NTC 4574
May 2, 2017 | Author: jlurrego | Category: N/A
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 2007-03-21
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN DE SALMONELLA SPP
E:
MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. GENERAL GUIDANCE ON METHODS FOR THE DETECTION OF SALMONELLA SPP
CORRESPONDENCIA:
esta norma es una adopción modificada (MOD) de la norma ISO 6579:2002
DESCRIPTORES:
método horizontal, método de análisis, microbiología, análisis microbiológico, detección, Salmonella, alimentación animal.
I.C.S.: 07.100.30 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproducción
Primera actualización Editada 2007-03-28
PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 4574 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-03-21. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología. ACEGRASAS S.A. ALGARRA S.A. ALIMENTOS POLAR S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS. S.A. ARCHIVO DE BOGOTÁ ASEBIOL LABORATORIO LTDA. ASINAL LTDA ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA ASOCIACIÓN DE MICROBIÓLOGOS JAVERIANOS BIANÁLISIS BIOCONTROL LTDA. BIOMERIEUX COLOMBIA BIOQUILAB LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CARULLA VIVERO S.A. CERCAL LTDA. COLFRIGOS S.A. COLOMBINA S.A. COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. CORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPÍA – MICROS– COSMÉTICA CCYTEC. CREPES & WAFLES S.A. DU PONT QUALICON
ENZIPAN DE COLOMBIA LTDA FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A. INDEPENDIENTE. INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES RENOVABLES IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. JOHNSON DIVERSEY KOYOMAD S.A. LABCONTROL E.U. LABFARVE LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA VEGETAL LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR LABORATORIO EMICAL LTDA. LABORATORIO GRAM LABORATORIO MICROLAB LTDA. LARKIN LESNIAK E.U MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MERCK S.A. MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS LTDA. NULAB LTDA. QUIK LTDA. QUÍMICOS Y REACTIVOS LTDA. QUIMIREL
SUIZO S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. V AQUALAB ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGÍA AVESCO S.A. BAVARIA S.A. BIOTRENDS LABORATORIOS CENICAÑA CENTROAGUAS S.A. E.S.P. CERVECERÍA LEONA S.A. CONGELAGRO CONSULTORÍAS MICROBIOLÓGICAS COOPERATIVA DE GANADEROS DE CARTAGENA LTDA. EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ FRIGORÍFICO GUADALUPE S.A. HOSPITAL DEPARTAMENTAL DE VILLAVICENCIO INGENIO PICHICHI S.A. INGENIO RIOPAILA INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO –ICA– INSTITUTO NACIONAL DE SALUD –INVIMA– INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA MÉDICA
LABORATORIO MICROBIOLÓGICO SIS LABORATOTORIO MICROBIOLÓGICO DE BARRANQUILLA LEVAPÁN S.A. LLOREDA GRASAS S.A. MEDIIMPLANTES LTDA. MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. PASIFLORA COLOMBIANA S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PRODUCTORA DE CONCENTRADOS Y JUGOS DE FRUTA PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS LTDA. QUIOS LTDA. REPRESENTACIONES BIOTECNOLÓGICAS LTDA. –RICA RONDO–, INDUSTRIA NACIONAL DE ALIMENTOS S.A. SCHERING COLOMBIANA S.A. TECNIMICRO LABORATORIO DE ANÁLISIS UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD PÚBLICA UNIVERSIDAD CATÓLICA INGECAL VIKINGOS S.A.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
CONTENIDO Página 1.
OBJETO .......................................................................................................................1
2.
REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1
3.
DEFINICIÓN .................................................................................................................2
4.
PRINCIPIO....................................................................................................................2
4.1
GENERALIDADES.......................................................................................................2
4.2
PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO NO SELECTIVO ..............................2
4.3
ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO ..............................................
4.4
SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO .............................................................................2
4.5
CONFIRMACIÓN..........................................................................................................3
5.
MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS ..............................................3
5.1
GENERALIDADES.......................................................................................................3
5.2
MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS .....................................................................3
5.3
SUEROS .......................................................................................................................5
6.
EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO ...................................5
6.1
EQUIPO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN HÚMEDO (AUTOCLAVE) ......................................................................................5
6.2
INCUBADORA .............................................................................................................5
6.3
MEDIDOR DE pH .........................................................................................................5
6.4
FRASCOS PARA CULTIVO ........................................................................................5
6.5
TUBOS PARA CULTIVO..............................................................................................5
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
Página 6.6
PIPETAS GRADUADAS ..............................................................................................5
6.7
CAJAS DE PETRI ........................................................................................................6
6.8
BAÑO DE AGUA..........................................................................................................6
7.
MUESTREO..................................................................................................................6
8.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO .................................................6
9.
PROCEDIMIENTO........................................................................................................6
9.1
MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES .....................................6
9.2
PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO.................................................................7
9.3
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO...............................................................................7
9.4
SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO .............................................................................7
9.5
CONFIRMACIÓN..........................................................................................................8
10.
EXPRESIÓN DE RESULTADOS ...............................................................................13
11.
INFORME DE ENSAYO .............................................................................................13
12.
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD .......................................................................13
ANEXOS ANEXO A (Normativo) DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO.......................................................................................14 ANEXO B (Normativo) COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS..................15 ANEXO C (Informativo) COMPARACIÓN ENTRE EL MÉTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA AOAC VERSIÓN 2005....24
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NTC 4574 (Primera actualización)
Página ANEXO D (Informativo) RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS ..................................................25 ANEXO E (informativo) CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS A LA NTC 4574 (primera actualización) Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA LA ISO 6579 ................................................................................................................................27 TABLAS Tabla 1. Interpretación de las pruebas bioquímicas .........................................................11 Tabla 2. Interpretación de las pruebas de confirmación ..................................................12 Tabla C.1. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de cuajada de queso fresco...........................................................................................................25 Tabla C.2. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de huevo deshidratado en polvo.........................................................................................26 Tabla C.3. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de carne cruda de pollo .......................................................................................................26 Tabla C.4. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con materiales de referencia .........................................................................................................................26
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NTC 4574 (Primera actualización)
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN DE SALMONELLA SPP.
ADVERTENCIA Para proteger la salud del personal de laboratorio, es esencial que los ensayos de laboratorio para detectar Salmonella spp. sean únicamente ejecutados en laboratorios apropiadamente equipados, bajo la supervisión de un microbiólogo, un microbiólogo experimentado, o ambos, y que se tenga un gran cuidado en la disposición de todos los materiales incubados.
1.
OBJETO
Esta norma describe los métodos horizontales para la detección de Salmonella spp. Sujeta a las limitaciones indicadas al comienzo de esta norma, se aplica a productos para consumo humano y para alimentación animal, las muestras ambientales en el área de la producción y manipulación de alimentos. La temperatura de incubación (35 ºC ± 2 °C) se acordará entre las partes involucradas y se debe especificar en el reporte del ensayo. 2.
REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado. (incluida cualquier corrección). NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para los análisis microbiológicos. (ISO 7218). NTC 4491-1, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 1. Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales. (ISO 6887). NTC 5395, Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de análisis. GTC 78, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. guía para la preparación y producción de medios de cultivo. Guía general para el aseguramiento de la calidad para la preparación de los medios de cultivo en el laboratorio. 1 de 33
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NTC 4574 (Primera actualización)
DEFINICIÓN
Para los propósitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones. 3.1 Salmonella spp. Bacteria gram negativa que forma colonias típicas sobre un medio selectivo, el cual exhibe características bioquímicas y serológicas descritas en la presente norma. 3.2 Detección de Salmonella spp. Determinación de la presencia o ausencia de Salmonella spp., en una muestra particular de producto, cuando los ensayos son realizados de acuerdo con la presente norma. 4.
PRINCIPIO
4.1
GENERALIDADES
Para la detección de Salmonella spp. se necesitan cuatro etapas sucesivas (véase también el Anexo A). NOTA Salmonella spp. puede estar presente en bajas concentraciones y está frecuentemente acompañada por otros microorganismos. Por tanto, es necesario un preenriquecimiento no selectivo y posteriormente realizar un enriquecimiento selectivo. NOTA La determinación de Salmonella puede realizarse también por los siguientes métodos: siembra en membranas hidrofóbicas, PCR, inmunofluorescencia (VIDAS) o cualquier otro método búsqueda.
4.2
PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO NO SELECTIVO
Se inocula en solución buferada, agua peptonada tamponada o caldo lactosado con la muestra para ensayo, y se incuba a 37 °C ± 1 °C por 18 h +/2 h. Para ciertos productos alimenticios es necesario emplear otros procedimientos de preenriquecimiento. Véase el numeral 9.1.2. 4.3
ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO
Se inocula 0,1 ml del medio de preenriquecimiento (véase numeral 4.2) en 10 ml del medio Rappaport Vassiliadis/medio verde malaquita (medio RVS) (o medio selenito según AOAC 967.25 p. 109) y 1,0 ml del medio de preenriquecimiento (véase el numeral 4.2) en el medio Tetrationate Mueller Kauffmann (medio MKTTn). El caldo RVS se incuba a 41,5 °C ± 1,0 °C durante 24 h ± 3 h y el caldo MKTTn se incuba a 37 °C ±1 °C durante 24 h ± 3 h. 4.4
SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO
A partir de los caldos de enriquecimiento líquido obtenidos en el numeral 4.3, se inoculan como mínimo dos medios selectivos sólidos: -
Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD),
y cualquier otro medio selectivo complementario al XLD y que sea especialmente adecuado para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positivas y Salmonella typhi y paratyphi; el medio se deja a la elección del laboratorio: 2
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NTC 4574 (Primera actualización)
EJEMPLO -
agar Rambach
-
gar Hektoen
-
agar McConkey
-
agar bismuto sulfito
-
agar Salmonella -Shigella(SS)
-
agar verde brillante
-
agares cromogénicos selectivos o diferenciales para Salmonella
El agar XLD se incuba a 37 °C ± 1 °C y se examina después de 24 h ± 3 h. El segundo agar selectivo se incuba a 37 °C ± 1 °C, y se examina después de 24 h ± 3 h o según las indicaciones del fabricante del medio de cultivo, si es necesario, después de 48 h para verificar la presencia de colonias las cuales, a partir de sus características, se consideran presuntivas de ser Salmonella spp. 4.5
CONFIRMACIÓN
Se subcultivan las colonias de Salmonella spp. presuntivas aisladas como se describe en el numeral 4.4, y se confirman mediante ensayos bioquímicos y serológicos apropiados. 5.
MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS
5.1
GENERALIDADES
Para la práctica actual de laboratorio véase la NTC 4092 (ISO 7218). NOTA
5.2
Se pueden emplear reactivos listos para usar, preparados comercialmente.
MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS
NOTA Debido al gran número de medios de cultivo y de reactivos, se considera preferible, para la claridad del texto, dar su composición y preparación en el Anexo B.
5.2.1
Medio de preenriquecimiento no selectivo: Solución buffer, agua peptonada tamponada o caldo lactosado
Véase el numeral B.1. 5.2.2
Primer medio de enriquecimiento selectivo: Rappaport. Vassiliadis/medio verde malaquita (medio RVS)
Véase el numeral B.2. 5.2.3
Segundo medio de enriquecimiento selectivo Tetrationate Mueller Kauffmann (medio MKTTn).
Véase el numeral B.3.
3
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 5.2.4
NTC 4574 (Primera actualización)
Medios sólidos selectivos en placa para aislamiento
5.2.4.1 Primer medio Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (agar XLD). Véase el Anexo B.4. 5.2.4.2 Segundo medio La elección del segundo medio se deja a criterio del laboratorio de análisis. Es conveniente seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a su preparación. -
agar Rambach
-
agar Hektoen
-
agar McConkey
-
agar bismuto sulfito
-
agar Salmonella –Shigella (SS)
-
agar verde brillante
-
agares cromogénicos selectivos o diferenciales para Salmonella.
Véase el literal B.5. 5.2.5
Agar Nutritivo
Véase el literal B.6 5.2.6
Tres azúcares / Agar hierro (Agar TSI)
Véase el literal B.7. 5.2.7
Caldo Urea (Christensen)
Véase el literal B.8. 5.2.8
Medio de la descarboxilación de L-Lisina (LIA)
Véase el literal B.9. 5.2.9
Reactivo para la reacción Voges- Proskauer (VP)
Véase el literal B.10. 5.2.10 Reactivos para la reacción de Indol Véase el literal B.11. 5.2.11 Agar nutritivo semisólido (movilidad). Véase el literal B.12. 4
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NTC 4574 (Primera actualización)
5.2.12 Disolución salina fisiológica Véase el literal B.13. 5.2.13 Caldo selenito cistina Véase el literal B.14. 5.3
SUEROS
Se encuentran disponibles comercialmente varios tipos de sueros que contienen anticuerpos frente a uno o varios antígenos O; es decir, antisueros que contienen uno o más grupos “O” (denominados sueros anti O monovalentes o polivalentes), suero anti Vi, y antisueros que contienen anticuerpos frente a uno o varios factores H (denominados sueros anti H monovalentes o polivalentes). Conviene hacer todos los esfuerzos para asegurarse que los antisueros empleados son adecuados para la detección de todos los serotipos de Salmonella. Con este objetivo se pueden emplear sólo antisueros preparados por un suministrador competente reconocido (por ejemplo, por un organismo de vigilancia gubernamental). 6.
EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO
NOTA Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable.
Equipo usual de laboratorio microbiológico (véase la NTC 4092) y, en particular, lo siguiente. 6.1
EQUIPO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN HÚMEDO (AUTOCLAVE)
Véase la NTC 4092 (ISO 7218). 6.2
INCUBADORA
Con capacidad de funcionar a 41,5 oC ± 1 oC y capaz de operar entre 37 °C ± 1 °C. 6.3
MEDIDOR DE pH
Con precisión de calibración de ± 0,1 unidades de pH a 25 ºC. 6.4
FRASCOS PARA CULTIVO
NOTA
Pueden usarse frascos para cultivo con tapa rosca metálica o plástica no tóxica.
6.5
TUBOS PARA CULTIVO
De 15 mm de diámetro y de 160 mm de longitud. 6.6
PIPETAS GRADUADAS O PIPETAS AUTOMÁTICAS
De capacidades nominales de 10 ml y de 1 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,5 ml y 0,1 ml respectivamente. 5
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 6.7
NTC 4574 (Primera actualización)
CAJAS DE PETRI
De tamaño pequeño (de 90 mm a 100 mm de diámetro) o de tamaño grande (de 140 mm de diámetro). NOTA
se pueden utilizar cajas de vidrio o de material desechable.
6.8
BAÑO DE AGUA
En caso de incubar en baño de agua, mantenerlo a una temperatura entre 41,5 °C ± 1,0 °C ó a 37 °C ± 1 °C. NOTA Se recomienda emplear un baño que contenga un agente antibacteriano debido a la baja dosis infectiva de Salmonella.
7.
MUESTREO
Es importante que el laboratorio reciba una muestra representativa y adecuada para su correspondiente análisis y que no haya sufrido daños o cambios durante el transporte o el almacenamiento. El muestreo no hace parte del método especificado en esta norma. Debe verse la norma específica para el producto que interese. Si no hay norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto. 8.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO
La muestra para ensayo se prepara de acuerdo con la norma específica del producto que interese. Si no hay norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto. 9.
PROCEDIMIENTO
(Véase el diagrama del Anexo A (Normativo)). 9.1
MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES
9.1.1 Véase la NTC 4491-1 (ISO 6887-1) y la norma específica que trate del producto en particular. Véase la norma ISO 8261 para leches y productos lácteos. Para la preparación de la suspensión inicial, se usa como diluyente el medio de preenriquecimiento especificado en el numeral 5.2.1 y el numeral 4.2 (agua peptonada tamponada). En general se prepara la suspensión inicial adicionando una muestra para ensayo de 25 g a 225 ml de medio de preenriquecimiento (véase el numeral 5.2.1), el cual está en proporción de la muestra para ensayo al medio de preenriquecimiento especificado en este método. Si la muestra para ensayo prescrita es diferente de 25 g, se usa la cantidad necesaria al medio de preenriquecimiento para producir aproximadamente una dilución 1/10 (masa a volumen).
6
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
NOTA Para reducir la carga de trabajo cuando más de 25 g de la muestra para ensayo de un lote específico de alimentos ha sido analizado y cuando hay evidencia disponible de que su mezcla (juntando las porciones de muestras para ensayo) no afecta el resultado del producto en particular, las muestras para ensayo pueden ser compuestas. Por ejemplo, si 10 porciones de ensayo de 25 g se van a analizar, se combinan las 10 unidades para formar una muestra para ensayo compuesta de 250 g y se adicionan 2,25 L de caldo de preenriquecimiento. Alternativamente, se pueden combinar porciones de caldos de preenriquecimiento de 0.1 ml ( en 10 ml de medio RVS) y 1 ml ( en 10 ml de medio tetrationate Mueller Kauffmann) de los caldos de preenriquecimiento provenientes de 10 porciones de muestras para ensayo separadas (véase el numeral 9.3.1) para enriquecerlas en 100 ml de los medios de enriquecimiento selectivos.
9.1.2
Preparaciones específicas de la suspensión inicial para ciertos productos alimenticios
NOTA Para preparaciones específicas de la suspensión inicial para ciertos productos alimenticios aplicables a la determinación de Salmonella o cualquier microorganismo se describen en las NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3 y NTC 4491-4 e ISO 8261. Si algún producto no está referenciado en estas normas o no existe una norma específica de producto, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
9.1.2.1 Cacao y productos que contienen cacao (por ejemplo más del 20 %) Se añaden, al agua peptonada tamponada (véase el numeral 5.2.1), preferiblemente 50 g/l de caseína (evitar el empleo de caseína ácida), o 100 g/l de leche desnatada en polvo estéril y se añaden después de unas 2 h de incubación, 0,018 g/l de verde brillante si es probable que el producto alimenticio esté muy contaminado con flora Gram positiva. 9.1.2.2 Productos alimenticios ácidos y acidificantes Se ha de asegurar que el pH no baja de 4,5 durante el preenriquecimiento. NOTA El pH de los productos alimenticios ácidos y acidificantes es más estable si se emplea agua peptonada tamponada a doble concentración.
9.2
PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO
Se incuba la suspensión inicial a 37 °C ± 1 oC durante 18 h ± 2 h. 9.3
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml del medio RVS (véase el numeral 5.2.2); se transfieren 1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2 a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate Mueller Kauffmann (véase el numeral 5.2.3). NOTA En el caso de utilizar el medio de cultivo selenito como medio de enriquecimiento, se transfieren 1.0 ml del cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml de caldo selenito (véase numeral 5.2.2). Se incuba a 35 ± 1 °C durante 24 h ± 2 h.
9.3.2 Se incuban los dos medios inoculados (véase el numeral 9.3.1) durante 24 h ± 3 h como sigue: Se incuba el caldo RVS sembrado (véase el numeral 9.3.1) a 41,5 °C ± 1 °C y el caldo tetrationate Mueller Kauffmann sembrado a 37 °C ± 1 °C. Hay que tener cuidado de que no se supere la máxima temperatura de incubación permitida (42,5 °C). 9.4
SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO
9.4.1 Tras incubar durante 24 h ± 3 h, utilizando el cultivo obtenido en el caldo RVS (9.3.2), se siembra mediante un asa la superficie de una placa de Petri que contenga el primer medio en placa selectivo (agar XLD), de tal forma que se obtengan colonias aisladas. 7
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
Se procede de la misma manera con el segundo medio selectivo (véase el numeral 5.2.4.2) empleando un asa estéril y cajas de Petri. 9.4.2 Tras incubar durante 24 h ± 3 h, utilizando el cultivo obtenido en caldo tetrationate Mueller Kauffmann (véase el numeral 9.3.2), se repite el procedimiento descrito en el numeral 9.4.1 con los dos medios selectivos en placa. 9.4.3 Se invierten las placas (véanse los numerales 9.4.1 y 9.4.2) dándoles la vuelta y se colocan en la incubadora a 35 °C ± 2 oC para el primer medio. Para el segundo medio en placa (véase el numeral 5.2.4.2), deben seguirse las instrucciones del fabricante. 9.4.4 Después del período de incubación durante 24 h ± 3 h, se examinan las cajas (véase el numeral 9.4.3) para la presencia de colonias típicas de Salmonella y de colonias atípicas que pueden ser Salmonella (véase la Nota 7). Se marca su posición en la parte inferior de la placa. Las colonias típicas de Salmonella que crecen en el agar XLD tienen un centro negro y una zona ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio del indicador. NOTA Las variantes de Salmonella H2S negativas (por ejemplo S. paratyphi A) que crece en agar XLD son rosas con un centro rosa más oscuro. Las Salmonella lactosa positivas que crecen en agar XLD son amarillas con o sin ennegrecimiento. Cualquier colonia sospechosa debe estar sujeta a confirmación (véase el numeral 9.5); el reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte obra de la experiencia, y su apariencia puede variar algo. No sólo de especie a especie, sino también de lote a lote de medio. Con relación a esto, la aglutinación, en esta etapa, de colonias con antisuero de Salmonella polivalente puede facilitar el reconocimiento de las colonias sospechosas.
El segundo medio sólido selectivo se incuba a la temperatura adecuada y se realiza la lectura después del tiempo recomendado por el fabricante para comprobar la presencia de colonias que, por sus características, se consideran Salmonella presuntivas. 9.5
CONFIRMACIÓN
9.5.1
Generalidades
Para las pruebas de confirmación pueden utilizarse los sistemas de identificación que están disponibles en el comercio para el análisis bioquímico de Salmonella si demuestran ser fiables. El empleo de los kits de identificación se refiere a la confirmación bioquímica de las colonias. Es conveniente que estos kits se empleen siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA El reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte una cuestión de experiencia y, su aspecto puede variar algo, no solo de serovariedad a serovariedad, sino también de lote a lote del medio de cultivo selectivo utilizado.
9.5.2
Selección de colonias para su confirmación
Para confirmación se toma al menos una colonia considerada como típica o sospechosa de cada placa de cada medio selectivo (véase el numeral 9.4), y luego otras cuatro colonias si la primera es negativa. Se recomienda que se identifiquen al menos 5 (cinco) colonias en el caso de estudios epidemiológicos. Si en una placa hubiera menos de 5 (cinco) colonias típicas o sospechosas, se toman para confirmación todas las colonias típicas o sospechosas. Se reaíslan las colonias seleccionadas en la superficie de placas de agar nutritivo previamente secado de manera que permita el desarrollo de las colonias bien aisladas. Se incuban las placas sembradas a 37 °C ± 1 °C durante 24 h ± 3 h. 8
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NTC 4574 (Primera actualización)
Una vez realizado el subcultivo en medio nutritivo, se emplean cultivos puros para la confirmación bioquímica y serológica, se somete a pruebas bioquímicas como son los medios TSI, LIA, Urea, VP, indol, motilidad. 9.5.3
Confirmación bioquímica
9.5.3.1 Generalidades Se siembran mediante una asa bacteriológica los medios especificados en los numerales 9.5.3.2 a 9.5.3.7 con cada uno de los cultivos obtenidos de las colonias seleccionadas en el numeral 9.5.2. 9.5.3.2 Agar TSI (numeral 5.2.6) Se siembra en estría la superficie inclinada del agar y la parte profunda por punción. Se incuba a 37 °C ± 1 °C durante 24 h ± 3 h. Se interpretan los cambios del medio de la siguiente manera: a)
b)
Profundidad -
Amarillo
glucosa positivo (utilización de la glucosa)
-
Rojo o sin cambio
glucosa negativo (no utilización de la glucosa)
-
Negro
formación de sulfuro de hidrógeno
-
Burbujas o fisuras
formación de gas a partir de la glucosa
Parte inclinada -
Amarillo sacarosa)
lactosa y/o sacarosa positivo (utilización de la lactosa y/o
-
Rojo o sin cambio y/o sacarosa)
lactosa y/o sacarosa negativo(no utilización de la lactosa
Los cultivos típicos de Salmonella muestran la parte inclinada alcalina (roja) y la parte profunda ácida(amarilla) con formación de gas (burbujas) y (en aproximadamente el 90 % de los casos) formación de sulfuro de hidrógeno (ennegrecimiento del agar) (véase el numeral 9.5.3.7). Cuando se aísla una Salmonella lactosa positivo (véase numeral 4.4), la parte inclinada del TSI es amarilla. Por esto la confirmación preliminar de los cultivos de Salmonella no debe estar basada sólo en los resultados de las pruebas del TSI (véase el numeral 9.5.3) 9.5.3.3 Caldo urea (véase el numeral 5.2.7). Se siembra con un asa bacteriológica el inóculo. Se incuba a 37 °C ± 1 °C durante 24 h ± 3 h y se examina de vez en cuando. Si la reacción es positiva, la descomposición de la urea libera amonio, que cambia el color del rojo de fenol a rosa y luego a cereza oscuro. La reacción es a menudo visible al cabo de 2 h a 4 h.
9
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NTC 4574 (Primera actualización)
9.5.3.4 Medio para la descarboxilación de la L-lisina (véase el numeral 5.2.8) Se siembra justo por debajo de las superficie del medio líquido. Se incuba a 37 °C ± 1 °C durante 24 h ± 3 h. La turbidez y un color morado después de la incubación indican una reacción positiva. Un color amarillo indica una reacción negativa. 9.5.3.5 Medio para reacción de Voges-Proskauer (VP) (véase el numeral 5.2.9) Se suspende el contenido de un asa de la colonia sospechosa en un tubo estéril que contenga 3 ml de medio VP. Se incuba a 37 °C ± 1 °C durante 24 h ± 3 h. Después de la incubación, se añaden dos gotas de la disolución de creatina, tres gotas de la disolución etanólica del n-naftol y luego dos gotas de la disolución de hidróxido potásico; se agita después de la adición de cada reactivo. La formación de un color rosa a rojo brillante en 15 min indica una reacción positiva. 9.5.3.6 Medio para la reacción del indol (véase el numeral 5.2.10) Se siembra con la colonia sospechosa un tubo que contenga 5 ml de medio SIM (movilidad). Se incuba a 37 °C ± 1 °C durante 24 h ± 3 h. Después de la incubación se añade 1 ml del reactivo de Kovacs. La formación de un anillo rojo indica una reacción positiva. Un anillo amarillo-marrón indica una reacción negativa. 9.5.3.7 Interpretación de las pruebas bioquímicas Salmonella muestra generalmente las reacciones indicadas en la Tabla 1.
10
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
Tabla 1. Interpretación de las pruebas bioquímicas
Prueba (9.5.3.2 a 9.5.3.7)
S.typhi Reacb % ción
Ácido de glucosa en + TSI Gas de glucosa en d TSI Ácido de lactosa en TSI Ácido de sacarosa en TSI Producción de sulfuro + de hidrógeno en TSI Hidrólisis de urea Descarboxilación de + la lisina Reacción de VP Producción de Indol a De la referencia [5]
Cepa de Salmonella S. paratyphi A S. paratyphi B S. paratyphi C ReacReacReacb % %b %b ción ción ción
Otras cepas Reac%b ción
100
+
100
+
+
100
0
+
100
+
+
92
2
-
100
-
-
1
0
-
0
-
-
1
97
-
10
+
+
92
0
-
0
-
-
1
98
-
0
+
+
95
0 0
-
0 0
-
-
0 14
b
Estos porcentajes indican que no todos los aislamientos de serotipos de Salmonella dan las reacciones marcadas como + +o -. Estos porcentajes pueden variar dentro de un mismo serotipó y entre un serotipo y otro de los causantes de toxi-infecciones alimentarias de diferentes procedencias.
c
Los porcentajes no son conocidos según la literatura disponible.
d
Salmonella Typhi no produce gas.
e
Las Salmonella enterica subespecie arizonae dan una reacción de lactosa positiva o negativa pero son siempre β-galactosidasa positivo. Para el estudio de estas cepas puede ser útil realizar pruebas complementarias.
9.5.4
Confirmación serológica y serotipo
9.5.4.1 Generalidades La detección de la presencia de los antígenos de Salmonella O, Vi, y H se realiza a partir de las colonias puras (véase el numeral 9.5.2) mediante aglutinación en portaobjetos con los sueros adecuados y, después de que las cepas autoaglutinantes hayan sido eliminadas. Se utilizan los antisueros según las instrucciones del fabricante si difieren de las descritas a continuación. 9.5.4.2 Eliminación de las cepas autoaglutinables Se sitúa una gota de la disolución salina (véase el numeral 5.2.12) en un portaobjetos de vidrio perfectamente limpio. Se dispersa parte de la colonia a probar en la gota, con un asa de manera que se obtenga una suspensión homogénea y turbia. NOTA También es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua, y luego mezclar esta disolución con una gota de la disolución salina (véase el numeral 5.2.12).
Se hace oscilar el portaobjetos de 30 s a 60 s. Se observa el resultado sobre un fondo oscuro, preferiblemente con la ayuda de una lupa. Si las bacterias se agrupan en unidades más o menos distintas, se considera la cepa como autoaglutinable y no debe someterse a las siguientes pruebas, porque la detección de antígenos no es posible. 11
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
9.5.4.3 Comprobación de los antígenos O Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede según el numeral 9.5.4.2, empleando una gota de suero anti O, en lugar de la disolución salina. Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva. Se usa el suero poli y monovalente uno después del otro. 9.5.4.4 Comprobación de los antígenos Vi Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede según el numeral 9.5.4.2, empleando una gota de suero anti Vi, en lugar de la disolución salina. Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva. 9.5.4.5 Comprobación de los antígenos H Se inocula el agar nutritivo semisólido con una colonia pura no autoaglutinable. Se incuba el medio a 37 °C ± 1 °C durante 24 h ± 3 h. Se usa ese cultivo para el examen de los antígenos H, procediendo según el numeral 9.5.4.2, empleando una gota de suero anti H, en lugar de la disolución salina. Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva. 9.5.5
Interpretación de las reacciones bioquímicas y serológicas
La Tabla 2 da las interpretaciones de las pruebas de confirmación (véanse los numerales 9.5.3 y 9.5.4) realizadas en las colonias seleccionadas (véase el numeral 9.5.2). Tabla 2. Interpretación de las pruebas de confirmación Reacciones bioquímicas
Auto aglutinación
Típicas
No
Típicas
No
Típicas
Si
Reacciones no típicas Reacciones no típicas
9.5.6
Reacciones serológicas Antígeno O, Vi y H positivo
Interpretación Cepa considerada como Salmonella Puede ser Salmonella
No / si
Todas las reacciones negativas No analizado (véase el numeral 9.5.4.2) Antígeno O, Vi y H positivo
No / si
Todas las reacciones negativas
No se considera que sea Salmonella
Confirmación definitiva
Las cepas que se consideran que son Salmonella o pueden ser Salmonella (véase la Tabla 2), deben enviarse a un centro de referencia de Salmonella reconocido para el tipificado definitivo. Este envío debe acompañarse de toda a información posible referente a la cepa(s) y si se trata de un brote o de un alimento aislado.
12
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 10.
NTC 4574 (Primera actualización)
EXPRESIÓN DE RESULTADOS
De acuerdo con los resultados de la interpretación, se indica la presencia o ausencia de Salmonella en una porción de x g de producto (véase la NTC 4092). Véase el Anexo C para los datos de precisión obtenidos del análisis interlaboratorios. 11.
INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe especificar: -
toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra;
-
el método de muestreo utilizado, si se conoce;
-
el método de ensayo utilizado, con referencia a esta parte de la norma;
-
todos los detalles operativos no especificados en esta parte de la norma, o considerado como opcional, cualquier incidente detallado que pueda haber influenciado los resultados del ensayo;
-
el resultado obtenido.
El informe del análisis debe también hacer constar si se obtuvo un resultado positivo exclusivamente con un medio en placa (véase el numeral 5.2.4) no especificado en la presente norma. 12.
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
Se debe verificar la capacidad del laboratorio de detectar la Salmonella con los métodos y los medios descritos en esta norma e introducir una muestra de referencia en los recipientes de control del medio de preenriquecimiento (véase el numeral 5.2.1). Se prosigue con los recipientes de control como para los ensayos de cultivo.
13
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización) ANEXO A (Normativo)
DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO
Muestra 25 g
PRE-ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO 225 ml de agua peptonada o caldo lactosado Incubación a 35°C ± 2°C - 18 h ± 2 h
Rapport Vassiliadis Incubar 41,5°C ± 0,5°C 24 h ± 3 h
Caldo de Muller-Kauffman tetratronato novobiocina (MKTTn) 37°C ± 1°C 24 h ± 3 h
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS
Rambach
Hektoen
McConkey
XLD
Bismuto sulfito
SalmonellaShiguella
Verde Brillante
Incubación a 35°C ± 2°C 24 h ± 3 h
Colonias características PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Reacción de Voges-Proskauer
TSI
Lisina
SEROLOGIA
Antisuero Polivalente Antisuero monovalente
14
Urea
Producción de Indol
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización) ANEXO B (Normativo)
COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS B.1
MEDIO DE PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO
B.1.1 Solución buferizada B.1.1.1 Composición Fosfato dibásico de sodio anhidro Ácido cítrico saturado Agua
9.23 g -1 000 ml
B.1.1.2 Preparación Disolver 9,23 g de fosfato dibásico de sodio anhidro en 800 ml de agua, ajustar la solución con ácido cítrico saturado a un pH de 4 + 0,1 aforar con agua a 1000 ml y mezclar. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min. B.1.2 Agua peptonada B.1.2.1 Composición Peptona Cloruro de sodio Hidrofosfato disodico .dodecahidratado(Na2HPO412H2O) Fosfato dihidrógeno potasico (KH2 PO4) Agua
10,0 g 5,0 g 9,0 g 1,5 g 1 000 ml
B.1.2.2 Preparación Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min. B.1.2 Caldo lactosado B.1.2.1 Composición Peptona de gelatina Extracto de carne Lactosa
5,0 g 3,0 g 5,0 g
B.1.2.2 Preparación Disolver 13 gr por litro mezclar bien y distribuir en frascos de 250 ml. Ajustar el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,9 . Esterilizar a 121 ºC durante 15 min. B.2
RAPPAPORT-VASSILIADIS VERDE MALAQUITA
B.2.1 Solución A
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
B.2.1.1 Composición Triptona Cloruro de sodio Fosfato dipotásico (KH2 PO4) Agua
5,0 g 8,0 g 1,6 g 1 000 ml
B.2.1.2 Preparación Debe ser preparada diariamente. Disolver los componentes en agua a 70 °C. B.2.2 Solución B B.2.2.1 Composición Oxalato verde malaquita Agua
0,4 g 100 ml
B.2.2.2 Preparación Disolver el oxalato verde malaquita en agua y mantenerlo en frasco oscuro y a una temperatura fresca. B.2.3 Medio completo B.2.3.1 Composición Solución A Solución B
1000 ml 10 ml
B.2.3.2 Preparación Mezclar 1 000 ml de solución A con 10 ml de solución B ajustar el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 5,2. Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml y esterilizar en autoclave a 115 ºC por 15 min. Mantener el medio en refrigeración. B.3
CALDO MULLER-KAUFFMANN TETRATIONATE NOVOBIOCINA (MKTTn)
B.3.1 Medio base B.3.1.1 Composición medio base Extracto de carne Digerido enzimático de caseína Cloruro de sodio (NaCl) Carbonato de calcio (CaCO3) Tiosulfato de sodio pentahidratado Bilis de buey para uso bacteriológico Verde brillante Agua
4,3 g 8,6 g 2,6 g 38,7 g 47,8 g 4,78 g 9,6 g 1000 ml
B.3.1.2 Preparación Se disuelven los componentes básicos deshidratados o el medio completo deshidratado en el agua mediante ebullición durante 5 min.. 16
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que sea de 8,2 ± 0,2 a 25 °C. Se mezcla el medio completamente. El medio base puede ser almacenado durante 4 semanas a 3 °C ± 0,2 °C. B.3.2 Disolución de yodo-yoduro B.3.2.1 Composición Yodo Yoduro potásico (KI) Agua
20,0 g 25,0 g 100 ml
B.3.2.2 Preparación Se disuelve completamente el yoduro potásico en 10 ml de agua, luego se añade el yodo y se diluye hasta 100 ml con agua estéril. No calentar. Se almacena la disolución preparada en la oscuridad a temperatura ambiente en un recipiente herméticamente cerrado. B.3.3 Disolución de novobiocina B.3.3.1 Composición Sal sódica de novobiocina Agua
0,04 g 5 ml
B.3.3.2 Preparación Se disuelve la sal sódica de novobiocina en el agua y se esteriliza por filtración. Se puede almacenar hasta 4 semanas a 3 °C ± 0,2 °C. B.4
AGAR XLD (XILOSA, LISINA DESOXICOLATO)
B.4.1 Composición Extracto de levadura en polvo Cloruro sódico Xilosa Lactosa Sacarosa Hidrocloruro de L-lisina Tiosulfato sódico Citrato amónico de hierro Rojo de fenol Desoxicolato sódico Agar Agua
17
3g 5g 3,75 g 7,5 g 7,5 g 5g 6,8 g 0,8 g 0,08g 1,0 g de 9 g a 18 g 1000 ml
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
B.4.2 Preparación Disolver los componentes básicos deshidratados o el medio base en el agua mediante calentamiento, con agitación frecuente, hasta que el medio comience a hervir. Evitar el sobrecalentamiento. Se ajusta pH de manera que después de la esterilización sea de 7,4 ± 0,2 a 25 °C. B.5
FENOL ROJO/ AGAR VERDE BRILLANTE(EDEL Y KAMPELMACHER)
B.5.1 Base B.5.1.1 Composición Extracto de carne Peptona Extracto de levadura Disodio hidrogeno fosfato Na2HPO4 Sodio dihidrogeno fosfato NaH2PO4 Agar Agua 1) Depende de la fuerza del gel
5,0 g 10,0 g 3,0 g 1,0 g 0,6 g 12 g a 18 g 1) 900 ml
B.5.1.2 Preparación Disolver los componentes y calentar si es necesario, ajustar el pH a 7,0, transferir a tubos y esterilizar en autoclave a 121 ºC por 15 min. B.5.2 Caldo carbohidrato rojo de fenol B.5.2.1 Composición Lactosa Sucrosa Rojo de fenol Agua hasta completar volumen
10,0 g 10,0 g 0,09 g 100 ml
B.5.2.2 Preparación Disolver los componentes en 50 ml de agua, luego llevar a 100 ml, calentar en un baño de agua a 70 °C por 20 min. Enfriar a 55 °C ± 1 °C y usar inmediatamente. B.5.3 Solución de verde brillante B.5.3.1 Composición Verde brillante Agua
0,5 100 ml
B.5.3.2 Preparación Añadir el verde brillante al agua, almacenar la solución en un sitio oscuro.
18
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
B.5.4 Medio completo B.5.4.1 Composición Base Caldo carbohidrato rojo de fenol Solución de verde brillante
900 ml 100 ml 1 ml
B.5.4.2 Preparación Añadir en condiciones asépticas la solución de verde brillante a el caldo carbohidrato rojo de fenol, enfriar a 55 °C ± 1 °C y añadir esto a la base. B.6
AGAR NUTRITIVO
B.6.1 Composición Extracto de carne Peptona Agar Agua 1) Depende de la fuerza del gel
3,0 g 5,0 g 12 g a 18 g 1) 1000 ml
B.6.2 Preparación Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min. B.7
TRES AZÚCARES / AGAR HIERRO (AGAR TSI)
B.7.1 Composición Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Glucosa Citrato férrico(III) Triosulfato de sodio Rojo fenol Agar Agua 1) Depende de la fuerza del gel
3,0 g 3,0 g 20,0 g 5,0 g 10,0 g 10,0 g 1,0 g 0,3 g 0,3 g 0,024 g 12 g a 18 g 1) 1 000 ml
B.7.2 Preparación Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,4. Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml y esterilizar a 121 ºC durante 10 min.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA B.8
NTC 4574 (Primera actualización)
CALDO UREA (CHRISTENSEN)
B.8.1 Base B.8.1.1 Composición Peptona Glucosa Cloruro de sodio Fosfato dihidrógeno potasico (KH2 PO4) Rojo fenol Agua
1,0 g 1,0 g 5,0 g 2,0 g 0,012 g 1 000 ml
B.8.1.2 Preparación Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min. B.8.2 Solución de urea B.8.2.1 Composición Urea Agua
400 g 1 000 ml
B.8.2.2 Preparación Disolver la urea en agua, esterilizar por filtración y chequear. B.8.3 Medio completo B.8.3.1 Composición Base Solución de urea
950 ml 50 ml
B.8.3.2 Preparación Añadir en condiciones asépticas la solución de urea sobre la base, enfriar a 45 °C ± 1 °C. Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml. B.9
L-LISINA DESCARBOXILADA
B.9.1 Composición L-lisina monohidroxiclorada Extracto de levadura Glucosa Púrpura de bromocresol Agua
5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1 000 ml
B.9.2 Preparación Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Distribuir en tubos en cantidades de 5 ml. Esterilizar a 121 °C durante 10 min. 20
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA B.10
NTC 4574 (Primera actualización)
REACTIVOS PARA LA REACCIÓN DE VOGES PROSKAUER (VP)
B.10.1 Medio VP B.10.1.1 Composición Peptona Glucosa Hidrógeno fosfato dipotásico Agua
7g 5g 5g 1 000 ml
B.10.1.2 Preparación Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario. Se ajusta el pH, de manera que después de la esterilización sea de 6,9 ± 0,2 a 25 °C si es necesario. Se reparte el medio en tubos en cantidades de 3 ml. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min. B.10.2 Disolución de creatina (N-amidinosarcosina) B.10.2.1 Composición Monohidrato de creatina Agua
0,5 g 100 ml
B.10.2.2 Preparación Se disuelve el monohidrato de creatina en agua. B.10.3 1-Naftol, disolución etanólica B.10.3.1 Composición 1-naftol Etanol, 96 % (fracción volumen)
6g 100 ml
B.10.3.2 Preparación Se disuelve el 1-naftol en el etanol. B.10.4 Disolución de hidróxido de potasio B.10.4.1 Composición Hidróxido de potasio Agua
40 g 100 ml
B.10.4.2 Preparación Se disuelve el hidróxido de potasio en el agua.
21
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA B.11
NTC 4574 (Primera actualización)
REACTIVOS PARA LA REACCIÓN DEL INDOL
B.11.1 Medio triptona/triptófano B.11.1.1 Composición Triptona Cloruro de sodio (NaCl) DL-Triptófano Agua
10 g 5g 1g 1 000 ml
B.11.1.2 Preparación Se disuelven los componentes en agua hirviendo. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,5 ± 0,2 a 25 °C. Se reparte el medio, en cantidades de 5 ml, en los tubos. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min. B.11.2 Reactivo de kovacs B.11.2.1Composición 4 dimetil amino benzaldehido Acido clorhídrico p = 1,18 g/ml a 1,19 g/ml 2 metil - 2 butanol
5g 25 ml 75 ml
B.11.2.2 Preparación Se mezclan los componentes. B.12
AGAR NUTRITIVO SEMISÓLIDO
B.12.1 Composición Extracto de carne Peptona Agar Agua 1) Depende de la fuerza del gel
3,0 g 5,0 g De 4 g a 9 g 1 1 000 ml
B.12.2 Preparación Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario. Se ajusta el pH, si fuera necesario de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2 a 25 °C. Se reparte el medio en matraces de capacidad adecuada. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min. B.12.3 Preparación de las placas de agar Se vierten unos 5 ml del medio recién preparado en tubos. No hay que dejar que el medio se seque. B.13
DISOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA
B.13.1 Composición Cloruro de sodio (NaCl) Agua
8,5 g 1 000 ml
22
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
B.13.2 Preparación Se disuelve el cloruro de sodio en agua. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2 a 25 °C. Se reparten cantidades de la disolución en matraces o tubos de manera que contengan de 90 ml a 100 ml después de la esterilización. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min. B.14
SELENITO CISTINA
B.4.1 Base B.14.1.1 Composición Triptona Lactosa Hidrofosfato disodico dodecahidratado(Na2HPO412H2O) Sodio selenito hidrogenado Agua
5,0 g 4,0 g 10,0 g 4,0 g 1 000 ml
B.14.1.2 Preparación Disolver primero los tres componentes tribásicos en agua, llevar a ebullición por 5 min. Después de enfriar añadir sodio selenito hidrogenado y ajustar el pH a 7,0 B.14.2 Solución de L-Cistina B.14.2.1 Composición L-Cistina Solución de hidróxido de sodio 1 mol/l Agua estéril hasta completar volumen
0,1 g 15 ml 100 ml
B.14.2.2 Preparación Colocar los componentes en un erlenmeyer estéril, llevar a 100 ml con agua estéril y no autoclavar. B.14.3 Medio completo B.4.3.1 Composición Base Solución de L-Cistina
1000 ml 10 ml
B.14.3.2 Preparación Enfriar la base y añadir la solución de L-Cistina, asépticamente, ajustar el pH a 7,0. Distribuir en tubos asépticamente. Preparar la solución diariamente.
23
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización) ANEXO C (Normativo)
COMPARACIÓN ENTRE EL MÉTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA AOAC VERSIÓN 2005 AOAC 995.20 ALIMENTOS ALTAMENTE CONTAMINADOS 10 ml de caldo RVS como 10 ml de caldo RVS como preenriquecimiento. preenriquecimiento. 0.1 ml de muestra 0.1 ml de muestra Se incuba a 41,5 °C ± 1 durante 24 h ± Se incuba a 42 °C ± 0,2 durante 24 h ± 2 h. 3 h. 10 ml de caldo Tetrationato como 10 ml de caldo Tetrationato como preenriquecimiento. preenriquecimiento. 1.0 ml de la muestra 1.0 ml de muestra Se incuba a 37 ± 1 °C durante 24 h ± 3 Se incuba a 43 ± 0,2 durante 24 h ± 2 h. h. ISO 6579:2002
24
AOAC 967.26 ALIMENTOS PROCESADOS
10 ml de caldo selenito cistina como preenriquecimiento. 1 ml de muestra Se incuba a 35 ± 1 °C durante 24 h ± 2 h. 10 ml de caldo Tetrationato como preenriquecimiento. 1.0 ml de muestra Se incuba a 35 ± 1 °C durante 24 h ±2 h.
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización) ANEXO D (Informativo)
RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS En el año 2000 AFSSA Ploufragan en Europa, y Biocontrol Systems en Estados Unidos, organizaron un análisis colaborativo internacional en el marco del proyecto europeo SMT CT 96 2098 [6]. Once laboratorios de nueve países europeos y 10 laboratorios de Estados Unidos participaron en este estudio que tuvo lugar sobre cuajada de queso fresco, huevo deshidratado en polvo, carne cruda de pollo y un material de referencia. Cada una de las muestras de alimentos se analizó a dos niveles diferentes de contaminación, junto con un control negativo. Las Tablas C.1 a C.4 dan las los valores del rendimiento por tipo de muestra según este análisis colaborativo. Los resultados obtenidos por algunos laboratorios han sido excluidos de los cálculos exclusivamente por razones técnicas identificadas claramente (desviaciones del protocolo). Tabla C.1. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de cuajada de queso fresco
Cuajada de queso fresco (blanco)
Cuajada de queso fresco (nivel de contaminación bajo)
Cuajada de queso fresco (nivel de contaminación alto)
23
23
23
5
5
5
Número de laboratorios excluidos
2
2
2
Número de laboratorios retenidos después de exclusión
21
21
21
Número de muestras aceptadas
105
105
105
Fiabilidad (especificidad), %
100
-
-
Fiabilidad (sensibilidad), %
-
74,3
83,8
100 100
83,8 60,5
95,2 71,7
Número de laboratorios que enviaron los resultados Número de muestras por laboratorio
Conformidad, % Concordancia, %
25
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización)
Tabla C.2. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de huevo deshidratado en polvo Huevo deshidratado en polvo (blanco)
Huevo deshidratado en polvo (nivel de contaminación bajo)
Huevo deshidratado en polvo (nivel de contaminación alto)
26
26
26
5
5
5
5
5
5
Número de laboratorios que enviaron los resultados Número de muestras por laboratorio Número de laboratorios excluidos Número de laboratorios retenidos después de exclusión Número de muestras aceptadas
21
21
21
105
105
104
Fiabilidad (especificidad), %
100
-
-
Fiabilidad (sensibilidad), %
-
98,1
99
100 100
96,2 96,2
98,1 98,1
Conformidad, % Concordancia, %
Tabla C.3. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de carne cruda de pollo Carne cruda de pollo (blanco)
Número de laboratorios que enviaron los resultados Número de muestras por laboratorio
Carne cruda de pollo Carne cruda de pollo (nivel de (nivel de contaminación bajo) contaminación alto)
25
25
25
5
5
5
5
5
5
Número de laboratorios excluidos Número de laboratorios retenidos después de exclusión Número de muestras aceptadas
20
20
20
100
99
100
Fiabilidad (especificidad), %
100
-
-
-
98
100
100 100
96,9 96
100 100
Fiabilidad (sensibilidad), % Conformidad, % Concordancia, %
Tabla C.4. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con materiales de referencia Material de referencia (cápsulas conteniendo unas 5 ufc de S. Typhimurium)
Número de laboratorios que enviaron los resultados
26
Número de muestras por laboratorio
5
Número de laboratorios excluidos
1
Número de laboratorios retenidos después de exclusión
25
Número de muestras aceptadas
125
Fiabilidad (especificidad), %
-
Fiabilidad (sensibilidad), %
94,4
Conformidad, % Concordancia, %
88,8 89,1
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualización) ANEXO E (Informativo)
CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS A LA NTC 4574 (Primera actualización) Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA LA ISO 6579 Documento de referencia ISO 6579:2002 1. OBJETO 1. OBJETO Esta norma describe los métodos Esta norma internacional describe un horizontales para la detección de método horizontal para la detección de Salmonella spp. Salmonella, incluyendo Salmonella Sujeta a las limitaciones indicadas al typhi y Salmonella paratyphi. comienzo de esta norma, se aplica a Sujeta a las limitaciones discutidas en productos para consumo humano y la introducción esta norma internacional para alimentación animal. es aplicable a: los productos para consumo La temperatura de incubación (35 ºC ± humano animal; 2 °C) se acordará entre las partes las muestras ambientales en el involucradas y se debe especificar en área de la producción y el reporte del ensayo. manipulación de alimentos. 2. REFERENCIAS 2. REFERENCIAS NORMATIVAS NORMATIVAS NTC 5395, Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de análisis. 4 PRINCIPIO 4. PRINCIPIO 4.1 GENERALIDADES 4.1 GENERALIDADES Para la detección de Salmonella spp. se La detección de Salmonella necesita necesitan cuatro etapas sucesivas cuatro etapas sucesivas (véase (véase también el Anexo A). también el anexo A). NTC 4574 (primera actualización)
NOTA Salmonella spp. puede estar presente en bajas concentraciones y está frecuentemente acompañada por otros microorganismos. Por tanto, es necesario un preenriquecimiento no selectivo y posteriormente realizar un enriquecimiento selectivo. NOTA La determinación de Salmonella puede realizarse también por los siguientes métodos: siembra en membranas hidrofóbicas, PCR, inmunofluorescencia (VIDAS) o cualquier otro método búsqueda. 4.2 PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO NO SELECTIVO Se inocula en solución buferada, agua peptonada tamponada o caldo lactosado con la muestra para ensayo, y se incuba a 37 °C ± 1 °C por 18 h +/2 h. Para ciertos productos alimenticios es necesario emplear otros procedimientos de preenriquecimiento. Véase el numeral 9.1.2.
NOTA Las Salmonella pueden estar presentes en números pequeños y, a menudo están acompañadas de números considerablemente mayores de otras Enterobacteriaceae o de otras familias. Además, el preenriquecimiento es necesario para permitir la detección de números bajos de Salmonella o de Salmonella lesionadas.
4.2 PRE-ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO NO SELECTIVO
Sustentación Se modifica el objeto debido a que se considera que al nombrar Salmonella spp, no es necesario mencionar que aplica para Salmonella typhi y Salmonella paratyphi, también. Adicionalmente es importante aclarar que la temperatura de incubación se acordará entre las partes dependiendo del tipo de muestras que se estén procesando.
Se incluyó la referencia normativa respecto a los requisitos que debe cumplir el agua para uso en análisis de laboratorio. Se modifica la redacción de la nota, porque se tiende a interpretaciones respecto a “microorganismos lesionados”. Adicionalmente se incluye una nota respecto al uso de métodos alternos que son utilizados para la detección de éste microorganismo que están referenciados en otros estándares internacionales tales como la AOAC.
Se divide el numeral en dos partes, generalidades y preenriquecimiento en medio líquido no selectivo. En generalidades se aclara que etapas son contempladas para la Se agua peptonada tamponada con la detección de Salmonella y dos notas muestra para ensayo, y se incuba a 37 respecto a muestras con concentraciones bajas y recomendaciones para uso de °C ± 1 °C por 18 h +/2 h. Para ciertos productos alimenticios es técnicas alternativas a la técnica propuesta en el documento. necesario emplear otros procedimientos de preSe adiciona como medio de enriquecimiento. Véase el numeral preenriquecimiento la solución buferada y el 9.1.2. caldo lactosado, como medios alternativos Para grandes cantidades, es que tienen la misma función que el agua conveniente calentar el agua peptonada tamponada a 37 °C ± 1 °C peptonada tamponada. El párrafo respecto al calentamiento antes de antes de ser sembrada con la porción sembrar la porción para análisis se retira para análisis. porque este procedimiento se da en la preparación de la muestra dependiendo del producto.
27
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
Documento de referencia
NTC 4574 (primera actualización) 4.3 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO Se inocula 0,1 ml del medio de preenriquecimiento (véase numeral 4.2) en 10 ml del medio Rappaport Vassiliadis/medio verde malaquita (medio RVS) (o medio selenito según AOAC 967.25 p. 109) y 1,0 ml del medio de preenriquecimiento (véase el numeral 4.2) en el medio Tetrationate Mueller Kauffmann (medio MKTTn). El caldo RVS se incuba a 41,5 °C ± 1,0 °C durante 24 h ± 3 h y el caldo MKTTn se incuba a 37 °C ±1 °C durante 24 h ± 3 h. 4.4 SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO A partir de los caldos de enriquecimiento líquido obtenidos en el numeral 4.3, se inoculan como mínimo dos medios selectivos sólidos: -Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) Y cualquier otro medio selectivo complementario al XLD y que sea especialmente adecuado para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positivas y Salmonella typhi y paratyphi; el medio se deja a la elección del laboratorio: EJEMPLO agar Rambach Agar Hektoen agar McConkey agar bismuto sulfito agar Salmonella Shigella(SS) agar verde brillante
NTC 4574 (Primera actualización)
ISO 6579:2002
Sustentación
4.3 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO Se adiciona el medio de cultivo LÍQUIDO SELECTIVO selenito recomendado por el método de la AOAC y que es ampliamente Se siembra el medio Rappaport- utilizado en los laboratorios Vassiliadis (caldo RVS) y el caldo colombianos. Adicionalmente se Muller-Kauffmann tetrationato (caldo aclara a que temperaturas y durante MKTTn) con el cultivo obtenido en el cuanto tiempo debe realizarse la numeral 4.2. incubación.
4.4
SIEMBRA EN PLACA E IDENTIFICACIÓN Se siembran dos medios sólidos selectivos a partir de los cultivos obtenidos en el numeral 4.3. agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD); cualquier otro medio selectivo complementario al XLD y que sea especialmente adecuado para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positivas y, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi; el medio se deja a la elección del laboratorio.
Se modifica el numeral para incluir como medio principal el XLD y una lista de los posibles medios de cultivo que pueden ser utilizados como alternativa no como una nota como está en el documento de referencia.
El agar XLD se incuba a 37 °C ± 1 °C y se examina después de 24 h ± 3 h. El segundo agar selectivo se incuba según las recomendaciones del fabricante.
NOTA – Para información, el agar verde brillante, agar sulfito de El agar XLD se incuba a 37 °C ± 1 bismuto, etc., podrían ser utilizados °C y se examina después de 24 h ± como el segundo medio en placa. 3 h. El segundo agar selectivo se incuba a 37 °C ± 1 °C, y se examina después de 24 h ± 3 h o según las indicaciones del fabricante del medio de cultivo, si es necesario, después de 48 h para verificar la presencia de colonias las cuales, a partir de sus características, se consideran presuntivas de ser Salmonella spp. 4.5 CONFIRMACIÓN 4.5 CONFIRMACIÓN DE En Colombia se entiende que IDENTIDAD confirmación se refiere a la identificación del microorganismo e identidad se refiere cuando se esta hablando de una persona; por lo tanto se elimina.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
Documento de referencia
NTC 4574 (primera actualización) 5.1
GENERALIDADES
NTC 4574 (Primera actualización)
Sustentación
ISO 6579:2002 5.1
GENERALIDADES
Para la práctica actual de Para la práctica actual laboratorio véase la NTC 4092 (ISO laboratorio véase la ISO 7218. 7218).
Se adiciona la nota respecto al uso de métodos rápidos y reactivos listos de para uso, debido a que en el mercado están disponibles con técnicas validadas.
NOTA 1 Se pueden emplear reactivos listos para usar, preparados comercialmente. 5.2.1 Medio de pre5.2.1 Medio de preenriquecimiento no selectivo: enriquecimiento no selectivo: agua peptonada tamponada. Solución buffer, agua peptonada tamponada o caldo lactosado Véase el numeral B.1. Véase el numeral B.1. 5.2.4.2 Segundo medio La elección del segundo medio se deja a criterio del laboratorio de análisis. Es conveniente seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a su preparación. agar Rambach agar Hektoen agar McConkey agar bismuto sulfito agar Salmonella –Shigella (SS) agar verde brillante. Véase numeral B.5.
5.2.4.2 Segundo medio
Se adiciona como medio de preenriquecimiento la solución buferada y el caldo lactosado, como medios alternativos que tienen la misma función que el agua peptonada tamponada. Se adiciona el listado para seleccionar el segundo medio.
La elección del segundo medio se deja a criterio del laboratorio de análisis. Es conveniente seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a su preparación.
5.2.9 Reactivo para la detección de la β-galactosidasa (o discos de papel listos para su uso y empleados según las instrucciones del fabricante). Véase el numeral B. 9.
5.2.11 Agar nutritivo semisólido Véase el numeral B.12.
Este numeral se elimina de la norma, debido a que actualmente en los laboratorios no se cuenta con los reactivos para realizar esta prueba. Se considera que las otras bioquímicas mencionadas en el documento, sirven para identificar una Salmonella, sin necesidad de realizar la detección por medio de la β- galactosidasa. Se adiciona “movilidad” para aclarar el uso del mismo.
5.2.11 Agar nutritivo semisólido (movilidad) Véase el numeral B.12. 6.7 CAJAS DE PETRI De tamaño pequeño (de 90 mm a 100 mm de diámetro) o de tamaño grande (de 140 mm de diámetro).
6.7 CAJAS DE PETRI Se incluye la nota para aclarar que De tamaño pequeño (de 90 mm a pueden utilizarse tanto cajas de 100 mm de diámetro) o de tamaño vidrio, como desechables. grande (de 140 mm de diámetro).
NOTA se pueden utilizar cajas de vidrio o de material desechable. 6.8 BAÑO DE AGUA En caso de incubar en baño de agua, mantenerlo a una temperatura entre 41,5 °C ± 1,0 °C ó a 37 °C ± 1 °C.
NOTA se pueden utilizar cajas de vidrio o de material desechable. 6.4 BAÑO DE AGUA En caso de incubar en baño de agua, mantenerlo a una temperatura entre 41,5 °C ± 1,0 °C ó a 37 °C ± 1 °C.
NOTA Se recomienda emplear un baño que contenga un agente antibacteriano debido a la baja dosis infectiva de Salmonella.
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En la norma se decide dejar como alternativa para incubar las muestras tanto la incubadora, como un baño de agua, introduciendo las dos temperaturas de incubación en este caso, pero el laboratorio tiene la libertad de decidir, mientras que cuente con una técnica validada y unificar el equipo en un solo numeral.
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NTC 4574 (primera actualización)
NTC 4574 (Primera actualización)
Documento de referencia ISO 6579:2002
Sustentación
9.1 MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES ... NOTA 5Para reducir la carga de trabajo cuando más de 25 g de la muestra para ensayo de un lote específico de alimentos ha sido analizado y cuando hay evidencia disponible de que su mezcla (juntando las porciones de muestras para ensayo) no afecta el resultado del producto en particular, las muestras para ensayo pueden ser compuestas. Por ejemplo, si 10 porciones de ensayo de 25 g se van a analizar, se combinan las 10 unidades para formar una muestra para ensayo compuesta de 250 g y se adicionan 2,25 l de caldo de pre-enriquecimiento. Alternativamente, se pueden combinar porciones de caldos de preenriquecimiento de 0.1 ml ( en 10 ml de medio RVS) y 1 ml ( en 10 ml de medio tetrationate Mueller Kauffmann) de los caldos de pre-enriquecimiento provenientes de 10 porciones de muestras para ensayo separadas (véase el numeral 9.3.1) para enriquecerlas en 100 ml de los medios de enriquecimiento selectivos. 9.1.2 Preparaciones específicas de la suspensión inicial para ciertos productos alimenticios
9.1 Muestra para ensayo y Se decide dejar el párrafo como nota suspensiones iniciales y no como requisito en dado caso Con el fin de reducir la carga de que esta situación se presente. trabajo cuando haya de analizarse más de una porción para análisis de 25 g de un determinado lote de alimento y, cuando exista evidencia de que su mezcla (juntando las porciones para análisis) no afecta al resultado de ese alimento en particular, las porciones de análisis pueden ser mezcladas. Por ejemplo, si deben analizarse 10 porciones de análisis de 25 g, se combinan las 10 unidades para constituir una porción para análisis compuesta de 250 g y se añaden 2,25 l de caldo de preenriquecimiento. Una alternativa sería reunir las porciones de 0,1 ml (en 10 ml de caldo RVS) y 1 ml (en 10 ml de caldo MKTTn) de los caldos de pre-enriquecimiento provenientes de 10 porciones para análisis separadas (véase el numeral 9.3.1) para enriquecerlas en 100 ml de los medios de enriquecimiento selectivos.
NOTA 6 Para preparaciones específicas de la suspensión inicial para ciertos productos alimenticios aplicables a la determinación de Salmonella o cualquier microorganismo se describen en las NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3 y NTC 4491-4 e ISO 8261. Si algún producto no está referenciado en estas normas o no existe una norma específica de producto, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
NOTA Las siguientes preparaciones específicas se refieren sólo al caso de Salmonella. Las preparaciones específicas aplicables a la determinación de cualquier microorganismo se describen en las normas internacionales ISO 6887-2, ISO 6887-3, ISO 6887-4 e ISO 8261.
9.1.2 Preparaciones específicas de la suspensión inicial para ciertos productos alimenticios
30
Se cambian las referencias normativas por las NTC colombianas que han sido adoptadas en el comité técnico. Adicionalmente se aclara que si algún producto que se vaya a analizar no está contemplado dentro de estas normas, se debe consultar la norma de producto y si no la hay, se debe establecer un acuerdo entre las partes interesadas para su análisis.
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (primera actualización) 9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml del medio RVS (véase el numeral 5.2.2); se transfieren 1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2 a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate Mueller Kauffmann (véase el numeral 5.2.3).
NTC 4574 (Primera actualización)
Documento de referencia ISO 6579:2002 9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml del medio RVS (véase el numeral 5.2.2); se transfieren 1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2 a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate Mueller Kauffmann (véase el numeral 5.2.3).
Sustentación
Se incluye una nota para aclarar que se debe hacer con la muestra en caso de usar el caldo de cultivo selenito.
NOTA En el caso de utilizar el medio de cultivo selenito como medio de enriquecimiento, se transfieren 1.0 ml del cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml de caldo selenito (véase numeral 5.2.2). Se incuba a 35 ± 1 °C durante 24 h ± 2 h. 9.5.3.5 Detección de la β- Véase explicación de su eliminación galactosidasa (5.2..9). Se suspende en el numeral 5.2.9. el contenido de un asa de la colonia sospechosa en un tubo que contenga 0,25 ml de la disolución salina (5.3.13). Se añade una gota de tolueno y se agita el tubo. Se coloca el tubo en un baño de agua (6.6) regulado a 37°C y se deja durante algunos minutos (5 min aproximadamente). Se añaden 5 ml del reactivo para la detección de la βgalactosidasa y se mezcla. Se vuelve a colocar el tubo en el baño de agua regulado a 37 °C y se deja durante 24 h ± 3 h, examinando el tubo de vez en cuando. ANEXO C Se introduce un anexo informativo realizando una comparación entre la (normativo) técnica analítica propuesta en el documento de referencia y el método COMPARACIÓN ENTRE EL propuesto en la AOAC para la MÉTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA detección de Salmonella. AOAC VERSIÓN 2005
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NTC 4574 (Primera actualización) BIBLIOGRAFIA
[1]
Manual Técnico División de Insumos pecuarios. Laboratorio Nacional de Insumos pecuarios 1996
[2]
Instituto Nacional de Salud, Análisis Microbiológico de Alimentos. Manual de procedimientos. Red Nacional de Laboratorios, Septiembre de 1990
[3]
Manual operativo de análisis microbiológicos para alimentos. Gilma Janeth Luna, Fondo Editorial. Fundación Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano.
[4]
AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 967.25 Salmonella in Foods. p 109111. Chapter 17.
[5]
AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 967.26 Salmonella in Foods. p 111112. Chapter 17.
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NTC 4574 (Primera actualización)
DOCUMENTO DE REFERENCIA INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General Guidance on Methods for the Detection of Salmonella. Geneve, 2002 (ISO6579:2002).
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