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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC-ISO 5667-16 2000-12-15

CALIDAD DEL AGUA. MUESTREO. PARTE 16. GUÍA PARA EL ENSAYO BIOLÓGICO DE MUESTRAS

E:

WATER QUALITY. SAMPLING. PART 16. GUIDANCE ON BIOTESTING OF SAMPLE

CORRESPONDENCIA:

esta norma es equivalente (EQV) a la ISO 5667-16: 1998

DESCRIPTORES:

agua; ensayo biológico; muestreo; calidad del agua.

I.C.S.: 13.060.01 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. Tel. 6078888 Fax 2221435

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PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La norma NTC-ISO 5667-16 fue ratificada por el Consejo Directivo el 2000-12-15. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma que pertenece al Comité Técnico 000016 Gestión ambiental. Agua, a través de su participación en Consulta Pública ACEITES Y GRASAS VEGETALES ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. AMBIENCOL INGENIEROS LTDA. ANTEK LTDA. ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE INGENIEROS DE PETRÓLEOS BAVARIA S.A. CARVAJAL S.A. CEMENTOS BOYACÁ S.A. CERVERIA LEONA S.A. COMPAÑÍA NACIONAL DE VIDRIOS S.A. DAMA ECOPETROL EMAC LTDA. EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ EMPRESAS PÚBLICAS DE MEDELLÍN GASEOSAS COLOMBIANAS S.A. GOBERNACIÓN DE CUNDINAMARCASECRETARÍA DEL MEDIO AMBIENTE GRIFFITH COLOMBIA S.A. ICA IDEAM INCOLBESTOS S.A.

INGEOMINAS INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIOIVON BERNIER LABORATORIO LARKIN LTDA. MINIPAK LTDA. MINISTERIO DE AGRICULTURA MINISTERIO DEL MEDIO AMBIENTE MINISTERIO DE DESARROLLO MINISTERIO DE MINAS Y ENERGÍA MINISTERIO DE SALUD MINISTERIO DE TRANSPORTE NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. PRODUCTOS ALIMENTICIOS MARGARITA S.A. SIEMENS SOCIEDAD ANÓNIMA SIKA ANDINA S.A. SMURFIT CARTÓN DE COLOMBIA S.A. SOCIEDAD DE ACUEDUCTO, ALCANTARILLADO Y ASEO DE BARRAANQUILLA TEFCO LTDA. UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA UNIVERDIDAD DE LA SALLE UNIVERSIDAD JAVERIANA UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO

UNIVERSIDAD LIBRE UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN

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NTC-ISO 5667-16

CALIDAD DEL AGUA. MUESTREO. PARTE 16. GUÍA PARA EL ENSAYO BIOLÓGICO DE MUESTRAS

1.

OBJETO

Esta norma ofrece una guía práctica acerca del muestreo, tratamiento previo, desempeño y evaluación de las aguas en el contexto del ensayo biológico. Se brinda información acerca de cómo enfrentar los problemas del ensayo biológico que surjan como consecuencia de la naturaleza de la muestra de agua y la adaptabilidad del diseño del ensayo. Se tiene como propósito dar a conocer experiencia práctica en cuanto a las precauciones que se deben tomar por medio de la descripción de métodos probados con éxito para solucionar o evitar algunos de los problemas experimentales del ensayo biológico de las aguas. En la medida de lo posible, se ha hecho referencia a normas internacionales y parámetros existentes. También se utilizó información extraída de documentos publicados o de comunicación oral. Se trataron principalmente problemas relacionados con la sustancia, en cuanto a muestreo, tratamiento previo y preparación de las muestras de agua para ensayo biológico y tratamiento de las muestras durante el ensayo, en especial al realizar ensayos con aguas y aguas residuales que contienen ingredientes inestables o removibles. Se delinearon los principios básicos de aseguramiento de la calidad, evaluación de datos y presentación de resultados. Se pone especial énfasis en el ensayo ecotoxicológico con organismos (“ensayo biológicos de especies únicas”). Algunas características tratadas en esta guía general se aplican lo mismo para estudios de biodegradación como de bio-acumulación en tanto se relacionan con el muestreo y la preparación de muestras. También se discute la preparación de sustancias con poca solubilidad y el ensayo más allá del límite de solubilidad del agua. Esta norma no es aplicable al examen bacteriológico del agua. En otras normas internacionales se describen los métodos adecuados

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 2.

NTC-ISO 5667-16

REFERENCIAS

Las siguientes normas contienen disposiciones que, a través de la referencia en este texto, constituyen disposiciones de la presente norma. En la fecha de su publicación, las ediciones indicadas se hallaban vigentes. Todas las normas se encuentran sujetas a actualización, y se invita a las partes que logren a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre la posibilidad de aplicar las ediciones más recientes de las normas indicadas a continuación. Los miembros de la IEC e ISO mantienen registros de las normas internacionales vigentes en la actualidad. NTC-ISO ISO 5667-3: 1994, Water Quality. Sampling. Part 3: Guidance on the Preservation and Handling of Samples NTC-ISO 5667-10: 1992, Water Quality. Sampling. Part 10: Guidance on Sampling of Waste Waters 3.

MUESTREO

3.1

GENERALIDADES

La escogencia de puntos de muestreo representativos, frecuencia de muestreo, tipo de muestras tomadas, etc. depende del objetivo del estudio. En general, el método de muestreo para análisis químico es compatible con el propósito del ensayo biológico. No obstante, algunos ensayos requieren de una particular manipulación y conservación del agua y agua residual. De acuerdo con el tipo de investigación (por ejemplo, ensayos de toxicidad o biodegradación) y la forma en que se vayan a procesar las muestras, se hace necesario dividir la muestra en diferentes partes que se preservan y/o almacenan bajo diversas condiciones y se procesan de variadas maneras. Si se han tomado varias muestras (por ejemplo, de diferentes lugares o en diversos tiempos) se pueden combinar a fin de lograr mayor representatividad. Es recomendable mezclar estas muestras por completo y, de ser necesario, dividirlas en sub-muestras. A fin de obtener submuestras de igual calidad, se debería garantizar que la muestra a granel mantenga la homogeneidad durante el proceso de sub-muestreo, por ejemplo, por medio de sacudida o agitación. Esto es especialmente válido en el caso de las mezclas de dos fases, por ejemplo, aguas que contienen partículas suspendidas, suspensiones algales. Se recomienda emplear aparatos de muestreo de enfriamiento al combinar varias muestras tomadas en diferentes tiempos. 3.2

MUESTREADORES/RECIPIENTES/CONTENEDORES

El volumen, la forma y el material de los recipientes depende de la naturaleza de la muestra (por ejemplo, degradabilidad/estabilidad), la cantidad de repeticiones, el volumen requerido para estos ensayos y la necesidad de preservar y almacenar las muestras antes del procesamiento adicional.

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Se aconseja reducir al máximo el tiempo requerido para la congelación y el deshielo por medio de la reducción del volumen de la muestras, es decir, el tamaño del recipiente. En general, resulta adecuado emplear recipientes de un litro para la congelación. Para ensayos que requieran mayores volúmenes, se recomienda dividir la muestra en recipientes que contengan menos de 10 l. El volumen total de la muestra tomada debería ser suficiente para cubrir cualquier ensayo complementario o repetido. Se recomienda guardar las submuestras restantes almacenadas congeladas por separado hasta que se realice la evaluación final. El material de los recipientes debería ser químicamente inerte, de fácil limpieza y resistente al calentamiento y congelación. Se recomiendan los recipientes de virio, polietileno o politetrafluoroetileno (PTFE). 3.3

ESTADO DE LLENADO DE LOS CONTENEDORES

Se aconseja decidir si se llenan los contenedores por completo hasta el borde o sólo en forma parcial, contando con un espacio de aire, teniendo en cuenta el tipo de muestra, el modo de preservación y el ensayo biológico contemplado. Los problemas relacionados con el llenado parcial pueden ser:

-

Agitación intensificada durante el transporte, que conduce a la degradación de las partículas adicionadas;

-

interacción con la fase de gas, que conlleva al arrastre;

-

oxidación de sustancias, que conduce, por ejemplo, a la precipitación de compuestos de metales pesados.

Los problemas relacionados con el llenado completo pueden ser:

-

agotamiento del oxígeno, con posible descomposición, que conduce a la formación de metabolitos tóxicos (por ejemplo, nitrito, sulfuro);

-

deterioro de la homogenización debido a la sacudida o agitación del volumen total.

Los contenedores de muestras, cuando se contempla la congelación para la preservación, no deberían llenarse por completo a fin de permitir la expansión del volumen. 4.

TRANSPORTE

Se recomienda proteger las muestras recogidas de la fragmentación, incremento de la temperatura y contaminación externa. Se aconseja evitar la identificación errónea de las muestras transportadas en hielo por medio de marcadores y/o rótulos a prueba de agua.

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PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO

Como se establece en la norma ISO 5667-3, resulta imposible emitir reglas absolutas para la preservación, por ejemplo, la duración del posible almacenamiento y la eficiencia de varios modos, puesto que estos aspectos dependen principalmente de la naturaleza de la muestra, en especial de su actividad biológica. Por lo general, las aguas potables y las freáticas son menos susceptibles a las reacciones biológicas y químicas que las aguas superficiales, aguas residuales crudas o tratadas. Si la composición química se puede anticipar en forma aproximada, se recomienda hacer referencia a la norma NTC-ISO 5667-3 para los propósitos del ensayo biológico. Sin embargo, se deben considerar algunas precauciones adicionales como se indica a continuación.

-

Es aconsejable procesar las muestras para ensayo biológico preferiblemente sin demora luego de la recolección a fin de evitar cambios en la composición original como resultado de las reacciones físicas y químicas y procesos biológicos o ambos. La duración máxima de almacenamiento no debería exceder las 12 h a temperatura ambiente (máximo 25° C). Se recomienda conservar las muestras en la oscuridad a fin de evitar el crecimiento de algas.

-

Si no es posible realizar el ensayo inmediatamente después del muestreo (o preparación de la muestra), por ejemplo, al preparar muestras compuestas, se aconseja el enfriamiento o congelación.

-

La forma más común y recomendada de preservar muestras de agua residual consiste en enfriarlas a una temperatura entre 0° C y 5° C. Al enfriarse en esta escala y almacenarse en oscuridad, la mayoría de muestras permanece estable de manera normal hasta durante 24 h (véase la norma ISO 5667-10). El enfriamiento debería comenzar tan pronto como sea posible después del muestreo, ya sea en campo, por ejemplo en cajas frías con hielo, o en un refrigerador en el vehículo de transporte.

-

La congelación debe ser inferior a –18° C, de acuerdo con la norma ISO 5667-10 para permitir en general un incremento en la conservación. Por lo general, los períodos de almacenamiento máximo van de unas cuantas semanas a dos meses dependiendo de la estabilidad de las muestras.

-

La experiencia ha demostrado que la calidad del agua residual puede afectarse durante la congelación y el deshielo.

-

Se aconseja excluir el uso de preservativos biocidales para el propósito del ensayo biológico. Tampoco se recomienda la adición de ácidos muy concentrados o bases para estabilizar las muestras, por ejemplo, HCl ó NaOH.

-

Se debería enfatizar que, si existe duda, el analista químico y el técnico del ensayo biológico deberían consultarse entre sí antes de decidir acerca del método de manipulación y preservación de las muestras. Si no son compatibles las técnicas de preservación para el análisis químico y para el ensayo biológico, se deberían proporcionar submuestras separadas para los diferentes propósitos.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 6.

APARATO Y EQUIPO

6.1

SELECCIÓN DEL APARATO

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El tipo, la forma y el material del equipo técnico dependen del ensayo y la naturaleza de la muestra. Todos los materiales que entran en contacto con la muestra de ensayo deben ser tales que las interferencias causadas por sorción o difusión del material de ensayo, por elusión de materia extraña (por ejemplo plastificantes) o por crecimiento de organismos, se mantengan en un nivel mínimo. Resultan convenientes los materiales inertes, por ejemplo, el vidrio, PTFE. Las conexiones de tubos deberían ser lo más cortas posibles y se recomienda cambiarlas periódicamente. Se aconseja evitar la contaminación del material de ensayo, debido por ejemplo, a la grasa de rectificado proveniente de tapones o accesorios. No resultan convenientes los tubos hechos de cobre, aleación de cobre o plásticos no-inertes. 6.2

SILIZACIÓN

Con el propósito de reducir al máximo la adsorción del material de ensayo en los contenedores, tuberías, vidrios o plásticos se puede silizar (siliconizar) por medio de inmersión o enjuague en una solución de fracción masiva al 5 % de diclorodimetilsilano en cloroformo o heptano. A medida que el solvente orgánico se evapora, el silano se deposita en la superficie, la cual debería enjuagarse muchas veces con agua o calentarse a 180 °C durante 2 h antes de usarse. Se aconseja emplear la silización sólo si se van a ensayar ingredientes del agua o sustancias de alta adsorción y no se encuentra disponible material inerte adecuado (por ejemplo, PTFE). 6.3

LIMPIEZA DE APARATOS Y EQUIPO

Antes de usarse, se recomienda limpiar el aparato y el equipo con adecuados agentes de limpieza, por ejemplo, ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, detergentes, etanol, ácido sulfúrico/peróxido de hidrógeno y, siempre que sea adecuado, se esterilizan térmica o químicamente (por ejemplo, con solución de hipoclorito). No se aconseja emplear ácido cromosulfúrico. El enjuague repetido del aparato con agua destilada (o agua con el mismo grado de pureza), garantiza que no hayan quedado vestigios del agente de limpieza o desinfección. A fin de remover los vestigios del uso anterior, se recomienda el lavado con ácido antes del lavado final con agua destilada. 7.

TRATAMIENTO PREVIO Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS

7.1

GENERALIDADES

El siguiente diagrama de flujo (véase la Figura 1) contiene información sobre términos comúnmente empleados (aunque algunas veces en forma diferente) en las normas y parámetros del ensayo biológico.

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Muestra, (ejemplo: sustancia, agua (residual)) Etapa preparatoria, ejemplo: disolución, homogeneización, filtrado, neutralización, aeración Muestra para ensayo, (ejemplo: sustancia disuelta, agua residual neutralizada) Agua de dilución

Medio nutriente

Medio de ensayo incluyendo muestra para ensayo (diluida)

Lote de ensayo

Medio de control excluyendo muestra para ensayo

Organismos de ensayo, inóculo.

Lote de control

Figura 1. Preparación de las muestras para bioensayo

La muestra, es decir una sustancia química, es una preparación, sólida o en solución, una mezcla de varias sustancias, agua o agua residual. La muestra de ensayo se elabora a partir de la muestra por medio de varios pasos específicos de la toma de muestra y el ensayo, por ejemplo, por medio de disolución, homogenización, sedimentación, filtrado, neutralización o aeración. Se adiciona agua de dilución para preparar una serie de diluciones definidas. El medio de ensayo (incluyendo la muestra de ensayo) se obtiene luego de la adición del medio nutriente. El lote de ensayo final se obtiene por medio de la adición de organismos de ensayo, que en el caso de microorganismos, se llama inóculo. En el lote de control o, en varios lotes paralelos, se preparan los controles a partir de una mezcla de agua de dilución y solución nutriente con organismos de ensayo sin muestra de ensayo. Cuando el efecto o el comportamiento de una sustancia se conoce a partir de ensayos previos (“sustancia de referencia”) y cuando dicha sustancia se examina dentro del marco de una serie de ensayos como muestra de ensayo, esto se denomina lote de referencia. 7.2

DESHIELO

Se aconseja deshelar las muestras almacenadas congeladas antes de su uso. Se recomienda el agua corriente o un baño de agua caliente a una temperatura que no exceda los 25 °C, junto con una suave sacudida, a fin de evitar el sobrecalentamiento local. Resulta esencial el deshiele de las muestras antes de usarse, puesto que el proceso de congelación puede tener el efecto de concentrar algunos componentes en la parte interior de la muestra que se congela en último lugar. El tratamiento con microondas involucra el riesgo de sobrecalentamiento.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 7.3

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HOMOGENEIZACIÓN

Es recomendable asegurar una distribución uniforme de todos los componentes solubles y particulados. Se puede aplicar una agitación suave, una sacudida vigorosa, tratamiento ultrasónico o dispersión mecánico de alta velocidad, de acuerdo con la naturaleza de las muestras. Durante este paso del tratamiento, se debería prestar atención a la pérdida potencial de ingredientes volátiles. Como regla general, se debería tener cuidado de que el estado original de la muestra se restaure o por lo menos se altere lo mínimo posible. 7.4

SEPARACIÓN DE MATERIA SOLUBLE Y PARTICULADA

En general, los ensayos biológicos se realizan con la muestra original. Sin embargo, en algunos casos, grandes cantidades de materia particulada, lodo y sedimento interfieren con los requisitos comportamentales de los organismos de ensayo (atascamiento de agallas de peces, deterioro del filtro de alimentación de dahpnids, limitación ligera de algas). Si no se quiere que estos efectos deletéreos se reflejen en los resultados del ensayo, se pueden evitar o superar dichas interferencias por diferentes medios. Las aguas ricas en partículas pueden dar origen a interferencias, por ejemplo, al realizar cuantificación por medio de un contador de partículas. De igual manera, el conteo microscópico se ve bastante deteriorado. La dosificación continua se considera poco confiable debido al atascamiento y bloqueo de la tubería. Sin embargo, la filtración, la centrifugación y otros métodos de separación involucran el riesgo de que los componentes activos, que se adhieren a las partículas, sean removidos antes del ensayo. Además, se deben tener en cuenta los problemas relacionados con la filtración, por ejemplo la adsorción y lixiviación en materiales de filtro. La sedimentación y centrifugación evitan estos problemas. Al realizar ensayos en presencia de partículas que causen problemas severos, se recomienda permitir que la muestra se asiente durante de 30 min a 2 h ó se lleva a cabo una filtración gruesa (>50 µm), removiendo así solo partículas gruesas. La masa de la partícula separada puede examinarse por separado. Algunos de los métodos de ensayo ofrecen la posibilidad de determinar un factor de corrección para parámetros tales como la turbidez. Las aguas ricas en bacterias interfieren en los ensayos relacionados con actividad de bacterias, por ejemplo, la inhibición de la respiración. Por lo menos en forma parcial, se puede dar cuenta de la interferencia debida a la actividad de las bacterias en la muestra, por medio del ejercicio de controles convenientes. Al ensayar algunas algas, cardúmenes de peces pequeños o cultivos celulares, las infecciones bacteriales pueden causar interferencia. Todos los métodos de esterilización disponibles, tales como el tratamiento térmico o UV o la filtración de la membrana (0,2 µm) involucran un alto riesgo de efectos secundarios. Cuando es necesario el filtrado es preferible la filtración de fibra de vidrio. Generalmente, la centrifugación, por ejemplo 10 min a 4 500 g ± 1 500 g, es preferible a la filtración. 7.5

CONCENTRACIÓN PREVIA

La concentración previa de las muestras incrementa la concentración no solo de sustancias peligrosas sino también de otros constituyentes del agua, los cuales pueden ser deletéreos en altas concentraciones. 7

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Adicionalmente resulta esencial tener en cuenta que en cualquier caso la concentración previa es selectiva según del procedimiento aplicado, lo cual altera el patrón de composición original de los ingredientes del agua, por ejemplo:

-

La extracción líquido / líquido con solventes orgánicos y la extracción de fase sólida por medio de la adsorción de sólidos (por ejemplo las resinas XAD) resultan particularmente eficientes para los componentes hidrofóbicos del agua. La intensidad iónica y la presión osmótica pueden atenuarse. Se pueden excluir los iones tóxicos, los químicos polares y los ingredientes coeficientes de agua (por ejemplo, el enmascaramiento), tales como ácidos húmicos.

-

La evaporación y la congelación-secado pueden conllevar a pérdida de sustancia volátiles y aumentar la intensidad y la presión osmótica;

-

La ultrafiltración puede conducir a una pérdida especialmente de pequeñas moléculas que penetran la membrana.

El incremento en la concentración por encima del umbral de solubilidad puede conducir a la precipitación o floculación de sustancias disueltas previamente. La acumulación biológica no se puede simular por medio de la concentración previa de muestras, puesto que los factores de bioconcentración (BCF) no pueden relacionarse o extrapolarse. Algunos ingredientes de la muestra de agua que se esté concentrando pueden experimentar reacciones químicas a una tasa superior a la de la muestra original. Se pueden obtener valores adecuados blancos sólo si se encuentran disponibles muestras de referencia descontaminadas, por ejemplo aguas arriba de la fuente de contaminación. Es permisible el incremento en la salinidad al preparar blancos con igual osmolaridad y composición iónica similar (por ejemplo, la proporción Na:K). No es posible extrapolar a partir de ensayos agudos con muestras concentradas previamente hasta los efectos crónicos de la muestra original. Por consiguiente, es preferible escoger un sistema de ensayo más sensible o prolongar el tiempo de exposición en vez de realizar previa concentración de la muestra. Si no existe método sensible disponible para ensayar la muestra original y se aplica un procedimiento de concentración previa, el resultado es más discutible entre mayor sea el factor de concentración. Por las razones mencionadas anteriormente, por lo general los ensayos para toxicidad aguda y crónica con muestras concentradas previamente son insignificantes y no se recomiendan. En todos los casos, los resultados de ensayo obtenidos con muestras de agua previamente concentradas deberían interpretarse con extrema precaución. Las investigaciones preliminares de este tipo no pueden normalizarse y deberían validarse por medio de investigaciones extensivas adicionales. 7.6

AJUSTE DEL pH

La selección del valor del pH al cual se debe ajustar la muestra se rige por el objetivo del ensayo, es decir:

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-

El ajuste del pH del agua de recibo producirá resultados más representativos del efecto de los tóxicos una vez se hallan en el ambiente;

-

El ajuste de un pH definido entre 6 y 9 (el cual generalmente es tolerable para la biota) permitirá la expresión de tóxicos ionizables que de otra manera serían enmascarados por las condiciones de pH por fuera de esta escala.

Por lo general, se neutralizan las muestras con valores pH extremos que exceden los límites de tolerancia de los organismos de ensayo. Se recomienda omitir la neutralización si el efecto del pH se va a reflejar en el resultado del ensayo o si se observa modificación física o reacciones químicas (por ejemplo, precipitación) debido al ajuste del pH. La concentración del ácido o base requerida para la neutralización debe ser tal que la modificación del volumen sea la menor posible. Se aconseja evitar el paso del punto neutral. No es recomendable que el agente de neutralización experimente una reacción con los ingredientes en la muestra, que pudiera, por ejemplo, conducir a la precipitación o al acomplejamiento. Además, no se debería influenciar el organismo de ensayo por medio de la ampliación o inhibición. Por lo general, se recomiendan las soluciones de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. 7.7

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE PARTIDA Y LOTES DE ENSAYO

7.7.1

Sustancias solubles en agua

Al preparar la solución de partida, la porción pesada de la sustancia no debería exceder la cantidad máxima por disolver (5 y la mayoría >7). Para una valoración más elaborada del potencial de bioacumulación, además del BCF, son factores indicativos

-

la cinética de depuración

-

la altura del altiplano de residuos y

-

la distribución de órganos específicos

Si la eliminación sigue un modelo de un compartimento de cinética de primer orden, es posible calcular un valor CT50 (tiempo para el 50 % de la eliminación) de la manera siguiente:

CT50 =

Loge 2 K2

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A menudo se observa una excreción de dos fases, es decir una eliminación rápida seguida de una más lenta debido a las diferentes tasas de captación en órganos específicos, procesos metabólicos o diferentes trayectorias de excreción. Para investigaciones de esta clase, resultan más adecuadas las técnicas de trazador radioactivo. La concentraciones de ensayo generalmente muy bajas en un ensayo de acumulación (1/100 ó 1/1 000 de LC50) imponen requisitos especiales sobre la eficiencia de los métodos analíticos que acompañan el ensayo. En algunas áreas (transformación de sustancias de ensayo) se pueden emplear sustancias radio-etiquetadas. En el Parámetro 305 de OECD se pueden encontrar detalles adicionales acerca de la determinación de la bioacumulación. 11.3

ENSAYO DE GENOTOXICIDAD

Los ensayos de genotoxicidad / mutagenicidad sirven como medidas preventivas dentro de un sistema de mantenimiento de salud pública general. En el tiempo presente existe poco conocimiento confiable acerca de los efectos de las sustancias mutagenéticas en sistemas ecológicos acuáticos. La genotoxicidad puede considerarse como una alteración del genoma celular bajo la influencia de sustancias. En la medida en que estos cambios se trasmiten a la siguiente generación celular, es posible hablar de efecto mutagénico de genotipo cambiante. Los efectos tóxicos desempeñan un papel esencial en la etología del cáncer. Sin embargo, no todas las alteraciones genotóxicas son heredadas por las células hijas, puesto que las células cuentan con sistemas de reparación compensatorios para el ácido deoxiribonucléico (ADN) que son capaces de revertir muchas alteraciones adversas. Adicionalmente, a menudo los efectos drásticos conducen a la muerte celular. Se puede considerar la inducción de sistemas de reparación como prueba de la concurrencia de efectos genotóxicos. Las mutaciones se dividen de tres tipos.

a)

Mutaciones genéticas, en las cuales la secuencia de base en un gen se modifica a través del intercambio de una base de ADN (mutación de punto) o por medio de la introducción o extracción de una o más bases de ADN (cambios en el código de lectura, mutaciones de cambio de estructura)

b)

Las mutaciones de cromosomas, en las cuales se altera la estructura del cromosoma visible, por ejemplo a través de la eliminación, traslocación o inversión. Las mutaciones de cromosomas pueden conducir a la formación de eliminaciones reconocidas como micronúcleos. La estructura de los cromosomas puede percibirse especialmente bien durante la metafase del ciclo celular.

c)

Las mutaciones de genoma en las cuales se cambia la cantidad total de células. En este tipo, la cantidad de las células individuales (aneuploidia) o el conjunto entero de cromosomas (poliploida) puede cambiar.

Las mutaciones de cromosomas y genomas sólo pueden observarse en células de organismos eucarióticos. Los procedimientos de ensayo in vivo e in vitro son distintos. Los procedimientos in vitro posibilitan la demostración del potencial genotóxico de un lote de ensayo y resultan apropiados a fin de reducir al máximo los ensayos de animales. No obstante, puesto que los procedimientos in vitro constituyen sistemas de ensayo suborgánicos, su valor informativo es limitado. 26

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Se puede indagar acerca del mecanismo del efecto genotóxico en forma diferencial mediante procedimientos in vitro. Como regla general, estos se realizan con cultivos de células provenientes de mamíferos (por ejemplo células de CHO, células V79). Su potencial metabólico en xenobióticos es comparativamente inferior. Por esta razón las enzimas microsómicas (fracción S9), por ejemplo de tejido de hígado inducidas por bifenilos policlorados (PCBs), se adicionan (activación metabólica) como serie paralela de ensayo. Aunque la fracción S9 puede causar una reducción en la actividad con algunas sustancias, es posible que primero induzca a un efecto mutagénico con otras numerosas sustancias (promutagénico) por medio de la biotransformación. Además la fracción S9 se adiciona en sistemas de ensayos bacteriales (procarióticos) (por ejemplo en el procedimiento de ensayo de Ames) en una serie paralela de ensayo. Con bacterias, los potenciales de alteración de genoma pueden identificarse rápida y fácilmente. Sin embargo, una extrapolación de los resultados a organismos superiores pone limitantes significativas. Al realizar ensayos bacteriales y procedimientos in vitro eucarióticos, es conveniente trabajar bajo condiciones estériles. Al igual que el agua, y en especial el agua residual, muy a menudo las muestras contienen muchas bacterias y dichas muestras generalmente deben filtrarse por medio de un filtro de membrana antes de usarse en la mayoría de los sistemas de ensayo. Las concentraciones / diluciones empleadas no deberían ser deteriorantes de células (citotóxicas). Los lotes de referencia (controles positivos) para verificar la reactividad de las células deberían prepararse en forma simultánea. 12.

EVALUACIÓN

12.1

GENERALIDADES

La evaluación de los resultados del ensayo primero involucra la inspección crítica de datos y una presentación y descripción de los resultados de ensayo empleando gráficos, tablas y parámetros estadísticos adecuados, por ejemplo valores medios y variaciones (estadísticas prescriptivas). En muchos casos se sigue un procesamiento estadístico más extensivo que se dirija a determinar las relaciones de concentración o dosis/respuesta a fin de calcular parámetros adecuados para el quantum de acción y examinar la importancia estadística (estadísticas de cálculo y ensayo). Esta evaluación estadística más extensiva es útil solo si los datos son suficientes para este propósito, lo cual requiere primero que todo de examen crítico de los datos. 12.2

INSPECCIÓN Y DESCRIPCIÓN DE DATOS BÁSICOS

Toda evaluación debería comenzar con un examen crítico de los resultados de ensayo obtenidos. Se verifica la credibilidad de todos los datos, lecturas primarias o datos transformados deducidos de las mediciones, en especial en el caso de los anómalos. Nota. Se recomienda que el evaluador elimine los anómalos solo después del juicio experto. Los ensayos de anómalos pueden emplearse aquí como auxiliares matemáticos.

En las consideraciones acerca de la credibilidad resulta útil una presentación gráfica, preferiblemente de los valores sin transformar. A menudo es muy conveniente un gráfico semilogarítmico de los efectos medidos. Cualquier gráfico debería presentar en forma clara las unidades de concentración, la cantidad de controles y lotes paralelos y los parámetros del efecto.

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Adicionalmente, los gráficos ofrecen información valiosa acerca del comportamiento de los componentes de ensayo y el punto hasta el cual es aconsejable la determinación de una relación matemática concentración/respuesta. También puede indicar cuál modelo estadístico es probablemente el más adecuado. En el caso de la evaluación más avanzada, en principio, se debería dar prioridad a los métodos aritméticos sobre los puramente gráficos puesto que, por lo general, permiten el cálculo de escalas de confianza y varianzas . Se aconseja presentar los datos en forma tabular junto con los valores medios calculados, los coeficientes de variación y el número de observaciones independientes de los lotes paralelos (réplicas). En algunos casos en que se van a reportar parámetros definidos simples, por ejemplo las diluciones de umbral, no hay necesidad de una evaluación estadística más extensiva. En estos casos, la evaluación termina con el cálculo del porcentaje de las inhibiciones y la decisión acerca de si un efecto medido es superior o inferior que un valor límite determinado. 12.3

EVALUACIÓN ESTADÍSTICA

12.3.1 Generalidades La evaluación estadística más extensiva se propone

a)

presentar una relación matemática entre el efecto medido y la concentración empleada (relación concentración / respuesta)

b)

calcular los parámetros estadísticos que caracterizan el efecto y

c)

realizar ensayos estadísticos o proporcionar escalas de confiabilidad (por ejemplo refiérase a la norma ISO 8466)

Se acostumbra proporcionar concentraciones como parámetros estadísticos para el efecto de una sustancia en la que se observó un quantum de acción específico (EC: concentración efectiva, ECx; x: % efecto x). Por ejemplo, el EC50 ofrece la concentración a la cual el efecto puede observarse en el 50% de los animales de ensayo ó el 50 % del efecto (por ejemplo la mortalidad, inmovilidad) (concentración de efecto medio, 50 % de cuantil). Estos parámetros para el quantum del efecto se derivan de la relación concentración / respuesta. En algunos ensayos se determina una concentración de efecto, por encima de la cual se observó un efecto importante estadísticamente, por ejemplo LOEC (Concentración inferior de efecto observado) y NOEC (Concentración de efecto no observado). Estos parámetros pueden determinarse mediante comparación de los resultados de ensayo de varios niveles de concentración con los resultados de control empleando ensayos estadísticos para el análisis de la variación (ANOVA) o, si no se cumplen los prerrequisitos, métodos no paramétricos (por ejemplo ensayos U múltiples). Nota. Dicha figura, por definición, será una de las concentraciones ensayadas. En forma alternativa, el LOEC puede ser un cálculo de punto, ECX. El valor de x se determina a partir de la experiencia práctica con el método de bioensayo particular. En muchas situaciones un EC10 será un cálculo LOEC apropiado. Para algunos métodos de ensayo con mayor variabilidad o más generalmente en situaciones donde los límites de confiabilidad alrededor de EC10 son superiores, el EC10 puede remplazarse por un EC20.

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El factor decisivo en la selección de una evaluación estadística o método de ensayo es la posibilidad de que el criterio del ensayo se relacione con el tipo de variable de respuesta (cualitativo) o métrico (cuantitativo) de variables (véase el numeral 9.5.3). 12.3.2 Variables de respuesta (cualitativas) Los métodos enunciados aquí son adecuados para los bioensayos en los cuales se estudia la variable “mortalidad” ó “inmovilidad” (por ejemplo, ensayos de toxicidad aguda con peces y daphnia). El método de cálculo clásico para variables cuánticas de esta clase se basa en el principio de probabilidad máxima. En el caso de la distribución normal este conduce a análisis probit (30), (31), con distribución logística para análisis logit (32) empleando la distribución Weibull para el análisis Weibit (33). En el caso de las variables cuánticas, los cálculos de parámetro que emplean el principio de probabilidad máxima tienen en cuenta la heterogeneidad de la varianza de los valores de medición. Esto constituye una diferencia muy importante para una regresión no pesada siguiendo la linealización de las curvas de respuesta de la concentración (por ejemplo, mediante el uso de papel probit). En esta situación, no se llega a escalas de confiabilidad válidas. 12.3.3 Variables métricas (cuantitativas) Los métodos de análisis probit, logit o Weibit arriba mencionados no son adecuados para variables métricas (cuantitativas). Por lo general, el principio de los mínimos cuadrados de la regresión lineal y no lineal se emplea para los métodos de cálculo. El propósito es seleccionar una función que permita el mejor ajuste a los datos (varianza residual inferior). Si los valores de medición revelan diferentes varianzas para las concentraciones de ensayo individual, se recomienda realizar los análisis de regresión con factores de pesaje adecuados (34). No se recomienda relacionar los efectos medidos en los lotes de ensayo con los controles no tratados e ingresarlos contra los logaritmos de la concentración. Esta transformación puede conducir a la heterogeneidad de las varianzas y, por tanto, conlleva mayores desventajas con respecto a la evaluación estadística. Por esta razón, la evaluación siempre debería realizarse con datos sin transformar. Se calculan las concentraciones de efecto, siempre que sea posible, a partir de las funciones de respuesta de la concentración. En el caso de las variables cuánticas (por ejemplo del ensayo de peces o daphnia agudos), se acostumbra proporcionar el EC0, EC50 y EC100 que también se pueden describir como LC0, LC50 y LC100 (LC: concentración letal). Donde: -

EC0: concentración ensayada superior a la cual no se observa ningún efecto en línea con el criterio del ensayo (LC0: todos los organismos sobreviven);

-

EC50: concentración a la cual existe un efecto sobre el 50% de los organismos en línea con el criterio del ensayo (LC50: 50% de los organismos mueren);

-

EC100: concentración inferior a la cual existe un efecto sobre el 100% de los organismos en línea con el criterio del ensayo (LC100: todos los organismos mueren)

-

El EC0 y EC100 son parámetros derivados directamente del experimento y no concentraciones de umbral determinadas estadísticamente. La NEC (Concentración sin efecto) se deriva de una relación concentración/efecto extrapolada a cero. 29

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En el caso de variables métricas, por lo general se calcula el EC50 , algunas veces también el EC10 (por ejemplo en el ensayo de inhibición de crecimiento de algas). Se debería tener presente que, por ejemplo, el EC50 no corresponde a una concentración de efecto medio, como en el caso de las variables cuánticas, pero designa la concentración a la cual una variable métrica es en promedio 50 % inferior a la de control. Nota. IC (concentración inhibitoria para el efecto x %). La designación EC50 algunas veces también se emplea en casos en los cuales una variable se inhibe en un 50% en relación con el control (por ejemplo cantidad de animales jóvenes en el ensayo de reproducción de daphnia, biomasa y tasa de crecimiento en el ensayo de inhibición de algas). Con el propósito de diferenciar estas concentraciones de efecto, determinadas a partir de las variables métricas de las arriba mencionadas, algunos autores sugieren que se deberían describir como ICx (concentración inhibitoria para el efecto x%).

El intervalo de confiabilidad puede calcularse empleando el método Fieller (30), (36), (38). Si la situación de datos es tal que ninguno de los métodos arriba mencionados puede aplicarse, la EC50 y su escala de confianza puede ser aproximada empleando métodos alternativos, por ejemplo, (Método Promedio de Desplazamiento, Método Kärber Sperman Ajustado (30,31) o la simple interpolación (de ser necesario de EC0 y EC100). Si no se obtiene EC100 con muestras no diluidas, se debería reportar el máximo EC obtenido. En muchos ensayos de biodegradación la cantidad de valores de degradación medidos en la fase de altiplano no es suficiente para permitir un tratamiento estadístico. Sin embargo, el último resultado de la fase de altiplano a menudo no es representativa de esta fase. En dichos casos, se recomienda indicar el resultado del ensayo en una escala del 10 %, por ejemplo, grado de biodegradación 70 % a 80 % de la remoción DOC. 12.3.4 Confirmación estadística de resultados 12.3.4.1 Generalidades. Los ensayos estadísticos aquí mencionados se emplean para determinar si en general la sustancia ensayada presenta un efecto importante o a partir de cúal concentración se observa un efecto importante o ambas. Esta concentración se describe como FOEC/LOEC (Concentración de Efecto Observado Primero/Inferior) y la siguiente concentración más baja (sin efecto importante) como NOEC (Concentración de Efecto No observado). Estos parámetros dependen de:

-

la varianza del parámetro medido;

-

la cantidad de paralelos en las concentraciones de ensayo y controles (réplicas);

-

la cantidad de concentraciones ensayadas;

-

los incrementos de los niveles de concentración.

Por tanto, el resultado se ve influenciado en gran medida por el diseño del ensayo. Aquí, además la elección de un método estadístico adecuado depende de si se examinan variables de respuesta cuánticas o cuantitativas (métricas).

30

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12.3.4.2 Variables cuánticas. Los métodos mencionados aquí son adecuados para ensayos en los cuales se examina la variable “mortalidad” o “inmovilidad” (por ejemplo, el ensayo de toxicidad aguda con peces y daphnia). Con el propósito de confirmar estadísticamente el efecto observado, resultan convenientes los ensayos para escalas de datos nominales. Y para determinar LOEC/NOEC, es apropiado el ensayo binomial de acuerdo con Fisher. 12.3.4.3 Variables métricas. La selección de un método de ensayo adecuado depende de si el criterio de ensayo (por ejemplo, biomasas, tasas de crecimiento, producción de animales jóvenes y tasa metabólicas) sigue una distribución normal aproximada y si la varianza es homogénea. Entonces, los métodos estadísticos pueden emplearse como los más confiables. En el caso de una distribución normal y homogeneidad de varianza, se intenta la confirmación estadística empleando análisis de varianza simple (ANOVA). Se determinan NOEC y LOEC empleando el ensayo Dunnett o Williams (35). Si no se cumplen estas condiciones previas, se puede confirmar el efecto empleando el ensayo Kruskal-Wallis. En ese caso, resultan adecuados los ensayos U múltiples (por ejemplo de acuerdo con Bonferroni-Holm (39) ) para determinar las LOEC/NOEC. Notas: 1)

La EC0 no se puede igualar con la NOEC, ya que se determina directamente de los datos sin emplear un método estadístico. Sin embargo, ambos se determinan en un mayor grado mediante el diseño del ensayo (por ejemplo, la cantidad y magnitud de la concentración incrementan).

2)

La determinación de la NOEC empleando los métodos estadísticos arriba mencionados se discute críticamente en la actualidad (40). En forma alternativa, se propone determinar la concentración umbral de efecto NEC a partir de la relación concentración- respuesta (71).

13.

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

13.1

ENSAYOS DE TOXICIDAD

Los ensayos de toxicidad brindan principalmente las concentraciones de umbral o efectivas, por ejemplo, NOEC/LOEC, EC10, EC50 y EC90 ó LC (concentración letal), respectivamente, cuando resulte apropiado. Los datos de la concentración deberían indicar en forma clara si estos se basan en el ión efectivo, en el compuesto o por ejemplo en la etapa de dilución. Siempre que sea posible, la curva de respuesta de la concentración debería presentarse junto con los resultados del ensayo en un gráfico, por ejemplo como se muestra en la Figura 2, donde se presentan los resultados del ensayo y los valores de ECx. Esta ofrece una clara representación del carácter de la relación entre la concentración y la respuesta y el acuerdo de los resultados con respecto al modelo. Deberían determinarse el criterio de ensayo (“punto final”), organismo de ensayo, tiempo de exposición y, siempre que sea posible, las escalas de confianza, por ejemplo para la EC50 (véase el numeral 12.3.4). Nota. Al ensayar las aguas residuales por medio de diluciones graduadas, se puede reportar la menor dilución sin efecto (véase el Anexo A).

31

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100

% de inhibición

80

60

40

20

0 EC

1 0,03

10 20 0,08 0,14

50 0,37

80 90 0,97 1,61

99 5,35

Concentración mg/l

Figura 2. Ejemplo de curva de concentración / respuesta adaptada a la distribución normal para la inhibición

13.2

ENSAYOS DE DEGRADACIÓN

El grado de degradación se describe mediante el porcentaje de disminución en la concentración de un (o varios) parámetro(s) como se menciona en el numeral 11.1. Se recomienda describir la cinética de la degradación (fase de retardo para adaptación, tiempo de media vida, “ventana de 10 días”). 13.3

ENSAYOS DE BIOACUMULACIÓN

Se debería describir el transcurso de tiempo de concentración de la sustancia en todo el organismo o tejidos especiales mediante gráficos o tablas a fin de demostrar que se ha alcanzado un estado estable. Se aconseja reportar los BCF como una figura sin dimensiones rodeada de no más de tres figuras importantes. Se debería establecer la base de los BCF (por ejemplo cuerpo, órgano, masa fresca o seca) y su diseño experimental (estático, semiestático, dinámico). 13.4

ENSAYOS DE GENOTOXICIDAD

En general, el número de incidentes observados (por ejemplo, las aberraciones cromosomáticas) o capacidades metabólicas adquiridas (por ejemplo la inducción de enzimas de reparación) se reporta en relación con concentraciones determinadas de una sustancia o diluciones de una muestra de agua. Este valor se relaciona con un valor correspondiente de lote de control. El valor puede normalizarse de acuerdo con el número de células al finalizar el ensayo. La relación concentración / efecto puede evaluarse de acuerdo con el numeral 12. Si se ensayan sustancias, el resultado generalmente se reporta en forma cualitativa (positivo/negativo). Nota. Si se ensayan aguas, el resultado se puede reportar como la menor dilución sin efecto

32

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 14.

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REPORTE DEL ENSAYO

Se recomienda registrar los siguientes datos en el reporte del ensayo:

a)

nombre del laboratorio que realiza el ensayo;

b)

fecha y período de ensayo;

c)

referencia al método de ensayo (número de la norma internacional o nacional) empleado;

d)

organismo de ensayo (por ejemplo, nombre científico, cepa, fuente), tratamiento previo terapéutico o de aclimatación (si existe alguno);

e)

designación del material de ensayo (número de lote, origen, fecha y período de muestreo);

f)

pretratamiento de la muestra (por ejemplo, preservación, preconcentración, homogenización, ajuste del pH, tipo de agente neutralizante, pre-aireación);

g)

datos, derivados, condensados o transformados, incluyendo, si es apropiado, los resultados de controles positivos (lote de referencia);

h)

datos químicos y físicos determinados durante el ensayo (por ejemplo, la temperatura, el contenido de CO2, pH, turbidez, precipitación, posible cambio en la concentración de la sustancia, etc.);

i)

cualquier desviación del protocolo de ensayo (naturaleza del agua de dilución, solución nutriente, aeración, temperatura, etc., cantidad de organismos o densidad del inóculo, cantidad de lotes paralelos y controles);

j)

método de evaluación (logit, probit, gráfico, computacional);

k)

detalles de los resultados del ensayo;

l)

comentarios acerca de los resultados del ensayo, si son necesarios;

m)

firma del investigador responsable;

n)

firma del controlador de calidad, si resulta apropiado.

15.

PRINCIPIOS BÁSICOS DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD PARA ENSAYOS BIOLÓGICOS

15.1

GENERALIDADES

El término “aseguramiento de la calidad” abarca todas las medidas tomadas a fin de determinar y reportar los errores potenciales y la calidad en los resultados de ensayo. También se puede aplicar la mayoría de medidas en una serie de Normas Internacionales (serie ISO 9000, etc.) introducidas bajo el término “aseguramiento de la calidad analítico” a los métodos de ensayo biológicos. 33

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El aseguramiento de la calidad de un ensayo incluye la planeación del muestreo, las mediciones y la evaluación, la documentación y valoración de los resultados y su registro. Consecuentemente con la importancia del aseguramiento de la calidad en el procedimiento, se debería incorporar en forma adecuada un programa correspondiente a la estructura de la organización general considerando que algunas veces, según del método de ensayo empleado, hasta el 30 % del tiempo del laboratorio debe dedicarse al logro del aseguramiento de la calidad adecuado. Las medidas de aseguramiento de la calidad se pueden subdividir en cuatro secciones:

15.2

-

fase preparatoria;

-

control interno de calidad;

-

auditoría de control externo de la calidad;

-

evaluación y documentación.

FASE PREPARATORIA

15.2.1 Organización y personal del laboratorio de ensayo Los usuarios de esta guía deberán tratar de garantizar lo siguiente: -

El laboratorio de ensayo se organiza de modo que permita que una cantidad suficiente de personal con la capacitación y experiencia necesaria inicial y adicionales necesarias para que realice las tareas asignadas.

-

El gerente general de la instalación de ensayo es normalmente, el responsable de los aspectos organizacional y administrativo y, entre otras cosas, de garantizar que se cumplan los requisitos relacionados con el personal y equipo para la conducción de los ensayos.

-

Un supervisor de ensayo biológico vigila la operación y desempeño. El es responsable de supervisar que el ensayo se realice de forma correcta y adecuada y que se documente como un reporte de ensayo.

-

Las tareas de aseguramiento de la calidad involucran la verificación de la conformidad del desempeño del ensayo con los métodos y criterios fijados en la Norma Internacional y del registro correcto de la información bruta, la cual además debe corresponder con los resultados ofrecidos en el reporte.

-

En laboratorios más grandes, puede ser aconsejable asignar una persona con la preparación necesaria para supervisar el aseguramiento de la calidad sobre una base de tiempo completo o parcial. Una unidad organizacional independiente puede asumir las tareas.

-

Se proporciona capacitación continua regular y adecuada tanto para el gerente del laboratorio como para otros miembros del personal del mismo.

34

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15.2.2 Equipo de laboratorio Los usuarios de esta guía deberían garantizar lo siguiente.

15.3

-

El laboratorio de ensayo cuenta con el equipo apropiado para conducir los ensayos. Además del equipo técnico, el laboratorio debería contar con adecuadas instalaciones en el edificio, disposición de cuartos e instalaciones de ingeniería domésticas (por ejemplo, electricidad, suministro de agua y gas, filtrado de emisiones, ventilación o aire acondicionado) a fin de cumplir con los requisitos de los ensayos por realizarse. La disposición de todos los desechos debería cumplir con las disposiciones de seguridad pertinentes.

-

La distribución del espacio dentro del área del laboratorio debería ser tal que se evitara la contaminación de las instalaciones, equipo, personal y sistemas de ensayo, lo mismo que la indeseada mezcla de las sustancias y medios de ensayo. En especial, el cultivo y mantenimiento de los organismos de ensayo debería separarse del sitio de preparación y ensayo.

-

Para métodos de ensayo biológico, también deberían cumplirse las precondiciones de aprobación del estatuto correspondientes (por ejemplo, los requisitos de legislación de protección animal y las disposiciones acerca de la protección contra epidemias), además de los preceptos relacionados con el laboratorio y equipo técnico.

FIJACIÓN DE LOS OBJETIVOS DE CALIDAD

Los objetivos de calidad se fijan como base de las decisiones sobre selección del método y de los pasos que hacen parte del aseguramiento de la calidad. Los objetivos de calidad abarcan tanto los parámetros estadísticos como las declaraciones acerca de la selectividad o especificidad del método de ensayo. 15.4

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO

Resulta esencial que todas las partes del método de ensayo se describan como realmente se emplearon, el equipo e instrumentos empleados y las medidas de aseguramiento de la calidad tomadas. Las etapas de ocurrencia frecuente, que son parte rutinaria de todos los ensayos o de un método de ensayo específico, pueden fijarse en las descripciones estándar (procedimientos operantes estándar (SOPs) ), lo que significa que no es necesario mencionarlas específicamente en cada plan de ensayo. Son típicos de dichos procedimientos el tratamiento de las muestras, el mantenimiento y la calibración de los instrumentos de medición, la limpieza del equipo y los instrumentos, la cría y cultivo de los organismos de ensayo, las instalaciones de seguridad y emergencia, etc.). Se debe informar por anticipado el alcance, contenido y tiempo programado del ensayo a todo el personal que hace parte del ensayo. La hoja de trabajo debe contener información clara acerca de las personas responsables, los objetivos del ensayo, la realización del mismo y los métodos de ensayo empleados, al igual que el tiempo y el tipo de mediciones por realizarse.

35

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 15.5

NTC-ISO 5667-16

DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE ENSAYO

Antes de la aplicación práctica de un método de ensayo, deben determinarse los parámetros de ensayo pertinentes (por ejemplo, las desviaciones estándar y los coeficientes de variación). También se deben definir los criterios de validez. En el caso de los métodos estandarizados, normalmente se ofrecen parámetros estadísticos y criterios de validez en el procedimiento normalizado. Adicionalmente, la fase preparatoria abarca la selección de una estrategia de calibración adecuada para los instrumentos, el ensayo de la conveniencia de los materiales y el examen de la posibilidad de que el método sea el adecuado para el objetivo. 15.6

CONTROL DE CALIDAD

15.6.1 Control de calidad interno El control de calidad interno es una parte integral del método de ensayo general. Se aplica normalmente en aquellas mediciones biológicas que se conducen sobre una base rutinaria. Incluye mediciones para identificar, superar y evitar errores y debería incluir los siguientes pasos:

-

ensayo de las precondiciones reales con respecto al personal, muestreo, laboratorio, equipo, organismos de ensayo, instrumentos y métodos analíticos;

-

calibración de instrumentos;

-

ensayos con sustancias de referencia;

-

mantenimiento de cuadros de control;

-

determinaciones múltiples;

-

control de credibilidad;

-

validación

Todas las medidas y resultados de control de calidad interno deben documentarse cuidadosamente, presentarse de manera clara y actualizarse con frecuencia. 15.6.2 Control de calidad externo (auditoría) Una comparación de los resultados de los ensayos y mediciones con los de otros laboratorios puede ser parte importante del control de calidad externo. La cooperación en los ensayos interlaboratorio que involucran un mayor número de participantes sirve para dar a los resultados mayor autoridad y posibilitar correcciones de fallas menores. La intención de la auditoría externa es confirmar (o no) que el control de calidad interno funciona. 15.6.3 Evaluación La evaluación de la información bruta obtenida de las etapas individuales del método de examen debería realizarse de acuerdo con el método documentado de evaluación. El desempeño del ensayo debería tener relación con los resultados intermedios y finales, y controlarse en forma regular mediante controles de credibilidad selectivos. 36

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15.6.4 Documentación Se aconseja establecer los registros e instrumentos de la documentación completa, todos los datos e información pertinentes en el curso del examen y los resultados y mediciones del control de calidad analítico y estadístico.

37

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Anexo A (informativo) Menor dilución sin efecto (LID) En el ensayo de toxicidad de agua residual mediante diluciones definidas (D), la menor dilución sin efecto (LD) expresa el lote de ensayo con mayor concentración en el cual no se ha observado inhibición ni siquiera efectos que no excedan la variabilidad específica de ensayo. D se expresa como el valor recíproco de la fracción de volumen de agua residual en el lote de ensayo. EJEMPLO.

¼ de agua residual (fracción de volumen de 25 %) es nivel de dilución D= 4.

38

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Anexo B (informativo)

Bibliografía

B.1

NORMAS INTERNACIONALES

1.

ISO 6341:1996, Water quality – Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea).

2.

ISO 7346-1: 1996, Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprindae)) – Part 1: Static method.

3)

ISO 7346-1: 1996, Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprindae)) – Part 2: Semistatic method.

4)

ISO 7346-1: 1996, Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprindae)) – Part 3: Flow-through method.

5)

ISO 7827:1994, Water quality – Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic compounds – Method by analysis of dissolved organic carbon (DOC)

6)

ISO 8192:1986, Water quality – Test for inhibition of oxygen consumption of activated sludge.

7)

ISO 8466-1:1990, Water quality –Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance characteristics – Part 1: Linear functions

8)

ISO 8466-1:1990, Water quality –Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance characteristics – Part 2: Non-linear functions

9)

ISO 8692:1989, Water quality –Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

10)

ISO 9000:1987, Quality management and quality assurance standards – Guidelines for selection and use.

11)

ISO 9408:1991, Water quality – Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic compounds – Method by determining the oxygen demand in a closed respirometer.

12)

ISO 9439:1990, Water quality – Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic compounds – Method by analysis released carbon dioxide.

13)

ISO 9509:1989, Water quality – Method for assessing the inhibition of nitrification of activated sludge microorganisms by chemicals and waste waters.

39

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14)

ISO 9887:1992, Water quality – Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds in an aqueous medium – Semicontinuous activated sludge method (SCAS).

15)

ISO 9888:1991, Water quality – Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds in an aqueous medium – Static test (Zahn-Wellens method).

16)

ISO 7827:1994, Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to freshwater fish – Method for evaluating the effects of substances on the growth rate of rainbow trout )Oncprhynchus mykiss Walbaum (Teleostei, Salmonidae)).

17)

ISO 7827:1994, Water quality –Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum.

18)

ISO 7827:1994, Water quality – Measurement of biochemical parameters – Spectometric determination of the chlorophyll-a concentration.

19)

ISO 7827:1994, Water quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.

20)

ISO 10707:1994, Water quality – Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic compounds – Method by analysis of biochemical oxygen demand (closed bottle test).

21)

ISO 10708:1995, Water quality – Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic compounds – Method by determining the biochemical oxygen demand in a two-phase closed bottle test.

22)

ISO 10712:1995, Water quality – Pseudomas putida growth in inhibition test (Pseudomas cell multiplication inhibition test).

23)

ISO 11733:1995, Water quality – Evaluation of the elimination and biodegradability of organic compounds in an aqueous medium – Activated sludge simulation test.

24)

ISO 11734:1995, Water quality – Evaluation of the ultimate anaerobic biodegradability of organic compounds in digested sludge – Method by measurement of the biogas production.

25)

ISO 13289:1), Water quality – Determination of genotoxicity of water and waste water – Umu test

26)

ISO/CD 14442:1997, Water quality – Guidance for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water.

27)

ISO/DIS 14593, Water quality – Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic compounds – Method by analysis of released inorganic carbon in sealed vessels.

28)

ISO/TR 15462, Water quality – Selection of tests for biodegradability.

29)

EN 45001: 1989, General criteria for the operation of testing laboratories.

40

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B.2

OTRAS PUBLICACIONES Y GUÍAS

30)

Finney, D.Y. (1971): Statistical methods in biological assay, 3rd Edition, University Press, London.

31)

Weber, E. (1980): Grundriβ der bilogischen Statistik, Fischer Verlag, Stuttgart.

32)

Ashton, W.D (1972): The logit transformation with special reference to its uses in bioassay. Griffin, London.

33)

Christensen, E.R. (1984): Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Res. 18, pp. 213-221

34)

Carrol, R.J and Ruppert, D (1988): Transformation and weighting in regression. Chapman and Hall, London.

35)

Dunnett, C. W. (1955): A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control Amer. Statist. Ass. J., 50: pp. 1096-1121.

36)

Fieller, E.L. (1944): A fundamental formula in the statistics of biological assay and some applications. Quart. J. Pharm. Pharmacol., 17: pp. 117-123.

37)

Girling, A.E., Whale, G.F., Adema D.M.M (1994): A guideline supplement for determining the aquatic toxicity of poorly water-soluble complex mixtures using water-accommodated fractions. Chemosphere, 29 (12): pp. 2645-2649.

38)

Morgan, B.J.T (1992): Analysis of quantal response data, Chapman & Hall, London.

39)

Holm, S. (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand J. Statist, 6: pp. 65-70

40)

Hoekstra, J.A. and van Ewijk, P.H. (1993): Alternatives for the no-observed-effect-level. Environm. Toxicol. Chem. 12: pp. 187-194.

41)

OECD 107

42)

OECD (1997) Report of the OECD Workshop on Statistical Análisis of Aquatic Toxicity Data Braunschweig, Germany, Oct. 15-17 1996, Paris March 1997.

43)

OECD 201

44)

OECD 202 Part I

Daphnia sp., Acute Immobilisation Test – 4 April 1984.

45)

OECD 202 Part II

Daphnia, Reproduction Test- Draft 6/93

46)

OECD 203

Fish, Acute Toxicity Test – 17 July 1992

47)

OECD 204

Fish, Prolonged Toxicity Test, 14-day study – 4 April 1984

48)

OECD 209

Activated Sludge, Respiration Inhibition Test – 4 April 1984

49)

OECD 210

Fish, Early-life Stage Toxicity Test – 17 July 1992

50)

OECD 301 A Ready Biodegradability: DOC-Die Away Test – 17 July 1992

Partition coefficient n-octano/water.

Alga, Growth Inhibition Test – 7 June 1984.

41

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51)

OECD 301 B Ready Biodegradability: CO2-Evolution Test – 17 July 1992

52)

OECD 301 C Ready Biodegradability: Modified MITI-Test – 17 July 1992

53)

OECD 301 D Ready Biodegradability: Closed Bottle Test – 17 July 1992

54)

OECD 301 E Ready Biodegradability: Modified OECD Screening Test – 17 July 1992.

55)

OECD 301 F Ready Biodegradability: Manometric Resporimetry Test – 17 July 1992

56

OECD 302 A Inherent Biodegradability: Modified SCAS – Test- 12 May 1981

57)

OECD 302 B Inherent Biodegradability:Zahn-Wellens/EMPA-Test – 17 July 1992

58)

OECD 302 C Inherent Biodegradability:Modified MITI-Test (II) – 12 May 1981

59)

OECD 303 A Simulation Test-Aerobic Sewage Treatment: Coupled units-Test- 12 May 1981

60)

OECD 305 A Bioaccumulation: Sequential Static Fish Test – 12 May 1981

61)

OECD 305 B Bioaccumulation: Semi-Static Fish Test – 12 May 1981

62)

OECD 305 C Bioaccumulation: Test for the Degree of Bioconcentration in Fish – 12 May 1981

63)

OECD 305 D Bioaccumulation: Static Fish Test – 12 May 1981

64)

OECD 305 E Bioaccumulation: Flow through Fish Test – 12 May 1981

65)

OECD 306

66)

OECD 471 Genetic Toxicology: Salmonella typhimurium, Reverse Mutation Assay – 26 may 1983

67)

OECD 473

Genetic Toxicology: In vitro Mammalian Cytogenetic Test – 26 May 1983

68)

OECD 476 April 1984

Genetic Toxicology: In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests – 4

69)

OECD 479 Genetic Toxicology: In vitro Sister Chromatid Exchange Assay in Mammalian Cells – 23 October 1986

70)

OECD 480 Genetic Toxicology: Saccharomyces Cerevisiae, Gene Mutation Assay – 23 October 1986

71)

OECD 481 Genetic Toxicology: Saccharomyces Cerevisiae, Mitotic Recombination Assay – 23 October 1986

72)

OECD 482 Genetic Toxicology: DNA Damage and Repair /Unscheduled DNA Synthesis in Mammalian Cells in vitro – 23 October 1986

73)

OECD (1995): Guidance Document for Aquatic Effects Assessment OECD Environment Monographs No. 92 OCDE/GD (95) 18, Paris 1995.

Biodegradability in Seawater – 17 July 1992

42

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC-ISO 5667-16

74)

OECD (1995): Aquatic testing Methods for Pesticides and Industrial Chemical, Paris (Draft Final Report, March, 1995).

75)

American Society for Testing and Materials (1991): Standard guide for collection, storage, characterization and manipulation of sediments for toxicological testing, ASTM E 1391-90, Philadelphia PA

76)

American Society for Testing and Materials (1993): Standard guide for conducting sediment toxicity tests with freshwater invertebrates, ASTM E 1383-93, Philadelphia PA.

77)

American Society for Testing and Materials (1980): Standard practice for conducting acute toxicity tests with fishes, macroinvertebrates and amphibians, ASTM E 729-80, Philadelphia PA2)

78)

ECETOC (1996): Aquatic toxicity testing of sparingly soluble, volatile and unstable substances, Monograph No. 26, pp. 1-67, Brussels

2)

En el subcomité ISO/TC147/SC6 se puede obtener información adicional acerca del ensayo biológico (pretratamiento de muestreo, desempeño y evaluación) y acerca de legislación internacional acerca del ensayo biológico en el contexto de la valoración y abatimiento de la contaminación del agua.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC-ISO 5667-16

DOCUMENTO DE REFERENCIA INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Water Quality - Sampling. Part 16: Guidance on Biotesting of Samples. Switzerland, ISO, 1998. 32 p. (International Standard ISO 5667-16:1998 )

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