Mikrobiologija Predavanje 3

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Sveučilište u Zagrebu Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije

Preddiplomski studij: EKOINŽENJERSTVO Kolegij : MIKROBIOLOGIJA

MIKROSKOPSKO PROUČAVANJE MORFOLOGIJE MIKROORGANIZAMA (III)

Dr. sc. Felicita Briški, red. prof. [email protected]

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Sadržaj III dijela • • • • • • • • •

GRAĐA SLOŽENOG SVJETLOSNOG MIKROSKOPA MOĆ RAZDVAJANJA LEĆE RADNA DALJINA OBJEKTIVA MIKROMETRIJA PRIPRAVA UZORAKA ZA MIKROSKOPIRANJE BOJENJE BAKTERIJSKIH STANICA BOJENJE BAKTERIJSKIH ENDOSPORA BOJENJE BAKTERIJSKIH ČAHURA OSTALE VRSTE MIKROSKOPA

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

MOĆ RAZDVAJANJA LEĆE Moć razdvajanja je sposobnost leće da: ¾ISTAKNE FINE DETALJE I STRUKTURU STANICE ¾ODNOSNO RAZDVOJI DVIJE TOČKE KOJE SU VRLO BLIZU

GRAĐA SLOŽENOG SVJETLOSNOG MIKROSKOPA

Mehanički dijelovi: 1. Podloga 2. Stalak 3. Tubus s revolverom 4. Stolić 5.Makrovijak i mikrovijak 6. Izvor svjetlosti

Optički dijelovi: 1. Okulari 2. Objektivi 3. Kondenzor

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Moć razdvajanja ovisi o: - Indeksu refrakcije (η ) sredstva kroz koje svjetlost prolazi prije ulaska u objektiv - Valnoj duljini svjetlosti (λ) - Numeričkoj aperturi (NA) leće objektiva

NA = η sinα α - kut koji tvore zrake svjetlosti dolazeći iz kondenzora i prolazeći kroz preparat

¾ Moć razdvajanja (d) je veća što je valna d = λ duljina upotrijebljene svjetlosti (λ) kraća, NA

1

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

RADNA DALJINA OBJEKTIVA ¾ Radna daljina je najmanja udaljenost između preparata i leće objektiva pri kojoj se slika jasno vidi

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

¾ IMERZIJSKA TEKUĆINA (anisol, cedrovo ulje) koristi se pri mikroskopiranju s imerzijskim objektivom da se spriječi rasipanje zraka svjetlosti Kod vlažnog preparata - stavlja se na pokrovnicu ispod koje je preparat na predmetnici i leće imerzijskog objektiva imerzijski objektiv (× 100) imerzijska tekućina pokrovnica predmetnica

¾ OBJEKTIVI: malo povećanje, srednje povećanje i imerzijski

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Shematski prikaz poprečnog presjeka mikroskopa s preparatom

Kod obojenog preparata – stavlja se izravno na preparat na predmetnici (suspenzija kulture prethodno fiksirana, obojena i preparat osušen)

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

MIKROMETRIJA

U mikrobiološkim istraživanjima bitno je odrediti dimenzije stanica. Kod svjetlosnog mikroskopa to se obavlja : a) okularnim mikrometrom (sadrži brojčanu ljestvicu) i

b) objektnim mikrometrom (sadrži 100 podjeljaka neobrojčanih, a ukupne duljine 1 mm)

10

0

Prije mjerenja treba baždariti okularni mikrometar i baždarenje provesti za sve objektive .

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

PRIPRAVA UZORAKA ZA MIKROSKOPIRANJE i PROMATRANJE MIKROBNIH STANICA

Živi mikroorganizmi – vlažni preparat, viseća kap, ubodni agar Fiksirani mikroorganizmi – bojanje preparata

Vlažni preparat:

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Određivanje pokretljivosti bakterijskih stanica: - Metoda viseće kapi (udubljena pokrovnica, kap suspenzije u udubinu, rubovi namazani vazelinom, obrnuti predmetnicu i poklopiti pokrovnicu. Ponovo rotirati i promatrati pod mikroskopom). Bakterijske stanice

suspenzija mikroorganizama mikrobiološka ušica, predmetnica i pokrovnica

2

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

- Metoda ubodnog agara (polučvrsti hranjivi agar u epruveti inokulirati s bakterijskom kulturom i inkubirati 24 h. Pokretljive stanice će rasti i na većoj udaljenosti od samog mjesta uboda ezom u odnosu na nepokretne stanice. Nepokretne stanice

Pokretne stanice

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

¾ Vlažni preparati se rabe za izravno istraživanje mikroorganizama u normalnome živom stanju. ¾ Međutim većina stanica su propusne za svjetlo i gotovo su bezbojne pa je otežano njihovo promatranje. ¾ Da bi se stanice bakterija mogle promatrati pod mikroskopom potrebno je primijeniti različite postupke bojenja.

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

BOJENJE BAKTERIJSKIH STANICA Svrha – usporedba morfoloških oblika i raspored bakterijskih stanica ¾ Jednostavno – tijekom bojenja primjenjuje se otopina koja sadrži samo jedno bojilo (karbolfuksin, metilensko modrilo)

Diferencijalno bojenje po Gramu Ukazuje na debljinu stanične stijenke bakterije. Priprava preparata: A. Suspenzija mikroorganizama (čista ili mješovita kultura), mikrobiološka ušica, predmetnica

¾ Složeno ili diferencijalno – zahtijeva upotrebu najmanje triju kemijskih reagensa (najpoznatije bojenje po Gramu) ¾ Bojanje endospora – primjenom kemijskih reagensa Kap suspenzije kulture – priprava razmaza –

sušenje razmaza

¾ Bojanje čahura - primjenom kemijskih reagensa

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

B. Postupak bojanja po Gramu Gram pozitivne stanice

Objašnjenje zašto se stanice oboje Gram pozitivno ili Gram negativno

Gram negativne stanice

Fiksiranje

PEPTIDOGLIKAN

PEPTIDOGLIKAN

Kristalviolet Lugol Ispiranje etanolom Kontrastno bojilo Safranin

MEMBRANA

MEMBRANA PERIPLAZMA LIPOPOLISAHARID + PROTEIN

Deblja stanična stjenka

Tanja stanična stjenka

3

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Dokazivanje ispravnosti dokazane reakcije na bojanje po GRAMU Jedna od reakcija - test kalijevim hidroksidom (KOH): a)

na predmetnicu kapnuti 2 kapi 3%-tne KOH

b)

mikrobiološkom ušicom uzeti koloniju bakterije izrasle na čvrstoj podlozi, dodati u KOH i miješati 30 s

c)

tijekom miješanja podizati ušicu i ukoliko vise vlakna dokaz je da je prisutna gram negativna kultura. (KOH razara staničnu stjenku, oslobađajući DNK i tvoreći vlakna).

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Postupak bojenja po Shaefer-Fultonu Svrha – uočiti oblik i položaj endospore u bakterijskoj stanici. Postupak: 1. Suspenzija bakterijske kulture razvuče se na predmetnicu 2. Preparat osuši na zraku i fiksira iznad plamena 3. Na preparat nanijeti primarno bojilo malahitnozelenilo 4. Zagrijavati predmetnicu s bojilom 3×15 sekundi 5. Preparat oprati pod mlazom vode 6. Obojiti kontrastnim bojilom safraninom (3-5 min)

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

BOJANJE BAKTERIJSKIH ČAHURA (kapsula) • Čahura – želatinozni vanjski sloj stanice (polisaharidi, glikoproteini, polipeptidi)

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

BOJANJE BAKTERIJSKIH ENDOSPORA

• Bakterije: anaerobni rodovi Clostridium i Desulfotomaculum i aerobni rod Bacillus • Tvore endospore kada su nepovoljni okolišni uvjeti kao: 1. nedostatak hranjivih tvari 2. nedostatak vode ili 3. nagomilavanje produkata metabolizma

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

• Preparat promatrati pod mikroskopom primjenom imerzijskog objektiva • U vidnom polju mikroskopa pojaviti će se zeleno obojene endospore i crveno obojene vegetativne stanice bakterija.

Vegetativne stanice

Endospore

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fotografski snimak sluzavih kolonija Bacillus antharcis koje tvore čahure (lijevo) i stanice obojene indijskim tušem (desno)

• Teško se oboji postupkom diferencijalnog bojenja, jer je tvar od koje je sačinjena čahura topiva u vodi, pa može biti isprana tijekom ispiranja preparata. • Postupak bojenja: - bakterijsku suspenziju ezom umutiti u indijski tuš - zatim obojiti metilenskim modrilom Preparati se tijekom bojenja ne zagrijavaju

4

Fakultet kemijskog inž inženjerstva i tehnologije Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu

Fakultet kemijskog inž inženjerstva i tehnologije Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu

Primjeri:

Mikroskopija u tamnom polju

Kvasci: Candida tropicalis i Trichosporon sp.

¾ Koristi se za promatranje mikroorganizama koji se : - ne vide pod svjetlosnim mikroskopom, - ne mogu se obojiti stanice ili se - bojanjem iskrivljuju njihova obilježja ¾ Kondenzor s tamnim poljem, prolaze samo difraktirane zrake u leću objektiva ¾ Mikroskopski preparat se pojavljuje kao svijetla slika na tamnoj pozadini ¾ Pogodno za promatranje bakterija, kvasaca

Fakultet kemijskog inž inženjerstva i tehnologije Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu

Fakultet kemijskog inž inženjerstva i tehnologije Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu

Primjer: 4 faze razvoja razvoja bakterijske stanice

Fazno-kontrastna mikroskopija ¾

Fazno-kontrastni mikroskop koristi prstenastom pregradom (dijafragma)

¾

Dopušta kružnom snopu svjetla prolazak kroz kondenzor, fokusiranje svjetla na preparat i ulazak difraktiranog svjetla u leću objektiva

¾

Ovaj postupak omogućava: Proučavanje unutrašnje strukture u živim organizmima

kondenzor

s

Fakultet kemijskog inž inženjerstva i tehnologije Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu

Mikroskop s fluorescencijom ¾Funkcionira na osnovi fluorescencije tvari. ¾ Fluorescentne tvari apsorbiraju zrake kratke valne duljine (UV) i otpuštaju svjetlo koje ima dulje valne duljine, što se može vidjeti posebnim filtrima. ¾ Primjer: fluorokromno bojilo auramin O sjaji žuto pod UV, pa kada su tako obojene stanice Mycobacterium tuberculosis, one se vide kao jasni žuti oblici na tamnoj pozadini

Fakultet kemijskog inž inženjerstva i tehnologije Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu

Primjer: stanice Bacillus subtilis u fazi sporulacije Crveno – određivanje DNK Zeleno – proteini Plavo – sF transkripcijska aktivnost Enzim βgalaktozidaza

5

Fakultet kemijskog inž inženjerstva i tehnologije Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu

Primjer: konzorcij nitrificirajućih bakterija

Zeleno – bakterije koje oksidiraju NH4+ Crveno – bakterije koje oksidiraju NO2-

Fakultet kemijskog inž inženjerstva i tehnologije Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu

Primjer: bakterija Salmonela snimljena pod transmisijskim elektronskim mikroskopom

Fakultet kemijskog inž inženjerstva i tehnologije Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu

Usporedba različitih tipova mikroskopa Tip mikroskopa Max. povećanje Moć razdvajanja SVJETLOSNI 1500 × 100-200 nm TAMNO POLJE 1500 × 100-200nm FAZNO-KONTRASTNI 1500 × 100-200 nm FLUORESCENTNI 1500 × 100-200 nm ELEKTRONSKI Transmisijski 500.000 - 1.000.000 1 nm Pretražni 10.000 –1.000.000 1-10 nm

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Pitanja za ponavljanje 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Navedite optičke i mehaničke dijelove složenog mikroskopa. Što je moć razdvajanja leće objektiva i o čemu ovisi (objasniti sve članove u izrazu)? Koja je uloga imerzijske tekućine u mikroskopiji? Navedite radne daljine pojedinih objektiva. Što je mikrometrija i kako se baždari mikroskop? Opišite pripravu vlažnog preparata. Kako se određuje pokretljivost bakterijskih stanica? Navedite svrhu i vrste bojenja bakterijskih stanica. Koja je svrha bojanja i opišite postupak diferencijalnog bojanja po Gramu. Koja je svrha jednostavnog bojanja bakterijskih stanica i opišite kratko postupak rada? Koja je svrha bojenja endospora i opišite ukratko postupak bojenja po Shaeffer-Fultonu? Opišite postupak bojenja čahura. Navedite ostale vrste mikroskopa i njihovu ulogu u mikroskopiji.

6