Obtención de Caseína, Reacción de Biuret y Punto Isoeléctrico

 

   

UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE”

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA SANTO DOMINGO

PERÍODO 

:

Octubre 2018 –  Febrero 2019

ASIGNATURA 

:

Cátedra Integradora de Bioquímica.

INTEGRANTES 

:

Chávez Esteban, Dela Génesis, Sarango Jordan, Verduga Ángela

NIVEL 

:

Tercero

DOCENTE 

:

Dr. Juan Neira

FECHA 

:

30/Enero/2019

TEMA 

:

Obtención de caseína, reacción de Biuret y punto isoeléctrico 

SANTO DOMINGO –  ECUADOR  ECUADOR 2019

 

I. 

INTRODUCCIÓN

La leche es una sustancia la cual contiene un sin número de vitaminas entre las cuales destacan la tiamina, riboflavina, ácido pantoténico, y vitaminas A, D Y K, También se  pueden encontrar minerales como, potasio sodio, calcio y fósforo. Las proteínas de la leche se las puede clasificar de 2 maneras Cómo proteínas globulares y fibrosas, fi brosas, aunque también se mantiene otra forma de clasificarlas como caseínas o también como proteínas de suero. (upo.es, 2009) Dentro de las proteínas globulares están Aquellas que tienen formas esferoidales y no tienen ningún tipo de interacciones entre moléculas como son los puentes de hidrogeno que a diferencia de las proteínas fibrosas son muy comunes y características de estas. Existen tres tipos de proteínas inmersas en la leche: caseína, lacto albuminas y lacto globulinas teniendo característica que todas estas son globulares. (genially, 2017) La caseína es una proteína considerada conjugad conjugadaa que se encuentra en la leche es un tipo de fosfoproteína que se encuentra cuándo se produce una acidificación en la leche l eche dando una formación de una masa blanca. Las fosfoproteínas son grupos de proteínas que están enlazados a Sustancia con ácido fosfórico. Unidos también cerina treonina por un grupo hidroxilo. En proporciónlíquida. La caseína la leche representa un porcentaje al 82% 2.7 en composición Paraen obtener la caseína se debe Reducir eldelpH77Hasta queYlauncaseína  precipite Es decir se tiene que llegar a su punto isoeléctrico el cual tiene un valor de 4.6 a temperatura ambiente. La caseína tiene varias aplicaciones en la industria como la fabricación de pinturas especiales en el apresto de tejidos también es muy usada en la clarificación de vinos, en la elaboración de preparados farmacéuticos y a su vez en la fabricación de plásticos. (upo.es, 2009) Cómo objetivo en esta práctica de laboratorio se Tiene como primer. la extracción de la Caseína A partir de la l a acidificación con ácido cítrico determinando así su. Isoeléctrico.

II. 

OBJETIVOS

Objetivo General   Extraer la caseína de la leche Disminuyendo el pH de la muestra con ácido cítrico

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Objetivos específicos   Realizar la prueba de Biuret con una pequeña cantidad de la caseína extraída

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anteriormente.   Obtener el punto isoeléctrico de la caseína.

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  III. 

REVISIÓN DE LITERATURA

CASEÍNA La caseína (del latín caseus, "queso") es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína)  presente en la leche y en algun algunos os de sus derivados derivados (produc (productos tos fermentados fermentados como el yogur yogur o el queso). En la leche, se encuentra asociada al calcio (fosfato de calcio), formando agregados que se denominan micelas de caseína. Las proteínas de la leche se dividen en tres grupos: Las caseínas, las proteínas del lactosuero y las que forman parte de la membrana del glóbulo graso. Estas últimas representan solamente solamente del orden del 1% del total de la proteína de la leche. Las caseínas son las principales proteínas de la leche. Se sintetizan exclusivamente en la glándula mamaria, y en la leche se encuentran en su mayor parte formando agregados multimoleculares conocidos como “micelas de caseína”. En la leche de vaca, la caseína representa alrededor del 80% del total de proteínas, es decir, de 25 a 28 gramos por litro de leche. En la leche humana la presencia de proteínas del lactosuero es mucho mayor, de tal forma que las caseínas son solamente del orden de la mitad de las proteínas totales, entre 5 y 8 gramos por litro. (Calvo, s.f.) Estructura de las moléculas de caseína Las moléculas individuales de caseína se caracterizan en general por tener un tamaño mediano (unos 200 aminoácidos, siendo algo menor la caseína κ ) contar con pocos tramos con estructura secundaria organizada, debido a la presencia de abundantes restos de  prolina, y tener unidos covalentemen covalentemente te grupos fosfato a alg algunos unos de los restos de serina, y muy ocasionalmente a restos de treonina. La falta de organización de las moléculas de caseína ha hecho que hasta el momento ninguna haya podido cristalizarse para llevar a cabo estudios detallados de su estructura secundaria y terciaria. Una propiedad clásica, que ha servido durante un siglo para su definición operacional, es que las caseínas precipitan a pH 4,6, que es su punto isoeléctrico (a temperatura ambiente). Desde el punto de vista de la l a estructura, en la leche bovina (y en la mayoría de las leches de otras especies) existen cuatro caseínas, conocidas como αs1, αs2, (la S del subfijo indica que son “sensibles” al calcio, es decir, que pueden precipitar al as ociarse con él) β  y κ . Las llamadas “caseínas γ” son simplemente fragmentos de la caseína β producidos por  proteolisis por la plasmina. plasmina. Todas las caseína caseínass tienen variante variantess genéticas, producidas producidas por sustitución de aminoácidos y en algunos casos por selección. Existen diferencias en la proporción que representa cada tipo en el total de las caseínas. De entre las especies más comunes, las mayores diferencias se encuentran en el contenido de caseína κ  que  que representa el 3% de las caseínas de leche de búfala, el 13% de las de la leche de vaca y el 26% de las de la leche humana. (Calvo, s.f.)

 

Proceso industrial de obtención de caseína Coagulación La caseína se obtiene coagulando leche descremada con ácido clorhídrico diluido, así se imita la acidificación espontánea. Los coágulos se decantan, se lavan con agua, se desecan y finalmente se muelen. Cuando coagula con renina, es llamada paracaseína, y cuando coagula a través de la reducción del pH del pH es llamada caseína ácida. Cuando no está coagulada se le llama caseinógeno. En la leche de vaca, la caseína representa alrededor del 80% del total de proteínas, es decir, de 25 a 28 gramos por litro de leche. En llaa leche humana la presencia de proteínas del lactosuero es mucho mayor, de tal forma que las caseínas son solamente solamente del orden de la mitad de las proteínas totales, entre 5 y 8 gramos  por litro (Ecuared, 2018). 2018).

Diagrama de flujo

 

Reacción de Biuret El reactivo de Biuret es muy usado para la determinación Cadenas de péptido de  proteínas, compuestos con 2 o más en enlaces peptídicos en sustancias en composición desconocida. desconocid a. La reacción que se realiza la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que van en fusión de los enlaces peptídicos Qué se destruye a liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína está expuesta al contacto con un concentrado álcali se forma una sustancia denominada Biuret. (Domínguez, 2016) El reactivo de Biuret en su estructura está compuesto por hidróxido de potasio y sulfato cúprico, junto con tartrato de sodio y potasio. Para verificar los resultados este reactivo nos da cambios de color azul o violeta cuando está en presencia de proteínas y a una coloración rosa cuándo se combina con polipéptido de cadena corta.

Punto isoeléctrico El punto isoeléctrico es el pH en el cual el número de cargas positivas es igual al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero. En los aminoácidos los grupos ionizables i onizables  pertenecen a grupos carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos. Los puntos isoeléctricos suministran información ventajosa para inferir sobre la conducta de los aminoácidos y  proteínas en solución. Así, la presencia de grupos ionizables en estas moléculas tiene importantes consecuencias consecuencias sobre la solubilidad ("EcuRed", 2019). Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las restantes condiciones persisten iguales. iguales. Esto se da porque los iones dipolares no muestran carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese pH ("EcuRed", 2019).

El valor de la carga depende del punto isoeléctrico y del pH El pH determina la carga de la biomolécula;   Cuando el pH sea más bajo que el pI de una molécula, ésta tendrá carga positiva.   Cuando el pH sea más alto que el pI de una molécula, ésta tendrá carga negativa.

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IV. 

Materiales y Metodología. -

4.1 Materiales Reactivos -  - 

Sulfato de cobre Citrato sódico

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Carbonato de sodio Ácido acético Etanol Hidróxido de sodio

Insumos -  -  -  -  -  - 

Vaso de precipitación de 250 mL Tubo de ensayo Varilla de vidrio Gotero Embudo Pipeta aforada

Equipos -  Balanza -  Baño María -  Plato agitador (Hot Plate) Muestra -  - 

Leche Clara de huevo

4.2 Procedimiento Obtención de caseína (Solución de caseína)   Colocar 100 mL de leche en un vaso de precipitación.   Proceda a acidificar con ácido cítrico al 10%, adicionando hasta que se corte

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totalmente. Colocar la leche cortada en tubos de ensayo. Colocarlos en la centrifuga para separar el suero. Eliminar el suero. Lavar el sedimento adicionando agua destilada al precipitado para eliminar residuos de lactosa y ácido. Dar una lavada rápida en etanol y descarte el etanol. Vuelva a adicionar etanol y agite. Elimine el etanol en la centrifuga. Colocar en un vaso el sedimento de caseína lavado.

  Disolver con NaOH 0.1 N (Hasta disolver completamente la caseína).   Llevar a 100 mL con agua destilada.

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Prueba de Biuret (Solución de caseína)   Colocar una pequeña cantidad de solución de caseína (10 mL) en un vaso de

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 precipitación.   Adicionar 1 mL de reactivo de Biuret.   Observar el resultado, la coloración violeta porque existe la presencia de proteína.

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Obtención del punto isoeléctrico de caseína        

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V. 

Al resto de solución de caseína con el electro pH  –  metro  metro colocado. Adicione gota a gota ácido acético 1N. Hasta que se precipite la caseína. En ese momento se tendrá el pH isoeléctrico de la caseína, pH 4.6. Disolver el precipitado formado, adicionando poco a poco NaOH 1N y se obtendrá nuevamente la solución de caseína.

RESULTADOS

Obtención de caseína Durante la primera prueba se observó la separación de fases al agregar limón a la solución, tanto en la muestra de leche comercial y leche ordeñada de granja. En la imagen 1 se detalla la formación del precipitado color blanquecino.

Fig. 1. Obtención de caseína en leche comercial y ordeñada.

Prueba de Biuret Tras la centrífuga de la leche y la adición del reactivo Biuret, la solución se tornó de color azul con un ligero tono violeta en la parte inferior del tubo de ensayo, que por simple inspección se determinó como una prueba positiva.

 

 

Fig.2. Prueba de Biuret positiva, con precencia de pellet violeta.

Obtención del punto isoeléctrico de la caseína La solución caseína formó un precipitado, el cual varío según la muestra, como se observa en la figura 3, el precipitado de la leche comercial es más espeso por lo contrario del de leche de granja, sin embargo, en ambos casos resultó una prueba positiva. Para la solución caseína de leche comercial el pH obtenido fue 5,23.

Fig. 3. Precipitado blanco de solución caseína en leche comercial y ordeñada. Adicionalmente se calculó el rendimiento de la caseína para lo cual se utilizó la siguiente formula:      =

    í    ℎ   

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 100

 

100

 

= 6 % 

VI. 

DISCUSIÓN

La leche es una emulsión, una suspensión coloidal que presenta proteínas solubles, minerales, vitaminas y otros componentes. Una parte del calcio y del magnesio presentes, forman con la caseína un complejo que, junto con las demás proteínas libres, se encuentran bajo la forma de una suspensión coloidal, formando micelas, además, es la  proteína presente presente eenn mayor proporción en la leche (en torno al 3%) (Berobide, (Berobide, n.d.). Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza, es decir, los grupos fosfato se protonan y la proteína neutra precipita es por este motivo que se observó el precipitado blanquecino de la imagen 1 (Miller, 2001). Todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente. Se conoce que las  proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico. En el punto isoeléctrico, se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación. La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica (Miller, 2001). Aunque el pH obtenido fue 5, 23 en la leche de granja esto se puede justificar debido a que la leche comercial pierde ciertas propiedades que la leche de granja. La reacción de Biuret se basó en la formación de la coloración violeta, debido a la  presencia de un un complejo de ccoordinación oordinación entre los iones Cu2+ y lo loss pares de electrones electrones no compartidos del nitrógeno que está presente en los enlaces peptídicos presentando la mayor absorción a 540 nm. Cuando una proteína se pone en contacto con NaOH o KOH concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Esta reacción en sí se usa para la identificación de proteínas a través del reactivo de Biuret (contiene ( contiene hidróxido  potásico (KOH), sulfato cúprico (CuSO4) y tartrato de sodio y potasio) (Llerena, 2014). Al realizarla en la leche entera comercial se pudo observar que dio positiva para esta reacción.

 

VII. 

CONCLUSIONES   La caseína se puede separar de la leche mediante un proceso de acidificación

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(limón o ácido acético) para el cual sabemos que es un conjunto heterogéneo de aminoácidos.   La caseína se separa únicamente cuando tiene un pH 4.6, en donde se muestra la acidez de la leche, y por ende precipitan las caseínas.

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VIII. 

RECOMENDACIONES   Para separar la caseína de forma correcta se debe realizar con horas de

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anticipación la acidificación de la leche, puesto que es importante el tiempo que esta se tarda y también depende de la calidad. De la leche y la cantidad de ácido  presente en la muestra.

Bibliografía academic.uprm. (2018). Obtenido de academic.uprm: http://academic.uprm.edu/~jvelezg/labmoleculas.pdf   Calvo, M. (s.f.). CASEÍNA. Obtenido de milksci: http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/proteins/caseina.html genially. (30 de Agosto de 2017). EXTRACCIÓN DE CASEÍNA-BIOQUÍMICA. Obtenido de https://view.genial.ly/59a79633072c1d3858d6c748/extraccion-de-caseina-bioquimica Murray, R. (2009). Harper bioquímica ilustrada. 28th. Mexico: McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES. Nations, F. a. (18 de Abril de 1997). Los Carbohidratos En La Nutricin Humana. Obtenido de FAO: https://books.google.com.ec/books?id=FZ_ed5pkNdoC&printsec=frontcover&dq=carb ohidratos&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiTd7dhJneAhUurlkKHUqZC70Q6AEIJjAA#v=onepage&q&f=false upo.es. (19 de abril de 2009). EXTRACCIÓN DE LA CASEINA Y DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELECTRICO. Obtenido de https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB. pdf Domínguez, E. (24 de Abril de 2016). Prueba de Biuret (proteínas) . Obtenido de http://biocoments.blogspot.com/2016/04/prueba-de-biuret-proteinas.html 

Berobide, R. Proteínas: Leche y caseína. Obtenido de http://liceo6.weebly.com/uploads/7/1/5/4/715 .com/uploads/7/1/5/4/7154339/protenas 4339/protenas_leche_y_c _leche_y_casena asena   http://liceo6.weebly Llerena, M. (2014). REACCIÓN DE BIURET. Obtenido O btenido de http://bioquimicamarzo  julio.blogspot.com/2014/07/reaccion-de-biuret.html  julio.blogspot.com/2014/07/reaccion-de-biuret.html 

 

Miller D.D. (2001). Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México