Nghien Cuu Da Dang Di Truyen Lua Dia Phuong o Lao Cai Bang Chi Thi ADN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG TỈNH LÀO CAI BẰNG CHỈ THỊ ADN Trần Danh Sửu, Nguyễn Thị Lan Hoa, Hà Minh Loan, Ngô Kim Hoài, Bùi Thị Thu Giang, Hoàng Thị Huệ, Hà Thị Xuân Mai, Nguyễn Thị Tuyết

SUMMARY Evaluation of genetic diversity of local rice (Oryza sativa L.) accessions collected from Lao Cai province at DNA level The genetic diversity and DNA fingerprinting of 124 local rice accessions collected from three districts of Lao Cai Provinces were elucidated by using 36 simple sequence repeat (SSR) markers distributed through 12 rice chromosomes. The result of SSR fingerprinting showed that total of 235 polymorphic bands were detected at 36 SSR loci. The numbers of polymorphic alleles varied from 3 to 14 depending on each locus, yielding average of 6 alleles per locus. The DNA profiles analysis indicated three out of 36 SSR markers revealed 3 unique alleles (rare alleles) in 3 surveyed rice genotypes. The information of these markers may come in handy to distinctly identify and characterize those 3 local varieties. Cluster analysis based on UPGMA resolved the local rice accessions into two major O. sativa groups, indica and japonica, agreed with classification based on choroplast DNA analysis. This application of DNA polymorphism analysis revealed genomic relationship in Vietnamese rice germplasm, generating a database useful for cultivar identification, local germplasm conservation, and breeding programs. Keywords: Chloroplast DNA, DNA profile, genetic diversity, local rice, SSR markers I. MỞ ĐẦU Việt Nam là một trong những nước có tài nguyên di truyền lúa phong phú và đa dạng trên thế giới. Dựa trên nghiên cứu về tiến hóa và sự đa dạng di truyền của các loài thuộc chi lúa Oryza, các nhà khoa học đã khẳng định miền Bắc Việt Nam nằm trong khu vực xuất xứ và đa dạng di truyền tối đa của loài lúa trồng châu Á (Oryza sativa) (Chang TT, 1976)[6]. Trong bối cảnh nguy cơ xói mòn nguồn gen do tốc độ đô thị hóa và hiện đại hóa, cho đến năm 2009, Trung tâm Tài nguyên Thực vật đã tiến hành thu thập và lưu giữ hơn 2000 nguồn gen lúa tại khu vực thủy điện Sơn La và các vùng lân cận, nơi sẽ được di rời dân cư để trở thành lòng hồ thủy điện Sơn La. Đây là vùng miền núi Tây Bắc có các tiểu vùng khí hậu phong phú và địa bàn dân cư gồm nhiều dân tộc thiểu số đã và đang sinh sống với những tập quán canh tác và sử dụng lúa rất đa dạng. Đây là các nguồn gen quý vì khó có thể tìm lại được trong tương lai, vì vậy cần được đánh giá chi tiết để phục vụ công tác lưu giữ và khai thác. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại những nguồn gen này là công tác đầu tiên cần tiến hành. Đây là công tác đánh giá ban đầu không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống lúa bản địa, mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác quản lý, khai thác phát triển các nguồn gen đặc sản. Ngày nay, chỉ thị phân tử đã được sử dụng rộng rãi như một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu di truyền và cho phép đánh giá một số lượng lớn locut trải khắp bộ gen của lúa. Những thông tin về đa dạng di truyền ở mức độ ADN có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ nhất giữa các giống, vì thế giúp nhận dạng những giống quý, hiếm trong các tập đoàn giống lúa trồng địa phương một cách nhanh chóng và chính xác. Kỹ thuật DNA fingerprinting đã được áp dụng để

1

nhận dạng và phân biệt giống ở hơn 30 loại cây trồng khác nhau như cam chanh (Citrus spp), chuối (Musa spp.), lúa mỳ (Triticum spp.), dâu tây... (Bhat, 2006; Rinehart, 2007)[5] [26]. Trong số các chỉ thị ADN thì chỉ thị SSR được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di truyền lúa trồng O. sativa, nghiên cứu quá trình tiến hóa, làm rõ độ thuần của vật liệu lai tạo giống... do đây là các chỉ thị đồng trội cho đa hình cao và ổn định. Hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập (www.gramene.org, 2006), phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của lúa (Giarroccoa và ctv., 2007)[11]. Nhiều nghiên cứu ứng dụng SSR và DNA fingerprinting trong nghiên cứu đa dạng di truyền để nhận dạng giống ở lúa đã được công bố trong những năm gần đây (Kalyan, 2006 [14]; Jalaluddin, 2007 [13]; Muhammad SR, 2009 [19]; Navraj KS, 2009 [20] Trong nghiên cứu này, chỉ thị SSR được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền và lập tiêu bản ADN của 124 nguồn gen lúa thu thập tại 3 huyện của tỉnh Lào Cai, nằm trong vùng lòng hồ thủy điện Sơn La, giúp nhận dạng giống, phát hiện khả năng trùng lặp, phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen lúa bản địa. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - 124 giống lúa thu thập từ vùng lòng hồ thủy điện Sơn la và các vùng phụ cận: gồm 3 huyện Mường Khương, Bắc Hà, Si Ma Cai của tỉnh lào Cai đang được lưu giữ tại Trung tâm Tài nguyên thực vật và 2 giống đối chứng Kasalath, Nipponbare. Các giống lúa này bao gồm 68 giống đã có số đăng ký chính thức và đã được nhân giống tại Hữu Lũng và Đà Bắc từ năm 2002 -2009. Các giống còn lại vừa được thu thập năm 2009. - Chỉ thị ADN lục lạp: Cặp mồi ORF 100 và 50 chỉ thị SSR định vị trên 12 nhiễm sắc thể của bộ gen lúa. Phương pháp nghiên cứu - ADN lá non của các giống lúa nghiên cứu được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Doyle, JJ. và ctv (1987)[8]. - Phản ứng PCR với mồi SSR được thực hiện với thành phần: 1x buffer (Fermentaq), 3mM MgCl2 (Takara), 0,25mM dNTPs, 20mM mồi SSR (xuôi và ngược), 0,5unit Taq (Fermentaq) và 0,25ng ADN tổng số lúa; ở điều kiện nhiệt: biến tính ở 95oC trong 5 phút, 35 chu trình: 94 oC trong 30 giây, 55 oC trong 40 giây, 72 oC trong 1 phút; tổng hợp tiếp ở 72 oC trong 7 phút, bảo quản tại 4 oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 8%. - Số liệu phân tích SSR được xử lý bằng phần mềm NTSYS pc2.1 và popgene3.1. Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo công thức của Nei (1972) [21]: I=

q12 Q1Q2

và D = - ln (I)

I: Hệ số tương đồng di truyền

D: khoảng cách di truyền theo cặp

q 12: số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu

Q1 và Q2: tổng số các alen của mẫu giống 1 và 2

Sơ đồ hình cây được thiết lập dựa trên phương pháp phân nhóm UPGA theo tương đồng di (Jaccards/Dice), sử dụng chương trình phần mềm NTSYS pc2.1. - Hệ số đa dạng gen (PIC = Polymorphism Information Content) được tính theo công thức của Nei (1973)[22]: PIC = 1 - ∑ hk 2 (hk: tần số xuất hiện của alen thứ k). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 2

Đa dạng các giống lúa nghiên cứu dựa trên chỉ thị ADN lục lạp Các giống lúa trồng (Oryza. sativa) Châu Á bao gồm 2 loài phụ chính: Indica và Japonica (Oka, 1988)[24]. Loài phụ Indica có xuất xứ nhiệt đới, còn loài phụ Japonica bao gồm hai loại lúa có xuất xứ từ ôn đới và nhiệt đới. Loài phụ Japonica có sự đa dạng di truyền thấp hơn so với loài phụ Indica (Glaszmann, 1987, Zang và ctv, 1992, Nil. và ctv, 2002)[12], [28], [23]. Trong chọn giống, các phép lai xa giữa các loài phụ khác nhau thường dẫn đến bất dục và không hữu thụ ở thế hệ con lai do phá vỡ các nhóm liên kết và sự tương tác giữa các gen có ích trong hệ gen. Việc giảm tái tổ hợp và những biến đổi trong phân ly tạo ra do lai xa có thể gây khó khăn trong việc chọn lọc tổ hợp lai mong muốn trong quá trình chọn giống. Do đó, đối với chọn giống, việc xác định và sử dụng các giống bố mẹ cho tính trạng mong muốn cùng nằm trong một phân loài phụ có ý nghĩa vô cùng quan trọng để khắc phục hiện tượng quá khác biệt về bộ gen. Ngoài ra, những thông tin về đa dạng di truyền phân loại các loài phụ sẽ rất có ý nghĩa đối với việc xác định các gen mục tiêu đã được lập bản đồ. Vì vậy, nhiệm vụ phân loại và nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các loài phụ là cần thiết, đảm bảo cung cấp thông tin cần thiết để chọn cặp bố mẹ thích hợp trong chọn giống. Có nhiều phương pháp đánh giá phân loại khác nhau: dựa trên hình thái, sinh lý như độ dài của trụ gian lá mầm (mescotyle), sự phân huỷ kiềm, chiều dài/rộng hạt..., sự bắt màu phản ứng của hạt thóc với dung dịch Phenol (Oka, 1958) ,dựa trên isozyme (Glaszmann (1987), và dựa trên chỉ thị ADN. Tuy nhiên, việc đánh giá phân loại di truyền và nguồn gốc di truyền dựa trên gen nhân đôi khi phức tạp do có sự trao đổi gen giữa lúa trồng và lúa dại khi chúng có cùng phân bố địa lý (Kuroda và ctv, 2005) [17]. Bộ gen lục lạp ở dạng đơn bội và di truyền theo dòng mẹ, trong khi bộ gen nhân di truyền theo cả hai bố/mẹ. Việc di truyền đơn dòng của các chỉ thị ADN lục lạp rất có ý nghĩa trong công tác xác định mối liên hệ phân loại di truyền và công tác xác định nguồn gốc ở lúa (Kawakami, 2007 [16]. Hơn nữa, lúa trồng được thuần hóa nhờ chọn lọc theo hướng có năng suất cao và chống chịu tốt. Do đó, để nghiên cứu mối liên hệ di truyền hay truy tìm nguồn gốc phát sinh của lúa, việc lựa chọn và đánh giá những vùng gen không liên quan đến các đặc điểm được chọn lọc là cần thiết. Kanno và ctv. (1993)[15] đã phát hiện một đoạn ADN khuyết 69 bp của lúa Indica so với lúa Japonica trong vùng ORF100 trên đoạn Pst-12 trong phân tử ADN lục lạp của lúa. Đoạn bị khuyết này được phát hiện bằng kỹ thuật PCR và được sử dụng như một chỉ thị để phân biệt giữa loài phụ Indica và loài phụ Japonica. Cặp mồi đặc hiệu 5'-ggccatcattttctttag-3' và 5'-agtccactcagccatctctc-3' (ký hiệu: ORF100) được thiết kế để khuyếch đại đoạn ADN mang vùng khuyết thiếu 69bp của vùng ORF100 nằm trên đoạn Pst-12 của ADN lục lạp (Chen, 1993)[7]. Trong nghiên cứu này, 124 giống lúa bản địa đã được phân loại dựa trên sự khác biệt ADN lục lạp của hai loài phụ Indica và Japonica bằng cặp mồi ORF100 với hai giống đối chứng Nipponbare (lúa Japonica) và Kasalath (lúa Indica). Các giống lúa nghiên cứu được gieo và thu lá non. Mỗi một mẫu giống, lá non của 10-20 cá thể được thu gộp để tách ADN tổng số chung. Sau đó, các cá thể này được tiếp tục chăm sóc để có thể thu mẫu lá để tách chiết ADN cho các phân tích cụ thể tiếp theo. ADN tổng số thu được pha loãng tại cùng một nồng độ và sử dụng làm khuôn mẫu để tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi ORF, nhằm phát hiện đa hình ADN lục lạp, tại vùng ORF 100, trên đoạn Pst-12. Kết quả phân tích đa hình cho thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa 2 giống đối chứng Nipponbare (lúa Japonica) và Kasalath (lúa Indica). Giống Kasalath (lúa Indica) cho sản phẩm khuyếch đại là băng ADN có kích thước nhỏ hơn so với giống Nipponbare (lúa Japonica). Trong số 127 giống lúa nghiên cứu, 34 giống có kiểu ADN lục lạp khuyết thiếu tại đoạn Pst1 của 3

ORF100 giống Kasalath (Indica), 88 giống còn lại đều có kiểu ADN lục lạp không khuyết thiếu giống Nipponbare (Japonica) (Hình 2) và 5 giống có cả hai kiểu ADN lục lạp. Như vậy, tỷ lệ lúa Japonica trong tập đoàn lúa nghiên cứu tại Lào Cai chiếm đa số, đạt 72,13%. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Trần Danh Sửu và cộng tác viên (2001) [2] sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu các giống lúa ở vùng Tây Bắc và Tây Nam nước ta cho thấy hầu hết các giống lúa ở vùng Tây Bắc thuộc loài phụ Japonica. Nguyễn Thị Quỳnh, (1998) [1] cũng phát hiện tỷ lệ Japonica của lúa nương ở vùng Tây Bắc chiếm phần lớn, trong lúa ruộng tỷ lệ Indica và Japonica gần ngang nhau. Nghiên cứu phân loại lúa dựa trên phân tích ADN nhân và ADN lục lạp của Fukuoka (2001) về đa dạng di truyền của 129 giống lúa bản địa của miền Bắc Việt Nam bằng chỉ thị phân tử RFLP và ADN lục lạp cũng cho thấy đa phần các giống lúa thuộc phân loài phụ Japonica, tính trên cả lúa nương và lúa ruộng.

Hình 1: Sản phẩm PCR của các mẫu giống lúa nghiên cứu với cặp mồi ORF100 Từ trái sang phải: 1: 50bp ladder; 2: Kasalath; 3: Nipponbare; 4-30: các mẫu giống lúa nghiên cứu

Trong đó, 5 mẫu giống cho cả hai băng giống cả 2 giống Kasalath và Nipponbare đó là các mẫu giống có số đăng lý 1960, 1979, 1982, 4023 và T7013. Vì thế, các mẫu giống này không thể được phân biệt bằng chỉ thị ORF 100. Mồi ORF 100 khuyếch đại đa hình trong đoạn Pst-12 trên vùng ORF 100 của ADN lục lạp nằm trong tế bào chất. ADN lục lạp nằm trong tế bào chất, ở dạng đơn bội và di truyền theo dòng mẹ. Do đó không thể có hiện tượng có 2 kiểu ADN lục lạp trong cùng 1 cá thể. Tuy nhiên, trong quá trình lấy mẫu, 10-20 cá thể được cắt lấy lá để tiến hành tách chiết ADN tổng số để dùng cho phản ứng, vì thế, có khả năng có hơn một giống trong một mẫu giống đăng ký. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành tách nhanh ADN từng cá thể của các mẫu giống này để phân tích, với số lượng mẫu từ 10-15 các thể/mẫu. Đây là mẫu ADN của cùng một cây đã được cắt lá để tách chiết ADN trong nghiên cứu phân tích PCR để phân loại dựa trên ADN lục lạp trên. Kết quả cho thấy trong cả 5 mẫu giống nêu trên, từng cá thể đều chỉ cho một loại sản phẩm khuyếch đại giống hoặc Kasalath, hoặc Nipponbare và không có cá thể nào mang cả hai băng có kích thước khác nhau như tổ hợp mẫu ban đầu. Tuy nhiên, ở tất cả các mẫu, kết quả đều cho hai loại sản phẩm: có cả kiểu ADN lục lạp của Kasalath và kiểu ADN lục lạp của Nipponbare. Điều này cho thấy, các mẫu giống này đã có sự trộn lẫn giữa lúa Indica và lúa Japonica, dựa trên phân tích ADN lục lạp. Đây có thể là do đặc điểm hỗn giống của giống địa phương. Trong 5 mẫu giống này, có 1 mẫu T7013 vừa được thu thập năm 2009, các giống còn lại đều đã được nhân giống từ các năm khác nhau.

4

A

B

Hình 2: Sản phẩm PCR của các cá thể của từng mẫu giống lúa nghiên cứu với cặp mồi ORF100 A: Các cá thể của mẫu giống 1960 ;B2: các cá thể của mẫu giống 4023 Để nghiên cứu và xác định chính xác độ lẫn giống ở mức độ ADN nhân, chúng tôi đã tiến hành khảo sát các mẫu giống này với một số chỉ thị SSR: RM335, RM340. Đây là các chỉ thị đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây của Bộ môn Đa dạng sinh học nông nghiệp và cho các sản phẩm là các alen có kích thước khá phân biệt giữa nhóm giống Indica và Japonica (Trần Danh Sửu và cs. 2010) )[4]. ADN của từng cá thể trong các mẫu giống nghi lẫn nói trên được sử dụng làm khuôn để nhân bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR của từng mẫu giống được phân tích trên gel polyacrilamid 8% và nhuộm ethidium bromide. Kết quả phân tích cho thấy không có allen dị hợp tử nào được phát hiện ở từng cá thể trong từng mẫu giống tuy nhiên các mẫu giống trên đều cho 2 alen.

Hình 3: Sản phẩm PCR của các các thể của mẫu giống sô 1960 với cặp mồi RM 335 Từ trái sang phải: DNA ladder, các giống đối chứng và lần lượt 11 cá thể của Acc. 1960 Trong trường hợp của mẫu giống 1960 với mồi RM 335, 2 allen tách biệt được phát hiện trong tổng số 11 cá thể nghiên cứu, 4 cá thể cho sản phẩm khuyếch đại là alen có kích thước nhỏ hơn, tương ứng với genome của lúa Indica, 7 các thể còn lại cho alen có kích thước lớn hơn, tương ứng với lúa Japonica. Kết quả này giúp củng cố giả thuyết lẫn giống cơ giới gây ra tỷ lệ dị hợp tử trong phân tích đa hình ADN lục lạp. Lập tiêu bản ADN của các giống lúa địa phương tỉnh Lào Cai Trong nghiên cứu này, 50 chỉ thị SSR của lúa định vị trên 12 nhiễm sắc thể được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền của các giống lúa. ADN tổng số được tách chiết bằng cách trộn lẫn 10-20 cá thể của từng mẫu giống được sử dụng để làm khuôn mẫu cho các phản ứng PCR. Tổng số 126 mẫu giống được tiến hành làm PCR, bao gồm 2 giống đối chứng Kasalath và Nipponbare và hai mẫu giống lẫn 1979 và 1982 (hai mẫu giống này chỉ lấy các cá thể cho kiểu phân loại Indica). Sản phẩm PCR được bố trí sắp xếp theo hai nhóm lúa Indica và Japonica theo kết quả phân loại ban đầu bằng chỉ thị ADN lục lạp và được điện di trên 4 bản gel acrylamide nồng độ 8% với cùng thời gian và điện trường. Mỗi gel được bố trí với DNA ladder ФX 147 và hai giống lúa đối chứng Nipponbare và Kasalath. 34 mẫu giống Indica và 2 mẫu giống được tuyển chọn những cá thể Indica của 2 mẫu giống 1979 và 1982 được load trên bản gel 1.

5

Hình 4: Biến động kích thước của các alen tại các locut SSR khảo sát Với 50 chỉ thị SSR, 45 chỉ thị cho sản phẩm PCR, tuy nhiên chỉ có 36 chỉ thị cho sản phẩm là các băng rõ nét ở các mẫu giống nghiên cứu, có thể sử dụng để lập tiêu bản. Thống kê trên 36 locut SSR, sản phẩm PCR là các băng có kích thước nằm trong khoảng từ 80 – 420 bp (Hình 4). Tuy nhiên, kích thước phổ biến của các alen thu được trong tập đoàn biến thiên trong khoảng 100- 250. Các nghiên cứu về DNA fingerprinting của lúa Bangladesh, India và Argentina dựa trên chỉ thị SSR trước đó của Muhammad (2009)[19], Navraj (2009)[20], Rinehart (2007)[26], Kalyan (2006)[14] cũng cho kết quả tương tự về biến thiên kích thước băng ADN. Tại mỗi locut SSR, kích thước của alen thu được trong tập đoàn nghiên cứu biến thiên từ hơn kém nhau 1-2 base (RM16, RM172, RM244, RM284, RM346…) cho đến hàng chục, hàng trăm base (RM164, RM171, RM180, RM335, RM340…).

Đánh giá đa dạng di truyền các nguồn gen lúa có nguồn gốc thu thập thuộc khu vực thủy điện Sơn La và các tỉnh lân cận bằng chỉ thị SSR Để đánh giá đa dạng di truyền các nguồn gen lúa có nguồn gốc thu thập tại vùng lòng hồ thủy điện Sơn La, cụ thể là tại 3 huyện của tỉnh Lào Cai, 50 chỉ thị SSR đã được sử dụng để tiến hành phân tích đa hình di truyền giữa các nguồn gen. Trong đó, 36 chỉ thị cho đa hình tại 1 locut và cho sản phẩm là các băng rõ nét. Chỉ thị RM20 cho đa hình tại hai locut nhưng cho sản phẩm không rõ nét và nhiều mẫu khuyết thiếu, nên không được sử dụng để phân tích đa hình di truyền. Tổng số alen được phát hiện tại 36 locut là 235. Số alen đa hình tại mỗi locut biến động từ 3 đến 14, đạt trung bình 6,53/locut. Số lượng alen nhiều nhất là 14 (locut RM335), đạt 11 alen (locut RM164) và 10 (locut RM21). Locut cho ít đa hình nhất (3 alen) tại RM172, RM245, RM559. Hệ số đa hình di truyền (PIC) thu được tại các locut SSR biến động từ 0,33 (locut RM21) đến 0,88 (RM335). Hệ số đa hình di truyền (PIC) trung bình thu được tại các locut SSR đạt 0,68, cho thấy mức độ đa dạng gen tồn tại trong 126 mẫu lúa nghiên cứu ở mức rất đa dạng. Chỉ số PIC thấp hơn cũng thu được trong nghiên cứu đa dạng lúa Bangladesh (Jalaluddin, 2007) )[10] (0,44); nghiên cứu đối với lúa Japonica của Mỹ (0,46) (Lu, 2005) )[18] và đạt cao hơn so với hệ số PIC của nghiên cứu đa dạng lúa tám (0,35), lúa nếp đồng bằng Bắc Bộ (0,43) (Trần Danh Sửu và cs., 2008, 2010)[3], [4] và nghiên cứu đa dạng lúa temperate Japonica (0,37) (Garris và ctv, 2005)[10]. Trong số 36 locut khảo sát, 18 locut không phát hiện dị hợp tử, 18 locut còn lại phát hiện ít nhất 1 mẫu giống dị hợp. Trong đó, Tỷ lệ alen dị hợp tử quan sát được (H) lớn nhất ở 2 locut 6

RM335 và RM251 (6,35%) , tính trung bình đạt 1,3 % (Bảng 3). Tỷ lệ đạt thấp hơn so với tỷ lệ dị hợp tử của tập đoàn lúa nếp đồng bằng đạt 2,4% khi khảo sát bằng 45 chỉ thị SSR trong đó có 36 chỉ thị tương tự trong nghiên cứu này (Trần Danh Sửu và cs. 2010)[4]. Mặc dù lúa là loài tự thụ phấn, nhưng nhiều nghiên cứu trước đó đã cho thấy: (i) có hơn một allen tại một locut của một giống và (ii) mức độ dị hợp tử trung bình đạt tương tự như kết quả thu được của nghiên cứu này (Olufowote & đồng tác giả, 1997)[25]; Garland & đồng tác giả, 1999[9]; Lu & đồng tác giả, 2005[18]; Giarrocco & đồng tác giả, 2007[11]). Không chỉ ở lúa, kết quả tương tự cũng được báo cáo trong công trình nghiên cứu đối với lúa mạch (Sjakste và đồng tác giả, 2002[27]). So sánh với nghiên cứu đa dạng di truyền trước đó trên tập đoàn 45 giống lúa nếp đồng bằng miền Bắc cho thấy, Số alen thu được từ 36 locut nghiên cứu khảo sát của các mẫu giống thu thập từ Lào Cai đạt 235, tương đương với số alen thu được từ 46 locut khảo sát với 45 giống lúa nếp trong nhiên cứu trước đây, đạt 234, với mức alen trung bình cũng đạt cao hơn (so với 5 alen/locut), nhưng tỷ lệ dị hợp tử lại nhỏ hơn. Số alen đa hình tại một locut cũng biến động nhiều hơn so với nghiên cứu trước. Ở các locut cho đa hình cao (>6) trong nhiên cứu trước như RM335, RM164, RM267, RM266, RM21, RM16, RM5, RM251, RM180... chúng tôi đều thu được kết quả đa hình cao hơn so với lần khảo sát trước trên lúa nếp đồng bằng. Tuy nhiên, mặc dù lượng mẫu giống nhiều hơn, nhưng tại các locut RM22 và RM244 số alen đa hình thu được từ các mẫu giống lúa tại tỉnh Lào Cai lại đạt ít hơn so với tập đoàn lúa nếp bản địa tại đồng bằng sông Hồng trước đây: lần lượt là 7 và 6 so với 10 và 8. Vì thế, rất có thể đây là các locut mang nhiều nét đặc trưng cho lúa nếp của đồng bằng Sông Hồng, và cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn để xác định các đặc trưng này. Bảng 1: Đa hình các locut SSR ở các giống lúa nghiên cứu TT Locut 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

RM5 RM128 RM174 RM263 RM266 RM279 RM509 RM16 RM22 RM251 RM142 RM273 RM335 RM349 RM153 RM164 RM267 RM133 RM340

NST

Số alen

1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 6 6

7 4 5 8 8 7 7 6 7 8 5 6 14 8 5 11 7 4 7

Giống có Số alen alen đặc trưng đặc a (SĐK) trưng

1

T7499

1 1

1984 T7022

c

PIC

H (%)

0.78 0,58 0,48 0,78 0,76 0,77 0,75 0,76 0,77 0,69 0,74 0,68 0,88 0,64 0,66 0,81 0,79 0,65 0,65

1,59 0 0 0 4,76 0 0 1,98 0 6,35 5,95 0 6,35 4,37 0 0,4 0,79 0 1,19

b

TT

Locut

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 31 32 33 34 35 36

RM559 RM172 RM180 RM346 RM152 RM264 RM284 RM242 RM245 RM171 RM 216 RM244 RM21 RM332 RM17 RM 19 RM309 Tổng số T. bình

∑

NST 6 7 7 7 8 8 8 9 9 10 10 10 11 11 12 12 12

Số alen 3 3 8 4 4 9 4 8 3 4 9 6 10 5 12 4 5 235 6.53

Số alen đặc trưng

3

Giống có alen đặc trưng a (SĐK)

c

PIC

H (%)

0,50 0,59 0,69 0,66 0,37 0,82 0,73 0,84 0,54 0,52 0,75 0,77 0,33 0,70 0,84 0,54 0,64

2,38 0 0 0 1,59 0 0 0 0 0 0,4 1,19 1,19 0 0,79 0,4 5,16

0,68

1,3

b

3

*: PIC: Hệ số đa dạng gen (PIC = Polymorphism Information Content) được tính theo công thức của Nei (1972) PIC = 1 - ∑ p2ij; ( pij là tần suất của alen thứ i tại locut thứ j). **: H: Tỷ lệ dị hợp tử quan sát được tại 1 locut

Trong số 36 chỉ thị SSR, chỉ có 3 chỉ thị cho nhận dạng đặc biệt (unique allele) với 3 alen duy nhất của 3 mẫu giống T7499, 1984, T7022 (Bảng 2). Các băng có kích thước nằm trong khoảng 100-250bp. Các nghiên cứu về DNA fingerprinting của lúa Bangladesh, India và Argentina dựa trên chỉ thị SSR trước đó của Muhammad (2009)[19], Navraj (2009)[20], Rinehart (2007)[26], Kalyan (2006)[14] cũng cho kết quả tương tự về biến thiên kích thước băng ADN hiếm. 7

Bảng 2: Các chỉ thị SSR cho alen đặc trưng với các giống TT 1 2 3

Số đăng ký 1984 T7022 T7499 Tổng số

Kích thước

Tên giống Ne Nương Séng Cù Plề Mùa là 3

~ 120 bp ~ 112 bp ~ 145 bp

A

Tên chỉ thị RM335 RM349 RM16 3

B Hình 5: DNA fingerprinting của giống lúa được nhận biết tại các locut SSR: A: RM335, B: RM349, C: RM16

C Quan hệ di truyền giữa các giống lúa và 2 giống đối chứng được phân tích UPGMA bằng phần mềm popgene 1.31 và NTSYS 2.1. Sơ đồ hình cây giữa các giống nghiên cứu ( sử dụng phần mềm NTSYS 2.1) cho thấy hệ số tương đồng di truyền của cả nhóm giống biến động từ 0,76 đến 0,98 (theo phương pháp SM, NTSYS). Tại mức tương đồng khoảng 77%, 126 giống lúa nghiên cứu phân thành 2 nhóm rõ rệt: Nhóm 1 gồm Nipponbare và 77 mẫu giống có kiểu ADN không thiếu của Japonica. Trong nhóm 1, các mẫu giống lúa lại chia làm hai phân nhóm nhỏ: phân nhóm1: 51 mẫu giống lúa trong đó đa phần là lúa ruộng và phân nhóm 2 gồm 24 giống lúa trong đó đa phần là các giống lúa nương. Nhóm 2 gồm Kasalath và 47 mẫu giống, trong đó gồm tất cả 34 mẫu giống có kiểu ADN lục lạp khuyết thiếu của lúa Indica. Kết quả cho thấy có sự tương đồng lớn giữa cách phân loại dưới loài giữa ADN lục lạp và genome. Không có mẫu giống nào có kiểu ADN lục lạp khuyết thiếu của Indica nào có kiểu phân nhóm thuộc Japonica nhờ đa hình genome tại các locut SSR. Tuy nhiên, một số mẫu giống (13 mẫu giống) có kiểu ADN lục lạp không khuyết thiếu của Japonica lại có kích thước các alen tương tự các mẫu giống lúa Indica và được phân nhóm với các giống Indica nhờ đa hình genome tại các locut SSR trong nghiên cứu. Hệ số tương đồng di truyền (Nei, 1972) (phân tích bằng phần mềm PopGene1.31) giữa các giống lúa nghiên cứu dao động từ 0,08 đến 0,95; thấp nhất (0,08) giữa cặp giống T7533 và T7021; tiếp theo hệ số tương đồng thấp cũng đạt được (0,11 và 0,13) là giữa mẫu giống 4024 và giống 4020 với mẫu giống T7022 và cao nhất (0,95) là giữa hai giống 4020 và 4024. Các giống đối chứng đều có tương đồng rất thấp so với các giống trong nhóm lúa nghiên cứu: đạt từ 0,05 đến 0,45 đối với giống Nipponbare và 0,09 đến 0,3 đối với giống Kasalath. Giống kasalath có nguồn gốc từ Ấn Độ và giống Nipponbare có nguồn gốc từ Nhật Bản. Các giống đối chứng này tuy đều nằm trong 2 nhóm lớn nhưng đứng tách biệt khỏi các giống địa phương được thu thập tại Lào Cai. Các cặp giống đa phần có tương đồng di truyền nằm trong khoảng từ 0,4-0,6.

8

Trong các cặp giống, có 2 cặp giống có hệ số tương đồng di truyền từ 0,9 trở lên: đó là 4020 và 4024 (0,91), cặp 4020 và 4021 (0,95). Hai cặp giống này có hệ số tương đồng lớn nhất và nên được xem xét để tránh loại trùng lặp dựa trên các chỉ tiêu theo dõi thêm về kiểu hình. IV. KẾT LUẬN Trong số 36 chỉ thị SSR được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền của 124 mẫu giống thu thập, 36 chỉ thị cho đa hình. Trong đó, nghiên cứu đã phát hiện 3 locut SSR cho các băng đặc trưng của 3 giống lúa bản địa thu thập tại Lào Cai, có thể được ứng dụng trong công tác tạo lập bộ chỉ thị nhận dạng giống lúa bản địa và các giống lúa Việt Nam nói chung. Các giống lúa trong vùng thu thập tại Lào Cai rất đa dạng, tập trung trong 2 phân nhóm chính của nhóm I, gồm các giống lúa thuộc nhóm lúa Japonica. Các giống này đều mang kiểu ADN lục lạp không khuyết thiếu của Japonica. Các giống lúa nương và lúa ruộng có xu hướng nhóm vào hai phân nhóm trong nhóm I. Nhóm II gồm tất cả các giống lúa có kiểu ADN khuyết thiếu của Indica và 13 giống có kiểu ADN lục lạp không khuyết thiếu. Tỷ lệ lúa thuộc nhóm Japonica đạt 62% (dựa trên đa hình ADN lục lạp), chiếm đa số trong các giống lúa thu thập tại Lào Cai. Trong 124 giống nghiên cứu, có 2 cặp giống có hệ số tương đồng di truyền từ 0,9 trở lên: đó là 4020 và 4024 (0,91), cặp 4020 và 4021 (0,95). Hai cặp giống này có hệ số tương đồng lớn nhất và nên được xem xét để tránh loại trùng lặp dựa trên các chỉ tiêu theo dõi thêm về kiểu hình. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

Nguyễn Thị Quỳnh (1998), Đánh giá sự đa dạng di truyền tài nguyên lúa của vùng Tây Bắc Việt Nam, Luận án Thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam.

2

Trần Danh Sửu, Lưu Ngọc Trình (2001), Sử dụng chỉ thị ADN để nghiên cứu quan hệ di truyền tiến hoá của lúa địa phương các vùng Tây Bắc và Tây Nam nước ta, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng, số 1/2001. Tr. 25-29, Viện Di truyền nông nghiệp.

3

Trần Danh Sửu (2008), Đánh giá đa dạng di truyền tài nguyên lúa Tám đặc sản miền Bắc Việt Nam. Luận án Tiến sỹ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

4

Trần Danh Sửu, Nguyễn Thị Lan Hoa và cộng sự. 2010. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nếp địa phương ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ bằng chỉ thị SSR. Kết quả nghiên cứu Khoa học và Công nghệ 2006 – 2010. Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. Bhat KV (2006). DNA fingerprinting and cultivar identification, publish online: http://www.iasri.res.in/ebook/EBADAT, 102-109. Chang TT (1976). The origin, evoluation, cultivation, dissemination and diversification of Asian and African rice, Euphytica 25. p 425 - 441. Chen WB, Sato YI, Nakamura I, Nakai H (1993). Indica-Japonica differentiation in Chinese traditional rice cultivars, Euphtica. 74, 195-201. Doyle, JJ. and JL. Doyle (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15. Garland SH, Lewinm M, Abedinia, Henry R, and Blakeney A (1999) The yse of microsatellite polymorphysim for the identification of Australian breeding lines of rice (Oryza satica L.). Euphytica 108: 53-63. Garris J, Amanda, Thomas H, Tai, Jason Cburn, Steve Kresovich and Susan McCouch (2005) Genetic Structure and Diversity in Oryza satica L. Genetics 169: 1631-1638. Giarroccoa LE, Marassib MA and Salernoa GL (2007). Assessment of the Genetic Diversity in Argentine Rice Cultivars with SSR Markers, Crop Sci 47:853-858. Glaszmann (1987). Isozyme and Classification of Asian Rice Varieties. Theor. Appl. Genet. 74, 21-30.

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Jalaluddin M, Nakai H, and Yamamoto T (2007). Genetic diversity and DNA fingerprinting of some modern Indica and Japonica rice, Breeding and Genetics, SABRAO. 39(1), 43-52. Kalyan Chakravarthi B and Rambabu Naravaneni (2006). SSR marker based DNA fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa L.). AJB. 5 (9): 684-688. Kanno A, Watanabe N, Kamura I and Hirai A (1993). Variations in chloroplast DNA from rice (Oryza sativa):

9

21

Differences between deletions mediated by short direct-repeat sequences within a single species. Theor. Appl. Genet. 86, 579-584. Kawakami, Kaworu Ebana, Tomotaro Nishikawa, Yo-ichiro Sato, Duncan A. Vaughan, and Koh-ichi Kadowaki. 2007. Genetic variation in the chloroplast genome suggests nultiple domestication of cultivated Asian rice (Oryza sativa L.). Genome 50: 180-187 Kuroda, Y., Sato, Y., Bouphanousay, C., Kono, Y., and Tanaka, K. 2005. Gene flow from cultivated rice (Oryza saativa L.) to wild Oryza species (O. rufipogon Griff., and O. nivara Sharma and Shastry) on the Vientaine plain of Laos. Euphytica, 142: 75-83. Lu H, Redusm MA, Coburn JR, Rutger JN, McCouch SR, Tai TH (2005) Population structure and breeding patterns of 145 U.S. rice cultivars based on SSR marker analysis. Crop Sci. 45: 66-76. Muhammad SR, Rezwan MM, Samsul AM and Lutfur Radman (2009). DNA fingerprinting of rice (Oryza sativa L.) cultivars using microsatellite markers. AJCS. 3 (3): 122-128. Navraj KS, Yogesh Vikal, Kuldeep Singh, Monika AJ and Sharma RC (2009). SSR marker-based DNA fingerprinting and cultivar identification of rice ( Oryza sativa L.) in Punjab state of India. Plant Genetic Resources, CJO.17Jul 2009, 1-3. Nei, M (1972). Genetic distance between populations. Amer. Naturalist, 106:283-292

22

Nei M (1973). Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc Natl Acad Sci. 70:3321-3323.

23

Nil, J., P. M. Colowit and D. J. Mackill, 2002 Evaluation of genetic diversity in rice subspecies using microsatellite markers. Crop Sci. 42: 601–607. Oka H. I. (1958). Intervarietal variation and classification of cultivated rice. Ind. J. Genet. Plant breed. 17: 7989, 1958a. Olufowote JO, Xu Y, Chen X, Park WD, Beachell HM, Dilday RH, Goto M and McCouch S.R (1997) Comparative evaluation of withhin-cultivar variation of rice (oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers. Genome 38: 1170-1176.

16

17

18 19 20

24 25

26 27 28

Rinehart TA, Trigiano RN, Mclaurin W, Knight P (2007). The Utility of DNA Fingerprinting for Plant Patent Protection: An example for Lagerstroemia. Southern Nursery Association Proceedings, Vol 51: 607-609. Sjakste, T.G., I. Rashal, and M.S. Röder (2003) Inheritance of microsatellite alleles in pedigrees of Latvian barley varieties and related European ancestors. Theor. Appl. Genet. 106: 539–549. Zhang, Q. F., M. A. S. Maroof, T. Y. LU and B. Z. Shwn. 1992. Genetic diversity and differentiation of Indica and Japonica rice detected by Rflp analysis. Theor. Appl. Genet. 83: 495–499.

10