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REGULACIÓN GENÉTICA EN EL OPERÓN lac

Introducción En 1961, Francois Jacob y Jacques Monod formularon el modelo del operón para explicar la regulación de la síntesis de proteínas. El modelo se basaba en estudios de la inducción de las enzimas del catabolismo de la lactosa en Escherichia coli. Además de la βgalactosidasa, estas enzimas incluyen la lac permeasa, que participa en el transporte de la lactosa a la célula, y la transacetilasa, que metaboliza ciertos disacáridos distintos de la lactosa. Los genes para las tres enzimas que participan en la captación y utilización de la lactosa están próximos entre sí en el cromosoma bacteriano y se regulan juntos. Estos genes, que determinan las estructuras de las proteínas, se denominan genes estructurales para distinguirlos de la región de control contigua en el DNA. Cuando se introduce lactosa en un medio de cultivo, todos los genes estructurales lac se transcriben y traducen de forma rápida y simultánea. En la región control del operón lac hay dos segmentos de DNA relativamente cortos. Uno, el promotor, es la región del DNA donde la RNA polimerasa inicia la transcripción. El otro es el operador, que es como un semáforo que emite una señal de avance o de detención para la transcripción de los genes estructurales. Un conjunto de sitios operadores y promotores, y los genes estructurales que ellos controlan, es lo que define a un operón; por lo tanto, la combinación de los tres genes estructurales lac y las regiones de control contiguas se denomina operón lac. En el DNA bacteriano cerca del operón lac se ubica un gen regulador denominado gen I, que codifica proteína represora. Cuando la lactosa está ausente la proteína represora se une firmemente al sitio operador. Esta unión impide que la enzima RNA polimerasa transcriba los genes estructurales adyacentes; en consecuencia, no se forma mRNA y no se sintetizan enzimas. En cambio, cuando la lactosa está presente, parte de ella es transportada al interior de las células y convertida en el inductor alolactosa. El inductor se une a la proteína represora y la altera de modo que no puede unirse al sitio operador. En ausencia de una proteína represora unida al operador, la RNA polimerasa puede transcribir los genes estructurales en mRNA, que luego se traduce en enzimas. Esta es la razón por la que en presencia de lactosa se producen enzimas. Se dice que la lactosa induce la síntesis de la enzima y el operón lac se denomina operón inducible. La regulación del operón lactosa también depende de la concentración de glucosa en el medio, la que a su vez controla el nivel intracelular de la pequeña molécula de AMP cíclico (cAMP), una sustancia derivada del ATP que actúa como una señal de alarma celular. Las enzimas que metabolizan la glucosa son constitutivas y las células crecen a su máxima velocidad con la glucosa como fuente de carbono porque pueden utilizarla de modo más eficaz. Cuando la glucosa ya no está más disponible se acumula cAMP en la célula. Este se une al sitio alostérico de una proteína activadora catabólica o CAP. Entonces la CAP se une con el promotor lac, que inicia la transcripción porque facilita la unión de la RNA polimerasa con el promotor. Por lo tanto, la transcripción del operón lac requiere tanto la presencia de lactosa como la ausencia de glucosa. El mismo mecanismo que involucra al cAMP permite que la célula crezca en presencia de otros azúcares. La inhibición del metabolismo de fuentes de carbono alternativas por la glucosa se denomina represión por catabolito. Cuando la glucosa está disponible, la concentración de cAMP en la célula es baja y por consiguiente la CAP no está unida. En esta práctica utilizamos un análogo de la lactosa que es el ONPG, el cual al reaccionar con la β-galactosidasa nos dará una coloración amarilla y que al agregar carbonato hace que se intensifique el color amarillo,

además que se detiene la reacción de la β-galactosidasa con el ONPG.

Fig 1. Reacción que lleva a cabo la β-galactosidasa, el ONP es el que da el color amarillo.

Objetivos  Comprender la importancia de la regulación genética como mecanismo para controlar los niveles de enzimas en la célula.  Conocer los elementos que integran el operón de lactosa.  Entender el funcionamiento del operón de lactosa en presencia y ausencia de este carbohidrato.  Conocer el concepto de represión catabólica y cómo se lleva a cabo.

Hipótesis Si las bacterias son capaces de activar el operón lac en presencia de lactosa entonces producirán la βgalactosidasa, comprobando su presencia agregando un análogo de la lactosa (ONPG) obteniendo una coloración amarilla.

Materiales y métodos Se desarrolló en la práctica según el manual de prácticas de Bioquímica Experimental (pág. 60-61). Colocamos en 4 microtubos estériles (A, B, C Y D) 1 ml de cultivo de E. coli w3110. Al tubo A le añadimos 250 µl de glucosa 2%, al tubo B 150µl de lactosa 2%, al tubo C 250 µl de una mezcla de glucosa2% y lactosa. Incubamos los tubos a 37 °C durante 15 minutos. A los 7.5 minutos de incubación añadimos 250 µl de lactosa 2% al tubo D. Luego centrifugamos los tubos a 10,000 rpm durante 1 minuto y decantamos el sobrenadante. Resuspendimos el paquete celular en 250 µl de amortiguador Z. Añadimos 25 µl de cloroformo y 12.5 µl de SDS 0.1% y agitamos suavemente 10 segundos. Añadimos 50 µl de reactivo ONPG, agitamos e incubamos a temperatura ambiente durante 2 minutos. Paramos la reacción añadiendo 125 µl de Na₂CO₃ 1M. Al final se observaron las intensidades del color amarillo.

Resultados y discusión Tabla 1. Intensidad de color en tubos después de agregar el carbonato de sodio. TUBO A B C D E

INTENSIDAD DE COLOR ₋ +++ ++ + ₋

Fig 3. Tubos después de agregar el carbonato, nótese la diferencia de intensidad de color en los tubos B, C y D, donde existe la presencia de β-galactosidasa.

En el tubo A como solo hay presencia de glucosa el operón Lac esta inactivado y como consecuencia no se sintetiza la β-galactosidasa y al agregar en análogo de la lactosa (ONPG) no sufre ninguna modificación y no presenta coloración alguna. Además la presencia de glucosa disminuye la concentración de cAMP. En el tubo B solo hay lactosa y este puede transformarse a alolactosa la cual se une al represor liberando al operador, teniendo como resultado la unión de la RNA poli y pla producción de la β-galactosidasa que al reaccionar con el ONPG da como resultado el color amarillo (ONP). En el tubo C las bacterias tiene mayor preferencia hacia la glucosa como sustrato, es por eso que al usar glucosa las concentraciones de cAMP disminuyen y no es capaz de unirse a CAP, hasta que se acabe la glucosa no se utiliza la lactosa pero si se quita el represor, cuando se acaba por completo la glucosa, las concentraciones de cAMP aumentan y se unen a CAP por lo que comienza la síntesis de β-galactosidasa a menos concentraciones al tiempo que agregamos el ONPG. En el tubo D como se agrega después de 15 minutos la lactosa esta empieza a actuar en el represor y al tiempo que se agrega el ONPG la concentración de β-galactosidasa es menor que en el caso del tubo C. El tubo E al no existir bacterias no se puede observar ninguna coloración, por lo tanto el tubo nos sirve como testigo de nuestro experimento.

Conclusiones En el tubo que contiene glucosa solamente (tubo A), no se desarrollará color amarillo debido a que el operón lac no será activado. En el tubo que contiene lactosa solamente (tubo B), se desarrollará el color amarillo debido a que el operón lac es activado. En el tubo que contiene glucosa y lactosa (tubo C), se desarrollará poco color amarillo, esto en cuanto se haya terminado de metabolizar la glucosa y el operón ya no esté reprimido para ser activado. En el tubo que contiene glucosa y que pasado un tiempo se le agregó lactosa (tubo D), se desarrollará color amarillo solo si la glucosa se terminó de metabolizar. El tubo que contiene glucosa y lactosa, pero no tiene microorganismos (tubo E), servirá de blanco, ya que al no contener a la Escherichia coli, no habrá microorganismos que metabolicen los carbohidratos añadidos.

Bibliografía Curtis Helena, “Biología”, séptima ed., Panamericana, Madrid, 2008, pp. 227-230.

Fig 2. Tubos antes de agregar el carbonato de sodio, nótese que no se logra ver la coloración amarilla.

Ed.