Northern Blotting

NORTHERN BLOTTING

NORTHERN BLOTTING Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama kali pada tahun 1977  secara umum teknik ini mirip dengan Southern Blot  Yang membedakan adalah sampel yang digunakan, yaitu RNA.  Teknik ini digunakan untuk melihat ekspresi (transkripsi) suatu mRNA (gen) pada organ atau jaringan tertentu, seperti daun, bunga, biji, batang, dan lain sebagainya. 

DEFINISI DAN PRINSIP Northern Blot adalah suatu teknik untuk mendapatkan informasi mengenai identitas, ukuran dan kelimpahan RNA. Prinsip northern blot adalah memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membran menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target

TAHAPAN NORTHERN BLOTTING

TAHAPAN UMUM NORTHERN BLOT isolasi RNA (total atau poli (A) RNA)  Generasi Probe  Denaturasi dan elektroforesis gel agarosa  Transfer ke support solid dan imobilisasi  Prehybridization dan hibridisasi dengan probe  Pencucian  Deteksi  Pengupasan dan reprobing (opsional) 

ISOLASI RNA Dapat dilakukan dengan cara:  Lisis membran Seluler  Penghambatan aktivitas ribonuklease  Deproteinasi  Recovery intact RNA

ISOLASI POLI (A) dalam beberapa kasus, langkah terpisah untuk isolasi mRNA dari RNA total dapat dimasukkan dengan poly (A) selection, hal ini meningkatkan sensitivitas.  Isolasi mRNA dari total RNA menggunakan poli-A prosedur seleksi +, yang melibatkan kolom oligo-T, atau beads primed oligo-T, untuk mengikat ekor poli-A + mRNA.  RNA diekstraksi spesies, apakah RNA total atau poli-A + yang dipilih, kemudian dipisahkan berdasarkan ukuran molekul dengan elektroforesis agarosa-gel 

GENERASI PROBE Dapat menggunakan radioaktif atau nonisotopically label, RNA, DNA atau probe oligodeoxynucleotide.  RNA Probe dapat diproduksi secara in vitro melalui reaksi transkripsi menggunakan Ambion yang MAXIscript Kit.  Nukleotida berlabel isotop atau nonisotopic dapat dimasukkan langsung selama sintesis dengan kit ini, atau RNA dapat disintesis unlabeled dan kemudian ditambah Psoralen-Biotin untuk menghasilkan probe terbiotinilasi untuk hybridizations blot. 

DENATURASI DENGAN ELEKTROFORESIS AGAROS 

Formaldehida biasa digunakan secara tradisional sebagai denaturan, meskipun sistem glyoxal memiliki beberapa keunggulan dibandingkan formaldehida.

TRANSFER KE SUPPORT SOLID DAN IMOBILISASI   



RNA ditransfer ke membran nilon bermuatan positif dan kemudian bergerak selama hibridisasi berikutnya. Metode berteknologi rendah terbaik untuk transfer agarosa adalah dengan elusi, pasif sedikit basa, ke bawah. Prosedur ini, dibandingkan dengan mentransfer ke atas, jauh lebih cepat dan karena itu menghasilkan band-band lebih ketat dan sinyal yang lebih. Atau, cara transfer yang tersedia secara komersial aktif (electroblotter, semidry electroblotter, vakum tinta, tinta tekanan, dll) dapat digunakan. Setelah RNA ditransfer, membran harus segera disiapkan untuk Crosslink RNA. Hal ini dapat dilakukan oleh sinar ultraviolet (metode yang disukai) atau dengan dipanggang.

PREHYBRIDISASI DAN HIBRIDISASI DENGAN PROBE 

Prehybridisasi atau memblokir, diperlukan sebelum menyelidiki hibridisasi untuk mencegah probe dari lapisan membran. Blocking yang baik diperlukan untuk meminimalkan masalah back ground.

HIBRIDISASI PROBES 





 

Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa probe ini melengkapi semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target. Secara umum, ukuran minimum untuk probe untuk memastikan spesifisitas adalah sekitar dua puluh lima basa, memberikan bahwa ada kecocokan lengkap antara urutan probe dan urutan dari mRNA target, Ada dua bentuk utama probe hibridisasi, pendekatan tradisional yang menggunakan DNA komplementer (cDNA). Atau, anti-sense oligonukleotida (umumnya 30-40 basa) dapat dirancang dari data urutan dan disintesis. Oligonukleotida, seperti cDNA, adalah molekul DNA yang tetapi 'riboprobes' basa RNA nya dapat digunakan. Riboprobes dapat meningkatkan sensitivitas dibandingkan dengan probe DNA, tetapi mereka kurang stabil dalam arti menjadi subyek dengan kerusakan oleh RNases.

PENCUCIAN Setelah hibridisasi, unhibridisasi probe dihilangkan dengan mencuci dengan buffer. Mencuci strigensi rendah (misalnya, dengan 2X SSC atau SSPE) menghilangkan larutan hibridisasi dan probe unhibridisasi.  Mencuci strigenci tinggi (misalnya, dengan 0.1X SSC atau SSPE) menghilangkan sebagian molekul hibridisasi. 

DETEKSI Jika probe radiolabeled selesai digunakan, blot dapat dibungkus dalam bungkus plastik agar tidak kering dan kemudian segera menggunakan film untuk autoradiografi.  Jika menggunakan probe nonisotopic, blot harus diperlakukan dengan reagen deteksi nonisotopic sebelum terkena film. 

DETEKSI Deteksi dicapai baik dengan radioaktivitas atau dengan non-radioaktif.  Dengan radioaktivitas, probe ditandai dengan 32P (atau 33P).  Dengan non-radioaktiv, deteksi dilakukan dengan pewarnaan. Salah satunya dengan teknik chemiluminescence, deteksi juga mungkin didasarkan pada fluoresensi, tapi ini memerlukan substansial investasi dalam instrumentasi khusus. 

TAHAPAN NORTHERN BLOT DALAM JURNAL

Biji tanaman yang sedang imbibisi atau akaar, batang, daun, atau bunga dari tanaman yang sudah matang Menggunakan metode phenol-SDS

Isolat Total RNA Seleksi mRNA

Poly (A+)RNA Elektroforesis Probing generate

Fragmen RNA Transfer RNA dari gel ke membran Hibridisasi deteksi

Hasil blotting

PROBING 







untuk RNA probe synthesis, 598 bp fragment dari Cmchi1 cDNA yang sudah diamplifujasi dengan primer 48EM dan 48RV. 527 bp fragment telah diamplifiksi dari Cmchi2 cDNA dengan primer 24DM and 24RV. T7 promoter diligasi ke setiap fragmen dari kedua fragmen tadi (Lign’s Kit, Ambion), dengan template untuk amplifikasi PCR menggunakan T7 adapter primer 1 (Lign’s Kit, Ambion) and a gen-specific primer (48EM from Cmchi1 and 24DM from Cmchi2). DIG-labelled RNA probe disintes menggunakan produk PCR yang tadi sebagai template (DIG RNA Labeling Kit, Roche Molecular Biochemicals).

PEMISAHAN DAN TRANSFER 







 

Poly(A+) RNA (1.75–5 ìg) dipisahkan dengan elektroforesi gel dalam1% agarose gel yang mengandung 1× denaturing gel buffer (ada dalam Northern MaxKit, Ambion) selama 2 jam dengan 70 V. RNA ditransfer dan di cross-linked ke membran positif (HybondN+, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA) membran RNA-blotted di prehybridiz dengan 10 ml buffer komersial hybridisasi(Ultrahyb, Ambion) selama1 jam dan dihibridisasi dengan probe DIG-labelled RNA (0.1 nM) semalaman dengan suhu 68°C. Membran dicuci di suhu 25°C sebanyak 2 kali pada stringensi rendah untuk 5 min dan dua kali di suhu 68°C pada stringensi tinggi untuk 20 min (NorthernMax kit, Ambion). Sinyal hybridisasi didetesi menggunakan chemiluminescence Setelah deteksi, membran yang sama dikupas dan reprobed dengan DIG-label antisense-aktin 7 dari Arabidopsis thaliana probe.

HASIL NORTHERN

TERIMA KASIH