Mikrobiologi Acara 4.pdf

ACARA IV : TEKNIK PRESERVASI KULTUR MIKROBA 1. Mengapa harus dilakukan preservasi dalam penelitian mikrobiologi ? Preservasi atau penyimpanan mikroba bertujuan untuk (1) mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dari mikroba hingga sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitasnya; (2) memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum. Beberapa teknik preservasi mikroba dan teknik preservasi yang telah digunakan dapat menentukan ketahanan hidup dan stabilitas ciri-ciri genetik mikroba (Machmud, 2001). Preservasi

mikroba

merupakan

suatu

teknik

penyimpanan

dan

 pemeliharaan koleksi atau plasma nutfah mikroba dalam jangka waktu tert entu. Hal tersebut bertujuan agar suatu saat mikroba diperlukan dapat dengan mudah diperoleh kembali dengan kondisi yang relatif stabil (Badjoeri, 2010). Berbagai

cara

penyimpanan

mikroorganisme

dilakukan

untuk

mendapatkan kultur murni dengan potensi yang stabil (Kusmiati, 2003). Semua metode pengawetan mempunyai prinsip kerja yang sama, yaitu memberikan penekanan (pengurangan) pada faktor-faktor yang menunjang kegiatan metabolisme mikroba sehingga kegiatan metabolisme mikroba terlambat atau terhenti untuk waktu tertentu (Sugiawan, 2000).

2. Mengapa digunakan Gliserol pada salah satu jenis teknis preservasi ? Gliserol dapat digunakan sebagai media karena gliserol dapat melindungi aktivitas antimikroba dengan cara meningkatkan stabilitas struktur protein asli dari mikroba sehingga dapat mencegah protein dari proses termal dan agregasi. Selain itu gliserol dapat meningkatkan energi bebas dari kompleks yang diaktifkan dan mengeser kesetimbangan energo tersebut. Gliserol ini dapat menyerap air pada permukaan protein yang dapat mengakibatkan hidrasi yang dapat melindungi protein dari kerusakan. Oleh karena itu giserol dapat memperpanjang penyimpanan mikroorganisme (Poedjiadi, 2006). Berbagai jenis bakteri dapat dibekukan langsung dalam medium tumbuhnya, tetapi penambahan senyawa krioprotektan seperti gliserol atau

dimethylsulfoxide (DMSO) dapat mengurangi dampak negatif ( stress) dari  pembekuan (Machmud, 2001). Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi viabilitas dan sta bilitas sel  bakteri

selama

proses

kriopreservasi.

Terjadinya

dehidrasi

dan

ketidakseimbangan osmotik dapat disebabkan oleh perubahan konsentrasi garam-garam dan metabolit lain. Terjadinya perubahan membran seluler bakteri  pada saat proses pendinginan melalui pembentukan kristal es yang besar dapat dicegah

dengan

menggunakan

bahan-bahan

krioprotektan

seperti

dimetilsulfoksida dan gliserol (Kusmiati, 2003).

3. Jelasakan juga karakteristik dari Gliserol ! Gliserol ialah suatu trihidroksi alkohol yang terdiri atas 3 atom karbon. Jadi tiap atom karbon mempunyai gugus  – OH. Satu molekul gliserol dapat mengikat satu, dua, tiga molekul asam lemak dalam bentuk ester, yang disebut monogliserida, digliserida dan trigliserida (Poedjiadi, 2006). Gliserol adalah sebuah komponen utama dari semua lemak dan minyak, dalam bentuk ester yang disebut gliserida. Molekul trigliserida terdiri dari satu molekul gliserol dikombinasikan dengan tiga molekul asam lemak. liserol (CH2OH.CHOH.CH2OH atau propana-1, 2, 3-triol), dalam bentuk murni, adalah,  bening, tidak berwarna, tidak berbau, cairan kental manis. Ini benar-benar larut dalam air dan alkohol, sedikit larut dalam banyak pelarut umum seperti eter dan dioksan, dan tidak larut dalam hidrokarbon. Pada suhu rendah, gliserol kadangkadang membentuk kristal yang cenderung meleleh pada 17,9 ° C. Gliserol cair mendidih pada 290 ° C di bawah tekanan atmosfer normal. Berat jenis 1.26 dan  berat molekul adalah 92,09. Gliserol tersebar luas di semua organisme hidup sebagai konstituen dari gliserida. Hal ini digunakan sebagai antibeku molekul oleh organisme tertentu (Kusmiati, 2003). Gliserol (1,2,3 propanatriol) merupakan cairan bening tidak berwarna yang memiliki kelarutan yang baik terhadap air.Gliserol dapat digunakan sebagai komponen formula CDS karena karakteristiknya yang dapat mengikat kandungan air pada udara (Bunyamin, 2011).

4. Jelaskan perbedaan preservasi jangka pendek dan jangka panjang, beserta kelebihan dan kekurangannya ! Preservasi jangka pendek dilakukan untuk keperluan rutin penelitian yang disesuaikan dengan kegiatan program atau proyek tertentu. Preservasi jangka  panjang dilakukan dalam kaitannya dengan koleksi dan konservasi plasma nutfah mikroba, sehingga apabila suatu saat diperlukan, dapat diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia. Dalam kaitannya dengan pemanfaatan koleksi mikroba. Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke media  baru. Kekurangan dari teknik ini yaitu memerlukan waktu dan tenaga yang  banyak. Kelebihan dari teknik preservasi jangka pendek hanya memerlukan  peralatan yang sederhana dan mudah diperoleh, sehingga dapat bermanfaat bagi lembaga yang belum memiliki peralatan canggih. Kelebihan preservasi jangka  panjang adalah mendapatkan bakteri yang stabil dalam waktu yang lama sehingga keberadaan bakteri tersebut terjaga, dan metode yang digunakan mudah. Kekurangannya adalah kontroling yang dilakukan dalam jangka waktu yang

lama

sehingga

dapat

terjadi

kegagalan

dalam

penyimpanan

(Machmud,2001). Preservasi jangka pendek dilakukan untuk keperluan rutin penelitian yang disesuaikan dengan kegiatan program atau proyek tertentu. Preservasi jangka  panjang dilakukan dalam kaitannya dengan koleksi dan konservasi plasma nutfah mikroba, sehingga apabila suatu saat diperlukan, dapat diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia (Sugiawan, 2000). Metode preservasi jangka pendek merupakan metode yang memungkinkan mikroorganisme

tetap

tumbuh,

atau

dengan

kata

lain

metabolisme

mikroorganisme tetap aktif (Utami, 2001).

5. Carilah 3 metode preservasi yang lain beserta metodenya ! 

Penyimpanan dalam akuades steril Menurut Machmud (2001), penyimpanan dengan cara ini juga memungkinkan terjadinya kontaminasi. Oleh karena itu, cara ini lebih dianjurkan sebagai alternatif penyimpanan jangka sedang atau sebagai

 pendamping penyimpanan jangka panjang. Tahap penyimpanan mikroba dalam akuades steril adalah sebagai berikut: a. Akuades steril disiapkan dalam botol dengan tutup berdrat ukuran 25 ml, 5-10 ml/botol atau dalam tabung ependorf.  b. Mikroba yang akan disimpan ditumbuhkan dalam bentuk biakan murni  pada medium agar miring yang sesuai. c. Biakan bakteri berumur 24-48 jam disimpan dengan beberapa cara seperti: 

menambahkan 3-5 ml akuades steril ke dalam biakan miri ng, mengocok tabung hingga diperoleh suspensi pekat bakteri (108-109 sel/ml), dan memindahkan 1 ml suspensi ke dalam tiap botol yang berisi air steril.



memindahkan satu ose biakan miring bakteri ke dalam tabung reaksi  berisi 3-5 ml akuades steril, tabung dikocok hingga suspensi merata, dan memindahkan 1 ml suspensi ke dalam tiap botol yang berisi air steril.



memindahkan satu ose biakan miring bakteri langsung ke dalam tiap  botol yang berisi air steril dan mengocok hingga merata.

d. Botol ditutup rapat dan disimpan pada suhu ruang atau suhu 10-15 oC. e. Uji viabilitas mikroba dan pemeliharaan stok isolat dilakukan secara rutin.



Penyimpanan dalam minyak mineral Menurut Machmud (2001), salah satu cara sederhana untuk memelihara  biakan bakteri, khamir dan jamur adalah dengan cara menyimpan dalam tabung agar miring dan menutup dengan minyak mineral atau parafin cair. Dasar teknik penyimpanan ini adalah mempertahankan viabilitas mikroba dengan mencegah pengeringan medium, sehingga waktu pere-majaan dapat diperpanjang hingga beberapa tahun. Cara penyimpanan dalam minyak mineral adalah sebagai berikut: a. Penyediaan tabung reaksi dengan tutup berdrat atau botol McCartney  berisi medium agar miring yang sesuai untuk mikroba yang akan dipelihara.  b. Penyediaan minyak mineral atau parafin cair steril, diautoklaf pada suhu 121oC selama 60 menit.

c. Menumbuhkan mikroba yang akan disimpan dalam tabung agar miring selama 24-48 jam dan memeriksa kemurnian biakan untuk menghindari kontaminasi. d. Setelah mikroba tumbuh baik parafin cair steril dimasukkan ke dalam  botol secukupnya, sehingga permukaan parafin atas berada 10-20 mm di atas permukaan medium agar. e. Botol biakan yang telah diberi parafin cair disimpan pada suhu ruang atau di kulkas. f. Uji viabilitas mikroba dan pemeliharaan isolat dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap tahun. g. Penumbuhan kembali (recovery) mikroba (bakteri, khamir) dilakukan dengan cara mengambil secara aseptik sebagian biakan dari tabung, memindahkan dan mensuspensikan pada medium cair. Minyak mineral mengapung di permukaan suspensi dan sebagian suspensi digoreskan pada medium agar yang sesuai. Biakan jamur digoreskan langsung pada medium agar.



Preservasi dalam tanah steril Menurut Machmud (2001), teknik ini mampu menyimpan mikroba selama 20 tahun atau lebih dengan biaya yang murah dan penyimpanan pada suhu ruang dan stabilitas genetik mikroba dapat dipertahankan. Cara  penyimpanan dalam tanah steril adalah sebagai berikut: a. Tanah yang agak liat diambil dan dihaluskan setra diayak sampai bersih,  partikelnya halus dan homogen.  b. Tanah yang sudah kering dan diayak, dimasukan kedalam tabung atau  botol dengan tutup berdrat ukuran 25 ml. c. Tabung yang berisi tanah dimasukan aquades steril hingga kebasahan 3050% kapasitas lapang, lalu ditutup. d. Tanah kemudian diautoklaf dengan suhu 121 oC tiga kali berturut-turut selama tiga hari masing-masing satu jam. e. Suspensi mikroba dibuat dalam larutan pepton steril 2% dalam aquades.

f. Sebanyak 0,1 ml suspense mikroba dimasukan kedalamm tabung berisi tanah steril. g. Tabung disimpan kembali dalam desikator atau diruang koleksi. h. Uji viabilitas dilakukan secara rutin minimal 1 tahun sekali.

6. Bagaimana cara mengetahui bahwa bakteri hasil preservasi kita memiliki kemampuan viabilitas yang baik ? Viabilitas suatu bakteri dapat dilihat ketika bakteri tersebut ditumbuhkan atau ditanam di media agar, bakteri t dapat tumbuh di media agar tersebut (Kusmiati, 2003). Dengan cara melakukan uji visiabilitas berkala dengan cara menumbuhkan  bakteri yang di preservasi. Pembiakkan bakteri tersebut dilakukan dengan cara menanamkan pada media agar kemudian diinkubasi 24-48 jam dan dilihat apakah bakteri dapat tumbuh atau tidak. Jika bakteri tersebut tumbuh maka kemampuan visiabilitasnya baik (Atlas, 1998). Isolat bakteri harus disimpan dengan baik dan aman serta dilakukan kontroling secara berkala. Viabilitas yang baik adala h bakteri dapat tumbuh dan memiliki karakter yang sama dengan ketika sebelum disimpan (Chotiah, 2007).

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan:

1. Laju aktivitas metabolisme mikroba dapat dihambat menggunakan metode preservasi dalam gliserol 15%, parafin cair, aquades steril, dan tanah

steril.

Preservasi

mikroba

adalah

upaya

penyimpanan

dan pemeliharaan mikroba dalam jangka waktu tertentu dan apabila suatu saat diperlukan dapat dengan mudah diperoleh kembali dengan kondisi yang relatif stabil. 2. Tujuan koleksi dan preservasi meliputi tujuan jangka pendek dan  jangka panjang. Isolat bakteri dapat memiliki daya tumbuh kembali dan kelangsungan hidup tinggi dengan perubahan karakter yang minimum jika dimasukkan kedalam cairan gliserol konsentrasi rendah (15%) untuk preservasi jangka pendek. Preservasi mikroba tujuan  jangka panjang dapat dilakukan dengan menggunakan minyak mineral atau parafin cair.

Saran: 

Praktikan telah mengetahui materi serta prosedur pelaksanaan praktikum.



Praktikan selalu memakai masker dan sarung tangan agar tidak terkontaminasi dengan bakteri.



Sebaiknya praktikan memperhatikan penjelasan asisten supaya lebih memahami proses kerja yang akan dilakukan

DAFTAR PUSTAKA Atlas, R. M. dan R. Barta. 1998. Microbial ecology: Fundamental and Aplications. Menlo Park: Benjamin/Summings Science Publishing. Badjoeri, M. 2010.  Preservasi Mikroba untuk Pelestarian dan Stabilitas  Palsma Nutfah. Puslit Limnologi. LIPI. Bunyamin, Anas. 2011.  Pemanfaatan Gliserol Hasil Samping Produksi Biodiesel  Jarak Pagar Sebagai Komponen Coal Dust Suppressant.  Bogor: IPB. Chotiah, Siti dan Lily Natalia. 2007. Viabilitas Clostridium sp. Setelah Konservasi  Eksitu dalam Jangka Waktu Lama pada Suhu Kamar . Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Kusmiati dan Priadi D. 2003. Kriopreservasi Bakteri Selulolitik Bacillus pumilus dengan Krioprotektan Berbeda. Cibinong. Bogor. Machmud, M. 2001. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba.   Buletin ArgoBio Vol.4. Poedjiadi, Anna. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press. Sugiawan, Wawan. 2000. Teknik Pengawetan Bakteri, Khamir, dan Kapang dengan

Metode

Pengering-Bekuan

(Freeze

Drying).

Temu

Teknis

Fungsional non Peneliti. Utami, T., Harmayani, E., Ngatirah., Rahayu. E. 2001.  Ketahanan dan Viabilitas Probiotik Bakteri Asam Laktat Selama Proses Pembuatan Kultur  Kering Dengan Metode Freeze dan Spay Drying . Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.

Nilai Akhir:............................................................................... Nama & Paraf Asisten: .... ........................................................