Mikrobiologija Predavanje 10 i 11

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Sveučilište u Zagrebu Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije

Preddiplomski studij: EKOINŽENJERSTVO

Kolegij : MIKROBIOLOGIJA

METABOLIZAMSKE RAZLIKE MEĐU MIKROORGANIZMIMA (X i XI)

Dr. sc. Felicita Briški, red prof. [email protected]

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Sadržaj X i XI dijela X - RAST MIKROORGANIZAMA Rast u ovisnosti o okolišnim uvjetima Fizikalni i kemijski zahtjevi za rast Temperaturni uvjeti Utjecaj pH vrijednosti Osmotski i hidrostatski tlak XI - UZGOJ MIKROORGANIZAMA Uzgoj u laboratorijskim uvjetima Elementi bitni za rast mikroorganizama Elementi u tragovima Aktivitet vode Rast i razmnožavanje bakterija Krivulja rasta bakterija Generacijsko vrijeme Određivanje rasta mikroorganizama

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Rast u ovisnosti o okolišnim uvjetima  Mikroorganizmi u povoljnim uvjetima kontinuirano obavljaju: Ö metabolizamske reakcije Ö povećavaju svoju veličinu i broj u populaciji  Mikroorganizmi najčešće najbolje rastu u: Ö vodi i tlu  Autotrofni i heterotrofni mikroorganizmi mogu se uzgajati na kemijski definiranim hranjivim podlogama  Prema izvoru ugljika i energije što koriste u metabolizmu svrstani su u 4 grupe: fotoautotrofi, fotoheterotrofi kemoautotrofi i kemoheterotrofi

RAST MIKROORGANIZAMA (X)

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

 Fotoautotrofi – koriste CO2 za opskrbu ugljikom

i svjetlost kao izvor energije Posjeduju: Ö klorofile (bakterioklorofili) - slični kao u biljaka Ö karotenoidne pigmente koji apsorbiraju svjetlost i prenose na molekule bakterioklorofila radi fotosinteze Predstavnici: Ö Cijanobakterije i zelene biljke molekule vode koriste kao izvor elektrona i protona U tom procesu dolazi do povećavanja koncentracije molekularnog O2

2 H2O → 4 H+ + O2↑+4 e-

1

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

 Kemoautotrofi (nefotosintetski autotrofi) oksidiraju anorganske spojeve za dobivanje energije potrebne za vezanje CO2 kao izvora ugljika Ö Spojevi i ioni koji služe kao elektron-donori: H2, H2S, NH4+, NO2- i Fe-spojevi Ö Primjeri rodova bakterija uz odgovarajući elektrondonor: Beggiatoa – H2S Tiobacillus – S° Gallionella – Fe2+ Nitrosomonas – NH4+ Nitrobacter – NO2-

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

 Fotoheterotrofi (fotoorganotrofi): Ö Organski spojevi izvor ugljika a svjetlost kao izvor energije Ö U fotosintetskom procesu za dobivanje energije obvezno anaerobni uvjeti Ö Kada koriste organske molekule (alkohol, masne kiseline) za dobivanje elektrona, proces se odvija u mraku i u aerobnim uvjetima  Kemoheterotrofi (kemoorganotrofi): Ö Energiju i izvor ugljika dobivaju metabolizirajući brojne jednostavne organske spojeve Ö Najveći broj mikroorganizama pripada ovoj skupini

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fizikalni i kemijski zahtjevi za rast  Potrebe za O2 i CO2: O2 - primalac (akceptor) elektrona u staničnim kemijskim reakcijama (metabolizmu) CO2 - esencijalna hranjiva tvar (izvor ugljika) Ö Aerobni mikroorganizmi zahtijevaju O2, koliko ga ima u zraku Ö Mikroaerofilni mikroorganizmi također zahtijevaju O2, ali manju koncentraciju od one u zraku. Ako je O2 uklonjen, nastaje izravna potreba za CO2

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

ÖAnaerobni mikroorganizmi iako ne mogu koristiti O2, imaju određene stupnjeve tolerancije prema njemu Aerotolerantni - mogu rasti u prisustvu O2 ali on nije nužan za metabolizam Fakultativni - ne koriste O2, ali uz njegovu prisutnost bolje rastu npr. Escherichia coli Striktni (obvezatni) - ne toleriraju nikakvu količinu slobodnog O2

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Primjer: bakterijski rast u polučvrstom agaru s tioglikolnom kiselinom koja uklanja O2 u podlozi do 1/3 vrha epruvete

1

2

3

Osjetljivost striktnih anaeroba na slobodni O2 Â Osjetljivost povezana s tvorbom reaktivnog oblika kisika, superoksid O2-, jer jer iz njega može nastati H2O2 Â Zato neke bakterije sintetiziraju enzim katalazu, koji cijepa H2O2 kako slijedi: 2 H2O2 + katalaza → 2 H2O + O2↑ ÂTest katalaze: 3% H2O2, predmetnica, eza i čista kultura Negativno

4 H2O2

• Nakon inokulacije i inkubacije, način rasta u podlozi određuje potrebu za kisikom. Aerobi (1) rastu samo na vrhu, aerotolerantni (2) i fakultativni anaerobi (3) duž cijele epruvete a striktni anaerobi samo na dnu epruvete (4)

Mikrobiološka ušica

Pozitivno

Predmetnica →

2

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Temperaturni uvjeti  Mikroorganizmi u prirodi rastu pri temperaturi od -10 do +110 °C. Ö PSIHROFILI (0 - 20 °C) ili kriofili rastu u antarktičkom i arktičkom ledu, hladnjacima u kućanstvu te u većini tala i dubokim oceanima Ö MEZOFILI (20 - 45 °C) rastu u području tjelesne temperature čovjeka (neki uzročnici bolesti), tlima i vodi Ö TERMOFILI (45 - 90 °C) rastu aerobno i anaerobno u vulkanskim izvorima, tlima, vrućim izvorima, stajnjaku i kompostu

Rast pri različitim temperaturnim rasponima • Svaki mikroorganizam raste u određenom temperaturnom rasponu i pri tome postoji temperaturni minimum, optimum i maksimum rasta

90 70 55 °C

TERMOFILI

P

37

RAST

25 20

T

S

45

MEZOFILI

I

E

S R

Z

H

O

15

F

0

I L I PSIHROFILI

M

P

(o)

R M

O

O

F

F

I

I

L

L

I

(m)

E

(mx)

I

TEMPERATURNI MINIMUM (m), OPTIMUM (o) I MAKSIMUM (mx)

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Utjecaj pH vrijednosti Prebivališta na kopnu i u vodama razlikuju se u kiselosti i lužnatosti zbog prisutnih minerala i mikrobiološke aktivnosti Mikroorganizmi se dijele na neutrofilne (najveći broj bakterija), acidofilne (Thiobacillus thiooxidans pH između 2,0 i 3,5 ) i alkalofilne (Vibrio cholerae pH=9,0) Najveći broj gljiva – raste u slabo kiselom okolišu (pH 5-6) Svaka skupina posjeduje svoj minimum, optimum i maksimum pH-vrijednosti pri kojoj raste ekstremni acidofili

acidofili

neutrofili

alkalofili

ekstremni alkalofili

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

 Tijekom rasta mikroorganizmi stvaraju otpadne produkte metabolizma (kiseline, lužine)  U hranjive podloge se zato dodaju puferi, koji sprječavaju promjenu pH-vrijednosti ( npr. aminokiselina u peptonu djeluje kao pufer)  Za mjerenje koncentracije H+ iona u podlozi primjenjuju se različiti indikatori Npr: promjena boje (kiselo→lužnato) metilno crvenilo (pH 5 - 7) crveno do žuto bromtimol plavo (pH 7 - 9) žuto do plavo krezol crveno (pH 8 – 9) žuto do crveno

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Osmotski i hidrostatski tlak  OSMOTSKI TLAK – objašnjen kod građe prokariotskih stanica Čvrste stanične stijenke bakterija, gljiva, algi i biljaka štite stanicu u hipotoničnim uvjetima  HIDROSTATSKI TLAK - nastaje zbog težine tekućine (na svakih 10 m dubine tlak raste za 105 Pa odnosno za 1 atm) Hidrostatski tlak uobičajeno štetno djeluje na veliki broj enzima ⇒ BAROFILI - mikrooganizmi koji rastu pri višim tlakovima ⇒ BAROTOLERANTNI - Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

UZGOJ MIKROORGANIZAMA (XI)

3

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Uzgoj u laboratorijskim uvjetima  Hranjive podloge za uzgoj mikroorganizama:

Tekuće - hranjivi bujon i sladovina Čvrste - hranjivi agar i sladni agar  Tvari za skrutnjivanje hranjive podloge:

Agar – agar: nerazgradivi polisaharid (monomer galaktoza) iz tropske alge Gracilaria lichenoides Želatina – nekada ali se ustanovilo da ga mnogi mikroorganizmi razgrađuju Alginat i karageenan – želirajuće tvari iz staničnih stijenki smeđih odnosno crvenih morskih trava (za pripravu imobiliziranih stanica, aditivi - prehrambena farmaceutska i tekstilna industrija) Vodeno staklo – pri uzgoju kemoautotrofnih bakterija (npr. Nitrosomonas i Nitrobacter

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

 Posebne podloge (specijalne) služe za održavanje i prenošenje mikroorganizama te izolaciju čistih kultura 1. Za prenošenje čuvaju sve mikroorganizme u uzorku do dolaska u laboratorij - soli, puferi i siromašne na C i N 2. Za namnožavanje - hranjive tvari za veliki broj mikroorganizama, npr. različiti bujoni 3. Selektivne – npr. Mac Conkeyev agar i EMB agar, jer bojila u podlozi inhibiraju rast gram pozitivnih bakterija; Sabouraudov agar za izolaciju gljiva, jer sadrži veliku koncentraciju šećera; dodavanje antibiotika jer inhibira rast nepoželjnih mikroorganizama 4. Diferencijalne – selektivni indikatori npr fuksin u Endo agaru ili eozin metilensko modrilo u EMB agaru

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fosfor - sastavni dio ATP, teihoične kiseline, fosfolipida, DNK i RNK Izvori: anorganske soli KH2PO4, K2HPO4 Kalij - aktivator enzima za sintezu peptidne veze u sintezi proteina, koenzim enolaze Izvori: anorganske soli Sumpor - prisutan u cisteinu i metioninu. Bitan element za sintezu proteina, u metabolitskim putovima i izvor energije kod sumpor oksidirajućih bakterija Izvori: anorganske soli Magnezij - koenzim većine fosforilirajućih enzima. Održava strukturu ribosoma te stanične stijenke Gbakterija. Izvori: anorganske soli

Vrste podloga  Kemijski nedefinirane podloge: ⇒ sladovina iz proklijalog ječma ⇒ krumpirova podloga je filtrat od prokuhanog krumpira  Sintetičke ili kemijski definirane podloge: ⇒ sve specifične tvari i njihove koncentracije poznate(npr. glukoza izvor C i energije, soli, aminokiseline i vitamini)  Kompleksne podloge: ⇒ poznati kemijski sastav ali ne količinski sastav ( izvor ugljika i dušika iz kvasnog ekstrakta, ekstrakta govedine, peptona, hidrolizata proteina) ⇒ Najčešće služe za rast najvećeg broja mikroorganizama (hranjivi bujon, maltozni agar)

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Elementi bitni za rast mikroorganizama Elementi: C, H, O, N, P, K, S te Mg i Fe C, H, O i N - bitni elementi u svakoj aminokiselini i prema tome u proteinima Ugljik najvažniji strukturni element za sva živa bića Izvori: organski spojevi - ugljikohidrati, lipidi i proteini anorganski spojevi - CO2 Dušik je sastavni dio staničnih proteina, nukleinskih kiselina i vitamina Izvori: anorganske soli - NH4Cl organske tvari -peptoni, aminokiseline, kazein

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Željezo - ključni element u citokrom enzimima za transportni sustav elektrona aerobnih bakterija Izvori: anorganske soli

Elementi u tragovima Kobalt - sastojak vitamina B12 (cijanokobalamin) potreban pri fiksiranju dušika Mangan - vrlo često zamjenjuje Mg kao koenzim Natrij - sve morske bakterije i njihovi enzimi Molibden - bitan za fiksiranje N2 Kalcij - uklopljen u strukturu bakterijskih endospora u velikim količinama. Bitan je za njihovu otpornost na toplinu. Izvori: različite anorganske soli

4

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Aktivitet vode

Mikroorganizmima - uz izvor hranjivih tvari, potrebna voda za rast i razmnožavanje Aktivitet vode aw – pokazatelj količine vode kojom mikroorganizam raspolaže u metabolizmu. Dodatkom soli ili šećera smanjuje se aktivitet vode. Halotelerantni rastu pri nižem aw B. subtilis ; Halotolerantan Staphylococcus aureus Halofil Vibrio fischeri

R A S

Ekstremni halofil Halobacterium salinarum

T

Rast i razmnožavanje bakterija  Osnovni pojmovi: ⇒ Rast bakterija - podrazumijeva povećanje veličine stanice ⇒ Razmnožavanje - svaka stanica daje novu stanicu  Rast i mehanizmi razmnožavanja: ⇒ Aktinomicete - tvore dugačke vlaknaste stanice, koje se u procesu filamentacije cijepaju u žive fragmente. Svaki fragment može porasti i stvoriti novi filament. ⇒ Streptomicete - zrakaste bakterije razmnožavaju se pomoću konidiospora. ⇒ Većina bakterija – razmnožava se binarnim cijepanjem

Koncentracija NaCl

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Shematski prikaz binarnog cijepanja Štapić prije cijepanja

 Definicija generacijskog vremena: To je vrijeme potrebno za udvostručenje broja mikroorganizama u populaciji

Dijeljenje kromosoma, rast stanice u dužinu Kromosomi podijeljeni, potpuna dužina stanice Unutarnji razvoj stijenke Kompletirana stanična stijenka Odvajanje stanice kćeri

Dijeljenje kromosoma – snimak elektronskim mikroskopom

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

⇒ Neki primjeri: Escherichia coli u laboratorijskim (optimalnim) uvjetima ima generacijsko vrijeme manje od 30 min, a u probavnom traktu ono može biti dulje od 12 sati Mycobacterium tuberculosis u laboratorijskim uvjetima 12 sati, a za stvaranje vidljivih kolonija više od 6 tjedana

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Krivulja rasta bakterija  Svaka bakterijska stanica se u povoljnim uvjetima započinje razmnožavati

početne bakterijske stanice + hranjiva podloga → rast i stvaranje novih stanica

Prikaz općenite bakterijske krivulje rasta Logaritam broja stanica

 Vrijeme, oblik svakog dijela krivulje rasta i broj živih stanica ovisni su o vrsti bakterija i upotrijebljenoj hranjivoj podlozi Faze rasta: lag-faza log-faza stacionarna faza log-faza odumiranja

stacionarna faza

10

log-faza rasta 5

1

log-faza odumiranja

lag-faza 4

12

24

36

Vrijeme (sati)

5

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Generacijsko vrijeme

lag-faza:

bakterije sintetiziraju enzime, povećavaju dimenziju ali ne broj stanica log-faza: dijeljenje stanica i ubrzan rast (ireverzibilni), svaka stanica u novoj generaciji dijeli se isto, broj stanica povećava se geometrijski stacionarna faza: rast i ugibanje stanica podjednaki, odumrle stanice oslobađaju hranjive tvari za stanice koje dalje rastu i razmnožavaju se logaritamska faza odumiranja: a) nagomilavaju se toksični otpadni produkti b) smanjuje se koncentracija hranjivih tvari c) broj živih stanica smanjuje se geometrijski d) mrtve stanice bivaju lizirane s pomoću autolitičkih (samoprobavnih) enzima

Prosječna vrijednost vremena dijeljenje stanica može se prikazati matematički:

B = B ⋅2 k

Bk i Bp je konačni i početni broj živih bakterija u populaciji , a n broj generacija koji se određuje

n

p

t n= g

t = vrijeme uzgoja, g = generacijsko vrijeme

Kada se u jednadžbu umjesto n uvrsti t /g slijedi izraz: t/g B = B ⋅2 k

p

Logaritmiranjem gornjeg izraza dobiva se izraz za generacijsko vrijeme: t t ⋅ log 2 log B = log B + log 2 odosno g= g log B − log B k

p

k

p

Jedinica za generacijsko vrijeme = sati (h)

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

Određivanje rasta mikroorganizama  Poznato je nekoliko metoda: ⇒ Određivanje mase stanica – centrifugiranjem odvojiti biomasu od podloge, isprati, sušiti pri 70 °C/1-2 sata a onda pri 105 °C do konstantne mase ⇒ Turbidimetrija – određivanje rasta stanica mjerenjem zamućenja tekuće podloge spektrofotometrijski ⇒ Određivanje broja mikroorganizama • izravno brojanje mikroorganizama u Thomaovoj komorici u poznatom volumenu ili primjenom fluorescentne mikroskopije • posredno određivanje broja živih stanica na čvrstoj podlozi (CFU/ 1ml)

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

• • • • • • • •

Opišite koje se tvari mogu koristiti za skrutnjivanje hranjivih podloga. Navedite koje vrste podloga se mogu koristiti u mikrobiološkom laboratoriju Koji su elementi bitni za rast mikroorganizama i zašto. Objasnite utjecaj aktiviteta vode na rast mikroorganizama Objasnite i shematski prikažite binarno cijepanje bakterija. Objasnite krivulju rasta bakterija. Što je generacijsko vrijeme i kako se izračunava? Kako se u laboratorijskim uvjetima prati rast mikroorganizama.

Pitanja za ponavljanje

• • • • • • • •

Opišite podjelu i značajke mikroorganizama prema izvoru ugljika i energije. Opišite podjelu mikroorganizama prema temperaturnim uvjetima u okolišu. Opišite rast mikroorganizama vezanih uz potrebe za kisikom. Objasnite zašto su striktni anaerobi osjetljivi na slobodni kisik. Opišite postupak dokazivanja prisutnosti enzima katalaze u mikroorganizama. Opišite podjelu mikroorganizama prema temperaturnim uvjetima. Opišite podjelu mikroorganizama prema pH-vrijednosti okoliša. Objasnite utjecaj osmotskog i hidrostatskog tlaka na rast mikroorganizama.

Fakultet kemijskog inž inženjerstva Sveuč Sveučiliš ilište u Zagrebu i tehnologije

KRAJ PREDAVANJA I HVALA NA POZORNOSTI

6