OMS.93 Parasitologie Med Tech Base Labo 9242544108

Parasitologie médicale: techniques de base pour le laboratoire

Organisation mondiale de. la Santé Genève 1993

Réimprimé 1997

Catalogage à la source : Bibliothèque de l'OMS Parasitologie médicale : techniques de base pour le laboratoire. 1. Parasitologie- manuels de laboratoire ISBN 92 4 254410 8

(Classification NLM: WC 25)

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90/8687 ·JOUVE- 2000 97/11445 ·JOUVE -1000

Table des matières Préface

vii

Liste des collaborateurs

viii

Introduction

1

Sécurité au laboratoire

2

Première partie : Techniques de prélèvement, de préparation et d'examen

5

Entretien du microscope

7

Etalonnage du microscope

8

Prélèvements de selles

9

Techniques de prélèvement Examen

iii

9 10

Examen macroscopique des selles

10

Examen microscopique de préparations à l'état frais

10

Identification des parasites

13

Techniques complémentaires

16

Technique de concentration

16

Techniques de coloration permanente

17

Identification des parasites dans les étalements colorés

25

Ecouvillonnage anal à la recherche des œufs d'oxyures

25

Etalement épais de matières fécales sous cellophane pour le diagnostic des bilharzioses intestinales (technique de Kata-Katz)

26

Expédition des prélèvements à un laboratoire de référence

30

Elimination des prélèvements

30

Contrôle de la qualité des examens coprologiques

31

Techniques de prélèvement

31

Préparation des réactifs

32

Techniques de préparation et d'examen des lames

32

PARASITOLOGIE MÉDICALE: TECHNIQUES DE BASE POUR LE LABORATOIRE

Urines Prélèvement des urines pour le diagnostic des infestations à Schistosoma

34

Examen des urines

34

Méthode de sédimentation des urines de 24 heures recueillies en fin de miction

34

Méthode de filtration à la seringue

35

Identification

37

Prélèvements vaginaux et urétraux

38

Techniques de prélèvement

38

Examen direct de frottis vaginaux et urétraux

38

Prélèvements de sang et autres prélèvements

40

Frottis sanguins colorés

41

Prélèvements

41

Coloration des frottis sanguins au Giemsa

44

Coloration de Field

45

Coloration à l'hématoxyline de Delafield pour la mise en évidence des microfilaires

46

Examen

46

Contrôle de la qualité des examens de sang

47

Techniques spéciales pour les Plasmodium

48

Identification

48

Surveillance de la chloroquinorésistance dans le paludisme à fa/ciparum

49

Techniques spéciales pour les trypanosomes

50

Recherche des trypanosomes dans le sang

50

Recherche des trypanosomes dans le suc ganglionnaire

55

Recherche des trypanosomes dans le liquide céphalorachidien (LCR)

57

Techniques spéciales pour les microfilaires

59

Prélèvements de sang pour la recherche de microfilaires

59

Recherche des microfilaires dans le sang périphérique

59

Techniques spéciales pour les leishmanies iv

34

60

TABLE DES MATIÈRES

Prélèvements cutanés

64

Techniques de prélèvement

64

Examen des prélèvements

65

Deuxième partie : Identification des espèces parasitaires Parasites intestinaux Helminthes

68 69 69

Clé de détermination des œufs

69

Larves

72

Protozoaires

73

Formes végétatives d'amibes

74

Kystes d'amibes

75

Flagellés

79

Balantidium coli

80

lsospora belli et Cryptosporidium

80

Toxoplasma gondii

81

Problèmes d'identification

81

Parasites sanguins Paludisme

83 83

Identification des Plasmodium dans les frottis minces

83

Identification des Plasmodium dans les gouttes épaisses

83

Structures pouvant être confondues avec des Plasmodium

85

Trypanosomes

85

Microfilaires

92

Bibliographie

95

Annexe 1. Matériel de parasitologie diagnostique nécessaire dans les centres de santé et les laboratoires des hôpitaux de district

96

Annexe 2. Préparation des réactifs et solutions

99

Annexe 3. Préparation des milieux de culture

111

Annexe 4. Nettoyage et conservation des lames porte-objets 113 Index v

115

Préface Ce manuel est un guide pratique destiné aux techniciens de laboratoire des centres de santé et des hôpitaux de premier recours. Seules les méthodes diagnostiques faisant appel à la microscopie sont décrites ici. Ce manuel a été préparé à partir d'éléments tirés de matériels de formation et de divers ouvrages publiés par le Hospital for Tropical Diseases, Londres, Angleterre, la Parasitology Training Section, Division of Labora tory Training and Consultation, Laboratory Program Office, Centers for Disease Control, Atlanta, GA, Etats-Unis d'Amérique, l'Organisation mondiale de la Santé, Genève, Suisse, et l'Organisation panaméricaine de la Santé, Washington, OC, Etats-Unis d'Amérique. En particulier, un certain nombre d'illustrations ont été tirées des publications suivantes: Brooke, M.M. & Melvin, D.M., Morphology of diagnostic stages of intestinal parasites of humans, 2nd ed., Atlanta, GA, US Department of Health and Human Services, 1984 (HHS Publication N° (CDC) 84-8116); Melvin, D.M. & Brooke, M.M., Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal parasites, 3rd ed., Atlanta, GA, US Department of Health and Human Services, 1982 (HHS Publication N° (CDC) 82-8282). Les noms d'espèces de parasites utilisés sont ceux de: International Nomenclature of Diseases, Volume II, Infectious Diseases, Part 4: Parasitic Diseases, CIOMS, OMS, Genève, 1987. Les règles de la nomenclature zoologique voudraient que quand le nom de genre est employé seul, il soit suivi de sp. ou sp.p. selon le cas. Dans le but de faciliter la lecture pratique de cet ouvrage, ces dernières lettres ont été supprimées. Par exemple, nous avons employé Plasmodium au lieu de Plasmodium sp.p ..

vii

Liste des collaborateurs Les personnes suivantes ont contribué à la préparation de cette publication: Dr P. L. Chiodini, Consultant Parasitologist, Hospital for Tropical Diseases, Londres, Angleterre; Dr K. Engbaek, Département de Microbiologie clinique, Hôpital général de Copenhague, Herlev, Danemark; Dr C. C. Heuck, Technologie de Laboratoire de Santé et Sécurité du Sang, OMS, Genève, Suisse; Dr L. Houang, Annemasse, France; Dr R. C. Mahajan, Department of Parasitology, Postgraduate Institute of Medical Education and Research, Chandigarh, Inde; Dr M. A. Melvin, Atlanta, GA, Etats-Unis d'Amérique; Dr L. Monjour, Parasitologie et Mycologie, Maladies tropicales et parasitaires, Groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, Pavillon Laveran, Paris, France; Dr J. C. Petithory, Contrôle national de Qualité en Parasitologie, service de Biologie médicale, Centre Hospitalier, Gonesse, France; Dr J. Vandepitte, Département de Microbiologie clinique, Hôpital universitaire St-Raphaël, Louvain, Belgique.

viii

Introduction Les maladies parasitaires sont responsables d'une morbidité et d'une mortalité considérables dans le monde entier et se présentent souvent comme des affections à symptômes non spécifiques. La plupart d'entre elles ne peuvent être diagnostiquées à l'aide du seul examen clinique, et des examens de laboratoire sont nécessaires pour savoir si un malade est infesté ou non par un parasite et, si tel est le cas, par quelle espèce. Le laboratoire joue donc un rôle important dans l'établissement du diagnostic des maladies parasitaires et il constitue l'élément clé du choix thérapeutique. Les examens de laboratoire doivent être exacts et fiables si l'on veut aider le médecin et par là même le malade. Ce manuel est un guide rédigé à l'intention des techniciens de laboratoire. On trouvera dans sa première partie des techniques permettant de rechercher les parasites dans les selles, le sang, les urines et autres sécrétions ou tissus. On y a signalé les pièges et erreurs possibles, ainsi que les méthodes permettant de les éviter. Les moyens de contrôle de la qualité sont également évoqués. Le technicien de laboratoire doit comprendre que seule l'application rigoureuse des techniques de mise en évidence des parasites permettra l'observation précise de ces derniers au microscope. La deuxième partie de ce manuel s'attache aux critères morphologiques utilisés pour identifier les parasites. Artefacts et problèmes d'identification y sont également évoqués. On trouvera le détail du matériel et des réactifs nécessaires dans les quatre annexes qui suivent. L'annexe 1 fournit une liste du matériel et des réactifs nécessaires dans les centres de santé et les laboratoires des hôpitaux de premier recours; l'annexe 2 fournit les formules et modes opératoires pour préparer les réactifs, et l'annexe 3 pour préparer les milieux de culture; enfin, l'annexe 4 décrit les méthodes de nettoyage et de conservation des lames employées pour les frottis sanguins.

Sécurité au laboratoire Principes généraux 1. Chaque laboratoire doit disposer d'un manuel des consignes de sécurité au

laboratoire, applicables en tout temps. 2. Le laboratoire doit également disposer d'une trousse de secours, et son personnel doit compter une personne capable d'apporter les premiers soins. 3. Tout personnel étranger au service doit se voir interdire l'accès aux salles de travail du laboratoire. 4. Il est interdit de manger, de boire, de fumer et de se maquiller dans l'enceinte du laboratoire. 5. Le personnel de laboratoire portera des vêtements protecteurs, qui devront être enlevés avant de quitter le laboratoire. 6. Le personnel de laboratoire doit nettoyer les paillasses au détergent (savon) et désinfecter les surfaces de travail en fin de journée, ou lorsque du matériel infectieux a été renversé. Les désinfectants les plus couramment utilisés sont les suivants: l'éthanol à 96% ou l'isopropanol (irritants pour la peau), la solution de phénol à 1% (corrosive, caustique), la solution d'hypochlorite à 0,5-1% (caustique, corrosive) (la solution alcaline est plus agressive que la solution neutre), les solutions de formaldéhyde à 1% ou de glutaraldéhyde à 2% (toxiques et irritantes pour la peau). Les solutions d'aldéhyde et de phénol agissent plus longtemps. Il est conseillé d'essuyer les surfaces de travail avec un chiffon imbibé de désinfectant plutôt que d'employer un vaporisateur. 7. Le personnel doit toujours se laver les mains avant de quitter le laboratoire.

Manipulation des prélèvements La manipulation de tous les prélèvements de laboratoire exige des précautions particulières et le port de gants en caoutchouc doit être obligatoire.

Prélè'l•ements de sang. Tous les prélèvements de sang doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Comme des germes très dangereux peuvent être transmis par le sang (par exemple, virus de l'immunodéficience humaine (VIH), virus de l'hépatite B), il faut faire extrêmement attention lorsque l'on recueille et que l'on traite les échantillons. Les risques particuliers sont les suivants: a) Piqûres ou coupures accidentelles- se débarrasser des aiguilles ou des hémostyles dans un récipient pouvant être incinéré par la suite, ou les enterrer dans un sac à déchets après les avoir fait tremper dans une solution désinfectante. Ne pas réutiliser les hémostyles. Ne pas laisser traîner des hémostyles usagés dans le laboratoire. Ne pas utiliser de verrerie ébréchée ni fêlée. b) Contamination au niveau de lésions de la peau ou des muqueuses- recouvrir toute coupure d'un pansement occlusif. Eviter tout contact du sang avec la peau ou les muqueuses. Le pipetage à la bouche doit être absolument proscrit! Si du sang est renversé sur la peau, laver immédiatement la zone touchée au savon et à l'eau; en cas de projection dans les yeux, les rincer 2

SÉCURITÉ AU LABORATOIRE

abondamment à l'eau. Toute éclaboussure de sang dans le laboratoire doit être noyée avec une solution d'hypochlorite, puis essuyée avec un chiffon imprégné de cette même solution.

Prélèvements de selles. Eviter tout contact avec la peau. Après utilisation, les prélèvements doivent être soit a) incinérés, soit b) plongés dans une solution désinfectante puis enterrés dans des sacs à déchets. Pre1èvements d'urine. Tout contact avec la peau doit être évité. Les prélèvements non contaminés peuvent être jetés dans les canalisations destinées aux eaux usées.

Elimination des lames porte-objets Les lames doivent être déposées dans un récipient contenant une solution d'hypochlorite à 1% et enterrées dans des sacs à déchets, si elles ne sont pas nettoyées et réutilisées.

3

Première partie Techniques de prélèvement, de préparation et d'examen

Entretien du microscope '

Ce que vous devez faire 1. Recouvrir le microscope d'une housse propre en tissu ou en plastique lorsqu'il n'est pas utilisé. 2. Prendre un surcroît de précautions pour protéger le microscope de la poussière pendant les périodes chaudes et sèches. 3. Prendre un surcroît de précautions pour protéger les lentilles et les prismes du microscope des moisissures pendant les périodes chaudes et humides. Pour cela:

- garder le microscope dans une pièce climatisée.

ou - le ranger dans une pièce spéciale, déshumidifiée -le prix d'un déshumidificateur électrique représente environ la moitié de celui d'un climatiseur.

ou - brancher plusieurs ampoules de 15 ou 25 watts dans une armoire dont les portes ferment bien,

ou - mettre une ampoule de 15 watts dans la boîte du microscope, qui agit alors comme une armoire chauffante,

ou - dans les régions sans électricité, installer une étagère sur laquelle on mettra la boîte du microscope à environ 30 cm au-dessus du tuyau du réfrigérateur à gaz ou à kérosène ou du congélateur ; un sac étanche à l'air et du gel de silice à l'état sec (de couleur bleue) permettront de conserver un microscope suffisamment au sec pour que les lentilles soient à l'abri des moisissures. 4. Nettoyer chaque jour l'huile des objectifs à immersion avec un chiffon doux inbibé d'éthanol/ éther (3 ml/7 ml) ou de benzène/ éthanol/ éther (2 ml/2 ml/1 ml), puis essuyer avec un chiffon propre non pelucheux. 5. Nettoyer les oculaires avec un chiffon doux non pelucheux; on peut aussi utiliser du papier optique ou des serviettes à démaquiller. 6. Utiliser la vis de blocage du microscope fixée à la base de la boîte pour éviter que l'instrument ne soit abîmé pendant le transport. 7. Donner le numéro du modèle et si possible le numéro de l'instrument et de la pièce lors des commandes de pièces détachées.

Ce que vous ne devez pas faire 1. Ne pas utiliser le papier ou le chiffon qui a servi à nettoyer l'objectif à immersion pour nettoyer les oculaires. 2. Ne pas nettoyer les surfaces peintes du microscope à l'alcool. 3. Ne pas démonter, ni essayer de nettoyer les parties du microscope difficiles à atteindre, sauf si l'on a été formé à le faire. 4. Ne pas laisser les orifices de la tête et de la couronne vides; les reboucher avec les obturateurs appropriés ou avec du sparadrap. 5. Ne pas échanger les objectifs ou les oculaires de microscopes de marques différentes - même les divers modèles d'un même fabricant peuvent avoir des caractéristiques différentes.

7

Etalonnage du microscope La taille est un critère important de détermination de nombreux parasites, en particulier lorsqu'il s'agit de kystes et d'œufs. On peut la déterminer au moyen d'une cellule hématirnétrique (de Neubauer) ou d'un micromètre oculaire. Avec ce dernier, on procède de la manière suivante: 1. L'échelle oculaire est divisée en 100 petites divisions. 2. L'échelle du micromètre objectif représente 1 mm divisé en fractions de 0,1 mm, elles-mêmes divisées en fractions de 0,01 mm. 3. Insérer le micromètre oculaire (un disque de verre rond) dans l'oculaire, en enlevant les lentilles supérieures et en posant le disque sur le diaphragme de champ. 4. Remettre l'oculaire dans le microscope. 5. Mettre le micromètre objectif sur la platine du microscope. 6. Mettre au point sur le micromètre objectif avec l'objectif le plus faible. 7. Ajuster les deux échelles (oculaire+ objectif) jusqu'à ce qu'elles soient parallèles. 8. Noter le nombre de divisions de l'oculaire et leur dimension sur le micromètre objectif, par exemple, 50 divisions de l'oculaire= 0,75 mm; 10 divisions de l'oculaire = 0,15 mm. 9. A partir de ce résultat, calculer la valeur d'une division de l'oculaire comme suit: 50 divisions de l'oculaire= 0,75 mm 1 division de l'oculaire = 0,75/50 = 0,015 mm ou 10 divisions de l'oculaire= 0,15 mm 1 division de l'oculaire = 0,15/10 = 0,015 mm. 10. Passer des mm aux f.im (1 mm = 1000 f.im), par exemple, 0,015 mm = 15 f.im. 11. Répéter l'opération pour tous les objectifs et noter le résultat obtenu pour chacun d'eux. 12. L'étalonnage n'a besoin d'être fait qu'une fois pour chaque microscope.

8

Prélèvements de selles On examine les prélèvements de selles à la recherche de protozoaires et de larves ou d'œufs d'helminthes. Les différentes formes de protozoaires retrouvées dans les selles sont les formes végétatives et les kystes. Pour les helminthes, les stades que l'on retrouve en général sont les œufs et les larves, bien qu'on puisse également observer des vers adultes ou des segments de vers. Les vers adultes et les segments de ténias sont en général visibles à l'œil nu, mais les œufs, les larves, les formes végétatives et les kystes ne sont visibles qu'au microscope. Pour pouvoir voir ces structures, les matières fécales doivent être correctement préparées et examinées.

Techniques de prélèvement En raison de la fragilité de nombreux parasites intestinaux et de la nécessité de ne pas modifier leur morphologie pour pouvoir les déterminer avec certitude, on ne pourra poser un diagnostic microscopique fiable que si les selles sont correctement recueillies. 1. Donner au malade le matériel suivant: - une boîte en carton paraffiné avec couvercle emboîté ou une boîte en plastique avec couvercle bien ajusté, et 2 bâtonnets applicateurs. Si l'on ne dispose pas de boîte paraffinée ni de boîte en plastique, on peut utiliser des boîtes de conserve ou des pots en verre. Ne pas utiliser de feuilles de bananier ni de boîtes d'allumettes pour la collecte et la conservation des selles. Dans les programmes de lutte, il suffit souvent d'examiner un seul prélèvement, mais pour des malades, il en faut en général trois, recueillis à 3 jours d'intervalle, afin de déceler toutes les infestations parasitaires. Diverses substances peuvent gêner la recherche des parasites (par exemple, les laxatifs, les antiacides, les milieux de contraste ingérés et certains antibiotiques). 2. Demander au malade de déféquer directement dans le récipient, ou sur un morceau de papier et de mettre ensuite la selle dans le récipient au moyen des bâtonnets applicateurs. S'il ne dispose pas de papier, le malade peut déféquer sur une grande feuille propre, comme une feuille de bananier. Toutefois, la selle doit être immédiatement transvasée dans le récipient prévu à cet effet. Elle ne doit pas rester sur la feuille, ni être apportée au laboratoire ainsi. 3. Certains éléments parasitaires, en particulier les formes végétatives d'amibes, vont se décomposer ou se modifier assez rapidement après l'émission de la selle et ne seront plus reconnaissables. Les températures élevées accélèrent cette dégradation. Par conséquent, le prélèvement doit atteindre le laboratoire très rapidement, c'est-à-dire dans la demi-heure qui suit son émission. Sic' est impossible, on ajoutera des conservateurs (voir page 30). 4. Le récipient contenant la selle doit être étiqueté lisiblement et porter les mentions suivantes: les nom et prénom ou le numéro du malade; la date d'émission de la selle; - l'heure à laquelle elle a été émise (la demander au malade). 9

TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

5. Le prélèvement doit être suffisamment important pour permettre une analyse satisfaisante. Il doit être au minimum de la taille d'un œuf de pigeon. Il ne doit être ni souillé, ni mélangé à de l'urine, car celle-ci détruit les formes végétatives d'amibes; les saletés gêneront l'examen. Si le prélèvement est trop petit ou s'il est mélangé à de l'urine ou à des saletés, il faut le refuser et demander au malade d'en apporter un autre. 6. Garder le carton contenant l'échantillon dans un réfrigérateur ou, si c'est impossible, dans l'endroit le plus frais et le plus ombragé du laboratoire. Ne pas le garder au chaud ni le laisser au soleil.

Examen Examen macroscopique des selles 1. Dès que le prélèvement arrive au laboratoire, vérifier sa consistance (degré moulée

molle

très molle

liquide

d'humidité) et inscrire l'une des mentions suivantes sur le récipient: moulée, molle, très molle, liquide. S'il y a du mucus, inscrire la lettre Met s'il y a du sang, inscrire la lettre S. Par exemple, une selle très molle avec du sang et du mucus portera la mention très molle, S, M. La consistance, ou le degré d'humidité, constituera une indication quant à la présence possible de formes végétatives ou de kystes de protozoaires. Les diverses catégories de selles et les techniques à utiliser figurent dans le tableau 1. 2. Si l'on reçoit plusieurs prélèvements à la fois, on examinera d'abord ceux qui contiennent du sang et du mucus, puis ceux qui sont liquides. Ces prélèvements contiennent en effet très probablement des formes végétatives d'amibes (qui meurent rapidement) et doivent être examinés dans l'heure qui suit l'émission de la selle. Les selles moulées peuvent être examinées dans la journée suivant leur émission, mais ne doivent pas attendre, le lendemain (les kystes peuvent se décomposer).

Examen microscopique de préparations à l'état frais La préparation à l'état frais est la technique la plus simple et la plus facile à mettre en œuvre pour examiner les selles et il convient de l'employer dans tous les laboratoires périphériques. Une telle préparation se fait directement à partir de la selle ou après concentration (voir page 16). Les principaux types de préparations non fixées que l'on utilise pour les analyses de selles sont les préparations en soluté physiologique, à l'iode et au bleu de méthylène tamponné:

Tableau 1. Catégories de selles et techniques appropriées

Consistance

Stades des protozoaires les plus susceptibles d'être retrouvésa

Moulée

Kystes

Molle

Kystes (parfois formes végétatives)

Très molle

Formes végétatives

Liquide

Formes végétatives

Technique à utiliser

Soluté physiologique

Iode

+ +

+ +

+ +

• On peut trouver des œufs et des larves de vers dans tous les types de selles.

10

Bleu de méthylène tamponné (si des formes végétatives sont visibles)

+ + +

PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

La préparation en soluté physiologique sert à un premier examen microscopique des selles. On l'emploie surtout pour mettre en évidence les œufs et les larves de vers, ainsi que les formes végétatives et les kystes de protozoaires. Ce type de préparation peut également révéler la présence d'hématies et de leucocytes. - La préparation à l'iode est surtout utilisée pour colorer le glycogène et les noyaux des kystes, s'il y en a. On peut en général identifier précisément les kystes dans ce type de préparation. Il faut faire un montage au bleu de méthylène tamponné chaque fois que l'on observe des formes végétatives d'amibes ou que l'on soupçonne leur présence dans une préparation en soluté physiologique. Il colore les formes végétatives d'amibes mais pas les kystes amibiens, pas plus que les formes végétatives ni les kystes de flagellés. Cette coloration ne convient qu'aux préparations à l'état frais. Elle n'est pas employée sur les prélèvements conservés dans lesquels les parasites sont morts. Matériel et réactifs

2Z.lt 10/4/84

1 Lamelles couvre-objets 2. Flacons compte-gouttes contenant: du soluté physiologique (réactif No 24)1 du lugol (solution à 1 %) (réactif No 18) du bleu de méthylène tamponné (réactif No 2) 3. Lames porte-objets 4. Crayons ou feutres pour l'étiquetage 5. Anse de platine (ou bâtonnets applicateurs, allumettes, cure-dents)

Préparations en soluté physiologique et à l'iode (examen direct) 1. Inscrire les nom et prénom ou le numéro du malade et la date sur le côté gauche de la lame avec un crayon gras. 2. Déposer une goutte de soluté physiologique au centre de la moitié gauche de la lame et une goutte de solution iodée au centre de la moitié droite de la lame. NOTE:

Si l'on soupçonne la présence de formes végétatives d'amibes, on emploiera du soluté physiologique chaud (37°C)

WHO 886r3

0 Tout au long de ce manuel, les " numéros de réactif " renvoient aux numéros attribués aux réactifs dans l'annexe 2.

11

TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

3. A l'aide d'un bâtonnet applicateur (allumette ou cure-dents), prélever une petite portion d'échantillon (de la taille d'une tête d'allumette) et mélanger avec la goutte de soluté physiologique. NŒE:

Selle moulée: prélever un petit morceau de façon à avoir à la fois une portion externe et une portion interne de la selle.

Selle accompagnée de mucus: s'il y a du mucus, étiqueter une seconde lame au nom ou au numéro du malade. Déposer une goutte de soluté physiologique sur la lame. Prélever un peu de mucus et le mélanger au soluté. Les formes végétatives, s'il y en a, sont parfois plus faciles à retrouver dans le mucus que dans les parties solides de la selle. Selle liquide: s'il n'y a pas de mucus, prélever un peu de liquide et mélanger avec le soluté physiologique. 4. De la même façon, prélever un peu de selle et mélanger avec la goutte d'iode pour faire une préparation à l'iode. Si l'on utilise une anse de platine, la passer à la flamme après usage. Si l'on emploie des bâtonnets applicateurs, les jeter. 5. Recouvrir la goutte de soluté physiologique et la goutte d'iode d'une lamelle. Pour cela, tenir la lamelle inclinée au contact de la lame. Toucher le bord de la goutte et abaisser doucement la lamelle. Cela permet d'éviter les bulles d'air dans la préparation.

12

PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

Préparation au bleu de méthylène tamponné (A réalisersi l'on observe des formes végétatives d'amibes dans la préparation en soluté physiologique) Procéder comme décrit de 1 à 5 pour les préparations en soluté physiologique et à l'iode, mais déposer une grosse goutte de bleu de méthylène tamponné au lieu du soluté physiologique ou de l'iode. Attendre 5 à 10 minutes avant d' examiner la préparation pour permettre au colorant de pénétrer dans les formes végétatives. Le bleu de méthylène tamponné va surcolorer celles-ci au bout d'environ 30 minutes. ll faut donc examiner la lame dans les 30 minutes qui suivent sa préparation.

Examen 1. Poser la lame montée sur la platine du microscope et mettre au point avec l'objectif x 10 (faible grossissement). 2. Régler la lumière dans le champ à l'aide du diaphragme. On doit pouvoir distinguer nettement les objets situés dans le champ. Il ne faut ni trop, ni trop peu de lumière. 3. Examiner toute la zone recouverte par la lamelle avec l'objectif x 10; mettre au point sur le coin supérieur gauche, puis déplacer la lame régulièrement d'avant en arrière ou de haut en bas.

4. Si l'on observe des parasites ou des éléments suspects, passer à l'objectif supérieur et augmenter la lumière en ouvrant le diaphragme afin d' observer leur morphologie en détaiL Il s'agit d'un examen systématique. Si les lames sont examinées de cette façon, tout parasite présent sera en général trouvé. En revanche, si la lame n'est pas examinée attentivement, des parasites peuvent échapper à l'observation. Examiner chaque champ microscopique soigneusement, en faisant varier la mise au point en hauteur, avant de passer au champ suivant. NE PAS OUBLIER D'EXAMINER LES PRÉPARATIONS DE MANIÈRE SYSTÉMATIQUE La Fig. 1 indique quels sont les examens à effectuer au laboratoire, aux différents niveaux.

Identification des parasites Œufs et larves de vers dans les préparations en soluté physiologique Les œufs sont faciles à déceler et à identifier dans le soluté physiologique. ll ne faut pas les colorer (le colorant peut gêner la détermination). La plupart des œufs sont suffisamment grands pour être reconnus au faible grossissement (x 10), mais quelques œufs plus petits nécessiteront un grossissement plus fort. Dans les préparations en soluté physiologique, les larves de Strongyloides stercoralis peuvent être visibles. Si le prélèvement est frais, il n'y a en général pas 13

TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

de larves d'ankylostomes, mais s'il est plus ancien, on peut avoir à les distinguer des premières.

Fig. 1. Techniques d'examen des selles selon l'importance du laboratoire Laboratoire du centre de santé

Prélèvement de selles- étalement direct de matériel frais

soluté physiologique - et (si l'on a observé des formes végétatives d'amibes) - bleu de méthylène tamponné {

-

-L . . . -

Tous prélèvements- concentration au formol/éther -

étalement épais sous cellophane

solution iodée

soluté physiologique solution 1odee

Hôpital de district Prélèvements de selles sans conservateur

soluté physiologique- et Etalement direct à l'état frais (si les selle{ (si l'on a observé des formes végétatives d'amibes) ne sont pas moulées ou si l'on observe - bleu de méthylène tamponné la présence de sang et de mucus) - solution iodée Tous prélèvements- concentration au formol/éther

-f -

soluté physiologique solution iodée

Prélèvements de selles avec conservateur

Fixés au formol -

concentration au formol/éther

- [ soluté physiologique solution iodée

On trouvera dans la deuxième partie, pp. 69-73, les caractéristiques permettant d'identifier les différentes sortes d'œufs et de larves avec des diagrammes et des clés d'identification. Certains vers ont une répartition géographique restreinte et on ne trouve donc pas tous les vers partout dans le monde. Il faut établir une liste des espèces présentes dans la région où ont lieu les examens.

Protozoaires dans les préparations de matériel frais

Préparations en soluté physiologique Dans le soluté physiologique, on peut observer les formes végétatives et kystes d'amibes et de flagellés. Les kystes vont apparaître comme des structures rondes ou ovales, réfringentes; les formes végétatives d'amibes peuvent être rondes ou irrégulières, celle des flagellés sont en général piriformes (allongés, en forme de poire). Dans les selles fraîches (maximum, 1 heure), on peut observer des formes végétatives mobiles. Cette mobilité peut être très utile pour identifier l'espèce, en particulier dans le cas des flagellés. La mobilité caractéristique de chaque espèce est décrite dans la deuxième partie (pp. 74-82).

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PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

On peut déceler les éléments parasitaires au faible grossissement (x 10), mais il faut un grossissement plus fort pour identifier de façon fiable des structures comme les kystes ou les formes végétatives. On peut alors observer la mobilité des éléments, des inclusions comme les érythrocytes et les levures dans les formes végétatives d'amibes, les cristalloïdes dans les kystes d'amibes, ainsi que la forme et les détails structuraux (par exemple, cytostomes, sillon de torsion ou filaments) des formes végétatives et kystes de flagellés. Aucun détail du noyau n'est visible dans les préparations en soluté physiologique. Toutefois, il faut régler soigneusement la lumière du microscope de façon que les objets apparaissent nettement. Trop ou trop peu de lumière gêneront l' observation. Il faut également mettre au point à différentes profondeurs de la préparation, afin de voir toutes les couches de la préparation. Se souvenir qu'il faut examiner l'ensemble de la zone recouverte par la lamelle de façon systématique, afin de diminuer le risque que des parasites échappent à l'observation.

Préparations au bleu de méthylène tamponné Si l'on observe des formes végétatives d'amibes ou des structures qui leur ressemblent, il faut faire une préparation au bleu de méthylène et l'examiner. Au bout de 5 à 10 minutes de coloration, les formes végétatives restent parfois mobiles, mais souvent elles se mettent en boule dans ces préparations. (Ne pas confondre des formes végétatives en boule avec des kystes; les kystes ne se colorent pas au bleu de méthylène). Dans les formes végétatives, le noyau et les inclusions (érythrocytes, levures) se colorent en bleu foncé, le cytoplasme en bleu clair. Il peut arriver que certaines formes végétatives ne se colorent pas; il faut donc rechercher les éléments bien colorés. Chercher les granules périnucléaires (granules situés le long de la membrane entourant le noyau)); s'ils sont présents, le parasite appartient à une espèce d'Entamoeba qu'il faut identifier. (Les caractéristiques permettant d'identifier les formes végétatives d'amibes figurent dans la deuxième partie, pp. 74-76).

Préparations à l'iode Les préparations à l'iode servent à repérer les kystes d'amibes et les kystes de flagellés. On peut les déceler à l'objectif x 10, mais ils ne sont pas aussi réfringents que dans le soluté physiologique. Pour observer les caractéristiques des kystes, il faut un grossissement plus fort; on mesurera les diverses structures pour être sûr d'identifier correctement ces kystes. Dans la solution iodée, le cytoplasme des kystes se colore en jaune ou en brun clair et le noyau en brun foncé. Dans les kystes d'Entamoeba colorés à l'iode, la disposition de la chromatine périphérique et la position du caryosome sont visibles. Les granulations chromatiques périphériques se colorent en jaune clair et ne sont pas toujours faciles à voir. Parfois, les jeunes kystes contiennent du glycogène qui se colore en brun foncé avec l'iode. Dans les kystes de flagellés colorés à l'iode, on peut observer les filaments. Dans les préparations à l'iode, on peut en général identifier précisément les kystes d'amibes et de flagellés. Toutefois, il est parfois impossible de faire une détermination précise et il peut s'avérer nécessaire de faire une coloration permanente. Les caractéristiques permettant d'identifier les kystes figurent dans la deuxième partie, pp. 76-82. 15

- - - - - - - - - - - ' TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Techniques complémentaires En plus des préparations à frais directes, on dispose de méthodes complémentaires pour le diagnostic des parasitoses intestinales. Les plus couramment employées sont les techniques de concentration pour la recherche des œufs, larves et kystes, et celles de coloration permanente pour la mise en évidence des formes végétatives et des kystes.

Technique de concentration Si les éléments parasitaires ne sont pas présents en grand nombre dans l'échantillon des selles examinées, la préparation à l'état frais peut ne pas suffire pour déceler une infestation. Ainsi, dans la mesure du possible, on concentrera les selles. Cette concentration permettra de mettre en évidence les œufs de vers, les larves et les kystes de protozoaires, mais PAS les formes végétatives de protozoaires, car ils sont en général détruits au cours du processus de concentration. L'examen direct d'une préparation à l'état frais est donc la première étape obligatoire de tout examen microscopique. La technique de concentration s'impose lorsque l'examen de la préparation à frais est négatif en dépit de symptômes cliniques d'une infestation parasitaire présentés par le malade; elle est également indiquée pour déceler les genres Schistosoma et Taenia. La technique de concentration recommandée est la méthode formol-éther (ou formol-acétate d'éthyle) 1. Cette méthode permet de retrouver tous les types d'œufs de vers (ascaris, ténia, schistosomes et autres œufs de douves), les larves, et les kystes de protozoaires. Matériel et réactifs

1. Bâtonnets applicateurs, en bois 2. Pissettes en verre ou en plastique, de 250 ml ou 500 ml. Ces flacons sont pratiques pour rajouter du formol dans les tubes à centrifuger. Toutefois, on peut utiliser n'importe quel petit flacon ou fiole. 3. Centrifugeuse, avec couronne et adaptateurs pour tubes coniques de 15 ml. Il faut utiliser des gaines étanches. 4. Tubes à centrifuger, 15 ml, coniques (inscrire une graduation à 7 ml et une à 10 ml au crayon gras). 5. Ecouvillons de coton 6. Lamelles couvre-objets 7. Entonnoir 8. Gaze chirurgicale 9. Lames porte-objets 10. Pipettes Pasteur, avec poires en caoutchouc 11. Supports pour tubes 12. Formol, 10% (réactif No 10). Pour l'usage quotidien, verser une partie de la solution dans une pissette en plastique, et l'étiqueter. 13. Ether ou acétate d' éthyle 1 14. Lugol, solution à 1% - dans une pissette en verre ou un flacon comptegouttes (réactif N° 18) 15. Soluté physiologique (réactif No 24) 1

Si l'on ne dispose pas d'éther ni d'acétate d'éthyle, prendre exactement la même quantité d'essence ordinaire. L'acétate d'éthyle n'est pas aussi inflammable ni aussi explosif que l'éther, il est donc moins dangereux à manipuler au laboratoire.

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PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

ATTENTION

L'éther est une substance extrêmement inflammable qui s'enflamme et explose rapidement au contact d'une flamme ou d'une étincelle. Conserver les bidons ou les flacons entamés sur une étagère dans la partie la plus fraîche du laboratoire. S'assurer qu'ils sont bien bouchés. Ne PAS mettre un flacon d'éther entamé au réfrigérateur: les vapeurs s'accumulent dans celui-ci, même si le flacon est fermé, et peuvent exploser lorsqu'on ouvre la porte. Ne pas ranger des flacons déjà entamés dans une armoire. Il vaut mieux les laisser sur une étagère de façon que les vapeurs puissent se disperser facilement. Technique

1. Verser 10 ml de formol à 10% sur environ 1 g de selles et mélanger à l'aide

2. 3. 4. 5. 6. 7. Ether Débris

8.

Formol

9.

Culot

ê

d'un bâtonnet applicateur jusqu'à obtention d'une suspension légèrement trouble. Mettre une couche de gaze dans un entonnoir et tenir l'entonnoir au-dessus du tube à centrifuger. Faire passer la suspension de matière fécale à travers la gaze dans le tube à centrifuger jusqu'à obtenir 7 ml. Retirer la gaze et la jeter. Ajouter 3 ml d'éther ou d'acétate d'éthyle et mélanger pendant une minute. Centrifuger pendant une minute. Le tube doit avoir le même aspect que sur le diagramme ci-contre. Décoller le bouchon gras (débris) avec un bâtonnet applicateur et jeter le surnageant en renversant le tube d'un mouvement rapide. Remettre le tube dans son support et laisser le liquide des parois descendre vers le culot. Mélanger soigneusement et prélever une goutte de liquide avec une pipette Pasteur pour la déposer sur une lame; couvrir avec une lamelle et examiner. Faire également une préparation colorée à l'iode. Examiner toute la zone recouverte par la lamelle avec les objectifs x 10 et x 40 à la recherche d'œufs, de kystes et de larves.

Examen du culot

~

Quatre couches après centrifugation finale

~

Les lames de matériel concentré doivent être examinées de la même façon que les préparations à frais (voir p. 13). Les préparations en soluté physiologique (non colorées) seront examinées de façon systématique, à la recherche d'œufs, de larves et de kystes. Si l'on observe des kystes ou des éléments qui leur ressemblent, on examinera une préparation à l'iode pour avoir plus de détails. Les parasites ont le même aspect que dans les préparations à frais. Dans les préparations en soluté physiologique de sédiment obtenu par la méthode au formol-éther (ou à l'acétate d'éthyle), les noyaux des kystes sont fixés et peuvent être visibles. Toutefois, il faut quand même examiner des préparations à l'iode pour que l'identification soit plus fiable.

Techniques de coloration permanente Dans la pratique courante, on ne fait pas de coloration permanente pour le diagnostic, ni pour l'identification des œufs ou des larves de vers. Toutefois, elles sont parfois nécessaires dans les cas suivants: identification des oocystes de Cryptosporidium; identification des formes végétatives de protozoaires, en cas de doute;' confirmation de l'identité des kystes de protozoaires, en cas de doute; conservation d'un matériel de référence; envoi à un laboratoire de référence pour avoir l'avis d'un expert. 17

TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Coloration des oocystes de Cryptosporidium Les oocystes de Cryptosporidium qui se trouvent dans les selles sont sphériques, et mesurent 4 à 6 J.lm de diamètre. On peut les concentrer par une technique au formol-éther modifiée, mais leur identification fait appel à des techniques de coloration. La technique de Ziehl-Neelsen modifiée est celle que l'on recommande. On peut aussi employer la technique à la safranine-bleu de méthylène. Matériel

Bâtonnets applicateurs en bois Lamelles couvre-objets Pinces Lames porte-objets Crayon ou feutre pour l'étiquetage Agitateur en verre Support pour lames, pour les lames montées Boîtes à coloration Papier absorbant ou éponge.

Technique de Ziehi-Neelsen modifiée Réactifs

Fuchsine phéniquée (réactif No 4) Formol (formaldéhyde) (réactif No 10) Solution d'acide chlorhydrique-éthanol (réactif No 13) Solution de glycérol-vert malachite (ou bleu de méthylène) (réactif N° 12) Solution d'acide chlorhydrique-méthanol (réactif No 14) Eau. Préparation

1. Faire un étalement mince de matières fécales, le laisser sécher à l'air et le fixer dans le méthanol pendant 2 à 3 minutes. Dans la mesure du possible, on le fixera ensuite dans des vapeurs de formol pour diminuer son infectiosité. (Le culot d'extraction obtenu avec le formol-éther n'est pas utilisable.) 2. Colorer l'étalement à la fuchsine phéniquée froide pendant 5 à 10 minutes. 3. Procéder à une différenciation par la solution d'acide chlorhydrique-éthanol à 1% jusqu'à ce que le colorant ne diffuse plus. 4. Rincer à l'eau du robinet. 5. Effectuer une contre-coloration au vert malachite (ou au bleu de méthylène) à 0,25% pendant 30 secondes. 6. Rincer à l'eau du robinet. 7. Sécher au buvard ou égoutter. 8. Examiner à un fort grossissement et confirmer la morphologie à l'aide de l'objectif à immersion. Mesurer les oocystes. Ceux de Cryptosporidium mesurent 4 à 6 J.lm.

Lorsqu'ils sont colorés par cette technique, les oocystes de Cryptosporidium apparaissent comme des sphérules rose vif sur fond vert pâle. On peut observer différents degrés de coloration interne, en fonction de l'âge et de l'état de l'oocyste.

Technique à la safranine-bleu de méthylène Réactifs

Solution d'acide chlorhydrique-méthanol (réactif No 14) Solution de bleu de méthylène-phosphate (réactif No 19) 18

PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

Solution de safranine (réactif No 23) Eau. Préparation

1. Préparer un étalement mince de matières fécales. 2. Le sécher à l'air. Le passer dans la flamme d'une lampe à alcool. 3. Fixer l'étalement dans une solution d'acide chlorhydrique-méthanol pendant 4 minutes. 4. Le rincer à l'eau du robinet. 5. Le colorer ensuite avec une solution aqueuse de safranine à 1% pendant 1 minute. Chauffer le colorant en tenant un écouvillon imbibé d'alcool enflammé sous la lame. Ne pas laisser le colorant sécher sur l'étalement. 6. Rincer le colorant à l'eau du robinet. 7. Effectuer une contre-coloration avec une solution de bleu de méthylène à 1% (p /v) pendant 30 secondes. 8. Rincer à l'eau du robinet et sécher la lame. 9. Balayer l'étalement avec l'objectif x 40 à la recherche d' oocystes, qui seront ensuite identifiés à l'objectif x 100. Les oocystes de Cryptosporidium sont des corpuscules ronds à ovales, de couleur rose-orangé (4 à 6j..lm de diamètre). Les sporozoïtes situés à l'intérieur des oocystes sont un peu plus foncés.

Technique de coloration au trichrome pour les protozoaires Cette technique est intéressante pour colorer les prélèvements de selles fraîches, ainsi que le matériel fixé à l'alcool polyvinylique (APV). Cependant, il importe de s'assurer que la durée de conservation des réactifs n'est pas dépassée et que la méthode est suivie scrupuleusement si l'on veut obtenir des résultats fiables. Réactifs

Solution décolorante d'acide acétique dans l'alcool (réactif N° 1) Ethanol à 70% (réactif N° 7) Ethanol à 95% 1 Solution de xylène phéniqué (réactif No 5) ou éthanol absolu Solution d'iode dans l'alcool (réactif No 16) Fixateur de Schaudinn (réactif No 25) Solution de trichrome (réactif No 27) Xylène1 Préparation des boîtes à coloration, et renouvellement des colorants

i) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Etiqueter les boîtes à coloration nécessaires pour l'opération et les disposer en ligne dans l'ordre suivant: Fixateur de Schaudinn Solution d'iode dans l'alcool Ethanol à 70% (1) Ethanol à 70% (2) Solution de trichrome Solution décolorante d'acide acétique dans l'alcool Ethanol à 95% (1) Ethanol à 95% (2) Xylène phéniqué ou éthanol absolu Xylène

1 Ce réactif ne demande aucune préparation. Il est directement utilisé à partir des récipients dans lesquels il a été acheté.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Disposer plusieurs couches de papier absorbant devant les boîtes. Si on n'en a pas, prendre des éponges ou du papier journal. ii)

Remplir chaque boîte avec la solution appropriée. S'assurer que le fixateur de Schaudinn comprenne bien de l'acide acétique. iii) Verser un peu de milieu de montage dans un petit flacon muni d'un couvercle ou d'un bouchon. (Conserver le grand flacon de solution-mère hermétiquement fermé pour éviter toute évaporation.) La série de boîtes à coloration est disposée dans un endroit pratique où on la laisse, pr~te à l'emploi. Si les rebords des boîtes sont en verre dépoli, enduire la surface dépolie d'une fine couche de vaseline afin qu'ils adhèrent bien aux couvercles. On renouvellera les solutions à intervalles réguliers comme suit: 1. Fixateur de Schaudinn- à renouveler une fois par mois. Verser le reste de fixateur dans un flacon à déchets pour solutions organiques et le remplacer par une solution fraîche. 2. Solution d'iode dans l'alcool- à renouveler toutes les trois semaines. Si la couleur s'altère ou devient trop pâle, la remplacer immédiatement. 3. Ethanol à 70% (1). Cette solution va jaunir avec l'iode de la solution d'iode dans l'alcool. La renouveler toutes les 3 semaines ou après avoir coloré 30 étalements, selon le cas. 4. Ethanol à 70% (2) - à renouveler toutes les trois semaines. 5. Solution de trichrome - à ne renouveler que lorsqu'elle devient verdâtre. Remuer doucement la boîte d'avant en arrière. Si ses parois ont l'air plus vertes que pourpres, jeter le colorant et le remplacer par du colorant frais. 6. Solution décolorante à l'alcool- acide acétique- à renouveler après avoir décoloré 20 étalements, ou une fois par semaine, selon le cas. 7. Ethanol à 95% (1) -à renouveler une fois par semaine. 8. Ethanol à 95% (2) - à renouveler toutes les deux semaines. 9. Ethanol absolu- à renouveler une fois par semaine; xylène phéniqué- à renouveler une fois par mois. 10. Xylène- à renouveler une fois par mois.

Tenir un registre de chaque solution, avec mention de la date à laquelle elle a été versée dans la boîte, par exemple: Solution

Première utilisation le

A renouveler le

Schaudinn

13 janvier 1990

12 février 1990

7 janvier 1990

28 janvier 1990

Iode dans l'é\lcool

Vérifier ce registre chaque semaine. Ainsi, les solutions coloreront toujours de manière satisfaisante les étalements de matières fécales. NOTE:

Laisser les boîtes à coloration couvertes en permanence, sauf pour introduire ou retirer des lames. Ne pas enlever les couvercles en cours de coloration. Si elles ne sont pas couvertes, les solutions vont absorber l'humidité de l'air et ne permettront plus une bonne coloration. La solution de xylène phéniqué et le xylène sont des solutions déshydratantes et éclaircissantes; elles éliminent l'eau et rendent le matériel translucide ce qui permet de l'examiner. Si ces solutions captent l'humidité, elles seront moins efficaces. On observe parfois dans les boîtes des gouttelettes d'humidité dues à la condensation. Si cela se produit, il faut jeter la solution et la remplacer par une solution fraîche.

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PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

Technique

1. Inscrire les nom et prénom ou le numéro du malade et la date sur une lame. 2. Prélever un peu de matière fécale au moyen d'un bâtonnet applicateur et l'étaler en une couche mince en frottant ce dernier de gauche à droite au milieu de la lame. La couche de matière fécale doit être aussi uniforme et lisse que possible et doit avoir la bonne densité. Il faut agir rapidement pour éviter que l'étalement ne sèche et plonger immédiatement la lame dans le fixateur de Schaudinn. NOTE:

Si la selle est dure, on en mélangera une petite quantité avec du soluté physiologique pour la ramollir et pouvoir faire l'étalement.

ENTRE LE MOMENT OÙ IL EST PRÉPARÉ ET LE MOMENT OÙ IL EST MONTÉ, L'ÉTALEMENT NE DOIT PAS SÉCHER 3.

4.

5.

6. 7. 8.

1

Fixer dans le fixateur de Schaudinn pendant 1 heure à température ambiante. (S'ille faut, on peut le laisser dans le fixateur pendant 2 jours). Disposer la lame dans la boîte à coloration de façon que l'extrémité portant le nom du malade soit dirigée vers le haut. Saisir la lame avec une pince. L'égoutter en mettant le bord de la lame sur du papier absorbant ou une éponge. La plonger ensuite dans la boîte à coloration suivante. La laisser dans la solution d'iode dans l'alcool pendant 1 minute (ni plus, ni moins). L'en sortir et l'égoutter comme en 4. La plonger dans la boîte suivante. La laisser dans l'éthanol à 70% (1) pendant 1 minute. La retirer et l'égoutter. La laisser dans l'éthanol à 70% (2) 1 pendant 1 minute. La retirer et l'égoutter. La colorer avec la solution de trichrome pendant 8 minutes. La retirer et l'égoutter.

Si la coloration doit être interrompue, on peut laisser la lame dans de l'éthanol à 70% (2). C'est la seule étape au cours de laquelle on peut interrompre le processus. Si la coloration a dépassé cette étape (point 7), il faut la terminer: elle ne doit pas être interrompue au-delà de ce point.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

9. Décolorer avec la solution d'alcool-acide acétique- prendre la lame avec des pinces et la plonger deux fois dans la solution (5 secondes au total). La solution d'alcool-acide continuera à décolorer l'échantillon aussi longtemps qu'elle restera en contact avec l'étalement et 5 secondes suffisent donc. (NE PAS plonger la lame dans la boîte et compter jusqu'à 5.) Egoutter la lame sur du papier absorbant ou une éponge. Rincer immédiatement l'étalement à l'éthanol à 95% (1) pour éliminer l'acide. 10. Plonger la lame une seule fois dans l'éthanol à 95% (1) pendant 1 à 2 secondes. L'égoutter avant de la mettre dans la boîte suivante. 11. Plonger la lame deux fois dans l'éthanol à 95% (2) pendant 2 à 3 secondes. L'égoutter avant de la mettre dans la boîte suivante. 12. Plonger la lame dans le xylène phéniqué ou l'éthanol absolu pendant 1 minute. L'égoutter avant de la mettre dans la boîte suivante. 13. La laisser dans le xylène pendant 2 à 3 minutes. 14. La retirer et l'égoutter. NE PAS LAISSER LA LAME SÉCHER A VANT DE LA RECOUVRIR AVEC LA LAMELLE. Si elle commence à sécher, la retremper dans le xylène- mais égoutter le xylène en excès avant de mettre le milieu de montage sur l'étalement. 15. Poser la lame à plat sur du papier absorbant, ou sur un morceau de papier journal, et à l'aide d'un agitateur en verre verser 3 ou 4 gouttes de milieu de montage sur l'étalement. Tenir la lamelle inclinée, le bord touchant le bord de l'étalement. L'abaisser doucement sur ce dernier, de façon que le milieu s'étale sous la lamelle sans former de bulles d'air. NOTE:

Si l'on colore plusieurs étalements à la fois, les décolorer chacun séparément. Prendre un étalement dans la boîte à coloration, l'égoutter, le décolorer, le rincer à l'éthanol à 95%, l'égoutter et le mettre dans le xylène phéniqué ou l'éthanol absolu (points 9 à 12). Retirer ensuite une autre lame du colorant et lui faire subir le même traitement. Continuer jusqu'à ce que tous les étalements aient été décolorés. Si l'on colore plusieurs lames, en retirer une seule à la fois du xylène, l'égoutter et la monter. Si certains étalements restent dans le xylène 4 à 5 minutes, ils ne seront pas abîmés. Laisser la préparation montée bien à plat sur du papier absorbant ou sur un morceau de papier journal, sur une table ou une surface plane; elle doit rester ainsi jusqu'à ce qu'elle soit sèche, ce qui peut prendre la nuit ou davantage. Toutefois, on peut examiner les préparations au bout de 30 minutes, mêmes si elles ne sont pas tout à fait sèches. Après examen, ne pas essayer d'enlever l'huile d'immersion jusqu'à ce que le montage soit tout à fait sec (environ 24 heures), car en essuyant l'huile on risque d'enlever la lamelle. Si cela se produit, rincer immédiatement l'étalement au xylène pendant 5 secondes et refaire le montage. Technique pour les prélèvements de selles fixés dans l' APV

1. Remuer le prélèvement de selle fixé dans l' APV doucement mais complè-

tement (voir p. 30), de façon à bien mélanger la selle et le fixateur. 2. Etiqueter une lame comme indiqué au point 1 de la technique utilisée pour les selles fraîches. 3. Plonger un bâtonnet applicateur dans le prélèvement fixé dans l' APV afin d'en retirer un peu de suspension de selle. Etaler cette dernière en faisant rouler le bâtonnet sur la lame. On peut également étaler la selle en tapotant le bâtonnet sur la lame et en le frottant de bas en haut au fur et à mesure qu'on l'étale. La couche de matière fécale doit être aussi uniforme et lisse que possible. On doit pouvoir tout juste distinguer des caractères d'imprimerie fins au travers, mais sans pouvoir les lire. Les préparations trop épaisses ne se colorent pas bien et sont difficiles à examiner. Si la préparation est trop mince, il n'y a pas suffisamment de matériel pour que l'examen soit fiable. 22

PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

matière fécale étalée en tapotant le bâtonnet ~

4. Les étalements DOIVENT SÉCHER avant de pouvoir être colorés. Les laisser sécher sur une surface plane ou dans un support pour lames. On peut les laisser à température ambiante ou dans une étuve à 37°C. Il faut en généraiS à 10 heures de séchage, généralement pendant la nuit. Il est préférable de préparer les étalements dans la journée, de les laisser sécher la nuit et de les colorer le lendemain. En cas de besoin, on peut conserver les étalements secs 3 à 4 semaines avant de les colorer. 5. Plonger l'étalement séché fixé à l' APV dans une solution d'iode dans l'alcool. i) ii) iii) iv)

v)

vi) vii) viii) ix) x)

Solution d'iode dans l'alcool- 15 minutes. Egoutter comme indiqué précédemment pour les étalements préparés à partir de selles fraîches. Ethanol à 70% (1)- 5 minutes. Egoutter. Ethanol à 70% (2)- 5 minutes. Egoutter. Solution de trichrome- 8 minutes. Si l'on colore plusieurs lames à la fois, n'en retirer qu'une du colorant et l'égoutter (laisser les autres dans le colorant). Ne décolorer qu'une lame à la fois. Solution décolorante à l'alcool-acide acétique- tenir la lame avec des pinces et la plonger rapidement dans la solution décolorante à 2 ou 3 reprises (5 secondes au total). L'égoutter 1 à 2 secondes. (Voir point 9 page 22). Ethanol à 95% (1) -Plonger la lame à deux reprises dans la solution pour éliminer l'acide. L'égoutter 2 secondes. Ethanol à 95% (2)- 5 minutes. Egoutter. Solution de xylène phéniqué ou alcool absolu - 7 minutes. Egoutter. Xylène- 10 minutes. Retirer une lame du xylène, l'égoutter pendant 2 secondes, puis la poser à plat ·sur du papier absorbant ou un morceau de papier. Pour le montage, procéder comme indiqué pour les échantillons de selles fraîches (page 22).

Aspect de l'étalement coloré au microscope

L'aspect des étalements préparés à partir de selles fixées dans l' APV est le même que celui des selles fraîches, mais on peut observer des variations d'un étalement à l'autre en raison: - de l'épaisseur des étalements qui ne sera jamais exactement la même, - de la durée de la décoloration qui peut être légèrement différente, et - du fait que les selles varient d'une personne à l'autre. En générat le substrat est coloré en vert ou en bleu-vert. Il peut arriver qu'un échantillon se colore en rouge, mais cela n'empêche pas de repérer ni d'identifier les éléments parasitaires. Les différentes inclusions présentes dans les selles se colorent de la manière suivante:

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

VERT (ou bleu-vert)

- cytoplasme des formes végétatives et des kystes (bien fixés et bien colorés), - cytoplasme des cellules de pus et des cellules d'origine tissulaire, - levures et moisissures (généralement), - protozoaires dégénérés, - parasites ayant été trop ou trop peu décolorés, - Blastocystis hominis (un protozoaire souvent retrouvé dans les selles), qui contient des granules rouges situés tout autour de la bordure externe de la cellule. VIOLET (ou bleu-violet ou rouge-violet)

- cytoplasme des formes végétatives et des kystes (parfois), - kystes d'Entamoeba coli (parfois), hématies ingérées et bactéries situées à l'intérieur des formes végétatives. ROUGE (ou rouge-violet)

- hématies ingérées et bactéries situées à l'intérieur des formes végétatives, - levures et moisissures (parfois), - kystes n'ayant pas été correctement fixés, - noyaux des cellules de pus et des cellules d'origine tissulaire, - chromatine nucléaire des formes végétatives et des kystes, cristalloïdes des kystes d'amibes.

Examen des étalements colorés 1. Poser l'étalement monté et tout à fait sec sur la platine du microscope et mettre au point avec l'objectif le plus faible (x 10). Choisir un endroit qui ne soit ni trop mince ni trop épais. Si l'étalement est uniforme (tous les endroits ont à peu près la même épaisseur), mettre au point au hasard avec l'objectif x 10. Certaines zones de l'étalement peuvent être trop épaisses pour qu'on puisse voir facilement au travers; d'autres peuvent être trop minces. Si l'ensemble de l'étalement est trop épais, rechercher l'endroit le plus mince. Les éléments parasitaires les mieux colorés seront en général retrouvés dans les zones les plus minces. Si l'ensemble de l'étalement semble trop mince, rechercher l'endroit le plus épais. Les éléments parasitaires seront probablement mieux colorés dans ces zones épaisses. 2. Déposer une goutte d'huile à immersion sur l'endroit choisi et passer à l'objectif à immersion. Les étalements colorés de matière fécale doivent être examinés à l'immersion. Ne pas employer le fort grossissement à sec. 3. Mettre soigneusement au point avec l'objectif à immersion. Régler l' éclairage du microscope à l'aide du diaphragme pour avoir suffisamment de lumière et pour pouvoir voir distinctement les cellules, bactéries et autres éléments présents dans le champ. Déplacer la lame sur la platine, en mettant au point soigneusement sur chaque nouveau champ, afin d'observer les éléments présents dans les divers plans de l'étalement. Il faut examiner environ la moitié de l'étalement; il n'est pas nécessaire d'examiner toute la partie recouverte par la lamelle comme cela s'impose avec les préparations en soluté physiologique. 24

PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

4. Il s'agit de rechercher principalement les formes végétatives et les kystes d'Entamoeba histolytica et de Giardia. S'il y a beaucoup de parasites dans l'échantillon, ils seront identifiés en quelques minutes. Si ce n'est pas le cas, continuer à examiner l'étalement.

Identification des parasites dans les étalements colorés Dans les étalements colorés, on observera à la fois les formes végétatives et les kystes d'amibes et de flagellés. Leur cytoplasme sera coloré en bleu-vert ou en vert; les noyaux, inclusions de type hématies et bactéries, les cristalloïdes des kystes d'amibes et les filaments des flagellés se coloreront généralement en rouge ou en violet. Le glycogène est dissous au cours de la coloration et n'est pas visible dans les préparations colorées. Là où il a été éliminé, on observera des zones transparentes ou blanches. Les caractéristiques employées pour identifier les protozoaires dans les étalements colorés sont présentées dans la deuxième partie, pp. 73-82.

Ecouvillonnage anal à la recherche des œufs d'oxyures On utilise l' écouvillonnage anal pour déceler la présence des oxyures (Enterabius vermicularis). Ceux-ci sont plus courants chez l'enfant que chez l'adulte. Toutefois, si dans une famille un enfant a des oxyures il arrive souvent que d'autres membres de la famille soient infestés. Par conséquent, si l'on en trouve chez un enfant, il est souhaitable d'examiner des prélèvements effectués chez tous les membres de la famille, en particulier chez les autres enfants. On retrouve en général les œufs d'oxyures dans les plis cutanés de la marge anale. Ils apparaissent rarement dans les selles.

Prélèvement Matériel nécessaire pour la méthode A

Centrifugeuse Ecouvillons (coton) Lames porte-objets Pipettes Pasteur avec poires en caoutchouc Soluté physiologique pour humidifier les écouvillons Tubes à essais, 100 x 13 mm Technique - Méthode A

Ecarter les fesses du malade, et frotter le pourtour de l'anus avec l'écouvillon, mais sans l'introduire dans l'anus. Mettre l'écouvillon dans un tube. Matériel nécessaire pour la méthode 8

Cellophane adhésive transparente Abaisse-langue ou cuillère en plastique ayant un manche de 10 cm de long Lame porte-objet Technique- Méthode 8

1. Plier une bande de cellophane adhésive transparente autour de l'extrémité d'un manche de cuillère ou d'un abaisse-langue, le côté adhésif vers l' extérieur.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

2. De l'autre main, écarter les fesses du malade. Appuyer l'extrémité de la cuillère portant la cellophane adhésive en différents endroits de la marge anale. 3. Coller ensuite le morceau de cellophane adhésive sur une lame. Avant de l'examiner, le soulever et déposer une goutte d'huile à immersion en son milieu et le recoller. Cela permettra d'améliorer la transparence de la cellophane. Se laver les mains; autrement, les œufs qui ont pu les contaminer peuvent provoquer une infestation s'ils arrivent jusqu'à la bouche de l'opérateur. Pour augmenter les chances de recueillir des œufs,le prélèvement doit être fait entre 22 heures et minuit, ou tôt le matin, avant que le malade n'ait uriné, déféqué ou fait sa toilette. Il est parfois nécessaire de procéder à plusieurs examens avant d'obtenir un résultat positif. Méthode d'examen

Le prélèvement sur cellophane adhésive permet un examen direct. Pour les écouvillons, procéder comme suit : 1. Verser dans le tube contenant l'écouvillon suffisamment de soluté physiologique pour recouvrir le coton- soit environ 5 ml. 2. Laisser reposer pendant 4 à 5 minutes. 3. Retirer l'écouvillon du soluté. Le rouler contre les parois du tube pour éliminer le liquide. 4. Jeter l'écouvillon. 5. Concentrer l'échantillon en le centrifugeant pendant 1 minute. 6. A l'aide d'une pipette, éliminer soigneusement le surnageant sans troubler le peu de culot présent. 7. Toujours à l'aide d'une pipette, transférer le culot sur une lame pour examen. Diminuer l'éclairage du microscope et mettre au point de la surface vers le fond de la préparation pour observer les œufs d'Enterobius (pour leur description, voir deuxième partie, pp. 69-71).

Etalement épais de matière fécale sous cellophane pour le diagnostic des bilharzioses intestinales (technique de Kata-Katz) Cette technique d' exarpen des étalements épais s'est avérée un moyen efficace pour diagnostiquer les bilharzioses et les helminthiases intestinales. Ces étalements peuvent être préparés sur le terrain, conservés dans des boîtes de lames et expédiés au loin pour examen dans un laboratoire central, le cas échéant. En revanche, elle ne convient pas pour rechercher les larves, kystes ou œufs de certains parasites intestinaux. Matériel et réactifs

Bâtonnets applicateurs, en bois Tamis, en acier inoxydable, nylon ou plastique, avec mailles de 60-105 Plaque perforée en acier inoxydable, plastique ou carton Lames porte-objets Cellophane, de 40 à 50 11rn d'épaisseur, en rectangles de 25 x 30 ou 25 x 35 mm Bocal à fond plat Pinces Papier hygiénique ou papier absorbant Papier journal Solution de glycérol-vert malachite (ou bleu de méthylène) (réactif N°12) 26

PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

Technique

Il faut être prudent lorsque l'on recueille des selles et toujours porter des gants pour éviter toute contamination des doigts. 1. Tremper les rectangles de cellophane dans la solution de glycérol-vert malachite ou de bleu de méthylène à 50% pendant au moins 24 heures avant usage. 2. Déposer une petite quantité de matière fécale sur un morceau de papier (le papier journal convient parfaitement). 3. Appuyer le tamis sur l'échantillon. 4. Au moyen d'un bâtonnet applicateur à bord plat, racler la surface supérieure du tamis pour recueillir la matière fécale qui sort des mailles. 5. Disposer une plaque perforée sur une lame propre. 6. Déposer un peu de matière fécale tamisée dans la partie évidée et la remplir soigneusement. Lisser avec le bâtonnet applicateur. 7. Enlever soigneusement la plaque de façon que toute la matière fécale reste sur la lame et que rien ne reste accroché à la plaque. 8. Recouvrir avec un rectangle de cellophane ayant trempé dans le glycérol. 9. S'il y a trop de glycérol sur la face supérieure de la cellophane, l'essuyer avec un morceau de papier hygiénique ou de papier absorbant. 10. Retourner la lame et appuyer l'échantillon contre la cellophane sur une surface lisse (un morceau de tuile ou de pierre plate fait parfaitement l'affaire) pour l'étaler de manière uniforme. 11. Ne pas retourner la lame d'un coup. La cellophane pourrait se détacher. La soulever doucement sur le côté en maintenant la cellophane.

La préparation de la lame est maintenant terminée. Il peut être nécessaire d'essuyer l'excès de glycérol avec un morceau de papier hygiénique pour que la cellophane reste bien fixée. Avec de la pratique, on peut obtenir des préparations parfaites. La figure 2 montre les différentes étapes de la préparation de Y étalement épais.

Selles dures Le principal problème rencontré avec cette technique d'étalement épais est l'impossibilité d'observer des œufs d'helminthes dans certains échantillons de selles trop dures (constipation). En pareil cas: après préparation par la méthode classique, attendre 24 à 48 heures avant de compter les œufs sur ces lames. Il se peut qu'elles s'éclaircissent lentement; préparer deux autres échantillons sur une grande lame (5 x 7,6 cm) et utiliser un morceau c~e cellophane légèrement plus grand (35 x 35 mm), puis appuyer très fort pour aplatir l'échantillon au maximum; - lorsque l'on emploie une grande lame, on peut ramollir les selles avec du soluté physiologique ou du glycérol avant de tamiser.

Observation correcte des lames A température ambiante, on conservera la lame pendant au moins 24 heures avant de l'examiner (voir plus bas pour ce qui concerne les œufs d'ankylostomes). Si l'on met la lame dans un incubateur (40°C) ou sous une lampe à fluorescence ou à incandescence au laboratoire, ou encore au soleil sur le terrain, on peut l'examiner au bout de quelques minutes. Pour faciliter Yexamen microscopique, on peut déposer une ou deux gouttes d'éosine dans le soluté physiologique (1: lOO) sur la face supérieure de la cellophane, que Y on laisse agir 3 à 5 minutes, puis que l'on essuie avec du papier hygiénique ou du papier absorbant. Cela facilite l'observation des œufs de

Schistosoma. 27

TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Fig. 2. Technique d'examen des étalements épais de matière fécale sous cellophane (Kato) pour le diagnostic de la bilharziose intestinale et des helminthiases digestives

1. On peut utiliser différents types de matériels. On voit ici la spatule et la plaque perforée en plastique, ainsi que le tamis en nylon d'un nécessaire de KataKatz que l'on trouve dans le commerce. Les deux premiers ustensiles et les lames porte-objets sont réutilisables. Le tamis en nylon est jetable. Il existe quelques nécessaires contenant des plaques perforées normalisées réutilisables, que l'on peut obtenir sur commande.

2. Le tamis en nylon et la cellophane nécessaires pour la technique de l'étalement épais peuvent être achetés en vrac. La cellophane en rouleau est coupée en morceaux de 25-30 mm et déposée dans un flacon à fond plat et à large ouverture contenant une solution de glycérol à 50% (ou davantage) et de vert malachite ou de bleu de méthylène (lOO ml d'eau, 100 ml de glycérol, 1 ml de vert malachite ou de bleu de méthylène en solution aqueuse à 3%).

3. La méthode utilisée pour cette technique est la même quel que soit le matériel employé. Le prélèvement de matière fécale est passé à travers le tamis au moyen d'une spatule afin de séparer la matière fécale des gros débris.

4. Cette matière fécale tamisée est ensuite mise dans la plaque perforée qui est posée à plat au milieu d'une lame. La partie évidée est entièrement remplie de matière jusqu'à hauteur de la surface de la plaque. La plaque de Kato-Katz que l'on voit ici donne 41,7 mg de matière fécale. Pour obtenir le nombre d'œufs par gramme de matière fécale, on multiplie le nombre d'œufs observés par 24.

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PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

Fig. 2. (Suite)

S. Le rectangle de cellophane ayant trempé dans le glycérol pendant au moins 24 heures est posé sur le prélèvement.

6. La lame est retournée sur un morceau de verre ou sur une autre lame et la matière fécale est étalée sous la cellophane par pression uniforme, comme il est montré ici. Une fois qu'elle est prête, on dépose une autre goutte de glycérol sur la cellophane et on lisse les bords de la cellophane pour que la lame se conserve bien. Si des bulles d'air se forment sous la cellophane en cours de conservation, une ou deux gouttes de glycérol déposées sur la cellophane et que l'on laisse reposer une nuit permettront de les éliminer. Ces étnlements épais sous cellophane peuvent être préparé, ::;:rr le terrain, conservés dans des boîtes de lames et expédiés au loin, ce qui permet de les examiner dans un laboratoire central le cas échéant, quelques jours ou quelques semaines plus tard .

• ,

7. Les œufs d'Ascaris (gauche) et de Trichuris (droite) sont visibles à tout moment. Les œufs d'ankylostomes (absents ici) ne sont visibles que dans les 30 minutes qui suivent le montage.

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8. Le moment idéal pour observer les œufs de S. mansoni, S. intercalatum ou S. japonicum se situe 24 heures après le montage. Au soleil, les lames s'éclaircissent rapidement et il n'est pas forcément nécessaire d'attendre 24 heures.

TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Expédition des prélèvements à un laboratoire de référence S'il faut envoyer les prélèvements à un autre laboratoire pour examen, il faut les conserver de manière à ce que les parasites ne se modifient pas. On emploie pour cela deux conservateurs: - le formol à 10%- pour la conservation des œufs, larves et kystes dans les préparations à l'état frais; - l' APV, un fixateur- pour la conservation des formes végétatives et des kystes, de manière à pouvoir faire une coloration permanente des étalements. Matériel et réactifs

Ruban adhésif Bâtonnets applicateurs en bois Flacons, 1 000 ml Etiquettes Crayon ou feutre pour l'étiquetage Flacons, 20 ml, avec bouchons vissés bien ajustés Formol (formaldéhyde) à 10% (réactif N° 10) APV1 (fixateur) (réactif No 22).

Conservation des prélèvements 1. Inscrire les nom et prénom ou le numéro du malade sur deux flacons de 20 ml. Inscrire la lettre F sur le coin supérieur droit de l'étiquette de l'un d'eux, et l'abréviation APV dans le coin supérieur droit de l'étiquette de l'autre. 2. Remplir à peu près à moitié le flacon «F» avec du formol à 10%. Remplir à peu près à moitié le flacon «APV »avec de l' APV. 3. A l'aide d'un bâtonnet applicateur, prélever un peu de matière fécale, de manière à avoir à la fois un peu de l'intérieur et du bord de l'échantillon et mélanger avec le formol à 10%. S'assurer que le tout est très soigneusement mélangé; écraser les morceaux. Prendre suffisamment de selle, mais pas trop, de façon que le mélange occupe environ les 2/3 ou les 3/4 du flacon. 4. A l'aide d'un bâtonnet applicateur, prélever un peu de la partie la plus molle de la selle et la mélanger avec l' APV comme décrit pour le formol. L'ensemble du mélange selle-APV ne doit pas occuper pl us des 314 du flacon. S'assurer que le mélange est très soigneusement fait. Ecraser les morceaux contre les parois du flacon. 5. Bien visser les bouchons des flacons. Entourer de ruban adhésif le haut de chaque flacon pour éviter toute fuite. 6. Emballer soigneusement les flacons dans une boîte ou un récipient d' expédition et les envoyer au laboratoire de référence. S'assurer que les flacons sont entourés d'un matériau absorbant (par exemple, coton, papier journal) et qu'ils sont bien protégés des chocs. 7. S'assurer que les informations nécessaires les accompagnent: nom et prénom ou numéro du malade, date d'expédition, parasites trouvés.

Elimination des prélèvements 1. Si les selles sont recueillies dans des boîtes en carton, la meilleure façon de s'en débarrasser est de brûler le tout. Sic' est impossible, ou si les selles ont 1 La préparation de I'APV est complexe, et fait appel à des solutions toxiques et corrosives. La technique figure dans l'annexe 2 (réactif W 22), mais il est peut-être préférable de préparer ce fixateur dans un laboratoire de niveau supérieur. Autrement, on en trouve dans le commerce, prêt à l'emploi.

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PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

été recueillies dans un récipient métallique ou en verre, recouvrir de formol à 10% ce qui reste dans le récipient. Cela tuera tous les parasites présents. Laisser reposer pendant au moins 1 heure avant de jeter le tout ou de laver le récipient (s'il est en verre). 2. Les lames employées pour les préparations à l'état frais doivent tremper dans un bac de désinfectant (par exemple, de l'hypochlorite de sodium) pendant au moins 1 heure avant lavage. Utiliser un bâtonnet applicateur pour pousser la lamelle dans un bêcher ou un petit bac de désinfectant, puis mettre la lame dans un autre bac. Les lamelles se cassent facilement; si on les met avec les lames, elles peuvent se briser et la personne qui les lave risque de se couper. 3. Entonnoirs, bouchons et tubes à centrifuger doivent également tremper dans du désinfectant pendant 1 heure avant lavage. 4. Les bâtonnets applicateurs et les compresses de gaze doivent être brûlés. Si c'est impossible, on peut les jeter après les avoir fait tremper dans du désinfectant.

Contrôle de la qualité des examens coprologiques Pour obtenir des résultats exacts et fiables, il faut appliquer un système de contrôle de la qualité des méthodes de laboratoire employées pour le diagnostic des infestations parasitaires. Ce contrôle doit être appliqué à la technique de prélèvement, à la préparation des réactifs, et aux techniques de préparation et d'examen des préparations finales.

Techniques de prélèvement Si les prélèvements de matières fécales ne sont pas correctement réalisés et traités avant examen, ils présenteront peu ou pas d'intérêt pour un diagnostic précis. Cela vaut particulièrement pour les protozoaires. Les formes végétatives d'amibes vont commencer à dégénérer 1 à 2 heures après émission de la selle et les modifications de leur aspect peuvent donner lieu à des erreurs d'identifications. Les formes végétatives de flagellés peuvent également subir des modifications rendant leur détermination difficile. Si les selles attendent plusieurs heures ou toute la nuit, les kystes se détérioreront, surtout si la température est élevée. La fraîcheur de la selle est moins importante pour les œufs et les larves d'helminthes que pour les protozoaires. Néanmoins, il peut se produire des modifications qui gêneront leur identification. Par exemple, les œufs d'ankylostomes peuvent être embryonnés et donner naissance à des larves. Même les œufs d'Ascaris peuvent se développer jusqu'aux stades multicellulaires. En outre, les larves peuvent dégénérer dans des selles trop anciennes empêchant toute identification de l'espèce. Pour faire en sorte que les prélèvements fournis pour l'examen soient bons, il faut être attentif aux points suivants: 1. Employer des récipients propres et secs pour recueillir les selles. (Les saletés gêneront l'examen et peuvent introduire des micro-organismes vivant à l'état libre dans le sol, qui poseront des problèmes d'identification d'espèce. Les urines et l'eau détruiront les formes végétatives s'il y en a.) 2. Porter l'échantillon au laboratoire dès qu'il est recueilli pour éviter toute détérioration des protozoaires et toute altération de la morphologie de ces derniers et de celle des helminthes. Inscrire le nom du malade et la date et l'heure à laquelle la selle a été émise. 31

TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

3. N'accepter pour l'examen que les selles fraîches. Ne pas essayer d'examiner des selles qui ont attendue ou qui sont contaminées par des saletés, de l'eau ou de l'urine. Demander plutôt au malade d'en apporter d'autres. 4. Si les selles ne peuvent être examinées dès leur arrivée, les mettre au réfrigérateur (4-5°C) ou dans l'endroit le plus frais et le plus ombragé du laboratoire. Ne pas les laisser au soleil. 5. Examiner les selles diarrhéiques et celles contenant du sang et du mucus dès leur arrivée au laboratoire.

Préparation des réactifs Pour préparer les réactifs, suivre scrupuleusement les formules et directives données. Ne pas modifier les ingrédients, ni leur quantité, ni la méthode de préparation, de quelque manière que ce soit. Conserver les réactifs comme indiqué dans la méthode de préparation. Certains réactifs se conservent indéfiniment s'ils sont correctement bouchés et à l'abri de la lumière solaire directe. C'est le cas par exemple des solutions de formol, du soluté physiologique, des fixateurs et des solutions dans l'alcool (sauf s'il y a évaporation). Les autres réactifs ne se conservent que peu de temps et sont inefficaces s'ils sont trop vieux. La durée d'utilisation de chaque solution est indiquée dans les instructions relatives à sa préparation. 1. Inscrire sur tous les réactifs la date à laquelle ils ont été préparés. Tenir un registre des solutions. Le passer en revue une fois par semaine et jeter les solutions périmées. 2. Bon nombre des solutions employées dans la coloration au trichrome doivent être renouvelées à intervalles réguliers. Ceux-ci figurent dans les instructions accompagnant cette technique et doivent être observés. Si ce n'est pas le cas, on obtiendra de mauvaises préparations, sans intérêt sur le plan diagnostique.

Techniques de préparation et d'examen des lames Aucune méthode d'examen coprologique n'est efficace à 100% - ce qui signifie que ces méthodes ne permettront pas toujours de retrouver toutes les espèces présentes et, si les individus d'une espèce donnée ne sont présents qu'en très petit nombre, qu'ils peuvent échapper à l'observation si l'on n'examine qu'un seul échantillon. Parce que ces techniques ne sont pas parfaites, il faut les appliquer aussi soigneusement que possible pour obtenir les meilleurs résultats. De plus, il faut s'assurer qu'on utilise bien les techniques appropriées au matériel examiné.

Examen direct à l'état frais 1. S'assurer que la préparation a une bonne densité. On doit pouvoir lire de petits caractères d'imprimerie au travers (mais pas trop nettement). S'il est trop épais ou trop mince, l'observation des éléments parasitaires peut être difficile. 2. Renouveler les solutions d'iode tous les 10 à 14 jours. Une solution trop ancienne ne colorera pas correctement les kystes. Elle ne doit pas non plus être trop forte, sinon la matière fécale peut s'agglutiner en une masse compacte, piégeant des parasites qui seront dès lors invisibles. Si elle est trop faible, les kystes ne seront pas correctement colorés.

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PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

Méthode de concentration 1. Choisir un échantillon bien représentatif de la selle pour la concentration. 2. Préparer des suspensions soigneusement mélangées de matières fécales dans Y eau ou le soluté physiologique. 3. Prendre les quantités de matériel appropriées. 4. Centrifuger à la bonne vitesse pendant le temps recommandé. 5. Préparer et examiner soigneusement les lames montées comme décrit pour les préparations à l'état frais. 6. Ne pas jeter le tube contenant le matériel concentré jusqu'à ce que l'examen soit terminé. On peut avoir besoin de faire une autre préparation.

Méthodes de coloration 1. Choisir des portions de selles molles et contenant du mucus, s'il y en a, pour faire les étalements à colorer. 2. S'assurer que les solutions sont encore bonnes. Les renouveler conformément aux instructions figurant dans les méthodes de coloration. Conserver les flacons des solutions-mères hermétiquement fermés à l'abri de la lumière solaire directe. 3. S'assurer que les boîtes à coloration sont bien fermées. Laisser les couvercles fermés, sauf pour introduire ou retirer des lames. Si on laisse les boîtes à coloration ouvertes, les solutions peuvent s'évaporer ou des débris peuvent tomber dedans et adhérer à la préparation. 4. Employer la quantité requise de milieu de montage. S'il y en a trop, on aura une couche épaisse à travers laquelle il sera difficile de mettre au point et l'étalement ne sera pas bien visible. S'il y en a trop peu, il y aura des vides sous la lamelle. Si l'étalement a été préparé à partir de selles fraîches, les zones de vide peuvent gêner le diagnostic. Elles rendent également la préparation difficile à examiner. 5. Toujours examiner les étalements colorés avec l'objectif à immersion. Employer l'objectif x 10 pour mettre au point sur l'étalement. S'il n'est pas uniforme, choisir une zone où l'étalement n'est ni trop mince ni trop épais et qui est bien colorée. Passer alors à l'objectif à immersion et rechercher les formes végétatives et/ ou les kystes de protozoaires.

NE PAS OUBLIER QU'UNE IDENTIFICATION FIABLE ET PRÉCISE DES PARASITES REPOSE SUR: • • •

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DES PRÉLÈVEMENTS SATISFAISANTS UNE BONNE PRÉPARATION ET UNE BONNE CONSERVATION DES RÉACTIFS LA MISE EN ŒUVRE SOIGNEUSE DES TECHNIQUES APPROPRIÉES ET L'EXAMEN MINUTIEUX DES PRÉPARATIONS FINIES

Urines On examine en général les urines à la recherche d'œufs de Schistosoma haematobium. On peut également y voir des formes végétatives de Trichomonas vaginalis. Dans les pays où la filariose est endémique, on peut trouver dans le culot de centrifugation des urines parfois laiteuses de certains malades des microfilaires appartenant aux espèces Wuchereria bancrofti et Onchocerca volvulus. Dans les régions d'endémie bilharzienne, le premier signe de l'infestation est une hématurie et/ ou une protéinurie décelable à l'aide de bandelettes réactives. Une hématurie importante indique une forte infestation.

Prélèvement des urines pour le diagnostic des infestations à Schistosoma Dans les urines, le nombre d'œufs varie au cours de la journée, et montre un pic entre 10 heures et 14 heures. On recueillera donc un échantillon de 10 ml au moins à ce moment-là, en fin de miction. On peut également recueillir de la même manière les urines de 24 heures. On examinera l'ensemble du prélèvement car les œufs peuvent être très rares. Demander au malade d'uriner dans une bouteille ou un flacon propre et examiner immédiatement les urines. Si elles doivent attendre plus d'une heure, ajouter 1 ml de formol (solution de formaldéhyde à 37%) non dilué pour 100 ml d'urine. Cela permettra de conserver tous les œufs présents. NOTE:

Si l'on ne dispose pas de formol, on peut ajouter 2 ml d'eau de Javel ordinaire pour 100 ml d'urine. AlTENTION

Le formol et l'eau de Javel sont corrosifs et sont dangereux en cas d'ingestion.

Examen des urines La sédimentation et la filtration sont les deux méthodes employées pour déceler les œufs de Schistosoma haematobium. La première est moins sensible mais meilleur marché et plus simple à mettre en œuvre que la seconde. La technique de filtration est surtout utilisée en santé publique lorsqu'on a besoin de données quantitatives.

Méthode de sédimentation des urines de 24 heures recueillies en fin de miction Matériel

Centrifugeuse avec couronne et adaptateurs pour tubes de 15 ml Tubes à centrifuger, coniques, 15 ml Lamelles couvre-objets Verre à pied conique pour urines Lame porte-objets Crayon ou feutre pour l'étiquetage Pipettes Pasteur, avec poires en caoutchouc. 34

URINES

Techniques

1. Agiter soigneusement l'échantillon et le verser dans un verre à pied conique. 2. Laisser reposer pendant une heure. Retirer le surnageant, transvaser le dépôt formé dans un tube à centrifuger et centrifuger à 2000 g pendant 2 minutes. 3. Examiner le culot de centrifugation à la recherche d'œufs avec l'objectif x 10, afin de balayer l'ensemble de la préparation. Ne pas centrifuger plus longtemps ni plus vite, car cela peut provoquer la rupture des œufs et la libération des miracidiums. • • •

TRAITER L'ÉCHANTILLON AUSSITÔT QUE POSSIBLE AGITER LE FLACON AVANT DE VERSER L'URINE ÉTIQUETER SOIGNEUSEMENT LAMES/TUBES/PAPIERS FILTRES

Méthode de filtration à la seringue Matériel et réactifs

Lamelles couvre-objets Porte-filtres, 13 mm ou 16 mm de diamètre Pinces Seringue plastique, 10 ml Filtre à membrane1, 12 ~ou 20 ~rn (polycarbonate), filtre en nylon ou papier filtre Lames porte-objets Lugol (solution-mère à 5%) (réactif no 17). Technique

1. Disposer un filtre de polycarbonate ou de nylon (porosité, 12 à 20 J..Lm) dans le porte-filtre. On peut également utiliser du papier filtre (Whatman No 541 ou N° 1). Agiter l'échantillon d'urine en le secouant doucement ou en remplissant et en vidant la seringue à deux reprises. 2. Aspirer 10 ml d'urine dans la seringue et fixer le porte-filtre sur la seringue. (Si l'échantillon fait moins de 10 ml, le mentionner dans le cahier de laboratoire.) 3. En maintenant le tout vertical, faire passer l'urine de la seringue dans le porte-filtre au-dessus d'une cuvette ou d'un évier.

Il

>. Il y en a quatre, situées aux quatre coins de l'embryon. Travailler à fort grossissement, diminuer légèrement la lumière et rechercher le mouvement rapide des cils (petits poils) de ces cellules.

Examen quantitatif Les résultats des examens d'urine, effectués par filtration à la seringue pour déceler les infestations à S. haematobium, peuvent être rangés dans les catégories suivantes: Infestation légère: 1 à 49 œufs pour 10 ml d'urine Forte infestation:> 50 œufs pour 10 ml d'urine Une troisième catégorie pour les échantillons renfermant plus de 500 ou plus de 1000 œufs de S. haematobium pour 10 ml d'urine est parfois nécessaire dans les régions où l'intensité de l'infestation atteint fréquemment ce niveau (c'està-dire dans plus de 10% des cas).

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Prélèvements vaginaux et urétraux On examine les prélèvements vaginaux et urétraux à la recherche de Trichomonas vaginalis, un flagellé parasite du système génito-urinaire. Il parasite aussi bien l'homme que la femme, mais l'homme est habituellement asymptomatique. Trichomonas vaginalis est en général identifié dans des préparations non fixées de prélèvements vaginaux ou urétraux. (Dans les préparations colorées ces parasites sont très déformés, et peuvent ne pas être identifiables.)

Techniques de prélèvement Matériel

Centrifugeuse avec couronne et adaptateurs pour tubes de 100 x 13 mm (les mêmes adaptateurs porteront les tubes coniques de 15 ml et les tubes de 100 x 13 mm) Lamelles couvre-objets Ecouvillons, stériles (coton) Lames porte-objets Pipettes Pasteur, avec poire de caoutchouc Crayon ou feutre pour l'étiquetage Tubes à essais, petits, 100 x 13 mm, avec bouchons de coton ou bouchons vissés, et contenant chacun 3 ml de soluté physiologique stérile. Technique

1. Avec un écouvillon stérile, effectuer le prélèvement vaginal ou urétral. 2. Mettre immédiatement l'écouvillon dans un tube stérile contenant environ 3 ml de soluté physiologique stérile. Briser l'extrémité du bâtonnet s'il est trop long pour le tube. 3. Si on le souhaite, on peut préparer des frottis àcolorer. Pour cela recueillir davantage de matériel au moyen d'un second écouvillon stérile et faire le frottis sur une lame. Laisser sécher. 4. Inscrire les nom et prénom ou le numéro du malade et la date du prélèvement sur le tube et sur la lame. NOTE:

Si le malade peut se rendre au laboratoire, on procède à un examen direct de préparations à l'état frais. Les tubes sont alors inutiles.

Examen direct de frottis vaginaux et urétraux 1. Si le malade peut se rendre au laboratoire, recueillir un peu d'écoulement vaginal ou urétral à l'aide d'un écouvillon stérile et le déposer sur une lame dans une goutte de soluté physiologique. 2. Recouvrir d'une lamelle et examiner aux objectifs x 10 et x 40 à la recherche de flagellés mobiles.

Matériel centrifugé ou sédimenté 1. Si l'on reçoit un écouvillon dans du soluté physiologique, récupérer le liquide en pressant le coton contre les parois du tube. Jeter ensuite l'écouvillon. 2. Centrifuger le tube pendant 2 minutes. S'il n'y a pas de centrifugeuse, laisser reposer le tube pendant 10 minutes afin de laisser les particules éventuelles se déposer au fond. 38

PRÉLÈVEMENTS VAGINAUX ET URÉTRAUX

3. A l'aide d'une pipette, éliminer le surnageant sans toucher au culot. 4. Prélever une goutte de culot et la déposer sur une lame. 5. Recouvrir d'une lamelle et examiner aux objectifs x 10 et x 40 à la recherche de flagellés mobiles. Dans les préparations à l'état frais, on peut identifier les flagellés grâce à leurs mouvements caractéristiques. Les formes végétatives de Trichomonas ont un mouvement nerveux et saccadé. Comme T. vaginalis est la seule espèce de Trichomonas parasitant le système génito-urinaire, il est inutile d'étudier les caractères morphologiques qui permettent de la différencier de T. hominis, qui vit dans l'intestin. Il arrive parfois, mais c'est rare, que l'on prenne les corps ciliés des cellules épithéliales du tractus génital pour des parasites.

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Prélèvements de sang et autres prélèvements On recherche dans le sang les parasites suivants:

- Plasmodium - Microfilaires

- Trypanosoma - Leishmania Les frottis colorés restent la technique d'examen du sang la plus couramment employée. On emploie en général le Giemsa (l'un des colorants de Romanowsky) pour ces frottis. Lorsqu'on a besoin d'un diagnostic rapide, on peut également employer la coloration de Field. L'hématoxyline de Delafield est utilisée pour les microfilaires. Selon les circonstances, on emploiera des gouttes épaisses ou des frottis minces. Les premières permettent une meilleure détection des parasites et font gagner du temps lors de l'examen. Toutefois, la technique du frottis mince déforme très peu le parasite et permet une identification de l'espèce lorsque c'est impossible avec les gouttes épaisses; son seul inconvénient est qu'il faut examiner de nombreux champs pour déceler la présence des parasites lorsqu'il y en a peu. Par conséquent, on réalisera toujours les deux types de préparations lorsqu'on recherche Plasmodium et trypanosomes; s'il est impossible d'identifier précisément le parasite sur la goutte épaisse, on examinera alors le frottis mince. Pour rechercher les microfilaires, on fera des gouttes épaisses. Le plus économique consiste à associer goutte épaisse et frottis mince sur la même lame. Toutefois, ils doivent être complètement secs (8 à 10 heures ou toute la nuit) avant de pouvoir être correctement colorés. Pour le paludisme, les lames seront colorées le jour même. Parfois, le médecin peut avoir besoin d'un diagnostic rapide. En pareil cas, faire le frottis mince et la goutte épaisse sur des lames séparées. Les frottis minces sèchent rapidement et peuvent être immédiatement colorés. Utiliser la coloration de Field rapide et examiner la lame tandis que le Giemsa est en cours. Rechercher les Plasmodium. S'ils sont visibles, un diagnostic de paludisme peut être posé et l'espèce de Plasmodium identifiée par le Giemsa. Si les parasites sont invisibles dans le frottis mince, colorer la goutte épaisse au colorant de Field. Rechercher les Plasmodium. Il est parfois difficile d'identifier l'espèce dans les gouttes épaisses et il arrive que l'on doive les envoyer à un autre laboratoire pour avoir l'avis d'un spécialiste. Les préparations directes de sang total frais (ou de sang centrifugé) sont en général utilisés pour déceler microfilaires et trypanosomes. Ils ne font que permettre le diagnostic d'infestation, et il faut faire des frottis colorés pour savoir en présence de quelle espèce on se trouve. Dans les régions où il est possible de trouver à la fois Plasmodium, trypanosomes et/ ou microfilaires, on fera des préparations à l'état frais et des frottis colorés. S'il n'y a ni trypanosomes, ni microfilaires dans la région, il suffit de faire des frottis colorés pour rechercher les Plasmodium.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Frottis sanguins colorés Prélèvements Il convient d'appliquer des techniques rigoureuses de prélèvement du sang et de préparation des frottis. Ne jamais oublier qu'il existe un risque de transmission d'un certain nombre de maladies virales, bactériennes et parasitaires par le sang. Matériel et réactifs

Bloc de bois rainuré (support pour lames) Flacon, petit (30 à 100 ml) avec compte-gouttes et bouchon vissé, ou petit flacon de verre (30 à 100 ml) avec bouchon vissé et compte-gouttes séparé (avec tétine en caoutchouc) Eprouvettes graduées, 10 mt 25 ml et 50 ml Pinces Compresses de gaze Baguette de verre Hémostyles stériles Crayon ou feutre pour Yétiquetage Lames porte-objets Registre ou fiche d'enregistrement Boîtes à coloration Papier buvard Alcoot éthanol à 70% ou isopropanol Tampon phosphate (réactif N° 3) Méthanol dans un flacon compte-gouttes. Colorant dilué (voir «Coloration des frottis sanguins au Giemsa», p. 44-45). Les directives relatives à la préparation de la dilution nécessaire pour chaque type de frottis y figurent, accompagnées de détails relatifs à l'aspect technique de la coloration1 . Les solutions diluées de Giemsa ne se conservent que 8 heures. Elles doivent donc être préparées extemporanément et non à l'avance. On les jettera en fin de journée.

Préparation d'une goutte épaisse et d'un frottis mince sur la même lame En microscopie paludéenne courante, on prépare sur la même lame un frottis mince et une goutte épaisse. Le frottis sert d'une part à l'étiquetage, mais s'il est bien préparé, il peut également servir à la confirmation de l'espèce. L'examen portera sur la goutte épaisse. Technique

Après avoir consigné les données relatives au malade sur la fiche ou le registre approprié, on prépare les frottis sanguins de la manière suivante: 1. En tenant la main gauche du malade, paume tournée vers le haut, choisir le troisième doigt après le pouce (pour les nourrissons, on peut employer le gros orteil. Mais on ne prendra jamais le pouce, ni chez l'adulte, ni chez l'enfant). Nettoyer le doigt avec un coton inbibé d' alcoot en appuyant fermement pour éliminer la saleté et la graisse du bout du doigt. Essuyer le doigt avec un chiffon de coton propre, en appuyant fermement pour stimuler la circulation sanguine.

1

La solution-mère de Giemsa s'achète généralement sous forme de solution toute prête.

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PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

2. A l'aide d'un hémostyle stérile, piquer le bout du doigt d'un mouvement de rotation rapide. En appuyant légèrement sur le doigt, exprimer la première goutte de sang et l'essuyer avec un tampon de coton sec. S'assurer qu'il ne reste aucun brin de coton sur le doigt.

3. En procédant rapidement et en manipulant les lames propres par leurs bords, recueillir le sang comme suit: Appuyer doucement sur le doigt et recueillir une petite goutte de sang de cette taille à peu prèse au milieu de la lame: elle servira à faire le frottis mince. Appuyer de nouveau pour recueillir deux ou trois gouttes plus grosses, ayant à peu près cette taille • , sur la lame à environ 1 cm de la goutte destinée au frottis mince, comme indiqué sur la figure. Essuyer le sang restant sur le doigt avec du coton.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

4. Frottis mince. En prenant une autre lame propre pour étaler, et en maintenant la lame sur laquelle se trouvent les gouttes de sang sur une surface plane et dure, toucher la petite goutte et laisser le sang se répartir le long du bord.

Pousser fermement la lame utilisée pour étaler sur la lame porte-objet dans le sens opposé aux grosses gouttes, en le tenant incliné à 45°. S'assurer que le bord de la lame utilisée pour étaler soit bien en contact avec la surface de la lame porte-objet pendant qu'on procède à l'étalement. Le frottis ne doit pas aller jusqu'au bord de la lame portant les gouttes, afin d'éviter que la personne qui la manipule ne s'infecte. 5. Goutte épaisse. Toujours tenir les lames par leurs bords, ou par un coin, pour réaliser la goutte épaisse comme suit: En prenant le coin de la lame utilisée pour étaler, rassembler rapidement les grosses gouttes et les étaler de manière à obtenir un frottis épais et uniforme. Ne pas trop mélanger le sang, mais l'étaler en cercle ou en rectangle en 3 à 6 mouvements.

6. Laisser la goutte épaisse sécher à plat, à l'abri des mouches, de la poussière et d'une chaleur excessive. Une fois que le frottis mince est sec, y inscrire au crayon ou au feutre les nom et prénom ou le numéro du malade et la date en travers de la partie la plus épaisse (comme montré ci-dessous). Ne pas employer de stylo à bille.

7. Envelopper la lame sèche dans du papier propre et l'envoyer au plus vite, au laboratoire accompagnée de la fiche du malade.

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PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

8. La lame utilisée pour étaler le frottis doit être désinfectée et peut ensuite être réutilisée pour le malade suivant, une autre lame propre du paquet servant alors pour étaler.

Coloration des frottis sanguins au Giemsa Méthode classique de coloration de la goutte épaisse et du frottis mince sur la même lame Pour obtenir la meilleure coloration possible, ces deux types d'étalements doivent être préparés sur des lames séparées et la coloration est alors réalisée avec des concentrations et des temps de coloration différents. Il est souvent impossible de procéder ainsi, et on fait en général les deux sur la même lame. En pareil cas, il importe surtout de bien colorer la goutte épaisse. On obtient de meilleurs résultats si les étalements ont séché toute la nuit. 1. Fixer le frottis mince en y ajoutant trois gouttes de méthanol, ou en le trempant quelques secondes dans un récipient de méthanol. Une fixation prolongée peut rendre difficile la mise en évidence des granulations de Schüffner et des taches de Maurer. Pour que la déshémoglobinisation puisse avoir lieu, la goutte épaisse ne doit pas être fixée; on évitera donc tout contact de celle-ci avec le méthanol ou des vapeurs de méthanol. 2. Disposer les lames dos à dos dans une boîte à coloration. 3. Préparer une solution de Giemsa à 3% dans de l'eau distillée ou désionisée tamponnée à pH 7,2 (réactif N° 3), en quantité suffisante pour remplir les boîtes utilisées. Mélanger soigneusement le colorant. 4. Verser doucement le colorant dans la boîte, jusqu'à ce que les lames soient entièrement recouvertes. 5. Laisser colorer pendant 30 à 45 minutes à l'abri de la lumière du soleil. 6. Verser doucement de l'eau propre dans la boîte pour faire déborder la mousse irisée qui s'est fm::rnée à la surface du colorant. Ou bien, plonger doucement toute la boîte dans un récipient rempli d'eau propre. 7. Vider doucement lé resté de colorant et rincer de nouveau à l'eau propre pendant quelques secondes. Vider l'eau. 8. Retirer les lames une à une et les mettre à égoutter sur un support, le côté portant les étalements vers le bas, en s'assurant que ces derniers ne touchent pas le support.

Méthode rapide de coloration de la goutte épaisse et du frottis mince sur la même lame Cette méthode convient à la coloration rapide de la goutte épaisse dans un laboratoire très actif lorsqu'on a besoin de résultats urgents, mais elle nécessite beaucoup plus de colorant. 1. Laisser la goutte épaisse sécher complètement; si l'on a besoin de résultats rapides, on peut accélérer le séchage avec un ventilateur, ou en exposant brièvement la lame à une chaleur douce, comme par exemple celle de la lampe du microscope. On prendra soin d'éviter toute surchauffe, pour éviter que la goutte épaisse ne soit fixée par la chaleur. 2. Fixer le frottis mince en le tamponnant doucement avec un coton imbibé de méthanol, ou en le trempant quelques secondes dans un récipient de méthanol. Pour que la déshémoglobinisation puisse avoir lieu, la goutte épaisse ne doit pas être fixée; par conséquent, éviter de l'exposer au méthanol ou à des vapeurs de méthanol.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

3. Préparer une solution de Giemsa à 10% dans de l'eau distillée ou désionisée tamponnée à pH 7,2; s'il n'en faut qu'une petite quantité, 3 gouttes de colorant par ml d'eau tamponnée permettront d'obtenir une solution de Giemsa à la bonne concentration. Il faut environ 3 ml de solution par lame. 4. Verser doucement le colorant sur la lame, par exemple à l'aide d'une pipette. On peut également disposer les lames face vers le bas sur une plaque à coloration concave et introduire le colorant sous la lame. 5. Laisser colorer pendant 5 à 10 minutes. 6. Rincer doucement le colorant en ajoutant quelques gouttes d'eau propre; ne pas renverser le colorant puis rincer, car cela laisserait un dépôt d'écume sur le frottis. 7. Mettre la lame sur le support, étalements vers le bas, pour qu'elle s'égoutte et sèche, en s'assurant que les étalements ne touchent pas le support.

Coloration de Field La coloration de Field permet une détection rapide des Plasmodium (mais elle ne colore pas toujours les granulations de Schüffner).

Méthode de coloration des gouttes épaisses Matériel

Une boîte à coloration remplie de colorant de Field A Une boîte à coloration remplie de colorant de Field B Deux récipients remplis d'eau propre. Technique

1. 2. 3. 4. 5.

Plonger la lame dans le colorant de Field A pendant 3 secondes. Rincer doucement en la trempant une fois dans l'eau propre. Plonger dans le colorant de Field B pendant 3 secondes. Rincer doucement comme en 2. Mettre la lame en position verticale dans un égouttoir et la laisser sécher à l'air.

Méthode de coloration des frottis minces Réactifs

Colorant de Field A Colorant de Field B dilué - 1 volume de colorant plus 4 volumes d'eau tamponnée (pH 7,2) Eau tamponnée pH 7,2. Technique

1. 2. 3. 4.

Fixer le frottis dans le méthanol pendant une minute. Rincer le méthanol avec de l'eau. A l'aide d'une pipette, recouvrir le frottis de colorant de Field B dilué. Ajouter immédiatement un volume égal de colorant de Field A et mélanger soigneusement en inclinant la lame à plusieurs reprises. 5. Laisser colorer pendant 1 minute. 6. Rincer le colorant à l'eau propre. 7. Mettre la lame en position verticale dans un égouttoir et la laisser sécher à l'air.

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PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

Coloration à l'hématoxyline de Delafield pour la mise en évidence des microfilaires Matériel et réactifs

Cinq boîtes à coloration Ether-éthanol (fixateur) (réactif N° 8) Solution décolorante d'acide chlorhydrique-eau (réactif No 15) Hématoxyline de Delafield (réactif No 6). Ce colorant peut être acheté tout prêt. Technique 1. Préparer des gouttes épaisses 1 obtenues par piqûre au doigt. Laisser

sécher 8 à 10 heures ou toute la nuit. 2. Préparer les boîtes à coloration de la manière suivante: Boîte N° 1 -Eau du robinet Boîte N° 2 - Ether-éthanol Boîte No 3 - Hématoxyline de Delafield Boîte No 4 -Acide chlorhydrique-eau (0,05% d'Hel) Boîte No 5 -Eau du robinet 3. Plonger la goutte épaisse sèche dans l'eau du robinet (boîte No 1) pendant 5 à 10 minutes. Les hématies se lysent et la préparation s'éclaircit ou blanchit lorsque la lyse est complète. 4. La laisser sécher. 5. La plonger dans l'éther-éthanol pendant 10 minutes (boîte No 2). 6. La laisser sécher. 7. La plonger dans l'hématoxyline de Delafield pendant 15 minutes (boîte N° 3). 8. La décolorer dans l'acide chlorhydrique-eau (boîte No 4). La plonger à deux reprises dans la solution. Agir RAPIDEMENT. La préparation vire au rouge. 9. Plonger immédiatement la lame dans l'eau du robinet (boîte No 5) pour éliminer l'acide. Mettre la boîte sous l'eau du robinet jusqu'à ce que la préparation vire au bleu. Fixer au robinet un embout de caoutchouc suffisamment long pour atteindre le haut de la boîte et laisser l'eau couler doucement; si elle coule trop fort, la goutte épaisse se décollera. Si l'on ne dispose pas d'eau courante, changer l'eau du récipient à plusieurs reprises, jusqu'à ce que l'étalement vire au bleu. Mettre le doigt en travers de la boîte pour éviter que la lame ne tombe, vider l'eau et remplir à nouveau. 10. Laisser la préparation sécher et l'examiner à l'objectif x 10 et à l'objectif à immersion, à la recherche des microfilaires.

Examen Gouttes épaisses 1. Mettre au point avec l'objectif x 10 et rechercher les microfilaires.

Elle sont faciles à trouver à ce grossissement. 2. S'il y a des microfilaires, passer à l'objectif à immersion et identifier l'espèce. Rechercher également la présence de Plasmodium avec ce même objectif. On examinera au moins 100 champs microscopiques. L'examen microscopique de la goutte épaisse doit révéler les éléments suivants: - Le fond doit être propre, débarrassé de tout débris et de couleur gris pâle moucheté par suite de la lyse des hématies. 1

Si l'on colore des frottis préparés à partir de culot de sang concentré, commencer à l'étape 5.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

- Les noyaux des leucocytes sont colorés en violet foncé. - Les Plasmodium sont bien distincts avec une chromatine rouge foncé et un cytoplasme bleu-violet clair. Dans les infestations à P. vivax et P. ovale, la présence de granulations de Schüffner dans le «fantôme» de l'hématie hôte peut parfois s'observer sur les bords de la préparation.

Frottis minces 1. Mettre au point avec l'objectif x 10 sur l'extrémité la plus mince du frottis, dans laquelle les hématies ne forment qu'une couche. 2. Mettre une goutte d'huile à immersion sur la lame et passer à l'objectif à immersion. Lorsque l'on recherche des Plasmodium et des trypanosomes, il faut examiner au moins 200 champs microscopiques. L'examen microscopique doit révéler les éléments suivants: Le fond doit être propre et débarrassé de tout débris; les hématies sont de couleur rose-grisâtre pâle. Les granulocytes neutrophiles ont un noyau violet foncé et des granules bien distincts. - La chromatine des Plasmodium est colorée en rouge-violet foncé et leur cytoplasme en bleu-violet clair. - Les granulations de Schüffner doivent apparaître comme des pointillés dans les érythrocytes contenant P. vivax ou P. ovale, de même que les taches de Maurer dans les érythrocytes contenant les formes annulaires plus grandes de P. falciparum.

Contrôle de la qualité des examens de sang Pour faire en sorte que les examens qu'il effectue soient fiables, le technicien de laboratoire doit être attentif aux points suivants: 1. Le matériel doit être propre. Les lames doivent être débarrassées de tout ce qui peut les souiller (poussière, graisse, savon, empreintes digitales et débris), sinon le sang peut ne pas bien adhérer à la lame ou ne pas se colorer correctement. On emploiera des hémostyles stériles pour piquer le doigt (ou l'oreille ou le gros orteil), afin d'éviter toute transmission de maladie d'un sujet à l'autre. La piqûre sera suffisamment profonde pour qu'il y ait assez de sang pour préparer les frottis. On nettoiera soigneusement le doigt avant de le piquer pour éliminer les saletés, moisissures et autres contaminants. On peut utiliser du sang prélevé par ponction veineuse, à condition de préparer les frottis immédiatement, car les anticoagulants modifient les propriétés adhésives du sang et la coloration. 2. Les frottis doivent avoir une densité satisfaisante. Le frottis mince doit avoir une extrémité plus fine dans laquelle les hématies sont en une seule couche, ce qui permet de bien observer leur morphologie. Si le frottis est trop épais, les hématies vont «s'empiler>> et l'on distinguera mal leur morphologie. S'il est trop mince, elles risquent d'être grossièrement déformées et seront souvent mal colorées. En outre, dans les zones trop minces, les parasites sont en général déformés. Il doit être possible de lire de petits caractères d'imprimerie à travers une goutte épaisse. Si l'étalement est trop épais, le sang peut s'écailler ou se détacher en cours de coloration et l'on peut perdre ainsi des fragments de préparation. S'il est trop mince, l'avantage de la goutte épaisse qui est de contenir un échantillon plus important, est perdu. 3. Pour obtenir de bons résultats, il faut laisser sécher les frottis en position horizontale pendant la durée indiquée. Si l'on incline ou si l'on renverse les gouttes épaisses, le sang peut couler d'un côté de la lame et la préparation sera irrégulière. La partie épaisse peut s'écailler. De plus, s'ils ne sèchent pas complètement, les frottis ne se coloreront pas correctement.

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PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

En cours de séchage, il faut mettre les frottis à l'abri de la poussière, des moisissures et de tout autre débris qui pourrait tomber dessus et entraîner par la suite des problèmes de diagnostic. n faut également les protéger contre les mouches et tous les autres insectes susceptibles de les endommager. Les frottis minces doivent être fixés au méthanol avant coloration, pour éviter que les hématies ne se lysent. On prendra du méthanol absolu anhydre. Sinon, les hématies seront abîmées et la coloration mauvaise. Ne jamais fixer les gouttes épaisses. Faire en sorte que le méthanol ne les touche pas. 4. Les colorants dilués et l'eau tamponnée utilisés pour la coloration doivent être préparés soigneusement, et la solution-mère de colorant doit être de bonne qualité. On conservera le flacon de solution-mère de Giemsa hermétiquement fermé et à l'abri de la lumière du soleil. La moindre humidité qui pénètrerait dedans le rendrait inutilisable. En général, on recommande de verser une partie de la solution-mère dans un flacon propre et sec; c'est cette portion qu'on utilisera. On protège ainsi le reste de la solution-mère contre toute contamination accidentelle par de l'humidité ou des débris. Ne jamais introduire une pipette mouillée dans le flacon de solution-mère. Le Giemsa dilué est utilisable pendant environ 8 heures. Par conséquent, on préparera les dilutions le jour même où elles seront utilisées. Le pH du colorant est un facteur très important pour obtenir des frottis bien colorés. On le contrôle au moyen d'une eau tamponnée à pH 7,2, qui donne les meilleurs résultats. Cette eau tamponnée peut se conserver un certain temps si le flacon est hermétiquement fermé. Cependant, on vérifiera de temps en temps son pH, pour s'assurer qu'il est bien neutre. 5. Il faut suivre scrupuleusement le mode opératoire de la coloration. Bien s'assurer qu'on utilise la méthode mise au point pour le type de frottis que l'on colore. Rincer le colorant exactement de la manière indiquée dans le mode opératoire. Si les frottis minces sont trop rincés, le colorant va être éliminé; si les gouttes épaisses ne le sont pas suffisamment, des résidus cellulaires et du colorant vont rester sur la lame et gêner par la suite l'examen microscopique. S'assurer que les lames contenant les deux types d'étalements sèchent en position verticale, la goutte épaisse vers le bas. Autrement, l'eau coulera sur le frottis mince et entraînera le colorant.

Techniques spéciales pour les Plasmodium Identification On peut observer trois structures à l'intérieur des parasites. Ce sont: le cytoplasme coloré en bleu, la chromatine en rouge ou en violet et les grains ou les bâtonnets de pigment brun ou noir. A l'exception des stades annulaires précoces (jeunes), ces trois structures doivent pouvoir être visibles. (Les anneaux précoces ne possèdent en général pas de pigment). n est important d'observer ces trois structures pour pouvoir distinguer les Plasmodium des cellules de l'hôte (leucocytes) et des artéfacts qui peuvent apparaître en cours de préparation. Dans les frottis minces, regarder l'aspect des parasites et celui des hématies qui les contiennent. Observer: 1. L'aspect des hématies contenant le parasite.

- Dimensions. L'hématie parasitée est-elle de la même taille que celles qui ne le sont pas (c'est-à-dire, de taille normale) ou est-elle plus grande?

- Taches. L'hématie est-elle remplie de granulations roses ou rouges? Ce sont les granulations de Schüffner que l'on ne rencontre que dans les infestations à P. vivax et P. ovale. (Elles sont absentes dans les hématies non parasitées). Les cellules contenant les stades tardifs des trophozoïtes de P. falciparum contiennent souvent des granulations rouge-mauve irrégulières. Ce sont les taches de Maurer.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

2. Aspect du parasite - Les stades de croissance du trophozoïte ont-ils un contour irrégulier? Sont-ils réguliers ou lisses? De quelle couleur est le pigment des trophozoïtes âgés, des schizontes et des gamétocytes? - Combien y a-t-il de mérozoïtes (s'il y en a) dans le schizonte mûr? - Quelle est la forme des gamétocytes, s'il y en a? - Quels sont les stades présents (annulaires, trophozoïtes âgés, schizontes, gamétocytes)? Laisser sécher complètement les frottis avant de les examiner. Si l'on est dans une région où la filariose existe, on balaiera la goutte épaisse à l'objectif x 10, à la recherche de microfilaires (voir pp. 59-60). Il est nécessaire d'employer l'objectif à immersion pour observer la morphologie des parasites. Examiner d'abord la portion centrale de la goutte épaisse. Les parasites sont plus faciles à déceler dans cette zone plus épaisse. Si leur morphologie n'est pas assez distincte, examiner les bords extérieurs plus fins, pour rechercher des parasites ayant un aspect plus caractéristique. Dans les gouttes épaisses, les hématies sont lysées et ont donc disparu. La couche de sang est plus épaisse que dans les frottis minces et les Plasmodium peuvent donc être situés à différentes profondeurs. Mettre au point soigneusement dans les différents plans pour observer les parasites. Dans les gouttes épaisses, ils apparaissent souvent plus petits que dans les frottis minces, mais on emploie les mêmes caractéristiques pour distinguer les espèces. Ceux qui se trouvent sur les bords extérieurs de la goutte épaisse ressemblent parfois plus à ceux des frottis minces qu'à ceux situés au centre de la goutte épaisse. De temps en temps, on peut voir les contours des hématies sur ces bords minces. Les caractéristiques précises utilisées pour identifier les espèces de Plasmodium dans les gouttes épaisses et les frottis minces sont exposées dans la deuxième partie, pp. 83-91, où sont également évoqués les problèmes de diagnostic.

Surveillance de la chloroquinorésistance dans le paludisme à falciparum Un Plasmodium pharmacorésistant survivra et continuera à se multiplier chez un malade en dépit d'un traitement médicamenteux à une posologie qui suffit normalement à guérir l'infestatüm. L'épreuve de terrain classique couramment utilisée nécessite l'examen d'une goutte épaisse par jour pendant les 7 premiers jours de traitement. Si les formes asexuées ont disparu du sang périphérique au 7e jour, on poursuivra l'examen jusqu'au vingt-huitième jour pour éliminer tous les risques de résistance RI avec recrudescence tardive. Il est plus simple d'examiner une goutte épaisse au 2e jour chez les malades gravement atteints, ou au 4e jour chez ceux qui le sont moins. Si la numération parasitaire est dans les deux cas de 20 à 25% plus élevée qu'avant le traitement, cela indique que l'on a affaire à une souche résistante et qu'il faut modifier le traitement. Technique - L'épreuve de terrain classique

1. Faire une numération leucocytaire et calculer le nombre de leucocytes par Jll de sang (L). 2. Préparer une goutte épaisse (parasitémie avant traitement) et compter le nombre d·e Plasmodium (P) et de leucocytes jusqu'à avoir dénombré 300 leucocytes. Le nombre de Plasmodium par Jll de sang est donné par la formule: Lx P /300. 49

PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

3. Administrer au malade 10 mg de chloroquine (base) par kg de poids corporel, par voie orale, une fois par jour, pendant les 2premiers jours, puis 5 mg par kg de poids corporel au troisième jour (soit au total 25 mg de chloroquine base par kg de poids corporel en 3 jours). 4. Faire une goutte épaisse par jour pendant les 7 premiers jours, puis au 14e et au 28e jours, si aucun signe de rémission n'est apparu pendant les deux premières semaines. Interprétation de l'épreuve de terrain classique

1. Si l'on ne retrouve aucune forme asexuée au 6e jour et aucun parasite (formes annulaires et gamétocytes) au 7e jour, la souche est soit sensible (S) soit résistante (résistance de type RI). Pour savoir dans quel cas l'on se trouve, l'observation sera poursuivie jusqu'au 28e jour. Si les formes annulaires ne sont pas réapparues au 28e jour, la souche est sensible; si elles réapparaissent, la souche présente une résistance RI. 2. Si les formes annulaires disparaissent pendant au moins 2 jours de suite, mais réapparaissent et sont présentes au 7e jour, on est en présence d'une résistance de type RI. 3. Si les formes annulaires ne disparaissent pas, mais si leur nombre passe à moins de 25% de ce qu'il était avant le traitement pendant les premières quarante-huit heures de traitement, il y a résistance de type RII. 4. Si le nombre des formes annulaires diminue de moins de 75% au cours des premières 48 heures, ou s'il ne bouge pas, ou s'il continue à augmenter, les parasites sont résistants à la dose normale de médicament et l'on est en présence d'une résistance de type RIII.

Techniques spéciales pour les trypanosomes1 On peut identifier les trypanosomes dans: - les frottis sanguins - le liquide céphalorachidien (LCR) - le suc ganglionnaire

Recherche des trypanosomes dans le sang Parmi les espèces de trypanosomes rencontrées en Afrique, il est impossible de distinguer Trypanosoma brucei gambiense de Trypanosoma brucei rhodesiense sur le plan morphologique. On peut les identifier dans des étalements épais ou minces. Toutefois, dans les gouttes épaisses ils peuvent être déformés et difficiles à différencier des débris cellulaires. Trypanosoma cruzi, rencontré dans les Amériques, est très déformé dans les gouttes épaisses, mais plus facile à identifier dans les zones épaisses des frottis minces. Tout comme pour les Plasmodium, le cytoplasme des trypanosomes se colore en bleu. Le noyau et le kinétoplaste sont colorés en rouge ou en violet. Rechercher un organisme allongé ayant un noyau proéminent situé près de son centre et une tache plus petite, le kinétoplaste, située près d'une extrémité. Le flagelle est issu de la partie postérieure du trypanosome, proche du kinétoplaste. Il est attaché à la paroi cellulaire, sauf à son extrémité antérieure, où il se termine par un bout libre. Comme le flagelle remue constamment, il provoque des extensions irrégulières de la paroi cellulaire, connues sous le nom de membrane ondulante. Le trypanosome peut être ondulé (deux ou trois courbes) ou être en forme de Cou de U. La forme, la position du noyau et la dimension et la situation du kinétoplaste sont des caractéristiques qui permettent de 1

Inspirées du Manuel pour la lutte contre la trypanosomiase, 1983, document OMS non publié.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

différencier les espèces. On trouvera davantage de détails sur cette question dans la deuxième partie, pp. 91-92

Le frottis de sang frais Cette méthode est la plus facile à mettre en œuvre et la moins onéreuse des techniques de mise en évidence des parasites dans le sang, mais c'est aussi la moins sensible. Matériel

Hémostyle Tampons de coton Lamelles couvre-objets Lames porte-objets Soluté physiologique (réactif No 24) Ethanol Méthode

1. Prendre l'annulaire (troisième doigt à partir du pouce). Le nettoyer avec

un tampon de coton légèrement imbibé d'éthanol. Sécher correctement. Piquer avec l'hémostyle.

2. Recueillir la première goutte de sang qui apparaît, directement au centre de la lame.

3. Ajouter une goutte de soluté physiologique. Mélanger le sang et le soluté avec le coin de la lamelle. Couvrir la préparation avec la lamelle.

4. Préparer deux gouttes épaisses sur une autre lame en prenant 2 autres gouttes de sang. Examiner le frottis frais de manière systématique au 51

PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

microscope (objectif x 10 avec ouverture réduite du condenseur). Le premier signe de la présence de trypanosomes ou de microfilaires vivants est un mouvement rapide au sein des hématies.

L'illustration de droite montre une vue (x 40) d'un trypanosome au milieu d'hématies: celle de gauche, des microfilaires (x 10). 5. Balayer de manière systématique toute la préparation. Les trypanosomes sont réfringents et difficiles à voir. On les voit mieux en diminuant un peu l'éclairage.

La goutte épaisse C'est une technique plus sensible que le frottis de sang frais car on examine davantage de sang dans chaque champ microscopique. 1. Déposer une goutte de sang sur une lame propre et sèche. 2. Préparer et colorer une goutte épaisse de la même façon que pour les hématozoaires (voir pp. 41-45). 3. Examiner l'ensemble de la préparation avec l'objectif à immersion. 4. Les trypanosomes sont visibles au sein de la masse d'hématies lysées et on peut les reconnaître à leur forme typique et à leur couleur bleuâtre clair, ainsi qu'à leur noyau et à leur kinétoplaste foncés.

Méthode au microhématocrite Matériel et réactifs

Ruban adhésif Tube capillaire Centrifugeuse pour microhématocrite Pâte à obturer Solution de citrate de sodium (réactif N° 26) Cette épreuve ne nécessite qu'une petite quantité de sang; on peut donc employer du sang obtenu par piqûre au doigt si la ponction veineuse est impossible. Cependant, on a besoin d'une centrifugeuse spéciale pour les tubes à microhématocrite. Méthode

1. Piquer le doigt de façon à obtenir 2 gouttes de sang sur une lame. Ajouter

1 goutte de solution de citrate de sodium à 2% et mélanger. Remplir le tube capillaire aux trois quarts. Si l'on a recueilli du sang veineux, remplir le tube capillaire au trois quarts avec du sang prélevé. 2. Sceller l'extrémité ouverte du tube en la chauffant ou à la pâte à obturer. 3. Centrifuger dans une centrifugeuse pour microhématocrite pendant 2 minutes pour les microfilaires, ou 4 minutes pour les trypanosomes. 4. Poser le tube capillaire sur une lame et en fixer les extrémités avec du ruban adhésif pour éviter qu'il ne roule.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

5. Examiner la limite séparant les hématies du plasma, à l'objectif x 10. On peut y voir des microfilaires ou des trypanosomes mobiles. Passer à un grossissement plus fort pour une meilleure observation.

Micro-technique de centrifugation 1 échange d'anions (m-AECT) Cette méthode est l'épreuve la plus sensible développée jusqu'ici pour déceler les trypanosomes dans le sang humain. Les colonnes préparées au laboratoire et fournies dans les trousses avec des réactifs stériles ne nécessitent aucune réfrigération. Une fois ouverts, la colonne et le tampon doivent être utilisés immédiatement. On prendra soin de passer chaque ustensile dans une solution désinfectante (par exemple, eau additionnée d'eau de Javel à 2 %). Matériel et réactifs

Le nécessaire d'épreuve doit comprendre le matériel et les réactifs pour une épreuve, à savoir: Colonne stérile dans un tube, dans du soluté physiologique tamponné au phosphate Tube contenant du glucose ou une solution de glucose prépesés Tube capillaire hépariné (tube de Caraway) pour prélèvements de sang Hémostyle Réservoir et tube à centrifuger Pipette en plastique pour manipuler le tampon. Par ailleurs, on aura également besoin du matériel suivant: Centrifugeuse manuelle Support pour colonne Bon microscope, permettant un grossissement jusqu'à x 150 Lames porte-objets Lamelles couvre-objets Ruban adhésif Pâte à modeler pour fabriquer la cellule d'observation. Technique

1. Retirer la colonne de son tube et la mettre au premier rang du support; la laisser s'égoutter. ~------------~--~----r-~

2. Ajouter le glucose ou la solution de glucose prépesés au tampon restant dans le tube et mélanger soigneusement. Mettre le tube de côté, derrière la colonne, sur le support. A l'aide d'une pipette, ajouter un peu de solution 53

PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

de glucose-soluté physiologique tamponné à la colonne et la laisser s'égoutter. Répéter l'opération. Le reste du tampon sera utilisé ultérieurement.

3. Après avoir piqué le doigt, remplir le tube capillaire (tube de Caraway) de sang jusqu'à la marque rouge et le vider immédiatement dans la colonne. Laisser imbiber le filtre supérieur jusqu'à ce que la colonne arrête de couler. Ajouter à la pipette quelques gouttes de tampon, et disposer immédiatement le réservoir sur la colonne; le remplir avec du tampon.

La colonne va commencer à couler goutte à goutte. Compter 6 ou 7 gouttes et mettre le tube à centrifuger sous la colonne, en s'assurant qu'aucune bulle d'air ne se forme. Seule l'extrémité de la colonne doit pénétrer dans le tube (la hauteur de la colonne peut être ajustée), ce qui permet d'éviter la formation d'une bulle d'air et toute perte de l'éluat hors du tube. Remplir le réservoir de tampon et laisser la colonne fonctionner toute seule, lentement. 4. Lorsque le tube à centrifuger est plein, le retirer et le mettre dans la gaine de la centrifugeuse manuelle. Equilibrer la centrifugeuse en mettant un poids équivalent dans la gaine opposée. Centrifuger pendant 5 minutes.

0

~--~~------._------------~~ 54

TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

5. Retirer le tube de la centrifugeuse et enlever la protection de plastique. Mettre l'extrémité du tube dans une cellule d'observation et ajouter de l'eau entre lame et lamelle. L'examiner ensuite au microscope, au grossissement x 10.

6. On repère facilement les trypanosomes: ce sont des petits organismes qui ondulent au fond du tube. Il arrive que des particules de cellulose aient traversé le filtre de la colonne et viennent compliquer l'examen. Dans ce cas, tourner le tube.

7. Croquis d'une cellule d'observation.

0

~------------------------~~ ATTENTION NE PAS OUBLIER D'IDENTIFIER le tube à centrifuger au moyen d'une étiquette ou d'un crayon feutre spécial NE PAS OUBLIER D'ÉQUILIBRER le rotor de la centrifugeuse si l'on centrifuge un nombre impair de tubes NE PAS OUBLIER DE JETER tous les ustensiles contaminés dans une bassine de solution désinfectante.

Recherche des trypanosomes dans le suc ganglionnaire La méthode classique de diagnostic de la maladie du sommeil dans ses stades précoces consiste à rechercher les trypanosomes dans le suc des ganglions lymphatiques cervicaux hypertrophiés. Le prélèvement est examiné entre lame et lamelle et les trypanosomes identifiés grâce à leurs mouvements.

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PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

Matériel

Tampons de coton hydrophile Ouate Lamelles couvre-objets Lames porte-objets Aiguille (pour injection sous-cutanée), 25 G, 0,5 x 16 mm Seringue, 5 ou 10 ml Ethanol à 70% Technique 1. Préparer la seringue; tirer le piston en arrière au maximum. 2. Se laver les mains au savon. 3. Demander au sujet de s'asseoir. Désinfecter l'endroit du cou choisi à l'éthanol à 70%. 4. De la main gauche, saisir le ganglion entre le pouce et l'index et le faire ressortir sous la peau. Tenir fermement.

5. De la main droite, tenir l'aiguille entre le pouce et l'index, l'introduire à angle droit au centre du ganglion. Percer d'abord la peau, puis pénétrer au centre du ganglion. S'assurer qu'on a évité les veines jugulaires et les artères. 6. De la main gauche, masser légèrement le ganglion. De la main droite faire pivoter l'aiguille. 7. Le suc ganglionnaire va pénéter dans l'aiguille. L'opération doit durer environ une minute. 8. Retirer l'aiguille d'un mouvement rapide, l'index sur la garde. Appliquer un tampon imbibé de désinfectant au point d'injection. Ne jamais appliquer de désinfectant avant d'avoir retiré l'aiguille, car il pourrait venir au contact de l'extrémité de l'aiguille et immobiliser les trypanosomes. 9. Fixer l'aiguille à la seringue, piston tiré en arrière. Pousser le piston doucement à mi-hauteur de la seringue pour faire couler le suc ganglionnaire sur une lame.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

10. Recouvrir la préparation d'une lamelle. Examiner immédiatement au microscope en grossissant environ 400 fois, avec l'objectif x 40.

11. Attendre jusqu'à ce que les courants de convection cessent. Il est impossible de repérer le mouvement des trypanosomes dans des cellules en mouvement. Commencer l'examen par la périphérie de la préparation, le long des bords de la lamelle, car les trypanosomes ont tendance à se diriger vers eux. Examiner ensuite le reste de la préparation .

.A

a

~------------------------~~ 12. La préparation contiendra des hématies et des leucocytes. Les trypanosomes ont environ 20 Jlm de long et sont souvent cachés par les globules qu'ils font bouger avec le mouvement de leur flagelle. Tout mouvement dans la préparation est donc suspect. Les trypanosomes disparaissent parfois, se cachant derrière des amas de globules. Observer très attentivement!

Recherche des trypanosomes dans lè liquide céphalorachidien (LCR) Lorsque les trypanosomes ont traversé la barrière hémato-encéphalique et envahissent le système nerveux centrat le malade est au second stade de la maladie: La seule façon de diagnostiquer les trypanosomes dans le système nerveux consiste à examiner le liquide céphalorachidien. Trois examens sont couramment pratiqués: Numération leucocytaire; Mesure de la protéinorachie; Détection des trypanosomes. 57

PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

Les leucocytes et les trypanosomes sont rapidement lysés. La numération doit donc être effectuée rapidement après la ponction. Les trypanosomes sont recherchés après concentration du LCR par centrifugation simple ou double. On décrira ici la technique de centrifugation simple, qui est la plus pratique. Le nombre de parasites trouvés dans le LCR du malade à un stade avancé montre des variations considérables.

Technique de centrifugation simple 1. Après avoir procédé à la numération leucocytaire, centrifuger le LCR recueilli par ponction lombaire pendant 10 minutes à 900 g. Transvaser le

surnageant et le conserver pour d'autres examens.

0

~---------------------------~~ 2. Remettre le culot en suspension dans le peu de LCR qui reste au fond du tube en tapotant avec le doigt.

3. Déposer une goutte de cette suspension sur une lame propre et sèche. Recouvrir immédiatement d'une lamelle. Attendre quelques minutes, jusqu'à ce que la convection cesse. 4. Poser la lame sur la platine du microscope et l'examiner à l'objectif x 10. Employer l'objectif x 40 pour confirmer la présence des trypanosomes. Balayer l'ensemble de la préparation en commençant par les bords, car on retrouve souvent les trypanosomes sur l'extrême bord de la préparation. Si l'on observe des trypanosomes mobiles dans le LCR, cela signifie que le malade a atteint le dernier stade de la maladie et que le système nerveux central est touché.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Détection indirecte On utilise l'inoculation de matériel biologique provenant de l'homme, d'animaux hôtes, ou de vecteurs, à des animaux réceptifs pour déceler les trypanosomes. C'est une méthode qui est plus sensible pour T. b. rhodesiense que pour T. b. gambiense. Plusieurs systèmes de culture ont été mis au point pour les trypanosomes, mais ces systèmes in vitro ne sont pas d'un usage courant pour l'isolement des trypanosomes chez les sujets atteints de maladie du sommeil.

Techniques spéciales pour les microfilaires Prélèvements de sang pour la recherche de microfilaires En cas de filariose présumée, le moment de la journée auquel on effectuera le prélèvement de sang est important. Certaines espèces ont une «périodicité»c'est-à-dire que .les microfilaires ne sont présentes dans le sang qu'à certains moments de la journée, et que pour les déceler il faut recueillir le sang au bon moment (voir tableau 2).

Tableau 2. Moments auxquels il faut prélever le sang des sujets présumés atteints de filariose Espèce

Moment auquel le prélèvement doit être fait 2

Répartition géographique

Wuchereria bancrofti

La nuit (entre 22 h et 0 h)

Afrique tropicale, Asie, Amérique centrale et du Sud, Océan Indien

Wuchereria bancrofti (var. pacifica)

A tout moment

Océan PacifiqUe

Brugia malayi

Surtout la nuit (entre 22 h et 0 h)

Chine du Sud, Inde du Sud, Asie du Sud-Est

Laa loa

Pendant la journée (entre 10 h et 12 h)

Afrique centrale et de l'Ouest

- Mansonella perstans

A tout moment

Afrique tropicale

- Mansonella ozzardi

A tout moment

Amérique intertropicale, Antilles

Filaires dont la pathogénie est douteuse :

a Ces périodes ne sont pas immuables.

Recherche des microfilaires dans le sang périphérique En microscopie, trois méthodes sont couramment utilisées pour la recherche des microfilaires dans le sang périphérique: - la goutte épaisse - l'examen du sang capillaire - l'examen du sang veineux hémolysé. Pour que l'on puisse confirmer l'espèce en cause les micro filaires doivent être colorées.

La goutte épaisse La préparer et la colorer comme décrit pp. 41-45. 59

PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

Examen du sang capillaire Faire une préparation en mélangeant du sang capillaire frais prélevé au doigt avec du soluté physiologique, mettre entre lame et lamelle, et examiner au microscope à la recherche de microfilaires mobiles. On peut également concentrer les microfilaires dans du sang veineux. L'examen se fera comme pour les trypanosomes (voir p. 51-52), en choisissant bien le moment du prélèvement.

Examen du sang veineux hémolysé Matériel et réactifs

Flacon, 10 ml Centrifugeuse Tubes à centrifuger, coniques, 15 ml Lames porte-objets Aiguilles pour ponction veineuse Support pour tubes à centrifuger Seringue, 5 ml Anticoagulant- solution de citrate de sodium à 2% (réactif No 26) Solution de formol à 2% (réactif No 10) Giemsa (réactif No 11) Ether Ethanol Méthode

1. Verser 1 ml de sang veineux dans 9 ml de formol à 2%; attendre 5 minutes que les hématies soient lysées, puis centrifuger à grande vitesse. 2. Vider le surnageant. Tapoter le tube pour mélanger le culot. 3. Déposer 1 goutte de culot sur une lame. L'étaler pour former un frottis mince. Laisser sécher à l'air. Fixer le frottis avec un mélange à parts égales d'éther et d'éthanol. Laisser sécher pendant 2 minutes. Colorer immédiatement au Giemsa. Les microfilaires se colorent bien. D'autres techniques de filtration ont été mises au point pour isoler les microfilaires, mais elles ne concernent que les laboratoires spécialisés et leur description n'entre pas dans le cadre de ce manuel. On trouvera le détail de ces techniques dans le travail de Melvin & Brooke.l

Techniques spéciales pour les leishmanies La leishmaniose est une parasitose provoquée par des protozoaires flagellés du genre Leishmania. Selon l'espèce en cause, on distinguera les leshmanioses cutanées, cutanéo-muqueuses et-viscérales. Ce sont les formes promastigotes du parasite qui sont transmises pqr la piqûre des phlébotomes. Elles pénètrent dans les cellules du système moponucléé phagocytaire de la peau ou des viscères, où elles se développent pour donner des formes amastigotes. Bien que ces dernières puissent être occasionnellement décelées dans les mononucléaires du sang périphérique, l'examen microscopique d'échantillons prélevés par aspiration ou par ponction-biopsie de moelle osseuse, des ganglions lymphatiques et de la rate, est plus sensible. Pour l'examen, on peut concentrer les leucocytes en une couche leucocytaire (« buffy coat») par le microhématocrite décrit pour la détection des trypanosomes (voir p. 52). 1

MELVIN, D. M. & BROOKE, M. M., ed. Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal parasites. Atlanta, US Department of Health and Human Services, 1982 (HHS Publication N. (CDC) 82-8282).

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

La symptomatologie clinique ne permet pas de différencier la leishmaniose viscérale des autres causes de splénomégalie fébrile. On peut mettre en évidence les leishmanies dans des échantillons prélevés par ponction-biopsie de la rate (98% de positivité), de la moelle osseuse (54 à 86%), ou de ganglions lymphatiques hypertrophiés (64%). La ponction de la rate peut être une technique à haut risque et il n'existe aucun consensus concernant son utilisation, bien que certains la préfèrent en raison de sa sensibilité élevée. Elle ne nécessite aucun matériel spéciat est moins douloureuse que la ponction de moelle osseuse et relativement facile à réaliser lorsque le médecin est expérimenté et que les précautions correctes sont prises. Dans la leishmaniose viscérale aiguë, lorsque la rate est petite et molle ou difficile à palper, on recommande la ponction de moelle osseuse ou de suc ganglionnaire. La ponction de la rate ne sera réalisée chez un malade qu'après mesure du temps de Quick et numération plaquettaire. Elle ne doit pas être tentée si le temps de Quick dépasse de plus de 5 secondes le témoin, ou si la numération plaquettaire est inférieure à 40 x 109 par litre (40000/mm3). Les deux précautions importantes à prendre si l'on veut opérer en toute sécurité sont les suivantes: - Agir rapidement, de manière que l'aiguille reste moins d'une seconde dans la rate; et - s'assurer que les axes de pénétration et de sortie de l'aiguille soient identiques, pour éviter de déchirer le péritoine splénique. Matériel

Tampons de coton hydrophile Lames porte-objets Aiguille, 21 G (32 x 0,8 mm) Crayon ou feutre Seringue, 5 ml Tubes pour milieux de culture Milieu de Novy, McNeal et Nicolle (NNN) 1 Milieu enrichi de Schneiderl Technique

1. Nettoyer 3lames de verre et y inscrire le nom du malade, la date et «ponction de rate». Les milieux de culture doivent être prêts (un tube de NNN et un tube de Schneider) et étiquetés de la même manière. Les laisser atteindre latempérature ambiante. Fixer une aiguille de 21G (32 x 0,8 mm) à une seringue de 5 ml. Disposer tout le matériel sur une table, au chevet du malade. 2. Recueillir le consentement éclairé du malade. Palper la rate et en dessiner les contours sur l'abdomen du malade avec un stylo. Pour des raisons de sécurité, la rate doit être palpable à au moins 3 cm sous le rebord costal à l'expiration. Nettoyer la peau avec un coton imbibé d'alcool à l'endroit de la ponction et laisser sécher. 3. Avec l'aiguille fixée à la seringue, pénétrer juste sous la peau, à égale distance des bords de la rate, 2 à 4 cm sous le rebord costal. Incliner l'aiguille vers le haut sous un angle de 45° avec la paroi abdominale. La ponction est réalisée de la manière suivante: tirer le piston de la seringue en arrière vers la graduation d'1 ml pour obtenir une force d'aspiration et d'un mouvement rapide enfoncer totalement l'aiguille dans la rate puis la retirer rapidement, en maintenant l'aspiration. 4. Pour les jeunes enfants qui sont agités, s'assurer de l'aide de deux assistants qui maintiendront l'enfant (bras croisés sur la poitrine, chemise relevée pour empêcher toute vision et bassin tenu fermement). Effectuer la 1

Pour la préparation des milieux de cu~ure, voir l'annexe 3.

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PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

5.

6.

7.

8.

ponction en une fois, en prenant les mêmes repères, les mêmes angles, les mêmes techniques que dans le point 3, en un mouvement rapide. L'insertion de l'aiguille doit être en phase avec la respiration du malade, de manière à éviter tout mouvement du diaphragme; si l'enfant crie, on piquera au moment de l'expiration bloquée. On n'obtient ainsi qu'une quantité très faible de matériel splénique, mais qui est suffisante pour la mise en culture et la préparation d'un frottis. Tirer doucement le piston de la seringue vers les graduations de 2 et 3 ml et, aseptiquement, insérer l'aiguille dans un tube de milieu de culture et appuyer brusquement sur le piston pour expulser le contenu de l'aiguille sur les parois du tube. Si nécessaire, répéter une ou deux fois l'opération jusqu'à ce que le matériel de ponction soit visible dans le tube. Refermer le tube et le retourner pour récupérer le matériel restant sur les parois. Répéter cette l'opération pour le second tube de milieu de culture. Il est indispensable d'employer des techniques aseptiques. Déposer doucement le reste du matériel de ponction sur des lames de verre en appuyant l'extrémité de l'aiguille sur la surface de la lame. Etaler immédiatement et uniformément avec l'aiguille d'un mouvement linéaire (et non circulaire). Le frottis ne doit pas être aussi épais qu'une goutte épaisse pour le paludisme. Retirer l'aiguille et utiliser son extrémité pour récupérer le matériel resté au fond de la seringue et l'étaler sur une lame. On peut encore trouver du matériel de ponction à l'extrémité du piston : le mettre directement sur une lame et l'étaler. Laisser les lames sécher. Inscrire l'heure de la ponction sur la carte du malade, suivie des instructions suivantes: « noter le pouls et la pression sanguine toutes les 30 minutes pendant 4 heures, puis toutes les heures pendant 6 heures. Le malade doit rester alité pendant 12 heures». S'assurer que le malade comprend les instructions. Inscrire l'opération dans le dossier et signer. Envoyer les lames et les milieux de culture au laboratoire. Les cultures sont incubées à 25°C et examinées régulièrement pendant deux semaines. Les lames sont colorées au Giernsa ou au colorant de Field et examinées à l'immersion (voir illustration ci-dessous). Le pH du soluté physiologique tamponné employé dans la coloration de Giemsa doit être de 6,8 pour Leishmania (et non de 7,2 comme pour les Plasmodium). On distingue différents degrés de densité parasitaire, comme indiqué dans le tableau 3.

A. Leishmania_: Formes amastigotes.

B. Leishmania: Formes promastigotes

Pour les leishmanioses viscérales, les méthodes sérologiques apportent une aide certaine au diagnostic. Le sérodiagnostic est moins intéressant pour les leishmanioses cutanéo-muqueuses et ne présente aucun intérêt pour les leish-manioses cutanées.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Tableau 3. Degrés de densité parasitaire (Leishmania) Degré

Densité parasitaire moyenne parasites/champa

+6

>100

+5

10-100

+4

1- 10

parasites/champ

+3

1- .1 0

parasites/10 champs

+2

1- 10

parasites/1 00 champs

+1

1- 1 0

0

0

parasites/champ

parasites/1 000 champs parasite/1 000 champs

a En prenant l'oculaire x1 0 et l'objectif à immersion x1 00.

La description détaillée des nombreuses techniques immunologiques dont on dispose n'entre pas dans le cadre de ce manuel. Le titrage immunoenzymatique (ELISA) et l'épreuve d' immunofluorescence indirecte (IFI) sont les plus utiles. L'épreuve peut être pratiquée sur du sérum ou sur un volume déterminé de sang prélevé par ponction digitale sur des bandes de papier absorbant que l'on laisse sécher. L'échantillon est élué au laboratoire et testé à une dilution unique, déterminée auparavant comme étant celle qui donne une sensibilité et une spécificité acceptables dans la région en question. Des réactions croisées peuvent se produire avec les infestations à Trypanosoma cruzi. On peut en général les éliminer par dilution, ou les identifier en testant les échantillons en parallèle en présence d'antigènes de T. cruzi.

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Prélèvements cutanés Dans l'onchocercose (cécité des rivières), une filariose humaine que l'on retrouve en Afrique, en Amérique centrale et du Sud et dans certaines parties de la Région de la Méditerranée orientale, on examine de petits fragments de peau. En effet, les vers vivent dans des nodules situés dans les tissus souscutanés. On prélève des fragments cutanés de taille et d'épaisseur uniforme par biopsie cutanée exsangue à l'aide d'une pince à sclérotomie. Matériel et réactifs

Lamelles couvre-objets Compresses de gaze Lames porte-objets, ou plaques de microtitrage Aiguilles, 22 G Scalpel, lame de rasoir, ou pince à sclérotomie1 de 2mm Ethanol à 95% Soluté physiologique (réactif No 24) ou eau distillée.

Techniques de prélèvement Malades présentant des nodules Rechercher les nodules: -

sur la poitrine (sur les côtes) sur les hanches, sur les jambes (mollets), dans le dos (omoplates).

Les nodules sont arrondis et durs, ont un diamètre de 1 à 5 cm; lorsqu'on les pousse du bout des doigts, ils roulent sous la peau. Prélever l'échantillon au centre du nodule.

Malades sans nodules Prélever les biopsies cutanées exsangues: - en haut de la fesse (partie supérieure externe, où l'on pratique les injections intramusculaires), - au niveau des mollets (partie supérieure externe), - dans le dos (milieu de l'omoplate).

Il est recommandé d'examiner 6 prélèvements (2 des fesses, 2 des mollets et 2 des omoplates).

1. Si l'on ne dispose pas d'une pince à sclérotomie, employer un scalpel stérile jetable et des aiguilles ou des vaccinostyles. Si l'on ne dispose pas de matériel jetable, l'instrument devra être stérilisé avant usage pour chaque malade. Pour cela onmet le scalpel, la lame de rasoir, le vaccinostyle ou l'aiguille dans un peu d'alcool que l'on flambe. 1

La pince à sclérotomie est fournie par : Karl Storz, Tuttlingen, Allemagne.

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PRÉLÈVEMENTS CUTANÉS

2. Désinfecter l'endroit choisi avec une compresse de gaze trempée dans l'alcool. 3. Enfoncer la pointe de l'aiguille de 2 à 3 millimètres dans la peau et la relever.

4. Poser la lame du scalpel ou la lame de rasoir sur la peau tendue au-dessus de la pointe de l'aiguille. Couper d'un coup sec le morceau de peau relevé par la pointe de l'aiguille, aussi près de l'aiguille que possible. Le prélèvement doit avoir 2 à 3 mm de large. Il doit rester accroché à la pointe de l'aiguille.

L'échantillon ne doit pas être taché de sang. La biopsie doit être exsangue pour éviter toute contamination par des parasites sanguins.

Examen des prélèvements 1. Déposer une goutte d'eau distillée ou de soluté physiologique sur une lame. 2. Déposer le petit morceau de peau dedans et recouvrir d'une lamelle. Ne pas appuyer sur le prélèvement ni sur la lamelle. S'il n'y a pas assez de soluté physiologique pour recouvrir le morceau de peau, en rajouter au bord de la lamelle, de manière qu'il pénètre par-dessous. 3. Laisser la lame montée reposer 30 minutes, puis l'examiner à l'objectif x 10. S'il y a des microfilaires, on peut en général les voir se tortiller dans le soluté physiologique. S'il n'y en a pas, on laisse reposer les prélèvements de peau dans du soluté physiologique pendant 4 heures à température ambiante, puis on les réexamine. L'examen quantitatif peut être effectué comme suit: Peser le fragment cutané avec une balance (1-10 mg). Le transvaser dans un godet de plaque de microtitrage. Ajouter 0,1 ml de soluté physiologique. Recouvrir la plaque pour éviter toute évaporation et laisser incuber à température ambiante pendant 24 heures. 5. Compter le nombre de microfilaires présentes dans le soluté physiologique à l'aide de l'objectif x 10, et exprimer le résultat par rapport au poids du prélèvement.

1. 2. 3. 4.

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TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Une digestion par la collagénase du fragment cutané pendant plus de 24 heures peut augmenter la sensibilité de l'examen pour les prélèvements provenant de malades ayant une faible charge parasitaire. Cette digestion peut également être pratiquée sur du matériel fixé à l'éthanol et conservé à température ambiante.

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Deuxième partie Identification des espèces parasitaires

Parasites intestinaux Helminthes Il existe trois groupes d'helminthes importants sur le plan médical-les nématodes (vers ronds), les cestodes (ténias) et les trématodes (douves). En général, les stades servant au diagnostic sont les œufs et les larves. Plus rarement, on peut observer des vers adultes comme Ascaris et Enterobius et diagnostiquer certaines téEniasis à l'aide de segments ou de proglottis. Toutefois, dans la majorité des helminthiases, ce sont les œufs qui servent à l'identification.

Clé de détermination des œufs Les caractéristiques utilisées pour identifier les espèces d'œufs sont les suivantes: 1. Dimensions. On mesure la longueur et la largeur, qui sont en général situées dans un intervalle précis. 2. Forme. Chaque espèce a une forme particulière. 3. Stade de développement au moment de l'émission des selles. Dans certaines espèces, les œufs consistent en une cellule unique; dans d'autres, ils peuvent être pluricellulaires; enfin, une troisième catégorie d'espèces possède des œufs généralement embryonnés (c'est-à-dire contenant une larve) lorsqu'ils sont émis dans les selles. De temps en temps, si le prélèvement de selles est vieux de plusieurs heures ou d'un jour ou deux, les œufs peuvent se développer jusqu'à des stades plus avancés. Par exemple, les œufs d'Ascaris sont en général monocellulaires lorsqu'ils sont émis; mais cette cellule unique peut se diviser et dans les échantillons qui ont attendu, on peut observer des œufs à 2 ou 4 cellules. Dans les prélèvements vieux de plusieurs heures, les œufs d'ankylostomes peuvent contenir 16 cellules ou 32, voire davantage. En 12 à 24 heures, l'œuf peut être embryonné; par la suite il peut éclore, donnant naissance à une larve. Par conséquent, lorsqu'on observe les stades de développement des œufs d'helminthes, s'assurer que les prélèvements de selles sont frais. S'ils ont plusieurs heures ou même un jour, s'attendre à des modifications dans les stades de développement de certaines espèces. L'idéal serait de n'accepter pour le diagnostic que des selles fraîches. 4. Epaisseur de la coque de l'œuf. Certaines espèces, comme Ascaris, ont des coques épaisses; d'autres, comme les ankylostomes, ont des coques minces. 5. Couleur. Certains œufs sont incolores (par exemple, les œufs d'ankylostomes et d'Enterobius), d'autres sor.t jaunes ou bruns (Ascaris, Trichuris). 6. La présence d'éléments caractéristiques comme: opercules, éperons, protubérances, petits crochets, ou parois externes mamelonnées. Si l'on trouve un œuf ou un objet qui ressemble à un œuf, on observera attentivement ses divers traits distinctifs, de manière à déterminer l'espèce. On se trouvera parfois en présence d'œufs atypiques ou déformés. En pareil cas, il faudra rechercher des formes plus typiques de manière à poser un diagnostic fiable. Ne pas oublier que plusieurs espèces d'helminthes peuvent cohabiter chez un même malade. La clé de détermination (Fig. 3) et les diagrammes d'œufs d'helminthes de la figure 4 seront utiles pour la détermination des espèces.

Observer attentivement la taille, la forme, le stade de développement, l'épaisseur de la paroi, sa couleur et la présence de structures particulières comme: opercule, éperon, protubérances, crochets et paroi externe bosselée, pour identifier les espèces auxquelles les œufs appartiennent. 69

Fig. 3. Clé de détermination des œufs d'helminthes Œufs

1

1

Non encapsulés, Protubérance à chaque extrémité ?

Encapsulés (30-50 ~mx 27-50 ~m)

L

Longueur de l'œuf < 100 ~m - - - - Petit éperon latéral (souvent invisible). Dans les selles. (68-100 ~mx 45-80 ~m) Dipylidium caninum

ou

Œufs de Schistosoma

Schistosoma japonicum

ou Schistosoma mekongi

(rare)

lnermicapsifer sp.

1 1 Protubérance à chaque extrémité

1

1

Avec éperon

Pas de protubérance

Eperon latéral proéminent, paro1 transparente

1 Avec ou sans opercule ? - - Sans opercule - - Avec ou sans éperon ? - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 -...J 0

Longueur de l'œuf > 110 ~m

1

Avec opercule Longueur maximale de l'œuf ?

Longueur de l'œuf< 35 ~m

Extension de la paroi avec rebord-- Clonorchis sinensis (=épaulement marqué) (extrémité postérieure large et arrondie) (25-35 ~mx 11-22 ~m) Allongé, pas d'épaulement - - - - Opisthorchis fe/ineus (25-35 ~mx 8-12 ~m) (extrémité postérieure avec bouton terminal pointu) Epaulement moins distinct, opercule large (28-30 ~mx 15-17 ~m)

. Eperon termmal Sarns 01 pa

Non - - Echinostoma sp. (83-120 ~mx 58-90

~m)

Fascia/a hepatica

Longueur de l'œuf> 120 J.lm - - - - - - - - - - - - - - - - - - j [ ovoïde, paroi mince, brun Jaunâtre

(130-145 ~mx 70-90 ~m) ou Fasciolopsis buski

(125-140

~mx

70-90 ~m)

Trichuris trichiura

En forme de citron mais légèrement rétréci au milieu (36-45 ~mx 20-30 ~m)

·

Extré!"1té antén~u!e effilée, - - S,chistosoma mtercalatum long eperon effile a (eperon plus long que extrémité courbe chez S. haem.) (140-240 ~mx 50-85 ~m) Uniquement dans les selles Strongy/oides stercoralis

C

. . Paro1 mmce et lisse, avec ou sans blastomère

Avec blastomeres, ovoïde ou ellipse allongée ?

Paroi épaisse, grossière ou lisse?

1

i-

Sans blastomères, Lou larves partiellement développées (50-76 ~m x 35-47 ~) Strongyloides ful/eborm Necator americanus Ovoïde avec 2 à 8 blastomères Ancy/ostoma duodenale (64-80 ~m x 35-40 ~m) Temidens diminutus

-f

Paroi à une membrane,---- Trichostrongylus sp. ellipse allongée symétrique (75-115 ~mx 40-50 ~m)

Paroi épaisse grossière, l'œuf contient une cellule non segmentée possédant des granules grossiers (45-70 ~mx 35-45 ~m)

ri _ . r

Paroi épaisse lisse, œuf symétrique ou asymétrique?

Asymetnque (un côté convexe, un côté aplati)

Oeuf brun foncé (38-45 J.lm x 22-30

Capillaria philippinensis

1 Œuf arrondi ou presque rond, paroi à 2 membranes, avec ou sans embryophore ?

lrJ

Sans embryophore, avec ou ~ans filamen polaires .

~m)

Ascaris lumbricoides

Dicracoelium /anceatum

(contient un miracidium)

Oeuf incolore - - - - - - - - Enterobius vermicularis Paroi à 4 couches (contient une larve) (50-60 ~m x 20-32 ~m)

Symétrique

En forme de citron, les extrémités ne faisant pas une saillie nette - - - - - - Capillaria hepatica (36-45 ~m x 21 ~m)

c __ _ _ _ _ _

{

Extrémité anténeure arrondie, -Sch1stosoma haematobwm en général dans les urines ou (rare dans les selles) les biopsies vésicales (112-170 ~mx 40-70 ~m)

Heterophyes heteraphyes

Ovoïde, jaune d'or Diphyllobothrium fatum Paroi épaisse, non embryonné Longueur de l'œuf entre (58-76 ~mx 40-51 ~) -{ 35 et 118 ~m Brun doré, non embryonné Paroi épaisse, ovoïde, avec opercule aplati ? Oui - - Paragonimus westermani (68-118 ~mx 40-51 ~m)

Extrémités faisant nettement saillie (49-65 ~mx 20-30 ~m)

~~~~nou épaisse ?

(petit bouton à l'extrémité postérieure)

Pas d'épaulement, - - - - - - - Metagonimus yokogawai paroi mince (26-30 ~mx 15-20 ~m)

L__ _ _

l

Schistosoma mansoni

(114-180~mx45-73~m)

Avec embryophore -------1[~~nia solium jaune pâle à brun, . . paroi à 2 membranes Taema sagmata (diam. = 44-77 ~m) (se d1stmgue par l'examen des proglottis) Avec filaments - - - - - - - Hymenolepis nana polaires (40-60 ~mx 30-50 ~m) Sans filaments polaires (70-86 ~m x 60-80 ~m)

Hymeno/epis diminuta

~

:u l> Ill

=i

rn

~

m

~

z

l>

c:

><

Fig 4. Identification des helminthes intestinaux DIMENSIONS RELATIVES DES ŒUFS D'HELMINTHES*

90

60

60

30

30

---1

......

6

'"'"',_____-~m;

m

~

'ii

0

~

MetagonimusHeterophyesOpisthorchis Clonorcllis yokogawai heterophyes felinous s/nensis

Taenia

Hymeno/epis nana

Enterobius verrnicu/aris

Trichuris trichiura

Ascaris lumbricoides fécondé

Ankylostome

Diphyllobothrium fatum

0

z c m

Hymenolepis diminuta

rJl

m rJl "tl

m· m

(")

E :i

15o

15o

___________ , -------

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~--~--~-

120

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120

----~---·------···--···

ln ~ :u

m rJl

--·---·- -·---

~~-~---.rx:x

90

90

~--

60

60

30

Paragonimus westermani

Trichostrongy/us Ascaris lumbricoides non fécondé

Schlstosoma japonicum

Schistosoma haematobium

Schistosoma manson/

Fascia/a hepatica

Fasciolopsis buski WHO

91106

PARASITES INTESTINAUX

Larves Dans les selles fraîches, les larves observées sont en général des larves rhabditoïdes (=premier stade larvaire) de Strongyloides stercoralis. Cependant, si les selles ont plus de 12 heures, ces larves peuvent muer en larves strongyloïdes (stade infestant): il faut alors les différencier des larves d'ankylostomes qui peuvent également éclore dans les selles au bout de 12 à 24 heures. La présence de larves strongyloïdes de Strongyloides stercoralis peut être l'indication d'une hyperinfestation généralisée. La figure 5 et le tableau 4 montrent quels sont les caractères employés pour différencier les espèces. Fig. 5. Larves d'helminthes ~trongyl()id_~s st~rcoralis

Ankylostome strongy/oïde

rhabdi~oip_e_

-

-

, rhabtfiJ_q_ïde

strf!nJJx!oïde

cavité buccale -

Ebauche génitale

WHO

91705

Tableau 4. Caractéristiques des larves d'helminthes Ankylostome

Strongyloides

Larves strongyloïdes

Larves strongyloïdes

Dimension 500 x 14-20 l!m

Dimension 500 x 14-20 l!m

Gaine

Pas de gaine

Extrémité postérieure effilée

Extrémité postérieure bifide ou tronquée

Œsophage représentant le tiers du corps sans renflement

Œsophage représentant la moitié du corps sans renflement

Larves rhabditoiaes

Larves rhabditoiaes

Dimension 100-150 x 15-171-!m

Dimension 200-300 x 15-18 l!m

Cavité buccale longue (15 l!m)

Cavité buccale courte (4 l!m)

Œsophage représentant le tiers de la longueur du corps et à deux renflements

Œsophage représentant le tiers de la longueur du cqrps et à deux renflements

Ebauche génitale petite (7 l!m)

Ebauche

Pore anal situé à 80 !!ffi de l'extrémité postérieure

Pore anal sih.Jé à 50 l!m de l'extrémité postérieure

gé~itale grande (22 !!ffi)

C'est dans les préparations à l'iode que l'on voit le mteux l'ébauche génitale. L'iode va tuer les larves, ce qui permettra de mieux observer leurs caractéristiques. Pour voir ces structures, il faut un fort grossiss~ment, sans immersion. - si l'on observe une larve ayant une cavité buccale courte et une ébauche génitale nettement visible, il s'agit de Strongyloides.

72

IDENTIFICATION DES ESPÈCES PARASITAIRES

-si Yon observe une larve ayant une cavité buccale longue sans que l'ébauche génitale soit visible, il s'agit d'un ankylostome.

Protozoaires Les protozoaires intestinaux comprennent les amibes et les flagellés. Deux stades permettent le diagnostic, ce sont: la forme végétative ou trophozoïte et le stade quiescen tou kyste. Ces deux stades peuvent être présents dans les selles. On trouve en général les formes végétatives dans les diarrhées ou les selles très molles, et les kystes dans les selles moulées. Toutefois, on peut retrouver la présence de ces deux stades dans un même échantillon. Formes végétatives et kystes peuvent être observés dans des préparations de selles fraîches en soluté physiologique. L'identification des espèces nécessite parfois une coloration. On trouvera dans le tableau 5 les différents types de montages généralement employés pour déceler et identifier les protozoaires, ainsi que les caractéristiques que l'on peut observer dans chacun d'eux.

Tableau 5. Caractéristiques des protozoaires visibles dans différents types de préparations Colorations temporaires Soluté physiologique

Bleu de méthylène tamponnéa

Coloration permanente (Trichrome)c

Amibes

Formes végétatives Mobilité

+

Cytoplasme

+

+

+

Inclusions

+

+

+

+

+

Noyaux Kystes Noyaux Cristalloïdes 8

+ +

+

Glycogène

+

Flagellés

Formes végétatives Mobilité

+

Forme

+

Noyau

+

+

+

+

Kystes Forme

+

Noyaux Filaments a On n'utilise la coloration au bleu de méthylène tamponné

que pour les

+

+

+

+

+

+

trophozo·~es amibiens vivants.

bOn !lmploie l'iode pour colorer les kystes, bien que les trophozoïtes de flagellés puissent également être colores par cette methode. Les techniques de coloration permanente ne sont pas employées couramment dans les laboratoires de diagnostjc, rr'ais sont réseryé!'S à des circonstances particulières, comme indiqué dans le texte (par exemple, diagnostic dune cryptospond1ose).

c

Les cristalloïdes des kystes d'amibes s'obseJVent mieux dans les préparations en soluté phy:siologique que dans celles à l'iode. C'est dans les étalements colorés de façon permanente qu'on les voit le mieux.

d

• Le gJycogène est dissous pendant la coloration et dans les étalements colorés de façon permanente on ne verra a sa place que des espaces vides (vacuoles). 1

On obseJVe parfois des fibrilles (filaments) dans les préparations en soluté physiologique.

73

PARASITES INTESTINAUX

Formes végétatives d'amibes Préparations à l'état frais en soluté physiologique On peut observer des formes végétatives d'amibes mobiles dans des préparations de selles fraîches en soluté physiologique. Elles vont apparaître légèrement verdâtres et réfringentes (brillantes). A fort grossissement, on peut observer leur mobilité et des inclusions telles qu'hématies et levures. Il est impossible de distinguer le noyau. (Les macrophages peuvent également contenir des hématies et bouger.) Lorsqu'une forme végétative se déplace rapidement dans une direction et forme des pseudopodes également rapidement, il peut s'agir d'Entamoeba histolytica. Les autres espèces d'amibes ne se déplacent en général pas de cette manière. Si la forme végétative se déplace comme décrit plus haut et si l'on observe la présence d'hématies dans son cytoplasme, on peut considérer qu'il s'agit d'E. histolytica. Il est parfois nécessaire de colorer le noyau au bleu de méthylène tamponné pour confirmation.

Préparation en soluté physiologique: MOBILITÉ DIRECTIONNELLE PRÉCISE

+ HÉMATIES INGÉRÉES E. histolytica

=

Préparation à l'état frais dans le bleu de méthylène tamponné Si l'on soupçonne la présence de formes végétatives d'amibes, examiner une préparation dans le bleu de méthylène tamponné (voir tableau 5). Les formes végétatives peuvent s'arrondir et demeurer immobiles, mais leur noyau et les inclusions qu'ils contiennent se coloreront en bleu foncé, alors que le cytoplasme sera bleu clair. Rechercher les grains de chromatine nucléaire périphérique (situés le long de la membrane autour du noyau); s'ils sont présents, il s'agit d'une espèce d'Entamoeba. S'il n'y a pas de chromatine périphérique, ce n'est pas un Entamoeba. Lorsque la chromatine nucléaire périphérique est visible, il faut identifier l'espèce. Pour cela, utiliser la «clé de détermination des formes végétatives d'amibes dans les étalem~nts colorés» (Fig. 6). Les formes végétatives d'E. histolytica ont environ 12 à 40 Jlm de long. Le noyau se présente comme un cercle bleu foncé portant un point foncé (le caryosome) en son centre. Si les grains de chromatine nucléaire périphérique sont fins et réguliers, et si le caryosome central est petit, il s'agit probablement d'E. histolytica, mais il faut observer plusieurs spécimens pour s'en assurer. Si l'on voit des hématies dans le cytoplasme, cela permettra de confirmer le diagnostic. Ces hématies vont apparaître en bleu foncé dans les préparations colorées au bleu de méthylène tamponné.

Entamoeba coli a à peu près la même taille qu'E. histolytica et possède également un noyau avec chromatine périphérique. En revanche, il a un cytoplasme grossier contenant souvent des bactéries ou des champignons. La chromatine nucléaire périphérique est irrégulière et le caryosome n'est pas au centre du noyau.

74

IDENTIFICATION DES ESPÈCES PARASITAIRES

Etalements colorés au trichrome Dans les étalements colorés, les formes végétatives peuvent avoir une forme ronde, allongée ou irrégulière. Les formes végétatives d'amibes se colorent généralement en vert ou en bleu-vert avec un noyau violet ou rouge. Les noyaux des espèces d'Entamoeba ont des grains de chromatine périphérique (comme dans les préparations au bleu de méthylène tamponné), qui peuvent former un cercle ou un «collier de perles». Le caryosome peut apparaître comme une tache rouge ou violette à l'intérieur du noyau. ChezE. histolytica, le caryosome est en général au centre du noyau mais peut parfois être excentré et seule l'observation de plusieurs spécimens permet de faire la distinction entreE. histolytica etE. coli. On peut observer, en plus des formes végétatives d'amibes, d'autres cellules qui leur ressemblent et qu'il faut bien différencier des amibes. Comparer les structures observées dans les étalements colorés avec les figures de la clé de détermination et de la p. 82. «Problèmes d'identification», pour savoir s'il s'agit de formes végétatives d'amibes, de cellules d'origine tissulaire, ou d'autres éléments.

Les formes végétatives appartiennent à l'espèce E. histolytica si les structures suivantes sont visibles: - Chromatine nucléaire périphérique et présence d'hématies dans le cytoplasme

ou - chromatine nucléaire périphérique uniforme et - petit caryosome central dans le noyau et cytoplasme lisse, finement granuleux et - longueur de la forme végétative= 2 à 6 fois le diamètre

Kystes d'amibes Il est indispensable de mesurer exactement les kystes pour pouvoir les identifier correctement.

Préparation à l'état frais en soluté physiologique Si l'on travaille à l'objectif x 40, mettre au point à différentes profondeurs de la préparation et rechercher des objets ronds et brillants ayant un diamètre à peu près égal à une à trois fois le diamètre d'une hématie. Rechercher également les cristalloïdes (structures en bâtonnets), que l'on voit mieux à fort grossissement. Ils sont plus distincts dans les préparations en soluté physiologique que dans celles à l'iode. Ces éléments ont un aspect caractéristique et on les trouve chez E. histolytica et E. coli. Dans la première espèce, les cristalloïdes ont des extrémités arrondies tronquées, alors que chez E. coli elles sont pointues. On les observe moins souvent dans les kystes d'E. coli que dans ceux de E. histolytica. Les noyaux ne sont pas faciles à voir en soluté physiologique, mais sont bien visibles dans les préparations à l'iode. L'aspect du noyau est important pour différencier les espèces d'amibes. Par conséquent, si l'on observe des kystes 75

PARASITES INTESTINAUX

Fig. 6. Clé de détermination des formes végétatives d'amibes Forme végétative avec ou sans chromatine nucléaire périphérique

Avec chromatine nucléaire périphérique

Sans chromatine nucléaire périphérique

1

1

Cytoplasme grossièrement Cytoplasme finement granuleux, granuleux avec ou sans bactéries et levures, hématies, pas de pas d'hématies bactéries

Un noyau dans toutes las formes végétatives

Deux noyaux dans plus de 50% des formes végétatives

1 1 Noyau avec granules périphériques

Noyau sans granules périphériques, grand endosome

Grande masse de chromatine dans un espace transparent

1

0

r~. ,f-c.· )

:;f .

Entamoeba coli

Petit endosome, granules périphériques dans le noyau disposés régulièrement

Taille >15 ~m

Grand endosome irrégulier

.

1

Dientamoeba fragilis* Taille 5 à 15 ~m

/odamoeba bütschlii Taille 8 à 15

~m

Taille 15 à 30 ~m

Endolimax nana

Entamoeba hartmanni

Entamoeba histolytica WHO 91082

* Dientamoeba fragi/is, bien que classé parmis les flagellés, a été inclus dans ce tableau pour des raisons pratiques.

(ou des éléments qui leur ressemblent) dans la préparation en soluté physiologique, examiner une préparation à l'iode. Tout kyste observé doit être mesuré.

Préparations à l'état frais dans l'iode Mettre au point avec l'objectif x 40 et rechercher des kystes. Dès qu'on en a trouvé, ou que l'on voit des objets qui leur ressemblent, passer au fort grossissement afin de distinguer les détails permettant d'identifier l'espèce. Mesurer les kystes. 76

Fig. 7. Clé de détermination des kystes d'amibes et de flagellés

Kyste

1

1

Avec filaments internes Kyste de flagellé

1

--.1 --.1

En forme de poire, 1 noyau,

Sans filaments, Kyste amibien 1

1

1 En forme de citron, 1 noyau

1

'

Taille4à711m

1

Kyste ovale Coque épaisse

Taille5à9flm

.

1

Absence de chromatine nucléaire pénphénque

1

1

Présence de chromatine nucléaire périphérique

1

Gros noyau

de chromatine

excentré vacuole colorée à l'iode

m

1

1

4 noyaux, masses

6

Taille >; elles basculent d'avant en arrière. - Celles de Chilomastix mesnili (non pathogènes) se déplacent en effectuant des rotations. - Celles de Trichomonas hominis (rarement pathogènes) ont un mouvement désordonné. NOTE:

Le bleu de méthylène tamponné ne colore pas les formes végétatives de flagellés; ce type de préparation ne présente donc aucun intérêt pour leur mise en évidence.

b) Préparations à l'état frais dans l'iode pour la détection et l'identification des kystes On emploie surtout les solutions d'iode pour colorer les kystes et rendre visible la structure des noyaux. Pour l'identification, employer la« clé d'identification des kystes d'amibes et de flagellés» (Fig. 7). Fig. 8. Clé d'identification des formes végétatives de flagellés dans les étalements colorés Forme végétative avec a~ moins 2 flagelles

211agelles, 1 noyau taille4- 9 ~m

'~ ~~:1

..

G:'c-\

·~

au moins 5 flagelles

411agelles

~

Taille 4-8 ~m. 1 noyau

~

Taille 6- 20 ~m. 1 noyau, 1 cytostome

. 5 flagelles, Forme végétative en 1 noyau, lorme de poire, membrane ondulante 4 paires de flagelles, (rarement visible), 2 noyaux, corps parabasaux, ·taille 8-20 ~m taille 10-20 ~m

Retortamonas intestinalis

Enteromonas hominis

Chilomastix mesnili

Trichomonas hominis NOTE:

Trichomonas hominis ne possède pas de stade kystique. 79

Giardia intestinalis

PARASITES INTESTINAUX

c) Formes végétatives et kystes de Giardia intestinalis dans les étalements colorés Les Giardia sont caractéristiques et correspondent en général aux illustrations que l'on trouve dans les manuels et les ouvrages de parasitologie. Ils sont faciles à identifier dans les étalements colorés. Les autres espèces de flagellés intestinaux sont rarement pathogènes.

Balantidium coli C'est le seul cilié à parasiter l'être humain et ces infestations sont rares. Il n'a pas été évoqué ailleurs dans ce manuel en raison de cette rareté des cas (c'est surtout un parasite du porc et du singe). Toutefois, comme on le rencontre parfois dans les échantillons de selles humaines, il sera brièvement décrit ici.

Balantidium coli possède des formes végétatives et des kystes. Les formes végétatives sont grandes (50 à 200 11m de long sur 40 à 70 11m de large) et très actives et sont facilement identifiables dans les préparations en soluté physiologique, à faible grossissement (voir plus bas). Elles sont recouvertes de petits poils courts (cils), qui battent rapidement et permettent à ces éléments parasitaires de se déplacer à grande vitesse. Elles meurent très rapidement une fois sorties de l'organisme et les selles doivent donc être examinées dans l'heure qui suit leur émission. Les kystes ont un diamètre de 45 à 75 11m. Ni les formes végétatives, ni les kystes ne se colorent bien à l'iode ni aux colorants permanents. La meilleure technique reste donc l'examen à l'état frais en soluté physiologique.

0

Forme végétative de Balantidium coli

20

40 J!m

Kyste de Balantidium coli

lsospora belli et Cryptosporidium sp. Isospora belli et Cryptosporidium, des coccidies, sont des parasites intestinaux. L'homme est rarement infesté par Isospora belli et lorsque cela se produit, l'infestation est rarement grave et souvent asymptomatique. L'infestation par Cryptosporidium est une cause importante de diarrhée chez l'enfant de moins de 5 ans, et peut être particulièrement grave chez les immunodéprimés.

Diagnostic de laboratoire On peut déceler les oocystes d'Isospora belli dans les étalements frais de matières fécales montés directement. Le cas échéant, on peut les concentrer par la technique au formol-éther (voir première partie, pp. 16-17). Mélanger une petite quantité de matière fécale dans du soluté physiologique à l'extrémité d'une lame et dans un peu de solution iodée à l'autre extrémité. 80

IDENTIFICATION DES ESPÈCES PARASITAIRES

Les oocystes d'Isospora belli sont ovales (environ 32 x 16 )lm) et contiennent une masse centrale de protoplasme bien individualisée (voir diagramme ci-dessous).

Oocyste immature d'lsospora belli

Oocyste mûr d'/sospora belli

NOTE:

Préparer une solution d'iode en mélangeant 10 ml de Lugol (réactif No 16) à 10 ml d'acide acétique à 25% v/ v. Cette solution permet une bonne coloration des noyaux. Les oocystes de Cryptosporidium s'observent dans les étalements de matière fécale colorés (voir première partie, pp. 18-19).

Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii est un parasite des animaux qui provoque la toxoplasmose. Chez l'homme, la toxoplasmose est souvent asymptomatique. Elle peut provoquer de la fièvre, des éruptions, une adénopathie et une lymphocytose. Sa forme la plus grave est la toxoplasmose congénitale qui provoque souvent des lésions cérébrales importantes chez le fœtus. Si elle est contractée au début de la grossesse, l'infestation peut provoquer l'avortement, alors qu'en fin de grossesse, elle sera à l'origine de symptômes d'infestation chez le nourrisson 2 à 3 mois après la naissance. Des manifestations cliniques graves, en particulier cérébrales, de la toxoplasmose se rencontrent souvent chez les malades atteints du sida. Le diagnostic de laboratoire de la toxoplasmose fait appel à: 1. Des épreuves sérologiques, parmi lesquelles le test de lyse («Dye test» de Sabin et Feldman), l'immunofluorescence indirecte (IFl), l'hémagglutination indirecte (IHA), la réaction de fixation du complément (FC), et le titrage immunoenzymatique (ELISA), plus récent. La description de ces techniques n'entre pas dans le cadre de ce manuel. 2. Des examens microscopiques, qui sont parfois utiles pour le diagnostic d'une infestation aiguë, et qui sont pratiqués sur des préparations de suc ganglionnaire, de moelle osseuse, de liquide céphalorachidien, de liquide péritonéal, pleurale ou d'expectorations, colorées au Giemsa ou au colorant de Field. Cette recherche est surtout pratiquée en cas de sida.

Les toxoplasmes sont des organismes en croissant de petite taille (3 x 7 )lm). Ils ont une extrémité arrondie, l'autre pointue. Leur cytoplasme se colore en bleu, et leur noyau, qui est situé dans l'extrémité arrondie, en rouge foncé. Dans les coupes tissulaires, ils peuvent parfois être arrondis et ressembler aux formes amastigotes de Leishmania.

Problèmes d'identification Dans les échantillons de selles, de nombreuses structures ressemblent à des parasites sans en être. Les cellules épithéliales et les macrophages peuvent être confondus avec des formes végétatives d'amibes, en particulier les seconds, qui montrent de légers 81

PARASITES INTESTINAUX

mouvements amiboïdes et peuvent contenir des hématies. Leurs noyaux, que l'on peut observer dans les préparations colorées au bleu de méthylène tamponné, sont plus grands que les noyaux des amibes et contiennent en général plusieurs grains ou particules de chromatine (voir ci-dessous).

Cellule épithéliale

Macrophage

On peut également confondre des cellules de pus avec des kystes d'amibes. Leurs noyaux forment 3 ou 4 expansions et se colorent en général très fortement. Leur cytoplasme montre un contour irrégulier et la membrane cellulaire est souvent invisible. Les kystes d'amibes ont une paroi cellulaire nette. On peut confondre les poils et les fibres avec des larves. Toutefois, les premiers n'ont pas la même structure interne que les secondes. Les cellules végétales (pollens, cellules de féculents, spores de champignons) peuvent être prises pour des kystes ou des œufs. Elles ont en général une paroi épaisse; les kystes ont une paroi mince. Les levures et les moisissures sont beaucoup plus petites que les kystes d'amibes et ne possèdent pas des noyaux comparables à ceux que l'on observe dans ces kystes. NOTE:

Les formes végétatives et les kystes d'E. histolytica ne sont souvent pas très typiques et il faut en examiner plusieurs avant d'être certain de l'espèce à laquelle on a affaire.

L'IDENTIFICATION PEUT NÉCESSITER L'ÉTUDE SOIGNEUSE DE PLUSIEURS KYSTES OU FORMES VÉGÉTATIVES. IL EST IMPÉRATIF DE LES MESURER.

82

Parasites sanguins Paludisme Identification des Plasmodium dans les frottis minces Lorsque l'on examine des frottis minces à la recherche de Plasmodium, il faut rechercher les hématies infestées et les parasites (hématozoaires) qu'elles contiennent.

Hématies infestées - Observer les dimensions des hématies infestées. - Les granulations de Schüffner sont-elles présentes? Agrandies: Granulations de Schüffner présentes1

P. vivax ou P. ovale. Observer les hématozoaires.

Hématies infestées

i_

Normales (P. falciparum): ---. P. malariae ou P. falciparum Granulations de Schüffner absentes. Cellules infestées pouvant avoir une taille inférieure à la normale dans les infestations à P. malariae

Hématozoaires Les stades annulaires des quatre espèces principales peuvent se ressembler. Si l'on observe des anneaux, rechercher les stades plus développés. Chez les malades atteints de paludisme à P. falciparum, en général on ne voit que les stades annulaires; les autres stades ne sont présents que dans les infestations graves. NOTE:

Si l'on observe Plasmodium falciparum, il est impératif d'enregistrer la parasitémie en pourcentage (sur cent hématies observées, combien sont infestées). Concernant les caractéristiques qu'il faut rechercher dans les frottis minces et les gouttes épaisses pour le diagnostic, voir les tableaux 6 et 7 et les figures 9, 10, 11 et 12. 2

Identification des Plasmodium dans les gouttes épaisses Dans les gouttes épaisses colorées, les hématies sont lysées; le diagnostic est donc fondé sur la seule morphologie des hématozoaires. Ces derniers ont tendance à être plus compacts et plus denses dans les gouttes épaisses que dans les frottis minces.

Méthodes de numération des hématozoaires dans les gouttes épaisses

Nombre de Plasmodium par microlitre La méthode que l'on va décrire est une méthode pratique suffisamment exacte. Elle est basée sur le nombre de parasites par ).11 de sang dans une goutte 1

Dans les lames mal colorées. les granulations de Schüffner peuvent ne pas être visibles: il est donc indispensable d'employer de bennes méthodes de coloration. et surtout un pH de 7,2·7,3. Les granulations de Schüffner absentes dans les premiers stades annulaires de P. vivax. 2 Le tableau 7 et les figures 9 à 13 ont été tirés des Planches pour le diagnostic du paludisme, W 1 à 8, Genève, Organisation mor.diale de la Santé, 1985.

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PARASITES SANGUINS

Tableau 6. Caractéristiques morphologiques des hématozoaires dans les frottis minces Stade

P. vivax

P. ovale

P. malariae

P. falciparum

Hématie infestée

Taille augmentée, granulations de Schüffner présentes

Taille augmentée; peut être ovale et frangée; granulations de Schüffner présentes

Taille normale ou diminuée; coloration foncée

Taille normale; les taches de Maurer peuvent être visibles ·

Stade annulaire (trophozoïte jeune)

Assez gros; une ou deux taches de chromatine ; il peut y avoir deux anneaux par hématie

Petit; polyparasitisme assez fréquent

Petit

Petit et délicat; présente souvent deux taches de chromatine en haltère; polyparasitisme fréquent; formes marginées.

Trophozoïte âgé

Grand; amiboïde ; pigment sous forme de bâtonnets fins

Petit; non amiboïde; pigment grossier

Petit; compact; souvent en bande équatoriale; pigment grossier

Taille moyenne; en général compact; pigment granulaire parfois présent

Schizonte à maturité

Grand; mérozoïtes grands (12 à 24); pigment en amas; corps en rosace

Plus petit que P. vivax, 6

Petit, mais avec grands mérozones (6 à 12) ; aspect caractéristique en "marguerite, ; pigment grossier

Rare dans le sang périphérique; mérozoïtes (Bà 26) petits; masse pigmentaire unique

Gamétocytes

Sphériques; compacts; noyau unique; pigment grossier

à 12 mérozoïtes; pigment plus foncé que chez P. vivax Semblables à ceux de P. vivax mais plus petits

Ressemblent à ceux de En forme de croissant; P. vivax mais plus petits, noyau unique moins nombreux et sans granulations de Schüffner

épaisse, ces derniers étant comptés par rapport à un nombre prédéterminé de leucocytes. On prend comme référence une moyenne de 8000 leucocytes par 111. Malgré des inexactitudes dues aux variations du nombre de leucocytes d'un individu en bonne santé à l'autre, et des variations encore plus grandes en cas de maladie, cette valeur de référence permet d'effectuer des comparaisons valables. Avant de commencer la numération, on examinera l'équivalent de 0,25!11 de sang (environ 100 champs microscopiques à l'aide d'un oculaire x 7 et d'un objectif à immersion x lOO) sur la goutte épaisse, afin de déterminer l'espèce en cause et les stades présents. Une fois cette opération terminée, la méthode de comptage suivante devra être employée pour les étalements positifs: 1. Il faut deux compteurs à main, l'un pour les Plasmodium, et l'autre pour les leucocytes. 2. a) Si, après avoir compté 200 leucocytes, 10 Plasmodium au moins ont été identifiés, enregistrer les résultats sur le formulaire, en indiquant le nombre de parasites pour 200 leucocytes. b) Si, après avoir compté 200 leucocytes, on n'a compté que 9 Plasmodium au plus, continuer à compter jusqu'à avoir enregistré 500 leucocytes et noter le nombre de parasites pour 500 leucocytes. 3. Dans chaque cas, le rapport de la numération parasitaire à la numération leucocytaire peut être converti en nombre de Plasmodium par 111 de sang, au moyen de la formule mathématique simple suivante: Nombre de Plasmodium x 8 000 = N omb re d e Pl asmod zum · par Il1 N omb re d e 1eucocytes Cela signifie que si l'on compte 200 leucocytes, le nombre de Plasmodium comptés est multiplié par 40 et que si l'on en compte 500, il est multiplié par 16. 4. D'ordinaire, on compte tous les stades présents, qu'il s'agisse de formes sexuées ou asexuées. Parfois, on fait une numération séparée pour les gamétocytes de Plasmodium falciparum, mais lorsque c'est le cas, ils sont tout de même compris dans la numération parasitaire générale. Il est rarement possible de distinguer les gamétocytes de P. vivax ou de P. malariae des formes asexuées avec suffisamment d'exactitude pour justifier un comptage séparé.

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IDENTIFICATION DES ESPÈCES PARASITAIRES

Le système des plus Il existe une méthode plus simple pour estimer les parasites dans les gouttes épaisses; il s'agit du système des plus. Il donne des indications sur la numération parasitaire relative et nécessite l'emploi d'un code comprenant 1 à 4 signes plus; ainsi: + = 1 à 10 Plasmodium pour 100 champs de la goutte épaisse ++ = 11 à 100 Plasmodium pour 100 champs de la goutte épaisse +++ = 1 à 10 Plasmodium par champ de la goutte épaisse ++++ =plus de 10 Plasmodium par champ de la goutte épaisse Ce système ne doit être employé que lorsqu'il est impossible d'effectuer une numération parasitaire par ~l de sang.

Structures pouvant être confondues avec des Plasmodium Dans les frottis sanguins, les structures qui peuvent ressembler à des Plasmodium sont les suivantes (voir également Fig. 13): plaquettes sur les hématies dans les frottis minces, agrégats plaquettaires, fragments de leucocytes dans les gouttes épaisses, colorant précipité sur les hématies, cellules cutanées du. malade, poussières, bactéries, levures, spores et autres éléments ayant pu se déposer sur le frottis pendant qu'il séchait, - algues et autres micro-organismes provenant de solutions colorantes contaminées.

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Tous ces éléments peuvent ressembler aux hématozoaires dans les frottis colorés et peuvent être pris pour eux. Cependant, ils ne présentent en général pas les trois caractéristiques des Plasmodium: cytoplasme coloré en bleu, chromatine colorée en rouge ou en violet et pigment brun ou noir. Ces trois caractères doivent être visibles pour pouvoir affirmer qu'on est en présence d'un Plasmodium, sauf pour les formes annulaires (qui ne sont pas pigmentées). En cas de doute, rechercher des spécimens plus typiques. Si aucun élément ne permet d'affirmer la présence d'hématozoaires, enregistrer le frottis comme «sans Plasmodium visibles», de préférence après avoir préparé, coloré et examiné un second frottis. La figure 13 montre certaines des structures pouvant être prises pour des hématozoaires. Il faut mettre les frottis à l'abri pendant qu'ils .sèchent pour éviter que des poussières ou des micro-organismes, tels que spores ou bactéries, ne viennent les contaminer. En outre, on s'assurera que les flacons de colorant (solutionmère et eau tamponnée) sont bien bouchés, de façon que les poussières et les micro-organismes présents dans l'air ne les contaminent pas, risquant ainsi de contaminer le frottis au moment de la coloration.

Trypanosomes Les trypanosomes peuvent être déformés dans les gouttes épaisses. S'il est impossible de les reconnaître dans ces dernières, les rechercher dans les zones les plus épaisses du frottis mince. On les trouve entre les hématies. Observer quelle est la longueur, la forme et les dimensions du kinétoplaste des trypanosames. (suite page 92) 85

PARASITES SANGUINS

Tableau 7

Détermination des espèces de Plasmodium dans des frottis épais colorés au Giemsa

Stades du parasite dans le sang périphérique Espèce Trophozo'lles

Schizontes

Gamétocytes

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Taille : petits à moyens ; nombre : souvent nombreux ; forme : couramment formes annulaires en virgule ; chromatine : souvent deux taches ; cytoplasme : régulier, fin à charnu ; formes matures: quelquefois présentes dans le paludisme grave, compactes, avec pigment en masse ou sous forme de quelques gros grains.

Habituellement associés à de nombreuses formes annulaires jeunes. Taille : petits, compacts; nombre ; peu nombreux, peu courants, en général dans le paludisme grave ; formes matures : 12-30 mérozo·~es ou plus, en amas compacts ; pigment: une seule masse sombre.

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Taille : petits à grands ; nombre: faible à moyen; forme: couramment, anneaux ouverts ou forme irrégulière ; chromatine: une tache , parfois deux ; cytoplame: irrégulier ou fragmenté; formes matures : compactes, denses ; pigment: dispersé, fin.

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