OBSERVACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS

UNIVERSIDAD DEL QUINDÍO FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS Y TECNOLÓGICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA IV SEMESTRE

OBSERVACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS MEDIANTE TINCIÓN GRAM

Arias, Diana Carolina. Código: 1094927766; Córdoba, Luz Dari. Código:

RESUMEN Una manera de diferenciar las bacterias Gram + de las Gram - es mediante el método de la tinción GRAM, el cual se basa en la fijación de los colorante en la de la pared celular. Se aplico la técnica GRAM con los colorantes cristal violeta y safranina, a muestras del medio de cultivo sembrado 5 días antes. Palabras clave: Gram positiva, Gram negativa, tinción GRAM

INTRODUCCIÓN El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y la forma más simple de incrementar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre dos tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, capsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. (Stanier et al., 2005). La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos de estos utilizados con frecuencia, son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos (Ingraham et al., 1999). Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. (Planas, 2000). En esta práctica se usó la tinción GRAM, esta es uno de los métodos más importantes en el

laboratorio bacteriológico ya que permite diferenciar las bacterias en Gram Positivas y Gram Negativas. “Este método fue descubierto por Christian Gram (Danés), en 1884, quien observó que en cortes histológicos que contenían bacterias coloreadas con violeta de genciana y tratadas con solución acuosa de yodo, este colorante podría ser removido del corte histológico con el empleo de alcohol, pero no de las bacterias. Posteriormente descubrió que no todas las bacterias retenían al violeta de genciana sino que algunas eran decoloradas por acción del alcohol. A las primeras las llamo Gram positivas y las segundas Gram negativas. Estas que quedan incoloras son teñidas luego mediante el empleo de un colorante de contraste como la safranina, para hacer posible su observación”. (Madigan et al., 2004). La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglicano que se encuentra en las paredes celulares de las bacterias. Las Gram + tiene muchas capas de peptidoglicano, las cuales a su vez, sostienen moléculas de acido teicoico. Este reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción. Un complejo de las moléculas cristal violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover. Como la pared celular de las Gram positivas retiene estos compuestos, es más difícil decolorar una célula Gram + que una Gram - (Schlegel et al., 2000) Una mezcla de

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alcohol remueve el cristal violeta de la célula Gram -, pero no de la Gram +. Esta mezcla de alcohol también disuelve mucho de la capa exterior de lipopolosacárido de la pared celular de la Gram negativa, lo cual acelera la remoción del colorante primario cristal violeta de estas células. (Stanier et al., 2005) Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram + serán del color del cristal violeta, o colorante primario, y las células Gram – serán del color de la safranina que es el colorante de contraste (Brewster et al., 2004).

poco del inoculo y se colocó en el portaobjetos, haciendo un frotis con él, luego éste se fijó a la llama con ligeros pases con el mechero y se dejó secar; a continuación se le adicionó el colorante cristal violeta, se dejó actuar durante un minuto y se lavó con agua destilada, luego se le agregó lugol, igualmente se dejó por un minuto, volvió y se lavó con alcohol al 96%, se le adicionó safranina, esta se dejó durante un minuto y se lavó nuevamente con agua destilada; una vez hecho esto, se dejó secar nuevamente; se realizó el montaje en el microscopio y se inició la observación en diferentes objetivos, también se preparó el objetivo de inmersión adicionándole un poco de aceite de cedro al cubreobjetos. Se realizaron microscópicos.

observaciones

de

hongos

OBJETIVOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN     

Diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas en un cultivo, mediante la tinción Gram. Observar niveles de organización multicelular. Aplicar el método de tinción Gram. Identificar células procariotas y eucariotas mediante tinción. Conocer las diferencias entre bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Al observar en el microscopio el inoculo teñido, de las muestras bacterianas del cultivo sembrado cinco días antes, se encontró lo siguiente:

A - 40X

B - 100X

C - 100X

D - 100X

METODOLOGÍA Se prepararon dos medios de cultivo: un agar nutritivo y un Mac Conkey, los cuales fueron abiertos en un lugar donde se encontraran bacterias; se llevó los medios a una incubadora y se dejaron allí durante cinco días. Se encendió un mechero para así usar la técnica aséptica, se utilizó un asa de siembra, la cual se calentó al rojo en el mechero, se tomó una gota de agua con el asa y se deposito en un portaobjetos. Se volvió a esterilizar el asa, se abrió la caja de petri que contenía el inoculo que se teñiría, se introdujo el asa evitando que ésta eliminara por excesivo calor a los microorganismos; se tomó un

Figura 1. Bacterias Gram+ (violeta) y Gram(rosadas). A- cocos (gram+); B- estafilococos (gram+) y bacilos (gram-); C- estafilococos (gram-) y D- estreptococos (gram+) y estreptobacilos (gram+).

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En las observaciones de todas las muestras, fue de notar, que se encontraron en más proporción las bacterias Gram+ que las Gram-. Esto es respaldado por lo dicho en Schlegel (2000), “la técnica de coloración de Gram es de gran utilidad en Bacteriología, ya que permite diferenciar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas. Casi la mitad de las bacterias, son Gram positivas y el resto Gram negativo”. La diferencia que se observó en la coloración de las bacterias es responsabilidad de la pared celular de estas, como lo dice Loewy (2002) “la propiedad de teñirse o no de violeta oscuro según la tinción introducida por Gram (1884) es una característica taxonómica importante, en la que participa fundamentalmente la pared celular y con la que se correlacionan también otras propiedades de las bacterias”. Entre la pared celular de las Gram negativas y de las Gram positivas hay ciertas diferencias estructurales lo que produce la tinción de distinto color en cada una de ellas, estas diferencias están corroboradas con lo mencionado en Ingraham (1999) donde dice: La pared celular de las Gram+ se distingue de las Gram-, en que las primeras poseen una pared celular gruesa, que consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de acido técnico; generalmente, 80% 90% de la pared de la célula Gram+ es peptidoglicano. La pared de la célula Gram-, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Solo 10% 20% de la pared de la célula Gram- es peptidoglicano. Mediante la tinción Gram también se pudo observar las agrupaciones de algunas de las bacterias encontradas, como se puede ver en la figura 1 (B-C-D), algunas bacterias aparecen en forma de cocos (estreptococos y estafilococos) y bacilos.

100X

Figura 2. Hongos filamentosos.

CONCLUSIONES   

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Se diferenció células Gram positivas de Gram negativas mediante la técnica de tinción GRAM. Se reconoció la forma y agrupaciones de algunas bacterias. Se comprendió que la tinción GRAM se basa en la cantidad de peptidoglicano presente en la pared celular de las bacterias. Se conocieron algunas propiedades de la pared celular de las bacterias.

BIBLIOGRAFÍA 

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También se encontraron y se observaron hongos filamentosos en el agar nutritivo, figura 2. 

Brewster, R. Q.; Vanderwerf, C. A.; McEwen, W. E. 2004. Curso Práctico de Química Orgánica. Vedado. La Habana: Pueblo y Educación. 311p. Ingraham, J. L. & Ingraham, C. A. 1999. Introducción a la Microbiologia. Volumen II. España: Reverté, S. A. 803p. Loewy, A. G. y Siekevitz, P. 2002. Estructura y Función Celular. (I. Rodríguez, Trad.). México: Continental S.A. 572p. Madigan, M. T; Martinko, J. M y Parker, J. 2004. Brock, Biología de los Microorganismos. (10ª ed.). Madrid: Pearson Educación. 1096p. Planas, J. 2000 Prácticas de Biología. Barcelona: Mega. 284p.

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Schlegel, H. G. y Zaborosch, C. 2000. Microbiología General. (J. Lalucat, Trad.) Barcelona: Omega. 654p. Stanier, R. Y; Ingraham, J. L; Wheelis, M. L. and Painter, P. R. 2005. Microbiología. Segunda edición. Barcelona, España: Reverté, S.A. 753p.