Modul Kimia Analisis

DIKTAT MATA KULIAH

K I M I A AN ALI S I S

: Drs. Adiwarna Disusun oleh

JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH JAKARTA

2008

1. Pengantar kimia Analisis Kimia analisis adalah suatu cabang ilmu kimia yang digunakan untuk analisa kimia berdasarkan besaran parameter kimia dan fisika dari suatu sampel secara kualitatif dan kuantitatif. 1.1. analisa kualitatif dan kuantitatif, a. Analisa kimia kualitatif adalah analisa kimia untuk mengetahui jenis atom, unsure, ion, molekul atau spesies yang terdapat dalam suatu larutan sampel. Analisa kualitatif bisa dilakukan dengan analisa aroma, warna, warna pembakaran, rasa, warna nyala, analisa kation, analisa anion, menggunakan pereaksi spesifik, atau dengan menggunakan alat analisa kimia kualitatif. - Analisa kation meliputi golongan I yakni Ag+, Hg2+2, Pb+2 ( golongan chlorida ), golongan IIA yakni Hg+2, Cu+2, Bi+3, Cd+2 (golongan H2S), golongan IIB yakni As+3, As+5, Sb+3, Sb+5, Sn+2, Sn+4 (golongan S=); golongan III yakni Fe+3, Cr+3, Al+3, Co+2, Ni+2, Mn+2, Zn+2 (golongan hidroksida), golongan IV yakni Ca+2, Ba+2, Sr+2 (golongan karbonat), Golongan V yakni Na+, K+, Mg+2, NH4+, H+, Li+ (golongan sisa) - Analisa anion meliputi golongan : -- A1 CO3=, HCO3-, S=, S2O3=, SO3=, NO2-, OCl-, CN-, CNO- ( golongan asam encer), -- A2 yakni F-, SiF6=, Cl-, Br-, I-, NO3-, ClO3-, ClO4-, MnO4-, CNS-, HCOO-, H3CCOO-, C2O4=, tartarat, citrate (golongan sulfat pekat). -- Golongan B1 yakni SO4=, S2O8=, PO4-3, PO3-3, AsO4-3, AsO3-3, CrO4=, Cr2O7=, SiO3=, SiF6=, Salisilat, Benzoat, H4C4O4= (golongan pengendapan), -- golongan B2 yakni MnO4-, MnO4=, CrO4=, Cr2O7= (golongan redoks)

b. Analisa kimia kuantitatif adalah analisa kimia untuk mengetahui kadar atom, unsur, ion, molekul, spesies yang terdapat dalam suatu sampel. Analisa kuantitatif dinyatakan dalam satuan %, ppt, molaritas, normalitas, molalitas, ppm, ppb.

1.2. Sampling Sampling adalah cara pengambilan sampel untuk digunakan dalam analisa kimia. Pada dasarnya cara sampling dapat dibagi menjadi : a. Gross sampling adalah pengambilan sampel secara kasar b. Random sampling adalah penganbilan sampel secara acak dari distribusi sampel c. Sistematik sampling adalah pengambilan sampel secara sitematik dari distribusi sampel d. Industrial sampling adalah pengambilan sampel sesuai dengan sampling port yang telah ditetapkan dalam suatu sistem industri kimia. 3.2. kesalahan analisa 3.2.1. Kesalahan konstan a. kesalahan operasional dan personal b. kesalahan alat dan reagen c. kesalahan metode d. kesalahan additive dan proporsional 3.2.2. Kesalahan aksidental 3.2.3. Minimasi kesalahan a. kalibrasi Perlakuan dengan blanko c. Perlakuan larutan standar d. menggunakan berbagai cara analisa e. Perlakuan analisa parallel f. Standard addisi g. standard dalam h. Aplikasi metode i. Dilusi isotop 3.2.4. Statistik sampling a. Ketepatan : nilai hasil ukur analisa mendekati nilai sebenarnya  b. Ketelitian : selisih antara dua hasil ukur c. Nilai rata-rata (: Jumlah hasil ukur (xi)/ jumlah pengukuran (n)

ml d. Deviasi relatif rata-rata : e. Kesalahan - kesalahan absolut ( e ) - kesalahan random ( xi -  - bias ( e = (xi -  e. Distribusi Normal

f. Pembandingan hasil

h. Standar deviasi --------------------------------------------------

s = √ Σ (Xi – Xr )2/ n - 1

VARIANSI = Σ (Xi – Xr )2/ n - 1 i. Koefisien variansi

- uji t t = ( x -  Ѵ n )/s uji t untuk pembandingan metode

t10 dari tabel = 2,23 untuk P = 0,05

- uji F F = S2A /S2B

- uji 

O

j. Analisa parallel

ts/n = kesalahan absolut L = ( 100 z ) % L = rentang data 1.3. tipe-tipe analisa kimia

Analisa kimia dapat digolongkan menjadi : - Analisa pendahuluan adalah analisa secara awal dari suatu sampel. - Analisa proximate dimana kadar masing unsur dalam sampel ditentukan berdasarkan senyawa-senyawa yang ada dalam sampel . - Analisa parsil adalah analisa menentukan konstituen tertentu dalam sampel. - Analisa konstituen runut adalah analisa penentuan kontituen dengan kadar sangat kecil sekali. - Analisa komplit adalah analisa masing-masing konstituen tergantung pada kadar nya dalam sampel analisa kimia berdasarkan kadar sampel dapat dibagi menjadi : - Analisa makro yakni penentuan konstituen dalam kadar lebih besar dari 0,1 gr. - Analisa semi mikro yakni penetuan kadar konstituen berkisar antara 0,01 – 0,1 gr. - Analisa mikro yakni penetuan konstituen dalam sampel kecil dari 0,001 gr, 1.4. Teknik analisa kimia Beberapa teknik yang sering digunakan dalan analisa kimia kuantitatif adalah : a. penentuan kadar yang cocok untuk suatu reaksi kimia baik dengan mengukur kadar reagen yang diperlukan untuk menyempurnakan reaksi atau pun berdasarkan kadar produk yang dihasilkan. b. menentukan alat analisa elektrik yang tepat. ( Amperometri, voltametri, konduktometri, potensiometri, coulombmetri ) c. Penentuan dengan menggunakan alat optik tertentu ( Spektrofotometer sinartampak-UV, spektrofotometer inframerah, spektrofotmeter resonansi magnit inti NMR, Spketrofotometer massa, spektrofotometer sinar X, spektrofotometer serapan atom, Spektrofotometer massa 2. Prinsip dasar kimia analisis 2.1. disosiasi elektrolitik,

Beberapa reaksi analisa kualitatif dan kuantitatif berlangsung dalam larutan encer. Oleh karena itu Hal ini merupakan pengetahuan dasar dimana pada kondisi tersebut reaksi ini berlangsung. Konsep tersebut merupakan teori sederhana dari disosiasi elektrolitik. Ionisasi asam dan basa di dalam larutan. Suatu asam bisa didefinisikan sebagai suatu senyawa yang bila dilarutkan dalam air akan mengalami disosiasi dengan pembentukan ion hidrogen sebagai ion positif. Kenyataannya ion hydrogen tak terdapat dalam kedaan bebas dalam larutan encer, tetapi setiap ion hydrogen bergabung dengan satu molekul air membentuk ion hidroksonium. Ion hidroksonium adalah proton terhidrasi sebagai berikut : a. Asam mono proton

HCl + H2O

HNO3 + H2O

H3O+ + Cl-

H3O+ + NO3 -

Ionisasi dapat menggambarkan seberapa besar kecengerungan ion hydrogen untuk bergabung dengan molekul air membentuk ion hidroksonium. Asam klorida dan asam nitrat diatas terurai dengan hampir sempurna di dalam larutan encer sesuai dengan persamaan reaksi di atas. Hal ini dapat dijelaskan dengan pengukuran titik beku dan metoda lainnnya. b. asam poliproton terionisasi dalam beberapa tahap. Pada asam sulfat satu ion hidrogennya dapat terdisosiasi hamper sempurna

H2SO4 + H2O

H3O+ + HSO4-

HSO4- + H2O

H3O+ + SO4=

H3PO4 + H2O

H3O+ + H2PO4-

H2PO4- + H2O

H3O+ + HPO4=

HPO4= + H2O

H3O+ + PO4-3

c. Asam lemah HOAct + H2O

H3O+ + ActO -

c. basa NaOH + 2H2O

Na(H2O)2+ + OH-

d. Basa poli hidroksi Ca(OH)2 + 4 H2O

Ca(H2O)4+2 + 2 OH-

Al(OH)3 + 6H2O

Al(H2O)6+3 + 3OH-

Kesetimbangan asam dan basa Menurut Bronsted-Lowry definisi asam dan basa adalah sebagai berikut : Asam adalah spesis yang mendonorkan (H+). and bases are adalah spesis yang menerima proton

Air Air akan mengalami reaksi kesetimbangan berikut : H2O

H+ + OH-,

Maka konstanta kesetibangan air : [H+] [OH-] Keq = ---------[H2O] Konsentrasi air dalam larutan air konstan dan ungkapan ini disederhanakan menjadi: Kw = (55,56 M) * Keq = [H +] [OH-] mana Kw disebut disosiasi konstan air dan sama 1.00x10-14 pada suhu kamar. Konsentrasi [H +] dan [OH-] karena sama 1.00x10-7 M.

asam Asam dalam air akan memisahkan, yang itu menyumbangkan proton itu. Kami menyebutnya asam yang terdisosiasi asam benar-benar kuat dan asam yang terdisosiasi asam hanya sebagian yang lemah. Kuat Asam Contoh: HNO3 (aq) + H2O NO3-(aq) + H3O + (aq) Keq = jumlah yang sangat besar Dalam contoh ini, HNO3 adalah asam dan H2O bertindak sebagai basis. NO3-disebut basa konjugasi dari asam HNO3, dan H3O + adalah asam konjugasi dari basa H2O. basa Basis dalam air dapat menerima sebuah proton dari air untuk menghasilkan OH-. Basa kuat adalah garam hidroksida yang terdisosiasi sepenuhnya dalam air, jadi pernyataan ini berlebihan. Tapi basa lemah tidak harus mengandung hidroksida sendiri, tetapi mereka menghasilkan solusi dasar dengan bereaksi dengan air. Lemahnya dasar contoh: NH3 (aq) + H2O NH4 + (aq) + OH-(aq) K = 1.8x10-5 Dalam contoh ini, NH3 adalah basa dan H2O bertindak sebagai asam. NH4 + adalah asam konjugasi dari dasar NH3, dan OH-adalah basa konjugat dari asam H2O. Sebuah senyawa yang dapat bertindak baik se 2.2. hukum aksi massa aktivitas larutan, k1 A + B ==== C + D k2 v1 = k1 [ A ] [ B ] v2 = k2 [ C ] [ D ] k1 [ A ] [ B ] = k2 [ C ] [ D ] k1 K = --------K2

[C][D] = ------------------[ A] [ B ]

Titrasi terbagi menjadi 4 bahagian : Tirasi adalah penyetaraan antara titrat ( zat yang dititrasi) dan titran (zat pentitrasi) dengan rumus V1N1 = V2N2 1. titrasi asam basa ( kesetimbangan asam basa) 2. titrasi pengendapan ( kesetibangan hasil kali kelarutan) 3. titrasi redoks ( kesemtibangan redoks ) 4. titrasi kompleksometri (kesetimbangan komleksometri)

2.1. Titrasi asam-basa From Wikipedia, the free encyclopedia Jump to: navigation, search

Titrasi setup. Buret biasanya akan dipegang oleh penjepit, tidak ditampilkan di sini. Merah muda ini kemungkinan besar disebabkan oleh penggunaan indikator fenolftalein. Titrasi asam-basa adalah penentuan konsentrasi asam atau basa dengan persis menetralkan asam / basa dengan asam atau basa konsentrasi diketahui. Hal ini memungkinkan untuk analisis kuantitatif dari konsentrasi asam diketahui atau larutan basa. Itu membuat penggunaan reaksi netralisasi yang terjadi antara asam dan basa dan pengetahuan tentang bagaimana asam dan basa akan bereaksi jika rumus mereka diketahui. Asam-Base titrasi juga dapat digunakan untuk mencari kemurnian persen bahan kimia.

Methoda titrasi Sebelum memulai suatu titrasi harus dipilih indikator yang cocok. Titik ekivalen pada suatu reaksi adalah titik dimana jumlah ekivalen dari reakstan yang bereaksi. Yang sangat realtif tergantung dengan asam dan basa yang digunakan. Ph pada titk equivalen dapat diperkirakan dengan menggunakan rumus berikut : 

Asam uat akan bereaksi dengan basa kuat membentuk pH netral.

 

Asam kuat akan bereaksi dengan asam lemah membentuk pH larutan asam (pH7) .

Bila asam lemah bereaksi dengan basa lemah titik equivalen akan menjadi basa jika basanya lebih kuat dari asamnya. Jika asam dan basanya sama kuat akan terjadi titik equivalent pada pH netral. Akan tetapi jika asam lemah sering kali tak bisa dititrasi dengan basa lemah karena karena perubahan warna pada indikator sering kali sangant cepat oleh karena itu sulit sekali untuk diamati perubahan warna indikatornya. Titik pada saat perubahan warna indikator disebut titik akhir titrasi. Pemilihan indikator yang cocok harus dilakukan, sebaiknya agar perubahan warna indikator menunjukan titik ekivalen dari suatu titrasi. Pertama buret harus dibasahi dengan larutan standard, pipet larutan yang tak diketahui, dan Erlenmeyer diisi dengan aquades. Kedua volume yang diketahui dari larutan yang tak diketahui konsentrasinya harus dipipet dan dimasukan kedalam erlenmeyer sambil ditambahkan beberapa tetes indikator. Buret harus selalu terisi larutan pentiter diatas skala buret agar mudah melakukan pembacaan skala volum pentiter yang terpakai. Kemudian larutan pentiter dialirkan dari buret ke dalam labu erlenmeyer titrat. Dengan cara demikian bisa diketahui banyaknya pentiter terpakai untuk netralisasi. Larutan pentiter dialirkan melalui ujung buret sampai indikator dalam larutan titrat berubah warna untuk menadai titrasi telah berakhir.voluume larutan pentiter yang terpakai dicatat sebagai volume untuk perhitungan titrasi.. Tiga titrasi harus dilakukan, kali ini lebih akurat, dengan mempertimbangkan kira-kira di mana titik akhir akan terjadi. Pembacaan pada buret pada titik akhir harus dicatat, dan ratarata untuk memberikan hasil akhir. Titik akhir tercapai ketika indikator hanya berubah warna secara permanen. Hal ini dapat dicapai dengan mencuci penurunan tergantung dari ujung buret ke dalam labu kanan pada akhir titrasi untuk mencapai penurunan yang lebih kecil dalam volume dari apa yang biasanya dapat dicapai dengan hanya solusi menetes dari buret. Asam-basa titrasi dilakukan dengan indikator fenolftalein, bila asam lemah - titrasi basa kuat, indikator biru bromthymol dalam asam kuat - reaksi basa kuat, dan indikator metil oranye untuk asam kuat - reaksi basa lemah. Jika dasar adalah dari skala, yaitu pH> 13,5, dan asam memiliki pH> 5,5, maka indikator kuning Alizarie dapat digunakan. Di sisi lain, jika asam adalah dari skala, yaitu pH > [H+] in basic solution was valid.

More Metal Hydroxide Equilibria and Another Intro to Complexation An example where Ksp is relatively large and we can neglect competing equilibrium: Mg(OH)2 (s)

Mg2+(aq) + 2 OH-(aq)

Ksp = [Mg2+][OH-]2 = 7.1x10-12 The solubility of Mg(OH)2 is equal to [Mg2+]. We need another equation to solve for [Mg2+]. From the stoichiometry of the reaction we know that 2 [Mg2+] = [OH-]. Substituting into the Ksp expression to eliminate [OH-]: Ksp = [Mg2+](2 [Mg2+])2 = 7.1x10-12 4 [Mg2+]3 = 7.1x10-12

[Mg2+]3 = 1.8x10-12 [Mg2+] = 1.2x10-4 An example where Ksp is very small and we can neglect hydroxide from the metal hydroxide dissolution: Al(OH)3 (s)

Al3+(aq) + 3 OH-(aq)

Ksp = [Al3+][OH-]3 = 3x10-34 The solubility of Al(OH)3 is equal to [Al3+]. Since Ksp is so small we can try solving this problem assuming that the [OH-] from the Al(OH)3 dissolution is negligible compared to the [OH-] from the dissociation of water. Ksp = [Al3+][OH-]3 = 3x10-34 [Al3+] = 3x10-34 / [OH-]3 pH

[OH-]

[Al3+]

3

1x10-11

3x10-1

4

1x10-10

3x10-4

5

1x10-9

3x10-7

6

1x10-8

3x10-10

7

1x10-7

3x10-13

At some pH the [Al3+] reaches a minimum and then increases with further increase in pH. The solubility of Al(OH)3 increases because a soluble complex, Al(OH)4-, begins to form at high pH. Precipitation (Insoluble Salts) pengantar Banyak ion logam membentuk senyawa yang larut dalam air. Kami menyebutnya garam larut (duhhh) atau presipitat. Umum presipitat karbonat, hidroksida, sulfat, dan sulfida. Ion yang kita anggap ion penonton ketika membahas kesetimbangan asam-basa akan membentuk garam larut. Garam larut dalam kontak dengan air mempertahankan keseimbangan dengan ion. Dalam kasus sederhana di mana tidak ada ion umum atau kesetimbangan bersaing, konsentrasi ion bergantung hanya pada konstanta kesetimbangan untuk endapan tertentu. Ketika kita berbicara tentang kesetimbangan kelarutan kita selalu menulis keseimbangan dengan padat di sebelah kiri. Sebagai contoh: Ba (IO3) 2 (s) Ba2 + (aq) + 2 IO3-(aq) Ekspresi konstanta kesetimbangan untuk garam larut ditulis mengikuti aturan yang sama seperti untuk keseimbangan lainnya. Konstanta kesetimbangan disebut produk kelarutan, Ksp. Ekspresi Ksp untuk kesetimbangan di atas adalah:

Ksp = [Ba2+][IO3-]2

Ksp Values for Some Precipitates Formula

Name

Ksp

AgCl

silver chloride

1.8x10-10

Al(OH)3 aluminum hydroxide 2x10-32 BaCO3

barium carbonate

5x10-9

Ba(IO3)2

barium iodate

1.6x10-9

BaSO4

barium sulfate

1.3x10-10

Fe(OH)2

iron(II) hydroxide

8x10-16

Fe(OH)3

iron(III) hydroxide

4x10-38

FeS

iron sulfide

6x10-18

PbCrO4

lead chromate

1.8x10-14

Pb(OH)2

lead hydroxide

2.5x10-16

PbS

lead sulfide

7x10-28

PbSO4

lead sulfate

1.6x10-8

The equilibria of insoluble salts is described in more detail in the document on solubility.

2.2.Titrasi pengendapan (Argentometry) Dalam kimia analitik, argentometri adalah jenis titrasi yang melibatkan perak (I) ion. Biasanya, digunakan untuk menentukan jumlah klorida hadir dalam sampel. Larutan sampel dititrasi terhadap larutan perak nitrat konsentrasi diketahui. Ion klorida bereaksi dengan perak (I) ion klorida untuk memberikan perak larut: Cl- (aq) + Ag + (aq) → AgCl (s) (Ksp = 1,70 × 10-10) CrO4-2 (aq) + Ag + (aq) → Ag2CrO4 (s) (Ksp = 1,70 × 10-10) Metode Volhard Contoh titrasi kembali, metode Volhard, dinamai Yakub Volhard, melibatkan penambahan perak nitrat kelebihan analit, klorida perak disaring, dan perak nitrat tersisa dititrasi terhadap tiosianat, [1] dengan besi (III) sebagai indikator yang membentuk darah-red [Fe (OH2) 5 (SCN)] 2 + pada titik akhir:

[edit] Mohr method Dalam metode Mohr, dinamai Karl Friedrich Mohr, kalium kromat merupakan indikator, memberikan kromat perak merah setelah semua ion klorida bereaksi: Cl- (aq) + Ag + (aq) → AgCl (s) (Ksp = 1,70 × 10-10) CrO4-2 (aq) + Ag + (aq) → Ag2CrO4 (s) (Ksp = 9 × 10-12) Solusinya harus mendekati netral, karena bentuk hidroksida perak pada pH tinggi, sedangkan kromat membentuk H2CrO4 pada pH rendah, mengurangi konsentrasi ion kromat, dan menunda pembentukan endapan. Karbonat dan fosfat mengendap dengan perak, dan harus absen untuk mencegah hasil yang tidak akurat. Metode Mohr dapat disesuaikan untuk menentukan kandungan klorin total sampel dengan membakar sampel dengan kalsium, maka asetat besi. Kalsium asetat "perbaikan" klorin bebas, endapan karbonat, dan menetralkan solusi yang dihasilkan. Asetat ferri menghilangkan fosfat. Semua klorida dilarutkan keluar dari residu, dan dititrasi. [1] Metode Volhard Contoh titrasi kembali, metode Volhard, dinamai Yakub Volhard, melibatkan penambahan perak nitrat kelebihan analit, klorida perak disaring, dan perak nitrat tersisa dititrasi terhadap tiosianat, [1] dengan besi (III) sebagai indikator yang membentuk darah-red [Fe (OH2) 5 (SCN)] 2 + pada titik akhir: Cl- (aq) + Ag + (aq) → AgCl (s) (Ksp = 1,70 × 10-10) Ag+ (aq) + SCN− (aq) → AgSCN (s) (Ksp = 1.16 × 10−12) Fe(OH)(OH2)52+ (aq) + SCN− (aq)→ [Fe(OH2)5(SCN)]2+ + OH− (Kst = 3,6 x 10-14)

Fajans method alam metode Fajans, dinamai Kazimierz Fajans, biasanya diklorofluoresein digunakan sebagai indikator, titik akhir ditandai dengan suspensi hijau berubah merah muda. Sebelum titik akhir titrasi, ion klorida tetap lebih. Mereka menyerap pada permukaan AgCl, menanamkan muatan negatif pada partikel. Melewati titik akhir-perak, kelebihan (I) ion menyerap pada permukaan AgCl, menanamkan muatan positif. Pewarna anionik seperti diklorofluoresein tertarik pada partikel, dan mengalami perubahan warna pada adsorpsi, akili titik akhir. Eosin (tetrabromofluorescein) cocok untuk titrasi melawan bromida, iodida, dan anion tiosianat, memberikan tajam akhir-poin dibandingkan diklorofluoresein. Hal ini tidak cocok untuk titrasi terhadap anion klorida karena mengikat AgCl lebih kuat daripada klorida tidak. [2] Cl- (aq) + Ag + (aq) → AgCl (s) (Ksp = 1,70 × 10-10) Ind-n (aq) + Ag + (aq) → AgnInd (s) (Ksp = 6,3 × 10-16)

Ind = indikator

3. Titrasi redoks Titrasi redoks adalah titrasi antara oksifator dengan reduktor. Oksidator meningkatkan muatan hasil reduksi, dan reduktor menurunkan muatan pengoksidasi. Contoh reaksi oksidasi reduksi adalah titrasi permanganometri antara anion permanganate dengan anion oksalat pada suhu 50 – 70 oC. MnO4− + 8H+ + 5e− → Mn2+ + 4H2O

Eo = +1.5119 Volt

C2O4= CO2 + 2eEo = - 0,44 Volt ---------------------------------------------------------------------------------------------2 MnO4- + 16 H+ + 10e 2 Mn+2 + 8 H2O Eo = + 1,5119 Volt 5 C2O4=

10 CO2 + 10e-

Eo = - 0,44

Volt

+ ----------------------------------------------------------------------------------------------2 MnO4- + 16 H+ + 5 C2O4= 2 Mn+2 + 8 H2O + 10 CO2 Eo = + 1,0719 Volt Esel

= (b Eo1 + a Eo2)/ab - RT/ab F ln K

Esel

= (b Eo1 + a Eo2)/ab - 0,05916/ab ln K

pada keadaan STP

(aMn+2)2 K = --------------------------------------(aMnO4-)2 (aC2O4=)5 (aH+)16 Contoh lain dari reaksi redok adalah reaksi iodometri 2I3- + 2e-

6I-

Eo = 0,535

Volt

2S2O3= S4O6= + 2eEo = - 0,17 Volt ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- + 2I3- + 2S2O3= 6I- + S4O6= Eo = 0,365 Volt

Table of Standard reduction potentials www.vaxasoftware.com Half reaction

εo (V)

Li+ + e− → Li(s) −3.0401 + − K + e → K(s) Ca2+ + 2e− → Ca(s) Na+ + e− → Na(s) Mg2+ + 2e− → Mg(s) Al3+ + 3e− → Al(s) Mn2+ + 2e− → Mn(s) 2H2O + 2e− → H2(g) + 2OH− Zn2+ + 2e− → Zn(s) Cr3+ + 3e− → Cr(s) Fe2+ + 2e− → Fe(s) Cr3+ + e− → Cr2+(s) Cd2+ + 2e− → Cd(s) Ni2+ + 2e− → Ni(s) Sn2+ + 2e− → Sn(s) Pb2+ + 2e− → Pb(s) 2H+ + 2e− → H2(g) Cu2+ + e− → Cu+(s) SO42− + 4H+ + 2e− → SO2(g) + 2H2O Cu2+ + 2e− → Cu(s) O2(g) + 2H2O + 4e− → 4OH− Cu+ + e− → Cu(s) I2(s) + 2e− → 2I− MnO4− + 2H2O +3e− → MnO2(s) + 4OH− Fe3+ + e− → Fe2+ Ag+ + e− → Ag(s) NO3− + 4H+ + 3e− → NO(g) + 2H2O Br2(l) + 2e− → 2Br− Br2(aq) + 2e− → 2Br− 2IO3− + 12H+ + 10e− → I2(s) + 6H2O O2(g) + 4H+ + 4e− → 2H2O Cr2O72− + 14H+ + 6e− → 2Cr3+ + 7H2O Cl2(g) + 2e− → 2Cl− β-PbO2(s) + 4H+ + 2e− → Pb2+ + 2H2O α-PbO2(s) + 4H+ + 2e− → Pb2+ + 2H2O ClO− + 2H+ + 2e− → Cl− + H2O MnO4− + 8H+ + 5e− → Mn2+ + 4H2O Au3+ + 3e− → Au(s) H2O2(l) + 2H+ + 2e− → 2H2O Au+ + e− → Au(s) F2(g) + 2e− → 2F− +2.890

+REDUCING −2.931 −2.868 −2.7144 −2.3568 −1.676 −1.185 −0.8277 −0.7628 −0.74 −0.440 −0.42 −0.40 −0.236 −0.13 −0.1266 0.0000 +0.159 +0.17 +0.3394 +0.414 +0.5180 +0.535 +0.597 +0.769 +0.7996 +0.96 +1.066 +1.0873 +1.2093 +1.2288 +1.33 +1.3601 +1.458 +1.468 +1.46 +1.5119 +1.52 +1.78 +1.83 +OXIDIZING

Teknik pemisahan campuran dengan kromatografi terdiri dari : a. b. c. d. e. f. g.

Kromatografi kertas (PC) Kromatografi lapisan tipis (TLC) Kolom kromatografi (CC) Kromatografi ion (IC) Kromatografi cair bertekanan tinggi (HPLC) Kromatografi gas (GC) Kromatografi elektroforesis

4.3. Kromatografi kertas,

Chromatography jar

Kertas kromatografi adalah teknik kimia analitik untuk memisahkan dan mengidentifikasi campuran atau yang bisa berwarna, terutama pigmen. Hal ini juga dapat digunakan dalam warna sekunder atau primer dalam percobaan tinta. Metode ini telah digantikan dengan kromatografi lapis tipis, namun masih merupakan alat pengajaran yang kuat. Dua-cara kertas kromatografi, juga disebut dua dimensi kromatografi, melibatkan menggunakan dua pelarut dan putar kertas 90 ° di antara. Hal ini berguna untuk memisahkan campuran kompleks dari senyawa yang sama, misalnya, asam amino

Technique of Paper Chromatography Tempat terkonsentrasi kecil solusi yang berisi sampel zat terlarut diterapkan pada secarik kertas kromatografi sekitar dua cm dari dasar piring, biasanya menggunakan tabung kapiler untuk presisi maksimum. Sampel ini diserap ke kertas dan dapat membentuk interaksi dengan itu. Setiap zat yang bereaksi atau obligasi dengan kertas tidak dapat diukur dengan menggunakan teknik ini. Makalah ini kemudian dicelupkan ke dalam perawatan pelarut, seperti etanol atau air, mengambil tempat cocok yang berada di atas permukaan pelarut, dan ditempatkan dalam wadah tertutup. Bergerak pelarut kertas dengan aksi kapiler, yang terjadi sebagai akibat dari daya tarik molekul pelarut untuk kertas, hal ini juga dapat dijelaskan sebagai diferensial adsorpsi dari komponen zat terlarut ke dalam pelarut. Sebagai pelarut naik melalui kertas itu bertemu dan melarutkan campuran sampel, yang kemudian akan melakukan perjalanan ke kertas dengan sampel zat terlarut pelarut. Berbeda senyawa dalam campuran sampel pada tingkat yang berbeda karena perbedaan dalam kelarutan dalam pelarut, dan karena perbedaan ketertarikan mereka pada serat di koran. Komponen lebih mudah larut yang lebih lanjut ia pergi. Kromatografi kertas mengambil mana saja dari beberapa menit sampai beberapa jam. Dalam beberapa kasus, kromatografi kertas tidak pigmen terpisah sepenuhnya, ini terjadi ketika dua zat tampaknya memiliki nilai yang sama dalam pelarut tertentu. Dalam kasus ini,

dua arah kromatografi digunakan untuk memisahkan beberapa tempat-pigmen. [Sunting] kromatografi Ascending Dalam metode ini, pelarut adalah di kolam renang di bagian bawah kapal di mana kertas yang supported.The cromatogram menaik dilipat di atas batang gelas yang setengah lainnya menjadi teknik chromatogram.This turun memberikan pemisahan cepat seperti yang dari teknik individu . [Sunting] kromatografi Descending Dalam metode ini, pelarut disimpan dalam sebuah palung di bagian atas ruangan dan dibiarkan mengalir ke bawah kertas. Cairan bergerak turun oleh aksi kapiler serta oleh gaya gravitasi, sehingga metode ini juga dikenal sebagai metode gravitasi. [Rujukan?] Dalam hal ini, aliran lebih cepat dibandingkan dengan metode ascending, dan kromatografi adalah menyelesaikan lebih cepat. Aparat dibutuhkan untuk kasus ini lebih canggih. Pelarut berkembang ditempatkan di palungan di bagian atas yang biasanya terdiri dari bahan inert. Makalah ini kemudian ditangguhkan dalam pelarut. Zat yang tidak dapat dipisahkan dengan metode naik kadang-kadang dapat dipisahkan dengan metode menurun. [Rujukan?] [Sunting] Kromatografi sebagai seni Kromatografi dapat digunakan sebagai alternatif seni karena warna tertentu yang menciptakan, tapi kromatografi kertas jarang menghasilkan warna dipahami jika dijalankan dengan benar. Kadang-kadang, hasil kromatografi dapat memulai dengan yang tidak diinginkan "berdaun" warna, tetapi jika dilakukan dengan benar dan lengkap, warna megah dapat diproduksi. [Sunting] Rƒ nilai Nilai Rƒ dapat didefinisikan sebagai rasio dari jarak yang ditempuh oleh substansi ke jarak yang ditempuh oleh pelarut. Nilai Rƒ biasanya dinyatakan sebagai pecahan dari dua tempat desimal tetapi disarankan oleh Smith bahwa angka persentase harus digunakan sebagai gantinya. Jika Rƒ nilai solusi adalah nol, zat terlarut tetap dalam fase diam dan dengan demikian itu bergerak. Jika Rƒ value = 1 maka zat terlarut tidak memiliki afinitas untuk fase diam dan perjalanan dengan pelarut depan. Analisa kualitatif adalah nilai Rf = hC/hS, hC tinggi naik komponen, hS = tinggi naik pelarut Analisa kuantitatif : a. Perbandingan luas puncak noda b. Perbandingan berat noda c. Perbadinga noda setelah dilarutkan d. planimetri

Displacement chromatography Tempat terkonsentrasi kecil solusi yang berisi sampel zat terlarut diterapkan pada secarik kertas kromatografi sekitar dua cm dari dasar piring, biasanya menggunakan tabung kapiler untuk presisi maksimum. Sampel ini diserap ke kertas dan dapat membentuk interaksi dengan itu. Setiap zat yang bereaksi atau obligasi dengan kertas tidak dapat diukur dengan menggunakan teknik ini. Makalah ini kemudian dicelupkan ke dalam perawatan pelarut, seperti etanol atau air, mengambil tempat cocok yang berada di atas permukaan pelarut, dan ditempatkan dalam wadah tertutup. Bergerak pelarut kertas dengan aksi kapiler, yang terjadi sebagai akibat dari daya tarik

molekul pelarut untuk kertas, hal ini juga dapat dijelaskan sebagai diferensial adsorpsi dari komponen zat terlarut ke dalam pelarut. Sebagai pelarut naik melalui kertas itu bertemu dan melarutkan campuran sampel, yang kemudian akan melakukan perjalanan ke kertas dengan sampel zat terlarut pelarut. Berbeda senyawa dalam campuran sampel pada tingkat yang berbeda karena perbedaan dalam kelarutan dalam pelarut, dan karena perbedaan ketertarikan mereka pada serat di koran. Komponen lebih mudah larut yang lebih lanjut ia pergi. Kromatografi kertas mengambil mana saja dari beberapa menit sampai beberapa jam. Dalam beberapa kasus, kromatografi kertas tidak pigmen terpisah sepenuhnya, ini terjadi ketika dua zat tampaknya memiliki nilai yang sama dalam pelarut tertentu. Dalam kasus ini, dua arah kromatografi digunakan untuk memisahkan beberapa tempat-pigmen. [Sunting] kromatografi Ascending Dalam metode ini, pelarut adalah di kolam renang di bagian bawah kapal di mana kertas yang supported.The cromatogram menaik dilipat di atas batang gelas yang setengah lainnya menjadi teknik chromatogram.This turun memberikan pemisahan cepat seperti yang dari teknik individu . [Sunting] kromatografi Descending Dalam metode ini, pelarut disimpan dalam sebuah palung di bagian atas ruangan dan dibiarkan mengalir ke bawah kertas. Cairan bergerak turun oleh aksi kapiler serta oleh gaya gravitasi, sehingga metode ini juga dikenal sebagai metode gravitasi. [Rujukan?] Dalam hal ini, aliran lebih cepat dibandingkan dengan metode ascending, dan kromatografi adalah menyelesaikan lebih cepat. Aparat dibutuhkan untuk kasus ini lebih canggih. Pelarut berkembang ditempatkan di palungan di bagian atas yang biasanya terdiri dari bahan inert. Makalah ini kemudian ditangguhkan dalam pelarut. Zat yang tidak dapat dipisahkan dengan metode naik kadang-kadang dapat dipisahkan dengan metode menurun. [Rujukan?] [Sunting] Kromatografi sebagai seni Kromatografi dapat digunakan sebagai alternatif seni karena warna tertentu yang menciptakan, tapi kromatografi kertas jarang menghasilkan warna dipahami jika dijalankan dengan benar. Kadang-kadang, hasil kromatografi dapat memulai dengan yang tidak diinginkan "berdaun" warna, tetapi jika dilakukan dengan benar dan lengkap, warna megah dapat diproduksi. [Sunting] Rƒ nilai Nilai Rƒ dapat didefinisikan sebagai rasio dari jarak yang ditempuh oleh substansi ke jarak yang ditempuh oleh pelarut. Nilai Rƒ biasanya dinyatakan sebagai pecahan dari dua tempat desimal tetapi disarankan oleh Smith bahwa angka persentase harus digunakan sebagai gantinya. Jika Rƒ nilai solusi adalah nol, zat terlarut tetap dalam fase diam dan dengan demikian itu bergerak. Jika Rƒ value = 1 maka zat terlarut tidak memiliki afinitas untuk fase diam dan perjalanan dengan pelarut depan. [Sunting] Penemuan Munculnya kromatografi perpindahan dapat dikaitkan dengan Tiselius [1], yang pada tahun 1943 pertama kali diklasifikasikan mode kromatografi yang frontal, elusi, dan perpindahan. Kromatografi Pemindahan sejak menemukan berbagai aplikasi dari isolasi unsur transuranic [2] untuk entitas biokimia [3]. Pemindahan kromatografi adalah metode kromatografi di mana komponen diselesaikan dalam berturut-turut "persegi panjang" zona zat murni sangat terkonsentrasi daripada pelarut dipisahkan "puncak". Molekul-molekul dipaksa untuk bermigrasi ke kolom oleh gelombang maju dari molekul displacer yang memiliki afinitas yang lebih tinggi untuk fase diam daripada larutan umpan. [4] Karena migrasi paksa, konsentrasi produk yang lebih tinggi dan kemurnian dapat diperoleh dibandingkan dengan moda lain kromatografi. Teknik ini ditemukan kembali oleh Horvath [5] dan telah sejak menemukan banyak aplikasi, terutama di bidang pemurnian makromolekul biologi. [Sunting] Prinsip

Prinsip dasar kromatografi perpindahan adalah: Sebuah molekul dengan afinitas tinggi untuk matriks kromatografi (displacer) akan bersaing secara efektif untuk situs mengikat, dan dengan demikian menggantikan seluruh molekul dengan afinitas yang lebih rendah [6] Ada perbedaan jelas antara perpindahan dan kromatografi elusi. . Dalam modus elusi, zat biasanya muncul dari sebuah kolom di sempit, puncak Gaussian. Pemisahan yang luas dari puncak, sebaiknya ke baseline, yang diinginkan untuk mencapai pemurnian maksimal. Kecepatan di mana setiap komponen campuran perjalanan ke kolom dalam mode elusi tergantung pada banyak faktor. Tapi untuk dua zat untuk melakukan perjalanan dengan kecepatan yang berbeda, dan dengan demikian dapat diselesaikan, harus ada perbedaan substansial dalam beberapa interaksi antara biomolekul dan matriks kromatografi. Parameter operasi yang disesuaikan untuk memaksimalkan efek dari perbedaan ini. Dalam banyak kasus, dasar pemisahan puncak dapat dicapai hanya dengan elusi gradien dan beban kolom yang rendah. Dengan demikian, dua kelemahan kromatografi elusi modus, terutama pada skala preparatif, adalah kompleksitas operasional, karena gradien pelarut memompa, dan throughput rendah, karena beban kolom yang rendah. Pemindahan kromatografi memiliki keunggulan dibandingkan kromatografi elusi dalam komponen diselesaikan menjadi zona berturut-turut zat murni daripada "puncak". Karena proses mengambil keuntungan dari nonlinier dari isoterm, feed kolom yang lebih besar dapat dipisahkan pada kolom tertentu dengan komponen dimurnikan pulih pada konsentrasi lebih tinggi secara signifikan. [Sunting] Teori dan Metode Seperti ditunjukkan di atas, proses kromatografi perpindahan dapat dipecah menjadi tiga tahap yang berbeda: loading, perpindahan, dan regenerasi. Demi kesederhanaan, contoh pemurnian biomolecule diberikan di sini akan dibatasi untuk protein. Pada prinsipnya, semua biomolekul kepentingan komersial saat ini - termasuk oligonukleotida dan antibodi - dapat dimurnikan dalam mode perpindahan, dengan pilihan yang tepat matriks kolom dan displacer. Memuat fase Pemurnian dimulai dengan kolom disetimbangkan dengan buffer pemuatan mirip dengan metode kromatografi elusi. Campuran pakan yang mengandung protein murni dalam buffer dimuat ke kolom pada tingkat yang cukup lambat, dalam kondisi di mana bahan baik dipertahankan. Tujuan dari langkah ini adalah untuk memulai pengikatan biomolekul dalam keadaan semiequilibrium. Hal ini ditunjukkan dalam grafik sebagai campuran protein dimulai pemisahan awal ke komponen kuning dan ungu. Perpindahan fase Setelah sampel telah dimuat, kolom diberi makan larutan displacer pada konsentrasi yang cukup rendah (biasanya 5 mM) dalam buffer yang sama yang digunakan untuk memuat sampel. Displacer ini dirancang untuk mengikat lebih erat dengan matriks dari salah satu biomolekul dan dengan demikian "mendorong" semua komponen campuran dari matriks depan itu. Selama masing-masing komponen sampel dan displacer tersebut tidak ireversibel teradsorpsi pada matriks kolom, ada beberapa dari masing-masing terus menyerap ke, dan dari desorbing, matriks. Dalam modus elusi, hasil yang optimal diperoleh ketika konsentrasi sangat rendah sehingga komponen individu bertindak independen dan tidak bersaing untuk situs mengikat matriks. Dalam modus perpindahan, komponen sampel diperkenalkan dalam bentuk yang jauh lebih terkonsentrasi, dan sehingga memungkinkan untuk komponen yang mengikat kuat - baik displacer atau salah satu protein dalam campuran sampel - bersaing untuk situs mengikat. Komponen mengikat kuat (awalnya, displacer sendiri) kemudian menggantikan dengan berhasil bersaing untuk situs mengikat. Berdasarkan kekuatan masing-masing mengikat, setiap komponen dalam sampel asli kemudian menjadi "displacer" untuk komponen kurang terikat erat berikutnya. Jadi kereta perpindahan didirikan sebagai berdekatan, band terfokus

dengan sedikit tumpang tindih (kuning dan ungu dalam grafik). Dalam menjalankan sukses, kereta sepenuhnya dibentuk sebelum komponen bunga tiba di bagian bawah kolom. Pecahan dapat dikumpulkan dan pemotongan produk yang diinginkan dibuat. regenerasi fase Ketika displacer yang menerobos, yaitu, mulai muncul dari kolom, jalankan selesai dan regenerasi kolom dapat dimulai. Regenerasi dilakukan dengan menggunakan buffer yang dapat menghapus displacer dari matriks, diikuti oleh equilibrium dengan memuat penyangga dalam persiapan untuk menjalankan berikutnya. Karena displacers harus mengikat lebih kuat dari protein apapun yang dimurnikan, maka diharapkan bahwa penghapusan mereka dari kolom harus memerlukan beberapa kondisi khusus. Bagian non-sepele dari desain yang displacer baik, maka, adalah penggabungan dari beberapa fitur struktural yang memungkinkan untuk penghapusan lengkap dari matriks di bawah beberapa kondisi.

Keuntungan dari kromatografi perpindahan Sebuah perbedaan penting antara perpindahan dan kromatografi langkah gradien adalah bahwa bagian depan displacer selalu tetap di belakang zona pakan yang berdekatan dalam kereta perpindahan sedangkan desorbents (misalnya, garam dalam pertukaran ion, pengubah organik dalam fase terbalik kromatografi) bergerak melalui zona pakan. Modus perpindahan kromatografi mengambil keuntungan dari karakteristik termodinamika dari sistem kromatografi untuk mengatasi banyak kekurangan elusi kromatografi preparatif dan gradien. Ini karakteristik perpindahan membuatnya kurang peka terhadap beban pakan daripada mode elusi operasi, sehingga memungkinkan untuk memberikan throughputs proses yang lebih tinggi. Keuntungan lain adalah resolusi tinggi yang dapat memberikan perpindahan

dibandingkan dengan proses elusi. Pemindahan kromatografi memanfaatkan kompetisi, nonlinear multikomponen antara komponen yang akan dipisahkan, sehingga dalam resolusi yang lebih tinggi, khususnya di kalangan spesies yang terkait erat. Sebaliknya, dalam proses elusi (misalnya, linear gradien, gradien langkah), pemisahan terjadi di bawah kondisi yang mengikat relatif lemah (yang penting untuk mendapatkan dari zat terlarut kolom). Faktor pemisahan antara zat terlarut dengan demikian lebih rendah dalam elusi daripada di pengungsian, menyebabkan resolusi miskin dalam mode elusi operasi. Keuntungan lain dari perpindahan termasuk kontrol yang lebih baik atas konsentrasi produk dan munculnya produk dalam konsentrasi yang relatif rendah pengubah fase gerak. Kombinasi throughputs tinggi dan resolusi tinggi dalam suatu proses tunggal membuat perpindahan modus operasi yang menarik untuk pemurnian protein.

[edit] Applications Pemurnian kromatografi protein dari campuran kompleks bisa sangat menantang, terutama ketika campuran mengandung protein yang sama dipertahankan atau bila diinginkan untuk memperkaya komponen jejak dalam feed. Selanjutnya, beban kolom sering terbatas ketika resolusi tinggi diperlukan menggunakan mode tradisional kromatografi (misalnya linear gradien, isokratik kromatografi). Dalam kasus ini, kromatografi perpindahan merupakan teknik yang efisien untuk pemurnian protein dari campuran kompleks pada beban tinggi kolom dalam berbagai aplikasi. Sebuah kemajuan penting dalam keadaan seni kromatografi pemindahan adalah pengembangan rendah displacers massa molekul untuk pemurnian protein dalam sistem pertukaran ion [7]. [8] [9]. Penelitian ini adalah signifikan dalam bahwa itu mewakili keberangkatan utama dari kebijaksanaan konvensional bahwa polimer polyelectrolyte besar dibutuhkan untuk menggantikan protein dalam sistem pertukaran ion. Rendah displacers massa molekul memiliki keuntungan operasional yang signifikan dibandingkan dengan displacers polyelectrolyte besar. Misalnya, jika ada tumpang tindih antara displacer dan protein yang menarik, bahan-bahan massa molekul rendah dapat dengan mudah dipisahkan dari protein dimurnikan selama pasca-perpindahan pengolahan menggunakan ukuran standar berbasis metode pemurnian (misalnya ukuran kromatografi eksklusi, ultrafiltrasi) . Selain itu, perilaku garam bergantung adsorpsi ini displacers MW rendah sangat memudahkan regenerasi kolom. Ini displacers telah digunakan untuk berbagai macam pemisahan resolusi tinggi di sistem pertukaran ion [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16]. Selain itu, kegunaan kromatografi perpindahan untuk pemurnian faktor pertumbuhan rekombinan [17], antigen protein vaksin [18] dan oligonukleotida antisense [19] juga telah ditunjukkan. Ada beberapa contoh di mana perpindahan kromatografi telah diterapkan pada pemurnian protein menggunakan pertukaran ion, interaksi hidrofobik, serta terbalik kromatografi fase [20]. Kromatografi Pemindahan cocok untuk memperoleh jumlah mg protein dimurnikan dari campuran kompleks dengan menggunakan kolom kromatografi standar analitis pada skala bangku. Hal ini juga sangat cocok untuk memperkaya komponen jejak dalam feed. Kromatografi Pemindahan dapat dengan mudah dilakukan dengan menggunakan berbagai sistem resin termasuk, pertukaran ion, HIC dan RPLC [21], [22] Duadimensi kromatografi merupakan pendekatan yang paling menyeluruh dan ketat untuk evaluasi proteome. Sementara pendekatan diterima sebelumnya telah digunakan pendekatan modus elusi kromatografi seperti pertukaran kation HPLC fase terbalik, hasil biasanya sangat rendah membutuhkan kepekaan analitis dalam picomolar berkisar femptomolar [23]. Sebagai kromatografi Pemindahan menawarkan keuntungan dari konsentrasi komponen jejak, dua dimensi kromatografi memanfaatkan perpindahan daripada modus elusi pada langkah kromatografi hulu merupakan alat yang berpotensi kuat untuk analisis komponen jejak, modifikasi, dan identifikasi komponen dinyatakan minor proteome. [ 24]

[edit] References 1. ^ A. Tiselius. Displacement development in adsorption analysis. Ark. Kemi. Mineral Geol. 16A: 1–18 (1943). 2. ^ G. T. Seaborg. The Transuranium Elements. Science 104(2704):379-386 (1946). 3. ^ J. Frenz and C.S. Horvath. High performance displacement chromatography. pp 212-314 in C. Horvath (Ed.) High Performance Liquid Chromatography-advances and perspectives. Vol. 5, Academic Press, San Diego, CA. 4. ^ N. Tugcu . Purification of proteins using displacement chromatography. pp 71-89 in M. Zachariou (Ed.) Methods in Molecular Biology: Vol 421 Affinity Chromatography: Methods and Protocols. 2nd edition. Humana Press, Totowa NJ. 5. ^ C.S. Horvath, A. Nahum, and J. Frenz. High performance displacement chromatography. J. Chromatogr. 218, 365–393(1981). 6. ^ Displacement Chromatography 101. [1] Sachem, Inc. Austin, TX 78737 7. ^ S. M. Cramer and G. Jayaraman, Current Opinions in Biotechnology 4: 217-225, (1993) 8. ^ G. Jayaraman, S. Gadam, and S. M. Cramer. J. Chromatogr. A 630:53-68. (1993) 9. ^ G. Jayaraman, Y. Li, J. A. Moore, and S. M. Cramer. J. Chromatogr. A 702:143-155. (1995) 10. ^ A. Kundu, S. Vunnum, G. Jayaraman, and S. M. Cramer. Biotech. and Bioeng. 48: 452-460. (1995) 11. ^ A. Kundu, S. Vunnum, and S. M. Cramer. J. Chromatogr. A, 707:57-67. (1995) 12. ^ A. Kundu, S. Vunnum, and S. M. Cramer. Adsorption 4:3-4. (1998) 13. ^ A. Kundu, K. Barnthouse, and S. M. Cramer. Biotech. and Bioeng., 56:119-129. (1997) 14. ^ KA. Kundu, A. A. Shukla, K. A. Barnthouse, J. Mooreand S. M. Cramer. BioPharm 10 :64. (1997) 15. ^ A. Kundu, and S. M. Cramer. Anal. Biochem., 248:111-116. ( 1997) 16. ^ A. A. Shukla, K. A. Barnthouse, S. S. Bae, J. A. Moore, and S. M. Cramer.. J. Chromatogr. A 814:1-2. (1998) 17. ^ K. A. Barnthouse, W. Trompeter, R. Jone, P. Inampudi, R.Rupp, and S. M. Cramer. J. Biotechnol. 66:125-136 (1998) 18. ^ A. A. Shukla, R. L. Hopfer, D. N. Chakravarti, E. Bortell, and S. M. Cramer. Biotechnol. Prog. 14: 91-101(1998) 19. ^ N. Tugcu, R. R. Deshmukh, Y. S. Sangvic, J. A. Moored, and S. M. Cramer J. Chromatogr. A 923:65-73(2001) 20. ^ R. Freitag and J. Breier. J. Chromatogr. A 691, 101–112 (1995). 21. ^ Trace Component Amplification. [2] Sachem, Inc. Austin, TX 78737 22. ^ N. Tugcu, R. R. Deshmukh, Y. S. Sanghvi, and S. M. Cramer. Reactive and Functional Polymers 54, 37–47(2003). 23. ^ . E. Nagele, M. Vollmer, P. Horth, and C. Vad. 2D-LC/MS techniques for the identification of proteins in highly complex mixtures. Expert Reviews in Proteomics. Vol. 1, No. 1, Pages 37-46 (2004). 24. ^ 2D-HPLC Course SACHEM, Inc. Austin, TX, 78737[3]

Retrieved from "http://en.wikipedia.org/wiki/Displacement_chromatography" 4.4. TLC, kolom dan

Ion chromatography Pertukaran ion kromatografi (atau kromatografi ion) adalah proses yang memungkinkan pemisahan ion dan molekul polar berdasarkan muatan mereka. Dionex Corp

memperkenalkan sistem komersial pada awal tahun 1970 yang menggunakan teknologi revolusioner penekanan untuk mengurangi konduktivitas latar belakang, sehingga meningkatkan kemampuan deteksi ion. Hal ini dapat digunakan untuk hampir semua jenis molekul dibebankan termasuk protein yang besar, nukleotida kecil dan asam amino. Solusi harus disuntikkan biasanya disebut sampel, dan komponen individual dipisahkan disebut analit. Hal ini sering digunakan dalam pemurnian protein, analisis air, dan kontrol kualitas

Sejarah Ion methods have been in use since 1850, when H. Thompson and J. T. Way, researchers in England, treated various clays with ammonium sulfate or carbonate in solution to extract the amonia dan kalsium rilis. Pada tahun 1927, kolom pertama mineral zeolit digunakan untuk menghilangkan kalsium dan ion magnesium mengganggu dari solusi untuk menentukan isi sulfat air. Versi modern dari IEC dikembangkan selama Proyek Manhattan perang. Suatu teknik yang diperlukan untuk memisahkan dan berkonsentrasi pada unsur-unsur radioaktif yang diperlukan untuk membuat bom atom. Para peneliti memilih adsorben yang akan latch ke unsur transuranium dibebankan, yang kemudian dapat dielusi diferensial. Pada akhirnya, sekali declassified, teknik ini akan menggunakan resin IE baru untuk mengembangkan sistem yang sering digunakan saat ini untuk pemurnian tertentu biologi dan inorganics. Pada awal 1970-an, kromatografi ion dikembangkan oleh Hamish Kecil dan rekan kerja di Dow Chemical Company sebagai metode baru yang dapat digunakan dalam analisis IEC otomatis. Ini kemudian mengarah pada pembentukan Dionex Corp (Dow-Ion Exchange) yang memimpin pasar di IC peralatan dan perkembangan. IC menggunakan resin ion lemah untuk fase stasioner dan suatu stripper menetralkan tambahan, atau penekan, kolom untuk menghilangkan ion latar belakang eluen. Ini adalah teknik yang kuat untuk menentukan konsentrasi rendah ion dan sangat berguna dalam studi kualitas lingkungan dan air, antara aplikasi lain

Prinsip dasar ion Kromatogram Pertukaran ion kromatografi mempertahankan molekul analit pada kolom berdasarkan coulombic (ion) interaksi. Permukaan fase diam menampilkan kelompok fungsional ion (RX) yang berinteraksi dengan ion analit muatan yang berlawanan. Jenis kromatografi dibagi lagi menjadi kromatografi penukar kation dan anion kromatografi pertukaran. Senyawa ionik yang terdiri dari spesies kationik M + dan spesies anionik B-dapat dipertahankan oleh fase diam. Kation kromatografi pertukaran mempertahankan kation bermuatan positif karena fase diam menampilkan kelompok fungsional bermuatan negatif: Anion kromatografi penukar anion mempertahankan menggunakan gugus fungsional bermuatan positif: Perhatikan bahwa kekuatan ion baik C + atau A-dalam fase gerak dapat disesuaikan untuk menggeser posisi kesetimbangan dan dengan demikian waktu retensi. Kromatogram ion menunjukkan kromatogram yang diperoleh dengan kolom penukar anion.

[edit] Typical technique

Metrohm 850 Ion chromatography system Sampel diperkenalkan, baik secara manual atau dengan autosampler, menjadi sebuah loop sampel volume yang diketahui. Sebuah larutan buffered dikenal sebagai fase gerak membawa sampel dari lingkaran ke kolom yang berisi beberapa bentuk materi fase diam. Ini biasanya resin atau matriks gel yang terdiri dari agarosa atau manik-manik selulosa dengan kovalen terikat kelompok fungsional yang bertugas. Analit target (anion atau kation) dipertahankan pada fase diam tetapi dapat dielusi dengan meningkatkan konsentrasi dari spesies yang sama menuduh bahwa akan menggantikan ion analit dari fase diam. Misalnya, dalam kromatografi penukar kation, analit bermuatan positif bisa digusur oleh penambahan ion natrium bermuatan positif. Analit kepentingan maka harus dideteksi dengan beberapa cara, biasanya oleh konduktivitas atau UV / Visible absorbansi cahaya. Dalam rangka untuk mengontrol sistem IC, kromatografi sistem data (CDS) biasanya diperlukan. Selain sistem IC, beberapa CDSs juga dapat mengontrol kromatografi gas (GC) dan HPLC sistem.

[edit] Separating proteins

Preparative-scale ion exchange column used for protein purification. Protein memiliki kelompok fungsional banyak yang dapat memiliki baik muatan positif dan negatif. Pertukaran ion kromatografi memisahkan protein sesuai dengan muatan bersih mereka, yang tergantung pada komposisi fase gerak. Dengan menyesuaikan pH atau konsentrasi ion dari fase gerak, molekul protein yang berbeda dapat dipisahkan. Misalnya, jika protein memiliki muatan positif bersih pada pH 7, maka akan mengikat ke kolom manikmanik bermuatan negatif, sedangkan protein bermuatan negatif tidak akan. Dengan mengubah pH sehingga muatan total pada protein negatif, juga akan dielusi.

Elution by changing the ionic strength of the mobile phase is a more subtle effect - it works as ions from the mobile phase will interact with the immobilized ions in preference over

those on the stationary phase. This "shields" the stationary phase from the protein, (and vice versa) and allows the protein to elute.

[edit] References      

Ion Chromatography by Hamish Small ISBN 0-306-43290-0 Handbook of Ion Chromatography by Joachim Weiss, Dionex Corporation, ISBN 978-3527287017 Ion Chromatography by James S. Fritz and Douglas T. Gjerde, ISBN 3527299149 Ion Chromatography (Journal of Chromatography Library) by P.R. Haddad and P.E. Jackson, ISBN 0444882324 Sample Preparation Techniques for Ion Chromatography by A. Seubert et al., Metrohm AG, Order Number 8.025.5003 Air Monitoring by Ion Chromatography by M. Läubli, D. Parab, K. Viehweger, Metrohm AG, Order Number 8.035.5003

Thin layer chromatography From Wikipedia, the free encyclopedia Jump to: navigation, search

Thin layer chromatography

Separation of black ink on a TLC plate Acronym

TLC

Classification

Chromatography Other Techniques

Related

Agarose gel electrophoresis SDS-PAGE

This box: view • talk

Kromatografi lapis tipis (TLC) adalah teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan campuran [1] kromatografi lapis tipis dilakukan pada selembar kaca, plastik, atau aluminium foil, yang dilapisi dengan lapisan tipis bahan adsorben, biasanya silika gel,. aluminium oksida, atau selulosa. Ini lapisan adsorben dikenal sebagai fase diam. Setelah sampel telah diterapkan di piring, campuran pelarut atau pelarut (dikenal sebagai fase gerak) ditarik piring melalui kapiler. Karena analit yang berbeda naik pelat TLC pada tingkat yang berbeda, pemisahan dicapai [2].. Kromatografi lapis tipis menemukan banyak aplikasi, termasuk: • penentuan komponen tanaman mengandung • pemantauan reaksi organik. • menganalisis ceramides dan asam lemak • deteksi pestisida atau insektisida dalam makanan dan air • menganalisis komposisi zat warna dari serat dalam forensik, atau • mengidentifikasi senyawa hadir dalam substansi tertentu • pengujian kemurnian radiokimia radiofarmasi Sejumlah perangkat tambahan dapat dibuat dengan metode asli untuk mengotomatisasi langkah-langkah yang berbeda, untuk meningkatkan resolusi dicapai dengan TLC dan memungkinkan kuantisasi lebih akurat. Metode ini disebut sebagai HPTLC, atau "high performance TLC". • [sunting] persiapan pelat Pelat TLC biasanya tersedia secara komersial, dengan ukuran partikel berkisar standar untuk meningkatkan reproduktifitas. Mereka dibuat dengan cara mencampurkan adsorben, seperti gel silika, dengan sejumlah kecil pengikat lembam seperti kalsium sulfat (gipsum) dan air. Campuran ini menyebar sebagai bubur tebal pada lembar pembawa tidak aktif, biasanya kaca, aluminium foil tebal, atau plastik. Pelat yang dihasilkan dikeringkan dan diaktifkan dengan pemanasan dalam oven selama tiga puluh menit pada 110 ° C. Ketebalan lapisan adsorben biasanya sekitar 0,1-0,25 mm untuk tujuan analitis dan sekitar 0,5 -. 2,0 mm untuk KLT preparatif [3]

[edit] Technique

Development of a TLC plate, a purple spot separates into a red and blue spot.

Kromatogram dari 10 minyak esensial diwarnai dengan pereaksi vanillin. Proses ini mirip dengan kromatografi kertas dengan keuntungan dari berjalan lebih cepat, pemisahan yang lebih baik, dan pilihan antara fasa diam yang berbeda. Karena kesederhanaan dan kecepatan TLC sering digunakan untuk reaksi kimia pemantauan dan analisis kualitatif produk reaksi. Tempat kecil larutan yang mengandung sampel diterapkan ke piring, sekitar satu sentimeter dari dasar. Plat tersebut kemudian dicelupkan ke dalam pelarut yang cocok, seperti heksana atau etil asetat, dan ditempatkan dalam wadah tertutup. Pelarut bergerak piring dengan aksi kapiler dan memenuhi campuran sampel, yang dibubarkan dan dilakukan atas piring dengan pelarut. Berbeda senyawa dalam campuran sampel pada tingkat yang berbeda karena perbedaan dalam daya tarik mereka ke fase diam, dan karena perbedaan kelarutan dalam pelarut. Dengan mengubah pelarut, atau mungkin menggunakan campuran, pemisahan komponen (diukur dengan nilai Rf) dapat disesuaikan. Juga, pemisahan dicapai dengan pelat KLT dapat digunakan untuk memperkirakan pemisahan kolom kromatografi. [4] Pemisahan senyawa didasarkan pada persaingan zat terlarut dan fase gerak untuk tempat mengikat fase diam. Misalnya, jika fase silika gel biasa digunakan sebagai fase diam dapat dianggap polar. Mengingat dua senyawa yang berbeda dalam polaritas, senyawa polar yang lebih memiliki interaksi kuat dengan silika dan karena itu lebih mampu untuk menghilangkan fase gerak dari tempat mengikat. Akibatnya, senyawa kurang polar bergerak lebih tinggi piring (menghasilkan nilai Rf yang lebih tinggi). Jika fase mobile berubah menjadi lebih polar pelarut atau campuran pelarut, itu lebih mampu menghilangkan zat terlarut dari tempat silika mengikat dan semua senyawa pada pelat TLC akan bergerak lebih tinggi piring. Praktis hal ini berarti bahwa jika Anda menggunakan campuran etil asetat dan heptana sebagai fase gerak, menambahkan hasil asetat lebih etil nilai Rf yang lebih tinggi untuk semua senyawa pada pelat TLC. Mengubah polaritas fase gerak biasanya tidak akan menghasilkan urutan terbalik dari menjalankan senyawa pada pelat TLC. Sebuah seri eluotropic dapat digunakan sebagai panduan dalam memilih fase gerak. Jika urutan terbalik dari menjalankan senyawa yang diinginkan, fase stasioner apolar harus digunakan, seperti C18-difungsikan silika. [Sunting] preparatif TLC TLC juga dapat digunakan pada skala semi-preparatif kecil untuk memisahkan campuran hingga beberapa ratus miligram beberapa. Campuran ini tidak "terlihat" pada pelat TLC sebagai titik, melainkan diterapkan ke piring sebagai lapisan tipis bahkan horizontal ke dan tepat di atas tingkat pelarut. Bila dikembangkan dengan pelarut senyawa terpisah di band horisontal daripada tempat horizontal dipisahkan. Setiap band (atau band yang diinginkan) yang dikerok bahan backing. Bahan backing kemudian diekstraksi dengan pelarut yang sesuai (misalnya DCM) dan disaring untuk memberikan materi terisolasi setelah penghapusan pelarut. Untuk skala kecil reaksi dengan produk mudah dipisahkan, preparatif TLC dapat

menjadi jauh lebih efisien dari segi waktu dan biaya daripada melakukan kromatografi kolom. Jelas, seluruh piring tidak dapat dikembangkan atau produk kimia akan dihancurkan kimia. Jadi teknik ini paling baik digunakan dengan senyawa yang berwarna, atau terlihat di bawah sinar UV. Atau, bagian kecil dari piring dapat dikembangkan misalnya kimia memotong bagian keluar dan kimia berkembang, atau masking sebagian besar dari piring dan mengekspos bagian kecil untuk pengembang kimia seperti yodium. [Sunting] Analisis Sebagai bahan kimia yang terpisah mungkin tidak berwarna, beberapa metode yang ada untuk memvisualisasikan tempat: • Seringkali sejumlah kecil senyawa neon, biasanya mangan-diaktifkan seng silikat, ditambahkan ke adsorben yang memungkinkan visualisasi dari tempat bawah blacklight (UV254). Lapisan adsorben sehingga akan berpendar hijau muda dengan sendirinya, tapi tempat analit memuaskan fluoresensi ini. • uap Yodium adalah reagen warna umum tidak spesifik • reagen warna khusus yang ada di mana lempeng TLC adalah dicelupkan atau yang disemprotkan ke piring [5] • Dalam kasus lipid, kromatogram dapat ditransfer ke membran PVDF dan kemudian mengalami analisis lebih lanjut, misalnya spektrometri massa, teknik yang dikenal sebagai Far-Timur blotting. Setelah terlihat, nilai Rf, atau faktor retensi, dari tempat masing-masing dapat ditentukan dengan membagi jarak yang ditempuh oleh produk dengan total jarak yang ditempuh oleh pelarut (solvent depan). Nilai-nilai ini tergantung pada pelarut yang digunakan, dan jenis pelat KLT, dan tidak konstanta fisik. Eluen pada lapisan tipis diletakkan di atas piring [Sunting] Aplikasi Dalam kimia organik, reaksi yang kualitatif dipantau dengan TLC. Tempat sampel dengan tabung kapiler ditempatkan di piring: tempat dari bahan awal, tempat dari campuran reaksi, dan "co-spot" dengan baik. Sebuah piring (3 oleh 7 cm) kecil TLC berlangsung beberapa menit untuk menjalankan. Analisis kualitatif, dan akan menunjukkan apakah bahan awal telah menghilang, yaitu reaksi selesai, jika produk apapun telah muncul, dan berapa banyak produk yang dihasilkan (meskipun ini mungkin berada di bawah-diperkirakan karena co-elusi). Sayangnya, TLC dari suhu rendah reaksi dapat memberikan hasil yang menyesatkan, karena sampel dipanaskan sampai suhu kamar dalam kapiler, yang dapat mengubah reaksi-sampel hangat dianalisis dengan TLC yang tidak sama dengan apa yang ada dalam labu suhu rendah . Salah satu reaksi tersebut adalah pengurangan DIBALH dari ester untuk aldehida. Sebagai contoh kromatografi dari ekstrak daun hijau (bayam misalnya untuk) dalam 7 tahap pembangunan. Karoten elutes cepat dan hanya terlihat sampai langkah 2. Klorofil A dan B berada setengah jalan di langkah terakhir dan lutein pewarnaan senyawa pertama kuning.

Step 1

Step 2

Step 3

Step 4

Step 7 Step 6 Step 5 Dalam satu studi TLC telah diterapkan dalam pemutaran reaksi organik [6] misalnya dalam fine tuning-sintesis BINAP dari 2-naftol. Dalam metode ini solusi alkohol dan katalis (misalnya (III) klorida besi) adalah tempat yang terpisah pada garis dasar, kemudian bereaksi dan kemudian langsung dianalisis.

[edit] References 1. ^ Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody. Experimental organic chemistry: Principles and Practice (Illustrated edition ed.). pp. 159-173. 2. ^ Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry (5th Edition) (Hardcover) by A.I. Vogel (Author), A.R. Tatchell (Author), B.S. Furnis (Author), A.J. Hannaford (Author), P.W.G. Smith ISBN 0582462363 3. ^ Tables showing the thickness value of commercial regular and preparative Thin Layer Chromatography plates 4. ^ Fair, J. D.; Kormos, C. M. J. Chromatogr. A 2008, 1211(1-2), 49-54. (doi:10.1016/j.chroma.2008.09.085) 5. ^ Stains for Developing TLC Plates http://www.ux1.eiu.edu/~cfthb/research/handbook/TLCstains.htm 6. ^ TLC plates as a convenient platform for solvent-free reactions Jonathan M. Stoddard, Lien Nguyen, Hector Mata-Chavez and Kelly Nguyen Chem. Commun., 2007, 1240 - 1241, doi:10.1039/b616311d

Column chromatography

Typical set up for manual column chromatography.

Seorang ahli kimia pada tahun 1950 dengan menggunakan kromatografi kolom. Wadah Erlenmeyer berada di lantai. Kromatografi kolom dalam kimia adalah metode yang digunakan untuk memurnikan senyawa kimia individu dari campuran senyawa. Hal ini sering digunakan untuk aplikasi pada skala preparatif dari mikrogram sampai kilogram. Kolom preparatif kromatografi klasik, adalah tabung gelas dengan diameter dari 50 mm dan tinggi 50 cm sampai 1 m dengan keran di bagian bawah. Dua metode yang umumnya digunakan untuk menyiapkan kolom, metode kering, dan metode basah. Untuk metode kering, kolom pertama diisi dengan bubuk kering fase stasioner, diikuti dengan penambahan fase gerak, yang memerah melalui kolom sampai benar-benar basah, dan dari titik ini tidak pernah diperbolehkan untuk kering. Untuk metode basah, bubur dibuat dari eluen dengan bubuk fase diam dan kemudian dengan hati-hati dituangkan ke dalam kolom. Perawatan harus diambil untuk menghindari gelembung udara. Sebuah solusi dari bahan organik dipipet di atas fase diam. Lapisan ini biasanya atasnya dengan lapisan pasir kecil atau dengan kapas atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan eluen baru ditambahkan. Eluen secara perlahan melewati kolom untuk memajukan bahan organik. Seringkali reservoir eluen bola atau corong pisah eluen-penuh dan tutup diletakkan di atas kolom. Komponen individu dipertahankan oleh fase diam berbeda dan terpisah dari satu sama lain ketika mereka sedang berjalan pada kecepatan yang berbeda melalui kolom dengan eluen. Pada akhir kolom mereka mengelusi satu per satu. Selama proses kromatografi seluruh eluen dikumpulkan dalam serangkaian fraksi. Komposisi aliran eluen dapat dipantau dan setiap fraksi dianalisis untuk senyawa terlarut, misalnya dengan kromatografi analitis, serapan UV, atau fluoresensi. Senyawa berwarna (atau senyawa neon dengan bantuan lampu UV) dapat dilihat melalui dinding kaca sebagai band bergerak.

Proses pemisahan lapisan komponen pada kolom kromatografi

Column chromatography proceeds by a series of steps.

[edit] Stationary phase (adsorbent) The stationary phase or adsorbent in column chromatography is a solid. The most common stationary phase for column chromatography is silica gel, followed by alumina. Cellulose powder has often been used in the past. Also possible are ion exchange chromatography, reversed-phase chromatography (RP), affinity chromatography or expanded bed

adsorption (EBA). The stationary phases are usually finely ground powders or gels and/or are microporous for an increased surface, though in EBA a fluidized bed is used.

Mobile phase (eluent) Fase diam atau adsorben dalam kromatografi kolom solid. Fase diam yang paling umum untuk kromatografi kolom silika gel, diikuti oleh alumina. Bubuk selulosa telah sering digunakan di masa lalu. Juga mungkin adalah pertukaran ion kromatografi, terbalik-fase kromatografi (RP), kromatografi afinitas atau diperluas tidur adsorpsi (EBA). Para fasa diam biasanya bubuk ditumbuk halus atau gel dan / atau mikroporous untuk permukaan meningkat, meskipun dalam EBA tempat tidur terfluidisasi digunakan. Fase gerak (eluen) Fase gerak atau eluen adalah salah pelarut murni atau campuran pelarut yang berbeda. Hal ini dipilih sehingga faktor retensi nilai senyawa bunga kira-kira sekitar 0,2-0,3 untuk meminimalkan waktu dan jumlah eluen untuk menjalankan kromatografi. Eluen juga telah dipilih sehingga senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Eluen dioptimalkan dalam pretest skala kecil, sering menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase diam yang sama. Tingkat aliran lebih cepat dari eluen meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk menjalankan kolom dan dengan demikian meminimalkan difusi, menghasilkan pemisahan yang lebih baik, lihat persamaan Van Deemter itu. Sebuah kolom laboratorium sederhana berjalan oleh aliran gravitasi. Laju aliran seperti kolom dapat ditingkatkan dengan memperpanjang kolom diisi segar eluen di atas puncak fase diam atau dikurangi dengan kontrol sentuh. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas terkompresi (misalnya udara, nitrogen, atau argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom (flash kromatografi kolom) [1] [2]. Ukuran partikel dari fase diam umumnya halus di kromatografi kolom flash daripada dalam kromatografi kolom gravitasi. Sebagai contoh, salah satu nilai yang paling banyak digunakan silika gel dalam teknik pertama adalah jala 230-400 (40-63 pM), sedangkan teknik yang kedua biasanya membutuhkan jala 70-230 (63-200 pM) silika gel [3]. Sebuah spreadsheet yang membantu dalam keberhasilan pengembangan kolom lampu kilat telah dikembangkan. Spreadsheet memperkirakan volume retensi dan volume band analit, nomor fraksi diharapkan mengandung analit masing-masing, dan resolusi antara puncak yang berdekatan. Informasi ini memungkinkan pengguna untuk memilih parameter yang optimal untuk preparatif skala pemisahan sebelum kolom flash itu sendiri yang dicoba. [4]

Automated Systems

Sebuah sistem kromatografi ion otomatis. Kromatografi kolom merupakan tahap yang sangat memakan waktu di lab apapun dan

dengan cepat dapat menjadi hambatan untuk setiap laboratorium proses. Oleh karena itu, beberapa produsen telah mengembangkan sistem otomatis flash kromatografi (biasanya disebut sebagai LPLC, kromatografi cairan tekanan rendah, sekitar 50-75 psi) yang meminimalkan keterlibatan manusia dalam proses pemurnian. Sistem otomatis akan mencakup komponen biasanya ditemukan pada lebih sistem HPLC mahal seperti pompa gradien, port sampel injeksi, detektor UV dan kolektor untuk mengumpulkan fraksi eluen. Biasanya sistem ini otomatis dapat memisahkan sampel dari beberapa miligram hingga skala kg industri dan menawarkan solusi yang jauh lebih murah dan lebih cepat untuk melakukan beberapa suntikan pada persiapanHPLC sistem. Resolusi (atau kemampuan untuk memisahkan campuran) pada sistem LPLC akan selalu lebih rendah dibandingkan dengan HPLC, sebagai bahan kemasan dalam kolom HPLC bisa jauh lebih kecil, biasanya hanya 5 micrometre sehingga luas permukaan meningkat fase stasioner, meningkatkan interaksi permukaan dan memberikan pemisahan yang lebih baik. Namun, penggunaan media ini kemasan kecil menyebabkan tekanan balik tinggi dan mengapa itu disebut kromatografi cair tekanan tinggi. Kolom LPLC biasanya dikemas dengan silika sekitar 50 mikrometer, sehingga mengurangi tekanan balik dan resolusi, tetapi juga menghilangkan kebutuhan untuk mahal pompa tekanan tinggi. Produsen kini mulai pindah ke yang lebih tinggi tekanan sistem flash kromatografi dan telah disebut ini kromatografi cair tekanan sebagai media (MPLC) sistem yang beroperasi di atas 150 psi. Perangkat lunak mengendalikan sistem otomatis akan mengkoordinasikan komponen, memungkinkan pengguna untuk hanya mengumpulkan faksi-faksi yang mengandung senyawa target mereka (dengan asumsi mereka terdeteksi pada detektor sistem) dan membantu pengguna untuk menemukan bahan murni yang dihasilkan dalam kolektor fraksi. Perangkat lunak ini juga akan menyelamatkan kromatografi yang dihasilkan dari proses untuk keperluan penarikan kembali arsip dan / atau lambat. Sebuah contoh wakil dari kromatografi kolom sebagai bagian dari latihan laboratorium sarjana adalah pemisahan tiga komponen (dari 28) dalam minyak spearmint: carvone, limonene dan dehydrocarveol [5]. Sebuah setup mikro yang terdiri dari pipet Pasteur sebagai kolom dengan fase diam silika gel dapat cukup. The eluen awalnya adalah heksana dan polaritas pelarut meningkat selama proses dengan menambahkan etil asetat. [Sunting] Kolom Kromatogram Perhitungan Resolusi Biasanya, kromatografi kolom diatur dengan pompa peristaltik mengalir buffer dan sampel solusi melalui bagian atas kolom. Solusi dan buffer melewati kolom di mana seorang kolektor fraksi pada akhir setup kolom mengumpulkan sampel dielusi. Sebelum koleksi fraksi, sampel yang dielusi dari kolom lulus melalui detektor seperti spektrofotometer atau spektrometer massa sehingga konsentrasi sampel dipisahkan dalam campuran larutan sampel dapat ditentukan. Misalnya, jika Anda adalah untuk memisahkan dua protein yang berbeda dengan kapasitas mengikat yang berbeda untuk kolom dari sampel solusi, jenis yang baik detektor akan menjadi spektrofotometer menggunakan panjang gelombang 280 nm. Semakin tinggi konsentrasi protein yang melewati solusi dielusi melalui kolom, semakin tinggi absorbansi panjang gelombang itu. Karena kromatografi kolom memiliki aliran konstan solusi dielusi melewati detektor pada konsentrasi yang berbeda-beda, detektor harus plot konsentrasi sampel dielusi selama perjalanan waktu. Ini plot konsentrasi sampel terhadap waktu disebut kromatogram.

Tujuan utama dari kromatografi adalah untuk memisahkan komponen yang berbeda dari campuran solusi. Resolusi itu menyatakan tingkat pemisahan antara komponenkomponen dari campuran. Semakin tinggi resolusi dari kromatogram, semakin baik tingkat pemisahan sampel kolom memberikan. Data ini adalah cara yang baik untuk menentukan pemisahan kolom sifat bahwa sampel tertentu. Resolusi dapat dihitung dari kromatogram. Kurva terpisah dalam diagram mewakili profil yang berbeda konsentrasi sampel elusi dari waktu ke waktu berdasarkan afinitas mereka ke kolom resin. Untuk menghitung resolusi, waktu retensi dan lebar kurva diperlukan. Waktu Retensi: Waktu dari awal deteksi sinyal oleh detektor dengan tinggi puncak profil konsentrasi elusi dari masing-masing sampel yang berbeda. Lebar Curve: Lebar kurva profil konsentrasi sampel yang berbeda dalam kromatogram dalam satuan waktu. Sebuah metode sederhana dari menghitung resolusi kromatogram adalah dengan menggunakan model plat [6]. Model piring mengasumsikan bahwa kolom dapat dibagi menjadi sejumlah bagian, atau piring dan keseimbangan massa dapat dihitung untuk setiap piring individu. Pendekatan ini mendekati kurva kromatogram yang khas sebagai kurva distribusi Gaussian. Dengan melakukan ini, lebar kurva diperkirakan sebagai 4 kali standar deviasi dari kurva, 4σ. Waktu retensi adalah waktu dari awal deteksi sinyal dengan waktu ketinggian puncak kurva Gaussian. Dari variabel pada gambar di atas, resolusi, nomor plat, dan tinggi piring model plat kolom dapat dihitung dengan menggunakan persamaan: Resolusi (Rs): Rs = 2 (TRB - tra) / (WB + WA) Dimana: TRB = waktu retensi dari B terlarut TRA = waktu retensi zat terlarut A wb = Gaussian kurva lebar B terlarut Wa = Gaussian kurva lebar zat terlarut A Plat Nomor (N): N = (TR2) / (w / 4) 2 Plat Tinggi (H): H=L/N Dimana L adalah panjang kolom [6]. [Sunting] Column Adsorpsi Equilibrium Untuk kolom adsorpsi, resin kolom (fase diam) terdiri dari microbeads. Bahkan partikel yang lebih kecil seperti protein, karbohidrat, ion logam, atau senyawa kimia lainnya yang terkonjugasi ke microbeads. Setiap partikel mengikat yang melekat pada microbead dapat diasumsikan untuk mengikat dalam rasio 1:1 dengan sampel zat terlarut dikirim melalui kolom yang perlu dimurnikan atau dipisahkan. Mengikat antara molekul target untuk dipisahkan dan molekul mengikat manik-manik kolom dapat dimodelkan menggunakan reaksi kesetimbangan yang sederhana Keq = [CS] / ([C] [S]) di mana Keq adalah konstanta kesetimbangan, [C] dan [ S] adalah konsentrasi molekul target dan molekul mengikat resin kolom, masing-masing. [CS]

adalah konsentrasi kompleks dari molekul target terikat pada resin kolom. [6] Menggunakan ini sebagai dasar, tiga isoterm yang berbeda dapat digunakan untuk menggambarkan dinamika mengikat kromatografi kolom: linear, Langmuir, dan Freundlich. Isoterm linear terjadi ketika konsentrasi zat terlarut perlu dimurnikan adalah relatif sangat kecil untuk molekul pengikatan. Dengan demikian, ekuilibrium dapat didefinisikan sebagai: [CS] = Keq [C]. Untuk menggunakan skala industri, molekul yang mengikat total pada manik-manik kolom resin harus diperhitungkan karena situs kosong harus diperhitungkan. Langmuir isoterm Freundlich dan isoterm berguna dalam menggambarkan keseimbangan ini. Langmuir isoterm: [CS] = (KeqStot [C]) / (1 + Keq [C]), di mana Stot adalah molekul mengikat total pada manik-manik. Freundlich isoterm: [CS] = Keq [C] 1 / n Isoterm Freundlich digunakan ketika kolom dapat mengikat sampel yang berbeda dalam larutan yang perlu dimurnikan. Karena sampel yang berbeda memiliki konstanta mengikat yang berbeda dengan manik-manik, ada banyak yang berbeda Keq ini. Oleh karena itu, Langmuir isoterm bukan model yang baik untuk mengikat dalam hal ini. [6] [Sunting] Lihat pula • Kromatografi, sebuah artikel gambaran yang mencakup semua teknik kromatografi. • kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) untuk kromatografi kolom menggunakan tekanan tinggi. • protein Cepat kromatografi cair (FPLC) untuk pemisahan protein menggunakan kromatografi kolom.

[edit] References 1. ^ Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43(14), 2923-2925. (doi:10.1021/jo00408a041) 2. ^ Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody. Experimental organic chemistry: Principles and Practice (Illustrated edition ed.). pp. 180-185. ISBN 978-0632020171. 3. ^ Normal phase column chromatography, Material Harvest 4. ^ Fair, J. D.; Kormos, C. M. J. Chromatogr. A 2008, 1211(1-2), 49-54. (doi:10.1016/j.chroma.2008.09.085) 5. ^ Isolation of Three Components from Spearmint Oil: An Exercise in Column and Thin-Layer Chromatography Davies, Don R.; Johnson, Todd M. J. Chem. Educ. 2007 84Abstract 6. ^ a b c d Harrison et al. Bioseparations Science and Engineering. Oxford University Press. New York, New York. 2003

[edit] External links

High performance liquid chromatography

High performance liquid chromatography

.

Sebuah HPLC. Dari kiri ke kanan: Sebuah perangkat memompa menghasilkan gradien dari dua pelarut yang berbeda, kolom baja ditegakkan dan aparatus untuk mengukur absorbansi

HPLC apparatus. Kromatografi cair kinerja tinggi (atau kromatografi cair tekanan tinggi, HPLC) merupakan bentuk kromatografi kolom sering digunakan dalam kimia biokimia dan analitis untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan menghitung senyawa berdasarkan polaritas istimewa mereka dan interaksi dengan fase diam kolom ini. HPLC menggunakan berbagai jenis fase diam (biasanya, hidrofobik rantai karbon jenuh), sebuah pompa yang menggerakkan fase gerak (s) dan analit melalui kolom, dan detektor yang memberikan waktu retensi charateristic untuk analit. Detektor juga dapat memberikan informasi characterisitc lainnya (yaitu UV / Vis data spektroskopi untuk analit jika demikian dilengkapi). Analit waktu retensi bervariasi tergantung pada kekuatan interaksi dengan fase diam, rasio / komposisi pelarut (s) yang digunakan, dan laju aliran fase gerak. Dengan HPLC, pompa (bukan gravitasi) memberikan tekanan yang lebih tinggi diperlukan untuk mendorong fase mobile dan analit melalui kolom padat. Kepadatan meningkat muncul dari ukuran partikel yang lebih kecil. Hal ini memungkinkan untuk pemisahan yang lebih baik pada kolom panjang pendek bila dibandingkan dengan kromatografi kolom biasa. [Sunting] Operasi Sampel yang akan dianalisis diperkenalkan dalam volume kecil dengan aliran fase gerak. Gerak analit melalui kolom diperlambat oleh bahan kimia tertentu atau interaksi fisik dengan fase diam seperti melintasi panjang kolom. Berapa banyak analit diperlambat tergantung pada sifat analit dan komposisi fase stasioner dan mobile. Waktu di mana mengelusi analit tertentu (keluar dari ujung kolom) disebut waktu retensi, waktu retensi dalam kondisi tertentu dianggap sebagai karakteristik mengidentifikasi cukup unik dari analit tertentu. Penggunaan ukuran partikel yang lebih kecil kemasan kolom (yang menciptakan backpressure lebih tinggi) meningkatkan kecepatan linear memberikan komponen lebih sedikit waktu untuk menyebar dalam kolom, yang mengarah ke resolusi ditingkatkan dalam kromatogram yang

dihasilkan. Pelarut umum digunakan termasuk kombinasi bercampur air atau cairan organik berbagai (yang paling umum adalah metanol dan asetonitril). Air mungkin berisi buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen analit, atau senyawa seperti asam trifluoroasetat yang bertindak sebagai agen pasangan ion. Sebuah perbaikan lebih lanjut untuk HPLC telah bervariasi komposisi fase gerak selama analisis, hal ini dikenal sebagai elusi gradien. Sebuah gradien normal untuk kromatografi fase terbalik mungkin mulai metanol 5% dan kemajuan linear untuk metanol 50% lebih dari 25 menit, gradien yang dipilih tergantung pada seberapa hidrofobik analit tersebut. Gradien memisahkan campuran analit sebagai fungsi dari afinitas analit untuk komposisi fase saat bergerak relatif terhadap fase diam. Proses partisi ini mirip dengan apa yang terjadi selama ekstraksi cair-cair tetapi terus menerus, tidak bertahap. Dalam contoh ini, menggunakan gradien air / metanol, komponen lebih hidrofobik akan mengelusi (datang dari kolom) ketika fase gerak sebagian besar terdiri dari metanol (memberikan fase gerak relatif hidrofobik). Senyawa-senyawa yang lebih hidrofilik akan terelusi dalam kondisi metanol relatif rendah / air yang tinggi. Pemilihan pelarut, aditif dan gradien tergantung pada sifat fase diam dan analit. Seringkali serangkaian tes yang dilakukan pada analit dan sejumlah berjalan sidang dapat diproses dalam rangka untuk menemukan metode HPLC yang memberikan pemisahan terbaik dari puncak.

[edit] Types [edit] Partition chromatography

HPLC moderen Seorang diri modern yang terkandung HPLC. Dalam gambar ini, sebuah Agilent 1.200 terhubung ke PC Partisi kromatografi adalah jenis pertama dari kromatografi yang dikembangkan kimiawan. Prinsip Koefisien partisi telah diterapkan dalam kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, fase gas dan cairan-cairan aplikasi. 1952 Nobel Prize di bidang kimia itu diperoleh oleh Archer John Porter Martin dan Richard Laurence Millington Synge bagi perkembangan mereka dari teknik, yang digunakan untuk pemisahan mereka dari asam amino. Partisi kromatografi menggunakan pelarut dipertahankan, di permukaan atau di dalam biji-bijian atau serat dari matriks "lembam" pendukung yang solid seperti kromatografi kertas, atau mengambil keuntungan dari beberapa coulombic tambahan dan / atau hidrogen donor

interaksi dengan dukungan yang solid. Molekul menyeimbangkan (partisi) antara fase diam cair dan eluen. Dikenal sebagai Kromatografi Interaksi Hidrofilik (HILIC) di HPLC, metode ini memisahkan analit didasarkan pada perbedaan kutub. HILIC paling sering menggunakan fase terikat diam polar dan non-polar, air larut, fase gerak. Partisi HPLC telah digunakan historis pada silika tak terikat atau mendukung alumina. Masing-masing bekerja secara efektif untuk memisahkan analit oleh perbedaan kutub relatif, bagaimanapun, HILIC memiliki keuntungan memisahkan asam, larutan basa dan netral dalam kromatogram tunggal. Analit polar berdifusi ke dalam lapisan air stasioner terkait dengan fase diam polar dan dengan demikian dipertahankan. Kekuatan retensi meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit polar dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tergantung pada kelompok fungsional dalam molekul analit yang mempromosikan partisi tetapi juga dapat mencakup coulombic (elektrostatik) interaksi dan kemampuan hidrogen donor. Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan mengurangi waktu retensi analit, sedangkan pelarut hidrofobik lebih cenderung meningkatkan waktu retensi. Partisi dan NP-HPLC telah jatuh dari kasih karunia di tahun 1970-an dengan perkembangan fase terbalik HPLC karena kurangnya reproduksibilitas waktu retensi sebagai air atau pelarut organik protik mengubah keadaan hidrasi dari silika atau media kromatografi alumina. Barubaru ini telah menjadi berguna lagi dengan perkembangan fase terikat HILIC yang meningkatkan reproduktifitas. [Sunting] kromatografi fase normal Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat kromatografi fasa air normal. Juga dikenal sebagai HPLC fase normal (NP-HPLC), atau adsorpsi kromatografi, metode ini memisahkan analit didasarkan pada adsorpsi dengan kimia permukaan stasioner dan dengan polaritas. Itu adalah salah satu jenis pertama HPLC yang dikembangkan kimiawan. NPHPLC menggunakan fase diam polar dan non-polar, non-berair fase gerak, dan bekerja efektif untuk memisahkan analit mudah larut dalam pelarut non-polar. Rekan analit dengan dan dipertahankan oleh fase diam polar. Kekuatan adsorpsi meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit polar dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tidak hanya tergantung pada kelompok fungsional dalam molekul analit, tetapi juga pada faktor sterik. Pengaruh sterics pada kekuatan interaksi memungkinkan metode ini untuk menyelesaikan (terpisah) isomer struktural. Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan mengurangi waktu retensi analit, sedangkan pelarut hidrofobik lebih cenderung meningkatkan waktu retensi. Pelarut polar yang sangat dalam campuran cenderung menonaktifkan fase diam dengan menciptakan lapisan air stasioner terikat pada permukaan fase diam. Perilaku ini agak aneh bagi fase normal karena hal ini sangat murni mekanisme adsorptif (interaksi adalah dengan permukaan yang keras daripada lapisan lembut pada permukaan). NP-HPLC jatuh dari kasih karunia di tahun 1970-an dengan perkembangan fase terbalik HPLC karena kurangnya reproduksibilitas waktu retensi sebagai air atau pelarut organik protik mengubah keadaan hidrasi dari silika atau media kromatografi alumina. Baru-baru ini telah menjadi berguna lagi dengan perkembangan fase terikat HILIC yang meningkatkan reproduktifitas. [Sunting] Pemindahan kromatografi Prinsip dasar kromatografi perpindahan adalah: Sebuah molekul dengan afinitas tinggi untuk matriks kromatografi (displacer) akan bersaing secara efektif untuk situs mengikat, dan dengan demikian menggantikan seluruh molekul dengan afinitas yang lebih rendah [1] Ada perbedaan jelas antara perpindahan dan kromatografi elusi. . Dalam modus elusi, zat biasanya muncul dari sebuah kolom di sempit, puncak Gaussian. Pemisahan yang luas dari puncak,

sebaiknya ke baseline, yang diinginkan untuk mencapai pemurnian maksimal. Kecepatan di mana setiap komponen campuran perjalanan ke kolom dalam mode elusi tergantung pada banyak faktor. Tapi untuk dua zat untuk melakukan perjalanan dengan kecepatan yang berbeda, dan dengan demikian dapat diselesaikan, harus ada perbedaan substansial dalam beberapa interaksi antara biomolekul dan matriks kromatografi. Parameter operasi yang disesuaikan untuk memaksimalkan efek dari perbedaan ini. Dalam banyak kasus, dasar pemisahan puncak dapat dicapai hanya dengan elusi gradien dan beban kolom yang rendah. Dengan demikian, dua kelemahan kromatografi elusi modus, terutama pada skala preparatif, adalah kompleksitas operasional, karena gradien pelarut memompa, dan throughput rendah, karena beban kolom yang rendah. Pemindahan kromatografi memiliki keunggulan dibandingkan kromatografi elusi dalam komponen diselesaikan menjadi zona berturut-turut zat murni daripada "puncak". Karena proses mengambil keuntungan dari nonlinier dari isoterm, feed kolom yang lebih besar dapat dipisahkan pada kolom tertentu dengan komponen dimurnikan pulih pada konsentrasi lebih tinggi secara signifikan.

Reversed phase chromatography (RPC)

Sebuah kromatogram campuran kompleks (air parfum) diperoleh terbalik fase HPLC Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat Terbalik-fase kromatografi. Fase balik HPLC (RP-HPLC atau RPC) memiliki fase non-polar stasioner dan Aqueous, fase gerak cukup polar. Satu fase diam umum adalah silika yang telah diobati dengan RMe2SiCl, di mana R adalah gugus alkil rantai lurus seperti C18H37 atau C8H17. Dengan fase stasioner, waktu retensi lebih lama untuk molekul yang lebih non-polar, sedangkan molekul polar mengelusi lebih mudah. Penyidik dapat meningkatkan waktu retensi dengan menambahkan lebih banyak air ke fase gerak, sehingga membuat afinitas analit hidrofobik untuk fase relatif hidrofobik stasioner kuat ke fase gerak sekarang lebih hidrofilik. Demikian pula, penyidik dapat mengurangi waktu retensi dengan menambahkan lebih pelarut organik untuk eluen. RPC begitu umum digunakan yang sering salah disebut sebagai "HPLC" tanpa spesifikasi lebih lanjut. Industri farmasi secara rutin menggunakan RPC untuk memenuhi syarat obat sebelum pembebasan mereka. RPC beroperasi pada prinsip kekuatan hidrofobik, yang berasal dari simetri tinggi dalam struktur air dipole dan memainkan peran paling penting dalam semua proses dalam ilmu kehidupan. RPC memungkinkan pengukuran kekuatan interaktif. Pengikatan analit ke fase diam sebanding dengan luas permukaan kontak sekitar segmen non-polar dari molekul analit pada hubungan dengan ligan dalam eluen air. Efek solvophobic didominasi oleh kekuatan air untuk "pengurangan rongga-" sekitar analit dan rantai-C18 versus kompleks keduanya. Energi yang dilepaskan dalam proses ini sebanding dengan tegangan permukaan eluen (air:

7.3 × 10-6 J / cm ², metanol: 2,2 × 10-6 J / cm ²) dan permukaan hidrofobik analit dan ligan masing . Retensi dapat dikurangi dengan menambahkan pelarut kurang polar (metanol, asetonitril) ke dalam fase gerak untuk mengurangi tegangan permukaan air. Elusi gradien menggunakan efek ini dengan secara otomatis mengurangi polaritas dan tegangan permukaan dari fase gerak berair selama analisis. Sifat struktur molekul analit memainkan peran penting dalam karakteristik retensi. Secara umum, suatu analit dengan luas hidrofobik lebih besar permukaan (CH, CC, dan umumnya non-polar ikatan atom, seperti SS dan lain-lain) hasil dalam waktu retensi lebih lama karena meningkatkan non-polar permukaan molekul daerah, yang non -berinteraksi dengan struktur air. Di sisi lain, gugus polar, seperti-OH,-NH2, COO-atau-NH3 + mengurangi retensi karena mereka terintegrasi dengan baik ke dalam air. Molekul yang sangat besar, namun, dapat mengakibatkan interaksi yang tidak lengkap antara permukaan analit besar dan rantai alkil ligan dan dapat memiliki masalah memasuki pori-pori fase diam. Waktu retensi meningkat dengan luas permukaan hidrofobik (non-polar). Senyawa rantai bercabang mengelusi lebih cepat dari isomer berhubungan linear karena luas permukaan keseluruhan menurun. Senyawa organik Similarly with ikatan CC single mengelusi lambat dibandingkan dengan C = C or CC-triple Bond sebagaimana ikatan ganda atau triple lebih pendek daripada single CC-bond. Selain fase tegangan permukaan ponsel (kekuatan organisasi dalam struktur eluen), lainnya pengubah fase gerak dapat mempengaruhi retensi analit. Misalnya, penambahan garam anorganik menyebabkan peningkatan linear moderat dalam tegangan permukaan larutan berair (1,5 × 10-7 ca. J / cm ² Mol per untuk NaCl, 2,5 × 10-7 J / cm ² Mol per untuk (NH4) 2SO4), dan karena entropi dari interface analit-pelarut dikendalikan oleh tegangan permukaan, penambahan garam cenderung meningkatkan waktu retensi. Teknik ini digunakan untuk pemisahan ringan dan pemulihan protein dan perlindungan dari aktivitas biologis mereka dalam analisis protein (kromatografi interaksi hidrofobik, HIC). Komponen penting lainnya adalah pengaruh pH karena ini dapat mengubah hidrofobisitas analit. Untuk alasan ini metode yang paling menggunakan agen buffering, seperti natrium fosfat, untuk mengontrol pH. Buffer melayani beberapa tujuan: mereka mengontrol pH, menetralisir muatan pada setiap silika terkena residu pada fase diam dan bertindak sebagai agen pasangan ion untuk menetralkan muatan pada analit. Formate Amonium biasanya ditambahkan dalam spektrometri massa untuk meningkatkan deteksi analit tertentu dengan pembentukan adduct amonium. Suatu asam organik yang mudah menguap seperti asam asetat, atau asam formiat paling sering, sering ditambahkan ke fase gerak jika spektrometri massa digunakan untuk menganalisis kolom eluen. Asam trifluoroasetat jarang digunakan dalam aplikasi spektrometri massa karena kegigihan dalam detektor dan sistem pengiriman pelarut, tetapi bisa efektif dalam meningkatkan retensi analit seperti asam karboksilat dalam aplikasi menggunakan detektor lainnya, karena merupakan salah satu asam organik terkuat. Efek dari asam dan buffer bervariasi oleh aplikasi tetapi umumnya meningkatkan kromatografi. Kolom fase terbalik cukup sulit untuk merusak dibandingkan dengan kolom silika normal, namun, banyak kolom fase terbalik terdiri dari alkil partikel silika diderivatisasi dan tidak boleh digunakan dengan dasar air karena ini akan menghancurkan partikel silika yang mendasarinya. Mereka dapat digunakan dengan asam encer, tetapi kolom tidak boleh terkena asam terlalu lama, karena bisa menimbulkan korosi bagian logam dari peralatan HPLC. RPHPLC kolom harus memerah dengan pelarut bersih setelah digunakan untuk menghapus sisa asam atau buffer, dan disimpan dalam sebuah komposisi yang tepat dari pelarut. Kandungan logam dari kolom HPLC harus tetap rendah jika kemampuan terbaik untuk zat terpisah dipertahankan. Sebuah tes yang baik untuk kandungan logam dari kolom adalah untuk menyuntikkan sampel yang merupakan campuran dari 2,2 '- dan 4,4' - bipiridin. Karena 2,2 '-

bipy dapat khelat logam, bentuk puncak untuk 2,2'-bipy akan terdistorsi (ekor) ketika ion logam yang hadir pada permukaan silika. [Rujukan?] .. [Sunting] Ukuran kromatografi eksklusi Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat kromatografi eksklusi ukuran. Ukuran kromatografi eksklusi (SEC), juga dikenal sebagai kromatografi permeasi gel atau kromatografi gel filtrasi, memisahkan partikel berdasarkan ukuran. Ini umumnya merupakan kromatografi resolusi rendah sehingga sering dicadangkan untuk langkah final, "polishing" pemurnian a. Hal ini juga berguna untuk menentukan struktur tersier dan struktur kuaterner protein dimurnikan. SEC digunakan terutama untuk analisis molekul besar seperti protein atau polimer. SEC bekerja dengan menjebak molekul-molekul yang lebih kecil dalam poripori partikel. Molekul-molekul yang lebih besar hanya melewati pori-pori karena mereka terlalu besar untuk masuk ke pori-pori. Oleh karena itu molekul yang lebih besar mengalir melalui kolom lebih cepat daripada molekul yang lebih kecil, yaitu lebih kecil molekul, semakin lama waktu retensi. Teknik ini banyak digunakan untuk penentuan berat molekul polisakarida. SEC adalah teknik resmi (suggested by European Pharmacopeia) untuk perbandingan berat molekul yang berbeda tersedia secara komersial molekul rendah heparins berat. [Sunting] Ion kromatografi penukar Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat pertukaran ion kromatografi. Dalam pertukaran ion kromatografi, retensi didasarkan pada daya tarik antara ion terlarut dan situs dibebankan terikat pada fase diam. Ion muatan yang sama dikecualikan. Jenis penukar ion meliputi: • Polistirena resin - Ini memungkinkan hubungan lintas yang meningkatkan stabilitas rantai. Tinggi linkage lintas Mengurangi meliuk, yang meningkatkan waktu ekuilibrasi dan akhirnya meningkatkan selektivitas. • Selulosa dan ion dekstran penukar (gel) - Ini memiliki ukuran pori yang lebih besar dan kepadatan muatan yang rendah membuat mereka cocok untuk pemisahan protein. • Controlled-pori kaca atau silika berpori Secara umum, penukar ion mendukung pengikatan ion biaya tinggi dan jari-jari yang lebih kecil. Peningkatan ion tanding (berkenaan dengan kelompok-kelompok fungsional dalam resin) konsentrasi mengurangi waktu retensi. Peningkatan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran kation sementara penurunan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran anion. Bentuk kromatografi secara luas digunakan dalam aplikasi berikut: pemurnian air, prekonsentrasi komponen jejak, ligan-kromatografi penukar, pertukaran ion kromatografi protein, tinggi-pH anion-kromatografi penukar karbohidrat dan oligosakarida, dan lain-lain. [Sunting] Bioaffinity kromatografi Proses kromatografi bergantung pada properti dari zat biologis aktif untuk membentuk stabil, kompleks yang spesifik, dan reversibel. Pembentukan kompleks ini melibatkan partisipasi pasukan molekul umum seperti Van der Waals interaksi, interaksi elektrostatik, dipol-dipol interaksi, interaksi hidrofobik, dan ikatan hidrogen. Ikatan, efisien biospecific dibentuk oleh aksi simultan dan terpadu dari beberapa kekuatan di situs mengikat pelengkap. [Sunting] kromatografi fase berair yang normal Aqueous fase kromatografi normal (ANP) adalah teknik kromatografi yang meliputi wilayah fase gerak antara fase terbalik kromatografi (RP) dan organik kromatografi fase normal (ONP). Teknik ini digunakan untuk mencapai selektivitas unik untuk senyawa hidrofilik, menunjukkan elusi fase normal yang menggunakan reverse-fase pelarut. [Rujukan?] [Sunting] isokratik aliran dan elusi gradien Sebuah pemisahan di mana komposisi fase gerak tetap konstan di seluruh prosedur disebut

isokratik (berarti komposisi konstan). Kata ini diciptakan oleh Csaba Horvath dari Universitas Yale [rujukan?], Yang merupakan salah satu pelopor dari HPLC. Komposisi fase gerak tidak harus tetap konstan. Sebuah pemisahan di mana komposisi fase gerak berubah selama proses pemisahan digambarkan sebagai elusi gradien. [2] Salah satu contoh adalah gradien mulai metanol 10% dan berakhir pada metanol 90% setelah 20 menit. Kedua komponen dari fase gerak biasanya disebut "A" dan "B", A adalah "lemah" pelarut yang memungkinkan zat terlarut untuk mengelusi hanya perlahan-lahan, sedangkan B adalah "kuat" pelarut yang cepat elutes zat terlarut dari kolom . Sebuah pelarut sering air, sedangkan B adalah pelarut organik bercampur dengan air, seperti asetonitril, metanol, THF, atau isopropanol. Dalam elusi isokratik, lebar puncak meningkat dengan waktu retensi linear menurut persamaan untuk N, jumlah pelat teoritis. Hal ini menyebabkan kerugian yang terlambateluting puncak menjadi sangat datar dan luas. Bentuk dan lebar dapat menjaga mereka dari yang diakui sebagai puncak. Elusi gradien mengurangi retensi nanti-eluting komponen sehingga mereka mengelusi lebih cepat, memberikan sempit (dan lebih tinggi) untuk komponen yang paling puncak. Ini juga meningkatkan bentuk puncak untuk puncak ekor, sebagai meningkatnya konsentrasi eluen organik mendorong bagian tailing dari puncak ke depan. Ini juga meningkatkan tinggi puncak (peak terlihat "tajam"), yang penting dalam analisis jejak. Program gradien mungkin termasuk mendadak "langkah" peningkatan persentase komponen organik, atau lereng yang berbeda pada waktu yang berbeda - semua sesuai dengan keinginan untuk pemisahan optimum dalam waktu yang minimal. Dalam elusi isokratik, selektivitas tidak berubah jika dimensi kolom (panjang dan diameter dalam) perubahan - yaitu, elusi puncak dalam urutan yang sama. Dalam elusi gradien, urutan elusi dapat berubah sebagai dimensi atau perubahan laju alir. [Rujukan?] Kekuatan pendorong yang berasal dari kromatografi fase terbalik dalam urutan tinggi struktur air. Peran fase gerak organik adalah untuk mengurangi urutan tinggi dengan mengurangi kekuatan penghambat dari komponen berair. [Sunting] Parameter [Sunting] diameter internal Diameter internal (ID) dari kolom HPLC merupakan parameter penting yang mempengaruhi sensitivitas deteksi dan selektivitas pemisahan elusi gradien. Hal ini juga menentukan kuantitas analit yang dapat dimuat ke kolom. Kolom besar biasanya terlihat dalam aplikasi industri, seperti pemurnian produk obat untuk digunakan nanti. Rendah-ID kolom telah meningkatkan sensitivitas dan konsumsi pelarut lebih rendah dengan mengorbankan kapasitas loading. • kolom ID yang lebih besar (lebih dari 10 mm) yang digunakan untuk memurnikan jumlah bahan yang dapat digunakan karena kapasitas beban yang besar. • kolom skala Analytical (4.6 mm) telah menjadi jenis yang paling umum dari kolom, kolom meskipun kecil dengan cepat mendapatkan popularitas. Mereka digunakan dalam analisis kuantitatif tradisional sampel dan sering menggunakan detektor absorbansi UV-Vis. • Narrow-bore kolom (1-2 mm) yang digunakan untuk aplikasi saat sensitivitas lebih diinginkan baik dengan khusus UV-vis detektor, deteksi fluoresensi atau dengan metode deteksi lainnya seperti kromatografi cair-spektrometri massa • Kolom kapiler (di bawah 0,3 mm) yang digunakan hampir secara eksklusif dengan deteksi alternatif berarti seperti spektrometri massa. Mereka biasanya terbuat dari kapiler leburan silika, daripada tabung stainless steel yang lebih besar mempekerjakan kolom. [Sunting] Ukuran partikel HPLC paling tradisional dilakukan dengan fase diam melekat pada bagian luar kecil partikel silika bulat (manik-manik yang sangat kecil). Partikel ini datang dalam berbagai ukuran

dengan 5 pM manik yang paling umum. Partikel yang lebih kecil umumnya memberikan luas permukaan lebih banyak dan pemisahan yang lebih baik, tetapi tekanan yang dibutuhkan untuk meningkatkan kecepatan optimal linear dengan kebalikan dari kuadrat diameter partikel [3] [4] [5]. Ini berarti bahwa perubahan partikel yang setengah besar, menjaga ukuran kolom yang sama, akan menggandakan kinerja, tetapi meningkatkan tekanan yang dibutuhkan dengan faktor empat. Partikel yang lebih besar yang digunakan dalam HPLC preparatif (diameter kolom 5 cm sampai dengan> 30 cm) dan untuk non-HPLC aplikasi seperti solid-fase ekstraksi. [Sunting] ukuran pori Fasa diam banyak berpori untuk memberikan luas permukaan yang lebih besar. Pori-pori kecil memberikan luas permukaan yang lebih besar sedangkan ukuran pori yang lebih besar memiliki kinetika yang lebih baik, terutama untuk analit yang lebih besar. Sebagai contoh, suatu protein yang hanya sedikit lebih kecil dari pori bisa memasuki pori-pori tetapi tidak mudah meninggalkan sekali di dalam. [Sunting] Tekanan Pompa Pompa bervariasi dalam kapasitas tekanan, namun kinerja mereka diukur pada kemampuan mereka untuk menghasilkan laju aliran yang konsisten dan direproduksi. Tekanan dapat mencapai setinggi 40 MPa (6000 lbf/in2), atau sekitar 400 atmosfer. Modern HPLC sistem telah ditingkatkan untuk bekerja pada tekanan yang lebih tinggi, dan karena itu dapat menggunakan ukuran partikel jauh lebih kecil dalam kolom (