Microbiologie - Geni clostridium.bacillus.legionella

Curs XXIV. C/ostridium, Bacillus, Legionella

Genul C/ostridium Bacteriile din Genul Clostridium sunt bacili anaerobi, majoritatea majoritatea mobili, majoritatea producători de exotoxine

sporulaţi,

Bacterii anaerobe. Generalităţi şi precizări de termeni Bacteriile anaerobe stricte sunt bacterii hipersensibile faţă de oxigen, care NU SE POT MULTIPLICA ŞI NU POT TRĂI IN PREZENŢA AERULUI ATMOSFERIC. Cauzele acestui comportament sunt: 1. Absenta enzimelor care inactiveaza derivaţii toxici de oxigen: peroxidaza, catalaza, superoxiddismutaza (uneori au, dar in cantitati foarte mici) 2. Absenta oxidazelor, fără de care anaerobii nu pot incorpora oxigen molecular în citoplasmă 3. Absenţa citocromilor (sau prezenţa lor în cantităţi foarte mici) - ceea ce face ca transportul electronilor să nu se realizeze către oxigen, ca acceptor final de electroni, cu pierderea toxicităţii prin reducere la H20. În consecinţă, energia rezultă din reacţii de fermentare, cu acceptori finali de electroni diferiţi de oxigen. Aceşti acceptori sunt cel mai frecvent organici, dar pot fi şi anorganici, la bacteriile autotrofe. Capnofilia este proprietatea unor bacterii de a se dezvolta mai bine in prezenţa unor concentraţii de C02 superioare celei atmosferice. Mulţi anaerobi sunt capnofili. Microaerofilia este proprietatea unor bacterii de a se dezvolta mai bine in prezenţa unor concentratii de 02 mai mici de 21 %, cât este concentraţia 02 în aerul atmosferic. Aerotoleranţa este proprietatea unor bacterii anaerobe de a creşte în prezenţa a 21 % 02, dar fără a utiliza oxigenul. Unele dintre bacterii le clasificate ca anaerobe pot fi aerotolerante. Datorită caracterelor metabolice ŞI m special a relaţiei lor cu oxigenul, diagnosticul microbiologie al infecţiilor cu anaerobi prezintă o serie de particularităţi. • Anaerobii pot fi considerati o "lume paralela" fata de restul bacteriilor. Există bacili Gram + si Gram -, precum şi coci Gram + si Gram - anaerobi • Tehnicile de izolare, cultivare, testare a sensibilităţii la antibiotice sunt complexe si costisitoare • Succesul diagnosticului depinde de respectarea strictă a specificaţiilor tehnice care indică limitarea la minimum a contactului cu aerul atmosferic în fiecare fază a diagnosticului Este necesară aplicarea unor tehnici de bază care să asigure anaerobioza momentele diagnosticului de laborator: • •

Pentru recoltare şi transport Pentru culturi

1

În toate

• •

Daca este posibil, pentru manipulări Daca este posibil, pentru medii: • PRAS = Prereduced Anaerobically Sterilised • Medii prereduse prin fierbere şi alte proceduri de eliminare a oxigenului Pentru succesul izolării anaerobilor, există o serie de cerinţe care se aplică încă din momentul recoltării. Acestea sunt: • Asepsie pentru evitarea contaminării • Se prefera recoltarea cu seringa; se evita recoltarea cu tamponul, iar daca nu este posibil se prefera tampoanele cu alginat de calciu • Pentru hemocultură se utilizează un sistem Vacuteiner • Pentru boala periodontală se utilizează sisteme speciale de prelevare, care să asigure recoltarea din sacul periodontal, cu evitarea contaminării cu floră aerobă şi, în măsura posibilităţilor, evitarea sângerării • Reducerea la maximum a intervalului de contact cu oxigenul atmosferic • Utilizarea unui mediu de transport preredus • Utilizarea unor sisteme de transport în anaerobioză: jar anaerob, sac de plastic cu amestec reducător • În cazul în care nu sunt disponibile astfel de sisteme, se poate utiliza o seringă cu care se aspiră prelevatul, după care se elimină tot aerul şi se astupă orificiul senngn Realizarea anaerobiozei se face într-o incintă închisă, urmărindu-se obţinerea unei atmosfere total lipsită de oxigen, cu 4+5% H2. Se pot utiliza catalizatori care stimulează producerea de radicali de hidrogen reactivi , care vor fixa resturile de oxigen, cu formare de H20. Captarea apei se face cu hîrtie de filtru sau agenţi de deshidratare. Ca sursă de amestec gazos pot fi utilizate flacoane de gaz cu supapă de presiune. Compoziţia amestecului gazos în volume este H2 : C02 : N2 = 5 : 15 : 80 sau 5 : 10: 85. Pentru eficienţa izolării şi cultivării anaerobilor contactul mediu de cultură amestec gazos este absolut necesar. De aceea nu trebuie udate marginile cutiilor Petri, pentru că în acest fel accesul gazelor din incintă la mediul de cultură nu mai este posibil. Există cutii cu capace speciale, care facilitează contactul atmosferei din incinta anaerobă cu mediul de cultură. lncintele utilizate pentru realizarea anaerobiozei pot fi: hote, cutii ("jar"-uri), pungi sigilate etc. Există şi o precedură simplă de obţinere a anaerobiozei direct în placa Petri în care se face însămânţarea, cu ajutorul unui plic cu amestec reducător plasat în interiorul plăcii. Placa se etanşeizează cu ajutorul parafinei solide.

• • • •

Procedurile de izolare propriu-zisă trebuie să ţină seama de următoarele aspecte: Să se asigure condiţii stricte de anaerobioză Să se utilizeze medii adecvate, preferabil prereduse; cu suplimente şi selective în cazul izolarii din produse cu contaminare mixtă Să se demonstreze caracterul anaerob prin cultivarea în paralel pe medii aerobe. Dacă bacteria se dezvoltă şi pe mediile aerobe, atunci nu este anaerobă! Să se efectueze controlul purităţii culturii izolate.

2

Pentru • • •

identificare se aplică un algoritm etapizat, după cum urmează: Confirmarea caracterului anaerob Identificarea categoriei microscopice (bacil, coc etc. - uneori dificil); Diferenţiere în cadrul categoriei microscopice (ex. Clostridii Gram pozitive, Bacili Gram Negativi etc) Rezultatele identificării se comunica etapizat.

Prezentăm mai jos date sintetice privind caracterele generale şi diagnosticul microbiologie al infecţiilor cu Clostridii. . Cuvinte cheie: Bacili Gram pozitivi, anaerobi, majoritatea sporulaţi, majoritatea produc exotoxine, majoritatea mobili; tetanos, gangrenă gazoasă, botulism, enterocolită postantibiotice; metabolism activ, miros putrid, mediu Nagler - C. perfringens; mediu VF, mediu cu thioglicolat, lapte turnesolat; sensibilitate la beta lactamine, Vancomicina (c. difficile) 1.

Minidefiniţie

Genul Clostridium include bacili Gram pozitivi anaerobi, majoritatea sporulaţi, unii cu aspect microscopic caracteristic, majoritatea mobile (excepţie C. perfringens), majoritatea producători de exotoxine, care pot cauza afecţiuni de natură infecţioasă sau toxiinfecţioasă grave, cu aspect specific sau nespecific. II.

Încadrare taxonomică

Domeniu: Bacteria Phylum: Firmicutes Clasa: Clostridia Ordin: Clostridiales Familie: Clostridiaceae Gen: Clostridium III.

Habitat

Clostridiile pot popula orice nişă ecologică care intruneşte condiţii nutritive şi de anaerobioză: cavităţile naturale ale omului şi animalelor, unde se pot întâlni ca microorganisme comensale, care se elimină în mediul înconjurător, contaminând alimente (conserve în cutie, conserve obţinute în gospodărie ca de ex.: carne conservată în untură, legume şi fructe etc.), surse de apă, solul etc. În căile respiratorii superioare, vagin, unităţi pilosebacee pot fi reprezentaţi în proporţie de 10- 100: 1 faţă de aerobi, iar în colon, proporţia este de 1000: 1. În intestinul uman există peste 100 specii de Clostridium.

3

IV.

Implicare în patologia umană

Infecţiile cauzate de Clostridii pot îmbrăca următoarele aspecte clinice: - septicemia (postabortum, neoplasm digestiv, postinfecţie intestinală, de cauză necunoscută): e. perfringens, e. difficile, e. septicum - infecţie localizată închisă (gangrenă gazoasă, celulită, infecţie intestinală, enterocolita postantibiotice): e. perfringens, e. septicum, e. oedematiens A (C. novyi), e. histolyticum, e. sordeli, e. difficile - infecţie chirurgicală (grefe, proteze articulare etc.): e. perJringens etc. - infecţie localizată minimă după inţepatură, muscatură, injecţie: e. tetani, e. perfringens, e. botulinum etc. - toxiinfecţie alimentară: e. perfringens tip A enterotoxigen, e. botulinum (toxine botulinice tip A, B, F, E) Dintre infecţiile cu tablou clinic particular amintim: tetanosul, botulismul, şi gangrena gazoasă, (Fig. ] -3). Tetanosul şi botulismul sunt boli cauzate de toxina tetanică, respectiv toxinele botulinice (Vezi capitol toxine bacteriene). Toxina tetanică blochează eliberarea inhibitorilor neurotransmiţătorilor, la nivelul sinapsei, motiv Toxina botulinică, o neurotoxină considerată cea mai puternică otravă, dimpotrivă, blochează eliberarea neurotransmiţătorului acetil-colina, ceea ce determină imposibilitatea contracţiei şi paralizie musculară progresivă, cu pericolul stopului respirator. Clostridiile gangrenei gazoase se multiplică la locul de inoculare, cu producere masivă de gaz, fenomene locale de obstrucţie a vaselor sanguine (Fig. 4), producere de toxine, necroză locală, anemie hemolitică şi alterarea gravă a stării generale, cu deces în proporţie de până la 80% din cazuri, în caz că tratamentul este întârziat. Clostridium difficile este implicat în etiologia enterocolitei postantibiotice (Fig. 3). C. difficile se multiplică la nivelul mucoasei intestinale, cu apariţia de focare în submucoasă, sângerare, eliberare de enterotoxină şi toxine citopatice, alterarea stării generale. Această infecţie apare frecvent ca infecţie nosocomială, în legătură cu administrarea de antibiotice care distrug flora aerobă intestinală.

4

Fig. 1. a. Contractură musculară generalizată la un soldat cu tetanus: risus sardonicus b. Copil cu tetanos

Fig. 2. a. Botulism la gâşte; botulism la copil, prin colonizare digestivă

5

Fig. 3. Colită post-antibiotice cu C. difficile

Fig. 4. Gangrenă gazoasă

Enumerăm câteva aspecte clinice particulare, care pot sugera o infecţie cu anaerobi: • Prezenţa de gaz în ţesuturi, scurgeri fetide, sânge înnegrit (Fig. 4, 5) • Examen direct pe frotiu colorat gram cu morfologie caracteristică (ex. Clostridium tetani) • Fluorescenta rosie in UV a scurgerilor purulente

6

Fig. 5. Fasciită necrozantă la o pacientă cu neoplasm de colon - scurgeri fetide

V.

Microbiologie - principalele caractere şi implicaţii în patogeneza şi diagnosticul microbiologie

Clostridiile sunt bacili gram pozitivi, sporulaţi, strict anaerobi, majoritatea mobili (excepţie C. perjringens). Majoritatea au morfologie microscopică caracteristică: Clostridium tetani are aspect de băţ de tobă sau rachetă de tenis, datorită endosporului cu localizare terminală; Clostridium botulinum formează un endospor subterminal. Dezvoltă colonii translucide, beta-hemolitice pe mediu cu sânge, iar pe mediu cu gălbenuş de ou produce un precipitat datorită eliberării de lecitinază. Clostridium perfringens nu formează spori în culturi. Clostridiile sunt foarte active metabolic, cu producerea finală de acid butiric, acid acetic, butanol, acetonă şi compuşi urât mirositori din aminoacizi şi acizi graşi. Formează gaz în cantităţi mari, respectiv C02 şi H2, prin fermentarea zaharurilor. VI.

Factori de patogenitate

Clostridiile posedă o serie largă de factori de patogenitate, cum sunt: toxine (tetanică - tetanospasmina, neurotoxinele botulinice, enterotoxina perfringens, toxinele A - enterotoxina şi B - toxina citopatică ale C. difficile etc.), enzime (proteaze, lipaze, colagenaze, hialuronidaze, adezine, capsula). VII.

Patogenie

În prezenta unor factori favorizanti, care afecteaza schimburile de oxigen, cu scăderea potentialului electric tisular, bacteriile anaerobe provenite din mediul exterior sau din flora endogenă a pacientului se multiplică la nivelul nişei ecologice create în

7

organismul gazdei. Această nişă poate lua naştere în situaţii traumatice, în cursul unor boli metabolice cu hipoxie tisulară sau în situaţii care favorizează flora anaerobă prin presiunea selectivă a antibioticelor inactive pe germeni anaerobi. Dintre aceste posibilităţi enumerăm: • Plagă profundă sau evoluţie in situs anatomic în vecinatatea cavităţilor masiv colonizate cu anaerobi • Plăgi muşcate de om • Distrucţii tisulare: tumori, traumatisme, chirurgie complexă • Diabetlacidoza • Pneumonii de aspiratie; endocardite • Terapie cu antimicrobiene inactive pe anaerobi (Aminoglicozide, Quinolone, Sulfamide) Multiplicarea clostridiilor este însoţită de exprimarea factorilor de patogenitate somatici (adezine, capsula etc.) şi/sau eliberaţi în mediu (toxine, enzime). etc. VIII.

Răspunsul

imun

Trecerea naturală prin boală nu produce imunizare nici la o doză letală tetanospasmină sau toxină botulinică. Se pot produce îmbolnăviri repetate, mai ales cazul botulismului, în care nu se face imunizare datorită numărului redus de cazuri. Anticorpii protectori pot fi sintetizaţi faţă de antigene somatice şi/sau faţă antigene extracelulare: anatoxine, administrate profilactic. Pentru botulism există vaccin pentru cei care sunt expuşi profesional, dar nu se practică vaccinare în masă. IX.

Noţiuni de epidemiologie

de în de un

şi profilaxie a infecţiilor nosocomiale

Căile de contaminare cu anaerobi pot fi: digestivă, respiratorie, oculară (mai ales pentru C. botulinum), cutanată (C tetani, clostridiile gangrenei gazoase etc.) Costridium tetani se multiplică la poarta de intrare, unde poate ajunge în caz de contaminarea accidentală a plăgilor cu pamânt, contaminarea bontului ombilical etc. Prevenirea îmbolnăvirilor se face prin aplicarea protocolului corect de tratament în cazul plăgilor sau intervenţiilor cu risc crescut de îmbolnăvire de tetanus: excizie largă a zonelor cu distrugeri tisulare, toaleta corectă a plăgii cu apă oxigenată, rapel cu anatoxină în cazul scăderii titrului de anticorpi sub cel protector. Profilaxia prin imunizare se poate face activ, prin vaccinare cu anatoxină tetanică, care intră în componenţa trivaccinului DTP (Diftero-Tetano-Pertussis) şi DT. Vaccinul DTP conţine anatoxinele tetanică şi difterică şi corpi bacterieni inactivaţi de Bordetella pertussis. Imunizarea iniţială se face prin trei inoculări succesive la doua luni interval, după vârsta de două luni, apoi se fac rapeluri după un an şi la intrarea în şcoala elementară. Botulismul se poate manifesta în urma consumului de toxină eliberată în alimente contaminate cu C. botulinum, sau în urma multiplicării C. botulinum la nivelul intestinului, în special la copii mici, sau prin contaminarea plăgilor cu C. botulinum. În cazul botulismului se recomandă manipularea şi prepararea corectă a alimentelor. Fierberea in activează toxinele botulinice. Conservele bombate sau alimentele suspecte organoleptic nu trebuie consumate.

8

Terapia cu ser hiperimun trebuie făcută cât mai repde după expunerea la toxina botulincă, întrucât fixarea toxinei la terminaţiile nervoase este ireversibilă. Gangrena gazoasă poate să apară ca urmare a inoculării transcutane de Clostridii din pâmânt, praf etc. sau poate fi de origine endogenă. Terapia gangrenei gazoase se făcea clasic prin administrare de ser de cal hiperimun, dar terapia modernă apelează la terapia hiperbară, adică administrarea de aer îmbogăţit în oxigen pe mască, la marii traumatizaţi şi după intervenţii chirurgicale în zone intens colonizate cu anaerobi. X.

Diagnosticul de laborator:

Etapele schemei de diagnostic microbiologie sunt urmărite în cazul diagnosticului de laborator al infecţiilor cu Clostridii, cu aplicarea particularităţilor menţionate în capitolul introductivş în ceea ce priveşte recoltarea, transportul, examenul diorect şi însâmânţarea pe medii de cultură. La examenul direct, reţinem aspectele macroscopice caracteristice: necroză, miros de putrefacţie, singe lizat, cu culoare închisă, modificată. Pe frotiu se observă bacili Gram pozitivi, care în cultură veche de cel puţin 48 h apar sporulaţi terminal în cazul C. tetani, cu aspect caracteristic de băţ de tobă, Uneori poate prezenta spori subterminali şi C. botulinum, iar C. difficile prezintă spori centreli sau subterminali (Fig. 6, 7, 8). Însămânţarea se face obligatoriu pe medii prereduse pentru anaerobioză şi pe medii pentru cultivarea aerobilor. Dintre metodele speciale pentru distrugerea formelor vegetative si retinerea sporilor: se pot folosi încălzirea in baie de apa, timp de de 10 minute, la 80 o C, a produsului insamantat, adaugarea de volume egale de alcool etilic de 95 o, cu agitare etc. Dintre mediile pentru anaerobi sunt utilizate: bulionul VF (Viande-Foie = carneficat), bulionul pentru anaerobi cu thioglicolat ca agent reducător, mediile cu sânge selective, cu ados de antibiotice pentru inhibarea bacteriilor aerobe. Controlul păstrării potenţialului redox corespunzător se face cu diverse substanţe care îşi schimbă culoarea prin oxidare, cum sunt: albastrul de metilen, sau resazurina, care îţi modifică culoarea în albastru, respective roşu, în prezenţa oxigenului. Tuburile cu mediu lichid care se oxigenează la suprafaţă trebuie regenerate prin fierbere, pentru eliminarea oxigenului. Pentru evidenţierea C. perJringens se utilizează mediul Nagler, cu gălbenuş de ou. lncubarea mediilor însămânţate se face timp de 24 de ore, la 36 ± 10 C. Aspectele sugestive pentru o infecţie cu Clostridii sunt: • Absenta creşterii in aerobioză a unor microorganisme vizibile pe frotiu • Creşterea numai in zona anaerobă a unui mediu solid sau semisolid • Creşterea anaerobă pe medii selective cu Kanamicină sau neomicină 75-100 ug/rnl

9

Fig. 6. Clostridium tetani - Spori terminali, aspect în băţ de tobă

Fig. 7. Clostridium botu/inum - Spori subterminali

10

Fig. 8. Clostridium perfringens. Bacili Gram pozitivi, uneori in diplo, uneori dispuşi în litere majuscule sau mici palisade. Nu se observă spori

Fig. 9. Clostridium difficile. Spori centrali

Identificare Identificare morfologică: • Microsopică: Prezenta sporilor pe frotiu Gram din cultură veche de cel puţin 24 h. Stimularea sporulării se poate face prin cultivare pe mediu Nagler, iniţial la 36 ± lOC, apoi la temperatura camerei. • Macroscopică: - Aspect frecvent hemolitic pe medii cu sange (C perfringens - hemoliza dubla) - Fig. 10

11

- Aspect în umbrelă pe medii semisolide însămânţate la suprafaţă sau aspect pufos al coloniilor pe medii însămânţate în profunzime Fig. 10. Hemoliză dublă pe agar cu ados de sânge la C.

Identificare biochimică şi enzimatică Se efectuează o baterie largită de teste pentru cercetarea spectrului metabolic al clostridiilor, cum sunt: fermentarea zaharurilor, producerea de fosfolipaza-lipaza, degradarea aminoacizilor si proteinelor (ureaza, indoI, gelatinaza), degradarea laptelui turnesolat (proteoliza + fermentarea lactozei), reducerea nitratilor la nitriţi, catalaza etc. Clostridiile dezvoltă aspecte caracteristice după inoculare în lapte turnesolat, de exemplu C. perfringens formează un cheag alveolar. C. perfringens produce lecitinaze şi lipaze, care dau un aspect caracteristic de precipitat pe mediul Nagler, cu gălbenuş de ou. Testele de neutralizare a formării precipitatului prin ser antiperfringens confirma identitatea bacteriei. Teste de identificare rapidă - Pentru orientare se pot folosi galerii (kit-uri) de primă generaţie, cu incubare în anaerobioză sau de a doua generatie, cu incubare in aerobioză (4 h). - Gaz lichid cromatografia are ca principiu detectarea produşilor finali de metabolism, utilizând un detector de variaţie ionică. - Tehnicile moleculare nu necesita izolare si identificare prin tehnici clasice. Presupun utilizarea sondelor moleculare si amplificarea acizilor nucleici prin PCR • Dezavantajele tehnicilor rapide moleculare • Nu furnizeaza date privind viabilitatea

12

•

• Nu furnizeaza date privind expresia genelor detectate Importanta: • Orientare rapida a diagnosticului • Studii de taxonomie • Identificare gene de virulenta, rezistenta la antibiotice, toxine etc. • Studii epidemiologice • Studii ecologice

gene ce codifică

Testarea sensibilităţii la antibiotice Pentru Clostridii un este necesara efectuarea antibiogramei! Sunt în general sensibile la beta-Iactamine, Vancomicina (C. difficile). Teste speciale Aceste teste se efectuează doar în laboratoare de referinţă şi vizează punerea în evidenţă a toxinelor (tetanospasmina în culturi de Clostridium tetani pe şoarece; toxine botulinice în aliment, fecale, ser, medii de cultură - test pe şoarece sau prin tehnica ELISA, care permite şi titrarea toxinei), diagnosticul serologie la om (ex. ELISA), evidenţierea C. difficile în fecale etc.

Genul Bacillus 1.

Minidefinitie Genul Bacillus cuprinde bacili Gram pozitivi aerobi, care formează endospori.

II.

Incadrare taxonomică

Domeniu: Bacteria Phylum: Firmicutes Clasa: Bacilli Ordin: Bacillales Familie: Bacillaceae Gen: Bacillus Din anul 2004, taxonomia Genului Bacillus s-a diversificat, asfel incât o parte dintre specii au trecut familii şi genuri distincte. Principalele specii patogene pentru om sunt: B. anthracis, B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis s.a. III.

Habitat

Bacilii din Genul Bacillus se multiplică în intestinul bovideelor, ovideelor etc., de unde sunt eliminate pe sol. Aici sporulează, iar sporii din praf şi de pe sol sunt reingeraţi şi suferă din n ou un ciclu de multiplicare.

13

De pe sol şi din praf sporii pot ajunge în contact cu omul pe cale cutanată sau respiratorie şi/sau cu produse alimentare, de unde pot fi ingeraţi. IV. Implicare în patologia umană şi/sau importanţă în bacteriologia medicală: O B. anthracis este agentul etiologie al antraxului O Alte specii (ex.B.cereus, B. subtilis, B. licheniformis) pot cauza infecţii cu alte localizări: abcese, bacteriemie/septicemie, infecţii ale plăgii şi infecţii la arşi, infecţii otice, endocardite, meningite, infecţii oculare, osteomielită, peritonită, infecţii de tract respirator şi urinar. O B.stearothermophylus (din 2004 Geobacillus stearothermophilus) este utilizat pentru controlul biologic al sterilzării. O B. thuringiensis şi alte specii - sunt utilizate ca insecticide (ex. combaterea ţânţarilor) O Unele specii produc substanţe cu proprietăţi antibiotice: bacitracina, polimixina Antraxul O Forme clinice: • Antraxul cutanat (carbunele) - se manifestă cu escare cu edem, prin manipularea materialului infectat - peste 95% din cazuri; incubare 1-3 zile; stadiul initial - papula, stadiu tardiv - escara; edem intens in jur; istoric de expunere la animale sau la produsele lor (Fig. 1)

Fig. 1. Antrax cutanat

T.e. Dixon. et al. New England Journal of Medicine, 341: 815-826 (1999) • •

Antrax intestinal, prin ingestie de carne infectata Antrax pulmonar, prin inhalare de material infectat (praf cu spori)

14

o

Faze clinice: • Faza initiala: Simptome absente sau usoare: stare de rau, febra usoara simptome gastrointestinale in boala gastrointestinala • Faza de multiplicare - producere de toxina in gangionii regionali si splina, cu afectarea functiei gastrointestinale; Toxina eliberata cauzeaza insuficienta acestor organe, in special splenica • Insuficienta organica cauzeaza debutul brusc al bolii hiperacute cu: dispnee, cianoza, febra inalta, dezorientare, soc, coma si moarte in cateva ore. Faza este inalt bacteriemica, dar uneori la om hemocultura poate fi negativa

V.

Microbiologie - principalele diagnosticul microbiologie

caractere si implicatii in patogeneza

si

Bacteriile din Genul Bacillus sunt bacili Gram pozitivi, care pot deveni Gram in culturi imbatranite, de dimensiuni mari, mobili prin flageli peritrichi (B. anthracis imobil), sporulati, cu sau fara capsulă (B. anthracis are capsulă), aerobi, facultativ anaerobi, catalaza +, unele specii sunt hemolitice, activi pe diverse substraturi organice. Majoritatea speciilor sunt saprofite, formează endospori rezistenţi la condiţii ostile fizice şi chimice. Au proprietati fiziologice care le confera capacitatea de supravietuire in medii nefavorabile: nisipuri desertice, soluri arctice, ape dulci, sediment marin. Unele specii sunt termofile, altele sunt psichrofile, acidofile, alcalifile, halotolerante, şi halofile - gama larga de temperaturi, pH, concentratii de NaCI la care pot supravietui. negativi

VI.

Factori de patogenitate Principalii factori de patogenitate ai B. anthracis sunt: - Capsula polipeptidica (acid poliglutamic), care conferă protecţie antifagocitară - Toxina produsa in faza logaritmica de crestere, formată din 3 proteine: a. antigenul protector (PA), b. factorulletal (LF), c. factorul edematiant (EF) În cazul B. cereus, factorii de patogenitate cu importanţă în patogenia bolii sunt: - Proteina complexa care cauzeaza: • Necroza cutanata si a mucoasei intestinale • Acumulare de lichid in intestin (diaree in toxiinfectii alimentare severe) • Actiune toxica letala - Doua hemolisine: cereolisina - toxina necrotica si letala si o alta hemolizina cu mecanism putin cunoscut - Fosfolipaze - factor de exacerbare prin degradarea membranelor celulare VII.

Patogenie Etapele acţiunii toxinei B. anthracis sunt:

15

o

Activarea antigenului protector (PA) de catre proteazele gazdei aflate in sange si pe suprafata celulelor eucariote, prin taierea unui fragment si expunerea situsului de legare pentru factorul letal (LF) si factorul edematiant (EF) O Complexul PA + LF sau PA +EF este internalizat prin endocitoza O Factorul edematiant (EF) este responsabil de edemul caracteristic din antrax, fiind o adenilat ciclaza dependentă de calciu (Fig. 2)

Fig. 2. Mecanisme

patogenice

în antrax

Cutansoua

Pulrnonarv

1.0w-t'1!V'1!1 germ ination and growtl1 at onesite lead to local edema anei necrotic lesion.

Low-level germ ination at one site leeds te rnassjve effusicn,

Toxsrnla

111 ucosal

ederna, anei necrotic lesion. oW

Ederna toxin

Q

••

o

ATP

~~spore MaCrOPhage---~

rvlAPKKP or others) I

cArvlP

~,

Bacillus

Lethal toxin

~) .

l'

{'I

Bacterial vi rlilence"fac~4 c8pSllle-------j Exotoxins Othertacrors

TNF-a+interleukin-l{3

+othsr cytokines

~[+ k

~'l0G.··.

Regional Iymph node

.t

Death Regional hernorrhaqic .~ ".",

l.vrnphatic OI' hernatoqe nous Menlngitis spread

lvrnphadanltis

toxsmie

Septicemia.

Pulmonsrv lvmphatic blockage

;1:' ""=-.~

Pulrnonarv ederna

Shock Death

Efectele acţiunii factorului edemaţiant ./

Cresterea nivelului [cAMP]

./

Perturbarea ./

Death

Death

(adenilatciclaza):

functiilor celulelor imune efectoare

Perturbarea

fagocitozei

16

./ Perturbarea raspunsului chemotactic ./ Perturbarea producerii de citokine Factorulletal acţionează ca o kinază a MAP kinazelor din organismul gazdei. MAP kinaze = Mitogen Activated protein kinaze = protein-kinaze specifice care răspund la stimuli extracelulari (mitogeni, stress osmotic, şoc termic şi citokine proinflamatorii) şi reglează diferite activităţi celulare, cum sunt: expresia genelor, mitoza, diferenţierea celulară, proliferarea şi supravieţuirea celulelor/apoptoza. Toate aceste procese suferă dereglări cu consecinţe grave asupra funcţionării proceselor celulare normale. VIII.

Raspunsul imun

În antrax, pentru obţinerea imunităţii protectoare este necesară prezenţa anticorpilor impotriva componentelor toxice, in special a antigenul protector. Aceşti anticorpi pot fi obţinuţi prin administrarea de vaccinuri acelulare pentru om, respectiv vaccinuri cu spori vii pentru animale. Capsula poli-D-glutamica a B. antracis este slab imunogena. Anticorpii antipolizaharid si a altor componente ale peretelui celular nu sunt protectori Raspunsul imun in forma digestiva este putin cunoscut. Nu s-au dezvoltat vaccinuri, fiind forme rare IX.

• •

•

Notiuni de epidemiologie si profilaxie

Antraxul este cauzat de Bacillus anthracis. Modul de transmitere: contact direct cu ierbivore infectate sau prin produsele lor; animalele ierbivore, gazdele primare ale B. anthracis, contracteaza infectia prin ingestia sporilor de pe plantele furajere (Fig. 3); sporii provin din sol sau praf sau sunt depusi pe plante de insecte care au consumat carne dintr-o carcasa infectata Grupe la risc: persoane care vin in contact cu animale infectate sau cu produsele lor

17

Fig. 3. Ciclul natural al B. anthracis ~~-~~~~~~~

lvlultiplication of bacilU4

.

.

Germination

\.

t.~. :.'~.;.~.l .. e

"S-Layer

'Stres~, Jbtl,'Ii.;:I..!

(iOil

Q Q

O

{)

Spoees M. Mock, A. Fouet, Annu. Rev. Microbio: 55: 647-671 (2001)

•

•

X.

Episoadele de toxiinfectie cu B. cereus apar sporadic dupa ingestie de alimente contaminate in care bacteria se multiplica abundent in conditii de stocare incorecta a alimentelor Majoritatea apar ca infectii secundare sau mixte la indivizi imunodeficienti sau imunocompromisi (alcoolism, diabet), dar pot sa apara si la indivizi sanatosi Diagnosticul de laborator

Principalele prelevate sunt: secretii din leziuni cutanate, ganglioni regionali, sputa, materii fecale, alimente suspecte, LCR, probe necroptice, sange etc. Pentru creşterea şanselor de izolare se pot aplica tehnici asemănătoare cu cele de la clostridii, cum sunt Încălzirea sau tratamentul cu alcool de 95 o C.

o

Examen microscopic direct • Frotiuri din prelevate se colorează cu AM policrom (coloratie M'Fadyean): bacili caracteristici, Gram pozitivi, cu capetele taiate drept, de dimensiuni mari, (1-1,5 Jlm/3-10 urn), formand lanturi lungi; incepe procesul de sporogeneza (sporul este oval, situat central, mai mic decat grosimea bacilului respectiv) - Fig. 4

18

Fig. 4. Frotiu prelevat cobai decedat cu antrax, col. M'Fadyean albastru de metilen policrom) capsula ia culoare roz in jurul bacililor albastru inchis (C) Capete taiate drept.

o

Cultivare - teste de identificare: O Aspect colonii: • pe geloza -sange la 37 o C: colonii R, cenusii sau albe, nehemolitice, cu aspect de sticla pisata; cel putin 3 mm diametru, uneori aspect de coada, coama sau medusa (Fig. 5) • Medii selective (PLET = Polimixina, Lizozim, EDTA, acetat de Thaliu): colonii S, mici; tratare cu alcool sau tratare termica pentru separare din amestecuri O Aspect microscopic O Catalaza + O Sensibilitate la fagul gamma O Sensibilitate la Penicilina (desi au aparut si tulpini rezistente) O Patogenitate: Formarea capsulei - agar nutritiv cu bicarbonat de sodiu in mediu anaerob- coloratie AM policrom; patogenitate pe soarecele alb O Identificare biochimica: O Catalazo-pozitiv O Testullecitinazei pozitiv O Sensibil la penicilina ( R: B. cereus, B. subtilis) O Teste moleculare

19

Fig. 5. aspect de cometă al coloniilor de B. anthracis pe geloză-sânge

In Parker MT, Duerden BI (eds): Systematic Bacteriology. Topley and Wilson's Principles ofBacteriology, Virology and Immunity. VoI. 2. Edward Arnold, Sevenoaks, England, 1990, with permission.) Teste de patogenitate: in vitro (capsulogeneza) sau in vivo, pe soarece Testarea sensibilităţii la antibiotice: O De regula sensibil la Penicilina, Eritromicina, Tetraciclina O Nu se face antibiograma, de obicei O Pot sa apara forme rezistente la Penicilina la B. anthracis Diagnosticul retrospectiv al antraxului la animale se face prin reacţia Ascoli, care pune în evidenţă prezenţa antigenului extras din organe de animal decedat cu suspiciune de antraxcu ajutorul anticorpilor specifici din serul anticarbunos (vezi lucrări practice reacţia de precipăitare în inel)

Genul Listeria

1.

Minidefinitie

Bacteriile din Genul Listeria care pot deveni patogene pentru om fac parte din Grupul II de specii încadrate în Genul Listeria şi sunt cocobacili Gram-pozitivi. Listeria monocytogenes, specia tip, este facultativ intracelulară, cu dispoziţie în lanturi scurte. Difera de alti Gram pozitivi, deoarece contine o molecula chimic si biologic similara lipopolizaharidului clasic, lipopolizaharidullisterian. Este implicată în afecţiuni digestive uşoare sau în afecţiuni invazive la persoane cu imunitate scăzută. Cel mai afectat este embrionul sau fătul, în cazul în care gravida contractează boala în timpul sarcmu.

20

II.

Incadrare taxonomică

Domeniu: Bacteria Phylum: Firmicutes Clasa: Bacilli Ordin: Bacil/ales Familie: Listeriaceae Gen: Listeria Speciile care pot deveni patogene pentru om,încadrate în grupul II de specii care fac parte din Genul Listeria sunt: Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii, mai rar Listeria selingeri. III.

Habitat

L. monocytogenes este ubiquitara. Se poate izola din sol, vegetatie, apa, tractul gastrointestinal al animalelor. IV.

Implicare in patologia umana

Îmbolnăvirea se produce prin ingestia de alimente contaminateşi poate fi urmată de avort fără simptome de boală la gravidă sau boala la indivizi cu imunitate scăzută. Categoriile cele mai expuse la risc sunt: fatul, nou-nascutul, pacienti cu neoplazii, gazdele imunocompromise. Listerioza neonatala poate îmbrăca 2 forme: cu debut precoce = granulomatosus infantiseptica - abcese organice multiple, frecvent avort (transmitere transplacentara) cu debut tardiv (transmitere la nastere sau imediat dupa) - meningita sau meningoencefalita cu sepsis in 2-3 saptamani Boala la adult: simptome respiratorii pseudogripale si/sau tulburare gastrointestinala usoara. Frisoane si febra datorate bacteriemiei; la imunosupresati poate produce boala severa, (ex. meningita la pacienti cu cancer, transplant renal)

V.

Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si diagnosticul microbiologie

Cocobacili Gram pozitivi, facultativ anaerobi, mobili la temperatura camerei, formeaza colonii beta-hemolitice pe geloza-sange si colonii albastre-verzui translucide sau incolore pe medii solide fără sânge. Microorganismele se dezvoltă în condiţii optime la 30 o C, dar pot creste la 4°C, astfel că replica rea continua in alimentele aflate la frigider (psichrofilie). Izolarea in laborator poate utiliza o tehnica de imbogatire la rece.

21

VI.

Factori de patogenitate

Listeriolizina o are activitate de hemolizină şi facilitează supravieţuirea intrafagocitară aL. monocytogenes. Alţi factori de patogenitate sunt: proteina M Streptococcus-like, lecitinaza, fosfolipaza C. VII. Patogenie Dupa infectarea celulelor macrofage sau parenchimatoase, scapa din vacuole sau fagozomi (prin acţiune a Listeriolizinei O), si se divide rapid in citoplasma, dupa care capata o capsula formata din filamente scurte de actina. Aceste filamente se reorganizeaza sub forma unei cozi lungi, care se extinde dintr-unul din capetele bacteriei. Coada faciliteaza miscarea bacteriei prin citoplasma, la suprafata celulei. La periferia celulei se pot forma protruzii, care penetreaza celulele vecine si le invadeaza. Astfel microorganismele evita expunerea la agenti antibacterieni umorali (e.g. complement, anticorpi etc.). - Fig. 1 Sunt distruse de macrofagul activat.

VIII.

Raspunsul imun

Imunitatea este mediată cellular. IX.

Notiuni de epidemiologie si profilaxie

22

Boala se transmite prin alimente contaminate. Cele mai frecvente surse sunt: branza, varza, laptele, carnea. Listeria se multiplică şi în alimentele păstrate la frigider. Tratamentul si cotrolul îmbolnăvirii în caz de suspiciune de expunere la alimente contaminate se face cu beta+lactamine (ampicillină) în monoterapie sau în combinaţie cu gentamicina.

x.

Diagnosticul de laborator

Prelevatle pot fi: secretii faringiene, nazale, uneori produse recoltate din leziuni extrarespiratorii, sange si/sau LCR, lichid amniotic, placenta, tesut fetal, materii fecale, secretii genitale, alimente, probe din mediul extern Cea mai gravă formă de boală la adult este meningita. La examenul LCR se observă hematii şi monocitoză. La examenul direct din prelevate, pe frotiuri colorate: Gram şi AM se observă coco-bacili gram pozitivi, de dimensiuni mici, izolaţi sau în lanţuri scurte, intra şi extrace 1ular. Microorganismul se izolează uşor, pe medii uzuale, la temperatura optimă de 30 o C. Pentru produse contaminate se pot utiliza medii selective cu antibiotice (ac. nalidixic) sau îmbogăţirea la rece. Identificarea se face pe baza caracterelor morfotinctoriale, caracterelor de cultură (miros de lapte acidulat, colonii S cu aspect de picături de rouă, hemoliza pe agar-sânge, psichrofilie), precum şi pe baza caracterelor biochimice (test CAMP cu tulpină de S. aureus pentru 1. monocytogenes, catalază pozitiv, API-Listeria, API-Strep) şi antigenice (serotipare). Patogenitatea se poate determina in vivo pe iepure sau cobai (sac conjunctival), şoarece, ou embrionat. În scop epidemiologic se poate efectua tipizare bacteriofagică, moleculară. Antibiograma este indicată mai ales în infecţiile grave, invazive. Pentru meningite este necesară testarea prin metode de determinare a CMI.

23