Nefelometrija i Turbidimetrija

UNIVERZITET U SARAJEVU FARMACEUTSKI FAKULTET

NEFELOMETRIJA I TURBIDIMETRIJA SEMINARSKI RAD

Mentor: Prof.dr Aida Šapčanin

Studenti: 1. Hodžić Selma 2. Hodžić Velida 3. Hurić Rijalda 4. Huskić Ema 5. Ibreljić Mediha 6. Islamagić Emir 7. Jerlagić Azra

Sarajevo, maj 2013.

Sadržaj : Sažetak ...................................................................................................................................... 2 Uvod .......................................................................................................................................... 3 1. Nefelometrija ......................................................................................................................... 4 2. Turbidimetrija........................................................................................................................ 6 3. Instrumenti za mjerenje zamućenja ....................................................................................... 7 3.1.Turbidimetar ................................................................................................................ 7 3.2. Nefelometar ................................................................................................................ 8 4. Mjerne jedinice zamućenja .................................................................................................... 9 5. Primjena nefelometrije i turbidimetrije ............................................................................... 10 5.1. Turbidimetrijsko odreĎivanje kazeina u rastvoru..................................................... 10 5.2.OdreĎivanje koncentracije sulfatnih iona u vodi ....................................................... 11 6.Primjena nefelometrije i turbidimetrije u farmaciji i medicini............................................. 13 6.1.Imuno-nefelometrija .................................................................................................. 13 6.2.Imuno-turbidimetrija ................................................................................................. 14 6.3.OdreĎivanje visoko osjetljivog C-reaktivnog proteina ............................................. 14 7.Zaključak .............................................................................................................................. 16 8.Literatura .............................................................................................................................. 17

1

SAŽETAK Instrumentalne metode obuhvaćaju veliki broj vrlo raznih metoda i postupaka. Tu su prvenstveno spektrometrijske metode koje se baziraju na interakciji uzorka i energije a kao posljedicu interakcije mjerimo elektromagnetsko zračenje ili zračenje raznih čestica (elektrona, protona, iona), zatim elektroanalitičke metode kod kojih je ili signal pobude ili signal odziva (ili oba) električna veličina, radiokemijske metode, termičke (toplinske) metode (termometrijske), metode separacije koje obuhvaćaju kromatografije i elektroforeze. U ovom seminarskom radu napravit ćemo kratki osvrt na nefelometriju i turbidimetriju, nespektroskopske instrumentalne metode. Objasnit ćemo: njihova osnovna načela i principe,ureĎaje za mjerenje (nefelometar,turbidimetar),mjerne jedinice, te ćemo nešto više reći o primjeni tih metoda u farmaciji i medicini.

2

UVOD Turbidimetrija i nefelometrija spadaju u nesprektroskopske instrumentalne metode analize zajedno sa polarimetrijom i refraktometrijom. Ako bi htjeli da shvatimo značenje imena ove dvije metode,onda možemo reći da turbidimetrija odnosno pridjev turbid znači mutan(zamućen) dok nefelometrija (grč. nefelos) znači oblak. Turbidimetrija i nefelometrija su metode kojima se odreĎuje koncentracija čestica u suspenziji. Zasnivaju se na elastičnom raspršivanju elektromagnetskog zračenja na suspendiranim česticama u otopini. Mjeri se smanjenje intenziteta prolaznog zračenja ili intenzitet raspršenog zračenja kao posljedica sudara sa česticama. Raspršivanje elektromagnetskog zračenja na suspendiranim česticama se često zove i Tyndallov efekat. MeĎutim, raspršenje može biti i Rayleighovog, Debyeovog ili Mieovog tipa, u zavisnosti od veličine čestica. Ako je dimenzija čestica reda veličine talasne dužine upadnog zračenja ili manja, zračenje će se raspršivati, ali ako je manja doći će do refleksije. Optimalna veličina čestica da bi došlo do raspršivanja je od 100 do 1000 nm, što odgovara veličini koloida. U nastavku ovog seminarskog rada ćemo detaljnije objasniti spomenute metode. Dakle, reći ćemo nešto više o turbidimetriji i nefelometriji, ureĎajima za mjerenje koji se koriste u ovim metodama (turbidimetar i nefelometar) te o primjeni ovih metoda u farmaciji i medicini što nam je od velikog značaja.

3

1. Nefelometrija Nefelometrija je tehnika za odreĎivanja mutnoće uzorka putem propuštanja svjetlosti kroz njega. U nefelometriji, za razliku od turbidimetrije, mjerenje intenziteta svjetlosti se vrši pod uglom u odnosu na pravac izvora svjetlosti. Ova tehnika je u širokoj upotrebi u kliničkim laboratorijama, jer se ona relativno lako može automatizovati. Ona je bazirana na principu da razblažena suspenzija malih čestica rasipa svjetlost (obično lasersku svjetlost) propuštenu kroz nju, umjesto da je jednostavno apsorbuje. Količina rasipanja se odreĎuje sakupljanjem svjetlosti pod uglom od obično 70 ili 75 stepeni. Nefelometrija se koristi u imunologiji za odreĎivanje nivoa IgM, IgG i IgA. Antitijela i antigeni se pomiješaju u koncentracijama na kojima se samo mali agregati formiraju, tako da se oni ne istalože brzo. Količina rasute svjetlosti se mjeri i poredi sa rasutom količinom standardne disperzije. U nefelometriji se mjeri intenzitet elastično raspršenog zračenja na koloidnim česticama pod uglom, uglavnom od 90o, na smjer inicijalne zrake. Intenzitet raspršenog zračenja proporcionalan je zamućenju otopine. Instrumenti za nefelometrijska mjerenja su posebni instrumenti s vrlo stabilnim izvorima zračenja, kivete su ili okrugle gdje zračenje dolazi kroz dno a mjeri se raspršeno kroz stijenku cilindra, ili slične kao kod molekularne luminiscencije, a detektori su fotomultiplikatorske cijevi, a detektori su fotomultiplikatorske cijevi.

Slika 1. Blok shema nefelometra s okruglim kivetama

Nefelometrijska mjerenja su pogodna za analizu otopina slabog zamućenja. Sustavi se, ukoliko se odreĎuje zamućenje, kalibriraju sa suspenzijama formazina (polimerni spoj, primarni standard za kalibraciju) ili sa sekundarnim standardima koji mogu biti stakleni štapovi raznog stupnja neprozirnosti i na taj način simuliraju zamućene sustave. Suspenzije formazina su po boji slične mlijeku. Oprez! Za formazin postoji vjerojatnost da je kancerogen. Ako je mjerenje zamućenja u funkciji zamjene dugotrajnog gravimetrijskog odreĎivanja, sustav se kalibrira kao i svako relativno instrumentalno odreĎivanje jednim od naprijed objašnjenih postupaka kalibracije.

4

Rezultati mjerenja s ove dvije tehnike ne mogu se direktno usporeĎivati kada se odreĎuje zamućenje otopina. Jedinice u kojima se izražava zamućenje su NTU (nephelometric turbidity units), FTU (formazine turbidity units) ukoliko se mjeri nefelometrijski, a FAU (formazine attenuation units) ako se mjeri smanjenje intenziteta u prolaznom zračenju (turbidimetrijski). Svi propisi i standardi za vodene ekosustave traže nefelometrijska odreĎivanja i rezultate daje u NTU jedinicama. U literaturi postoje podaci da 1 NTU odgovara ekvivalentu od 1 mg/mL suspendiranog SiO2. Metode koje se osnivaju na raspršenju EMZ upotrebljavaju se najčešće za odreĎivanje koncentracije u suspenzija ili za odreĎivanje stupnja zamućenja u ekosustavima ali primjena nije ograničena samo na ta odreĎivanja. Raspršenjem EMZ može se odrediti veličina čestica, raspodjela i molekulska masa (posebno za polimerne čestice). Ta odreĎivanja, iako se osnivaju na istim principima nisu tako jednostavna.

5

2. Turbidimetrija Turbidimetrija je metoda kojom se odreĎuje koncentracija čestica u suspenziji. Zasniva se na električnom raspršivanju EM zračenja na suspendiranim česticama u otopini. Kod turbidimetrijskih mjerenja pravolinijski usmjereno zračenje prolazi iz izvora kroz otopinu uzorka do detektora, a mjeri se smanjenje intenziteta prolaznog zračenja. Turbidimetrijski se odreĎuje zamućenje vode ili koncentracija u sistemima u kojima reakcijom nastaje talog koji se teško filtrira zbog malih cestica ili želatinozne prirode taloga. Turbidimetrija često zamjenjuje dugotrajno gravimetrijsko odreĎivanje .U turbidimetriji se mjeri transmitancija primarnog zračenja: T= I/IO gdje je I0 intenzitet ulaznog zračenja nakon prolaska kroz slijepu probu,a I je intenzitet zračenja nakon prolaska kroz uzorak. Propušteno zračenje je proporcionalno koncentraciji suspendirane supstance prema izrazu koji je analogan Beerovom zakonu: S=logI0/I=kbc gdje je S zamućenje, k je konstanta proporcionalnosti, odnosno koeficijent zamućenja, b je dužina puta kroz uzorak, a c je koncentracija. Na turbidimetrijsko odreĎivanje koncentracije suspendirane supstance utiču sljedeći faktori: koncentracija čestica, odnosa indeksa loma čestice i okolnog medija ,veličina,oblik i raspodjela čestica i talasna dužina ulaznog zračenja. Vrijednosti zamućenja ovise i o orijentaciji čestica u suspenziji obzirom da sve čestice nisu sferične. Ako je dimenzija čestica reda veličine valne duljine upadnog zračenja ili manja zračenje ce se raspršivati ali ako je veća doći će do refleksije. Optimalna veličina čestica da bi došlo do raspršenja je 100 do 1000 nm, dakle veličina koloida. Teorija rasipanja svjetlosti na mikroskopskim česticama je veoma složena i pojava zavisi od toga da li je talasna dužina svjetlosti mnogo manja ili mnogo veća od veličine čestica (Tyndallovo, odnosno Rayleighovo rasipanje), ali je za praktične svrhe značajno samo to da se pojava može kvantitativno mjeriti. Iz teorije grubo proizlazi da je rasipanje obrnuto proporcionalno nekom stepenu (2 do 4) talasne dužine, pa bi za postizanje jačeg efekta rasipanja (i tačnijeg mjerenja) trebalo u načelu raditi na plavom kraju vidljivog spektra. Iako to važi za potpuno neobojene rastvore, oni ipak često i apsorbuju odreĎene talasne dužine, pa je najispravnije da se u svakom konkretnom slučaju eksperimentalno utvrdi talasna dužina optimalna za mjerenje rasipanja.

Slika 2. Tyndallov efekat 6

3. Instrumenti za mjerenje zamućenja Plavo svijetlo se raspršuje učinkovitije nego crveno (zbog čega je i boja neba plava Rayleighovo raspršenje). Kroz obojene suspenzije propušta se zračenje iste boje (monokromatsko svjetlo), zbog smanjenja apsorpcije. Mjerni instrumenti koji se koriste u turbidimetriji su vrlo slični spektrometrima za ultraljubičasto područje (spektrofotometri), a mogu se koristiti i obični spektrofotometri ili čak kolorimetri. Izvori zračenja su živin luk s filtrima za odabir samo jedne valne duljine ili volframova svjetiljka u kombinaciji s monohromatorima ili filterima. 3.1. Turbidimetar Monohromatsko svijetlo je nužno kod turbidimetrijskih odreĎivanja da se smanji apsorpcija elektromagnetskog zračenja na česticama, te da je smanjenje jačine posljedica uglavnom raspršenja (prividna apsorpcija). Detektori su u turbidimetriji, kao i u spektrofotometriji, fotoćelije, a fotomultiplikatori su potrebni kod nefelometrijskih instrumenata. Kivete za tekuće uzorke su u turbidimetriji iste kao i za spektrofotometrijska odreĎivanja. Svjetlost prolazi kroz filter stvarajući svjetlost poznate valne duljine koja zatim prolazi kroz kivete i sadrži rješenje. Fotoelektrične ćelije skupljaju svjetlo koja prolazi kroz kivete. Mjerenje je dato za iznos apsorbiranog zračenja.

Slika 3. Shema turbidimetra Dijelovi turbidimetra: 1. izvor svjetlosti, 2. optička leća, 3. otvor u objektivu, 4. okrugla kiveta, 5. fotometar s filtrima (fotomultiplikator), 6. direktne zrake svjetlosti. 7

3.2. Nefelometar Nefelometar je mjerni instrument za mjerenje zamućenja fluida (tekućina i plinova). Zamućenje je svojstvo fluida (tekućina i plinova) koje opisuje prisutnost suspendiranih ili koloidnih tvari u otopini. Mjerenja zamućenja iznimno su važna u nadzoru kakvoće pitke vode, otpadnih voda i industrijskih voda. Čimbenici koji utječu na zamućenje su: koncentracija čestica, odnos indeksa loma svjetlosti čestice i okolnog medija, veličina, oblik i raspodjela čestica, te valna duljina ulaznog zračenja. Vrijednosti zamućenja ovise i o orijentaciji čestica u suspenziji obzirom da sve čestice nisu sferične.

Slika 4. Shema nefelometra Dijelovi nefelometra: 1. izvor svjetlosti, 2.optička leća, 3. otvor u objektivu, 4. okrugla kiveta, 5. fotometar s filtrima (fotomultiplikator), 6. raspršene zrake svjetlosti (90º).

Slika 5. Nefelometar u mjestu Kosan, otok Cheju, Južna Koreja.

8

4. Mjerne jedinice zamućenja Mjerne jedinice u kojima se izražava zamućenje su NTU (engl. Nephelometric Turbidity Units), FTU (engl. Formazine Turbidity Units) ukoliko se mjeri nefelometrijski, a FAU (engl. Formazine Attenuation Units) ako se mjeri smanjenje intenziteta u prolaznom zračenju turbidimetrijski. Svi propisi i standardizacija vodnih traže nefelometrijska odreĎivanja i rezultate daje u NTU jedinicama. U literaturi postoje podaci da 1 NTU odgovara ekvivalentu od 1 g/l suspendiranog silicijevog dioksida SiO2 u čistoj vodi. Metode koje se zasnivaju na raspršenju elektromagnetskog zračenja upotrebljavaju se najčešće za odreĎivanje koncentracije u suspenzijama (turbidimetrija i nefelometrija), ili za odreĎivanje stupnja zamućenja u ekosustavima, ali primjena nije ograničena samo na ta odreĎivanja. Raspršenjem elektromagnetskog zračenja može se odrediti veličina čestica, raspodjela i molekulska masa (posebno za polimerne čestice). Ta odreĎivanja, iako se zasnivaju na istim načelima nisu tako jednostavna. U Hrvatskoj je maksimalno dozvoljeno zamućenje pitke vode 4 NTU, dok je na primjer u Sjedinjenim Američkim Državama 1 NTU.

Slika 6. Zamućenje vode koje ima vrijednosti 5, 50 i 500 NTU (od lijeve strane na desnu).

9

5. Primjena nefelometrije i turbidimetrije 5.1. Turbidimetrijsko odreĎivanje kazeina u rastvoru U fizičko-hemijskom smislu mlijeko je istovremeno pravi rastvor (mliječni šećer, minerali, albumini globulini), koloidni rastvor (kazein) i emulzija/suspenzija (mliječne masti). Kazein se iz mlijeka iz koga je prethodno uklonjena mliječna mast (obrano mlijeko) može staložiti spuštanjem pH do 4,6 (izoelektrična tačka), isprati vodom i osušiti, pri čemu se dobiva u vidu bjeličastog praha. Kada se ponovo rekonstituiše razblaženim natrij-hidroksidom, on gradi koloidan bijeli rastvor, sličan mlijeku. Takav rastvor je pogodan za turbidimetrijska mjerenja.

Postupak a) 2% rastvor kazeina (osnovni rastvor) Odmjeri se oko 0,5 g praškastog, suhog kazeina, u kome je prethodno odreĎen sadržaj vode, i u laboratorijskoj čaši od 100 ml razmuti štapićem u oko 20 ml 0,1n NaOH. Čaša se poklopi i ostavi preko noći. Sljedećeg dana se sadržaj promiješa – sav kazein je prešao u mliječno-bijeli koloidan rastvor. Rastvor se pažljivo prespe u normalni sud od 25 ml, čaša ispere 3 puta s po 1 ml 0,1n NaOH (ulijevajući spirine u normalni sud), a zatim se normalni sud rastvorom 0,1n NaOH dopuni do crte, zatvori i okrene nekoliko puta da se rastvor ujednači. Napomena: pri odmjeravanju voditi računa o sadržaju vode u praškastom kazeinu i odvagu tako podesiti da se što tačnije dobije 2% rastvor. b) rastvori kazeina koncentracije 1%, 0,5%, ... RazrijeĎeniji rastvori kazeina (1% i 0,5%) i razrjeĎenja potrebna za snimanje standardne prave se dobivaju razrjeĎivanjem osnovnog 2%-og rastvora kazeina deseto-normalnim natrijhidroksidom u odgovarajućoj razmjeri. Rastvori za mjerenje rasipanja svjetlosti se direktno – bez dalje obrade – stavljaju u kivetu spektrofotometra i odreĎuje im se apsorbansa prema 0,1n rastvoru natrij-hidroksida. Slika 7. prikazuje turbidansu koloidnog rastvora kazeina u zavisnosti od talasne dužine upadnog zračenja.

Slika 7. Efekat rasipanja kazeinskog rastvora u zavisnosti od talasne dužine upadnog zračenja. 10

Iako je rastvor kazeina mliječno-bijele boje, u spektru propuštene svjetlosti se zapaža maksimum pri oko 600 nm, koji je izraženiji u razrijeĎenijem rastvoru. Za njega je vjerovatno odgovorna neka pretežna veličina koloidnih čestica u kazeinskom rastvoru. Pri višoj koncentraciji taj maksimum zamagljuje višestruko rasipanje svjetlosti. Pri mjerenju turbidanse nam je potrebna što veća osjetljivost, pa zato detaljnije ispitujemo područje oko maksimuma, u intervalu izmeĎu 550 nm i 700 nm. S obzirom da je preliminarnim eksperimentom utvrĎeno jako negativno odstupanje od Lambert-Beerovog tako pri višim koncentracijama, za konstruisanje standardnih pravih se pravi više razrjeĎenja u intervalu koncentracija izmeĎu 0 i 0,5% i mjeri im se turbidansa pri više talasnih dužina u navedenom intervalu. Dobiveni rezultati su skupno prikazani na slici 8.

Slika 8. Standardne prave za turbidimetriju kazeinskih rastvora u 0,1M NaOH. Kako se vidi sa slike 8, Lambert-Beerov zakon strogo važi za turbidimetriju kazeinskih rastvora u 0,1M NaOH do koncentracije od cca. 0,5%, za talasne dužine u intervalu od 550 do 700 nm, o čemu svjedoče visoki koeficijenti determinacije (uglavnom 0,99 i više). Ipak, zbog ograničenja instrumenta (Specol 10), najbolje je raditi pri 650 nm jer je tada pokazivanje instrumenta najstabilnije.

11

5.2. OdreĎivanje koncentracije SO42- iona u vodi Zadatak: 1. Izraditi baždarni dijagram za odreĎivanje sulfat-iona 2. Iz baždarnog dijagrama odrediti koncentraciju SO42--iona u uzorku vode

a) fotometar MA 9502,MA 9507 Iskra;Kranj,Slovenija

b) turbidimetar 2100A Hach, USA

Slika 9. a) fotometar s okruglim kivetama i obojenim filterima b) turbidimetar s okruglim kivetama Kivete Čistoća kiveta za mjerenje zamućenja vrlo je važna. Otisci prstiju, prljavština ili ogrebotine smetaju pri odreĎivanju jer mogu uzrokovati dodatno raspršenje ili mogu apsorbirati dio zračenja. Uvjeti mjerenja: fotometar MA 9502, MA 9507 Iskra; Kranj Filtar: obojeni (plavi) turbidimetar 2100A Hach, USA Skala: 1-100 NTU

12

Potrebne otopine i reagensi: - otopine poznate koncentracije SO42-- iona (otopina Na2SO4): temeljna standardna otopina (TSO)

  (SO42-)=1000,00 g/mL

standardna otopina

  (SO42-)=200,00 g/mL

- otopina za kondicioniranje: glicerol 50 mL, HCl konc. 30 mL, etanol 95 %-ni ili izo-propanol 100 mL, NaCl 75 g , H2O 300 mL; dobro promiješati - BaCl2, p.a.

Priprema otopina: Pripremiti radnu standardnu otopinu (200 g/mL) razrjeĎenjem temeljne standardne otopine (1,0 mg/mL). Pripremiti u odmjernim tikvicama od 25 mL otopine SO42— iona za izradu baždarnog dijagrama tako da koncentracija bude izmeĎu 0 – 180 g/mL za mjerenja turbidimetrijski a 040 g/mL za mjerenja nefelometrijski. U svaku odmjernu tikvicu dodati 2,5 mL otopine za kondicioniranje, nadopuniti do oznake (25 mL) deioniziranom vodom i dobro promućkati. Pripremiti standarde u pažljivo očišćenom staklenom posuĎu. Upotrebljavati samo čistu deioniziranu vodu za ispiranje staklenog posuĎa i za sva razrjeĎenja. Temeljna standardna otopina je pripremljena ranije a radne standardne otopine mogu se pripremati zajednički za cijelu grupu. Priprema uzorka: Uzorak je vodovodna voda. Priprema se pod istim uvjetima kao i standardne otopine za izradu baždarnog dijagrama. Ne zaboraviti na faktor razreĎenja ! Kalibracijski postupak: Otopine sulfata za izradu baždarnog dijagrama staviti u Erlenmeyerovu tikvicu od 100 mL i dodati na vrhu spatule krutog BaCl2. Miješati na magnetskoj miješalici 60 sekundi. Na isti način pripremiti slijepu probu. Prenijeti slijepu probu i otopine sulfata u kivete, staviti u držač na fotometru i kad se kazaljka umiri, očitati otklon na skali apsorbancije fotometra pet puta (5). Očitane otklone kazaljke fotometra (intenzitet raspršenog zračenja u NTU ili prividna apsorpcija na skali fotometra E ili A) prema koncentraciji SO42-iona u otopini i prikazati grafički.

13

6. Primjena nefelometrije i turbidimetrije u farmaciji i medicini U imunološkim ispitivanjima nefelometrija se koristi za odreĎivanje serumskih koncentracija: 1. Imuno-globulina (IgA, IgM, IgG) 2. Komponenti komplementa (C3, C4 i dr.) 3. Reaktanata akutne faze zapaljenja (CRP, transferin) 4. U reakcijama precipatacije proteina i odreĎivanje imunskih kompleksa. Primjenom nefelometrije i turbidimetrije u imunologiji, razvile su se imuno-nefelometrija i imuno-turbidimetrija, kao suvremene tehnike za odreĎivanje proteina i peptida, koje su zamijenile klasične, dugotrajne, precipitacione tehnike u gelu.

6.1. Imuno-nefelometrija Imuno-nefelometrija je aplikacija nefelometrije za odreĎivanje koncentracije antigena. Kao što je već poznato,nefelometrija je optička metoda kojom se mjeri intenzitet svijetlosti rasute od strane partikula suspendovanih u fluidu ili makromolekula u rastvoru. Zasniva se na svojstvu razblažene suspenzije mikropartikula da rasipa svijetlost. Inicijalni antigen-antitijelo kompleksi su makromolekuli koji ne rasipaju svijetlost. MeĎutim, ovi kompleksi imaju sposobnost da formiraju agregate. Veličina agregata raste u toku nekoliko minuta do nekoliko sati dok njihova sposobnost da rasipaju svijetlost ne dostigne maksimum. Ukoliko se koncentracija jednog reaktanta održava na konstantnom nivou, onda će stopa rasipanja svijetlosti rasti sa rastućom koncentracijom drugog reaktanta, do dostizanja maksimalne vrijednosti. Rasuta svijetlost se sakuplja i mjeri u detektoru pod odreĎenim uglom (najčešće 13-24ο). Bilo porast stepena rasipanja svijetlosti bilo maksimalna vrijednost se mogu kalibrisati za različite koncentracije reaktanata radi dobijanja kalibracione krive. Nepoznate koncentracije se onda mogu odreĎivati mjerenjem odgovora i usporeĎivanjem sa standardnom krivom. U slučaju viška antitijela, koncentracija solubilnih imunih kompleksa mjerena posredstvom intenziteta rasute svijetlosti je proporcionalna koncentraciji antigena. U slučaju viška antigena veličina solubilnih imunih kompleksa opada sa porastom koncentracije antigena, a na osnovu izmjerenog signala stiče se pogrešna slika o niskoj koncentraciji antigena. Stoga se uzorak koji sadrži ciljni antigen razblažuje do uspostavljanja koncentracije koja spada u domen rastućeg dijela Heidelbrerg-Kendall-ove krive, dok test reagens sadrži konstantnu količinu specifičnih antitijela. Princip: Formiranje imunskih kompleksa se mjeri u nefelometru nakon dodavanja pufera, specifičnog antiseruma i uzorka koji sadrži ciljni protein. Laserski snop svijetlosti usmjeren kroz kivetu biva rasut od strane imunskih kompleksa. Električni signal koji se sistemom sočiva usmjerava ka fotodetektoru je proporcionalan intenzitetu rasute svijetlosti i konvertuje se u koncentraciju proteina korištenjem standardne krive. Zavisno od geometrijskog aranžmana detektora detektuje se samo dio rasute svijetlosti. Talasna dužina svijetlosti i veličina partikula determinišu optimalni ugao za mjerenje. 14

Svijetlost rasuta od strane antigen-antitijelo kompleksa se može mjeriti:  

po završetku reakcije tzv. End-point metodom kada se dozvoljava reakciji da se odigra tokom definisanog vremena npr. 15-30 minuta i mjeri se maksimalan odgovor; kontinualno tokom reakcije tzv. Fixed-time metodom baziranom na odreĎivanju razlike izmeĎu dvije vrijednosti mjerene u različitim vremenskim periodima. Prvo mjerenje se obavlja nakon 7,5 sekundi od dodavanja svih komponenti reakcije, a drugo mjerenje nakon inkubacije od npr. 6 min, 12 min tj. u skladu sa uputstvima testa. Prednost ovog metoda se ogleda u oduzimanju signala koji se javlja i u slučaju kada kompleksi antigena i antitijela nisu formirani. Daljim dodavanjem antigena ili antitijela može se provjeriti da li je mjerenje vršeno u rastućem dijelu krive, što je slučaj kada dodavanje antigena rezultuje u povećanju signala ili ako dodavanje antitijela ne dovodi do promjena u signalu

6.2. Imuno-turbidimetrija Imuno-turbidimetrija je metoda kojom se koncentracija antigena odreĎuje na osnovu apsorpcije svijetlosti od strane solubilnih imunih kompleksa. Princip: Solubilni imuni kompleksi se formiraju dodavanjem uzorka antiserumu i pufera koji sadrži akcelerator koji omogućava kinetička mjerenja u skladu sa principom fiksiranog vremena. Povećanje apsorpcije na 334 ili 340 nm se mjeri u okviru definisanog intervala vremena.

6.3. OdreĎivanje visoko osjetljivog C-reaktivnog proteina: Metode odreĎivanja: Koncentracija CRP se odreĎuje imunohemijskim metodama. U prošlosti CRP se mjerio pomoću semikvantitativne lateks aglutinacije. Danas se dosta koriste nefelometrija i turbidimetrija. Ove metode su potpuno automatizovane, brze i reproducibilne. MeĎutim, one uglavnom imaju granicu detekcije oko 5 mg/L, pa nisu pogodne kada se procjenjuje rizik za nastanak kardiovaskularnih bolesti,gdje su značajne promjene koncentracija CRP u opsegu od 0,5–3,5 mg/L. Upotreba fluorescentno, luminescentno ili radioaktivno obilježenih antitijela poboljšava odreĎivanje niskih koncentracija CRP. Ove metode su skupe, vremenski duge, kompleksnije za izvoĎenje i zahtijevaju dodatnu laboratorijsku opremu. Primjena kovalentno vezanih lateks čestica za specifična antitijela je poboljšala svojstva antigen-antitijelo kompleksa da rasipaju svijetlost. Različiti imunoturbidimetrijski testovi koji se koriste na biohemijskim analizatorima zasnivaju se na ovom principu i pokazali su se kao veoma pouzdani za odreĎivanje niskih koncentracija CRP. Granica detekcije odreĎivanja: S obzirom da se na osnovu jako niskih koncentracija CRP vrši procjena rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti, neophodno je da primijenjene metode daju pouzdane vrijednosti pri koncentraciji od 1 mg/L. Za neka klinička istraživanja (populacione studije) potrebno je koristiti metode kojima se pouzdano odreĎuju koncentracije hsCRP od 0,15 mg/L. Funkcionalna osjetljivost većine metoda druge generacije iznosi ≤ 0,3 mg/L. 15

Preciznost metoda: Metode koje se primjenjuju za odreĎivanje hsCRP bi trebalo da imaju Kv za nepreciznost u seriji