Microbiologia Manual

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA Laboratorio de Ingeniería Ambiental

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

Miguel Ángel Rendón Sagardi Ingeniería Química

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

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MANUAL DE PRÁCTICAS ELABORADO Y REVISADO POR:

M.C. GUSTAVO ADOLFO MIRANDA ROSAS M.C. RAÚL PÉREZ ÁVILA

PERTENECIENTES AL DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA DEL INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA

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DATOS GENERALES

NOMBRE DE LA MATERIA: MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

SEMESTRE: SEXTO

NOMBRE DEL MAESTRO TITULAR: M.C. RAÚL RÉREZ ÁVILA

NOMBRE DEL ALUMNO: MIGUEL ÁNGEL RENDÓN SAGARDI

NO. DE CONTROL: 07010179

EQUIPO: 2

CALIFICACIÓN FINAL:

_____________________________________

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ÍNDICE DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

1. CONTINGENCIA AMBIETAL 2. MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO 3. MORFOLOGÍA COLONIAL Y TINCIÓN DE GRAM 4. MEDIOS DE CULTIVO 5. CULTIVO DE BACTERIAS Y DILUCIONES 6. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN 7. DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD DEL AGUA USANDO EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

8. AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR MÉTODOS DIRECTOS

9. CINÉTICA DE FERMENTACIÓN

10. FLUCTUACIÓN DE MICROORGANISMOS EN LA ATMÓSFERA

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7 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ASISTENCIA AL LABORATORIO

La asistencia al laboratorio será de acuerdo al horario y calendario de prácticas programadas. Se considerará retardo si el alumno se presenta a realizar su práctica de 10 a 15 minutos después de la hora establecida. Pasado ese tiempo no se admitirá a ningún alumno dándose por vista la práctica. No se podrá abandonar el laboratorio sin la autorización del maestro, mientras dure la práctica. Es obligatorio el uso de bata blanca en el laboratorio y los implementos necesarios de protección personal. Cuando por mala fe, negligencia o descuido, desperdicien sustancias, destruyan o maltraten material, instrumentos, equipo o instalaciones; los responsables deberán pagar por el daño ocasionado o reponer los aparatos o equipo dañado.

REPORTE DE PRÁCTICAS

Cada alumno debe tener una libreta (engrapada o cosida, no de espiral) tamaño esquela (de 10 por 15 cm.) en donde hará sus anotaciones personales de “recorrido de campo” y dentro del laboratorio. El recorrido de campo lo avalará el profesor que hizo el recorrido anotando fecha y firma. El alumno una vez concluidos los análisis de cada práctica anotará en la hoja del formato oficial, únicamente resultados y observaciones personales. Si el trabajo fue en equipo (o personal en equipo) se reportarán los resultados del equipo y cada uno anotará los resultados obtenidos personalmente.

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8 Al final del periodo el alumno entregará su libreta y sus hojas de reporte para evaluar su desempeño y acreditar la calificación del laboratorio que será reportada al maestro de teoría. La calificación del laboratorio se acreditará cuando el alumno no tenga adeudos de material, libros, revistas, tesis, reportes (de equipo y personales) Mantener limpia y ordenada El área de trabajo permanentemente. No arrojar residuos sólidos a los lavabos, tarjas o sumideros. Estrictamente prohibido ingerir alimentos dentro del laboratorio. No se permiten bromas, peleas o juegos, así como vocabulario soez dentro del laboratorio. Al o los alumnos que se les sorprenda realizando lo anterior se les retirará de la práctica y cuando el caso lo amerite podrá cancelarse su derecho de asistencia al laboratorio. Al terminar el experimento limpie muy bien el material del equipo y mesa de trabajo. Entregue al maestro las sustancias sobrantes, no las tire. Toda el agua que se genere al realizar la práctica será depositada en un lugar especial (cubeta de residuos) para su tratamiento y disposición final, así como los medios de cultivo. El alumno se enterará de los dispositivos de seguridad del laboratorio y en caso de contingencia dará la voz de aviso inmediatamente. En caso de siniestro siga las instrucciones del encargado del laboratorio, guarde la calma. Ayude a sus compañeros de ser necesario y siga la ruta de evacuación.

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PRÓLOGO

Integrar en un solo manual de prácticas de laboratorio los conocimientos básicos de la microbiología general y de la microbiología ambiental supone ser muy ambicioso, sin embargo, se ha querido dar al estudiante en éste manual de prácticas un compendio de instrucciones claras y precisas que le permitan introducirse en los aspectos completamente básicos de la microbiología, hasta la microbiología aplicada, con la finalidad de entender algunos procesos ambientales como las relaciones de los microorganismos con el ambiente en el que se desarrollan o la biodegradación de contaminantes. En particular, se pretende que quien termina este curso con éxito (teóricopráctico), tenga los elementos necesarios de los procedimientos y habilidades que les permitan manipular los materiales y microorganismos con rapidez, seguridad, precisión y limpieza. Todo esto, con objeto de poderlos encontrar, observar, describir, distinguir y caracterizar en su ambiente, con lo cual se estará en condiciones de controlarlos, estudiarlos y, hasta cierto punto, utilizarlos para un proceso de interés. Es importante tener en cuenta que dada la amplitud de actividades que se abarcan en algunas prácticas, no todos los ejercicios aquí planteados se pueden realizar dentro del tiempo normalmente disponible por sesión, es decir, algunos de los ejercicios requieren de más tiempo que el asignado en cada sesión. Por lo anterior, algunas experiencias se realizarán en tiempos extras y no necesariamente cuando lo indique el calendario. El orden en que se presentan las prácticas no necesariamente será el que se siga durante el desarrollo del curso. Los cultivos microbianos señalados en cada práctica pueden ser sustituidos según el criterio del profesor y la disponibilidad de las cepas que en algunos casos no es posible conservar y se deben obtener directamente del suelo, agua, clínicas u hospitales, instituciones de investigación, etc. De tal manera que muchos de los experimentos que se creen que se obtendrán resultados aparentemente obvios no necesariamente corresponderán con el resultado deseado. Se puede concluir de lo anterior que el trabajar con seres vivos, es trabajar con entidades variables. Al final se incluye un apéndice con algunas técnicas, fórmulas de algunos medios de cultivos, reactivos y colorantes empleados en las prácticas.

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10 REGLAMENTO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE INGENIERÍA AMBIENTAL

Tomando en consideración que se trabaja básicamente con microorganismos y estos pueden ser patógenos reconocidos o potenciales, se deberán seguir estrictamente las indicaciones de este reglamento. No se debe menospreciar el riesgo a la salud que representan muchas de las sustancias que se emplean ni las preocupaciones en el uso de mecheros de gas debiendo dar aviso de inmediato en el caso de fugas o derrames. 1. La hora de entrada debe cumplirse puntualmente. No se permitirá el acceso al laboratorio a quien llegue con retraso. 2. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. Solo podrá quitársela al salir de éste. 3. No se permitirá la entrada a personas ajenas al laboratorio. 4. Recogerse el cabello antes de entrar al laboratorio. 5. La puerta del laboratorio deberá mantenerse en lo posible siempre cerrada. 6. Limpiar la mesa de trabajo con una solución germicida antes de empezar y al terminar el trabajo. 7. Colocar todos los objetos personales en los lugares asignados para ello. Dejar fuera solamente el material que se va a utilizar. 8. Abstenerse de comer, fumar, beber, aplicarse maquillaje e introducirse objetos a la boca. 9. No se debe pasear entre las mesas de laboratorio. Si fuera posible, el trabajo debe realizarse sentado. 10. Hablar solo lo necesario. 11. Leer cuidadosamente el instructivo antes de empezar la práctica y seguir las instrucciones del profesor. Si no entiende, pregunte. 12. Informar al profesor sobre cualquier accidente que ocurra. 13. Depositar en los botes de basura todo el material de desecho no contaminado, como papel, algodón, cerillos, etc. 14. No debe lavarse material de ningún tipo durante la sesión práctica. 15. Al finalizar cada sesión, colocar el material debidamente separado en los lugares asignados para ello: material contaminado para esterilizar, sin etiquetas; material sucio para lavar; material para incubar; y reactivos debidamente cerrados y ordenados. 16. El material para incubar debe llevar la siguiente identificación: grupo, equipo, nombre del alumno, fecha y nombre del microorganismo o experimento. 17. Lavarse meticulosamente las manos antes de salir del laboratorio. 18. En caso de emergencia, inmediatamente cerrar la llave de gas ya apagar cualquier aparato con el que se esté trabajando. De manera ordenada y rápida salir del laboratorio. RECUERDE: NO CORRO, NO GRITO, NO EMPUJO.

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OBJETIVOS GENERALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

1. Aprender el vocabulario y los conceptos teóricos y experimentales que permitan conocer la naturaleza y diversidad de los microorganismos y el lugar que ocupan entre los seres vivos. 2. Reconocer las interrelaciones que se presentan entre los microorganismos y el ambiente. 3. Reconocer la importancia de los microorganismos como modelos de investigación científica. 4. Utilizar adecuadamente las técnicas microbiológicas que permitan manipular los microorganismos para su aislamiento, estudio de las características fisiológicas de cultivo, identificación y clasificación, selección, modificación, propagación, utilización y control. 5. Integrar las funciones generales de los microorganismos en los diferentes ecosistemas.

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Practica No. 1 Miguel Ángel Rendón Sagardi M.C. Raúl Pérez Ávila

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15 CONTINGENCIA AMBIETAL PRÁCTICA No. 1

FECHA DE REALIZACIÓN: 01 de septiembre de 2009

OBJETIVO: Contribuir a la instrumentación de una tarea eficiente y segura en el ámbito del Laboratorio de Microbiología Ambiental, mediante procedimientos que prevengan, protejan y/o eliminen los riesgos físicos, químicos y biológicos. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: RIESGOS QUIMICOS •

Todo producto químico es un contaminante tóxico potencial que puede comportar riesgos por sí mismo o producir reacciones más peligrosas en contacto con otros.

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Todos los docentes involucrados en el dictado de los trabajos prácticos de materias que utilicen productos químicos deben conocer sus propiedades físico-químicas, los efectos que producen sobre la salud y la forma de disminuir su incidencia nociva.

Envases •

Los reactivos deberán estar contenidos en recipientes de tamaño adecuado para facilitar su uso, evitar el trasvase y traslado de un lugar al otro del laboratorio. El envase deberá ser acorde al producto a contener y a las cantidades que se deben dispensar.

•

Deberá tenerse en cuenta el posible efecto corrosivo que las sustancias químicas y agentes físicos (temperatura, radiación solar) puedan tener sobre el material del envase. Los envases plásticos deben ser revisados con frecuencia.

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Los recipientes de pequeña capacidad que contengan sustancias corrosivas (ácidos y álcalis) deberán ubicarse separados entre sí y sobre bandejas de polietileno de alta densidad o policarbonato según su compatibilidad para retener derrames (rotura, volcado).

•

Los recipientes de vidrio se utilizarán sólo para guardar pequeñas cantidades de productos. Los envases de vidrio deben transportarse protegidos (ver transporte) y las botellas de dos litros deben disponer de un asa que facilite su manejo.

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Cada reactivo debe estar identificado correctamente mediante etiquetas normalizadas. Las sustancias químicas se catalogarán y reconocerán por medio de colores de acuerdo a su peligrosidad.

Desechos generados •

En el laboratorio debe existir un contenedor especial para vidrios rotos, material para adsorber derrames (tierra de diatomeas, arena, etc.) e implementos de limpieza para recolectar desperdicios en caso de rotura de material.

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Los residuos deberán ser separados y envasados en recipientes adecuados de vidrio, plástico o bolsas plásticas, perfectamente identificados y rotulados.

RIESGOS BIOLOGICOS Los agentes biológicos son todos aquellos microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos, susceptibles de originar algún tipo de infección, alergia o intoxicación, con lo cual todo material de origen biológico es un contaminante tóxico potencial que puede comportar riesgos por sí mismo. El laboratorio de Microbiología Ambiental se encuentra ligado a estos riesgos, y es por esto que: •

Todo el personal docente debe conocer el nivel de riesgo que implica la manipulación de microorganismos, vectores, hongos, parásitos, animales, sangre, suero, plasma, antisueros, etc. o cualquier agente modificado genéticamente o proveniente de seres vivos, así como las posibles rutas de penetración, infección o transmisión.

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El docente a cargo de los turnos de trabajos prácticos debe restringir el ingreso al laboratorio sólo a aquellas personas cuyas tareas lo justifiquen, quienes deberán estar informadas y capacitadas convenientemente.

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Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona de trabajo que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.

TRABAJOS PRÁCTICOS CON MATERIALES BIOLÓGICOS En la entrada de todos los laboratorios debe existir información sobre el nivel de seguridad con el que se trabaja. •

Nivel de Seguridad I: Agente no patógeno. Utilizable para prácticas microbiológicas estándar. Sólo este nivel de riesgo está permitido para los laboratorios de enseñanza de grado.

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•

Nivel de Seguridad II: Agente patógeno que puede provocar enfermedades en humanos o animales pero tiene pocas probabilidades de producir riesgo grave para el personal o su entorno. Riesgo individual moderado y comunitario limitado.

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Nivel de Seguridad III: Agente patógeno que suele ocasionar enfermedades humanas graves pero no se propaga de una persona a otra. Riesgo individual elevado o comunitario escaso (por ejemplo, aerosoles o transmisión por aire).

•

Nivel de Seguridad IV: Riesgo individual y comunitario elevados. Agentes patógenos que suelen ocasionar enfermedades graves o mortales y que puede propagarse fácilmente (epidemias).

En aquellos laboratorios en que se desarrollen actividades con microorganismos que no pertenezcan al Grupo I, se debe exponer en la puerta el símbolo de Riesgo Biológico durante el tiempo en que se realicen las tareas, informar la especie con la que se trabaja, el nombre y forma de ubicar al profesional responsable en caso de accidente y los requerimientos que deben cumplir las personas que ingresen al laboratorio. Las siguientes medidas de contención primaria son necesarias para prevenir el escape de agentes infecciosos en el ambiente del laboratorio y proteger a las personas. Barrera 1: está dispuesta alrededor del microorganismo e incluye las buenas prácticas microbiológicas, así como cualquier equipo diseñado para prevenir la diseminación de los agentes infectivos por aerosol o aire. Por ejemplo, para el Nivel de Seguridad I puede alcanzar con un mechero; para los otros niveles es necesario una cabina. Barrera 2: está dispuesta alrededor del trabajador e incluye ropa protectora (delantales, guantes, barbijos, zapatos cerrados, etc.) así como medidas de higiene y supervisión médica. •

El uso de máscaras protectoras para ojos, nariz o boca está recomendado para el manejo de microorganismos peligrosos o manipulaciones de otros agentes biológicos que puedan conducir a la formación de aerosoles y especialmente en caso de trabajar con hongos.

•

El derrame o caída de muestras contaminadas, diluciones y medios sembrados o inoculados será informada al docente de inmediato. Se procederá a tratar el área afectada con solución desinfectante que corresponda, la cual se dejará actuar y se recogerá con papel absorbente que será luego autoclavado. Se tomarán las precauciones debidas para cada desinfectante. Una vez limpia, la zona será tratada nuevamente con desinfectante.

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•

En caso de rotura del recipiente de vidrio que contiene microorganismos, proceder de igual forma pero no tocar los residuos antes de que el desinfectante hubiera actuado.

•

El almacenamiento de recipientes con cualquier material biológico debe efectuarse en cuartos, heladeras, congeladoras, etc., perfectamente identificados y etiquetados y bajo la responsabilidad del docente a cargo del laboratorio.

•

Los docentes deberán estar entrenados en el manejo correcto de cada instrumento: fuentes de poder, autoclaves, centrífugas refrigeradas, espectrofotómetros, estufas, microscopios, baños termostatizados, termocicladores, hornos de hibridación, etc.

•

El área de trabajo debe estar limpia, ordenada sin libros, abrigos o bolsas sobre las mesadas trabajo. a) Siempre desinfectar y ordenar la zona de trabajo antes de comenzar, al terminar o si se hace un intervalo.

•

Lavarse las manos meticulosamente cada vez que deje de trabajar y secarse con papel descartable.

•

Los jefes de trabajos prácticos y coordinadores deberán implementar que las manipulaciones más riesgosas, como el trasvasamiento de cultivos, sean realizados por los docentes en zonas aptas para esa tarea.

Tratamiento y disposición de los desechos generados •

Todos los cultivos se autoclavarán antes de su disposición final y los residuos generados se tratarán como residuos domiciliarios. Se tomarán los recaudos necesarios para que los recipientes individuales estén contenidos en otros de mayor capacidad para prevenir la diseminación de material orgánico dentro del autoclave en situaciones de daño o derrame.

•

En caso de trabajar con hongos toxicogénicos, los cultivos se inactivarán y se procederá como en el punto anterior.

•

Las pipetas usadas, portaobjetos y otros elementos abiertos deberán colocarse en un recipiente con solución desinfectante para su posterior descontaminación y lavado o descarte.

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Está terminantemente prohibido verter muestras o cultivos en las piletas.

•

Todos los elementos corto punzantes utilizados serán desechados en descartadores apropiados (recipientes rígidos que no permitan su apertura).

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No está permitido encapuchar las agujas antes de ser desechadas.

•

Los restos recipientes de vidrio rotos, una vez desinfectados, deberán ser envueltos en papel grueso, cuádruplo y colocado en caja de cartón, asegurándose de que no queden bordes y aristas potencialmente cortantes.

•

En el laboratorio debe existir un contenedor especial para vidrios rotos, material para recoger derrames (tierra de diatomeas, arena, etc.) e implementos de limpieza para recolectar desperdicios en caso de rotura de material.

BUENAS PRÁCTICAS •

Las buenas prácticas incluyen reglas, recomendaciones o prohibiciones relacionadas con el conocimiento, el sentido común y la solidaridad en el ambiente de trabajo.

•

No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio.

•

Se deberá usar vestimenta adecuada (guardapolvos que cubran la ropa de calle, preferentemente de algodón y mangas largas que no será utilizado fuera del laboratorio, zapatos cerrados).

•

No está permitido pipetear con la boca.

CONTINGENCIA O EMERGENCIAS •

Los planes de contingencia que permitan contener derrames o fugas, sismos, incendios, accidentes, deben ser conocidos por todo el personal docente, comunicados a los alumnos al inicio del ciclo lectivo y cumplido estrictamente.

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Los alumnos y docentes deben estar familiarizados con los elementos de seguridad disponibles, salidas, extintores, duchas, lavaojos; además de contar el equipo de protección personal.

•

El área de trabajo debe estar limpia y ordenada. No deben colocarse libros, abrigos o bolsas sobre las mesadas de trabajo.

•

Toda herida o abrasión, aún los pequeños cortes que puedan producirse durante el trabajo práctico deben ser informados obligatoriamente al docente.

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Practica No. 2 Miguel Ángel Rendón Sagardi M.C. Raúl Pérez Ávila

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23 MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO PRÁCTICA No. 2

FECHA DE REALIZACIÓN: 08 de septiembre de 2009

OBJETIVO: El alumno conocerá las partes del microscopio de campo luminoso, su funcionamiento y cuidados para conservarlo en las mejores condiciones de trabajo y así lograr buenas observaciones utilizando los diferentes objetivos. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: Una de las herramientas más útiles e importantes en microbiología es el microscopio. Todas las formas vivientes con las que se experimentan en Microbiología son prácticamente invisibles a simple vista y es esencial estar plenamente familiarizado con el Microscopio al empezar cualquier curso de Microbiología. Desde el punto de vista óptico, se reconocen dos tipos de microscopios: el que solamente usa una lente, también llamada lupa, que es el microscopio simple y el que se usa por lo menos dos lentes, microscopio compuesto, en el cual la imagen producida por la primera lente o sistema de lentes (objetivo) es ampliada por la segunda lente o sistema de lente (ocular) AUMENTO MAXIMO UTIL (x)

LIMITE DE RESOLUCIO N (nm)

APLICACIÓN EN MICROBIOLOGÍA

Campo luminoso

1500

100-200

Muy usado con objetos teñidos.

Campo oscuro

1500

100-200

Ultravioleta

2500

100

Fluorescencia

1500

100-200

Contraste de fases

1500

100-200

Con focal

1500

100-200

Barrido

15000-100000

1 a 10

Transmisión

6000-400000

1

1000000100000000