Nghiên Cứu Vai Trò Của Alginat Trong Quá Trình Tạo Nguyên Liệu Probiotics Chứa Lactobacillus Acidophilus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NINH THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALGINAT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTICS CHỨA Lactobacillus acidophilus

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NINH THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALGINAT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTICS CHỨA Lactobacillus acidophilus

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ 60720402

Người hướng dẫn khoa học: 1.

TS. Đàm Thanh Xuân

2.

ThS. Nguyễn Thị Trinh Lan

HÀ NỘI 2013

MỤC LỤC DANH MỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chương 1: TỔNG QUAN

2

1.1. Đại cương về probiotics

2

1.1.1. Khái niệm

2

1.1.2. Các vi sinh vật được sử dụng trong chế phẩm probiotics

2

1.1.3. Cơ chế tác dụng

4

1.1.3.1. Cơ chế tác dụng

5

1.1.3.2. Ứng dụng của probiotics

5

1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotics trên thế giới 1.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotics ở Việt Nam 1.3. Lactobacillus acidophilus

5

10

1.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý

10

1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat

11

1.3.3. Các dạng chế phẩm probiotics chứa L. acidophilus

11

1.4.

12

Alginat

7 7

1.4.1. Tính chất

12

1.4.2. Ứng dụng

13

1.4.3. Một số nghiên cứu sử dụng alginate trong bào chế probiotics

13

1.5.

Phương pháp đông khô

15

1.5.1. Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô

16

1.5.2. Ứng dụng

16

1.5.3. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật

16

1.6.

19

Nang cứng

1.6.1. Đặc điểm dạng thuốc nang cứng

19

1.6.2. Đánh giá chất lượng nang cứng

20

Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị

21

2.1.1. Nguyên vật liệu sử dụng

21

2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

22

2.1.3. Các dung dịch và hỗn dịch sử dụng trong nghiên cứu

22

2.1.4. Thiết bị

22

21

Phương pháp nghiên cứu

23

2.2.1. Phương pháp nhân giống

23

2.2.2. Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối

23

2.2.3. Phương pháp đông khô

24

2.2.4. Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall

25

2.2.5. Phương pháp tạo thuốc bột chứa L. acidophilus

25

2.2.6. Phương pháp tạo nang cứng chứa L. acidophilus

25

2.2.7. Phương pháp xác định hàm ẩm

25

2.2.

2.2.8. Phương pháp xác định số lượng VSV theo nguyên tắc pha loãng liên tục

26

2.2.9. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống

27

sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột 2.2.10. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của alginate đến khả năng

28

sống sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình đóng thuốc nang cứng Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

30

3.1.

Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong quá trình đông khô

30

3.1.1. Đánh giá thể chất của các nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus tạo thành sau khi đông khô

30

3.1.2. Đánh giá độ ẩm và tốc độ hút ẩm của các mẫu đông khô vi sinh vật với tá dược bảo vệ là sữa gầy và alginate

33

3.1.3. Khảo sát số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sống sót sau đông khô

36

3.1.4. So sánh khả năng sống sót của vi sinh vật trong nguyên liệu đông khô có và không có kết hợp alginate và sữa gầy

39

3.2.

Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột và đóng nang cứng

42

3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi khuẩn L. acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột

43

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi khuẩn L. acidophilus trong quá trình tạo nang cứng

45

Chương 4: BÀN LUẬN

48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

55

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B. subtilis

: Bacillus subtilis

Cfu (Colony- Forming Units)

: Số đơn vị khuẩn lạc

FAO (Food and Agriculture Organization)

: Tổ chức nông lương thế giới

Glass : một trạng thái nhiệt động quá bão hòa không bền với độ nhớt cao HDL (High density lipoprotein)

: Lipoprotein tỉ trọng cao

HDSK

: Hỗn dịch sinh khối

IDF (Internation Dairy Federation)

: Liên đoàn bơ sữa thế giới

Kl/kl

: Khối lượng/khối lượng

Kl/tt

: Khối lượng/thể tích

L. acidophilus

: Lactobacillus acidophilus

LAB (Lactic acid bacteria)

: Nhóm vi khuẩn lactic

LDL (Low density lipoprotein)

: Lipoprotein tỉ trọng thấp

MRS (de Man, Rogosa, Sharpe)

: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

MT

: Môi trường

PPI (Proton Pump Inhibitor)

: Ức chế bơm proton

S. boulardii

: Saccharomyces boulardii

Tt/kl

: Thể tích/khối lượng

VSV

: Vi sinh vật

WHO (World Health Organization)

: Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng

STT

Trang

Bảng 1.1 Các thế hệ bào chế của chế phẩm chứa probiotics

7

Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotics trên thị trường Việt Nam

9

Bảng 1.3 Cơ chế bảo vệ của tá dược trong quá trình đông khô

17

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

21

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

22

Bảng 3.1 Thể chất của các mẫu đông khô L. acidophilus với các tá

31

dược bảo vệ tại thời điểm ngay sau khi đông khô Bảng 3.2

Biến thiên hàm ẩm (%) của một số mẫu đông khô L.

34

acidophilus với tá dược bảo vệ khác nhau theo thời gian Bảng 3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót trong 4 mẫu sau đông khô

37

Bảng 3.4 Tỷ lệ VSV sống sót sau đông khô so với mẫu ban đầu

37

Bảng 3.5 Hàm ẩm của các mẫu đông khô với tá dược bảo vệ là hỗn

40

hợp sữa gầy với alginate ở các nồng độ Bảng 3.6 Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột sau đông khô

41

trong các mẫu đông khô sử dụng kết hợp alginate và sữa gầy. Bảng 3.7 Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột đông khô

44

Bảng 3.8 Số lượng vi sinh vật sống sót trong 1 viên nang trong môi

45

trường acid HCl pH 1,2 với tốc độ khuấy 50 v/phút Bảng 3.9 Tỷ lệ vi sinh vật sống sót của mẫu alginate so với mẫu tinh bột trong môi trường pH 1,2

46

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Tên bảng

STT

Trang

Hình 1.1

Hình ảnh L. acidophilus trên kính hiển vi điện tử.

11

Hình 1.2

Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- D-

12

mannuronic Hình 3.1

Hình ảnh mẫu đông khô với nước cất.

32

Hình 3.2

Đồ thị biểu thị hàm ẩm trung bình của các mẫu ngay sau

34

đông khô và trong thời gian bảo quản. Hình 3.3

Hình ảnh mẫu đông khô với alginate ngay sau khi tháo khỏi

35

máy và sau 3 phút để ngoài môi trường. Hình 3.4

Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn L. acidophilus sống sót

38

trong các mẫu sau đông khô Hình 3.5

Hàm ẩm của các mẫu đông khô với tá dược bảo vệ là hỗn

40

hợp sữa gầy với alginate ở các nồng độ Hình 3.6

Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột sau đông khô

42

trong các mẫu đông khô sử dụng kết hợp alginate và sữa gầy. Hình 3.7

Biểu đồ thể hiện số lượng vi sinh vật sống sót sau khi thử

44

trong môi trường acid HCl pH 1,2 Hình 3.8

Số lượng vi sinh vật sống sót trong 1 viên nang trong môi trường acid HCl pH 1,2 với tốc độ khuấy 50 v/phút

46

LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng và long biết ơn sâu sắc tôi xin g i l i c Thanh Xuân và ThS. Nguyễn Thị Trinh Lan, nh ng ng và ch b o cho tôi t nh ng b ớc

i th

ơn ến TS. Đàm t n t nh h ớng

u ti n cho ến khi tôi hoàn thi n lu n văn nà

Đồng th i, tôi xin g i l i c

ơn tới Ds. Lê Ngọc Khánh cùng các th

các anh chị kỹ thu t vi n trong bộ ôn Công Nghiệp Dược

hân ịp nà tôi c ng xin g i l i c cô giáo tr

ng Đại học

c

tôi trong th i gian tôi học t p tại tr Và cuối c ng là l i c

ơn ến an giá

à ội

ạ

và tạo

cô giáo,

tạo ọi iều ki n giúp ỡ

tôi trong suốt quá tr nh thực hi n ề tài, ch b o tôi trong th i gian là thực nghi

th

n

.

hi u c ng toàn th các ọi iều ki n thu n l i cho

ng

ơn tôi g i tới Mẹ của tôi, gia

nh, ng

i thân và bạn b

ộng vi n, giúp ỡ tôi trong suốt quá tr nh học t p và hoàn thành lu n văn tốt nghi p o th i gian là thực nghi nà c n c nhiều thiếu s t kh a lu n

ôi r t

c ng nh kiến th c của b n thân c hạn, kh a lu n ong nh n

c sự g p

của các th

c hoàn thi n hơn

ôi xin chân thành c

ơn

à ội, ngà 30, tháng , nă ọc viên s

inh hị Kim Thu

cô, bạn b

ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotics thuộc nhóm các vi sinh vật sống không thể thiếu đối với sức khỏe con người. Những vi sinh vật này đưa vào cơ thể khi còn sống với một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ. Chúng thường được bổ sung kèm với chế độ ăn hoặc qua các chế phẩm chứa probiotics. Vi sinh vật hay được sử dụng nhất trong các chế phẩm probiotics là nhóm vi sinh vật sinh acid lactic, mà trong đó điển hình là Lactobacillus acidophilus. Tuy nhiên, probiotics kém ổn định do bất lợi của điều kiện bảo quản cũng như hàng rào sinh học của vật chủ. Do vậy, các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới hiện nay đều được thực hiện với mục tiêu giúp ổn định vi sinh vật. Trong đó, alginat là tá dược được nghiên cứu nhiều nhất trên thế giới. Nhưng trong nước các nghiên cứu về tá dược này còn rất hạn chế. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: N p ob o

a alginat s

o

q á

ì

ạo

y

Lactobacillus acidophilus”.

Với các mục tiêu: alginat . alginat ộ

1

à

lệ

C ươ 1.1.

Đạ ươ

1. TỔNG QUAN

ề probiotics

1.1.1. Khái niệm Probiotics bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “sự sống”. Khái niệm probiotics đầu tiên xuất phát từ nhà khoa học Eli Metchnikoff, trong cuốn sách “Kéo dài sự sống” của ông đưa ra 1908. Ông cho rằng những người nông dân Bulgary sống lâu là vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic, các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đường ruột. [55] Thuật ngữ “probiotics” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi Kollath. Probiotics được định nghĩa là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn, kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác”. [55] Năm 1974, Parker đã phát triển định nghĩa này, ông cho rằng probiotics là “những vi sinh vật và những cơ chất giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột”. Sau đó đến năm 1989, Fuller đã thay đổi định nghĩa này, ông cho rằng probiotics là “thực phẩm” bổ sung một số vi sinh vật sống có ích cho vật chủ nhằm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột của nó. Định nghĩa này nhấn mạnh vai trò khả năng sống của vi sinh vật. Năm 1998, Salminen đã định nghĩa probiotics là “những thực phẩm chứa vi khuẩn sống ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ”. Năm 2002 Marteau đã định nghĩa probiotics hoàn chỉnh hơn “probiotics là những chế phẩm chứa tế bào vi sinh vật hay những thành phần của tế bào vi sinh vật mà ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ”. [23], [55] Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Lương thực thế giới (FAO) đưa ra định nghĩa probiotics được coi là hoàn chỉnh nhất hiện nay: “Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với lượng phù hợp sẽ đem lại lợi ích cho sức khỏe của sinh vật chủ”. [23], [55] 1.1.2. Các vi sinh vậ

ợc sử dụng trong ch ph m probiotics

Probiotics được chia làm 3 nhóm chính sau [6]: 2

- Nhóm vi khuẩn lactic (chiếm phần lớn): gồm 2 chi phổ biến là chi Lactobacillus và Bifidobacterium. - Nhóm không phải vi khuẩn lactic: + Chi Propionibacterium: P. freudenreichii, P. cyclohexanicum,... + Chi Bacillus: B. subtilis, B. clausii,... + Chi Brevibacillus: B. laterosporus,… + Chi Sporolactobacillus: S. laevolacticus,… + Chi Escherichia: E. coli,... - Nhóm nấm men: chủ yếu là chi Saccharomyces cerevisiae. Việc lựa chọn các vi sinh vật trên dùng làm nguyên liệu probiotics đều phải dựa vào các tiêu chí sau:  Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ  Chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non  Không sinh độc tố và không gây bệnh cho vật chủ  Có khả năng sinh enzym, chất kháng sinh hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng được  Có khả năng sống và cư trú trong ruột  Dễ nuôi cấy và có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài L. acidophilus là trực khuẩn chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật có ích cư trú ở đoạn trên của ống tiêu hóa. Nó có khả năng làm giảm số lượng các vi sinh vật hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase - một enzym quan trọng trong chuyển hóa sữa; có liên quan đến quá trình sản xuất một số vitamin nhóm B như: niacin, acid folic, pyridoxin; tăng cường chức năng của hệ thống miễn dịch; giảm sự tiêu diệt vi sinh vật có ích do sử dụng kháng sinh dài ngày.[6] Với các đặc điểm trên, L. acidophilus là vi sinh vật được lựa chọn đầu tiên để sản xuất các chế phẩm probiotics. 3

1.1.3. Cơ

tác dụng c a probiotics

1.1.3.1. Cơ

tác dụng [3],[4],[6],[7]

- Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám: Probiotics cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng với các vi khuẩn gây bệnh để duy trì và phát triển. Bằng cách chiếm lĩnh và bám chặt vào thành ruột, probiotics ngăn ngừa các vi khuẩn có hại tấn công và phát triển. - Tăng cường chức năng chống đỡ của niêm mạc ruột: Probiotics sống tại đường ruột cũng đồng thời tăng cường chức năng chống đỡ của niêm mạc ruột và giảm thiểu sự di chuyển của các vi khuẩn và kháng nguyên từ ruột vào mạch máu. Chức năng này giúp giảm sự nhiễm khuẩn và dị ứng đối với các kháng nguyên có trong thực phẩm. - Sản sinh ra các chất ức chế: Một số probiotics sản sinh ra các kháng sinh như bacteriocins giúp ngăn ngừa và tiêu diệt mầm bệnh. Trong quá trình lên men đường, các thành phần khác nhau của probiotics sản sinh ra acid lactic giúp làm giảm pH của ruột và ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn không cần thiết. Một số sản phẩm sinh ra trong quá trình trao đổi chất, quá trình lên men chuyển hóa carbohydrat như butyrat và acid butyric có khả năng chống ung thư. - Kích thích đáp ứng miễn dịch: Probiotics có khả năng làm tăng cả phản ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằng cách kích thích các tế bào phản ứng miễn dịch (macrophases, lymphocytes) và tăng cường sự sản xuất ra các thành phần miễn nhiễm (cytolines, immunoglobulins, interferon). - Tăng cường chức năng tiêu hóa: Probiotics trong ruột non giúp giảm lượng mật trong cơ thể và giảm cholesterol. Probiotics sản sinh ra các enzym khắc phục quá trình tiêu hủy carbohydrate và làm thuận tiện hơn quá trình ruột hấp thụ năng lượng từ các chất dinh dưỡng. Probiotics cũng đồng thời lên

4

men những carbohydrat không tiêu hóa được trong ruột non và sản xuất ra vitamin B, K. 1.1.3.2. Ứng dụng c a probiotics: Probiotics được ứng dụng:  Trong các bệnh tiêu hóa [16], [20], [27] - Tăng khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzym khác - Hỗ trợ trong điều trị tiêu chảy do sử dụng kháng sinh - Tác dụng lên Helicobacter pylori  Tăng cường miễn dịnh [22], [39] - Kích thích miễn dịch niêm mạc - Tăng cường miễn dịch, giảm phản ứng dị ứng - Giảm nguy cơ nhiễm vi khuẩn, nấm - Giảm nguy cơ mắc ung thư  Chống tăng huyết áp, giảm cholesterol máu [14], [26]  Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản 1.2. Tình hình nghiên c u và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Tình hình nghiên c u s n xuất và sử dụng các ch ph m probiotics trên th giới Việc sử dụng thực phẩm có probiotics (như 1 thành phần tự nhiên của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotics mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thể kỷ 20. Những nghiên cứu về đặc điểm phân loại và quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởi Apajalahti và cs (1998) [13]; Vander Wielen và cộng sự (2000) [49] đã cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus. Bằng kỹ thuật gen, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài vi sinh 5

vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn probiotics. Netherwood và cs (1999) [38]; Gong và cs (2002) [23]; Zhu và cs (2002) [54] đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của probiotics. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ. Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotics đối với đời sống động vật như tác động của probiotics đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Mayer, 1991)[46]; (Hersbberg và Mayer, 2000) [25] đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (McCracken và Lorenz, 2001). [37] Những ảnh hưởng có lợi của probiotics thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotics còn rất hạn chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotics trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh...), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột. [22], [40] Đa phần các sản phẩm probiotics sử dụng theo đường uống, chúng phải chịu tác dụng của dịch vị, cũng như của acid mật vì thế vi sinh vật bị chết rất nhiều và không đến ruột được hoặc đến ruột với số lượng rất ít không đủ gây tác dụng. Việc đảm bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản xuất, bảo quản, lưu hành, và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản, do vậy đã có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau như cải tiến phương pháp đông khô tạo bột [32], [33], áp dụng phương pháp lên men 2 bước, phương pháp vi nang hóa [15], [21], phương pháp sử dụng kết hợp với tá dược bảo vệ [41], 6

[42]. Việc bảo vệ các vi sinh vật probiotics để chúng sống sót và phát huy tác dụng khi đến ruột là một vấn đề quan trọng và đang được giải quyết. 1.2

T

Vệ

am

x ấ à ử ụ

m

Ở nước ta, các chế phẩm probiotics đã chiếm lĩnh thị trường hơn 10 năm; tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất probiotics phục vụ cho đời sống còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây. Đến nay, trên thị trường nước ta đã có mặt các sản phẩm probiotics của bốn thế hệ bào chế như sau: [6] Bả T ế ệ

1.1: Cá

ế ệ bào

Đặ đ ểm VSV

T ế ệ 1 VSV sống (trong (Non-

sữa chua, phomat,

coated)

kim chi, …) Bào tử VSV.

ế

ế p ẩm

p ob o

s

Ư đ ểm

N ượ đ ểm

Giá rẻ → sử dụng

VSV gần như không

nhiều.

sống sót khi qua dạ dày và dịch mật.

Thuận lợi cho nuôi

Mất nhiều thời gian

cấy, sản xuất, lưu

phát triển thành VSV →

hành.

chậm tác dụng, hạn chế khả năng cạnh tranh với VSV gây bệnh.

Probiotics đông

Tỉ lệ sống ở nhiệt

Tỷ lệ VSV bị chết vẫn

khô.

độ thường cao hơn

cao.

T ế ệ 2 VSV đưa vào dưới Bảo vệ VSV khi đi

Mất thời gian màng bao

Enteric-

dạng viên nén,

qua dạ dày và dịch

tan rã để giải phóng

coated

viên nang có lớp

mật.

VSV.

bao ngoài tan trong ruột. 7

T ế ệ 3 Dạng bao vi nang.

Hoàn thiện ý tưởng Chưa khắc phục được

Micro-

của thế hệ 2.

nhược điểm của thế hệ

encapsul

2: khả năng phóng thích

ated

tại ruột chưa tốt, tan chậm trong ruột.

T ế ệ 4 Lớp bên trong là

VSV có tỷ lệ sống

Đòi hỏi công nghệ cao,

Dual –

protein, lớp ngoài

cao. Chịu được

kỹ thuật bào chế hiện

coated

là polysaccharid.

acid dịch vị và

đại, trang thiết bị đắt

muối mật. Lớp bao

tiền.

bên trong có tính

Giá thành cao.

thúc đẩy phóng thích VSV tại đích. Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotics ở nước ta là Công ty TNHH một thành viên Pasteur Đà Lạt, Công ty TNHH một thành viên vaccin và sinh phẩm Nha Trang, với một số chế phẩm quen thuộc trên thị trường như Enzym biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver. Tuy nhiên, nguyên liệu chủ yếu trong các chế phẩm probiotics của Công ty TNHH một thành viên Pasteur Đà Lạt cũng như công ty TNHH một thành viên vaccin và sinh phẩm Nha Trang đều là chủng vi sinh vật Bacillus subtilis. Và mới đây đã xuất hiện thêm công ty ANABIO R$D, có nhà máy sản xuất nguyên liệu probiotics hiện đại không kém so với các nước trên thế giới. Ngoài việc sản xuất nguyên liệu probiotics cổ điển trong nước như nguyên liệu chứa chủng vi sinh vật Bacillus subtilis, ANABIO còn có thêm nguyên liệu chứa các chủng vi sinh vật lactic. Do vậy, thị trường chế phẩm probiotics không chỉ lớn về số lượng mà còn đa dạng về chủng loại vi sinh vật, đồng thời giá thành sản phẩm các chế phẩm probiotics đã được hạ nhiều lần, người sử dụng có thể sử dụng 8

sản phẩm chất lượng cao mà giá thành lại rẻ. Tuy nhiên, sản phẩm ở đây vẫn chủ yếu thuộc thế hệ 1 nên khả năng bảo vệ VSV vẫn còn rất thấp (Bảng 1.2.) B ng 1.2: Một số chế phẩm probiotics trên thị trường Việt Nam STT T ế B ệ dượ

T à

p ầ

à dạ

bào

ế

N à sả x ấ

ệ 1

1

L-Bio-3D

300mg vi khuẩn: L. acidophilus, Me-Auspharm B. longum, L. rhamnosus

2

1

Antibio

– Việt Nam

Gói bột uống 1g chứa 108 cfu L. Organon – Mỹ acidophilus

3

1

Biosubtyl

Gói 1g chứa 107 - 108 vi khuẩn B. Viện vaccin

LD

subtilis và L. acidophilus

Đà Lạt – Việt Nam

4

1

Biolacto

Viên nang chứa ít nhất 108 vi Union – Mỹ khuẩn L. acidophilus và L. bul garicus

5

1

Lactomed

Viên nang 320 mg chứa:

II Dong - Hàn

L. bifidus 2 ×106 vi khuẩn

Quốc

L. acidophilus 2 × 106 vi khuẩn Streptococcus faecalis 2 × 106 vi khuẩn 6

1

Ultraflore

Viên nang 0,2 g chứa 2 × 109 nấm Sobio – Pháp men Saccharomyces cerevisiae

7

8

1

1

Antibio

Viên nang chứa 2 × 108 – 2 × 109 Lyocentre –

-philus

vi khuẩn L. acidophilus

Probio

Gói bột đông khô chứa 109 L. Imexpharm –

9

Pháp

acidophilus 9

2

Abiiogran

Việt Nam

Thuốc cốm, 1g chứa 108 cfu L. Dae Han New acidophilus

Pharm – Hàn Quốc

10

3

Lactomin Hỗn hợp Probiotics bao vi nang chứa L. acidophilus, B. longum, L.

Austrapharm

rhamnosus 300 mg

– Việt Nam

Laclean

Bột cốm pha hỗn dịch chứa Lactic

Cell-biotech –

gold

Acid Bacteria 1,25 x 109,

Hàn Quốc

plus

11

4

Mebipharm-

L.acidophilus (100 tỉ cfu/g); L. rhamnosus (100 tỉ cfu/g); B. longum (50 tỉ cfu/g); B. bifidum (50 tỉ cfu/g); Enterococcus faecium (100 tỉ cfu/g) 12

4

Kidlac

Bột cốm pha hỗn dịch uống:

Cell-biotech –

Lactic Acid Bacteria 0,5 x 109, L.

Hàn Quốc

acidophilus (100 tỉ cfu/g), B. longum (50 tỉ cfu/g), B. breve (50 tỉ cfu/g), Enterococcus faecium (100 tỉ cfu/g)

1.3.

Lactobacillus acidophilus

1.3.1. Đặ

ểm hình thái, sinh lý

L. acidophilus thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic, là trực khuẩn Gram dương, kích thước từ 0,6 – 0,9 × 1,5 – 6,0 µm, mọc đơn hoặc đôi hoặc tạo chuỗi ngắn, không có bào tử, không di động, kỵ khí không bắt buộc, phản 10

ứng catalase âm tính, phát triển tối ưu ở 370C, không phát triển ở 20 – 220C hoặc ở nhiệt độ cao hơn 480C [4], [12], [44].

Hình 1.1: Hình ảnh L. acidophilus trên kính hiển vi điện tử.

1.3.2. Kh

yển hóa carbohydrat

L. acidophilus chuyển hóa glucose, lactose, sucrose sinh acid lactic, nhưng không sinh khí; không chuyển hóa glycerol, erythritol, D-arabinose, Larabinose, D-ribose, D-xylose. [6], [12] 1.3.3. Các dạng ch ph m probiotics ch a L. acidophilus Trên thị trường dược phẩm hiện nay, các chế phẩm chứa L. acidophilus chủ yếu là dược phẩm và thực phẩm chức năng bào chế dưới dạng bột, cốm, nang cứng. Khác với chế phẩm khác, chế phẩm probiotics phải duy trì số lượng VSV sống sót nhất định trong thời hạn sử dụng cũng như trong hệ thống tiêu hóa của người sử dụng. Do đó, phương pháp sản xuất và thành phần chế phẩm probiotics được cải biến khác so với chế phẩm thông thường. Về thành phần, chế phẩm probiotics thường có thêm các tá dược bảo vệ như chất xơ, đường,… Về phương pháp sản xuất nguyên liệu, hiện nay có rất nhiều phương pháp sản xuất nhằm tăng khả năng bảo vệ VSV. Điển hình là phương pháp bẫy bằng cách tạo vi nang [21], phương pháp phun sấy [15],…Trong đó, một trong những phương pháp tỏ ra hiệu quả và được sử dụng nhiều là phương 11

pháp đông khô. Phương pháp đông khô giúp cho VSV ổn định và giúp VSV có tỷ lệ sống sót cao trong thời gian bảo quản. [17] 1.4.

Alginate

1.4.1. Tính chất Alginate có nguồn gốc chủ yếu là từ tảo nâu, rong mơ. Alginate là tên chỉ chung acid alginic và 1 số muối của nó như natri alginate, kali alginate. Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M).[43]

Acid α – L – Guluronic

Acid β – D – Mannuronic

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- Dmannuronic Tùy theo nguồn gốc của alginate mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau. Điều này làm cho tính chất của alginate biến đổi trong một dải rộng. Muối natri của acid alginic dễ hút ẩm, tuy nhiên khá ổn định nếu được bảo quản trong điều kiện mát mẻ và độ ẩm tương đối thấp. Dung dịch Natri alginate ổn định nhất ở pH 4÷10, ở pH < 3 acid alginic bị kết tủa lại, hấp tiệt khuẩn có thể làm giảm độ nhớt của dung dịch [24], [43], [50].

12

Thực tế natri alginate không tan trong ethanol (95%), ether, chloroform, và hỗn hợp ethanol nước có chứa hơn 30% ethanol. Không tan trong các dung môi hữu cơ khác và trong dung dịch acid có pH 70oC) nên các chuỗi polymer này một phần bị đề polymer hóa làm giảm độ nhớt của dung dịch polymer trước khi kết hợp với sinh khối và cũng là lí do các mảng nguyên liệu đông khô tạo thành khi đông khô với alginate không có cấu trúc mảng dài mà chỉ là các cấu trúc dạng mảng xốp, ngắn (vài mm). Và chính cấu trúc dạng chuỗi polymer của alginate khiến cho nguyên liệu tạo thành khó có thể được làm nhỏ thành dạng bột mịn. Khác với việc sử dụng alginate trong đông khô, khi sử dụng alginate làm tá dược để vi nang hóa, sản phẩm probiotics được tạo ra có thể chất tốt hơn. Cụ thể, trong thí nghiệm của Asma Sohail và cộng sự [15], vi nang chứa probiotics được tạo thành bởi alginate 2% và CaCl2 bằng phương pháp phun sấy có kích thước phân bố đồng đều từ 10 – 40 µm và hình dạng tròn đều đẹp. 48

Tóm lại, sử dụng dung dịch alginate làm tá dược trong đông khô giúp thu được một mẫu nguyên liệu có thể chất xốp, dễ dàng lấy ra khỏi dụng cụ chứa hơn so với các mẫu không sử dụng tá dược. Tuy nhiên sử dụng alginate làm tá dược trong đông khô sẽ tạo ra nguyên liệu nhanh bị hút ẩm, khó phân tán nhỏ thành dạng bột mịn, việc này dẫn đến khó đồng nhất giữa số lượng VSV probiotics các lô mẻ trong quá trình bào chế tạo sản phẩm tiếp theo. 4.1.2. Đ ớ

ộ m à ợ

ệ à ữ

ộ ú

m

mẫ

ậ

ầy à alginate

Hàm ẩm và tốc độ hút ẩm của mẫu đông khô với alginate 2% ngay sau đông khô và trong thời gian bảo quản 2 tuần đều lớn hơn so với mẫu đông khô với sữa gầy 10%, đặc biệt chỉ trong 2 tuần bảo quản hàm ẩm của mẫu đông khô với alginate 2% đã lên tới khoảng 13%, trong khi đó hàm ẩm của mẫu đông khô với sữa gầy 10% vẫn đạt tiêu chuẩn nhỏ hơn 5%. Trong hình 3.3 cho thấy mẫu đông với alginate hút ẩm rất nhanh, ngay sau 3 phút đã chuyển từ dạng tơi xốp sang dạng dẻo. Điều này có thể giải thích là do natri alginate là muối của acid alginic, alginic là acid được cấu tạo bởi các gốc uronic. Gốc uronic chứa nhiều nhóm phân cực, ưa nước [43], do vậy tốc độ hút ẩm của alginate ngoài môi trường rất nhanh. Hàm ẩm 13% sau thời gian bảo quản 2 tuần là quá lớn, không đảm bảo được tiêu chuẩn của nguyên liệu, do vậy không sử dụng riêng alginate 2% làm tá dược trong quá trình đông khô được, có thể kết hợp bổ sung với sữa gầy hoặc các tá dược khác. Về tiêu chí hàm ẩm nguyên liệu, sữa gầy vẫn đạt. Do vậy, sữa gầy là một trong những lựa chọn đầu tiên làm tá dược bảo vệ VSV trong khi đông khô. Còn theo nghiên cứu của Lim Chi Ming, sữa gầy có tác dụng bảo vệ VSV trong quá trình đông khô là do protein trong sữa gầy tạo thành lớp áo bảo vệ trên thành tế bào và cung cấp chất đệm giúp ổn định pH trong suốt quá trình đông khô [32]. Trên thực tế, trong các chế phẩm đông khô, sữa gầy 49

thường được sử dụng kèm thêm với các nhóm tá dược khác như carbohydrat, polymer, polyols, aminoacid,… để tăng cường tác dụng bảo vệ VSV [17]. 4.1.3. K

ợ

.

Kết quả khảo sát tỉ lệ sống sót của L. acidophilus sau đông khô cho thấy khi sử dụng chất bảo vệ là hỗn dịch sữa gầy10% cho số lượng vi sinh vật sống sót cao nhất (khoảng 108), tiếp theo là mẫu đông khô với dung dịch alginate (khoảng 107), mẫu đông khô với dịch lên men (106), mẫu đông khô với nước cất (105). Kết quả này tương tự với kết quả của Lim Chi Minh và cộng sự thực hiện năm 2008 [32]. Theo kết quả công bố của Lim Chi Minh, tỷ lệ sống sót của VSV sau đông khô của sữa gầy (13,03%) cũng cao hơn so với nước cất (0,07%). Đặc biệt, theo Lim Chi Minh, tỉ lệ sống sót của VSV sau khi đông khô với nước (0,07%) tương đương với kết quả nghiên cứu trên chủng vi sinh vật khác cũng thuộc chi Lactobacillus là Lactobacillus salivarius với nước (0,08%). Tác dụng bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô có thể được giải thích như sau: Natri alginate có cấu trúc polyme nên sẽ trương nở trong nước, tạo ra được xung quanh và bên trong tế bào VSV một môi trường có độ nhớt tương tự giúp giảm thiểu biến đổi cấu trúc phân tử ở mức thấp nhất [32]. Với sữa gầy có thành phần chủ yếu gồm lactose và protein chính là những yếu tố quyết định khả năng bảo vệ của chúng. Protein có trong sữa tạo ra môi trường có độ nhớt cao giúp bảo vệ cấu trúc tế bào vi sinh vật, trong khi thành phần lactose sẽ tạo liên kết hydro giữa đường - protein, liên kết này giúp ổn định protein tế bào, giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại đi. Sự ổn định màng tế bào và protein cấu trúc bằng liên kết hydro của các disaccharid còn được gọi là “lí thuyết thay thế nước” [17]. Còn theo nghiên cứu khác thì protein trong sữa gầy có thể tạo nên một lớp áo bảo vệ 50

trên thành tế bào. Trong sữa gầy còn chứa nhiều chất tan như muối phosphat, citrat có khả năng đệm giúp ổn định pH mẫu khi mà dung môi mất dần trong quá trình đông khô [32]. Như vậy, alginate có tác dụng bảo vệ Lactobacillus acidophilus trong quá trình đông khô. Khi đông khô với tá dược là alginate 2% cho tỉ lệ sống sót của L. acidophilus là 1,90% cao gấp 27,1 lần so với mẫu chứng đông khô với nước cất, và cao gấp 7,91 lần so với mẫu đông khô với dịch li tâm. Tuy nhiên tỉ lệ sống của L. acidophilus trong mẫu đông khô với alginate còn kém sữa gầy nhưng vẫn đạt số lượng vi sinh vật là 107. 4.1.4. S

ậ à

ợ alginate à ữ

y

ệ

ầy

Khi kết hợp sữa gầy với alginate với tỷ lệ tăng dần đến 5%, không thấy có sự gia tăng về tỷ lệ sống sót của VSV. Mặt khác, việc kết hợp này làm cho quá trình bào chế phức tạp hơn nên việc kết hợp với alginate với tỷ lệ như trong thí nghiệm này là không khả thi. Dianawati Dianawati và cộng sự cũng thực hiện nghiên cứu năm 2012 [19] về phối hợp các tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô, đó là đánh giá tác dụng bảo vệ của việc phối hợp 5 loại protein và 3 loại đường đối với B. longum trong quá trình đông khô. 5 loại protein được nghiên cứu là natri caseinate 12%, whey protein 12%, natri caseinate:whey protein 6%:6%, sữa gầy 12%, dầu đậu nành 12% được phối hợp lần lượt với 3 loại đường là glycerol (3% kl/tt), mannitol (3% kl/tt), maltodextrin (3% kl/tt) tạo ra 15 dịch nhũ tương. Lượng B. longum và nhũ tương được đưa vào khi đông khô theo tỷ lệ 1:4. Kết quả cho thấy nhũ tương phối hợp giữa whey protein – natri casenate và Glycerol giúp VSV có tỷ lệ sống sót cao sau đông khô, đạt 99,2%. Còn đối với nhũ tương phối hợp giữa natri casemate và manitol, tỷ lệ VSV sống sót sau đông khô, sau quá trình tiếp xúc với acid và sau quá trình tiếp 51

xúc với muối mật lần lượt là 97,4%, 81,6% và 99,3%. Kết quả cuối cùng cho thấy sữa gầy có tác dụng bảo vệ vượt trội so với dầu đậu nành và loại đường có nhiều nhóm OH bảo vệ tốt hơn maltodextrin [19]. Điều này lại khẳng định một lần nữa tác dụng bảo vệ VSV vượt trội của sữa gầy trong quá trình đông khô. 4.2.

Nghiên c u ả

ưởng c a alginate đến khả ă

khuẩn L. acidophilus trong quá trình đó 4.2.1. N k

ả

ẩ L. acidophilus

ưở o

thuốc bộ

à đó

alginate đế k ả ă q á

ì

ạo

sống sót c a vi c ng số

só

ố bộ

Theo kết quả nghiên cứu cho thấy alginate có tác dụng bảo vệ VSV tốt hơn so với tinh bột trong môi trường pH 1,2. Tác dụng bảo vệ của alginate trên các vi sinh vật trong điều kiện acid pH thấp của dạ dày có thể giải thích như sau: khi tiếp xúc với dung dịch acid pH thấp muối natri alginate chuyển thành dạng acid alginic không tan. Acid alginic trương nở tạo ra một lớp màng bao quanh bột đông khô chứa vi sinh vật, cách li vi sinh vật với điều kiện bất lợi của môi trường xung quanh [30]. So sánh kết quả thí nghiệm này với kết quả trong nghiên cứu của Latha Sabikhi năm 2010 khi đánh giá khả năng bảo vệ L. acidophilus trong chế phẩm probiotics bằng phương pháp tạo vi nang với alginate. Với nguyên liệu ban đầu chứa khoảng 109 cfu/g, mẫu không được bảo vệ đều có số lượng sống sót sau 1h, 2h trong điều kiện pH 1 giảm xuống còn khoảng 105 ÷106 cfu/g (giảm khoảng 1000 lần) [31]. Ở nghiên cứu của Latha Sabikhi với phương pháp tạo vi nang bảo vệ thì sau 1h trong pH 1 số lượng Lactobacillus acidophilus LA1 giảm từ 107 cfu/g lúc ban đầu xuống còn khoảng 106 cfu/g (nghĩa là giảm khoảng 10 lần), sau 2h trong điều kiện acid pH 1, số lượng VSV của mẫu bao vi nang còn 105 cfu/g (giảm 100 lần so với ban đầu). Còn trong thí nghiệm có sử dụng alginate làm tá dược độn thì sau 1h trong môi 52

trường acid HCl pH 1,2 số lượng vi sinh vật giảm từ 1,7 x 109 cfu/g xuống còn khoảng 1,9 x 107 cfu/g (tương đương khoảng xấp xỉ 100 lần), còn tại thời điểm sau 2h lượng vi sinh vật còn lại là khoảng 1,1 x 107 cfu/g (giảm khoảng 155 lần so với ban đầu) [31]. Tóm lại, kết quả thí nghiệm cho thấy mẫu nguyên liệu sử dụng Natri alginate làm tá dược độn cho tỉ lệ sống sót trong môi trường acid pH 1,2 cao hơn so với mẫu thử với bột đông khô và mẫu bột đông khô có sử dụng thêm tá dược độn là tinh bột. Từ đó có thể sơ bộ kết luận natri alginate khi sử dụng làm tá dược độn trong chế phẩm vi sinh với tỉ lệ cao (trong thí nghiệm này là 50%) cho hiệu quả làm gia tăng tỉ lệ sống sót của L. acidophilus ATCC 4653. 4.2.2. N k

ả

ẩ L. acidophilus

ưở o

alginate đế k ả ă q á

ì

số

só

ạo

Kết quả thí nghiệm cho thấy tỷ lệ VSV sống sót trong môi trường acid pH 1,2 của mẫu nang cứng chứa alginate gấp 40 lần so với mẫu nang cứng chứa tinh bột. Điều này có thể giải thích như sau: khi tiếp xúc với dung dịch acid pH thấp muối natri alginate chuyển thành dạng acid alginic không tan. Acid alginic trương nở tạo ra một lớp màng bao quanh bột đông khô chứa vi sinh vật, cách li vi sinh vật với điều kiện bất lợi của môi trường xung quanh [30]. Do vậy, tỷ lệ VSV sống sót của mẫu sử dụng alginate lớn hơn so với mẫu sử dụng tinh bột. Mặt khác, tỷ lệ sống sót giữa 2 mẫu alginate và tinh bột trong môi trường acid pH 1,2 ở nang cứng lớn hơn so với thuốc bột. Cụ thể, đối với thuốc bột, tỷ lệ này là 40, trong khi đó đối với thuốc nang cứng tỷ lệ này là 120. Nguyên nhân là do acid alginic trương nở tạo lớp kết dính với vỏ gelatin, trong khi đó mẫu thuốc bột không có sự kết dính này nên vỏ nang nhanh bị vỡ hơn so với mẫu alginate. Sự kết hợp này làm cho tỷ lệ sống sót VSV trong mẫu alginate cao hơn nhiều lần so với mẫu tinh bột ở chế phẩm nang cứng. 53

Kết quả này cũng tương tự như kết quả của Randolph Stanley Porubcan thực hiện năm 2006 [42]. Trong nghiên cứu của Randolph Stanley Porubcan, ông cũng tạo nang cứng probiotics chứa Natri alginate với hàm lượng từ 10% đến 99%. Kết quả của nghiên cứu cho thấy số lượng VSV bị chết trong môi trường acid pH 1,6 không nhiều, cụ thể trước khi thử trong môi trường acid pH 1,6 thì số lượng cfu/ nang là 9,0x109, sau khi thử trong môi trường acid pH 1,6 trong 90 phút số lượng cfu/ nang không chứa alginate nhỏ hơn 104, còn số lượng cfu/ nang chứa alginate là 4x108 [42]. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khi sử dụng alginate làm tá dược độn trong nang cứng đã làm gia tăng tỷ lệ VSV sống sót trong môi trường acid pH thấp. Tuy nhiên, sau 2 giờ trong môi trường acid pH 1,2 cho kết quả hầu như không còn VSV sống sót. Do vậy, cần phải có biện pháp phối hợp với các tá dược bảo vệ khác hoặc thay đổi dạng bào chế để tăng tỷ lệ VSV sống sót.

54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN

I.

Đề tài đã thu được các kết quả sau: 1. Đã k 

đượ ả ẩ L. acidophilus

ưở o

alginate đế k ả ă

q á

ì

đô

số

só

k ô:

Khi sử dụng dung dịch natri alginate 2% làm tá dược bảo vệ trong quá

trình đông khô đã làm tăng tỷ lệ sống sót của L. acidophilus so với mẫu đông khô với nước cất (khoảng 27 lần). 

Thể chất của sản phẩm thu được sau đông khô với alginate 2%: khó

làm nhỏ và nhanh bị hút ẩm trở lại. 

Khi kết hợp sữa gầy với natri alginate các nồng độ 1%, 2%, 5% tạo ra

được nguyên liệu có thể chất tốt tương đương với dùng riêng tá dược là sữa gầy. Nhưng tỉ lệ sống sót lại không có thấy sự khác biệt lớn giữa các mẫu, đạt khoảng 109cfu/g. 2. Đã nghiên c u ả khuẩn L. acidophilus 

ưởng c a alginate đến khả ă o

q á

ì

đó

sống sót c a vi

thuốc bột và thuốc nang c ng

Đã đánh giá được tác dụng bảo vệ vi sinh vật của alginate khi sử dụng

làm tá dược độn cho dạng thuốc bột probiotic trong điều kiện tiếp xúc với môi trường acid HCl pH 1,2 cho số lượng vi sinh vật sống sót khoảng (10 6 ÷ 107 cfu/g) cao hơn khoảng 37 lần so với các mẫu không sử dụng thêm tá dược độn và mẫu bột đông khô có kết hợp tá dược độn thường dùng là tinh bột. 

Đã đánh giá được tác dụng bảo vệ vi sinh vật của alginate khi sử dụng

làm tá dược độn cho dạng thuốc nang cứng: trong điều kiện tiếp xúc với môi trường acid pH 1,2 với tốc độ khuấy 50 v/phút, mẫu nang cứng với alginate làm tá dược độn cho tỷ lệ VSV sống sót cao hơn 100 lần so với mẫu nang cứng với tinh bột làm tá dược độn, và tỷ lệ này cao hơn so với mẫu thuốc bột.

55

II.

ĐỀ XUẤT Do thời gian có hạn nên đề tài chưa đề cập được hết các vấn đề có liên

quan, chúng tôi đề xuất một số hướng nghiên cứu như sau: 

Nghiên cứu về độ ổn định của nang và thuốc bột với thời gian dài tới 1

năm. 

Nghiên cứu các biện pháp kết hợp tá dược alginat với các tá dược bảo

vệ khác trong quá trình tạo thuốc bột và đóng nang cứng để làm gia tăng số lượng VSV sống sót trong môi trường acid pH thấp 

Nghiên cứu một số biện pháp bào chế khác của tá dược alginat với

VSV như phương pháp vi nang hóa, phương pháp bao pellet,…

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội (2009), Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tập III. 2. Bộ y tế (2010), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học. 3. Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật Hà Nội. 4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB KHKT, tập 2, tr 68, 69, 128. 5. Đào Thị Hạnh (2012), “Nghiên cứu bào chế cốm probiotic chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus”, Luận văn thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội, trang 7-12. 6. Nguyễn Ngọc Hiệp, Bùi Tùng Hiệp (2008), “Vi sinh vật trong sản phẩm probiotic”, Tạp chí Dược học số 390. 7. Lê Gia Hy (2006), Vi sinh vật học đại cương (tập 2), Viện công nghệ sinh học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, Hà Nội. 8. Ngô Đăng Nghĩa (1999), “Tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất alginat natri từ rong mơ Việt Nam và một số ứng dụng của nó trong một số lĩnh vực sản xuất”, Luận án tiến sĩ, Trường đại học Thủy Sản. 9. Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, 33-65. 10. Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học Dược, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. 11. Trường Đại học Dược Hà Nội, Quá trình thiết bị (2010). 12. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, tập 5, tr. 129 – 154.

Tài liệu tiếng Anh 13. Apajalahti. J. H. A, L. K. Sarkilabti, B. R. E. Maki, J. P. Heikkinen, P. H. Nurminen and W. E. Holben (1998), Effective recovery of bacteria DNA and percent-guanine-plus-cytosin-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens, Appl Environ. Microbiol, 64, pp. 4084 4088. 14. A. Sibel Akalin, Siddik Gönç, Selmin Düzel (1997), “Influence of Yogurt and Acidophilus Yogurt on Serum Cholesterol Levels in Mice”, Journal of Dairy Science Volume 80, (Issue 11), Pages 2721–2725. 15. Asma Sohail, Mark S. Turner, Allan Coombes, Thor Bostrom, Bhesh Bhandari (2011), “Survivability of probiotic encapsulated in alginat gel microbeads using a novel impinging earosols method”, International Journal of Food Microbiology 145, pages 162-168. 16. C Felley, P Michetti (2003), “Probiotics and Helicobacter pylori”, Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, Volume 17, Issue 5, Pages 785791. 17. C Morgan, G Vesey (2009), Freeze-Drying of Microorganisms, Elsevier, Australia. 18. Coates D, Richardson G. (1974), “A note on the production of sterile solutions of sodium alginat”. Can J Pharm Sci 9: 60–61. 19. Dianawati Dianawati, Vijay Mishra, Nagendra P. Shah (2013), “Survival of Bifidobacterium longum 1941 microencapsulated with proteins and sugars after freezing and freeze drying”, Food Research International 51, pages 503–509 20. Drahoslava Lesbros-Pantoflickova, Ire`ne Corthe´sy-Theulaz, and Andre´ L. Blum (2007), “Helicobacter pylori and Probiotics”, The Journal of Nutrition Volume 137 no 3, 812-818.

21. Filomena Nazzaro, Florinda Fratianni, Raffaele Coppola, Alfonso Sada, Pierangelo Orlando, (2009), “Fermentative ability of alginat-prebiotic encapsulated Lactobacillus

acidophilus

and

survival

under

simulated

gastrointestinal

conditions”, Journal of Functional Food 1, 319-323. 22. Gibson. G. R and Fuller. R. (2000), “Aspect of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use”, J. Nut, 130, pp. 391-395. 23. Gong. J, Forster. R. J., Yu. H., Chamber. J. R., Sabour. P. M., Wheatcroft. R. and Chen. S. (2002), Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the muscosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen, FEMS. Microbiol. Lett, 208, pp. 1 - 7. 24. Hartman AW et al. “Viscosities of acacia and sodium alginat after sterilization by cobalt-60”. Journal of Pharmaceutical Sciences 1975; 64: 802–805. 25. Hershberg. R. M. and L. F. Mayer (2000), Antigen processing and presentation by intestinal epithelial cells – polarity and complexity, Immunol. Today 21, pp. 123 – 128. 26. James W. Anderson, MD and Stanley E. Gilliland, PhD, (1999), “Effect of Fermented Milk (Yogurt) Containing Lactobacillus acidophilus L1 on Serum Cholesterol in Hypercholesterolemic Humans”, Journal of The American College of Nutrition Volume 18 no 1, 43-50. 27. Jose´ A. Medeiros, MD, PhD and Marta-Isabel Pereira, MD (2013), “The Use of Probiotics in Helicobacter pylori Eradication Therapy”, Journal of Clinical Gastroenterology Volume 47 - Issue 1, pages 1-5. 28. Kaila Kailasapathy and James Chin (2000), “Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp”, Immunology and Cell Biology 78, 80–88.

29. Karla Bigetti Guergoletto, “Dried Probiotics for Use in Functional Food Applications”, Food Industrial Processes – Methods and Equipment. 30. Kumar M, Nagpal R, Kumar R, Hemalatha R, Verma V, Kumar A, Chakraborty C, Singh B, Marotta F, Jain S, Yadav H (2012), “Cholesterollowering probiotics as potential biotherapeutics for metabolic diseases”, PMC. 31. Latha Sabikhi, R. Dabu, D.K. Thompkinson, Suman Kapila (2010), “Resistance of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus LA1 to Processing Treatments and Simulated Gut Conditions”, Food Bioprocess Technol 3, pages 586-593. 32. Lim Chi Ming, Raha Abd Rahim, Ho Yin Wan, Arbakariya B. Ariff (2009), “Formulation of Protective Agents for Improvement of Lactobacillus salivarius I 24 Survival Rate Subjected to Freeze Drying for Production of Live Cells in Powderized Form”, Food Bioprocess Technol 2, pages 431–436. 33. M. Abadias, A. Benabarre, N. Teixido, J. Usall, I. Vinas (2001), “Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake”, International Journal of Food Microbiology 65, 173-182. 34. Manoj Kumar, Ashok Kumar, Ravinder Nagpal, Dheeraj Mohania, Pradip Behare1, Vinod Verma, Pramod Kumar, Dev Poddar, P. K. Aggarwal, C. J. K. Henry, Shalini Jain & Hariom Yadav (2010), “Cancer-preventing attributes of probiotics: an update”, Internationat Journal Food Sciences and Nutrition; 61(5):473-96. 35. Martha I. Alvarez-Olmos and Richard A. Oberhelman (2001), “Probiotic Agents and Infectious Diseases:A Modern Perspective on a Traditional Therapy”, Probiotic Agents and Infectious Diseases • CID 2001:32 (1 June), 1567-1577.

36. Mcfarlane G, Cummings JH (1999), “Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health?”, British Medical Journal, 318, pp. 999–1003. 37. McCracken. V. J. and R. G. Lorenz (2001), The gastrointestinal ecosystem: Aprecarious alliance among epithelium, immunity and microbiota, Cell. Microbiol, 3, pp. 1 – 11. 38. Netherwood. T, Gilbert. H. J., Parker. D. S. and O’Donnell. A. G. (1999), Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gastrointetinal tract, Appl. Environ. Microbiol, 65, pp. 5134 -5138. 39. Ng. S. C., Hart. A. L., Kamm. M. A., Stagg. A. J. and Knight. S. C. (2009), Mechanisms of Action of Probiotics: Recent Advances, Inflamm Bowel Dis, 15(2), pp. 300 – 310. 40. Patterson. J.A and Burkholder. K.M. (2003), Application of prebiotics and probiotics in poultry production, J. Animal Science, 82, pp. 627 -631. 41. Pramod Kumar Singh, Parneet Kaur Deol and Indu Pal Kaur (2012), “Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginat beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer”, Food Funct, 3, pp 83-90. 42. Randolph Stanley Porubcan (2007), “Formulations to increase in vivo survival of probiotic bacteria and extend their shelf-life”, United States Patent No US 7,229,818 B2. 43. Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn (2009), The Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press. 44. Robert S. Breed, E. G. D. Murray, Nathan R. Smith (1957), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Baillierek Tindall and Cox Ltd., The United States of America, pp. 282, 506, 541, 543 – 552.

45. Rolfe. R .D. (2000), The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health, J. Nutr, 130, pp. 396S – 402S. 46. Schat. K. A. and Mayers. T. J. (1991), Avian Intestinal Immunity, Crit. Rev. Poult. Biol, 3, pp. 19 – 34. 47. Stephen F. Perry (1998), “Freeze-drying and cryopreservation of bacteria”, Molecular Biotechnology Volume 9, Issue 1, pp 59-64. 48. Sunil Sazawal, Girish Hiremath, Usha Dhingra, Pooja Malik, Saikat Deb, Robert E Black (2006), “Efficacy of probiotics in prevention of acute diarrhoea:a meta-analysis of masked, randomised, placebo-controlled trials”, Lancet Infect 6: 374–82. 49. Van der Wielen. P. W .J, Biesterveld. J. S., Notermans. S., Hofstra. H. and Van knapen. F. (2000), Role of volatile fatty acid development of the cecal microflora in broiler chicken during growth, Appl. Environ. Microbiol, 66, pp. 2536 - 2540. 50. Vandenbossche GMR, Remon J-P. (1993), “Influence of the sterilization process on alginat dispersions”. J Pharm Pharmacol 45: 484–486. 51. Vilaichone RK, Mahachai V, Tumwasorn S, Nunthapisud P, Kullavanijaya P. (2002), “Inhibitory effect of Lactobacillus acidophilus on Helicobacter pylori in peptic ulcer patients: in vitro study”, Pubmed. 52. WHO/FAO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”. 53. Youichi Tamai, Noriko Yoshimitsu, Yasuo Watanabe, Yuji Kuwabara, Seiichiro Nagai (1996), “Effects of milk fermented by culturing with various lactic acid bacteria and a yeast on serum cholesterol level in rat”, Journal of Fermentation and Bioengineering Volume 81, Issue 2, Pages 181–182.

54. Zhu. S.Y., Zhong. T., Pandya. Y. and Joerger. R. D. (2002), 16S rRNA-based analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens, Appl. Microbiol, 68, pp. 124–137. 55. http://en.wikipedia.org/wiki/Probiotics