Obtencion de Amilasa

 

Tabla de Contenido Introducción …………………………………………………………. 2  Objetivo General ……………………………………………………. 3  Objetivos Particulares ……………………………………………… 33   Hipótesis ……………………………………………………………... Justificación …………………………………………………………... 3  Metodología Experimental …………………………………………... 4  Resultados y Análisis…………………………………………………. 8 Conclusiones ………………………………………………………….. 15 Bibliografía …………………………………………………………….. 16

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Introducción En todos los procesos vitales están implicadas las enzimas, las cuales son biomoléculas especializadas en la catálisis de las reacciones químicas que tienen lugar en la célula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones químicas mucho más que cualquier catalizador artificial conocido. Las enzimas son utilizadas en diversas industrias como en la industria textil, alimenticia, de detergentes, farmacéutica, para el tratamiento de desechos etc. Sin embargo, la demanda de enzimas en dichas industrias ha aumentado considerablemente por lo que actualmente se han investigado diversos métodos para la obtención de enzimas de manera rápida y con buenos rendimientos. Por lo que la biotecnología desarrolla cada vez más métodos de obtención de enzimas por medio de microorganismos para poder abastecer la demanda de las enzimas en la industria. Una de las enzimas con mayor demanda son las amilasas, estas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, son las enzimas responsables de la degradación del almidón, hidrolizan los enlaces glucosídicos α-1-4. α -1-4. Estas se pueden dividir en tres grupos: - α-Amilasas: Las cuales rompen al azar los enlaces en el interior del sustrato (endoamiladas), produciendo maltosa y pequeños oligosacáridos. - ß- Amilasas: Las cuales hidrolizan ordenadamente unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores del sustrato (exoamilsas) - Glucoamilasas: Estas liberan unidades de glucosa a partir de los extremos no reductores del sustrato. Como se ha mencionado se pueden obtener diversas enzimas a partir de microorganismos, en el caso de la enzima α-Amilasa α -Amilasa se puede obtener de Bacillus subtilis, esta es una bacteria Gram positiva, Catalasa positiva, aerobio facultativo, comúnmente se encuentra en el suelo. Es miembro del género Bacillus.

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Objetivo Ge General neral Obtener α-amilasa α-amilasa por cinética del crecimiento del microorganismo Bacillus subtilis,  por medio de una fermentación utilizando como sustrato cáscara de papa.

Objetivos Particulares -Identificar el microorganismo Bacillus subtilis,  por medio de pruebas bioquímicas primarias: tinción de Gram, oxidasa, motilidad, catalasa y oxidación/ fermentación (OF). - Hacer el recuento del microorganismo por el método de dilución en placas. - Demostrar el aprovechamiento de la cáscara de papa como sustrato en la formación de α – amilasa. – amilasa.

Hipótesis Si se somete a Bacillus   subtilis  a condiciones apropiadas de fermentación (37°C durante 48 horas) y con un sustrato degradable para este microorganismo (como es el almidón que se encuentra en la cáscara de papa) se obtendrá la enzima ααamilasa, la cual tendrá la utilidad de hidrolizar almidón en azúcares simples.

Justificación La enzima α-amilasa α-amilasa es una de las enzimas más utilizadas a nivel industrial especialmente en la alimentaria, como en cervecería, dulcería, cereales y panadería específicamente en la sacarificación maltogénica. Sin embargo, su producción es muy limitada, por lo que se han hecho diversas investigaciones para mejorar su producción. Anteriormente la producción de enzimas era por síntesis química, pero en los últimos años esto ha sido reemplazado por la producción a base de microorganismos. Las enzimas de origen microbiano presentan ventajas técnico-económicas ya que poseen tiempos de generación menores, tienen requerimientos de espacio menor por unidad de enzima producida y una potencialidad ilimitada en cuanto a la disponibilidad de nuev nuevas as enzimas. Otro factor a considerar es que se pueden utilizar diversos sustratos, los cuales son considerados como desechos.

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Metodo Me todo logía Experimental

Lista de materiales Material de vidr io

Equipo

Otros materiales

Rea Reactiv ctiv os

2 matraz Erlenmeyer 500 mL

Incubadora

Asas bacteriológicas

Dextrosa anhidra

4 vasos de precipitados 100 mL

Centrifugadora

Papel filtro

4 vasos de precipitados 50 mL

Microscopio eléctrico

Piseta destilada

20 tubos de ensaye

Incubadora rotacional

Portaobjetos

Cloruro de calcio

5 pipetas de 1 mL

Incubadora

Cubreobjetos

sulfato de amonio

5 pipetas volumétricas de 5 mL

Balanza granataria

Tiras de pH

Sulfato de hierro.

 Agitador de vidrio

Espectrómetro

Gradilla

cido sulfúrico concentrado

con

agua Fenol al 5%

2 matraz aforado 100 mL

1 matraz aforado 25 mL

1 vidrio de reloj

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Cajas Petri

1 embudo de vidrio

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Purificación de la bacteria Bacillus subtilis 1. Se tomó una asada de la cepa proporcion proporcionada ada de B. subtilis y se sembró en una placa de BHI por el método de dilución americana. 2. Se dejó incubar por 24 horas a 37º C. Pruebas Bioquímicas primarias 1. Se realizaron las pruebas bioquímicas primarias con la bacteria B.  subtilis aislada anteriormente: - Tinción de Gram - Catalasa - Oxidasa - Motilidad - Oxidación-Fermentaci Oxidación-Fermentación ón (OF)

Preparación del medio de cultivo 1. Se pesó 300 g de cás cáscara cara de papa y ya a lavada y escurrid escurrida a 2. Se licuó la cás cáscara cara de pap papa a con un poc poco o de agua y se filtró. 3. El filtrado obtenido se llevó a u un nv volumen olumen de 100 ml. 4. Se enriqueció el medio con 0.1 % de Cloru Cloruro ro de calcio, 5% de sulfato de amonio y 0.2 % de Sulfato de hierro. 5. Se esterilizó en autoclave a 121°C y 15 lb d de e presión, durante 15 minutos.

Inoculación del medio de cultivo y proceso de fermentación. Preparación del preinóculo 1. Se tomaron dos asad asadas as (con a asa sa de 10 μL) y se introdujeron en 10 ml de caldo nutritivo.  preinóculo se dejó dejó en incubación incubación por 24 horas a 37º C. 2. Dicho preinóculo

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Fermentación 1. Se inoculó el medio de cultivo con el preinócu preinóculo. lo. 2. Se colocó en el incubador rotatorio a 125 rpm, durante 48 horas a temperatura de 37 °C. 3. A los tiempos 0, 1, 2, 3, 4 y 5 horas, s se e realizó un sembrado e en n cajas Petri con medio caldo nutritivo para realizar conteo en placas. Y se extrajo un volumen de 5 mL del sistema de fermentación, se depositó en frascos viales y se congeló para su posterior análisis de azúcares. 4. Las placas s se e introdujeron a una incubadora a 37 °C durante 24 horas. 5. Se hizo la lectura de las UFC de las placas, u una na vez terminada la incubación. 6. Acabada la fermentac fermentación ión se centrifugó a 250 rpm durante 20 minutos y se conservó el sobrenadante. Determinación de azúcares totales por el método de fenol sulfúrico

Preparación de la curva de calibración de azúcares 1. Se preparó una soluci solución ón de de dextrosa xtrosa anhidra 400 mg/L. 2. En tubos de ensayo, rotulados del 1 al 7 se agregó los siguie siguientes ntes volúmenes de la solución de dextrosa: 0.0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mL; en ese orden. 3. A los mismos tubos se les agregaron los siguientes volúme volúmenes nes de agua destilada: 2, 1.9, 1.8, 1.6, 1.4, 1.2 y 1 mL. En ese orden. 4. A todos los tub tubos os se les agregó 0.1 mL de fenol al 5 %. %. 5. A todos los tubos se lles es agregó 2.5 mL de á ácido cido sulfúrico concentrado. concentrado. En baño de hielo y la campana de extracción. 6. Una vez que los tubos estuvieron a temperatura ambiente se leyó la absorbancia en el espectrómetro, a longitud de onda de 490 nm.

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Determinación de azúcares totales en las muestras por el método de fenol-sulfúrico 1. A cada muestra de 5 mL tomad tomada a en los diferentes tiempos se le ag agregó regó 0.1 mL de fenol al 5 %. 2. Después se les a agregó gregó 2.5 mL de ácido ácido sulfúrico concentrado. concentrado. En baño de hielo y la campana de extracción 3. Una vez que las muestras estuvieron a temperatu temperatura ra ambiente se leyó la absorbancia en el espectrómetro, a longitud de onda de 490 nm.

Prueba cualitativa de la actividad enzimática de la amilasa 1. 2. 3. 4.

En 20 mL d de e agua des destilada tilada se agregó 0.01 g aproximad aproximadamente amente de almidón. almidón. A 5 tubos de ensayo se les agregó 3 mL de la solución d de e almidón. A cada uno de los 5 tu tubos bos se les ag agregó regó la enz enzima ima obtenida. Después de det determinados erminados tiempos (5, 1 10, 0, 20, 40 y 60 minutos) se le adicionó adicionó una gota de lugol a cada tubo. 5. Se obs observó ervó y se anotaron resultados.

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Resultados y Análisis Resultados Lo primero que se realizó fue la purificación de la bacteria  Bacillus subtilis a partir de una cepa proporcionada por los profesores, para llevar a cabo la purificación, la bacteria B. subtilis se resembró en una caja Petri con agar nutritivo por el método de dilución americana, dicha placa se dejó incubar por 24 horas a 37°C. Imagen I.- Purificación de nutritivo.

la bacteria B. subtilis en agar

Se observaron colonias circulares de color beige, de superficie lisa con aspecto húmedo. Una vez purificada y aislada la bacteria B. subtilis se  le realizaron las pruebas bioquímicas primarias. Obteniendo los siguientes resultados.

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Tabla I.- Resultados obtenidos de pruebas bioquímicas primarias de la bacteria B. 

subtilis Prueba Bioquímica Tinción de Gram

Oxidasa

Resultado Bacilos Gram (+)

Positivo

Motilidad

Positivo

Catalasa

Positivo

Oxidación /Fermentación (OF)

Bacteria fermentativa

Se compararon los resultados obtenidos experimentalmente con los reportados en la literatura, al ver que ambos coincidían se decidió realizar los preinóculos a partir de la bacteria B. subtilis purificada y aislada anteriormente. Una vez terminada la incubación de los preinóculos estos tenían una coloración ligeramente café. Una vez listos los preinóculos, se le agregaron al matraz de fermentación que contenía el medio de cultivo preparado anteriormente. Para monitorear el crecimiento de la bacteria se realizó una curva de crecimiento microbiano, para la cual se fueron tomando las muestras cada 60 minutos, ya que el tiempo de duplicación de la bacteria reportada en la literatura es de 40 minutos. En el recuento de las placas, se obtuvieron los siguientes resultados.

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Tabla II.- Resultados de UFC/ml obtenidos en diferentes tiempos de la fermentación de B. subtilis Tiempo (horas)   (horas)

Dilución

UFC/ ml (promedio)

3 x 105 

0

-

1

10 -1

3.6 x 105 

2

10-2

4.7 x 105 

3

10-3

3.1 x 105 

4

10-4

6.1 x 106 

5

10-5

-------------

6

10-6

-------------

Como se puede observar en la tabla anterior, en las últimas diluciones no hubo crecimiento del microorganismo en las cajas, esto se puede atribuir a que el factor de dilución fue muy grande o que el microorganismo agotó todo el nutriente en el medio de fermentación y murió. Gráfica I. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis.

En la gráfica anterior se puede ver que el microorganismo primero se fue adaptando al medio en el que se encontraba y luego fue creciendo hasta llegar a la fase exponencial y a la fase estacionaria, sin embargo, a partir del tiempo cinco no se pudo seguir el crecimiento ya que no hubo crecimiento de la bacteria en las placas.

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Otro factor importante a considerar es la degradación de azúcares por parte del microorganismo. La cual se hizo por el método de fenol-sulfúrico, con lo cual obtuvimos los siguientes resultados.

Tabla III.- Resultados obtenidos de la prueba de degradación de azúcares totales por fenol-sulfúrico. Tiempo (horas)

Absorbancia (nm)

0

1.887

1

1.842

2

1.825

3

1.818

4

1.820

5

1.805

Como se puede ver en la tabla tres, la absorbancia va disminuyendo a través del tiempo. Para determinar la concentración de glucosa, nos apoyamos de una curva de calibración, para la cual se tomaron los siguientes datos. Tabla IV.- Datos de curva de calibración de glucosa.  Absorbancia (nm)

Glucosa (μg /mL) 

0.2322 0.545

10 25

0.6998

40

1.02382

60

1.27811

75

1.75031

100

Con los datos se construyó la curva de calibración

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Gráfica II.- Curva de calibración

Utilizando la regresión lineal se obtuvo la ecuación de la recta: y=59.225x-2.4953 Pudiendo así calcular la concentración de glucosa en cada tiempo:

Tabla V. Concentración de glucosa en función del tiempo. Tiempo (horas)

Glucosa (μg /mL) /mL)  

0

109.2622

1

106.5971

2

105.590

3

105.1757

4

105.2942

5

104.4658

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Gráfica III.- Curva de degradació degradación n de glucosa glucosa

Como se puede observar en la gráfica, el microorganismo fue degradando la glucosa del medio lentamente, sin embargo, al tiempo cinco se nota un pequeño aumento en la concentración de glucosa, esto puede haber sido por la composición del medio de cultivo ya que como sabemos la papa contiene diversos compuestos entre los cuales pudieron aportar una mayor cantidad de carbohidratos. Otro factor pudo haber sido por un error al momento de llevar a cabo el procedimiento o las lecturas.

Una vez finalizada la fermentación, se extrajo el extracto enzimático por medio de centrifugación, en el cual se inactivó el sedimento obtenido el cual era de coloración café. Se siguió trabajando con el extracto obtenido, el cual presentaba una coloración café translúcida. Imagen II.- Extracto enz enzimático imático obtenido a partir de la fermentación

Para obtener la enzima α-amilasa, α -amilasa, fue necesario precipitarla a partir del extracto con sulfato de amonio en baño de hielo. Una vez que la s solución olución se saturó y s se e tornó de

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una coloración café más oscuro se centrifugó para obtener la enzima. La cual se secó a temperatura ambiente. Por último, se realizó una prueba cuantitativa de la enzima α -amilasa, esta prueba fue con una solución de almidón a la cual se le agregó la enzima y se dejaron reposar diferentes tiempos, una vez terminado el tiempo de reposo, se le agregaron gotas de lugol, esto era para identificar si la enzima había degradado el almidón presente. Tabla VI. Resultados de la prueba cualitativa de la actividad enzimática de la amilasa. Tiempo (min uto s)

5

10

20

40

60

Resultado

Sin embargo, no hubo un cambio en el color al agregar el lugol, como se puede observar en la tabla anterior, esto se puede atribuir a que a la enzima se haya desestabilizado en el proceso de secado ya que como sabemos las enzimas son muy susceptibles al calor. Y la nuestra se dejó secando aproximadamente veinticuatros horas a temperatura ambiente.

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Conclusiones Mediante esta serie de experimentos descritos en este informe, y cumpliendo las condiciones que el microorganismo Bacillus subtilis requiere para producir α-amilasa α-amilasa se puede afirmar que la hipótesis formulada es correcta y se cumplieron los objetivos propuestos. La experimentación tuvo contratiempos por la falta de algunos reactivos como ácido sulfúrico y sustrato de amonio; pero esto no representó mayores problemas que posponer pruebas por algunos días. Otro factor que intervino el desarrollo del proyecto, mas no en el resultado, fueron los días de asueto y el periodo vacacional, que interrumpieron la fluidez del desarrollo experimental y acortaron la disposición del laboratorio.

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Bibliografía   Bibliografía biotecnología otecnología de los enz enzimas. imas. Zar Zaragoza, agoza, España : •  Wiseman, Alan. Manual de bi  Acribia S.A., 2004. •  Kelly, Catherine T. Fogarty, William M. Microbial enzymes and biotechnology 2nd edition. England : ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS LTD, 2000. •  http://www.enzymeindia.com/enzymes/enzymes-spanish.asp (mayo de 2017) http://www.enzymeindia.com/enzymes/enzymes-spanish.asp  College, Occidental. Bio. 130 Intro. to celular chemistry. Translation and Signal Sequence. [En línea] 1 febrero de 2017. http://departments.oxy.edu/biology/bio130/lectures_2000/11-17-00_lecture.htm

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