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MÓDULO II: UNIDAD 1 CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL PRODUCTO ACABADO Y SEMIELABORADO

Introducción y Objetivos de la Unidad Según el Reglamento 1223/2009 sobre productos cosméticos, el fabricante de dichos productos es el responsable de su seguridad. Esto significa que, desde el punto de vista microbiológico, el producto situado en el punto de venta debe tener un número bajo de microorganismos y estar libre de algunos específicos. Por otra parte, debe asegurarse de que los microorganismos que puedan llegar al producto cosmético durante su uso habitual no proliferarán afectando adversamente a su calidad y seguridad, es decir, de que esté bien conservado. El riesgo dependerá de la capacidad que tenga el producto de albergar un crecimiento microbiano; como veremos en el Módulo IV, la probabilidad de que algunos productos cosméticos se contaminen es extremadamente baja, debido a características fisicoquímicas como una baja actividad de agua, un pH extremo, etc. En estos casos el producto estaría exento de análisis microbiológico. Sin embargo, la mayoría de cosméticos ofrece condiciones óptimas para la proliferación microbiana, como agua, nutrientes y otros factores de crecimiento. Además, las condiciones de fabricación y almacenamiento a temperatura ambiente, el pH alrededor de la neutralidad, la humedad relativa a la cual pueden almacenarse y las condiciones de utilización por parte de los consumidores hacen que sean un medio óptimo para el crecimiento microbiano, lo que puede suponer un peligro para el consumidor y un deterioro de las características del producto. Para evitarlo, la calidad del producto acabado se debe asegurar mediante la aplicación de unas Buenas Prácticas de Fabricación (BPF, Módulo III) durante la producción – además del control de las materias primas, la utilización de conservantes y estrategias de conservación adicionales (Módulo IV) y el control microbiológico del producto semielaborado y acabado, que es el objetivo que ahora nos ocupa.

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FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Control microbiológico del producto acabado

En esta Unidad nos centraremos en el control microbiológico utilizando las técnicas clásicas de Microbiología y en base a la Normativa UNE-EN-ISO. Haremos un especial énfasis en la comprobación de la idoneidad o aptitud de los métodos de recuperación de microorganismos, aspecto imprescindible en cualquier análisis microbiológico en Cosmética. Además, conoceremos los límites de contenido microbiano que recomiendan diferentes Organizaciones, ante la carencia de legislación en este aspecto. Los objetivos de esta Unidad son, por tanto: -

Conocer los principales tipos de microorganismos que pueden contaminar un producto cosmético según sus características.

-

Saber cómo se realiza un muestreo para el análisis microbiológico.

-

Saber cómo se lleva a cabo el análisis microbiológico completo de una muestra cosmética y cuáles son los requerimientos aconsejados en cuanto a contenido microbiano para comercializar los productos acabados.

-

Saber cómo se realizan los ensayos de aptitud de los métodos descritos y reconocer la importancia de comprobar la idoneidad de la neutralización de los conservantes.

Índice de la Unidad 1. Generalidades ......................................................................................................... 3 2. Normativa aplicable .................................................................................................. 6 3. Muestreo .................................................................................................................. 9 Producto semielaborado (granel) .............................................................................................. 9 Producto elaborado (unidades envasadas) ............................................................................. 10 Preparación de las muestras ................................................................................................... 12

4. Recuento de bacterias aerobias mesófilas, mohos y levaduras ....................... 15 Siembra en masa (o por inmersión o en profundidad) ............................................................ 16 En superficie o por extensión .................................................................................................. 17 Filtración a través de membrana ............................................................................................. 18 Cálculo de resultados .............................................................................................................. 19 MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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5. Detección de microorganismos aerobios mesófilos (enriquecimiento) ........... 21 6. Detección de microorganismos patógenos ........................................................ 22 Detección de Escherichia coli .................................................................................................. 23 Detección de Staphylococcus aureus ..................................................................................... 24 Detección de Candida albicans ............................................................................................... 26 Detección de Pseudomonas aeruginosa ................................................................................. 27

7. Comprobación de la idoneidad del método (neutralización y recuperación) ... 28 Validación y neutralización. Generalidades ............................................................................. 28 Idoneidad del método de siembra por inclusión ...................................................................... 31 Idoneidad del método de la siembra en superficie .................................................................. 35 Idoneidad del método de filtración a través de membrana ..................................................... 35 Idoneidad del método de detección de bacterias mesófilas aerobias y hongos por enriquecimiento........................................................................................................................ 36 Idoneidad del método de detección de microorganismos patógenos ..................................... 37 Interpretación de los resultados de los ensayos de idoneidad ................................................ 40 Validación de un método alternativo ....................................................................................... 40

8. Límites ................................................................................................................... 41 UNE-EN ISO 17516:2014. ....................................................................................................... 41 SCCS, Scientific Committee on Consumer Safety- Europa .................................................... 42 USA (PCPC, Personal Care Product Council) ........................................................................ 42 Farmacopea Europea / USA.................................................................................................... 42 España. Ministerio de Sanidad y Consumo............................................................................. 43

9. Bibliografía ............................................................................................................ 44 Anexo 1...................................................................................................................... 46 Anexo 2...................................................................................................................... 49 Anexo 3...................................................................................................................... 51

1. Generalidades El control microbiológico de los productos cosméticos es de suma importancia para garantizar la seguridad del consumidor y también para mantener la calidad del cosmético, sobre todo de cara a la imagen de la empresa que los comercializa. En los años 60 los problemas microbiológicos se centraban en evitar el crecimiento visible de mohos en la superficie de los productos, pero en 1969 un informe de la FDA (Food and Drug Administration - USA) mostraba que el 25% de los cosméticos estaban contaminados y que predominaban las bacterias Gram negativas. A partir de MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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ahí, la CTFA (Cosmetics, Toiletries and Fragrance Association) en el mismo país creó comités para la garantía de calidad microbiológica de los productos cosméticos para estudiar la situación y redactar guías sobre Microbiología y también sobre Buenas Prácticas de Fabricación para la industria. En la segunda mitad de los años 70, la atención se focalizó en los cosméticos que se aplican alrededor de los ojos, después de que hubiera habido casos de ceguera producidos por máscaras de pestañas contaminadas con Pseudomonas aeruginosa. Debido a ello, se desarrollaron los ensayos de eficacia conservante (Challenge Tests), que veremos en el Módulo IV. Actualmente, se han dado casos de infecciones en hospitales debidas a colutorios contaminados por Burkholderia en personas inmunodeprimidas. Los microorganismos más habituales que pueden contaminar los productos cosméticos de base acuosa (champús, geles de baño, lociones, acondicionadores capilares, etc.) son bacterias Gram negativas, tanto si el origen es el entorno de fabricación como si es en su utilización por el consumidor (ver Tabla I), ya que habitan principalmente en lugares con presencia de agua. Entre las bacterias Gram negativas, son de especial importancia las que pertenecen a la familia de las pseudomonadáceas (géneros Pseudomonas, Burkholderia, Xanthomonas, Acinetobacter, Alcaligenes, etc.). Son microorganismos que se adaptan fácilmente a cualquier ambiente, siempre que éste sea acuoso. Su principal origen es el agua de fabricación o materias primas diluidas en agua, como las soluciones de tensioactivos, opacificantes, polímeros, etc. Pueden metabolizar virtualmente casi cualquier sustrato; como ejemplo, Burkholderia cepacia es capaz de metabolizar hasta 100 moléculas orgánicas conocidas. También, dentro del grupo de Gram negativas, es fácil aislar enterobacterias como las del género Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Proteus, Klebsiella, etc. No son tan flexibles metabólicamente como las anteriores, pero también se encuentran frecuentemente en ambientes acuosos. Los microorganismos Gram positivos no son tan versátiles como las bacterias Gram negativas y en productos con tensioactivos (aniónicos y particularmente catiónicos) es difícil encontrarlos, puesto que sus formas vegetativas son muy sensibles a ellos, así como a los conservantes más comúnmente utilizados en cosmética. Pueden aparecer como esporas (bacilos esporulados) en productos que no se han fabricado en MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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condiciones higiénicas o con materias primas contaminadas y, sobre todo, en productos pulverulentos, que pueden ser fuente de infección por Clostridium. Por otra parte, la presencia de estafilococos o micrococos (microorganismos de la piel) indicaría una manipulación humana deficiente. Tabla I. Microorganismos aislados, de mayor a menor frecuencia, en los productos cosméticos dependiendo del origen. Origen: consumidor Bacterias Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas spp Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter spp Moraxella spp Enterobacter spp Citrobacter freundii Klebsiella pneumoniae K. oxytoca Serratia spp Staphylococcus aureus S. epidermidis Sarcina spp Propionibacterium spp Corynebacterium spp Streptococcus mutans Bacillus spp Clostridium perfringens C. tetani Hongos Candida albicans Rhodotorula spp Penicillium spp Aureobasilium pullulans Scopulariosis spp

Origen: fabricación Burkholderia cepacia B. picketti Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas spp Acinetobacter spp Moraxella spp Enterobacter spp Citrobacter freundii Klebsiella pneumoniae K. oxytoca Serratia marcescens Serratia spp Salmonella spp Ochrobacterium anthropi Proteus spp Aeromonas sobria Bacillus spp

Candida lipolytica Saccahromyces cerevisiae Penicillium spp Aureobasidium pullulans Paecilomyces variotii

Tras las bacterias Gram negativas, los mohos y levaduras son la causa más frecuente de contaminación de productos cosméticos. Estos microorganismos los encontraremos en productos con una baja actividad de agua, como pomadas, ceras, etc. y serán indicativos de un ambiente poco higiénico o de materias primas/material de acondicionamiento contaminados. Los mohos crecen siempre en la superficie de los productos de una forma característica (requieren oxígeno para su crecimiento) y es

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una de las causas que peor imagen generan de la empresa cosmética. Los hongos, además, siempre prefieren un ambiente ácido para su proliferación. La Tabla II recoge una lista de los productos cosméticos retirados del mercado europeo en el periodo 2005-2008. Como se puede observar, las bacterias Gram negativas, y en concreto P. aeruginosa, son las más frecuentemente aisladas. En general, los productos con un pH alrededor de la neutralidad será donde podamos encontrar microorganismos patógenos, mientras que en productos de pH entre 3 y 10 podremos encontrar también microorganismos alterantes. Tabla II. Productos retirados del mercado europeo por contaminación microbiana en el periodo 2005-2008. Lundov and Zachariae, 2008.

2. Normativa aplicable Los métodos de control microbiológico aquí descritos se basan en el recuento de bacterias aerobias mesófilas y hongos (mohos y levaduras), y en la detección de los patógenos: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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Candida

albicans.

En

según

qué

casos,

además

de

determinar

cuántos

microorganismos hay en una muestra, es necesario detectar cualquier microorganismo que esté presente (patógeno o no) aun a niveles muy bajos, por lo que se aconseja el método de enriquecimiento. No existe ningún método oficial de control microbiológico de cosméticos a día de hoy; los métodos descritos en esta Unidad están basados en las siguientes Normas ISO (International Standard Organization), a su vez Normas UNE-EN, aunque se pueden seguir otros (Farmacopeas, Ministerio de Sanidad, etc.). -

UNE-EN ISO 21148:2010 Cosméticos. Microbiología. Instrucciones generales para el examen microbiológico.

-

UNE-EN ISO 21149:2010 Cosméticos. Microbiología. Detección y recuento de bacterias aerobias mesófilas.

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UNE-EN ISO 16212:2011. Cosméticos. Microbiología. Enumeración de levaduras y mohos.

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UNE-EN ISO 18415:2012 Cosméticos. Microbiología. Detección de microorganismos específicos y no específicos.

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UNE-EN ISO 18416:2015 Cosméticos. Microbiología. Detección de Candida albicans.

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UNE-EN ISO 21150:2015 Cosméticos. Microbiología. Detección de Escherichia coli.

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UNE-EN ISO 22717:2015 Cosméticos. Microbiología. Detección de Pseudomonas aeruginosa.

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UNE-EN ISO 22718:2015 Cosméticos. Microbiología. Detección de Staphylococcus aureus.

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UNE-EN ISO 29621:2011 Cosméticos. Microbiología. Directrices para la evaluación del riesgo y la identificación de productos de bajo riesgo microbiológico.

En el Cuadro 1 se explica la importancia de cada grupo de Normas y lo que han aportado al campo de la Microbiología Cosmética, ya que hasta su publicación no había un consenso acerca de cómo realizar los ensayos microbiológicos a nivel global. Dos de las premisas que siempre marcan las Normas es que puedan ser llevadas a cabo por cualquier empresa, por limitados recursos que tenga, y estandarizar las técnicas microbiológicas. Se intenta, a su vez, que todas las Normas estén coordinadas entre sí. Cuando se realizan los ensayos para determinar la contaminación microbiológica es indispensable asegurar que cualquier conservante presente en la muestra ha sido inactivado. En caso contrario, llegaríamos a interpretaciones erróneas de los recuentos MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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o detecciones obtenidos. Por ello, debe confirmarse previamente la validez del método de recuento y de la detección de patógenos mediante una comprobación de la idoneidad de los neutralizantes y del método utilizado (ver apartado 7). Cuadro 1 Los objetivos de las Normas ISO de Microbiología Cosmética y algunas de las aportaciones a este campo se listan a continuación: UNE-EN ISO 21148:2010. Instrucciones generales para el examen microbiológico. El objetivo es asegurar que las técnicas generales que se utilizan para llevar a cabo los exámenes microbiológicos en productos cosméticos sean las mismas en todos los laboratorios que las adopten. Algunas de las aportaciones importantes que se encuentran en el texto son: -

Recomendación de cómo tienen que ser las instalaciones y equipamiento. Preparación de los equipos y del material de laboratorio, esterilización, almacenamiento. Prevención de Riesgos Laborales del personal del laboratorio y de prevención de contaminación del medio ambiente. Obtención de resultados homogéneos. Exigencia de rigor en el cálculo. Exige la formación del personal. Es factible utilizar procedimientos alternativos siempre que se demuestre su equivalencia. Anexos referentes a técnicas de identificación, recuento y siembra y estandarización de inóculos.

-

UNE-EN ISO 21149:2010 Cosméticos. Microbiología. Detección y recuento de bacterias aerobias mesófilas. UNE-EN ISO 16212:2011. Cosméticos. Microbiología. Enumeración de levaduras y mohos Muestran las directrices generales para la detección y enumeración de microorganismos mesófilos aerobios (bacterias, hongos) presentes en los productos cosméticos: -

Mediante el recuento de colonias en agar no selectivo después de la incubación aeróbica o bien, Mediante la comprobación de la ausencia de crecimiento bacteriano después de un enriquecimiento.

Las aportaciones más importantes de estas dos Normas son: -

Importancia de comprobar la idoneidad de la neutralización. Se pueden utilizar otros métodos (rápidos) siempre que se validen. Aconseja llevar a cabo un análisis de riesgo microbiológico con el fin de determinar si la Norma es aplicable. Incluye un capítulo de ejemplo de cálculo de resultados, ejemplos de diluyentes y medios de cultivo y un Anexo de los neutralizantes de moléculas antimicrobianas.

UNE-EN ISO 18416:2015; UNE-EN-ISO 21150:2015; UNE-EN ISO 22717:2015; UNE-EN ISO 22718:2015; UNE-EN ISO 18415:2012: Normas acerca de la detección de patógenos y microorganismos específicos y no específicos. Al igual que las dos Normas anteriores, este grupo incluye la importancia de comprobar la idoneidad de la neutralización, la premisa de pueden utilizarse otros métodos siempre que se validen y el consejo de llevar a cabo un análisis de riesgo microbiológico previo, con el fin de determinar si las Normas son aplicables. UNE-EN ISO 29621:2011 Cosméticos. Microbiología. Directrices para la evaluación del riesgo y la identificación de productos de bajo riesgo microbiológico. Esta Norma era necesaria, ya que asesora a la industria y a las autoridades reguladoras en la definición de productos acabados que presentan un bajo riesgo de contaminación durante su producción y/o uso, después de efectuar un análisis de riesgos y a juicio de un profesional. Incluye también la premisa de poder evaluar el riesgo en base al historial del producto, por experimentos que lo demuestren o por referencias bibliográficas. El resultado del análisis de riesgos permite determinar qué nivel de análisis es necesario para asegurar la calidad del producto, o incluso concluir que la aplicación de rutina de las Normas Internacionales de Microbiología para cosméticos no es necesaria. Esta Norma no la desarrollaremos en esta Unidad, sino en el Módulo IV.

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Para el recuento de microorganismos aerobios y detección de patógenos puede utilizarse el método de siembra en placa o el método de filtración a través de membrana. Este último método es útil si la muestra presenta propiedades inhibidoras del crecimiento microbiano que no pueden neutralizarse o diluirse adecuadamente, o bien para muestras que presentan una contaminación microbiana muy baja. Es aconsejable también para el análisis del agua como materia prima (Módulo II, Unidad 3). En el anexo 1 se detallan los diluyentes y medios de cultivo aconsejados para los análisis y en el anexo 2 los neutralizantes recomendados, ambos según Normativa ISO. La Normativa también contempla la utilización de cualquier otro medio de cultivo, diluyente, medio neutralizante, etc., siempre que se haya demostrado previamente su idoneidad en la recuperación de los microorganismos para el método escogido. Para la realización de los ensayos es muy aconsejable tomar como referencia, para el trabajo en el laboratorio microbiológico, la Norma UNE-EN-ISO 21148: Instrucciones generales para el examen microbiológico. 3. Muestreo La empresa cosmética debe tener definido, por escrito y aprobado un plan de muestreo, dependiendo del tipo de producto y condiciones de fabricación y envasado. Además, debe tener establecida la caducidad de los análisis del producto semielaborado y un plan de actuación en caso de obtener Resultados Fuera de Especificaciones (OOS) o, específicamente en Microbiología, Microbial Data Deviations (MDD), en graneles y producto acabado. También es muy importante guardar muestras representativas del producto acabado en la muestroteca, pero también de graneles, ya que nos puede ayudar posteriormente a la investigación de alguna desviación. Estos temas los estudiaremos en el Módulo III (Buenas Prácticas de Fabricación). Producto semielaborado (granel) Algunas de las instrucciones que deben seguirse para conseguir una muestra representativa de un granel serían las siguientes:

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La extracción de muestras se debe realizar con utensilios limpios (espátulas, cucharas, sacamuestras, etc.), de material inerte (acero inoxidable, plástico o vidrio) y estéril.

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La cantidad de muestra a extraer debe ser la suficiente como para realizar los análisis por triplicado de forma separada.

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Se debe tomar una muestra por cada partida de producto granel y la toma se debe realizar por las válvulas o bocas de acceso al reactor o depósito fijo o móvil, siempre que esté asegurada la homogeneidad del producto. En el caso de que la homogeneidad no esté asegurada o se requiera un nivel exhaustivo de control microbiológico (definido más adelante para el producto acabado) debería analizarse muestras de la parte inferior y superior del reactor o depósito.

-

Si la muestra se ha extraído de un contenedor, éste debe señalizarse colocándole un adhesivo de muestreo.

-

Las muestras extraídas se deben identificar convenientemente, indicando como mínimo el nombre o referencia interna, lote, parte del contenedor de donde se ha extraído, fecha de muestreo y firma de la persona que realiza el muestreo.

Producto elaborado (unidades envasadas) En el anexo 3 se muestra una tabla de unidades a muestrear dependiendo del tamaño del lote, según UNE-ISO 2859-1:2012. Procedimientos de muestreo para la inspección por atributos. Parte 1: Planes de muestreo para las inspecciones lote por lote, tabulados según el nivel de calidad aceptable (NCA). En la práctica, en lotes de producción formados por un número elevado de unidades, no es posible realizar el número de análisis que se muestra en dicha tabla, por lo que, en general, se establecen diferentes niveles de muestreo que dependen de varios factores o de niveles de actuación previamente establecidos. A la hora de realizar el muestreo se debe tener en cuenta que es necesario disponer de unidades tomadas en diferentes momentos del envasado para que éstas sean lo MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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más representativas posibles de un lote. Basándonos en esta premisa y únicamente como ejemplo, podríamos definir un nivel mínimo de muestreo, de la siguiente forma: -

Toma de 2 unidades al inicio del envasado del lote, 1 unidad a la mitad y 1 unidad al final.

Sin embargo, factores como el volumen del lote, proceso de fabricación en continuo, paros o averías en la línea durante el envasado de un producto, hacen recomendable incrementar el nivel de muestreo de la siguiente manera: -

Cuando el envasado de un lote de producto puede durar más de 1 turno (8 h), por ejemplo, en un lote de producto de gran volumen almacenado en depósito de elevado tonelaje o fabricaciones en continuo, se recomienda tomar 2 unidades al inicio, 1 unidad cada 2 h y 1 unidad al final del envasado.

-

Si el producto a granel que se va a envasar está almacenado en varios depósitos/recipientes de baja capacidad (por ejemplo, contenedores de 100, 200 o 1000 kg), y siguiendo el mismo criterio definido anteriormente, se recomienda tomar unidades que proceden de cada uno de los depósitos que forman parte del mismo lote.

-

Cuando se está envasando y se produce un paro/avería en la línea durante un periodo de tiempo superior a 2 h, al reiniciar de nuevo el envasado se recomienda tomar 2 unidades y seguir con la pauta establecida.

En caso de un nivel exhaustivo pueden multiplicarse las muestras por dos. Dicho control más exhaustivo estaría justificado cuando: -

Es una primera fabricación de un producto o se ha cambiado algún ingrediente relevante.

-

Es un producto destinado a población especialmente sensible (bebés, personas inmunodeprimidas (hospitales), pieles atópicas, ancianos, higiene íntima, etc.).

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Ha habido problemas de contaminación previos.

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Se ha cambiado alguna etapa en la producción.

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Se ha realizado alguna actuación en la maquinaria de producción/envasado.

Por el contrario, ciertos productos no requieren un control tan exhaustivo, como los clasificados de bajo riesgo microbiológico. Este tema lo estudiaremos en el Módulo IV, Unidad 2. Preparación de las muestras Todas las operaciones de toma de muestra y de homogenización de la misma deben realizarse en las máximas condiciones de asepsia, con el fin de evitar contaminaciones externas: -

La muestra debe procesarse en una cabina de seguridad biológica (CSB) y llevar guantes.

-

Debe desinfectarse la parte externa del envase de la muestra con etanol preparado al 70% antes de la toma de muestra.

-

En todas las operaciones posteriores, deben utilizarse materiales estériles o asépticos (jeringuillas, espátulas, cuchillas, etc.) y condiciones que aseguren que no se contamina la muestra durante el ensayo.

En este punto, cabe decir que, si el procedimiento de análisis implica la combinación o mezcla de muestras, este proceso sólo se debe realizar en el laboratorio y utilizando material nuevo y estéril para cada muestra. Este procedimiento es necesario sobre todo en el caso de productos de un volumen pequeño, como máscaras, monodosis etc. pero también puede realizarse con las muestras que provienen de un mismo momento de envasado.

Acondicionamiento La gran cantidad de tipos de muestras que existen en la industria cosmética hace que el acondicionamiento y la dilución, suspensión o dispersión de la muestra sean tareas en algunos casos no muy sencillas, ya que, sean cuales sean las características de la muestra, ésta debe poderse procesar de modo que no dañe a los posibles MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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microorganismos presentes y, por supuesto, en condiciones de máxima asepsia. Algunas de las acciones que se pueden realizar son las siguientes: -

Los líquidos, geles, cremas y polvos se deben agitar bien dentro de su envase primario con ayuda, si es necesario, de espátulas estériles.

-

Los polvos compactos deben disgregarse antes de mezclarlos, en un mortero estéril con bolas de vidrio estériles.

-

Las pastillas de jabón y otras muestras moldeadas se cortan con cuchilla estéril.

-

En el caso de aerosoles, se desecha la primera parte de la muestra, se pulveriza directamente dentro de un recipiente estéril y se diluye posteriormente.

-

En el caso de espumas, se deja reposar la muestra después de pulverizarse en un recipiente estéril para que desaparezca el gas y se diluye posteriormente.

-

En el caso de toallitas cosméticas o parches, éstos se extraen de su envase y se sumergen en el caldo neutralizante. Puede realizarse, en paralelo, un análisis del líquido escurrido si estos soportes se encuentran humedecidos.

Dilución Consiste en pesar o medir la muestra y diluir, disolver o suspender en el diluyente estéril apropiado, es decir, que no tenga actividad biocida, y siempre en condiciones asépticas. La muestra diluida debe procesarse, por cualquiera de los métodos que luego se describen, antes de 45 min. En el caso de que sospechemos que existe una elevada contaminación, se deben realizar diluciones decimales sucesivas en el diluyente escogido, con el fin de obtener un número de UFC (Unidades Formadoras de Colonias) comprendido entre los límites recomendados (30-300 UFC/placa). La dilución 1/10 es la recomendada para el análisis. Sin embargo, puede suceder que esta dilución no sea la idónea para neutralizar las moléculas antimicrobianas del producto y recuperar los microorganismos que pueden estar presentes en la muestra, MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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por lo que se deberá aumentar el volumen de diluyente (o reducir la cantidad de muestra) o probar diferentes neutralizantes. Este hecho se determina tras efectuar los ensayos de idoneidad (apartado 7), que deben realizarse antes de los análisis de recuentos o detecciones de microorganismos. También puede ser necesario realizar una dilución más alta cuando la muestra no permita, por su naturaleza, una dilución 1/10. Por otra parte, puede realizarse una composición de muestras, por ejemplo las tres unidades del inicio del proceso de envasado y así sucesivamente, siempre en condiciones de asepsia, como hemos visto antes. Muestras miscibles en agua El proceso sería como sigue: -

Diluir a una concentración 1/10 en un diluyente con neutralizantes y agitar hasta su completa solubilización. Es recomendable que la cantidad de muestra sea de, al menos, 1 g. Para pesar la muestra pueden utilizarse espátulas estériles, o jeringas desechables. A veces es útil disgregar la muestra aspirando con la propia jeringa varias veces la muestra en el diluyente.

-

Dejar la muestra en contacto de 15 a 20 minutos (el que se haya determinado) para asegurar la completa inactivación de los conservantes. Los compuestos neutralizantes recomendados figuran en el anexo 2, aunque en general todos los caldos neutralizantes que se comercializan contienen ya los neutralizantes más usuales.

-

Si la muestra no presenta conservantes, puede diluirse directamente en agua de peptona tamponada estéril.

Muestras grasas Mezclar la muestra inicial con 5 g de polisorbato 80 estéril precalentado a una temperatura de 40ºC. En este punto, puede mantenerse esta temperatura hasta obtener una mezcla homogénea no más de 10 minutos, removiendo con una espátula estéril. Añadir la cantidad de diluyente (por ejemplo, agua de peptona tamponada) necesaria para completar un volumen final para una dilución 1/10, calentada previamente a 40ºC, y formar una emulsión. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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Muestras pulverulentas Tomar la cantidad de muestra necesaria y suspender en el diluyente apropiado. Antes de realizar la siembra, agitar de nuevo la muestra. Otro tipo de muestras En el caso de otro tipo de muestras, por ejemplo toallitas o parches, suspenderlos en el peso adecuado de diluyente neutralizante para conseguir una dilución 1/10. Si la muestra no contiene conservantes, es aconsejable añadir un tensioactivo no iónico, como el polisorbato 80, para facilitar el desprendimiento de los posibles microorganismos de la muestra.

4. Recuento de bacterias aerobias mesófilas, mohos y levaduras Las bacterias mesófilas aerobias son microorganismos que pueden desarrollarse en un medio nutritivo a 30-35ºC en condiciones aerobias. Dentro de este grupo podemos encontrar microorganismos patógenos, ya que pueden crecer en estas condiciones. Sin embargo, lo más habitual es que se detecten microorganismos no patógenos para el ser humano pero que pueden alterar las características organolépticas del producto cosmético. Dentro de este grupo de microorganismos encontramos bacterias de la familia de las psedomonadáceas, enterobacterias, estafilococos coagulasa negativos, especies de Bacillus, etc. En el caso del recuento de mesófilos aerobios pueden detectarse colonias de hongos además de bacterias en el medio de cultivo para el recuento. En el caso del recuento específico de hongos, ya que los medios aconsejados contienen cloranfenicol, detectaremos éstos de forma selectiva. La metodología para el recuento de estos microorganismos dependerá del tipo de muestra a analizar y la sensibilidad que escojamos. Cada una de estas metodologías se describe a continuación.

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Siembra en masa (o por inmersión o en profundidad) La siembra en masa consiste en mezclar una alícuota de la muestra (o de una dilución de la misma) con un medio nutritivo no selectivo que contenga agar (ver medios sólidos para el recuento en el anexo 1). Se deja solidificar y se incuba el tiempo suficiente para que se desarrollen colonias microbianas, que indicarán el número de microorganismos cultivables presentes en la muestra. Brevemente, el método es como sigue: -

De la muestra diluida, tomar 1 ml y depositarlo en una placa Petri vacía, previamente rotulada en su base con el número de referencia de laboratorio, la dilución sembrada y la fecha de análisis. Deben sembrarse, como mínimo, dos placas por dilución.

-

Añadir unos 20-25 ml del medio sólido para el recuento adecuado, fundido y mantenido a 48±3º C.

-

Mezclar por rotación la muestra con el agar, evitando mojar la tapa de la placa, y dejar solidificar.

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Incubar las placas en posición invertida a 32,5 ± 2,5ºC durante 72 h ± 6 h. En general, a las 48 h podemos observar colonias, pero en el caso de control microbiológico de tensioactivos aniónicos diluidos y productos con un elevado contenido en agua como son geles de baño, champús y acondicionadores capilares, es aconsejable prolongar la incubación 24 h más, para permitir el crecimiento de colonias de posibles microorganismos como Burkholderia. Este microorganismo, habitual en los productos cosméticos, forma colonias muy pequeñas y difíciles de visualizar.

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En el caso de recuento de hongos, incubar de 3 a 5 días a 25 ± 2,5ºC.

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Control de esterilidad del medio con agar nutritivo: depositar en una placa de Petri 20-25 ml del medio de cultivo elegido. Dejar solidificar e incubar como se describe anteriormente.

MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús

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FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Control microbiológico del producto acabado

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Control de esterilidad del diluyente: depositar en una placa de Petri 1 ml del diluyente sin muestra problema y añadir el medio con agar de igual forma. Incubar como se describe anteriormente.

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Después de la incubación, contar el número de colonias que se han desarrollado en cada placa. Calcular el número de UFC/g ó ml de muestra, teniendo en cuenta la dilución efectuada y el volumen sembrado (ver apartado “cálculo de resultados”). El límite de sensibilidad de este método es de