realiza la prueba.

Un diagnóstico parasitológico es de gran ayuda porque por lo general significa que se puede implementar un tratamiento efectivo. Existen productos comerciales para el tratamiento de la mayoría de las parasitosis y la parasitología es, entonces, uno de los campos en el cual las curas son por lo general directas y simples. Hay excepciones, como por ejemplo las infecciones por Cytauxzoon,

El manual "Parasitología: Diagnósticos en perros y gatos" está dividido en tres partes. La Parte I presenta información básica sobre los diversos métodos disponibles para los veterinarios clínicos y laboratorios para el examen de muestras de materia fecal, orina, sangre y tejido para la detección de parásitos. Se describen los procedimientos paso por paso, incluso los equipos y reactivos necesa-

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rios, para cada una de las técnicas que generalmente se utilizan en veterinaria. Se incluye además, una explicación general de los métodos más especializados que usualmente usan los laboratorios de diagnóstico centralizados, como se mencionó anteriormente. En la Parte II, se presentan casos de estudio que demuestran el uso de las técnicas descriptas en la Parte I en casos clínicos reales. Cada estudio de un caso describe las marcas, la historia clínica, el examen físico, la evaluación inicial y el supuesto diagnóstico y pasa a tratar el plan de diagnóstico y el resultado. En la Parte III se proporciona material de referencia, incluso un glosario de términos utilizados en parasitología, lecturas sugeridas para mayor información e índices de figuras y temas.

es una guía ilustrada de todos los parásitos que pueden aparecer en las heces, la sangre, la orina o los tejidos de los gatos y perros. Para estos detalles, se remite al lector a otras fuentes (ver Lecturas Sugeridas en la Parte III).

Este manual ha sido diseñado para presentar los diversos métodos que se usan y pueden usarse en el laboratorio clínico. No pretende ser una exhaustiva compilación de todas la técnicas posibles. Las técnicas presentadas se describen con detalles suficientes para permitir realizarlas en la mayoría de los laboratorios. La utilidad de muchas de las técnicas se ilustra con una serie de historias clínicas que presentan situaciones en las cuales las diferentes metodologías podrían ayudar en un diagnóstico. Algunas de las técnicas presentadas no serán necesariamente el método preferido por todos los laboratorios o todos los profesores de parasitología. Gran parte de las controversias entre los parasitólogos sobre las diferente técnicas en realidad parecen remitirse a una diferencia en la preferencia personal y los parásitos de rutina que un parasitólogo o un técnico de laboratorio podría buscar en una cierta área geográfica. Este manual no 8

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Parte I

Capítulo 1: Análisis de materia fecal DESCRIPCIÓN GENERAL El análisis de la materia fecal en veterinaria se puede realizar con distintos objetivos. Si el análisis de materia fecal es parte del control de rutina de la mascota, las pruebas adecuadas para lograr este objetivo son: • Frotis fecal directo • Flotación con sulfato de zinc • Métodos de flotación estacionaria • Flotación centrífuga de azúcar Otros métodos, incluso los análisis de sedimentación y el aparato de Baermann se pueden utilizar cuando el análisis de materia fecal se realiza para diagnosticar una presunta parasitosis de cierto tipo. Los diferentes análisis funcionan mejor según cada situación, independientemente de qué tan bien pudiera funcionar la prueba para el diagnóstico de una infección.Algunos laboratorios prefieren los métodos estacionarios para los análisis de rutina. Un veterinario, amigo de los autores, realiza un análisis estacionario de materia fecal al comenzar el exámen clínico de la mascota ya sea con una muestra suministrada por el dueño o tomada durante el exámen. La preparación lleva sólo unos segundos y cuando el análisis está terminado, en aproximadamente 10 o 15 minutos, el veterinario está listo para examinar la muestra con el microscopio delante del dueño. Este veterinario siente que este método compromete al dueño con el tratamiento recomendado para la mascota. Conoce bien su parasitología y reconoce que es posible que pierda algunos parásitos como parte de su diagnóstico: sin embargo, siente que se detectarán parásitos de rutina como helmintos y coccidios que podrían estar presentes y no se preocupa por otros parásitos menos comunes que podrían pasarse por alto en un perro o gato sano. Otros veterinarios no planean tener los resultados del análisis terminado en el momento de la visita de la mascota; en cambio, llaman al cliente después para info rmarle los resultados de la prueba. En estos casos, se pueden usar otros métodos analíticos o el personal técnico puede usar va rios análisis diferentes. Muestras frescas versus muestras fijadas En medicina veterinaria, las muestras de materia fecal frescas, más que las muestras fijadas, por lo general se procesan para exámenes de rutina. En cambio, en medicina de seres humanos, el peligro de infección del personal de laboratorio con los agentes presentes en las muestras ha llevado a fijar la mayoría de las muestras antes de presentarlas. Los agentes infecciosos, como por ejemplo la hepatitis A y otros patógenos como la ameba humana, Entamoeba histolytica, por lo general no están presentes en las muestras provenientes de caninos y felinos; por esta razón, en la medicina veterinaria, aún se procesan las muestras sin

el fijador inicial. Una ventaja del exámen de preparaciones frescas es que los organismos viviente con frecuencia se pueden visualizar por su movimiento. La desventaja es que sin fijador, algunos protozoos se pueden descomponer si no se examina la muestra rápidamente apenas se la recibe. Los huevos y quistes en las muestras de materia fecal fijadas con formol no tienen las mismas características de flotabilidad que cuando no están fijadas con formol. Así, el uso de métodos de sedimentación es mucho más común en los laboratorios de medicina de seres humanos que en los laboratorios veterinarios. Los métodos de sedimentación, como se los describe en los textos de parasitología en seres humanos y luego en este capítulo, son métodos útiles pero tienden a requerir más tiempo para el exámen de la muestra. Por lo tanto, para diagnósticos de rutina con frecuencia se prefieren los métodos de flotación utilizando heces frescas. Pruebas especializadas En la actualidad existen métodos que detectan los antígenos de diferentes parásitos en las heces. Los dos parásitos que se detectan más comúnmente con este método son Giardia y Cryptosporidium. Estas pruebas han sido desarrolladas para infecciones en seres humanos y todavía no están comercializadas en forma directa para muestras de materia fecal de caninos y felinos. Sin embargo, varios laboratorios de diagnóstico de animales usan estas pruebas de rutina que parecen proporcionar resultados adecuados según la verificación interna de los laboratorios que surge de la comparación con métodos de diagnóstico más estándares. Estas pruebas son relativamente costosas y con frecuencia requieren la adquisición de material suficiente para analizar muchas muestras. Por estas razones, con frecuencia se realizan en laboratorios de diagnóstico centralizados. De manera similar, los métodos de rotulación de patógenos con anticuerpos fluorescentes también los usan por lo general los laboratorios centralizados que tienen microscopios de fluorescencia. Al final de este capítulo se explican en detalle las pruebas de antígenos fecales.

FROTIS FECAL DIRECTO El método más rápido para la detección de parasitosis es el frotis fecal salino directo. El término frotis en realidad no es un nombre muy correcto ya que no se hacen frotis de las heces. En cambio, una pequeña cantidad de heces, aproximadamente la que se puede tomar con el extremo de un aplicador de madera, apenas se humedece en una gota de solución salina en un portaobjetos (Figura 1.1). En el caso de heces de perro y gato, hay altas probabilidades de que haya grandes trozos de granos del alimento seco que hayan sido ingeridos por la mascota; estos trozos pueden re-

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tirarse con el extremo del aplicador. Las heces de perros y gatos con frecuencia absorben la humedad de la gota que se colocó en el portaobjetos, por lo tanto puede ser necesario agregar un poco más de solución salina. Colocar la gota al aplicador y dejar que se deslice sobre el portaobjetos con las heces es una de las mejores formas de hacerlo. Por lo general, no hay motivo para hacer estas preparaciones con agua. El objetivo del frotis directo es visualizar trofozoitos vivos y estas etapas habitualmente se lisarán si la preparación se hace con agua en lugar de solución salina. Por supuesto que si el agua es el único medio disponible, puede permitirle al clínico dar un vistazo rápido y detectar altas concentraciones de huevos o quistes que pueden detectarse en muestras con agua. Una vez que se ha desparramado el material en el portaobjetos hasta formar una preparación homogénea y que se han retirado los trozos grandes, se puede colocar un cubreobjetos sobre la preparación (Figura 1.2). Primero, se debe escanear el portaobjetos con un objetivo de 10X o 20X (con práctica, todos los parásitos de los perros y gatos se pueden visualizar con un objetivo de 10X). Luego, se pueden examinar los objetos de interés más de cerca con un alto objetivo seco (40X). El uso de una lente de inmersión en aceite sobre preparaciones húmedas por lo general no resulta satisfactorio porque la preparación es demasiado espesa o porque el material que se encuentra debajo del portaobjetos se mueve por la presión de la lente sobre la superficie del cubreobjetos. La observación con inmersión en aceite es una posibilidad, pero sólo si se sella primero el portaobjetos con esmalte para uñas o parafina derretida. En parasitología humana, las preparaciones con frecuencia se tiñen con yodo, lo cual hace que los núcleos de los trofozoitos sean más fáciles de visualizar ya que los gránulos de glucógeno se tiñen en algunos de los quistes y trofozoitos. En medicina veterinaria, la mayoría de las especies de amebas y otros parásitos protozoos importantes en medicina para seres humanos, por lo general no se observan, por lo tanto el uso de yodo no es necesario y tampoco resulta útil.

Figura 1.1. Los materiales necesarios para realizar un frotis directo son: cubreobjetos de 22 x 22 mm (o de 18 x 18 mm), un portaobjetos para microscopio, un aplicador, heces y solución salina. Siempre es mejor hacer la preparación con solución salina en lugar de agua, de modo que los trofozoitos vivos permanecerán viables y móviles.

FLOTACIÓN CON SULFATO DE ZINC Uno de los mejores medios para observar los quistes de Giardia y diversos huevos de parásitos es con la flotación con sulfato de zinc. Esta técnica tiene la ventaja de ser rápida y relativamente fácil de realizar. Como actualmente se consigue solución de sulfato de zinc ya preparada, la tarea se hace menos onerosa porque no hay que trabajar en la preparación de este reactivo. Una alternativa poco costosa es usar sulfato de magnesio (sales de Epsom) en lugar de sulfato de zinc. Las únicas desventajas con las sales de Epsom son que la solución es un poco más viscosa y que tiende a cristalizarse un poco más rápido durante la observación (Figura 1.3).

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Figura 1.2. Al preparar el frotis directo, es importante colocar una pequeña cantidad de solución salina en el portaobjetos y luego agregar una pequeña cantidad de heces, más o menos del tamaño del extremo del aplicador, aproximadamente 2 mm2. Luego se mezclan las heces con la solución salina y se las desparrama hasta formar una mezcla relativamente clara (A). Si hay sólidos presentes, en especial común cuando se administra a los animales alimento seco, se pueden apartar con cuidado los sólidos a un costado de la gota con el borde del cubreobjetos antes de bajar el cubreobjetos sobre la preparación (B).

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Figura 1.4. Al tomar la muestra de la parte superior del tubo de la centrífuga, se lo debe empujar con cuidado hacia abajo en forma recta a través de la parte superior del líquido y luego se debe tirar en forma recta hacia arriba. En ocasiones, el material que se encuentra en la parte superior del tubo puede ser tan espeso que se parece más a un barro que a un menisco. En estos casos, parte del material se puede trasladar del lateral del loop al portaobjetos.

Figura 1.3. Ya sea que se use sulfato de zinc o de magnesio, o nitrato de sodio, siempre es mejor verificar la gravedad específica con un hidrómetro. El nitrato de sodio se puede adquirir seco en una cantidad pre-medida para flotaciones estacionarias. El sulfato de zinc se puede adquirir líquido con una gravedad específica de 1,18. El sulfato de magnesio probablemente sea la solución para flotación menos costosa, pero algunas sales de Epsom (si bien están graduadas para alimentos y aprobadas para usar como laxante) pueden estar levemente descoloridas o pueden contener algunos sólidos cuando están presente en soluciones de gravedad específica 1,2; la elección de otra marca con frecuencia resolverá estos problemas. (A) Este hidrómetro tiene una escala de 1,000 (gravedad específica del agua) a 1,220. (B) En esta imagen, el menisco se encuentra en 1,200, entre los números 80 (1,180) y 20 (1,220). Este hidrómetro sería inapropiado para verificar una solución azucarada pesada.

Figura 1.5. Cuando se traslada el loop al portaobjetos del microscopio, se lo puede examinar como la simple y pequeña porción tomada con el loop o debajo de un cubreobjetos. La observación de una o dos porciones tomadas con el loop tiene la ventaja de que la muestra no se desparrama debajo de una superficie más grande como ocurre con el cubreobjetos. La desventaja de examinar la porción tomada con el loop es que se puede secar si el examinador tarda demasiado durante la observación.

Cuando se la hace en forma correcta, la centrifugación de sulfato de zinc puede hacerse rápido. Mediante el uso de una centrífuga en la que se puedan colocar seis tubos a la vez (Figura 1.4), es fácil que una persona procese y examine alrededor de 60 muestras por hora con este método. El secreto del análisis rápido es no usar un cubreobjetos durante la fase de observación del exámen. Una vez que uno se ha tomado el trabajo de concentrar los quistes y huevos en un

pequeño círculo de 5 mm, ¿para qué desparramarlos debajo de un cubreobjetos de 22 X 22 mm? La realización de la prueba sin cubreobjetos hace que sea necesario examinar las muestras rápidamente, antes de que se sequen y antes de que los cristales formados a medida que el sulfato de zinc sale de la solución hagan que la observación de las muestras resulte imposible (Figura 1.5). por lo tanto, sólo se puede preparar la cantidad de muestras que una persona puede leer

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en una sola sentada. Con seis muestras, se pueden colocar tres porciones tomadas con el loop en cada portaobjetos, de este modo sólo se necesitan dos portaobjetos cada seis muestras. Si se necesita más tiempo, se puede colocar en el portaobjetos un loop lleno de agua o una gota de solución salina antes de agregar el loop del tubo. Si en último caso se necesita un cubreobjetos, se puede agregar una gota de agua al material que se encuentra sobre el portaobjetos y luego aplicar un cubreobjetos. El loop funcionará mejor si se lo pasa por la llama antes de cada uso (Figura 1.6). La llama asegura que no se arrastre nada entre una muestra y la otra. Mientras se coloca el loop en la llama, puede observarse una acumulación de sulfato de zinc y materia fecal en él que formará una costra. Se puede limpiar el loop sumergiéndolo dos o tres veces en agua, raspándolo con un aplicador o colocándolo más tiempo sobre la llama. Es importante que el loop sea de alambre resistente a las llamas y también que sea lo suficientemente delgado para que funcione bien. Un loop típico de microbiología para placas de agar tiene un alambre muy grueso y el orificio del loop es demasiado pequeño. Los quistes de Giardia flotarán sobre la superficie del sulfato de zinc. Con frecuencia, cuando están presentes en los bordes del material que se encuentra sobre el portaobjetos, aparecerán de un color rosado debido a la aberración esférica causada por la curvatura de la gota sobre el portaobjetos. La presencia de huevos también será obvia sobre el portaobjetos.A medida que se seca el portaobjetos, los quistes colapsan. Un inconveniente del método con sulfato de zinc es que no detecta los huevos más pesados. Por lo tanto, es probable que usando este método no se observen en la muestra los huevos de tenias taeniid y Diphyllobothrium y Spirometra, la mayoría de los trematodos y algunos nematodos, por ejemplo,Trichuris vulpis.

Figura 1.6. El loop utilizado para tomar una muestra de la parte superior de un tubo es más fino que el loop típico que se utiliza en microbiología y tiene un diámetro un poco más grande. Es importante que el loop sea de alambre resistente a la llama, de lo contrario se derretirá. La colocación del loop sobre la llama parece ayudarlo a tomar la muestra del menisco del tubo de la centrífuga. En ocasiones, el loop acumulará una costra de material seco producto de los restos de heces y la colocación sobre la llama que se puede quebrar con cuidado y sacar del alambre con el extremo de un aplicador.

FLOTACIÓN CON SULFATO DE ZINC MATERIALES •Centrífuga común de mesada con rotor de tambor horizontal oscilante y soportes para tubos de 13 X 100 mm • Microscopio binocular compuesto, debe tener por lo menos objetivos de 10 X y 40 X y 10 piezas oculares • Vasos de cartón no encerado o vasos similares de 88 a 120 cm3 (3 a 4 onzas) • Fieltro de doble pliegue • Hidrómetro: rango de gravedad específica 1,000 a 1,300 • Botellas plásticas para lavado • Tubos de centrifuga de fondo redondeado y de vidri o , de 13 x 100 mm • Aplicadores de madera • Portaobjetos para microscopio: de vidrio de 7,62 x 2,54 cm (3 x 1 pulgadas) • Mechero de Bunsen, lámpara de alcohol o encendedor de cigarrillos • Loop de alambre de aproximadamente calibre 28 y loop de 4 a 5-mm

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• Mezclador Vortex • Agua de la canilla REACTIVOS • Solución de sulfato de zinc, gravedad específica 1,18 (aproximadamente 33 g de cristales en 100 ml de agua).Verificar la gravedad específica con un hidrómetro y ajustarla en caso de ser necesario. El sulfato de zinc se puede adquirir ya preparado con una gravedad específica de 1,18. PROCEDIMIENTO 1. Desmenuzar aproximadamente 1 g de la muestra de materia fecal en 5 ml de agua en un vaso de cartón. Esto se puede lograr mezclando en forma manual con dos aplicadores. Si se sostienen los aplicadores con los dedos pulgar e índice, unos ligeros golpecitos con el dedo anular y mayor sobre los aplicadores produce una efectiva acción de mezclado.

2. Filtrar la suspensión de materia fecal a través de dos capas de gasa y pasarla a un segundo vaso de cartón, lavando con un pequeño volumen de agua. 3. Verter el filtrado en el tubo de ensayo. 4. Centrifugar durante 1 minuto a 800g. 5. Decantar el sobrenadante. 6.Agregar aproximadamente 3 ml de solución de sulfato de zinc y volver a suspender con los aplicadores y el mezclador Vortex. 7. Llenar el tubo hasta 1 cm del borde y volver a centrifugar a aproximadamente 800g durante 1 minuto. 8. Sin sacar el tubo de la centrífuga y con un loop de alambre recién colocado en la llama, extraer 1 o 2 loops del centro de la película de la superficie y colocar en un portaobjetos con el número de muestra. 9. Examinar con un microscopio compuesto con magnificaciones de 100X y 400X.

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MÉTODOS DE FLOTACIÓN ESTACIONARIA La flotación estacionaria es un medio por el cual los h u evos y quistes de los parásitos pueden aparecer flotando en la superficie de un medio líquido. El proceso es de simple realización y se lo puede arm a r con materiales del laboratorio o con la adquisición de diversos kits comerciales, como por ejemplo Fec a lyzer® (EVSCO Pharmaceuticals) o Ova s s ay® (Synbiotics Corpora t i o n ) .Todos estos métodos trabajan sobre el mismo principio. Los huevos son más pesados que el agua, p e ro la mayor parte de la materia fecal es más pesada que los huevo s . De este modo, se m e z clan las heces con una solución que tiene una densidad flotante superior a los huevos pero inferior a los otros materiales de las heces. Mediante pru e b a y error se ha demostrado que una gravedad específica de 1,2 es aproximadamente la densidad correcta p a ra lograr una buena separación entre los huevos y los restos en la mu e s t ra de materia fecal. Una solución de material que pesa 1,2 veces el peso de un volumen igual de agua tiene una gravedad específica de 1,2; por lo tanto, 10 ml de agua pesan 10 gramos y 10 ml de una solución con una gravedad específica de 1,2 pesa 12 gramos. E n t re los reactivos comunes que se usan en estas prep a raciones están la sal de mesa (NaCl), el sulfato

de zinc, el sulfato de magnesio y el nitrato de sodio. El primer medio utilizado de rutina para realizar este p rocedimiento fue la sal de mesa saturada (solución salina), que tiene una gravedad específica de aprox imadamente 1,2. La separación por lo general no es tan buena como cuando se usa la centrifugación, pero en general es adecuada para obtener una mu e s t ra bastante limpia. La solución de nitrato de sodio tiene la desventaja que parece cristalizarse levemente más rápido en el portaobjetos que las otras soluciones. La solución de sulfato de magnesio tiene una viscosidad que es levemente superior a la de las otras tres soluciones y entonces es posible que los huevos floten a la superficie más lentamente en este material que en las otras tres soluciones. Los métodos en las dive rsas pruebas pre p a ra d a s (por ejemplo, Fe c a lyzer y Ova s s ay) trabajan sobre el mismo principio. Difi e ren del método descripto en cuanto a que el soporte de la mu e s t ra también funciona como tamiz. En el método Fe c a ly z e r, el tubo en el cual se produce la flotación sirve también como dispositivo de toma de mu e s t ras en el cual el fondo del accesorio de inserción proporciona un medio para medir la cantidad de heces que se introduce en el tubo.

FLOTACIÓN ESTACIONARIA MATERIALES

• Microscopio binocular compuesto: debe tener por lo menos objetivos de 10 X y 40 X y 10 piezas oculares • Vasos de cartón no encerado o vasos similares de 88 a 120 cm3 (3 a 4 onzas) • Fieltro de doble pliegue • Hidrómetro: rango de gravedad específica 1,000 a 1,300 • Botellas plásticas para lavado • Tubos de centrifuga de fondo redondeado y de vidrio, de 16 x 100 mm • Soporte para tubos de ensayo • Aplicadores de madera • Portaobjetos para microscopio • Cubreobjetos de vidrio de 18 x 18 mm • Mezclador Vortex REACTIVOS

• Solución de flotación:

cloruro de sodio saturado (solución salina), sulfato de zinc,

gravedad específica 1,18; sulfato de magnesio, gravedad específica 1,2 o nitrato de sodio, gravedad específica 1,2. PROCEDIMIENTO 1. Desmenuzar aproximadamente 1 g de la muestra de materia fecal en 5 ml de agua en un vaso de cartón. Esto se puede lograr mezclando en forma manual con dos aplicadores. Si se sostienen los aplicadores con los dedos pulgar e índice, unos ligeros golpecitos con el dedo anular y mayor sobre los aplicadores produce una efectiva acción de mezclado. 2. Filtrar la suspensión de materia fecal a través de dos capas de gasa y pasarla a un segundo vaso de cartón, lavando con un pequeño volumen de solución de flotación. 3. Verter el filtrado en el tubo de ensayo, colocar el tubo en el soporte. 4. Llenar el tubo con solución de flotación hasta tener un leve menisco de líquido moviéndose sobre la superficie.

5. Colocar un cubreobjetos en la parte superior del tubo. 6. Dejar reposar el tubo con el cubreobjetos durante 10 o 15 minutos, luego retirar el cubreobjetos y colocar sobre el portaobjetos del microscopio 7. Examinar con un microscopio compuesto con magnificaciones de 100X y 400X.

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Método Fecalyzer El Fecalyzer es un dispositivo de flotación comúnmente usado en muchas prácticas veterinarias (Figura 1.7). El accesorio de inserción verde tiene una porción en el fondo que el cliente puede insertar en las heces de la mascota para tomar una cantidad de heces previamente medida. Luego se puede colocar el accesorio de inserción en el vial blanco con tapa a presión y se lo lleva a la clínica para examinar. La solución de flotación, por lo general solución de nitrato de sodio a una gravedad específica de 1,2, se agrega en la cámara blanca, se reinserta el accesorio de inserción verde y se mezcla por rotación con la solución de flotación. Luego se llena el accesorio de inserción con la solución de modo tal que aparezca un menisco en la parte superior y se coloca un cubreobjetos de 22 x 22 mm en la superficie del menisco. Después de aproximadamente 5 o 10 minutos, se retira el cubreobjetos y se coloca en un portaobjetos de vidrio para examinar la muestra. El accesorio de inserción verde tiene una parte con tejido que evita que las partículas más grandes floten en la superficie e interfieran con el exámen microscópico de la muestra.

Método Ovassay El dispositivo Ovassay Plus Kit es muy similar al Fecalyzer en cuanto a diseño y concepto (Figura 1.8).Al igual que en el método anterior, se agregan heces a un accesorio de inserción central y se mezcla con la solución de flotación, por lo general sulfato de zinc. Se coloca el filtro en el dispositivo y se crea un menisco positivo mediante el agregado de más solución de flotación. Se agrega un cubreobjetos para microscopio en la parte superior del dispositivo y luego se deja que flote el material durante aproximadamente 10 minutos. El accesorio de inserción central tiene una parte con tejido que evita que las partículas más grandes floten contra el cubreobjetos e interfieran con el exámen microscópico de la muestra. Al igual que con el Fecalyzer, la flotación estacionaria tiene la distintiva ventaja de que no requiere una centrífuga para el procesamiento. La desventaja es que el método no permite la recuperación máxima de huevos y quistes de parásitos de la muestra de materia fecal. Sin embargo, para diagnósticos de rutina, ambos análisis son útiles y pueden ayudar en la mayoría de las situaciones clínicas.

Figura 1.7. El Fecalyzer es un dispositivo de flotación estacionaria que ha sido desarrollado para la toma y el procesamiento de muestras de materia fecal. La parte interna se puede usar para tomar una porción de las heces del tamaño apropiado mediante la inserción del extremo en las heces. Luego se puede colocar la muestra en el recipiente exterior y se la lleva a la clínica. En el momento de examinar la muestra, se puede agregar medio de flotación y mezclar la muestra girando el accesorio de inserción dentro del soporte. Luego se llena el accesorio de inserción con solución de flotación de modo tal que se forme un menisco positivo. Un tamiz colocado en el accesorio de inserción evita que las grandes partículas floten en la superficie. Luego se coloca un cubreobjetos de 22 x 22 mm en la parte superior del tubo y se lo deja reposar de 5 a 10 minutos. Por último, se retira el cubreobjetos y se coloca en un portaobjetos para microscopio para determinar qué parásitos han flotado a la superficie.

Figura 1.8. El Ovassay es un dispositivo para recolección y p rocesamiento de materia fecal que se utiliza para realizar una flotación de materia fecal estacionaria. El dispositivo i n t e rno se puede usar para tomar una muestra del tamaño a p ropiado clavándolo en las heces. Luego, el accesorio de i n s e rción se puede colocar en el soporte y llevar a la clínica. En el momento de procesar la muestra, se puede agregar medio de flotación al tubo y mezclar las heces girando el accesorio de inserción dentro del soporte. A continuación, se llena el accesorio de inserción con medio de flotación de modo tal que se forme un menisco positivo. Se coloca un c u b reobjetos de 22 x 22 mm sobre el menisco y se lo deja reposar de 5 a 10 minutos. Por último, se retira el cubreobjetos y se lo traslada a un portaobjetos para microscopio para identificar aquellos parásitos que han flotado a la superf i c i e

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FLOTACIÓN CENTRÍFUGA DE AZÚCAR Los para s i t ó l o gos ve t e ri n a rios en su mayoría prefi eren un método de flotación centrífuga a los métodos estacionarios. Cada técnico pre fi e re dife rentes medios de flotación, p e ro un método que se usa comúnmente es el método de flotación centrífuga de azúcar. Este método tiene la ventaja de que hará que h u evos más pesados floten, lo cual no ocurre con los métodos que emplean dive rsas soluciones salinas (por ejemplo, sulfato de magnesio, s u l fato de zinc, cl o ruro de sodio o nitrato de sodio). La solución de azúcar puede funcionar con flotación estacionaria, pero con frecuencia los huevos y quistes apare c e r á n distorsionados por la presión osmótica causada por el azúcar y la alta viscosidad de la solución re q u i e re que los huevos permanezcan en la solución dura n t e un tiempo mayor antes de que logren llegar a la superficie del tubo estacionari o . Este inconveniente ha sido superado por el uso de centrifugación. La solución de azúcar tiene la desventaja de que puede a t raer moscas y cucara ch a s . Cuando se trabaja al aire l i b re , las moscas se vuelven bastante fru s t rantes ya que se posan y alimentan sobre los bordes de los cub reobjetos en la mu e s t ra fi n a l . Las cucara chas con f recuencia están presentes en los lab o ra t o rios donde se alimentan con los derrames o gotas de restos de mu e s t ras o con el material que queda en los tubos de la centrífuga o en las mismas centrífugas. Para los huevos de parásitos de la mayoría de las especies, la flotación centrífuga de azúcar es un método muy fácil de usar y altamente exitoso. Sin embargo , los huevos de trematodos, como por ejemplo los de Pa rago n i mus y Alaria, con frecuencia colapsarán o se ab rirán y se saldrá su contenido interno, lo cual a veces puede hacer que sean más difíciles de re c o n ocer. Este método es excelente para la demostración de oocitos de la especie Cryptosporidium. Con los mic roscopios que se usan por lo ge n e ral en los consultorios ve t e rinarios, la interacción entre las pro p i e d ades ópticas de la solución y los oocitos hacen que los oocitos parezcan pequeños puntos de color rosado a rojo que flotan en la superficie del azúcar justo debajo del cubreobjetos. Sin embargo, cuando se utilizan microscopios más sofisticados como los que se usan p a ra inve s t i g a c i ó n , el color de los oocitos con frecuencia no se observa porque las correcciones de la aberración esférica en las lentes del objetivo corri gen la propiedad que hace que los oocitos parezcan ro s ados. O t ra ventaja del procedimiento de flotación con azúcar es que los portaobjetos se pueden examinar durante un tiempo una vez que están pre p a rados. Si se evita que los portaobjetos se sequen (colocándolos sobre una toalla de papel húmeda en una caja de Petri) y se los guarda refrigerados, mu chos de estos h u evos se pueden observar con éxito durante unos días. Si se colocan los portaobjetos en un org a n i z a d o r

y se los mantiene fríos, incluso se los puede mandar con hielo para obtener ayuda en el diagnóstico, con frecuencia sin tener pro blemas en ver los parásitos contenidos. Los oocitos de Cryptosporidium tienden a colapsar después de aproximadamente media hora y desapare c e n ; los quistes de Giardia presentes con frecuencia aparecerán colapsados y se necesitará habilidad para identifi c a r l o s , incluso en preparaciones en nu evos portaobjetos y en las mu e s t ras que se han dejado por un tiempo, los huevos de anquilostomas pueden formar embriones, que los hace muy cl a ros y más difíciles de observa r. Sin embargo , los huevos de c á s c a ra dura y los oocitos de coccidios se pueden ve r bastante bien durante va rios días. La solución utilizada para la flotación es una solución de azúcar saturada que tiene una gravedad específica de aproximadamente 1,3. La solución de flotación se l o gra disolviendo azúcar de caña en agua al punto de s a t u ración (Fi g u ra 1.9).

Figura 1.9. Cuando se prepara el azúcar para la flotación, por lo general se necesitan aproximadamente 900 g cada 700 ml de agua ( aproximadamente 1300 g/l). Será necesario agre g a r el azúcar lentamente y disolverla revolviendo. Con frecuencia se puede entibiar el agua para ayudar en la disolución del azúcar, pero se la debe enfriar antes de verificar la gravedad específica con un hidrómetro. A algunos les resulta muy útil p reparar la solución de azúcar en un hervidor doble igual que cuando se hace caramelo. Es buena idea cuando el producto se ha enfriado agregar una pequeña cantidad de formol (10 ml/l) para evitar que el moho crezca en el medio.

Con frecuencia se puede acelerar el proceso pro d uciendo la mezcla con calor, se calienta el agua antes de agregar el azúcar o durante el pro c e s o . Un amigo por lo ge n e ral hace la solución de azúcar en un hervidor doble donde se agrega el azúcar al agua caliente. Si se usa calor, es necesario veri ficar la gravedad

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específica una vez que se dejó enfriar la solución. Si se calienta la solución durante la producción, se puede formar una gran cantidad de cristales a medida que se enfría la solución. Estos pueden quedar en la botella de almacenamiento. Una vez que se preparó la solución, es necesario agregar un conservante para evitar que crezca moho en el agua con azúcar. Generalmente se usan dos conservantes distintos, fo rmol y fenol (ácido carboxíli-

co), y se agregan aproximadamente 5 ml de formaldehído al 37% o 5 ml de fenol licuado a cada litro. La solución de azúcar también se puede conservar mediante autoclave y congelamiento, pero el autoclave puede causar la caramelización del azúcar y oscurecer su aspecto. En las siguientes figuras se describe el procedimiento de flotación centrífuga de azúcar (Figuras 1.10–1.13).

Figura 1.11. Una vez que se decantó el agua del sedimento tamizado y centrifugado, se debe agregar solución de azúcar (aproximadamente 3 a 4 ml) y el sedimento debe quedar suspendido en la solución de azúcar. Es importante que se mezcle bien la muestra y esto resulta más fácil si se usan dos aplicadores. Se puede usar un mezclador Vortex si los aplicadores están insertados en las muestras, pero se puede generar gran cantidad de burbujas de aire si no se tiene cuidado.

Figura 1.10. Mezclar las heces en un vaso pequeño y luego volcarlas sobre una gasa para eliminar los sólidos antes de revolver y mezclar con el azúcar. Algunos técnicos pasan por alto la etapa de tamizado, pero si esto se hace, los sólidos en la muestra final pueden hacer que resulte muy difícil de examinar bajo el microscopio.

Figura 1.12. Una vez que la centrífuga se detiene por completo, se puede levantar el cubreobjetos directamente de la parte superior del tubo.

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Figura 1.13. El cubreobjetos se debe colocar con cuidado sobre un portaobjetos para capturar la menor cantidad de burbujas de aire que sea posible.

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FLOTACIÓN CENTRÍFUGA DE AZÚCAR MATERIALES

• Centrífuga común de mesada con rotor horizontal y soportes para tubos de 16 X 100 mm • Microscopio binocular compuesto: debe tener por lo menos objetivos de 10 X y 40 X y 10 piezas oculares • Vasos de cartón no encerado o vasos similares de 88 a 120 cm3 (3 a 4 onzas) • Fieltro de doble pliegue • Hidrómetro: rango de gravedad específica 1,000 a 1,300 • Botellas plásticas para lavado • Tubos de centrífuga de fondo redondeado y de vidrio, de 16 x 100 mm • Aplicadores de madera • Portaobjetos para microscopio • Cubreobjetos de 18 x 18 mm • Marcador • Agua de la canilla • Agitador magnético REACTIVOS

• Solución de flotación de azúcar: lentamen-

te agregar alrededor de 1000 g de azúcar pura granulada a 1000 ml de agua destilada en un vaso de laboratorio de 4 L sobre un agitador magnético.Verificar la gravedad específica (debe ser 1,300; esto es básicamente una solución saturada).Ajustar, en caso de ser necesario, agregando más agua o más azúcar. PROCEDIMIENTO 1. Con aplicadores (dos funcionan mejor que uno) colocar aproximadamente 1 g de heces en un vaso de cartón. 2. Agregar aproximadamente 8 ml de agua de la canilla y dispersar las heces en el agua vigorosamente con los aplicadores. Puede ser que las heces no se separen rápidamente; de ser así, dejar descansar la muestra durante un corto tiempo para permitir que se ablande. 3. Tamizar el barro fecal pasándolo por un fieltro a un segundo vaso de cartón. 4.Verter el barro tamizado del segundo vaso en el tubo de ensayo de la centrífuga. 5. Centrifugar a 800g durante 1 minuto. 6. Decantar el sobrenadante. 7. Agregar solución de flotación de azúcar a

aproximadamente 1/4 del total y volver a suspender el pellet vigorosamente con dos aplicadores. 8. Después de colocar el tubo en la centrífuga, llenarlo con solución de azúcar hasta que rebalse levemente de modo tal que haya un leve bulto (menisco) en la película de la superficie por sobre el borde del tubo. 9.Agregar un cubreobjetos a la superficie del tubo. 10. Ca rgar y balancear la centrífuga (asegura rse de balancearla con otro tubo lleno de azúcar). Centrifugar a 800g durante 10 minutos. 11. Ret i rar el cubreobjetos levantándolo dere cho de modo tal que una gota se adhiera al mismo. Colocar el cubreobjetos sobre un portaobjetos y examinar con el micro s c o p i o.

ANÁLISIS DE SEDIMENTACIÓN La medicina veterinaria usa muy poco los distintos análisis de sedimentación por las siguientes razones: Los parásitos más comunes se detectan por lo general usando los métodos de flotación; habitualmente no hay necesidad de fijar las muestras extraídas de caninos y felinos (como se dijo anteriormente, esto cambia la permeabilidad de los huevos y quistes y por lo tanto sus densidades flotantes) y muchos de los trematodos y amebas presentes en la materia fecal de los seres humanos no están en las muestras provenientes de perros y gatos. De este modo, los beneficios de la sedimentación por lo general no superan a las desventajas, que incluyen la mayor cantidad de material que con frecuencia se debe examinar, la dificultad para ver diversos protozoos cuando están desparramados en esta muestra más grande sin la ayuda de la aberración esférica y la cantidad de pasos extra que requiere el procesamiento. Las muestras sí tienen la ventaja de que se pueden conservar de modo tal que una parte o toda la muestra se puede observar otro día, pero en la mayoría de las clínicas veterinarias, los veterinarios simplemente no tienen tiempo para volver más tarde y re-examinar los portaobjetos. El procedimiento de sedimentación más básico es el

simple tamizado de la material fecal en agua o solución salina seguido de la sedimentación en un tubo sin centrifugación. Un gran porcentaje de las bacterias permanecerán en la solución y los huevos más pesados se irán al fondo del tubo. El problema es que por lo general hay una gran cantidad de material que queda por examinar. Sin embargo, el procedimiento es mejor que nada y casi no tiene costo de preparación. Muchos de los huevos son muy pesados en comparación con el agua y por lo tanto con frecuencia se asentarán en un tiempo relativamente corto. Un procedimiento que tiene éxito en la medicina para seres humanos es el procedimiento de sedimentación en formol/acetato etílico (Figura 1.14). Este método también es útil en la medicina veterinaria porque es capaz de encontrar casi todo lo que puede estar presente en una muestra de materia fecal. El problema, una vez más, es que con frecuencia hay gran cantidad de material para examinar. El proceso limpia las muestras que tienen mucha fibra o mucha grasa, pero por desgracia esto no es tan común en las muestras de perros y gatos. La sedimentación en ácido/acetato etílico es una técnica hermana de la sedimentación en formol/acetato etílico. En esta técnica, las he-

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ces frescas se suspenden en una solución ácida, típicamente de ácido clorhídrico (elaborado en una proporción de 40 partes de HCl concentrado con 60 partes de agua). El resto de la técnica es igual que para el método de sedimentación en formol/acetato etílico. El método de sedimentación en formol/acetato etílico tiende a proporcionar una muestra más limpia que la obtenida con formol, pero no funciona en quistes de protozoos. Sin embargo, algunos técnicos prefieren usar el método con ácido/acetato etílico para las mu e st ras de materia fecal tomadas de animales salvajes.

Figura 1.14. Cuando el acetato etílico se mezcla con el agua fecal, el formol o la mezcla de ácidos y luego se centrifuga, se formará una capa entre el solvente orgánico y la fase acuosa. Es necesario desalojar esta obstrucción con un aplicador antes de decantar el tubo. Se debe tener cuidado al desalojar el material de las paredes del tubo de modo tal que no vuelva a caer en el pellet cuando decante. Si el pellet está en alcohol ácido, probablemente sea deseable volver a suspenderlo en agua antes de colocarlo en un portaobjetos; de lo contrario, tiende a no formar un lodo sino que se desparrama rápidamente a los bordes del portaobjetos y se sale.

SEDIMENTACIÓN CON ÁCIDO / ACETATO ETÍLICO MATERIALES

en 60 ml de agua.

• Centrífuga común de mesada con rotor

PROCEDIMIENTO 1. Con aplicadores (dos funcionan mejor que uno) colocar aproximadamente 1 g de heces en un vaso de cartón. 2. Agregar aproximadamente 8 ml de agua de la canilla y dispersar las heces en el agua vigorosamente con los aplicadores. Puede ser que las heces no se separen rápidamente; de ser así, dejar descansar la muestra durante un corto tiempo para permitir que se ablande. 3. Tamizar el barro fecal pasándolo por un fieltro a un segundo vaso de cartón. 4.Verter el barro tamizado del segundo vaso en el tubo de ensayo de la centrífuga. 5. Centrifugar a 800g durante 1 minuto. 6. Decantar el sobrenadante. 7. Agregar aproximadamente 8 ml de solución ácida mezclando con el aplicador. 8. Agregar aproximadamente 5 ml de acetato etílico, colocar el tapón y agitar vigorosamente apretando el tapón en su lugar. 9. Sacar el tapón, cargar y balancear la

horizontal y soportes para tubos de 16 X 100 mm • Microscopio binocular compuesto: debe tener por lo menos objetivos de 10 X y 40 X y 10 piezas oculares • Vasos de cartón no encerado o vasos similares de 88 a 120 cm3 (3 a 4 onzas) • Fieltro de doble pliegue • Hidrómetro: rango de gravedad específica 1,000 a 1,300 • Botellas plásticas para lavado • Tubos de centrífuga cónicos de vidrio de 15 ml • Tapón de goma • Aplicadores de madera • Portaobjetos para microscopio • Cubreobjetos de 18 x 18 mm

REACTIVOS

• Acetato etílico • HCl diluido: 40 ml de HCl concentrado

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centrífuga (asegurarse de balancearla con otro tubo de peso similar). Centrifugar a 800g durante 10 minutos. 10. Habrá una obstrucción de material en el lugar de la interfaz ácido/acetato etílico. Pasar el aplicador alrededor de la pared de vidrio y hacer decantar el acetato etílico, la obstrucción y la solución ácida. 11. Examinar el sedimento para detectar la presencia de huevos.

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APARATO DE BAERMANN A ve c e s , en la medicina ve t e rinaria se tienen sospechas de infecciones por nematodos que producen larvas en lugar de huevos que pasan a las heces. En los perro s , esto ocurre en infecciones con Cre n o s oma vulpis, Fi l a roides hirthi, Fi l a roides osleri y S t ro n gyloides sterc o ra l i s . En los gatos, A e l u ro s t ro n gylus abstrusus y Strongyloides felis (solo se encuentra en el Pacífico Sur) son casi las únicas infe c c i o n e s que dan como resultado la aparición de larvas en las heces. Se puede hacer un agregado poco común a esta lista, p e ro estos son la mayoría de los casos en los cuales la etapa que pasa a las heces es una larva . F. hirthi y F. osleri tienen larvas que tienden a no move rse mu cho; si cualquiera de estas fueran el agente s o s p e choso de signos pulmonares observa d o s , ex i sten mu chas pro b abilidades de que el uso de un aparato de Baermann no agregará nada al diagnóstico. Pa ra estas dos larva s , el mejor medio de encontra r l a s es con una flotación con sulfato de zinc. Pa ra las otras especies, el aparato de Baermann (Fi g ura 1.15) aumentará las posibilidades de encontrar las larvas que pueden estar re l a t i vamente desparra m adas en toda la mu e s t ra de materia fe c a l . Una vez que se encontra ron las larva s , h ay que dife renciarlas pero esto en realidad es una tarea re l a t i vamente fácil. A d emás, se debe tener cuidado con el tiempo transcurrido desde la toma de la mu e s t ra de las heces utilizadas para pre p a rar el aparato porque los huevos de anquilostoma son capaces de tener cría y confundir el diagnóstico. Sin embargo, en su mayoría, el método de Baermann es una técnica útil para ve ri fi c a r una infección con cualquiera de estas especies de nematodos.

Figura 1.15. Este dispositivo consta de un embudo unido a un tubo de goma por medio de un clamp. La materia fecal se coloca sobre un trozo de gasa o un colador de té y se la suspende sobre agua en el embudo. Las larvas salen de las heces y pasan al agua. Con el tiempo, las larvas se asentarán en el fondo del tubo y se las podrá recolectar ya sea colocando un g o t e ro en la punta que gotee a un portaobjetos o centrifugando el contenido en un tubo de centrífuga y examinando el sedimento.

APARATO DE BAERMANN MATERIALES

• Tubos de centrífuga cónicos de vidrio de

• Microscopio binocular compuesto: debe

• Espátula (baja lenguas) • Fieltro de doble pliegue • Portaobjetos para microscopio • Cubreobjetos

tener por lo menos objetivos de 10 X y 40 X y 10 piezas oculares • Embudo de 13 a 15 cm (5 o 6 pulgadas) de diámetro • Centrífuga común de mesada con rotor horizontal y soportes para tubos de 16 X 100 mm • Estante para tubos y soporte para embudo • Colador de té o filtro soporte equivalente • Trozo de tubo de paredes finas de 8 a 10 cm (3 o 4 pulgadas) de longitud • Gotero sin el bulbo de goma insertado en un extremo del tubo de paredes finas, el otro extremo está unido al embudo • Clamp para el tubo

15 ml

REACTIVOS

• Agua PROCEDIMIENTO 1. Con la espátula, separar entre 5 y 15 g de heces y colocarlas en el colador de té (puede resultar más fácil desparramar el material sobre el fieltro y colocar esto en el colador o, si no se dispone de un colador, se puede suspender con un hilo sobre la parte supe-

rior del embudo una bolsita hecha con fieltro) 2. Llenar el embudo con agua de la canilla tibia; mover el tubo y el clamp para eliminar las burbujas de aire que pudieran estar atrapadas. 3. Si hay gran cantidad de larvas activas presentes, como ocurre con frecuencia en el caso de Aelurostrongylus, unas pocas gotas se pueden examinar después de aproximadamente una hora, pero puede ser necesario dejar reposar la preparación en el aparato de un día para otro. 4. Llenar el tubo de la centrífuga desde el fondo abriendo el clamp (¡RECORDAR que las larvas de Strongyloides de tercera etapa pueden penetrar en la piel!) 5. Centrifugar y examinar con el microscopio

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PRUEBAS DE ANTÍGENOS FECALES En la actualidad, existen pruebas para detectar los antígenos de Cryptosporidium y Giardia cuando están presentes en muestras de materia fecal. Estas pruebas tienen la ventaja de eliminar la necesidad de confiar en la microscopía. Sin embargo, una desventaja importante es que en la actualidad su uso resulta relativamente costoso. Por lo tanto, cuando se ejecuta un control positivo y negativo, una sola prueba puede ser muy costosa. Sin embargo, existen muchas rezones para pensar que este tipo de pruebas será cada vez más común para el diagnóstico de los patógenos relativamente difíciles de encontrar. Las pruebas actuales se realizan del modo típico para una placa de ensayo inmuno-absorbente vinculado a enzimas (ELISA) o para inmuno-ensayos de fase sólida. Es mucho más probable que los veterinarios realicen los ensayos de fase sólida (Figura 1.16) porque están diseñados para usarlos con pacientes individuales. Los laboratorios de diagnóstico es más probable que utili-

Figura 1.16. Este es un ejemplo de un inmunoensayo de fase sólida diseñado para usar con una sola muestra (ProSpecT® Giard i a / C ryptosporidium Formato Rápido). La prueba es similar a las desarrolladas para detectar diversos antígenos y anticuerpos en muestras de sangre o suero. Las heces diluidas se aplican a la membrana y, luego, después de una serie de pasos, ocurrirá un cambio colorimétrico en la membrana con manchas que se oscurecerán si el antígeno está presente en las heces. Dichas pruebas han sido desarrolladas para detectar los antígenos de Giardia y Cryptosporidium. La foto es gentileza de REMEL Inc

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cen las placas de ELISA (Figura 1.17) porque ellos realizan un batch de muestras de proceso y tienen muchas muestras para analizar al mismo tiempo. Los diversos ensayos ProSpecT® (Remel) para Giardia y Cryptosporidium son ejemplos de estos ensayos.

MÉTODOS DE CULTIVO DE MATERIA FECAL El único método de cultivo de materia fecal para protozoarios capaz de ser realizado en la mayoría de los consultorios veterinarios es el sistema de cultivo recientemente presentado InPouchTM para tricomonadas (BioMed Diagnostics)(Figura 1.18). Este sistema tiene pequeños sobres de plástico con medio que puede ser inoculado con hisopos fecales y los protozoarios se cultivan a temperatura ambiente. Se ha comprobado que el sobre da muy buenos resultados en la aislación de tricomonadas provenientes de heces de gatos con diarrea. El kit usado para la detección de organismos en las heces de felinos estuvo originalmente diseñado para

Figura 1.17. Este es un ensayo ELISA que se ha usado de ru t ina para detectar antígenos de Cryptosporidium en materia fecal (ProSpecT® Cryptosporidium Ensayo de Microplacas; hay un ensayo similar para Giardia). El costo de las placas hace que la prueba sea muy cara, por lo tanto sólo se utiliza de ru t ina en laboratorios de diagnóstico centralizados. Por lo general la muestra se analiza con una muestra de c o n t rol positiva y negativa. Los resultados se pueden leer visualmente o mediante el uso de un lector de ELISA. En la pru eba mostrada (A), las cubetas positivas se ponen de color amarillo al finalizar la prueba y las negativas quedan transpare ntes. La intensidad del color se puede utilizar como una aproximación para la intensidad de la infección. Las fotos son gentileza de REMEL Inc

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la detección de Tritrichomonas foetus en muestras vaginales de hembras de bovinos y todavía se lo comercializa sólo para este uso. Por suerte, el proceso funciona bien para las muestras de materia fecal sin una gran proliferación de bacterias como para que hagan que no se puedan leer las muestras. Una vez que se ha incubado la muestra en el sobre, se la puede examinar con un microscopio directamente a través de la pared del sobre utilizando un dispositivo proporcionado por el fabricante que aplana y desparrama el sobre para poder examinarlo. Si hay tricomonadas presentes, se las puede sacar con una pipeta para seguir examinándolas con el microscopio o para pasarlas a otro medio. Este es el primer kit que hace que el cultivo de muestras de este patógeno sea relativamente fácil de analizar en el consultorio.

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