Nano Vàng Và Ứng Dụng Trị Bệnh Ung Thư Bằng Phương Pháp Quang Nhiệt Trị

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HOA HỌC TỰ NHIÊN ĐHQG HCM KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA LÝ

 Nguyễn Thị Kim Dung Nguyễn Trung Hải Thịnh Mai Hữu Thoại

Đề tài: NANO VÀNG VÀ ỨNG DỤNG NANO VÀNG DẠNG QUE TRỊ BỆNH UNG THƢ BẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG NHIỆT

Seminar Hóa học Nano

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HOA HỌC TỰ NHIÊN – ĐHQG HCM KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA LÝ

 Nguyễn Thị Kim Dung Nguyễn Trung Hãi Thịnh Mai Hữu Thoại

Đề tài: THANH NANO VÀNG ỨNG DỤNG TRỊ BỆNH UNG THƢ BẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG NHIỆT GVHD: Nguyễn Thị Phương Phong Seminar Hóa học Nano

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2014

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý Mở đầu Bước qua thế kỷ XXI, chất lượng cuộc sống con người ngày càng được nâng cao. Tuy nhiên bên cạnh đó con người không tránh khỏi việc phải đối mặt với nhiều vấn đề về sức khỏe. Bệnh ung thư đã ngày càng trờ nên phổ biến hơn và nguy hiểm hơn. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) và bộ Y tế Việt Nam thì Việt Nam có tỉ lệ mắc bệnh ung thư cao trên thế giới. Nguyên nhân chính là do người dân tiếp xúc hàng ngày môi trường bị ô nhiễm và thực phẩm có chứa chất bảo quản độc hại. Tỉ lệ người tử vong vì căn bệnh này rất cao. Trong khoảng một thập kỷ trở lại đây, các nhà khoa học đã cho thấy nhiều phương pháp điều trị bệnh ung thư có hiệu quả cao, trong đó việc ứng dụng hạt nano vàng vào việc tìm, nhận biết và tiêu diệt tế bào ung thư đang dần cho những kết quả rất khả quan. Các tính chất của hạt nano vàng hình cầu được sử dụng trong việc cho hình ảnh của tế bào ung thư bằng cách sử dụng kính hiển vi đồng tiêu và kính hiển vi trường tối đơn giản. gần đây liệu pháp quang nhiệt sử dụng các thuộc tính hấp thụ cảu kháng thể liên hợp thanh nano vàng (nanorods) và hạt nano vàng hình cầu đã được chứng minh để tiêu diệt chọn lọc tế bào ung thư không ảnh hưởng đến các tế bào khỏe mạnh. Trong khuôn khổ bài viết này, chúng tôi xin phép phương pháp điều chế thanh (que) nano vàng, ứng dụng phương pháp quang nhiệt trị trong việc điều trị bệnh ung thư.

Trang 3

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý Mục lục Mở đầu .......................................................................................................................... 3 Danh mục hình ảnh ........................................................................................................ 5 1. Tổng quan ............................................................................................................... 6 1.1

Sơ lược về bệnh ung thư ....................................................................................... 6

1.2

Hạt nano và sự ra đời của công nghệ nano............................................................ 7

1.3

Ứng dụng nano vàng điều trị bệnh ung thư. .......................................................... 8

1.4

Các phương pháp điều chế hạt nano vàng ............................................................. 9

2. Thực nghiệm điều chế nano vàng dạng thanh ứng dụng điều trị ung thư................ 12 2.1

Hóa chất – thiết bị .............................................................................................. 12

2.2

Tổng hợp thanh nano vàng ................................................................................. 13

2.3

Chuẩn bị kháng thể anti-EGFR mang thanh nano vàng (anti-EGFR/Au) ............ 13

2.4

Thí nghiệm lên tế bào bình thường và tế bào ủ bệnh của hệ liên hợp anti-

EGFR/Au..................................................................................................................... 14 2.5

Bề mặt plasmon hấp thụ và tán xạ ánh sáng của thanh nano vàng lên tế bào. ..... 14

2.6

Tiến hành trị liệu quang nhiệt. ............................................................................ 14

3. Kết quả và nhận xét ............................................................................................... 15 3.1

Kết quả tổng hợp nano vàng dạng thanh ............................................................. 15

3.2

Kết quả trị liêu quang nhiệt ................................................................................ 18

4. Kết luận................................................................................................................. 21 Tài liệu tham khảo ....................................................................................................... 23

Trang 4

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý Danh mục hình ảnh Hình 1: Tỉ lệ một số loại ung thư thường gặp trên toàn thế giới (tính đến năm 2010) .... 6 Hình 2: Ảnh tán xạ của các tế bào không ung thư (a) và các tế bào ung thư (b), (c) sau khi ủ với kháng thể EGFR lien hợp nano vàng. .............................................................. 9 Hình 3: Các loại hạt nano vàng tương ứng với các hình dạng khác nhau ...................... 10 Hình 4: A) Quang phổ hấp thu plasmon bề mặt của các thanh nano vàng với những bước sóng khác nhau. B) Ảnh TEM của các thanh nano .............................................. 15 Hình 5: Ảnh tán xạ của các tế bào khảo sát. Cột trái – HaCaT, cột giữa – HSC, cột phải – HOC. A) tán xạ của hạt nano vàng. B) tán xạ của thanh nano vàng. .......................... 16 Hình 6: Phổ phát xạ từ các tế bào đơn được đo bằng máy quanh phổ hấp thu. A) antiEGFR gắn trên hạt nano hình cầu. B) anti-EGFR gắn trên thanh nano. ........................ 17 Hình 7: Liệu pháp quang nhiệt có chọn lọc với các tế bào ung thư ở những mức năng lượng khác nhau. Cột trái – HaCaT, cột giữa – HSC, cột phải – HOC. ........................ 19

Trang 5

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý 1. 1.1

Tổng quan Sơ lƣợc về bệnh ung thƣ

Ung thư là tên gọi chung của một nhóm các bệnh liện quan đến việc phân chia tế bào một cách vô tổ chức, các tế bào này có khả năng xâm lấn các mô bằng cách phát triển trực tiếp vào các mô lân cận hoặc di chuyển đến các mô khác bằng cách đi vào máu hoặc hệ bạch huyết. Nguyên nhân gây ung thư là sự sai hỏng của DNA, tạo nên các đột biến ở các gen thiết yếu điều khiển quá trình phân bào cũng như các cơ chế quan trọng khác. Một hoặc nhiều đột biến được tích lũy lại sẽ gây ra sự tăng sinh không kiểm soát và tạo thành các khối u. Khối u là một khối mô bất thường, có thể ác tính, tức ung thư hoặc lành tính, tức không ung thư. Theo thống kê của Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới (International Agency for Research on Cancer, IARC) thì năm 2002, trên toàn thế giới ước tính có khoảng 10,9 triệu người mới mắc bệnh ung thư, tỷ lệ ung thư ngày càng tăng do tốc độ đô thị hóa và sự ô nhiễm môi trường.

Hình 1: Tỉ lệ một số loại ung thư thường gặp trên toàn thế giới (tính đến năm 2010) [1]

Theo thông tin của Bộ Y tế Việt Nam và Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm Việt Nam có khoảng 150.000 đến 200.000 người mắc bệnh ung thư mới và có khoảng 50% Trang 6

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý tử vong vì căn bệnh này, là nguyên nhận gây tử vong cao thứ 2 của quốc gia. Theo thống kê đến năm 2010, cả nước có từ 240.000 đến 250.000 người mắc bệnh ung thư, chủ yếu là ung thư phổi, dạ dày, đại tràng, ung thư vú, cổ tử cung, v.v… Nguyên nhân gây bệnh thì có nhiều, song chủ yếu là do nguồn nước ô nhiễm và nguồn thực phẩm có chứa chất bảo quản độc hại. Việc điều trị ung thư là rất quan trọng trong chương trình Phòng chống ung thư ở mọi quốc gia. Muốn nâng cao chất lượng điều trị, không chỉ hoàn chỉnh về kỹ thuật của mỗi phương pháp, thiết bị, mà còn phải có kinh nghiệm, kiến thức; chẩn đoán thật chính xác, xây dựng phác đồ điều trị cho mỗi bệnh nhân một cách hợp lý nhất, thông thường phải phối hợp làm việc trong một tập thể các thầy thuốc chuyên khoa. Có 2 nhóm phương pháp điều trị bệnh ung thư thông dụng. -

Các phương pháp điều trị tại chỗ: bao gồm phẫu thuật và tia xạ. Có khả

năng điều trị triệt để khi bệnh còn ở giai đoạn sớm, các tế bào ung thư chỉ khu trú ở tại chỗ hoặc tại vùng. Nếu các khối u đã di căn xa, chúng ta vẫn có thể dùng phương pháp này để trị tạm thời hoặc kết hợp với những phương pháp khác. -

Các phương pháp điều trị toàn thân. Bao gồm điều trị hoá chất (dùng thuốc

chống ung thư), điều trị nội tiết (dùng nội tiết tố hoặc dùng kháng nội tiết tố), điều trị miễn dịch (làm tăng sức đề kháng của cơ thể để diệt tế bào ung thư). Các phương pháp này có tác dụng trên phạm vi toàn cơ thể, vì vậy chỉ thường được áp dụng điều trị khi bệnh có tính chất toàn thân hoặc đã lan rộng. 1.2

Hạt nano và sự ra đời của công nghệ nano.

Tiền tố “Nano” được sử dụng trong tài liệu khoa học đầu tiên vào năm 1908, khi Lohmann sử dụng nó để chỉ các sinh vật rất nhỏ có đường kính 200nm. Vào năm 1974, Tanigushi sử dụng thuật ngữ công nghệ nano chỉ sự liên kết các vật liệu cho kĩ thuật chính xác trong tương lai. Hiện tại trong khoa học, tiền tố nano được biểu thị với kích thước 1 phần tỉ mét. Tổ chức Nanotechnology Initiative (NNI) trực thuộc chính phủ Mỹ định nghĩa công nghệ nano là “bất cứ thứ gì liên quan đến các cấu trúc có kích thước nhỏ hơn 100nm”.

Trang 7

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý Sau đó, định nghĩa này đã được loại bỏ bởi các nghiên cứu liên quan khác tập trung vào các thiết bị vi lỏng và các vật liệu đang được tiến hành ở vi mô μm. Sau này công nghệ nano đã được định nghĩa cụ thể hơn đó là khoa học, kỹ thuật và thao tác liên quan tới các hệ thống có kích thước nano, ở đó các hệ thống này thực hiện nhiệm vụ điện, cơ, sinh, hóa hoặc tính toán đặc biệt. Nền tảng của công nghệ này là hiện tượng “các cấu trúc, thiết bị và hệ thống có tính chất và chức năng mới khi ở kích thước siêu nhỏ”. Cấu trúc cơ bản của công nghệ nano bao gồm các hạt hay tinh thể nano, lớp nano và ống nano. Các cấu trúc nano này khác nhau ở chỗ chúng được tạo thành như thế nào và các nguyên tử, phân tử của chúng được sắp xếp ra sao. Công nghệ nano là một ngành khoa học phát triển nhanh trong những năm gần đây với việc tạo ra những vật liệu và thiết bị có kích thước nano mét. Công nghệ nano tập trung vào các lĩnh vực như vật lí, sinh học, kỹ thuật, hóa học, khoa học máy tính và các ngành khác. Từ đó, vật liệu nano được nghiên cứu rộng rãi và được tạo ra trở thành đối tượng nghiên cứu của công nghệ nano. Trong số đó, hạt nano đang đóng một vai trò rất quan trọng trong lĩnh vực công nghệ nano và nó đã mang đến một kỉ nguyên mới trong lĩnh vực nano thuốc và nó đã làm thay đổi nền tảng của việc chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa bệnh dựa trên đặc tính của nó. Một trong những vật liệu nano được tạo ra và được ứng dụng rộng rãi đó chính là nano vàng. 1.3

Ứng dụng nano vàng điều trị bệnh ung thƣ. Nguyên tắc cơ bản trong việc điều trị ung thư đó chính là ngăn chặn sự phân

chia tiếp tục của các tế bào và tiến hành phá hủy chúng. Khó khăn trong việc này đó chính là việc phát hiện sớm sự bất thường của các tế bào lúc chúng mới hình thành từng nhóm nhỏ. Mặt khác việc phá hủy chúng cũng rất khó khăn để không phá hủy những tế bào bình thường khác. Năm 2005, một nhóm các nhà khoa học ở Mỹ đã công bố rằng, các hạt nano vàng có thể dùng để phát hiện sớm ung thư một cách dễ dàng. Nguyên nhân là do các tế bào ung thư có một loại protein gọi là “biểu bì tăng trưởng trung tâm” (Epidermal Growth Factor Receptor – EFGR) bám trên bề mặt còn các tế bào bình thường thì Trang 8

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý không có. Khi đính kèm các kháng thể của EFGR vào các hạt nano vàng rồi tiêm vào cơ thể, các kháng thể của EFGR khi gặp các tế bào ung thư sẽ bám chặt lên bề mặt của chùng. Vì vậy chỗ nào có tế bào ung thư thì có các hạt vàng, còn những tế bào bình thường thì không. Do tính tán xạ mạnh của các hạt nano vàng, khi chiếu chùm ánh sang trắng và quan sát kỹ dưới kính hiển vi, chúng ta có thể thấy những chùm sáng phát ra từ các hạt nano. Từ đó xác định được vị trí của các tế bào ung thư trong cơ thể. Tháng 3 năm 2009, các nhà khoa học Mỹ tiếp tục công bố cách dùng hạt nano vàng tìm tế bào ung thư để tiêu diệt. Nguyên nhân là khi chiếu tia hồng ngoại vào, cũng như đối với nhiều loại hạt khác, hạt nano vàng hấp thụ tia hồng ngoại và nóng lên. Nhưng đối với mỗi bước sóng của tia hồng ngoại có một kích thước (đường kính) phù hợp của hạt nano vàng, có hiện tượng hấp thụ cộng hưởng xảy ra: Hạt nano vàng rất nóng. Lợi dụng hiện tượng này, người ta chế tạo hạt nano vàng hình cầu rỗng (vì tia hồng ngoại chỉ làm nóng lớp mặt ngoài) đường kính cỡ 30-50 nanomet. Khi đính các kháng thể vào các hạt nano vàng này rồi cho vào cơ thể, chúng chỉ tập trung bám dính vào những tế bào ung thư. Chiếu tia hồng ngoại có bước sóng thích hợp vào, do hấp thụ cộng hưởng, các hạt nano vàng rất nóng làm tiêu diệt tế bào ung thư, còn các tế bào lành ở xung quanh nóng lên không đáng kể. Người ta thấy rằng chỉ cần làm nóng tế bào ung thư cao hơn nhiệt độ bình thường của cơ thể khoảng 6-7 oC là có thể tiêu diệt được mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường.

Hình 2: Ảnh tán xạ của các tế bào không ung thư (a) và các tế bào ung thư (b), (c) sau khi ủ với kháng thể EGFR lien hợp nano vàng. [3]

1.4

Các phƣơng pháp điều chế hạt nano vàng Vàng có kí hiệu hóa học Au, số hiệu nguyên tử 79, là kim loại chuyển tiếp mềm,

dẻo, dễ uốn, dễ dát mỏng, màu vàng óng và chiếu sáng. Vàng không phản ứng với hầu Trang 9

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý hết các hóa chất, nhưng lại tan trong nước cường toan tạo thành Chloroauric acid (HAuCl4) là tiền thân của Au trong nhiều ứng dụng. Vàng có ở dạng quặng hoặc hạt trong đá hoặc các mỏ bồi tích. Tùy thuộc vào kích thước, hình dạng và tính chất vật lý mà có nhiều loại hạt nano vàng được phát minh. Nano vàng được nghiên cứu sớm nhất có dạng hình cầu, tiếp theo đó là dạng hình que (nanorod), dạng vỏ bọc (nanoshell) , dạng khung (nanocage) và một loại hạt nano vàng khác được tạo ra nhờ đặc tính tán xạ tốt trên bề mặt của nó là hạt nano SERS.

Hình 3: Các loại hạt nano vàng tương ứng với các hình dạng khác nhau

Trong hai thập kỉ qua, sự phát triển không ngừng công nghệ nano đã tạo ra các hạt nano vàng có hình dạng và kích thước khác nhau dưới sự kiểm soát tốt, độ chính xác cao. Dưới đây, chúng tôi xin giới thiệu một số phương pháp tổng hợp hạt nano vàng tiểu biểu. -

Phương pháp khử hóa học:

Là phương pháp sử dụng tác nhân hóa học để khử ion kim loại Au3+(trong dung dịch muối vàng HAuCl 4) thành Au. Đây còn được gọi là phương pháp hóa ướt do tác nhân hóa học được sử dụng ở dạng lỏng như acid citric, vitamin C, natri bohidrua (NaBH4), etanol, etilen glycol, glycerin, natri citrat, poly sodium acrylate (PSA). Sau khi hòa tan muối vàng HAuCl4, cho tác nhân khử vào đồng thời khuấy nhanh dung dịch. Các ion Au 3+ sẽ bị khử thành nguyên tử Au, cho đến khi dung dịch trở nên bão hòa thì dần xuất hiện kết tủa các hạt vàng có kích thước nm; nếu khuấy đủ mạnh sẽ tạo ra các hạt có kích thước đồng đều hơn. Thông thường người ta cho chất ổn định vào để ngăn sự kết dính của các hạt nano vàng.

Trang 10

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý Tùy thuộc vào từng loại hóa chất và tác nhân khử tương ứng khác nhau mà tạo ra các hạt nano vàng với chất lượng, kích thước và hình dạng khác nhau. Do đó, khi điều chế vàng bằng phương pháp hóa học cần lựa chọn hóa chất sử dụng với nồng độ thích hợp, chất ổn định,…để tạo ra sản phẩm theo yêu cầu. -

Phương pháp vật lý

Dùng tác nhân điện tử hay sóng điện từ có năng lượng cao như tia γ , tia tử ngoại, tia laser khử ion kim loại thành kim loại. Đây là phương pháp bottom-up. Với phương pháp chiếu xạ gamma-γ Co-60 và dùng chitosan vừa làm chất khử vừa làm chất ổn định đã và đang được nghiên cứu phổ biến tạo ra các hạt nano vàng có dạng hình cầu kích thước khoảng 16-25 nm và độ đồng nhất cao. Ngoài ra, nano vàng còn được tạo thành trong micelle không ion (đầu phân cực không bị ion hóa) như poly oxyetylen, isooctyl eter (thường được biết là Triton X-100 hay TX-100) mà không cần tác nhân khử nào khác vì nó cũng đóng vai trò là chất ổn định. Phương pháp này đơn giản, tiến hành ở nhiệt độ thường, sản phẩm có độ tinh khiết cao và khả năng chế tạo ra các hạt nano có kích thước nhỏ hơn so với phương pháp khử hóa học. -

Phương pháp sinh học

Phương pháp khử sinh học dùng tác nhân khử là vi khuẩn, vi nấm, vi rút…khử ion kim loại. Nhiều loại vi nấm và vi khuẩn được sử dụng như Bacillus subtilis, Bacillis Licheniformic, khuẩn Lactobacillus (khuẩn acid lactic), nấm Verticillium tạo ra hạt nano vàng có kích thước từ 20-50 nm, khuẩn Actinomycete tổng hợp hạt nano vàng có kích thước 7-12 nm… Ngoài ra trên thế giới người ta còn sử dụng các loại nấm mốc, tảo và cây trồng như cỏ linh lăng, lá cây rau mùi, vỏ cây quế để chế tạo nano vàng. Phương pháp khử sinh học đơn giản, thân thiện với môi trường, có thể tạo ra số lượng lớn các hạt tuy nhiên thời gian dài thường trên 3 ngày.

Trang 11

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý -

Phương pháp vi nhũ

Sử dụng dung dịch chứa các micellce rất sạch, ổn định về mặt nhiệt động bao gồm pha nước và pha dầu tạo thành hệ vi nhủ. Trong hệ vi nhũ, những giọt nước có kích thước nano được tạo bởi những dầu ưa nước của chất hoạt động bề mặt trong khi đuôi kỵ nước được solvat hóa bởi pha dầu. Nước trong các micelle đảo đóng vai trò như các trung tâm phản ứng rất nhỏ cho các phản ứng khử ion vàng tạo thành các hạt vàng. Dung dịch chứa muối vàng được hòa trôn với chất khử như sodium bis (2 – ethylhexyl) sulfosuccinate (ATO) trong dung môi alcan lỏng. Tác nhân khử sẽ thúc đẩy quá trình khử của ion kim loại vàng tạo thành hạt vàng kim loại. Sự va chạm giữa cá micelle gây nên sự tranh dành lõi, dẫn đến sự phát triển hạt trong micelle cho đến khi đạt kích thước tối đa được quyết định bởi tỉ lệ khối lượng nước/chất hoạt động bề mặt. Theo thời gian phản ứng xảy ra các hạt nano vàng được chiết từ micelle bởi ly tâm, rửa dung môi để loại chất hoạt động bề mặt thừa. -

Phương pháp sử dụng nhiệt vi sóng

Sử dụng tác nhân khử hóa học dưới tác dụng nhiệt của lò vi sóng để khử ion vàng, quá trình khử diễn ra nhanh.Các chất khử thường dùng là các hợp chất polyol như etilen glycol, glycerin, nước…Phương pháp này tạo ra các hạt nano với kích thước đồng đều và nhỏ hơn so với những phương pháp khác, vì khi nhiệt được cung cấp cho toàn bộ hệ thống như nhau.Ưu điểm của phương pháp là thời gian khử nhanh, thiết bị đơn giản, dễ sử dụng. Tuy nhiên, phải sử dụng thêm chất khử và chất ổn định để tránh làm hạt vàng keo tụ trở lại. 2. 2.1

Thực nghiệm điều chế nano vàng dạng thanh ứng dụng điều trị ung thƣ Hóa chất – thiết bị -

Auric acid - HAuO2 0.0005M (Sigma)

-

Cetyltrimethylammonium bromide (CTBA) – C19H42BrN 0.2M (Sigma)

-

Sodium borohydride – NaBH4 0.01M

-

Benzyldimethylhexadecylammonium chloride (BDAC) 0.15M

-

Ascorbic acid 0.788M

-

N-(2-hydroxyethyl)piperazineN′-2-ethanesulfonic acid (HEPES) Trang 12

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý

2.2

-

Poly(styrenesulfonate) (PSS, MW=18 000, Polysciences Inc.)

-

Dulbecco’s modification of Eagle’s medium (DMEM, Cellpro)

-

Blue trypan 0.4% (Sigma)

-

Kính hiển vi đảo ngược (Olympus IX70)

-

Máy ly tâm

-

Cùng một số thiết bị và hóa chất phổ biến khác.

Tổng hợp nano vàng hình que Các nano vàng hình que được tổng hợp theo phương pháp “tăng trưởng hạt qua

trung gian” (seed-mediated growth method) với một số thay đổi. Đầu tiên dung dịch gồm 0.0005 M acid auric trong 0.2M CTAB được khử ở nhiệt độ phòng bởi NaBH4 lạnh để mang các hạt nano nhỏ ( < 5nm) như dung dịch keo. 100 mL dung dịch tăng trưởng được điều chế bằng cách khử 0.001 M acid auric trong dung dịch chứa 0.2 M CTAB, 0.15 M BDAC bằng 0.004 M Ag+ và 70μL acid ascobic 0.0788M. 8 μL dung dịch hạt đưa vào dung dịch tăng trưởng và các thanh nano vàng thu được sau vài giờ. Hiệu suất phản ứng sẽ cao hơn nếu thời gian phản ứng lâu hơn. Thanh nano vàng với các tỷ lệ kích thước khác nhau thu được bằng cách thay đổi nồng độ Ag+ [4]. 2.3

Chuẩn bị kháng thể anti-EGFR mang nano vàng hình que (anti-EGFR/Au) Các nano vàng hình que vừa tổng hợp trên nên CTAB được tích điện dương sau đó

ly tâm ở 14000 vòng/phút để loại CTAB. Các bề mặt tích điện dương của que nano được thay đổi thành một bề mặt tích điện âm bằng cách cho các que nano vào dung dịch polymer dẫn PSS - Poly(styrenesulfonate). PSS thêm vào dung dịch được tách ra bằng cách ly tâm dung dich chứa các thanh nano ở 8000 vòng/phút, các hạt được phân tán trong dung dịch HEPES ở pH=7,4. Các que nano PSS trắng trộn với dung dịch kháng thể sau đó được pha loãng trong HEPES cùng một bộ đệm và cho phép phản ứng trong 20 phút. Các kháng thể liên kết với các que nano PSS bởi sự tương tác của hấp phụ vật lý (hấp phụ tĩnh điện), phương pháp tương tự như được sử dụng để tạo hệ liên hợp khi hạt ở hình cầu. Bởi sự tương tác của hấp phụ vật lý (hấp phụ tĩnh điện). Các que nano liên hợp với kháng thể đơn dòng anti - EGFR được ly tâm và phân tán vào đệm

Trang 13

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý photphat (pH=7.4) để tạo thành một dung dịch gốc với mật độ quang khoảng 0.5 ở 800 nm. Hợp chất anti - EGFR/Au ổn định ở nhiệt độ 4 oC trong vài ngày [4]. 2.4

Thí nghiệm gắn tế bào bình thƣờng và tế bào ủ bệnh lên hệ liên hợp anti-

EGFR/Au. Tế bào biểu mô lành tính HaCaT (tế bào sừng), dòng tế bào ác tính HOC 313 thế hệ 8 và HSC 3 (tế bào biểu mô sừng bị ung thư) được nuôi cấy trong DMEM có 5% huyết thanh thai bê (FBS) ở 37 ° C dưới 5% CO2. Các tế bào được phân cắt bởi enzym trypsin và phân tán lên mặt kính thủy tinh 18 mm trong 12 tấm nuôi cấy, thời gian tăng trưởng tăng trưởng 3 ngày. Các lớp vỏ được bọc lại bằng colagen tạo điều kiện cho tế bào phát triển tối ưu. Các tế bào được lấy ra từ môi trường nuôi cấy, rửa sạch với đệm PSB, sau đó ngâm vào dung dịch chứa anti-EGFR/Au trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ngâm trong dung dịch chứa thanh nano vàng, lớp tế bào được rửa bằng đệm PSB, cố định với paraformandehide, tráng lại với glycerol, và được gắn vào với lớp vỏ khác [4]. 2.5

Bề mặt plasmon hấp thụ và tán xạ ánh sáng của nano vàng dạng que lên tế

bào. Các hình ảnh tán xạ ánh sáng được ghi lại bằng cách sử dụng một kính hiển vi đảo ngược Olympus IX70 với trường tối tụ cao tầng (U-DCW, 0,9 -1,2). Sử dụng ánh sáng trắng từ đèn vonfram, điều chỉnh thành 1 tia rất hẹp đến phần trên của mẫu. Dầu iris 100/1.35 (UPLANAPO) được sử dụng để hấp thu các ánh sáng tán xạ từ mẫu. Hình ảnh thu được bằng cách sử dụng tấm phim (Kodak E100 VS). Phổ phát xạ của các hạt nano vàng trên các tế bào đơn được đo bằng vi quang phổ kế SEE1100 với độ phóng đại 20x cho khu vựng tập trung đường kính 8μm. Ánh sáng tán xạ từ các tế bào có thể bỏ qua do sự hấp thụ tăng cường và tán xạ từ các hạt nano vàng [4]. 2.6

Tiến hành trị liệu quang nhiệt. Dùng đèn lasers Ti-sapphire phát ra tia có bước sóng 800 nm. Bước sóng này nằm

ở vùng NIR mà tại đó các mô có sự hấp thụ thấp. Nó cũng trùng với các dãy hấp phụ theo chiều dọc của các nano vàng dạng que. Các lớp tế bào đã ngâm vào dung dịch liên hợp nano, rửa sạch với đệm PBS. Và sau đó tiếp xúc với ánh sáng laser đỏ với cường độ Trang 14

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý khác nhau. Các laser đỏ ở 800 nm được tập trung tại vùng có đường kính 1 mm trên mẫu. Nhiều khu vực trên vùng khảo sát được tiếp xúc với ánh sáng laser đỏ với mật độ khác nhau cho mỗi 4 phút và sau đó nhuộm với Blue trypan 0.4% trong 10 phút để kiểm tra khả năng di chuyển của tế bào. Các tế bào bị nhuộm xanh trong khi các tế bào sống vẫn bình thường. Sau khi được nhuộm mẫu được chụp ảnh với độ phóng đại 10x [4]. 3. 3.1

Kết quả và nhận xét Kết quả tổng hợp nano vàng dạng que

Hình 4: A) Quang phổ hấp thu plasmon bề mặt của các thanh nano vàng với những bước sóng khác nhau. B) Ảnh TEM của các thanh nano

Hạt nano vàng hình cầu hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến khoảng 520 nm. Sự hấp thụ plasmon trên bề mặt của các que nano vàng có 2 phần: một phần có bước sóng dài mạnh do sự dao động theo chiều dọc của các electron và một dãi có bước sóng ngắn yếu xung quanh 520 nm do sự dao động ngang của các electron. Hình 4A cho thấy sự hấp thụ quang học của các que nano vàng với tỷ lệ hình dạng khác nhau thu được bằng cách thay đổi nồng độ Ag+ trong quá trình phát triển. Các dãy hấp thụ theo chiều dọc thay đổi từ vùng ánh sáng khả kiến đến vùng gần hồng ngoại cho các hình dạng quetăng lên. Trong nghiên cứu, tỷ lệ 3,9 được lựa chọn do sụ hấp phụ trùng với sự phát xạ tối thiểu của tế bào mô của con người. Các dãy hấp phụ của que nano cũng trùng với bước sóng laser 800 nm. Hình ảnh TEM của các thanh nano vàng với tỉ lệ 3,9 được thể hiện trong hình 1B [4].

Trang 15

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý

Hình 5: Ảnh tán xạ của các tế bào khảo sát. Cột trái – HaCaT, cột giữa – HSC, cột phải – HOC. A) tán xạ của hạt nano vàng. B) tán xạ của thanh nano vàng.

Trong kính hiển vi trường tối, một chùm ánh sáng trắnng hẹp được sử dụng với độ phóng đại 100x, các hạt nano khác nhau sẽ tán xạ ánh sáng khác nhau, tùy thuộc vào kích thước và hình dạng của chúng để so sánh hình ảnh tán xạ của anti-EGFR trên hạt nano vàng hình cầu (đường kính 35 nm) sau khi ủ với tế bào cũng được thể hiện ở hình 5A. Do các bề mặt plasmon tần số dao trong trong vùng khả kiến, nên sự hấp phụ và phát xạ điều trong vùng ánh sáng khả kiến. Các hạt nano vàng hình cầu tán xạ ánh sáng từ xanh lá cây đến vàng. Hình 5B cho thấy hình ảnh tán xạ của anti – EGFR gắn trên que nano vàng (tỉ lệ 3,9) sau khi liên kết với các tế bào ác tính. Các nano vàng dạng que tán xạ mạnh mẽ ánh sáng từ cam tới đỏ do sự dao động theo chiều dọc của bề mặt plasmon trong khu vực gần hồng ngoại. Cả 2 anti-EGFR gắn trên nano vàng hình cầu và nano vàng dạng que đều tương tác với 2 loại tế bào ác tính và giúp phân biệt các tế bào ung thư và tế bào thường. Các tế bào bình thường không được nhận dạng do tương tác đặc hiệu với các hạt nano vàng [4]. Để định lượng các hạt nao vàng tương tác với mỗi loại tế bào, phổ phát xạ từ các tế bào đơn được đo bằng máy quang phổ hấp thu. Hình 6A cho thấy phổ phát xạ trung bình của anti – EGFR gắn trên nano vàng hình cầu trên 20 tế bào riêng lẽ khác nhau của từng loại, hình 6B cho thấy quang phổ phát xạ trung bình của anti – EGFR gắn trên Trang 16

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý nano vàng dạng que, trên 20 tế bào riêng lẽ khác nhau của từng loại. Trong cả 2 trường hợp hạt nano vàng hình cầu và nano vàng dạng que, hàm lượng vàng trên các tế bào ác tính nhiều gấp 2 lần so với các tế bào thường. Việc xác định hàm lượng này không nhất thiết tương ứng với sự khác biệt về nồng độ của EGFR giữa tế bào ác tính và tế bào thường vì các tế bào ác tính có thể liên kết với các hạt nano vàng do tương tác không đặc hiệu

Hình 6: Phổ phát xạ từ các tế bào đơn được đo bằng máy quanh phổ hấp thu. A) anti-EGFR gắn trên hạt nano hình cầu. B) anti-EGFR gắn trên nano vàng dạng que.

. So với các hạt nano hình cầu, hàm lượng của các nano vàng dạng que cao hơn rất nhiều trên cả tế bào ác tính và tế báo thường, chủ yế do tương tác giữa PSS trên bề mặt của que nano và các protein trên bề mặt tế bào. Mặc dù phổ phát xạ đầy đủ các que nano vàng không hoàn toàn được ghi nhận đầy đủ do hạn chế của thiết bị ở 1000 nm, có thể thấy rằng vị trí phát xạ theo chiều dọc được đo một cách chính xác và sự dịch chuyền sang vùng ánh sáng đỏ so với sự phát xạ của que nano vàng tự do có cùng kích thước (xem Hình 1A, đường cong màu cam). Sự dịch chuyển sang vùng ánh sáng đỏ có thể là do hai nguyên nhân. Một là do sự thay đổi chỉ số khúc xạ trên bề mặt hạt nano gây ra bởi sự liên hợp với các anti – EGFR với các EGFR trên bề mặt tế bào. Hai là kết quả sự tương tác của các hạt nano trên bề mặt tế bào. Sự tương tác trên plasmon của Trang 17

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý nano vàng dạng que cũng được quan sát trên bề mặt ống carbon nano và trong dung dịch. Sự phát xạ của thanh nano vàng trên tế bào bình thường HaCat và tế bào ác tính HSC và HOC là quá rộng để đưa ra một giá trị chính xác và hữu ích cho các bước sóng cực đại cho mục đích chuẩn đoán. Điều này không giống như các kết quả đạt được trên các hạt hình cầu, dải bước sóng cực đại là khác nhau cho các tế bào ác tính và không ác tính đã cung cấp một kỹ thuật chuẩn đoán ung thư đơn giản [4]. 3.2

Kết quả trị liêu quang nhiệt Các anti – EGFR gắn trên hạt nano vàng hình cầu đường kính 35nm. Đóng vai trò

hấp thu quang nhiệt hiệu quả và chọn lọc để phá hủy các tế bào ung thư bằng tia laser ion argon mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường xung quanh. Các bước sóng laser tại 514 nm chồng lên bề mặt hấp thụ các hạt nano vàng hình cầu, trong đó có một tia hấp thu cực đại ở 520 nm. Bằng cách liên hợp với các anti – EGFR nhằm đánh dấu các phân tử EGFR, các tế bào ác tính có thể bị phá hủy với năng lượng ít hơn nữa năng lượng cần thiết để tiêu diệt các tế bào bình thường do sự liên hợp của EGFR trên các tế bào ác tính. Tuy nhiên, tại bước sóng này, sự thâm nhập mô của ánh sáng là rất thấp (dưới 500 μm). Trong khi điều kiện này có thể có lợi cho các tổn thương trên bề mặt, để điều trị ung thư trong cơ thể mong muốn sự thâm nhập sâu hơn vào các mô. Vùng quang phổ gần hồng ngoại cho sự thâm nhập tối đa do tán xạ tương đối thấp hơn và hấp thụ từ bên trong mô. Từ việc hấp thụ ánh sáng của các kim loại quý có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi hình dạng hoặc kích thước nano, liệu pháp quang nhiệt hấp thụ có thể được phát triển. Hình dạng khác của các hạt nano vàng như phân nhánh, ngũ giác, lăng kính lớn có bề mặt hấp thụ plasmon ở khu vực gần hồng ngoại. Nano dạng que là ứng cử viên tốt nhất cho ứng dụng này do khả năng kiểm soát chính xác, tối đa hấp thụ của các bước sóng cần thiết bằng cách thay đổi các tỷ lệ hình dạng, có thể được thực hiện bằng cách thay đổi nồng độ Ag+ trong quá trình tổng hợp nano vàng. Tuy nhiên, các tính năng khác, như liên hợp với các dạng nano khác và các phân tử của họ kháng thể nên được nghiên cứu nhiều hơn trong tương lai [4].

Trang 18

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý

Hình 7: Liệu pháp quang nhiệt có chọn lọc với các tế bào ung thư ở những mức năng lượng khác nhau. Cột trái – HaCaT, cột giữa – HSC, cột phải – HOC.

Sau khi ủ kháng thể liên hợp anti – EGFR gắn lên nano vàng dạng que trong 30 phút, các tế bào được tiếp xúc với bức xạ lasers ở các cường độ khác nhau 40, 80, 120, 160, và 200 mW với một điểm trọng tâm của 1 mm đường kính cho mỗi 4 phút. Các tế bào này sau đó được nhuộm với blue trypan để kiểm soát sự ổn định của liệu pháp quang nhiệt. Hình 7 cho thấy ảnh của mẫu chiếu xạ ở mức năng lượng laser khác nhau. Tiếp xúc với tia laser đỏ 800 nm và trên 160 mW ( 20W/cm 2) gây ra sự phá hủy các tế bào bình thường HaCaT, được kiểm tra bởi khả năng di chuyển với blue Trypan Trang 19

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý (Hình 7, cột bên trái). Tế bào chết được thể hiện là một điểm màu xanh trong khu vực tròn phù hợp với kích thước điểu laser. Các tế bào bên ngoài điểm laser là tồn tại, do không bị ảnh hưởng bởi blue trypan. Điều này cũng chỉ ra rằng anti – EGFR gắn trên thanh nano vàng không ảnh hưởng đến tế bào. Giảm năng lượng laser đến 120 mW, số lượng tế bào bị nhuộm bởi blue trypan giảm ở vị trí laser. Tại năng lượng này chỉ có trung tâm điểm laser chứa năng lượng đủ cao để gây ra sự phá hủy tế bào. Mật độ năng lượng ở cạnh của điểm laser không đủ để tổn thương tế bào, nên các tế bào chết bị nhuộm màu xanh trở nên nhỏ hơn [4]. Hình 7 cột giữa cho thấy rằng các tế bào ác tính HSC bị tổn thương quang nhiệt tại cường độ của tia laser thấp hơn. Tế bào chết xảy ra trong vòng kiểm soát của tia laser sau khi tiếp xúc với các tia laser trên 80 mW ( tương ứng 10W/cm2) ngưỡng năng lượng cho tế bào chết của cá tế bào HSC là khoảng một nửa là cần thiết để gây chết các tế bào bình thường HaCaT. Màu xanh mờ hiển thị trong hình ảnh bên ngoài điểm laser tế bào HSC, là do các tế bào bị chết do tiếp xúc kéo dài của các tế bào trong dung dịch đêm bên ngoài môi trường tế bào. Các tế bào ác tính HOC cũng bị phá hủy quang nhiệt tại trên 80 mW, trong khi không có tế bào chết quan sát ở cường độ thấp hơn ( hình 3 cột bên phải). Năng lượng để tiêu diệt tế bào ác tình bằng một nữa năng lượng cần để tiêu diệt tế bào bình thường do sự tác động của EGFR trên các tế bào ung thư và số lượng cao hơn của các kháng thể liên hợp anti – EGFR gắn trên thanh nano vàng hấp thụ ánh sáng và chuyển đổi chúng thành nhiệt ở bề mặt tế bào. Từ quang phổ hấp thụ của 3 loại tế bào trong hình 2, có thể thấy rằng số lượng thanh nano vàng trên hai loại tế bào ác tính cao hơn so với các tế bào bình thường 2 lần. Các que nano vàng hấp thu năng lượng quang phổ và chuyển chúng thành nhiệt cung cấp vào màng tế bào ác tính làm cho chúng chết ở mức độ năng lượng thấp hơn so với tế bào bình thường. Các kết quả trên cho thấy rằng que nano vàng liên hợp với các kháng thể có thể được sử dụng như một tác nhân quang nhiệt chon lọc và hiệu quả cho liệu pháp chữa trị bệnh ung thư bằng cách sử dụng năng lượng thấp, vô hại tia laser hồng ngoại. vì vậy để biết thêm trong ứng dụng cơ thể, đó là mong rằng các khối u sẽ được phá hủy chọn lọc Trang 20

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý ở mức năng lượng laser sẽ không gây ảnh hưởng đến cá mô bình thường xung quanh là do hàm lượng của cá thanh nano vàng liên kết chọn lọc với các khối u. Năng lượng ngưỡng để tiêu diệt cá tế bào ung thư tìm được là 10 W/cm2 thấp hơn năng lượng cần thiết trong trường hợp sử dụng vỏ nano vàng. Sự khác biệt này là kết quả của mặt cắt hấp thu năng lượng cao hơn, một hằng số ái lực cao hơn cho các liên hợp của que nano vàng và kháng thể, hoặc do sự tương tác cao hơn cho sự liên hợp giữa các kháng thể trên bề mặt tế bào ung thư. Được biết, nhiều khối u rắn, bao gồm cả não, bàng quang, dạ dày, vú, phổi, nội mạc tử cung, cổ tử cung, âm hộ, buồng trứng, thực quản, dạ dày, tuyến tiền liệt, thận, tuyến tụy, u nguyên bào xốp, và các tế bào ung thư biểu mô, tác động trên các tế bào chất chất ở mức độ khác nhau. Các phân tử đặc biệt trên màng tế bào tương tác chọn lọc với các nano vàng dạng que với hàm lượng cao hơn với cá tế bào ung thư, cho phép quang nhiệt chọn lọc với tia laser hồng ngoại gần cho nhiều loại tế bào ung thư. Sự tán xạ mạnh mẽ của que nano vàng cho phép chúng tương tác hình ảnh tốt. Như vậy, nano vàng dạng que đã cung cấp một phương pháp chuẩn đoán hình ảnh và điều trị lép trong cảm biến sinh học và điều trị ung thư, có thể điều chỉnh để sử dụng trong các vùng ánh sáng khả kiến và gần hồng ngoại. 4.

Kết luận

Nghiên cứu này cho thấy rằng nano vàng dạng que là một nhóm các tác nhân tương phản hình ảnh và điều trị kép quang học hoạt động do sự hấp thu mạnh mẽ và tán xạ hồng ngoại. Bằng cách sử dụng plasmon bề mặt quang phổ cộng hưởng và hình ảnh tán xạ ánh sáng, các tế bào ác tính HSC và HOC dễ dàng phân biệt với các tế bào bình thường HaCaT do sự tác động chọn lọc của các protein EGFR trên bề mặt của tế bào ác tính. Sau khi tiếp xúc với các tế bào, kháng thể liên hợp anti – EGFR gắn trên que nano vàng, dưới tác động của bức xạ lasers có bước sóng 800 nm với các cường độ khác nhau được khảo sát để gây ra sự quang nhiệt hủy giữa các tế bào ác tính và bình thường. Tăng sự hấp thụ của các thanh nano của tế bào ác tính đã làm giảm năng lượng cần thiết để quang nhiệt hủy các tế bào xuống bằng một nữa so với năng lượng cần thiết để gây ra sự phá hủy của tế bào bình thường. Que nano vàng đại diện cho một chất hấp phụ Trang 21

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý quang học hoạt động tương thích sinh học và phân tán có khả năng định hướng cho sự quang nhiệt hủy chọn lọc điều trị bệnh ung thư.

Trang 22

ĐH KHTN – Khoa hóa – BM. Hóa Lý Tài liệu tham khảo [1] ] http://www.benhvienhyvongmoi.vn/chi-tiet-tin/l-24/t-78 , 2014. [2] Ivan H. El-Sayed,

Xiaohua Huang,

Mostafa A. El-Sayed. Surface Plasmon

Resonance Scattering and Absorption of anti-EGFR Antibody Conjugated Gold Nanoparticles in Cancer Diagnostics: Applications in Oral Cancer. Nano Letters Vol 5, No 5 (2005). 829-834. [3] Srivalleesha Mallidi, Timothy Larson, Justina Tam, Pratixa P. Joshi, Karpiouk,

Konstantin

Sokolov

and

Stanislav

Emelianov.

Andrei

Multiwavelength

Photoacoustic Imaging and Plasmon Resonance Coupling of Gold Nanoparticles for Selective Detection of Cancer. Nano Letters Vol 9, No 8 (2009). 2825-2831. [4] Xiaohua Huang, Ivan H. El-Sayed, Wei Qian and Mostafa A. El-Sayed. Cancer Cell Imaging and Photothermal Therapy in the Near-Infrared Region by Using Gold Nanorods. Jounal of the American Chemical Society(JACS). Vol 128, No 6, (2006). 2115-2120.

Trang 23