NTC 5025

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025 2001-12-19

LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO NITRÓGENO

E:

MILK AND MILK PRODUCTS. NITROGEN CONTENT

DE

DETERMINATION

OF

CORRESPONDENCIA:

DESCRIPTORES:

leche; producto proteína.

lácteo;

nitrógeno;

I.C.S.: 67.100.10 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. Tel. 6078888 Fax 2221435

Prohibida su reproducción

Editada 2002-01-31

PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 5025 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-12-19. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 311201 Leche y productos lácteos. ALGARRA S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. BIOCONTROL S.A. CARULLA VIVERO S.A. CONSEJO NACIONAL DE LA LECHE Y PREVENCIÓN DE LA MASTITIS CONSEJO NACIONAL LÁCTEO COOPERATIVA DE LECHEROS DE ANTIOQUIA, COLANTA CHRISTIAN HANSEN – CENTRO AGROLECHERO INDEPENDIENTE - HUGO PARDO INDUSTRIA COLOMBIANA DE LECHES S.A., INDUCOLSA

INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO, ICA INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS, INVIMA LA ALQUERÍA S.A. LARKIN LTDA MEALS DE COLOMBIA S.A. NESTLE DE COLOMBIA S.A. PARMALAT COLOMBIA LTDA. – PROCESADORA DE LECHES S.A., PROLECHE PLASTILENE S.A.

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas. ASOCIACIÓN NACIONAL DE INDUSTRIALES ASOCIACIÓN NACIONAL DE LECHEROS, ANALAC COOPERATIVA DE LECHEROS DE LA COSTA, COOLECHERA FRIESLAND COLOMBIA – COLPURACÉ FRSKALECHE

JAIRO PASACHOA – INGENIERO DE ALIMENTOS LA CAMPIÑA S.A. MINISTERIO DE SALUD SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD TETRA PAK LTDA. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025

LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE NITRÓGENO

1.

OBJETO

Esta norma especifica los métodos para la determinación del contenido de nitrógeno en la leche y en productos lácteos. 2.

TÉRMINOS Y DEFINICIÓNES

Para los propósitos de esta norma, se aplican los siguientes términos y definiciones. 2.1 Contenido de nitrógeno: fracción másica de sustancias determinadas por los procedimientos especificados en las Partes de la 1, 2 y 4 de esta norma. 2.2 Contenido de nitrógeno no proteico: fracción másica de sustancias determinadas por el procedimiento especificado en la parte 3 de esta norma. Nota. El contenido de nitrógeno, el contenido de nitrógeno proteico y el contenido de nitrógeno no proteico se expresan como porcentaje en masa.

3.

REACTIVOS

Sólo se emplean reactivos de grado analítico reconocido, a menos que se especifique de otra manera, y agua destilada o desmineralizada o agua de pureza equivalente. 3.1

SULFATO DE POTASIO (K2SO4)

Con bajo contenido de nitrógeno 3.2

SOLUCIÓN DE SULFATO DE COBRE(II) PENTAHIDRATADO (CuSO4 5H2O)

Se disuelven 5,0 g de sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4 5H2O) en agua, en un matraz volumétrico de 100 ml. Se diluye hasta completar los 100 ml y se mezcla.

1

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 3.3

NTC 5025

ÁCIDO SULFÚRICO

Por lo menos del 95 % (m/m) - 98 % (m/m), libre de nitrógeno, ρ20 aproximadamente = 1,84 g/ml. 3.4

SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE SODIO

Con bajo contenido de nitrógeno, que contenga 50 g de hidróxido de sodio (NaOH) por 100 g. Nota. Se puede emplear una solución de hidróxido de sodio al 40 % (m/m) en lugar del 50 % (m/m), si se presentan problemas de taponamiento del sistema de flujo en una unidad automática de destilación.

3.5

SOLUCIÓN INDICADORA

Se disuelven 0,1 g de rojo de metilo en etanol al 95 % (V/V) y se diluye con etanol hasta completar 50 ml. Se disuelven 0,5 g de verde de bromocresol en etanol al 95 %(V/V) y se diluye con etanol hasta completar 250 ml. Se mezcla una parte de la solución de rojo de metilo con 5 partes de la solución de verde de bromocresol. 3.6

SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO (H3BO3)

Se disuelven 40,0 g de ácido bórico (H3BO3) en un litro de agua caliente. Se deja enfriar la solución y se ajusta el volumen hasta completar nuevamente 1 litro. Se adicionan 3 ml de la solución indicadora (véase el numeral 4.5), se mezcla y almacena la solución en una botella de vidrio de borosilicato. (La solución será de color naranja pálido). Se protege la solución contra la luz y fuentes de vapor de amoníaco, durante el almacenamiento. 3.7

SOLUCIÓN VOLUMÉTRICA ESTÁNDAR DE ÁCIDO CLORHÍDRICO

c(HCl) = (0,1 ± 0,0005) mol/l. 3.8

SULFATO DE AMONIO [(NH4)2SO4]

Mínimo de 99,9 % m/m sobre materia seca. Inmediatamente antes de emplearse, se seca el sulfato de amonio a 102 °C ± 2 °C durante mínimo 2 h. Se enfría a temperatura ambiente en un desecador. 3.9

TRIPTÓFANO (C11H12N2O2) Ó CLORHIDRATO DE LISINA (C16H15ClN2O2)

Mínimo de 99 % m/m. No se deben secar estos reactivos en el horno antes de emplearse. 3.10

SACAROSA

Con contenido de nitrógeno inferior a 0,002 % (m/m). 3.11

SOLUCIÓN DE ÁCIDO TRICLOROACÉTICO

Se disuelven 15,0 g de ácido tricloroacético (CCl3COOH) en agua en un matraz volumétrico de 100 ml. Se diluye hasta la marca y se mezcla. No se deben emplear otras concentraciones de ácido tricloroacético, ni volúmenes de soluciones diferentes a las especificadas.

2

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NTC 5025

Nota. Otras concentraciones o volúmenes de soluciones modificarán el desempeño del método con respecto a su valor medio y características de desempeño.

4.

APARATOS Y EQUIPOS

Aparatos comunes de laboratorio y en especial los siguientes: 4.1

BAÑO DE AGUA

Capaz de mantenerse un temperatura de 38 °C ± 1 °C. 4.2

MATRACES KJELDAHL

De 500 ml y 800 ml de capacidad. 4.3

BALANZA ANALÍTICA

Con capacidad para pesar con aproximación a 0,1 mg. 4.4

REGULADORES DE EBULLICIÓN

Gránulos de óxido de aluminio, Al2O3 fundido, anfótero, de alta pureza, tamaño de malla 10, los cuales no se deben reutilizar. También se pueden utilizar perlas de vidrio. 4.5

BURETA O PIPETA AUTOMÁTICA

Con capacidad para medir volúmenes de 1,0 ml de solución de sulfato de cobre (véase el numeral 4.2). 4.6

PROBETAS GRADUADAS

De 50 ml, 100 ml y 500 ml de capacidad, respectivamente. 4.7

APARATOS DE DIGESTIÓN

Con el fin de mantener los matraces Kjeldahl (véase el numeral 4.2) en una posición inclinada (aproximadamente 45°); con calentadores eléctricos o quemadores de gas que no calienten los matraces por encima del nivel de su contenido, y con sistema de extracción de vapores. Se recomienda ajustar el calentador con el fin de poder determinar el ajuste máximo que se debe usar durante la digestión. Con el propósito de evaluarlo, se precalienta al punto de ajuste del calentador. En el caso de los quemadores de gas el período de precalentamiento debe ser de 10 min y para calentadores eléctricos, de 30 min. Se determina el punto de ajuste del calentador con el que se logra llevar 250 ml de agua, incluyendo de 5 a 10 reguladores de ebullición, desde una temperatura inicial de 2° C hasta alcanzar una ebullición gradual en 5 min o 6 min para cada uno de los calentadores. Este es el máximo ajuste del calentador que se debe usar durante la digestión. 4.8

APARATO DE DESTILACIÓN

Elaborado en vidrio de borosilicato u otro material adecuado al que pueda acondicionarse un matraz Kjeldahl (véase el numeral 4.2) que conste de una cabeza difusora eficiente conectada a un condensador recto y a un tubo de salida de menor diámetro conectado a su extremo 3

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inferior. Las mangueras de conexión y el (los) tapón(es) deben ajustarse con precisión y preferiblemente deben ser de neopreno. 4.9

MATRACES CÓNICOS O ERLENMEYER

De 500 ml de capacidad, graduados cada 200 ml. 4.10

BURETA

De 50 ml de capacidad, graduada por lo menos cada 0,1 ml, que reúna los requisitos de la NTC 2175 (ISO 385), clase A. 4.11

BLOQUE DE DIGESTIÓN

Bloque de aleación de aluminio o aparato equivalente, acondicionado con un control de temperatura ajustable y dispositivo para medición de la temperatura del bloque. 4.12

TUBOS DE DIGESTIÓN

Con capacidad de 250 ml, acondicionados para ser usados con el bloque de digestión (véase el numeral 4.11). 4.13

RECOLECTOR DE VAPORES

Para usarlo con los tubos de digestión (véase el numeral 4.11). 4.14

APARATO LAVADOR CENTRÍFUGO O BOMBA DE FILTRACIÓN O ASPIRADORA

Construido de material resistente al ácido y para uso con suministro de agua corriente. 4.15

UNIDAD DE DESTILACIÓN

Manual o semiautomática, para destilación al vapor, adecuada para recibir los tubos de digestión de 250 ml (véase el numeral 4.12) y los matraces cónicos o erlenmeyers de 500 ml (véase el numeral 4.9). Nota. Dependiendo del método seleccionado para la determinación del nitrógeno en el filtrado, ya sea mediante el método Kjeldahl (parte 1) ó el método de digestión de bloque (parte 2), se requieren los aparatos mencionados en dicho método, con excepción de los mencionados a continuación que se requieren en la parte 3.

4.16

MATRACES CÓNICOS

Con capacidad de 25 ml. 4.17

PIPETAS

De capacidades de 10 ml y 20 ml. 4.18

EMBUDO DE VIDRIO PARA FILTRACIÓN

De 75 mm de diámetro.

4

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 4.19

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PAPEL DE FILTRO

De 15 cm de diámetro, libre de nitrógeno, Whatman No 1, o equivalente. 4.20

VASO DE PRECIPITADO

De 50 ml de capacidad. Nota. Dependiendo del método seleccionado para la determinación del nitrógeno en el filtrado, ya sea mediante el método Kjeldahl (parte 1) ó el método de digestión de bloque (parte 2), se requieren los aparatos mencionados en dicho método, con excepción de los siguientes adicionales que se requieren para el método de la Parte 4.

4.21

PIPETAS,

De 5 ml de capacidad. 4.22

PIPETA AUTOMÁTICA

Pipeta de bomba de pistón para suministro de porciones de 10 ml de la solución de ácido tricloroacético (véase el numeral 4.11). 5.

PARTE 1. DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO MEDIANTE EL MÉTODO KJELDAHL

5.1

PRINCIPIO

Se digiere una muestra para ensayo con una mezcla de ácido sulfúrico concentrado y sulfato de potasio, empleando sulfato de cobre (II) como catalizador para así convertir el nitrógeno orgánico presente en sulfato de amonio. Se adiciona hidróxido de sodio en exceso a la muestra digerida enfriada para liberar amoníaco. Se destila el amoníaco, el destilado se recoge en un exceso de solución de ácido bórico y se titula con solución de ácido clorhídrico. Se calcula el contenido de nitrógeno a partir de la cantidad de amoníaco. 5.2

TOMA DE MUESTRAS

La toma de muestras no hace parte del método especificado en la presente norma. En la NTC 666 (ISO 707) se ofrece un método de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado durante el transporte o almacenamiento. 5.3

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

Se calienta la muestra a 38 °C ± 1 °C en el baño de agua (véase el numeral 4.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesarla (véase el numeral 5.4.1). 5.4

PROCEDIMIENTO

5.4.1 Muestra para ensayo y tratamiento previo En un matraz Kjeldahl limpio y seco (véase el numeral 4.2), se adicionan de 5 a 10 reguladores de ebullición (véase el numeral 4.4), 15 g de sulfato de potasio (véase el numeral 4.1), 1,0 ml de la solución de sulfato de cobre (véase el numeral 4.2), aproximadamente 5 ml ± 0,1 ml de la 5

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muestra para ensayo preparada (véase el numeral 6.3), pesada con aproximación a 0,1 mg y 25 ml del ácido sulfúrico (véase el numeral 4.3). Los 25 ml de ácido sulfúrico se usan para lavar cualquier solución de sulfato de cobre, sulfato de potasio o muestra para ensayo remanente en el cuello del matraz. Se mezcla con suavidad el contenido del matraz Kjeldahl. 5.4.2 Determinación 5.4.2.1 Digestión. Se enciende el sistema de extracción de vapor del aparato de digestión (véase el numeral 4.7) antes de comenzar. Se calienta el matraz Kjeldahl y su contenido (véase el numeral 5.4.1) en el aparato de digestión regulando el ajuste del calentador lo más bajo posible de manera que la muestra para ensayo digerida no suba hasta alcanzar el cuello del matraz Kjeldahl. Se realiza la digestión con este ajuste del calentador durante al menos 20 min o hasta que aparezca vapor blanco en el matraz. Se incrementa la temperatura del calentador hasta la mitad del ajuste máximo determinado en el numeral 4.7 y se continúa el período de calentamiento durante 15 min. Al finalizar dicho período se incrementa el calor al ajuste máximo determinado en el numeral 4.7. Después que la muestra para ensayo ha sido digerida (presenta color azul verdoso claro) se continúa la ebullición durante 1 h a 1,5 h en el ajuste máximo. Si el líquido no hierve, puede ser que el calentamiento sea muy bajo. El tiempo de digestión total estará entre 1,8 h y 2,25 h. Notas 1)

Con el fin de determinar el tiempo de ebullición específico requerido para las condiciones de análisis en un laboratorio particular empleando un conjunto específico de aparatos para análisis de leche, se selecciona una muestra de leche con contenido de proteínas y contenido graso altos y se determina su contenido proteínico empleando diferentes tiempos de ebullición (1 h a 1,5 h) después de que aclare. El resultado medio de proteínas se incrementa al aumentar el tiempo de ebullición, se hace consistente y luego disminuye cuando el tiempo de ebullición es demasiado largo. Se selecciona el tiempo de ebullición que produce el resultado máximo de proteínas.

2)

Si al finalizar la digestión se evidencian pequeños puntos de material no digeridos adheridos a las paredes del matraz Kjeldahl, se deja enfriar el matraz, se lavan las paredes de éste con agua, para arrastrar las partículas a la superficie del ácido sulfúrico. Se debe reiniciar el calentamiento muy suavemente hasta la evaporación total del agua. El calentamiento progresivo debe permitir la desaparición normal de las partículas no digeridas. Al finalizar la digestión, la muestra para ensayo digerida debe ser clara y hallarse libre de material no digerido. Se deja enfriar la muestra para ensayo digerida en el ácido, en matraces abiertos, en una campana separada a temperatura ambiente durante un período de aproximadamente 25 min. Si se dejan los matraces sobre los quemadores calientes para que se enfríen, llevará más tiempo alcanzar la temperatura ambiente. La muestra para ensayo digerida y enfriada debe ser líquida o líquida con algunos cristales pequeños en el fondo del matraz, al finalizar el período de enfriamiento de 25 min. No se debe dejar la muestra para ensayo digerida sin diluir, en los matraces, toda la noche, ya que puede cristalizarse durante este período y será muy difícil su disolución con el fin de evitar esta situación.

3)

La cristalización excesiva después de 25 min es el resultado de una pérdida indebida de ácido durante la digestión y puede originar valores de ensayo bajos. La pérdida indebida de ácido se debe a la excesiva aspiración de vapores, o al tiempo de digestión excesivamente prolongado, causado por un ajuste máximo, incorrecto del calentador. Se adicionan 300 ml de agua a los matraces Kjeldahl de 500 ml, ó 400 ml de agua al emplear los matraces Kjeldahl de 800 ml. También se emplea agua para lavar el cuello del matraz. Se mezcla el contenido de los matraces, por completo, asegurándose que se disuelva cualquier cristal que se separe. Se adicionan de 5 a 10 reguladores de ebullición (véase el numeral 4.4). Se deja enfriar nuevamente la mezcla a temperatura ambiente antes de la destilación. Las muestras de ensayo digeridas y diluidas se pueden tapar y mantener para la destilación más tarde.

6

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025

5.4.2.2 Destilación. Se abre la llave de suministro de agua al condensador, en el aparato de destilación (véase el numeral 4.8). Se adicionan 75 ml de solución de hidróxido de sodio (véase el numeral 4.4) a la muestra para ensayo digerida diluida (véase el numeral 5.4.2.1) vertiendo cuidadosamente la solución en el cuello inclinado del matraz Kjeldahl de manera que forme una capa en el fondo del bulbo del matraz. Debería existir una interfase limpia entre las dos soluciones. Inmediatamente después de la adición de la solución de hidróxido de sodio al matraz Kjeldahl, se conecta al aparato de destilación (véase el numeral 4.8), el cual cuenta con un tubo de salida del condensador, cuya punta se encuentra inmersa en 50 ml de la solución de ácido bórico (véase el numeral 4.6) contenido en un matraz cónico (véase el numeral 4.9). Se revuelve vigorosamente el matraz Kjeldahl para mezclar su contenido por completo hasta que ya no sean visibles capas separadas de solución en el matraz. Se coloca el matraz en el calentador. Se enciende éste para lograr una temperatura lo suficientemente alta para hervir la mezcla. Se continúa la destilación hasta que comience la ebullición irregular (ebullición intermitente) e inmediatamente se desconecta el matraz Kjeldahl y se apaga el calentador. Se cierra el suministro del agua del condensador. La velocidad de destilación debe ser tal, que se reúnan cerca de 150 ml de destilado cuando la ebullición irregular (ebullición intermitente) inicie y el volumen del contenido del matraz cónico sea aproximadamente de 200 ml. Si el volumen del destilado recogido es menor a 150 ml, es probable que haya menos de 300 ml de agua adicionada para diluir la muestra para ensayo digerida. La eficiencia del condensador debe ser tal que la temperatura del contenido del matraz cónico no exceda los 25° C durante la destilación. 5.4.2.3 Titulación. Se titula la solución receptora de ácido bórico con la solución de ácido clorhídrico volumétrico estándar (véase el numeral 4.7) hasta la primera traza de color rosa. Se registra la lectura de la bureta por lo menos con aproximación a 0,05 ml. Una placa de agitación iluminada puede contribuir a la visualización del punto final. 5.5

ENSAYO DE LOS BLANCOS

Se mantiene un registro de los valores obtenidos para los blancos. Si éstos cambian, se debe identificar la causa. Siempre se titulan los blancos con el mismo titulante que se emplea para las muestras de ensayo. Se realiza un ensayo blanco siguiendo el procedimiento descrito en los numerales 5.4.2.1 a 5.4.2.3. Se reemplaza la muestra para ensayo con 5 ml de agua con aproximadamente 0,85 g de sacarosa (véase el numeral 4.10). Se mantiene un registro de los valores obtenidos para los blancos. Si éstos cambian, se identifica la causa. Notas: 1)

El propósito de la sacarosa en un blanco o norma de recuperación es actuar como material orgánico para consumir una cantidad de ácido sulfúrico durante la digestión que es escasamente equivalente a una muestra. Si la cantidad del ácido sulfúrico libre residual al final de la digestión es demasiado baja, la recuperación de nitrógeno mediante ambos ensayos de recuperación en los numerales 5.6.1 y 5.6.2 será baja. Si la cantidad de ácido residual presente al final de la digestión es suficiente para retener todo el nitrógeno, pero las condiciones de temperatura y tiempo durante la digestión no fueron las adecuadas para liberar todo el nitrógeno de una muestra, entonces la recuperación de nitrógeno en la sección 5.6.1 será aceptable y la recuperación de nitrógeno en el numeral 5.6.2 será baja.

2)

La cantidad de titulante empleada en el blanco debería ser siempre superior a 0,00 ml. Los blancos dentro del mismo laboratorio deberían ser consistentes en el tiempo. Si el blanco ya es rosado antes de comenzar la titulación, algo está fallando. Por lo general, en dichos casos, los matraces cónicos o erlenmeyers no están limpios o el agua que se puede condensar del aire, en la parte externa del aparato condensador, ha caído dentro del matraz de recolección causando contaminación.

7

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 5.6

NTC 5025

ENSAYOS DE RECUPERACIÓN

5.6.1 Se recomienda verificar la precisión del procedimiento en forma regular mediante los siguientes ensayos de recuperación, realizados de acuerdo con los numerales del 5.4.1 al 5.4.2.3. 5.6.2 Se verifica que no ocurra pérdida de nitrógeno mediante una muestra para ensayo de 0,12 g de sulfato de amonio (véase el numeral 4.8) junto con 0,85 g de sacarosa (véase el numeral 4.10). Nota. La verificación de la recuperación de sulfato de amonio no ofrece información acerca de la capacidad de las condiciones de digestión para liberar el nitrógeno que está enlazado en las estructuras proteínicas.

El porcentaje de nitrógeno recuperado debe estar entre 99,0 % y 100,0 % para todas las posiciones en el aparato. En caso que las recuperaciones de nitrógeno excedan un porcentaje del 100 %, el sulfato de amonio sólo es útil para determinar si ha ocurrido perdida de nitrógeno o la normalidad del titulante es inferior al valor establecido. Para recuperaciones inferiores al 99 %, la pérdida podría estar en el paso de digestión o de destilación. Es posible emplear una mezcla de sulfato de amonio y una pequeña cantidad de ácido sulfúrico (la cantidad que permanece como residuo al finalizar una digestión) en un matraz Kjeldahl. Se diluye con el volumen normal de agua, se adiciona la cantidad normal de hidróxido de sodio y se destila. Si la recuperación del nitrógeno aún es baja con la misma cantidad, la pérdida de nitrógeno se encuentra en el aparato de destilación y no en el de digestión. La probable causa sería un tubo con fuga en un sistema tradicional o que las extremidades de los condensadores no están sumergidas por debajo de la superficie del ácido bórico al comienzo de la destilación. El aparato debe pasar este ensayo antes de verificar las recuperaciones mediante el procedimiento especificado en el numeral c). 5.6.3 Se verifica la eficiencia del procedimiento de digestión mediante el uso de 0,16 g de clorhidrato de lisina ó 0,18 g de triptófano (véase el numeral 4.9) junto con 0,67 g de sacarosa (véase el numeral 4.10). Se debe recuperar por lo menos el 98 % del nitrógeno. Si la recuperación es inferior al 98 % después de contar con una recuperación del 99 % a 100 % en sulfato de amonio, entonces la temperatura o el tiempo de digestión es insuficiente (se sigue el procedimiento en el numeral 5.4.2.1 párrafo 3) o existe material de muestra sin digerir (es decir carbón) en el interior del matraz Kjeldahl. La evaluación final de desempeño se realiza mejor mediante la participación en un sistema de ensayos de aptitud del método. 5.6.4 Resultados inferiores ya sean en el ensayo de recuperación (o mayores al 100,0% en el numeral 5.6.2) indican fallas en el procedimiento y/o una concentración imprecisa de la solución de ácido clorhídrico volumétrico estándar (véase el numeral 4.7). 5.7

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

5.7.1 Cálculo Se calcula el contenido de nitrógeno, expresado como porcentaje en masa, mediante la siguiente ecuación: Wn =

1,4007 ⋅ (Vs − Vb ) ⋅ M Wt

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025

Donde: Wn =

es el contenido de nitrógeno de la muestra, expresado como porcentaje en masa;

Vs =

es el valor numérico del volumen de la solución volumétrica estándar de ácido clorhídrico (véase el numeral 3.7) empleado en la determinación (véase el numeral 5.4.2.3), en mililitros, expresados por lo menos con aproximación a 0,05 ml;

Vb =

es el valor numérico del volumen de la solución volumétrica estándar de ácido clorhídrico (véase el numeral 3.7) empleado en el ensayo blanco (numeral 5.5), en mililitros, expresado por lo menos con aproximación a 0,05 ml;

M=

es el valor numérico de la molaridad exacta de la solución volumétrica estándar de ácido (véase el numeral 3.7), expresado con cuatro decimales;

Wt =

es la masa de la muestra para ensayo (véase el numeral 5.4.1) en gramos, expresada con aproximación a 0,1 mg.

5.7.1.1 Expresión de resultados. Se expresa el contenido de nitrógeno con cuatro decimales. 5.7.2 Cálculo del contenido de proteína cruda El contenido de proteína cruda, expresado como porcentaje en masa, se obtiene mediante la multiplicación del contenido de nitrógeno (véase el numeral 5.7.1) por 6,38. 5.7.3 Expresión de resultados Se expresan los resultados de ensayo con tres decimales. 5.8

PRECISIÓN

5.8.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron del resultado de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 57251). En la referencia [1] del anexo B (Bibliografía) se resumen los detalles del ensayo interlaboratorio del método. Los valores derivados de este ensayo interlaboratorio pueden no ser aplicables a los rangos de concentración y matrices diferentes a los determinados. 5.8.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo único obtenidos con el mismo método sobre material de ensayo idéntico, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, empleando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5% de los casos no podrá ser mayor a 0,006 %.

1

ISO

Se empleó la norma 5725:1986, Precisión de los métodos de ensayo. Determinación de la repetibilidad y reproducibilidad para un método de ensayo estándar mediante ensayos interlaboratorio (ahora anulada y reemplazada por la ISO 5725-2:1994 (véase la NTC 3529-2:1999), con el fin de obtener los datos de precisión.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025

5.8.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo únicos, obtenida con el mismo método, en material de ensayo idéntico, en diferentes laboratorios, con diferentes operadores, empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no podrá ser mayor a 0,007 7 %. 5.9

INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar:

-

toda la información requerida para la completa identificación de la muestra;

-

el método de muestreo empleado, si se conoce;

-

el método empleado, citando esta norma;

-

todos los detalles de operación no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s);

-

el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos;

-

los resultados finales obtenidos, si se ha verificado la repetibilidad;

-

los resultados finales obtenidos, si la recuperación ha sido verificada

6.

PARTE 2. DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO MEDIANTE EL MÉTODO DE DIGESTIÓN DE BLOQUE (MÉTODO MACRO)

6.1

PRINCIPIO

Se digiere una muestra para ensayo, con una mezcla de ácido sulfúrico concentrado y sulfato de potasio, empleando sulfato de cobre (II) como catalizador para así convertir el nitrógeno orgánico presente en sulfato de amonio. Se adiciona hidróxido de sodio en exceso a la muestra para ensayo digerida y enfriada para liberar amoníaco. Se destila el vapor del amoníaco empleando una unidad de destilación de vapor, manual o semi-automática; se recoge el destilado en un exceso de solución de ácido bórico y se titula con ácido clorhídrico. 6.2

MUESTREO

El muestreo no hace parte del método especificado en la presente norma. En la NTC 666 (ISO 707) se ofrece un método de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado durante el transporte o almacenamiento. 6.3

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

Se calienta la muestra a 38 °C ± 1 °C mediante el baño de agua (véase el numeral 4.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesar la muestra para ensayo (véase el numeral 6.4.1). 10

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 6.4

NTC 5025

PROCEDIMIENTO

6.4.1 Muestra para ensayo 6.4.1.1 Muestra para ensayo y tratamiento previo. Se adicionan 12 g de sulfato de potasio (véase el numeral 3.1), 1,0 ml de la solución de sulfato de cobre (véase el numeral 3.2), aproximadamente 5 ml ± 0,1 ml de la muestra para ensayo preparada (véase el numeral 6.3), pesada con una aproximación de 0,1 mg y 20 ml del ácido sulfúrico (véase el numeral 3.3) en un tubo de digestión limpio y seco (véase el numeral 4.12). El ácido sulfúrico se adiciona para lavar cualquier solución de sulfato de cobre, sulfato de potasio o muestra para ensayo remanente en las paredes del cuello del tubo de digestión. Se mezcla con suavidad el contenido del tubo. 6.4.2 Determinación 6.4.2.1 Digestión. Se coloca el bloque de digestión (véase el numeral 4.11) a una temperatura inicial baja para controlar la formación de espuma (aproximadamente a una temperatura entre 180 °C a 230 °C). Se transfiere el tubo al bloque de digestión y se pone el recolector de vapores (véase el numeral 4.13) que se conecta por sí mismo a un lavador centrífugo de dispositivo similar (véase el numeral 4.14), en la parte superior del tubo. La tasa de succión de dicho lavador centrífugo o dispositivo similar debe ser apenas suficiente para remover los vapores. Es posible que se requiera mantener el aparato completo dentro de una campana extractora de vapores. Se realiza la digestión de la muestra para ensayo durante 30 min ó hasta que se desarrollen vapores blancos. Luego se incrementa la temperatura del bloque de digestión hasta una temperatura entre 410 °C a 430 °C y se continua con la digestión de la muestra para ensayo hasta que ésta, una vez digerida, sea clara. Notas: 1)

Para controlar la formación de espuma puede ser necesario incrementar la temperatura de manera gradual durante un período de aproximadamente 20 min. En ningún evento, se permite que la espuma suba más de 4 cm a 5 cm por debajo de la superficie del recolector de vapores que se encuentra insertado en la parte superior del tubo de digestión. Después que la muestra para ensayo digerida se aclara (presenta color azul verdoso claro) se continúa la digestión a una temperatura entre 410° C a 430 ° C, durante mínimo 1 h. En este período el ácido sulfúrico debe estar hirviendo. Si la ebullición visible del líquido claro no se hace evidente a manera de burbujas formándose en la superficie del líquido caliente alrededor del perímetro del tubo, entonces la temperatura del bloque puede ser demasiado baja. El tiempo de digestión total estará entre 1,75 h y 2,5 h Para determinar el tiempo de ebullición específico requerido para las condiciones de análisis en un laboratorio empleando un aparato cualquiera, se selecciona una muestra de alto contenido de proteínas y grasas y se determina su contenido proteínico empleando diferentes tiempos de ebullición (1 h -1,5 h) después de la limpieza. El contenido medio de proteínas se incrementa al aumentar el tiempo de ebullición, se hace consistente y luego disminuye cuando el tiempo de ebullición es demasiado prolongado. Se selecciona el tiempo de ebullición que produzca el resultado máximo de proteínas.

2)

Si al finalizar la digestión se evidencian pequeños puntos de material no digeridos adheridos a las paredes del matraz Kjeldahl, se deja enfriar el matraz, se lavan las paredes de éste con agua, para arrastrar las partículas a la superficie del ácido sulfúrico. Se debe reiniciar el calentamiento muy suavemente hasta la evaporación total del agua. El calentamiento progresivo debe permitir la desaparición normal de las partículas no digeridas. Al finalizar la digestión, la muestra para ensayo digerida debe ser clara y debe hallarse libre de material no digerible. Se retira el tubo del bloque con el recolector de vapores en su lugar.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025

Se deja enfriar hasta temperatura ambiente durante un período de aproximadamente 25 min. La muestra para ensayo digerida y enfriada debe ser sólo líquida, o líquida con unos pocos cristales pequeños en el fondo del tubo. No se deben dejar las muestras de ensayo digeridas, enfriadas, sin diluir toda la noche, ya que pueden solidificarse y será muy difícil solubilizarlas con agua. 3)

La cristalización excesiva después de 25 min es el resultado de una pérdida indebida de ácido durante la digestión y puede originar valores de ensayo bajos. La pérdida indebida de ácido se debe a la excesiva aspiración de vapor o a un tiempo de digestión excesivamente prolongado causado por digestiones durante un período demasiado prolongado a una temperatura por debajo de la temperatura máxima del análisis. Para reducir la pérdida de ácido, se reduce la velocidad de aspiración del vapor.

Después que se ha enfriado la muestra para ensayo digerida a temperatura ambiente, se retira el recolector de vapores y cuidadosamente se adicionan 85 ml de agua a cada tubo. Se agita para mezclar y disolver cualquier cristal que se separe. Se deja enfriar de nuevo el contenido del tubo a temperatura ambiente. 6.4.2.2 Destilación. Se abre el agua de refrigeración del condensador del aparato de destilación. Se pone el tubo de digestión que contiene la muestra para ensayo digerida y diluida, a la unidad de destilación (véase el numeral 4.15). Se pone un matraz cónico (véase el numeral 4.9) que contenga 50 ml de la solución de ácido bórico (véase el numeral 4.6) debajo de la salida del condensador, en forma tal que el tubo de salida se encuentre por debajo de la superficie de la solución de ácido bórico. Se ajusta la unidad de destilación para dispensar 55 ml de solución de hidróxido de sodio (véase el numeral 4.3). Nota. Cuando se emplee el 40 % (m/m) de la solución de hidróxido de sodio se recomienda ajustar el volumen dispensado a 65 ml. Si el suministro automático de la solución de hidróxido de sodio es extremadamente variable debido al taponamiento parcial del tubo de suministro, entonces ocurrirá gran variabilidad en el resultado del duplicado.

Teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante, se opera la unidad de destilación en forma tal que se evapore el destilado de amoníaco liberado mediante la adición de la solución de hidróxido de sodio, recogiendo el destilado en la solución de ácido bórico. Se continúa con el proceso de destilación hasta que se haya recolectado por lo menos 150 ml de destilado. Se retira el matraz cónico de la unidad de destilación. 6.4.2.3 Titulación. Se titula la solución receptora de ácido bórico con la solución de ácido clorhídrico volumétrico estándar (véase el numeral 3.7) hasta obtener la primera traza de color rosa. Se toma la lectura de la bureta por lo menos con aproximación a 0,05 ml. Una placa de agitación iluminada puede contribuir a la visualización del punto final. 6.5

ENSAYO DE LOS BLANCOS

Siempre se titulan los blancos con el mismo titulante que se emplea para las muestras de ensayo. Se realiza un ensayo blanco siguiendo el procedimiento descrito en los numerales 6.4.2.1 a 6.4.2.2. Se reemplaza la muestra para ensayo con 5 ml de agua que contenga aproximadamente 0,85 g de sacarosa (véase el numeral 3.10). Se mantiene un registro de los valores de los blancos. Si éstos cambian, se identifica la causa. Nota 1. El propósito de la sacarosa en un blanco o norma de recuperación es actuar como material orgánico para consumir una cantidad de ácido sulfúrico durante la digestión que es escasamente equivalente a una muestra para ensayo. Si la cantidad de ácido sulfúrico libre residual al final de la digestión es demasiado bajo, la recuperación de nitrógeno mediante ambos ensayos de recuperación en los numerales 6.6.1 y 6.6.2 será baja. Si la cantidad de ácido residual presente al final de la digestión es suficiente para retener todo el nitrógeno, pero las condiciones de temperatura y el tiempo durante la digestión no fueron los adecuados para liberar todo el nitrógeno de una muestra,

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025

entonces la recuperación de nitrógeno de acuerdo con el numeral 6.6.1 será aceptable y la recuperación de nitrógeno en el numeral 6.6.2 será baja.

El titulante empleado en el ensayo blanco debe ser siempre superior a 0,00 ml. Los blancos dentro del mismo laboratorio deben ser consistentes en el tiempo. Si el blanco ya es rosado antes de comenzar la titulación, algo está fallando. Por lo general, en dichos casos, los matraces cónicos o erlenmeyers no están limpios o el agua que se puede condensar del aire, en la parte externa del aparato condensador ha caído dentro del matraz de recolección causando contaminación. 6.6

ENSAYOS DE RECUPERACIÓN

6.6.1 Se recomienda verificar la precisión del procedimiento en forma regular mediante los siguientes ensayos de recuperación, realizados de acuerdo con los numerales del 6.4.1 al 6.4.2.2. 6.6.2 Se verifica que no ocurra perdida de nitrógeno mediante una muestra para ensayo de 0,12 g de sulfato de amonio (véase el numeral 3.8) junto con 0,85 g de sacarosa (véase el numeral 3.10). Nota. La verificación de la recuperación de sulfato de amonio no ofrece información acerca de la capacidad de las condiciones de la digestión para liberar nitrógeno que está enlazado a las estructuras proteínicas.

El porcentaje de nitrógeno recuperado debe estar entre 99,0 % y 100,0 % para todas las posiciones en el aparato. En caso que las recuperaciones de nitrógeno excedan un porcentaje del 100 %, el sulfato de amonio sólo es útil para determinar si ha ocurrido pérdida de nitrógeno o la normalidad del titulante es inferior al valor establecido. Para recuperaciones inferiores al 99 %, la pérdida podría estar en la digestión o destilación. Es posible emplear una mezcla de sulfato de amonio y una pequeña cantidad de ácido sulfúrico (la cantidad de remanente residual al finalizar una digestión) en un matraz Kjeldahl. Se diluye con el volumen normal de agua, se adiciona la cantidad normal de hidróxido de sodio y se destila. Si la recuperación del nitrógeno aún es baja con la misma cantidad, la pérdida de nitrógeno se encuentra en el aparato de destilación y no en el de digestión. La probable causa sería un tubo con fuga en un sistema tradicional o que los extremos de los condensadores no están sumergidos por debajo de la superficie del ácido bórico al comienzo de la destilación. El aparato debe aprobar este ensayo antes de pasar a verificar las recuperaciones mediante el procedimiento especificado en el numeral 6.6.1. 6.6.3 Se verifica la eficiencia del procedimiento de digestión mediante el uso de 0,16 g de clorhidrato de lisina ó 0,18 g de triptófano (véase el numeral 3.9) junto con 0,67 g de sacarosa (véase el numeral 3.10). Se debe recuperar por lo menos el 98 % del nitrógeno. Si la recuperación es inferior al 98 % después de contar con una recuperación del 99 % a 100 % en sulfato de amonio, entonces la temperatura o tiempo de digestión es insuficiente (se sigue el procedimiento en el numeral 6.4.2.1 párrafo tercero, o existe material de muestra sin digerir (es decir carbón) en el interior del matraz Kjeldahl. La evaluación final de desempeño se realiza mejor mediante la participación en un sistema de ensayos de aptitud del método. 6.6.4 Resultados inferiores ya sean en el ensayo de recuperación (véase el numeral 6.6.1) indicarán fallas en el procedimiento y/o concentración imprecisa de la solución volumétrica estándar de ácido clorhídrico (véase el numeral 3.7). 13

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 6.7

NTC 5025

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

6.7.1 Cálculo Se calcula el contenido de nitrógeno, expresado como porcentaje por masa, mediante la siguiente ecuación: Wn =

1,4007 ⋅ (Vs − Vb ) ⋅ M Wt

Donde: Wn =

es el contenido de nitrógeno de la muestra, expresado como porcentaje en masa;

Vs =

es el valor numérico del volumen de la solución volumétrica estándar de ácido empleada en la determinación (véase el numeral 6.4.2.3), en milímetros, expresados con aproximación a 0,05 ml;

Vb =

es el valor numérico del volumen de la solución volumétrica estándar de ácido empleado en el ensayo blanco (véase el numeral 6.5), en milímetros, expresado por lo menos con aproximación a 0,05 ml;

M=

es el valor numérico de la molaridad exacta de la solución volumétrica estándar de ácido (3.7), expresado con cuatro decimales;

Wt =

es el valor numérico de la masa de la muestra para ensayo (véase el numeral 6.6.1) en gramos, expresada con aproximación a 0,1 mg.

6.7.1.1 Expresión de resultados. Se expresa el contenido de nitrógeno con cuatro decimales. 6.7.2 Cálculo de contenido de proteína cruda El contenido de proteína cruda, expresado como porcentaje en masa, se obtiene mediante la multiplicación del contenido de nitrógeno (véase el numeral 6.7.1.1) por 6,38. 6.7.3 Expresión de resultados Se expresan los resultados del ensayo con 3 decimales. 6.8

PRECISIÓN

6.8.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron del resultado de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 57251). En la referencia [1] del anexo B (Bibliografía) se resumen los detalles del ensayo interlaboratorio del método. 6.8.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo único obtenidos con el mismo método sobre material de ensayo idéntico en el mismo laboratorio por el mismo operador empleando el 14

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025

mismo equipo dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5 % de los casos no podrá ser mayor a 0,006 %. 6.8.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo único, obtenida con el mismo método en material de ensayo idéntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no podrá ser mayor a 0,0077 %. 6.9

INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar:

-

toda la información requerida para la completa identificación de la muestra;

-

el método de muestreo empleado, si se conoce;

-

el método empleado, citando esta norma;

-

todos los detalles de operación no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s);

-

el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos;

-

los resultados finales obtenidos, si se ha verificado la repetibilidad;

-

los resultados finales obtenidos, si la recuperación ha sido verificada

7.

PARTE 3. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE NITRÓGENO NO PROTEICO

7.1

PRINCIPIO

Se precipitan las proteínas de una muestra para ensayo mediante la adición de solución de ácido tricloroacético, tal que la concentración final de dicho ácido en la mezcla sea aproximadamente del 12 %. Se remueve la proteína láctea precipitada mediante filtración; el filtrante restante contiene los componentes de nitrógeno no proteico. Se determina el contenido de nitrógeno del filtrado mediante el procedimiento descrito en la parte 1 ó 2 de la presente norma. Nota. Cuando el contenido total de nitrógeno de la muestra de leche se ha determinado previamente, el contenido real de nitrógeno proteico puede calcularse como la diferencia entre el contenido total de nitrógeno y el contenido de nitrógeno no proteico.

7.2

TOMA DE MUESTRAS

La toma de muestras no hace parte del método especificado en la presente norma. En la NTC 666: 1996 (ISO 707) se ofrece un método de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya dañado o alterado durante el transporte o almacenamiento. 15

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 7.3

NTC 5025

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

Se calienta la muestra a 38 °C ± 1 °C mediante el baño de agua (véase el numeral 4.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesar la muestra para ensayo (véase el numeral 8.4.1). 7.4

PROCEDIMIENTO

7.4.1 Muestra para ensayo Se pipetean 10,0 ml ± 0,1 ml de la muestra de ensayo preparada (véase el numeral 8.3), en un matraz cónico o Erlenmeyer previamente pesado (véase el numeral 4.16). Se vuelve a pesar el matraz y su contenido registrando los pesos con aproximación a 0,1 mg. 7.4.2 Determinación 7.4.2.1 Precipitación y filtración. Se adicionan 40 ml ± 0,5 ml de solución de ácido tricloroacético (véase el numeral 4.11) al matraz cónico. Se pesa el matraz y su contenido de nuevo con aproximación a 0,1 mg. Se mezcla con movimientos circulares y se deja el matraz verticalmente durante cerca de 5 min para permitir que el precipitado sedimente. Se filtra el contenido del matraz mediante un papel de filtro (véase el numeral 4.19). Se recoge todo el filtrado entero en un matraz cónico limpio y seco (véase el numeral 4.16). El filtrado debe ser claro y estar libre de material particulado, de lo contrario, se repite el proceso de precipitación y filtración. 7.4.2.2 Porción filtrada. Se agita con movimientos el filtrado para asegurar una buena mezcla. Se pipetean 20 ml del filtrado en un vaso de precipitados de 50 ml (véase el numeral 4.20) y se pesa. Se vierte el filtrado desde el vaso de precipitados al matraz Kjeldahl (véase el numeral 4.2) o al tubo de digestión (4.12) que contenga la cantidad apropiada de reguladores de ebullición (véase el numeral 4.4), sulfato de potasio (véase el numeral 4.1) y solución de sulfato de cobre (véase el numeral 4.2) de la manera especificada en la parte 1 (procedimiento Kjeldahl) ó Parte 2 (procedimiento de digestión de bloque) de esta norma. De inmediato se vuelve a pesar el vaso de precipitados vacío. 7.4.2.3 Digestión y destilación. Se adiciona la cantidad apropiada de ácido sulfúrico (véase el numeral 4.3) especificada en la Parte 1 ó Parte 2 al contenido del matraz Kjeldahl o tubo de digestión (véase el numeral 4.12) Se continúa con el procedimiento de digestión y destilación mediante el procedimiento descrito en la Parte 1 ó Parte 2 de esta norma. 7.4.2.4 Digestión y titulación. Se emplea la solución de ácido clorhídrico 0,01 mol/l (véase el numeral 4.7) para titular el amoníaco liberado (en vez de la solución de ácido clorhídrico 0,1 ml/l de la forma como se emplea en la parte 1 ó 2 de esta norma. 7.5

ENSAYO DEL BLANCO

Se digiere, destila y titula un blanco que contenga cerca de 0,1 g de sacarosa y 16 ml ± 0,5 ml de solución de ácido tricloroacético (véase el numeral 4.11) Siempre se titulan los blancos con la misma solución que se emplea para las muestras de ensayo. Se mantiene un registro de los valores de los blancos. Si éstos cambian, se identifica la causa.

16

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 7.6

NTC 5025

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

7.6.1 Cálculo Se calcula el contenido de nitrógeno, expresado como porcentaje en masa, mediante la siguiente ecuación:

Wn =

1,4007 ⋅ (Vs − Vb ) ⋅ M1 W f x Wm / W f − 0,065 Wm

(

)

Donde: Wn =

es el contenido de nitrógeno de la muestra, expresado como porcentaje en masa;

Vs =

es el valor numérico del volumen de la solución volumétrica estándar de ácido clorhídrico empleada en la determinación (véase el numeral 7.4.2.4), en ml, expresados por lo menos con aproximación a 0,05 ml;

Vb =

es el valor numérico del volumen de la solución volumétrica estándar de ácido empleado en el ensayo blanco (véase el numeral 8.5), en ml, expresado con aproximación a 0,05 ml;

Mr =

es el valor numérico de la molaridad exacta de la solución de ácido (4.7), expresado con cuatro decimales;

Wf =

es el valor numérico de la masa del filtrado de 20 ml (véase el numeral 7.4.2.2) en g, expresado con aproximación de 0,1 mg.

Wm = es el valor numérico de la masa de la muestra para ensayo de leche (véase el numeral 7.4.1), en g, expresado con aproximación de 0,1 mg. Wt =

es el valor numérico de la masa de la muestra para ensayo de leche más 40 ml de la solución de ácido tricloroacético (véase el numeral 4.11) en g, expresada con aproximación a 0,1 mg.

Nota. El factor 0,065 en el denominador hace suponer que la leche contiene cerca del 3,5 % de grasa y 3,0 % de proteína verdadera (por tanto 0,035 + 0,030). Puede requerirse ajustar el factor para otros productos lácteos líquidos.

7.6.1.1 Expresión de resultados.Se expresa el contenido de nitrógeno con cuatro decimales. 7.6.2 Cálculo de contenido de nitrógeno no proteico El contenido de nitrógeno no proteico, expresado como porcentaje por masa, se obtiene mediante la multiplicación del contenido de nitrógeno (véase el numeral 8.6.1.1) por 6,38. 7.6.3 Expresión de resultados Se expresan los resultados de ensayo con 3 decimales.

17

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

7.7

NTC 5025

PRECISIÓN

7.7.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron de los resultados de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 57251). En las referencias [2,3] del Anexo B (Informativo) se han reportado estos resultados. 7.7.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de un ensayo único obtenidos con el mismo método sobre material de ensayo idéntico en el mismo laboratorio por el mismo operador, empleando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5 % de los casos no será inferior a 0,0025 % del contenido de nitrógeno no proteico de la muestra. 7.7.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo único, obtenida con el mismo método en material de ensayo idéntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no será mayor al 0,0052 % del contenido de nitrógeno no proteico de la muestra. 7.8

INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar:

-

toda la información requerida para la completa identificación de la muestra;

-

el método de muestreo empleado, si se conoce;

-

el método empleado, citando esta norma;

-

todos los detalles de operación no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s);

-

el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos;

-

si se ha verificado la repetibilidad los resultados finales obtenidos;

8.

PARTE 4: DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE NITRÓGENO PROTEICO

8.1

PRINCIPIO

Precipitación de proteínas de una muestra para ensayo mediante la adición de solución de ácido tricloroacético tal que la concentración final de éste en la mezcla sea de aproximadamente el 12 %. Separación del precipitado de proteína mediante filtración (el filtrado contendrá los componentes de nitrógeno no proteico). Determinación del contenido de nitrógeno del precipitado mediante el procedimiento descrito en la parte 1 ó 2 de la presente norma. 18

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 8.2

NTC 5025

MUESTREO

El muestreo no hace parte del método especificado en la presente norma. En la NTC 606 (ISO 707) se ofrece un método de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado durante el transporte o almacenamiento. 8.3

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Se calienta la muestra a 38 °C ± 1 °C mediante el baño de agua (véase el numeral 6.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesar la porción de ensayo (véase el numeral 8.1). 8.4

PROCEDIMIENTO

8.4.1 Muestra para ensayo Se pesan 5 ml ± 0,1 ml, con aproximación a 0,1 mg, de la muestra de ensayo preparada (véase el numeral 8.3), en un matraz Kjeldahl (véase el numeral 4.2) o en un tubo de digestión (véase el numeral 4.12). Inmediatamente se adicionan 5 ml ± 0,1 ml de agua al matraz Kjeldahl (véase el numeral 4.2) o en el tubo de digestión (véase el numeral 4.12), enjuagando cualquier cantidad de leche que haya en el cuello del matraz o en el tubo hasta el fondo del mismo. 8.4.2 Determinación 8.4.2.1 Precipitación y filtración. Se adicionan 40 ml ± 0,5 ml de solución de ácido tricloroacético (véase el numeral 4.11) al matraz o al tubo y se agita con movimientos circulares hasta mezclar bien el contenido. Se deja el matraz o tubo verticalmente durante aproximadamente 5 min para permitir que el precipitado se sedimente. Se pasa la mezcla del matraz Kjeldahl o del tubo de digestión por el papel de filtro (véase el numeral 4.19) y se recoge el filtrado. Una parte del precipitado permanecerá en el matraz Kjeldahl o en el tubo de digestión y otra parte se recoge en el papel de filtro. No es necesario retirar todo el precipitado del matraz o tubo. Inmediatamente después de filtrar la mezcla y de manera que no se seque ningún precipitado en el cuello del matraz Kjeldahl o del tubo de digestión, se adicionan mediante una pipeta automática (véase el numeral 4.22), 10 ml de la solución de ácido tricloroacético (véase el numeral 4.11). Se usa también la solución de ácido tricloroacético para enjuagar cualquier precipitado que se encuentre en el cuello del matraz o del tubo y se pasa todo al papel de filtro. Se revuelve hasta mezclar el contenido. Se agita la mezcla del matraz o del tubo por medio del mismo papel de filtro, recogiendo el filtrado sobre el recolectado previamente. Inmediatamente se enjuaga de nuevo el cuello del matraz o el tubo con una cantidad adicional de 10 ml de solución de ácido tricloroacético (véase el numeral 4.11). Se revuelve hasta mezclar el contenido y nuevamente se vierte la mezcla del matraz o del tubo por medio del mismo papel de filtro, adicionando el filtrado al recogido previamente. El filtrado debe ser claro y encontrarse libre de materia particulada. Nota. En este punto, ya no se requiere más del filtrado y se puede desechar de manera apropiada.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025

8.4.2.2 Precipitado. Con cuidado y usando guantes se retira el papel de filtro del embudo y se dobla el papel a fin de encerrar el precipitado. Si queda algún precipitado (véase el numeral 8.4.2.1) ya sea en el borde interno o externo del matraz Kjeldahl o del tubo de digestión, se frota con el papel de filtro doblado de modo que no se adhiera el precipitado al papel y luego se deja caer el papel de filtro dentro del matraz Kjeldahl o el tubo de digestión. 8.4.2.3 Digestión y destilación. Se adiciona la cantidad apropiada de reguladores de ebullición (véase el numeral 4.4), sulfato de potasio (véase el numeral 4.1), solución de sulfato de cobre II (véase el numeral 4.2) y ácido sulfúrico (véase el numeral 4.3) como se especifica en la parte 1 (procedimiento Kjeldahl) ó en la parte 2 (procedimiento de digestión de bloque) de la presente norma. Se determina el contenido de nitrógeno del precipitado y del papel de filtro ya sea mediante el procedimiento descrito en la parte 1 ó parte 2 de esta norma. 8.5

ENSAYO DEL BLANCO

Se realiza un ensayo para un blanco. Se cambia la muestra para ensayo por un papel de filtro (véase el numeral 4.19) lavado con solución de ácido tricloroacético (véase el numeral 4.11). Se mantiene un registro de los valores blancos. Si éstos cambian, se identifica la causa. 8.6

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

8.6.1 Cálculo Se calcula el contenido de nitrógeno proteico, expresado como porcentaje en masa, mediante la siguiente ecuación:

W pn =

1,4007 ⋅ (Vs − Vb ) ⋅ M Wt

Donde: Wpn = es el contenido de nitrógeno proteico de la muestra, expresado como porcentaje por masa; Vs =

es el valor numérico del volumen de la solución volumétrica estándar de ácido empleada en la determinación, en mililitros, expresados por lo menos con aproximación a 0,05 ml;

Vb =

es el valor numérico del volumen de la solución volumétrica estándar de ácido empleado en el ensayo blanco, en mililitros, expresado con aproximación a 0,05 ml;

M=

es el valor numérico de la molaridad exacta de la solución volumétrica estándar de ácido, expresado con cuatro decimales;

Wt =

es el valor numérico de la masa de la porción de ensayo, en gramos, expresada con aproximación a 0,1 mg.

8.6.1.1 Expresión de resultados. Se expresa el contenido de nitrógeno con cuatro decimales.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5025

8.6.2 Cálculo del “equivalente de proteína” El contenido de nitrógeno proteico, expresado como “equivalente de proteína”, se obtiene mediante la multiplicación del contenido de nitrógeno proteico (véase el numeral 8.6.1.1) por 6,38. Esto corresponde al contenido proteico verdadero de la leche. 8.6.3 Expresión de resultados Se expresan los resultados de ensayo con 3 decimales. 8.7

PRECISIÓN

8.7.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron de los resultados de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 5725. En la referencia [2,3] se han reportado estos resultados. 8.7.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de un ensayo único obtenidos con el mismo método sobre material de ensayo idéntico en el mismo laboratorio, por el mismo operador, empleando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5 % de los casos no será mayor de 0,0038 %. 8.7.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo único, obtenida mediante el mismo método en material de ensayo idéntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no debe ser mayor al 0,0092 %. 8.8

INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar:

-

toda la información requerida para la completa identificación de la muestra;

-

el método de muestreo empleado, si se conoce;

-

el método empleado, citando esta norma;

-

todos los detalles de operación no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s);

-

el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos;

-

si se ha verificado la repetibilidad los resultados finales obtenidos;

21

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 9.

NTC 5025

NORMAS QUE DEBEN CONSULTARSE

Las siguientes normas contienen disposiciones que, a través de la referencia en este texto, constituyen disposiciones de la presente norma. Dichas publicaciones no se aplican para referencias fechadas, subsecuentes enmiendas o actualizaciones. No obstante, se invita a las partes que lleguen a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre la posibilidad de aplicar las ediciones más recientes de las normas indicadas a continuación. Para referencias no fechadas, se aplica la última edición de la norma referenciada. NTC 2175: 1986, (Reaprobada 1999) Material de vidrio para laboratorio. Buretas. Requisitos generales. (ISO 385-1:1984, Laboratory glassware – Burettes – Part 1: General requirements) NTC 666: 1996, Leche y productos lácteos. Guía para muestreo. (ISO 707:1997, Milk and milk products – Guidance on sampling) NTC 3529-1: 1999, Precisión de los métodos de medición y de los resultados. Principios generales y definiciones. (ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 1: General principles and definitions). NTC 3529-2: 1999, Exactitud (veracidad y precisión) de métodos de medición y resultados. Parte 2. Método básico para la determinación de repetibilidad y reproducibilidad en un método normalizado de medición. (ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2: A basic method for the determination of repeatability and reproductibility of a standard measurement method). 10.

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 1: Kjeldahl Method. Switzerland, ISO, 1998. 9 p. (ISO/DIS 8968-1). INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 2: Block Digestion Method (Macro Method). Switzerland, ISO, 1998. 7 p. (ISO/DIS 8968-2). INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 4: Determination of Non-Protein Nitrogen Content. Switzerland, ISO, 1998. 6 p. (ISO/DIS 8968-4). INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 5: Determination of Protein Nitrogen Content Switzerland, ISO, 1998. 6 p. (ISO/DIS 8968-5).

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Anexo A (informativo)

Procedimiento modificado para el análisis de otros productos lácteos cuando no existe una norma separada para dicho producto

A.0

INTRODUCCIÓN

El procedimiento descrito en la parte 1 de la presente norma se ha optimizado y su desempeño se ha evaluado para el análisis de leche de bovino. Es probable que el analista desee emplear el mismo procedimiento, con una leve modificación, para la determinación del contenido de nitrógeno de una serie de productos lácteos. Cuando no existe una norma separada para dichos productos, se debe observar, sin embargo, que el procedimiento y su desempeño no se han validado para los usos indicados. A.1

PROCEDIMIENTO

Se pesa, con aproximación a 0,1 mg, la masa requerida de muestra para ensayo, tomado de una muestra para ensayo preparada en forma adecuada, como se describe a continuación. Se procede con la determinación del contenido de nitrógeno empleando el método descrito en los numerales del 6.1 al 6.4. Las cantidades de ácido sulfúrico (véase el numeral 3.3) y la solución de hidróxido de sodio (véase el numeral 3.4) empleadas en los procesos de digestión y destilación no deben cambiar. Al cambiar la proporción de ácido con respecto a otros componentes mediante el incremento de la cantidad de ácido disminuye el punto de ebullición inicial de la mezcla en la digestión, lo cual no es recomendable. Se aconseja emplear un tamaño de muestra adecuado con respecto al material de ensayo, con los reactivos de la manera como se especifica en la Parte 1 o en la Parte 2. El tamaño de la muestra adecuado para cualquier material puede calcularse de la siguiente manera: La cantidad óptima de proteína por matraz se encuentra entre 0,15 g y 0,30 g para cualquier muestra. Por tanto, si una muestra de queso Cheddar promedio contiene 24,00 % de proteína, entonces la cantidad de muestra de queso Cheddar debería estar entre 0,625 g y 1,25 g. La decisión de emplear pesos de muestra que se promedien en el extremo inferior o superior de la serie depende de cuanto ácido consumirá el remanente de componentes de la muestra (es decir, grasa y carbohidrato) durante la digestión. En el método descrito en la parte 1, el analista comienza con 25 ml (aprox. 46 g) de ácido sulfúrico. Al finalizar la digestión se deben dejar cerca de 15 g de ácido sulfúrico en el matraz Kjeldahl para retener todo el nitrógeno. La crema con contenido graso del 40 % es un ejemplo de producto difícil. En este caso el contenido de proteína o nitrógeno de la muestra es bajo y el contenido de grasa es alto. Se asume que una muestra de crema promedio contiene cerca del 40 % de grasa, 1,9 % de proteína y 2,9 % de lactosa. Para lograr 0,15 g de proteína en el matraz, sería necesario emplear una muestra de crema de 7,89 g. Esta muestra contendría 3,16 g de grasa y la grasa sola consumiría 56,8 g (aproximadamente, 30,9 ml) de ácido sulfúrico en la digestión. En estos casos debe reducirse la cantidad de muestra para permitir que una cantidad adecuada de ácido sulfúrico permanezca al finalizar la digestión. En el caso del material de muestra como la crema, también sería mejor emplear un titulante que cuente con una concentración inferior (por ejemplo 0,01 mol/l). La cantidad de sacarosa requerida para un blanco o para normas de recuperación para productos diferentes a la leche de bovino puede determinarse de la siguiente manera: 23

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Primero se requiere un cálculo del contenido aproximado de grasa, proteína y carbohidratos para el tipo de material de muestra y el tamaño de muestra aproximado por emplearse en la digestión. En segundo lugar, durante la digestión, 1 g de grasa consumirá cerca de 18 g de ácido sulfúrico, 1 g de proteína consumirá cerca de 9 g de ácido sulfúrico y 1 g de carbohidrato consumirá cerca de 7 g de ácido sulfúrico. Con base en esta información se puede calcular la cantidad de ácido consumido por una muestra y la cantidad de sacarosa requerida para consumir la misma cantidad de ácido durante la digestión. Esta cantidad de sacarosa debería emplearse para el blanco y la norma de recuperación de sulfato de amonio. Para la norma de recuperación de nitrógeno aminoácido (véase el numeral 6.6), se reduce la cantidad de sacarosa mediante la cantidad de ácido que va a consumir (calculada como proteína) el clorhidrato de lisina o triptófano. Se asume que la recuperación de nitrógeno en la digestión del aparato empleado es la misma para productos diferentes a la leche, sin realizar experimentos de recuperación con el fin de producir condiciones que logren niveles similares de ácido sulfúrico residual al finalizar la digestión. Para los productos deshidratados, o en polvo se pesan 2 g con precisión de 0,1 mg, en el material volumétrico de 50 ml, y se disuelven directa en el material volumétrico de 50 ml, con 20 ml de agua a 40 °C, se agita la mezcla bien y se deja enfriar a 20 °C. Luego se aplica el procedimiento para la determinación de nitrógeno.

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Anexo B (Informativo) Bibliografía

1.

BARBANO, D.M., Clark J.L., Dunhais, C.E., Fleming, J.R. (1990) J. Assoc., Off. Anal. Chemistry 73, 849-859

2.

SERTL, D. and MALONE, W.J.A.O.A.C. Int. 76: 711-719 (1993)

3.

AOAC, Official Methods of Analysis (1990) 15th ed., 4th Supplement (1993), Method Nr. 992.22

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Anexo C (Informativo)

Otras normas internacionales sobre el mismo tema Nota. Las normas citadas a continuación se relacionan únicamente para información; se invita a consultar las respectivas ediciones vigentes.

Organismo internacional ISO

ISO

Número norma

Tema

ISO 5542:1984 Leche. Determinación del Confirmada 2000 contenido de proteína. Método del colorante negroamido (Método de rutina) ISO 9622:1999 Leche entera. Determinación del contenido de grasa láctea, proteína y lactosa. Guía sobre la operación de instrumentos en medio infrarrojo. IDF Standard 20 Leche Determinación del B:1993 contenido de nitrógeno. Parte 1: Método kjeldahl Parte 2: Método de digestión de bloques (método marco) Parte 3: Método de digestión de bloques (método de rutina semi-micro-rápido. Parte 4: Determinación del contenido de nitrógeno no proteico. Parte 5: Determinación del contenido de nitrógeno – proteico.

Principio

Parte 1. Titulación – kjeldahl Parte 2. Digestión en bloque – titulación kjeldahl Parte 3. Digestión en bloque (método rápido), titulación kjeldahl Parte 4. titulación kjeldahl, después de la eliminación de las proteínas. Parte 5. titulación kjeldahl sobre precipitado de proteína. INTERNATIONAL IDF Standard 98 Leche. Determinación del Método del DIARY A:1985 contenido de proteína. colorante negro FEDERATION, Método del colorante negro amido IDF amido (método de rutina) Oficial Methods of AOAC Official Nitrógeno total en crema Titulación – Analysis of AOAC, Method 920.109 kjeldahl 17 TH Edition, 2000. Oficial Methods of AOAC Official Nitrógeno en leche (Total). Titulación kjeldahl. Analysis of AOAC, Method 991.20 Método Kjeldahl 17 TH Edition, 2000. Oficial Methods of AOAC Official Nitrógeno no proteico en Titulación kjeldahl, leche entera después de la Analysis of AOAC, Method 991.21 17 TH Edition, eliminación de las 2000. proteínas. INTERNATIONAL DIARY FEDERATION, IDF

Norma ISO relacionada -----

----

ISO/DIS 8968-1 ISO/DIS 8968-2 ISO/DIS 8968-3 ISO/DIS 8968-4 ISO/DIS 8968-5

ISO 5542:1984

991.20

ISO/DIS 8968-1

ISO/DIS 8968-4

Continúa...

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NTC 5025 (Final)

Organismo internacional Oficial Methods of Analysis of AOAC

Número norma

Tema

AOAC Official Contenido de nitrógeno Method 991.22 proteico en leche

Oficial Methods of Analysis of AOAC

AOAC Official Contenido de nitrógeno Method 991.23 proteico en leche

Oficial Methods of AOAC Official Protein in milk. Dye binding Analysis of AOAC, Method 967.12 Method I 17 TH Edition, 2000.

Oficial Methods of Analysis of AOAC, 17 TH Edition, 2000. Oficial Methods of Analysis of AOAC, 17 TH Edition, 2000.

AOAC Official Protein in milk. Dye binding Method 975.17 Method II

AOAC Official Mid-Infrared Method 975.18 Method

Spectroscopic

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Principio

Norma ISO relacionada Titulación kjeldahl ISO/DIS 8968-5 sobre precipitado de proteína Diferencia entre la determinación de nitrógeno total y nitrógeno no proteico. Método del colorante negro amido con espectrofotometría o colorímetro fotoeléctrico. 5542:1984 Espectrofotometría ISO o colorímetro (2000) IDF Standard 98 fotoeléctrico A:1985 ISO 9622:1999