Microbiologia Lab Nº4

FACULTADTítulo: DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICAS

“MÉTODOS DE COLORACIÓN”

Asignatura: Microbiología Docente responsable: Jacinto Hervias, Pedro Grupo de laboratorio: G1 Integrantes:       

Ajahuana Villafan, Teresa Mónica Cruzat Campos, Alexandra Echeverría Vega, Patricia Huaman Pashanasi, Gisela Quintana Blas, Paola Silva Villacrez, Jhuliana Vargas Huyhua, Milagro

Semestre académico: 2015 – 2 Ciclo académico: VIII

LIMA –PERÚ 2015

INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa En el presente informe se desarrollarán los métodos de coloración, así como la tinción ácido resistente dándose a conocer los resultados obtenidos en la práctica.

I.

COMPETENCIAS  

II.

Realizar manualmente métodos de tinción habituales usados en la preparación de láminas de observación Describir minuciosamente sus observaciones, al microscopio

MARCO TEORICO TINCIONES UTILIZADAS EN MICROBIOLOGIA Técnicas de tinción. Fundamentos El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructúrales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. Tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que es realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la

fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de ta1 modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. EI azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas. Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Examen microscópico de las muestras clínicas. Sin tinción No se utiliza ningún tipo de colorante. Es el montaje directo húmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observación. El material que es demasiado espeso para permitir la

diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solución salina fisiológica estéril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parásitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc.

Examen microscópico Tinción simple Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

Examen microscópico de las muestras clínicas muy modificadas. Tinción diferencial Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. Los ejemplos clásicos serían la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen. Examen de muestras al microscopio: la tinción GRAM La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM

Descrita en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y gramnegativos (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las Gram positivas como las gramnegativos, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram positivas como las gramnegativos se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcoholacetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.

Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gramnegativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células Gram positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células Gram positivas son todavía azules, pero las gramnegativos son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativos se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativos son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células. 2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células Gram positivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos más viejo de 24 horas puede perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta-yodo. El carácter de Gram positivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos son más Gram positivos que otros y algunos son Gramvariables, es decir, unas veces Gram positivos y otras gramnegativos.

Otras tinciones de uso habitual RODAMINA-AURAMINA Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las mico bacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes. Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el

aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica.

NARANJA DE ACRIDINA El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos.

ZIEHL-NEELSEN (BAAR) Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias. Contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácidoalcohol resistente. Las micro bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de ZiehlNeelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Se ha desarrollado una coloración de ácidoalcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son

decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles. El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

BLANCO DE CALCOFLÚOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calco flúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos florecen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice.

III.

METODO EXPERIMENTAL a) COLORACION SIMPLE 1. .Se tomó una pequeña cantidad de la placa que contenía la siembra de Streptococcus agalactiae con el asa de siembra y la esparcimos en el porta objeto (limpio y desinfectado) agregando una gota de agua destilada.

2. Fijamos al calor la porta-objeto, a través del mechero.

3. Cubrimos el porta objeto correctamente seco con azul de metileno y dejamos actuar por 3 minutos.

4. Lavamos con agua a chorro lento, retirando la mayor cantidad de coloración azul posible y dejamos secar.

5. Observamos al microscopio .

b) COLORACION GRAM

1. Se utilizó como cultivo Shigella fexneri 2. Se tomo una pequeña cantidad de la placa que contenía la siembra de con la asa de siembra y la esparcimos en porta objeto (limpio y desinfectado) agregando una gota de agua destilada .

shigella fexneri

3. .Fijamos al calor el porta-objeto , a través del mechero .

4. Cubrimos el frotis con reactivo de cristal violeta durante un minuto y luego lo lavamos agua lentamente.

5. Cubrimos el frotis con solución de lugol y lo dejamos durante 2 minutos.

6. Lavamos con agua corriente, y aplicamos lentamente el alcoholacetona.

7. Volvemos lavar el frotis y agregamos fuscina fenicada .

8. Lavamos con agua corriente y dejamos secar, para luego observarlo en el microscopio .

c) COLORACION ACIDO RESISTENTE

a) Se utilizo como cultivo Enterobacter cloacas b) Se tomo una pequeña cantidad de la placa que contenía la siembra de con la asa de siembra y la esparcimos en porta objeto (limpio y desinfectado) agregando fucsina fenicada al 5% y dejamos reposar 60 segundos antes de calentarlo.

c) Calentamos la preparación con suavidad en el mechero de alcohol por debajo del portaobjeto, haciendo que se desprendan algunos vapores y evitando que la fucsina hierva , esto se repitió por 2 veces.

d) Enfríamos el porta-objeto con la muestra y lavamos con agua corriente .Decoloramos con alcohol – ácido hasta que no arrastre colorante.

e) Procedemos a cubrir el porta objeto con azul de metileno por 1 minuto .

6. Lavamos con agua corriente el porta objeto y lo demos secar para observarlo en el microscopio.

d) COLORACION NEGATIVA 1. Colocamos varias asadas de cultivo en un porta objeto limpio, cerca de uno de los bordes , el cultivo utilizado fue Escherichia coli .

2. Colocamos un volumen igual de tinta china cerca del cultivo y los mezclamos con el cultivo hasta esparcirlo hasta todo el porta objeto .

3. Dejamos secar el frotis. Y cubrimos con fucsina fenicada durante 10 segundos, enjuagamos con agua y luego lo dejamos secar, Procedemos a observarlo en el microscopio .

IV.

RESULTADOS Y DISCUSION

MÉTODOS DE COLORACIÓN

microorganismo

Coloración simple

Método de coloracion Coloracion de la Coloración Gram acido resistente Gram Gram -

Coloración de esporas

Coloración negativa:

tinción especial o de ZiehlNeelsen (B AAR)

+

Estreptococcus agalacteae Shigella fexneri Enterobacter cloacae ~ Escherichia coli

+++

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~

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~ ~

~ ~

++ ~

~ --

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~ ~

~ ~

~ ~

~ ~

~ +++

De que manera lo identifico Se mostró una coloración del azul metileno identificando al microorganismo .

microscopio:+++

No se presento: --No se realizo:~ Muestra encontradas 1. PRIMER Estreptococcus



en

MICROORGANISMO: agalacteae

Durante un tiempo determinado y luego se lava y acontinuacion el portaobjetos se seca y se examina , en algunos caso se hace uso de un mordiente para auentar la afinidad de la muestra biologica por un colorante otra es cubrir una estructura (como un flagelo) para darle mayor espesor y facilitar la observacion despues del teñido. El colorante se aplica extendidamente una de las funciones de una mordiente es aumentar la afinidad de la muestra biológica por u colorante , cubrir otra estructura.(flagelo)para darle mayor espsor y fragilidad a la observación después del teñido.



Tiñe membrana citoplasma de la bacteria encontrado en Introducción a la microbiología escrita por Gerard J. Tortora, Berdell R.

2. SEGUNDO spp fexneri

De que identifico

manera

lo

MICROORGANISMO: Shigella

Se observo una tinción rojiza esto se debe por el colorante usado como contrastador. encontrando Gram negativas



Las bacterias Gram-negativas tienen una bicapa lipídica gruesa en la parte exterior, que es selectivamente permeable, no todo puede pasan a través de ella, y una de esas cosas es la tinción de Gram. encontrado en Microbiología clínica práctica escrita por Pedro García Martos

3. TERCER MICROORGANISMO: Enterobacter cloacae

De que manera lo identifico No se pudo identificar zonas coloradas esto se debe a que el microorganismo no es acido resistente por ello se vio de color azul



la propiedad de la acido alcohol resistencia no se conoce a fondo pero se sabe que solo las celulas intactas con alto contenido lipídico poseen este carácter , dependiente dela mayor solubilidad del colorante fenicado en los lípidos celulares que en decolorante son las micobacterias BAAR por excelencia principalmente su contenido





fosfolipidico abarca 40% de peso secototal, en la fraccion insaponificable se encuentran sustancias de elevado peso molecular como el acido micolico que es el responsable del acido alcohol resistencia encontrado en Introducción a la microbiología escrita por Gerard J. Tortora, Berdell R. Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcoholácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de De que manera lo las moléculas del colorante lo cual también identifico presento facilita su entrada a las bacterias. Las Se la bacterias que resisten la decoloración son de rápidamente coloración azul de la color rojo y las que no, se ven de color azul china en ya que se utiliza azul de metileno como tinta tinción de contraste.encontrado en microorganismo como Microbiología clínica práctica Escrita por una zona transparente Pedro García Martos que rodea a la pared 4. CUARTO MICROORGANISMO: se realizo

no

5. QUINTO MICROORGANISMO: Echericha coli

V.

CONCLUSIONES   









VI.

En la práctica se analizó en base a la teoría las distintos métodos de coloración y se realizó su respectivo ensayo El microorganismo Estreptococcus agalacteae se puso analizar con rapidez en el microscopio sin necesidad de ningún mordiente Mediante el análisis del método de coloración Gram se pudo determinar que el microorganismo o inoculo era un Gram negativo debido a su descoloración El microorganismo usado fue el Shigella fexneri este se pudo observarlo al llevarlo al microscopio su color rojiza característica principal de la GRAM negativa Los microorganismo acido resistentes mediante la práctica se pudo determinar que estos poseen un gran contenido fosfolipidico que hace que pesar de un descolorante permanezcan del color de su colorante. En caso del Enterobacter cloacae no es acido resistente debido a que este cambio a color azul .si hubiese sido acido resistente seria de color rojizo En caso del Echericha coli se observó una zona transparente que rodea a la pared permitiendo determinar la ubicación dela cápsula bacteriana.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué importancia tiene la pared celular bacteriana en la coloración de Gram? La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado, ya que permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. 2. ¿Cuáles son las diferencias químicas importantes que explican el estado ácido-resistente? La Resistencia acido- alcohol tiene capacidad de incorporar ciertos colorantes y retenerlos después de someterlos a la acción de ácidos y alcoholes y está determinada por la presencia en la pared celular de los

ácidos micólicos que son ácidos grasos de cadenas ramificadas de alto peso molecular (60 a 70 átomos de carbono). Las micobacterias son bacilos ácido-alcohol resistente, corto, ligeramente curvo. El género Mycobacterium, incluido en esta clasificación, comprende especies patógenas para el hombre, animales y especies saprófitas. El grado de “ácido-alcohol resistencia” es variable entre las especies de este género y está relacionado muchas veces con las condiciones culturales, no pudiendo utilizarse esta diferencia para distinguirlos entre sí. Los bacilos “ácidoalcohol resistentes” (BAAR) se observan de color rojo al ser coloreados con los colorantes para Ziehl Neelsen, mientras que otros gérmenes y células toman distintos tonos de azul debido al azul de metileno que se utiliza como colorante de contraste. La coloración de Ziehl Neelsen constituye una técnica sencilla rápida y económica, de baja sensibilidad.

VII.

REFERENCIAS

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MICROBIOLOGÍA CLÍNICA MEDIOS DE CULTIVO (CURSO 2012-2013) (GRUPOS 1 y 2) universidad 5,7,8 Microbiología Médica + StudentConsult, 6a ed., Patrick R. Murray ,edición 2 , 2009,, 68 .89 Centro Nacional deBiopreparados. La Habana, Cuba, Enterococcus, medios de cultivo convencionales y cromogénicos ,MSc. Marilyn Díaz Pérez, Dr. C. Claudio Rodríguez Martínez, Dra. C. RaisaZhurbenko, Cruickshank, R. Medical Microbiology, 11th ed., London: Livingstone LTD, 1968, p.268. - MacFaddin. 1985. Media forisolation-cultivation-identificationmaintenance of medical bacteria, volume 1. Williams &Wilkins, Baltimore, Md. - Grasmick. 1992. In Isenberg (ed.), Clinicalmicrobiologyprocedureshandbook, vol. 1. American SocietyforMicrobiology, Washington, D.C. Rojas N, Chaves E, García F (2006) Bacteriología Diagnóstica, Costa Rica, Universidad de Costa Rica, Facultad de Microbiología. García R, Córdoba R, (1988) Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria.