Microbiologia Industrial

 

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

 

Índice •

Introducción 1

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Introducción 2

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La producción de vino como modelo de un proceso de fermentación industrial o

Presentación

o

Hongos y las levaduras

o

Crecimiento de microorganismos

o

Factores ambientales que afectan al crecimiento: temperatura

o

T

o

o

R  Activida ctividad d de agua

o

 pH  pH 

o

 Potencial redox y concentración de oxígeno  oxígeno 

o

R adiación

o

Presión hidros hidrostática tática

o

 Control de microorganismos  microorganismos 

o

Metabolismo microbiano: introducción introducción  

o

Catabo atabolismo lismo d dee la gluc glucosa osa

o

Respirac espiración ión y fe ferment rmentación ación

o

Expresión de la información genética

•

Tratamiento de Residuos sólidos urbanos

•

Tratamiento de aguas residuales

 

Introducción a la Microbiología Ambiental 1.- Introducción. A la hora de desarrollar un proceso industrial destinado a la producción de un metabolito secundario o de una enzima de origen microbiano, hay que considerar varios aspectos: (1º) el aislam ais lamien iento to del mi microo croorgan rganism ismos os de interé interés, s, la detecc detección ión de los metabol metabolit itos os secunda secundario rioss deseados y la conservación del microorganismo aislado para la producción industrial estable, (2º) el diseño del proceso de fermentación, fermentación, y (3º) la mejora de las cepas aisladas para increment incrementar ar el rendimiento. Todos los organismos producen metabolitos primarios (aquellos que intervienen en las rutas centrales centra les del metab metabolismo olismo y que son esenciales para la supervi supervivencia vencia y, en general, general, idénticos idénticos en todo tipo de organismos) y secundarios. Estos últimos son específicos de cada tipo de organismo y están involucrados en el establecimiento de las relaciones ecológicas del organismo productor.

2.- Aislamiento y manipulación de cultivos de interés. 2.1.- Aislamiento de cultivos El primer paso en el proceso industrial es el aislamiento de un microorganismo que produzca un metabolito secundario con interés industrial. La tarea de aislamiento de microorganismos hay que plantearla considerando las características del producto y del proceso que se va a realizar y las características ecológicas de la muestra que se toma. Lo primero nos indicará dónde tomar las muestras y lo segundo cómo diseñar los medios de aislamiento para los microorganismos  presentes en dichas muestras. El estudio ecológico de las características del microorganismo de interés permitirá hacer una  búsqueda sistemática en los diferentes nichos de un ecosistema, lo que proporcionará un gran número de microorganismos de salida para el proceso de detección. Un esquema de de estudio previo a la toma de amuestras comprendería siguientes  pasos: (1º) lista gruposecológico de microorganismos que van ser aislados (los medioslos y técnicas de cultivo son diferentes para bacterias y hongos, por ejemplo); (2º) descripción del ecosistema o hábitat en el que se van a tomar las muestras, (3º) agrupac agrupación ión de las muestras según el material material de origen (suelo y horizontes del suelo, agua, material vegetal, etc.); (4º) lista de los parámetros ambientales a considerar (pH, salinidad, potencial redox, temperatura, etc.); (5º) lista de los substratos naturales disponibles por los microorganismos autóctonos en su ambiente natural, (6º) diseño de las técnicas de aislamiento usando la información de los puntos anteriores, (7º) evalua eva luació ciónn de las técnic técnicas as de ais aislam lamien iento to usando usando patrone patroness interno internoss como como contro control, l, y (9º) utilización de procedimientos de enriquecimiento para los microorganismos que puedan ser de interés. 1.2.- Detección de metabolitos secundarios:

 

Una vez recogidas las muestras hay que desarrollar el procedimiento de búsqueda y detección (screening en inglés) del metabolito secundario de interés. Históricamente la búsqueda se ha dirigido hacia la producción de antibióticos; pero actualmente se ha ampliado el campo a otros  productos terapéuticos y, en general, puede desarrollarse cualquier búsqueda para la que se disponga de un sistema de detección suficientemente correcto. En cualquier caso, haz que considerar dos cualidades importantes a la hora de diseñar un proceso de detección: (1º) la selectividad: se ha de poder detectar un compuesto de interés mezclado con un número muy elevado de compuestos que no son interesantes; y, (2º), la sensibilidad: la concentración del metabolito secundario de interés puede ser extremadamente baja. La búsqueda puede hacerse en cultivos sólidos o en cultivos líquidos. Sin embargo, puesto que la  producción ha de realizarse en cultivos líquidos y puesto que los metabolitos secundarios de cultivos sólidos son diferentes de los de cultivos líquidos, es conveniente realizar la detección, siempre que sea posible, en medios de cultivo líquido. Las pruebas de actividad se pueden realzar sobre diferentes tipos de organismos (animales vivos,  plantas, bacterias, hongos), sobre cultivos celulares o sobre preparaciones subcelulares. Para cada tipo de búsqueda hay que diseñar un procedimiento de detección adecuado. 1.3.- Desarrollo del inóculo: Tanto en la primera producción industrial como en las siguientes es necesario utilizar grandes volúmenes de cultivo por lo que la preparación de un inóculo adecuado es una tarea de importancia capital. En un proceso industrial puede ser necesario realizar incubaciones de gran volumen (>160.000 litros) para las que son necesarios también grandes inóculos (>1.000 litros). Para repetir rutinariamente la operación de producción es necesario utilizar cultivos almacenados del microorganismo de interés (cultivos «stock») y a partir de ellos hay que desarrollar el inóculo intentando: (1º) minimizar la pérdida de viabilidad durante el proceso de recuperación del microorganismo, (2º) obtener una copia genéticamente idéntica a la que se había almacenado (esto es: evitar mutaciones y contaminaciones), (3º) incrementar la biomasa del cultivo y (4º) cultivar microorganismo hasta un estado fisiológico adecuado para lograr la mayor eficiencia en la faseelfinal de producción. Al desarrollar un inóculo es necesario conseguir una alta velocidad de crecimiento y de concentración de biomasa al inicio del proceso de fermentación. 1.4.- Mejora de las técnicas de cultivo: Desde las primeras etapas del desarrollo de un proceso industriales hace necesario mejorar el medio de cultivo del microorganismo para conseguir un mayor rendimiento en la producción del metabolito de interés, reducir la presencia de otros productos que puedan dificultar el aislamiento del compuesto deseado y reducir los costes de producción. Puesto que el número de variables químicas y físicas independientes que afectan el crecimiento del microorganismo es muy alto, su opti optimi mizac zació iónn me medi diant antee el an anál ális isis is si sist stem emát átic icoo de ca cada da una de el ella lass se ha hace ce rá rápi pida dame ment ntee

 

im imposi posible. ble. Para reali realizar zar el estudi estudioo cua cuando ndo hay más de cinco cinco variabl variables es indepe independi ndient entes es se recomienda utilizar una aproximación de análisis multivariable (método de Packett-Burman) que consiste en agrupar varias variables para decidir sobre el incremento en rendimiento debido al cambio de un grupo de ellas. 1.5.- Conservación de los microorganismos importantes: La conservación de microorganismo de interés industrial es una técnica básica en todo el  proceso. La conservación ha de estar encaminada al mantenimiento de las cepas altamente  productivas durante largos periodos de tiempo sin que se produzcan cambios fenotípicos, espec esp ecia ialm lment entee en la lass car carac acte terí ríst stic icas as relac relacio iona nada dass co conn la pro produc ducci ción ón de lo loss meta metabo boli lito toss secundarios de interés. Se han desarrollado varias técnicas de conservación; (1) el subcultivo de célul células as activas, activas, (2) la desecación de cultivos, (3) la liofilización, (4) la congelación mecánica (-20 ó -80ºC) y (5) la ult ultrac raconge ongelac lación ión en vapo vaporr de nitróge nitrógeno no líquid líquidoo (-156ºC) (-156ºC) o en nit nitróge rógeno no líquid líquidoo (-196ºC) (-196ºC).. Generalmente, las tasas de supervivencia son más elevadas después de la conservación en nitrógeno líquido que tras cualquiera de los otros métodos. En los casos de conservación por  congel con gelaci ación, ón, es nece necesari sarioo aña añadir dir a los cul cultiv tivos os agentes agentes cri criopro oprotec tector tores es (glice (glicerol rol,, Di-Met Di-Metil il-SulfOxido, DMSO).

 

MICROBIOLOGÍA MICROBIOLOG ÍA APLICADA 1.- Introducción La Microbiología Industrial trata de utilizar microorganismos para que produzcan compuestos o realicen funciones que sean útiles desde un punto de vista aplicado. Comprende el cultivo de mi micr croo oorg rgan anis ismo mos s fármacos, pa para ra su alimentos, pr prop opia ia pr prod oduc ucci ción ón co como mo al alim imen ento to y pa para ra la pr prod oduc ucci ción ón y transformación de disolventes orgánicos, etc. Para poder utilizar microorganismos en procesos aplicados debemos conocer los principios  básicos del funcionamiento celular y del cultivo controlado de microorganismos. Para cada  producto o transformación concreta será necesario, además, determinar qué microorganismo es el más adecuado para llevarlo a cabo. En este capítulo revisaremos algunos aspectos básicos para el estudio de los procesos de  producción que estudiaremos en capítulos cap ítulos siguientes. 2.- Tipos de organización celular  Los seres vivos pueden agruparse en tres grandes grupos que se separaron en épocas evolutivas muy antiguas: bacteri bacterias, as, arqueas y eucari eucarias as. Bacterias y arqueas presentan un tipo de organización organización celular conocida como procariótica procariótica porque en ellas el material genético genético no está separado del resto del citoplasma por una membrana nuclear (son células sin núcleo), mientras que los organismos pertenecientes al grupo de eucaria presentan un núcleo diferenciado del resto de la célula y, por tanto, su organización celular se denomina eucariótica. La teoría evolutiva establece establece que todos los seres vivos (procarióti (procarióticos cos y eucarióticos eucarióticos)) derivan de un antepasado común cuyos descendientes fueron divergiendo a lo largo de la evolución. Mediante técnicas de biología molecular ha sido posible ir estableciendo las relaciones familiares entre los diferentes grupos de organismos de forma que pueden representarse en esquemas que relacionan los grupos entre sí. Estos esquemas se conocen generalmente con el nombre de árboles universales de la vida . Los organismos más relevantes desde el punto de vista industrial y aplicado pertenecen al grupo de bacterias y eucarias. Dentro de las bacterias se encuentran la mayoría de los organismos  patógenos, un gran número de productores de substancias de interés aplicado (antibióticos, por  ejemplo) y productores y agentes alterantes de alimentos. Dentro Dent ro de los los euca eucari rias as no noss en encon contr tram amos os lo loss an anim imal ales, es, pl plan anta tass y ho hong ngos os (l (las as le leva vadur duras as unicelulares y los hongos filamentosos). Hay algunas arqueas que participan en procesos de interés aplicado (organismos metanógenos,  por ejemplo). Aunque su número es reducido, probablemente se irá incrementando en el futuro conforme se profundice en el estudio de este tipo de microorganismos.

 

En esta presentación hemos dejado de un lado los virus por ser estructuras acelulares que sólo desarrollan actividad biológica cuando se encuentran en el interior de una célula a la que infectan y por su escasa relevancia en microbiología industrial (dejando a un lado su efecto negativo sobre ciertos cultivos industriales). El estudio de la organización interna de las células procarióticas y eucarióticas cae fuera de las  posibilidades de este documento y los conceptos básicos b ásicos deben ser repasados repasado s por los alumnos. 3.- Estructura de la pared celular  La estructura de la pared celular de las bacterias permite distinguir dos grandes grupos: las  bacterias Grampositivas (cuya pared celular contiene una sola membrana, una gruesa capa de  peptidoglicano y ácidos teicoicos, Fig. 1A) y las bacterias Gram-negativas (cuya pared celular  tiene dos membranas ligeramente ligeramente diferentes que delimita delimitann un espacio periplásm periplásmico ico en el que se encuentra una delgada capa de peptidoglicano, y que presentan lipopolisacáridos en el exterior, Fig. 1B)

Las

diferenc encias

estructurales entre las paredes celulares de bacterias Gram positivas y Gram-negativas son responsables de diferente sensibil sensi bilidad idad a antibiót antibióticos icos y de diferencias en su cap capaci acidad de exp export rtar  ar   proteínas al exterior de la célula. Las bacterias entéricas son ejemplos de Gram-negativas mientr mientras as qu quee las bacter bacterias ias láct láctic icas as so sonn ejem ejempl plos os de Gram-positivas

Las células eucarióticas pueden tener pared que recubra su membrana. Esto ocurre en los hongos y en las plantas. Sin embargo, la estructura de esta pared es diferente a la de las bacterias. Una diferencia esencial es que los eucariontes no tienen peptidoglicano en su pared celular. Las enzimas que sintetizan el peptidoglicano son dianas específicas para antibióticos activos frente a  bacterias pero son inactivos frente a eucarias (por ejemplo, las penicilinas y cefalosporinas cefalosporinas). ). 4.- Membranas biológicas Las membranas biológicas son unas estructuras esenciales para el mantenimiento de la integridad celular y para el correcto funcionamiento de los procesos biológicos. Desempeñan dos funciones esenciales: (1) son barreras de permeabilidad que separan diferentes compartimentos celulares, y (2) son un soporte que permite mantener ordenados los componentes celulares para que puedan funcionar correctamente.

 

Las mem membran branas as biológ biológica icass son imp imperm ermeabl eables es al agua agua,, compue compuesto stoss polares polares y compue compuesto stoss cargados. Para que este tipo de compuestos entre o salga de la célula o de los compartimentos intracelula intra celulares res son necesarios canales de paso específicos específicos.. Las moléculas apolares, sin embargo, embargo, sí pueden atravesar las membranas biológicas. Las barreras barreras de permea permeabil bilida idadd per permit miten en manten mantener er concen concentrac tracion iones es difere diferente ntess de ion iones es o moléculas a ambos lados de una membrana biológica. Esta diferencia de concentraciones (que se suele denominar  gradiente de concentración) da lugar a la existencia de una energía potencial que puede ser transformada en la energía química necesaria para el funcionamiento de los  procesos biológicos. Por tanto, los agentes químicos que destruyen las membranas biológicas son letales para las células ya que destruyen los gradientes que son la base de muchos procesos biológicos y desordenan los componentes celulares al destruir el soporte en el que se encuentran.

 

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL III El Vino 1.- Introducción En este capítulo vamos a utilizar la producción de vino como esquema para estudiar los  principios básicos de la microbiología industrial y de la biología de microorganismos. Más adelante estudiaremos otros procesos de producción industrial con un mayor detalle. La microbiología industrial está dedicada a la utilización comercial de microorganismos e incluye procesos que tienen gran importancia económica, ambiental y social. Tradicion Tradic ionalm alment entee se ha uti utiliz lizado ado la palabra palabra fermentación en mi microb crobiol iologí ogíaa indust industria riall para describir los procesos de cultivo de microorganismos con propósitos industriales. Sin embargo, no hay que confundir esta utilización del térmico con el proceso bioquímico de fermentación consistente en la regeneración del poder reductor (NADH) por un procedimiento no oxidativo (estos procesos se estudiarán más adelante en el curso). La fermentación que tiene lugar en la  producción del vino, en este sentido, comprende ambos significados: por un lado, se trata  bioquímicamente de un proceso defermentación fermentación industrial (producción de trata glucosa en condiciones anaerobias) y es una en de el alcohol sentido adepartir que se de un  proceso industrial llevado a cabo por microorganismos. microorgan ismos. El desarrollo de una fermentación industrial incluye dos tipos de procesos denominados, por sus nomb nombres res en ingl inglés, és, pr proc oceso esoss upstream y pr proc oces esos os downstream. Los Los proce procesos sos upstream comprenden la selección y preparación del microorganismo, la preparación del medio de cultivo y de las las con condi dici cion ones es de fe ferm rmen enta taci ción ón (cult (cultiv ivo). o). Los Los pr proc oceso esoss downstream in incl cluy uyen en la  purificación del producto y el tratamiento de los residuos de d e la fermentación. En el proceso de fermentación del mosto de uva para producir vino, podemos distinguir los  procesos upstream de la selección y preparación de cepas de levadura, tratamiento del mosto y acondicionamiento de loas condiciones de fermentación. Los procesos downstream comprenden, en este caso, el tratamiento del vino para su clarificación y el de los residuos del proceso. Los productos fabricados por fermentaciones industriales pueden agruparse grosso mod o en dos clases: •

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(1) los productos de gran volumen y bajo valor (en este grupo se incluyen los productos alimenticios, bebidas, aditivos alimentarios y algunos productos químicos producidos por  fermentación) y (2) los productos de bajo volumen y alto valor (los fármacos, por ejemplo).

Por otro lado, hay que señalar que tienen origen en fermentacione fermentacioness industriale industrialess un gran número de productos de uso cotidiano que pertenecen a diferentes grupos:

 

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(1) alimentos (derivados lácteos y de vegetales fermentados), bebidas (vino, cerveza, etc.), aditivos alimentarios (vinagre, ácido cítrico, carotenos, etc.). (2) product productos os farmacéutico farmacéuticos: s: antib antibiótic ióticos os ß-lactámicos ß-lactámicos (penicilinas (penicilinas y cefalosporina cefalosporinas), s), antibiótic antib ióticos os amino aminoglicósi glicósidos dos y tetracicli tetraciclinas; nas; compue compuestos stos antitumoral antitumorales es y otros fármacos (lovastatina, por ejemplo, utilizada para controlar la producción de colesterol). (3) Enzimas microbianas tales como proteasas, amilasas, etc. (4) Prod Product uctos os quí químic micos os tal tales es com comoo alcohol alcoholes, es, polisa polisacári cáridos, dos, disolve disolvente ntess (aceton (acetona), a), lípidos, productos base para la producción de plásticos, etc. (5) Productos recombinantes diseñados por ingeniería genética.

Además de estas utilidades, los microorganismos se usan industrialmente en ciertos procesos de micr microbi obiol ologí ogíaa am ambi bient ental al ta tale less co como mo el tr trat atam amie ient ntoo de re resi siduo duoss sólid sólidos os y lí líqui quidos dos y en  biorremediación. Estos aspectos serán será n tratados más adelante en este curso. 2.- Producción de vino   Se trata de una fermentación para la fabricación de un producto de gran volumen y bajo valor  añad añadid ido. o. En el pro proce ceso, so, un hongo hongo (Sacch crece ce ut util iliz izan ando do el az azúca úcar  r  (Saccharomyc aromyces es cerevisia cerevisiae) cre (glucosa) presente en el mosto de uva para producir alcohol. El proceso puede esquematizarse como sigue:   Vamos a utilizar el estudio de la fermentac fermentación ión del vino para revisar los factores factores que intervienen intervienen en un proceso industrial estudiando en los próximos apartados • • • •

El microorganismo (hongos) El crecimiento de microorganismos El medio de cultivo El proceso de fermentación

2.1.- El microorganismo: Saccharomyces cerevisiae. Los hongos La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto unicelular. Los hongos son organismos eucarióticos (sus células tienen unaa organización interna endeorgánulos membranosos) quimioheterótrofos. A continuación vamos explicar el concepto quimioheterótrofo ya describir los principales grupos de hongos. Los organismos necesitan carbono y energía para poder crecer. En la naturaleza las fuentes de energía pueden ser químicas (energía presente en los enlaces de compuestos químicos) o lumínica (energía de la luz que se transforma en energía química). Por otra parte, las reaccines de óxido-reducción que tienen lugar en los seres vivos requieren donadores de electrones que pueden ser orgánicos o inorgánicos. Por último, el carbono puede encontrarse de dos formas, como carbono orgánico y como carbono inorgánico (CO 2). La combinación de estas posibilidades da lugar a las diferentes categorías de microorganismos en función de su nutrición:

 

Tipo ddee nnuutrición

Fuente de carbono

Fuente ddee eennergía Fuente ddee eellectrones

Ejemplo

Quimiotrofos

química

-

-

-

Fototrofo Organotrofo

luz -

comp.orgánico

-

-

Litotrofo

-

comp. inorgánico

-

-

Autotrofo

-

-

inorgánico

-

Heterotrofo

-

-

orgánico

-

Quimioorgano(hetero)trofo

química

comp.orgánico

orgánico

 bacterias, animales

Quimiolito(auto)trofo

química

comp. inorgánico

inorgánico

algunas bacterias

Fotolito(auto)trofo

luz

comp. inorgánico

inorgánico

bacterias, plantas, algas

Fotoorgano(hetero)trofo

luz

comp.orgánico

orgánico

algunas bacterias, algas

hongos,

Como puede verse, las bacterias versatilidad metabólica. mayor que la que presentan plantas, animalespresentan u hongos.una Engran cualquier caso, los principalesMucho microorganismos de interés aplicado industrial pertenecen al grupo de los quimioheterótrofos. El microorganismo responsable de la fermentación alcohólica de la producción del vino es la levadura S. cerevisiae. Las levaduras son hongos unicelulares, a diferencia de otro tipo de hongos a los que conocemos como filamentosos. Sin embargo, biológicamente, ambos tipos de hongos (unicelulares o filamentosos) son similares. Las levaduras se multiplican en los medios de cultivo como células aisladas individuales que se dividen y, de esta forma, aumentan su número. En el caso de los hongos filamentoso, sin embargo, las células se encuentran contenidas dentro de unos tubos formados por la pared celular. Estos tubos se denominan hifas y van creciendo por  sus punt puntas as (cre (crecim cimien iento to apical apical)) y ramifi ramificán cándose dose para formar formar la coloni coloniaa que deno denomi minamo namoss micelio. Por consiguiente, los hongos filamentosos tienen un crecimiento micelial, mientras que las levaduras no. Es importante tener en cuenta que en el crecimiento micelial, sólo el borde de la colonia (las  puntas de las hifas) crece. La parte central de una colonia micelial está formada por células cé lulas viejas mientras que el borde de la colonia está formado por células jóvenes. Las células jóvenes se encuentran en trofofase (fase de alimentación y crecimiento), mientras que las células viejas se encuentran en idiofase (fase de diferenciación). Cuando observamos una colonia micelial (por  ejemplo una colonia de moho sobre una naranja), el crecimiento de la colonia se produce sólo  por el borde de la parte mohosa y en la parte central de la colonia se produce la diferenciación que dará lugar a la formación de las esporas y a la aparición del color verdoso característico.

 

Las células jóvenes desarrollan la mayoría de la actividad metabólica del hongo, liberando enzimas enzim as al medi medioo y abosorbiendo los nutriente nutrientes. s. La zona centra central,l, por otra parte, tiene células en las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser necesarias para que el micelio colonice nuevas zonas pobres en nutrientes (por ejemplo, cuando el moho de una fruta comienza a extenderse por la fuente de plástico en la que se encuentra) o cuando el hongo se diferencia (por ejemplo, cuando produce esporas o cuerpos fructíferos). El crec crecim imie ient ntoo de un hongo hongo co como mo le levad vadur uraa o co como mo ho hongo ngo fi fila lame ment ntoso oso est está, á, en al algun gunas as ocasiones, regulado por condiciones ambientales, de forma que un mismo hongo puede crecer en ciertas situaciones como levadura y en otras como hongo filamentoso (por ejemplo, los hongos  patógenos ustilago maydis y Candida albicans). Otro aspecto importante a tener en cuenta es que la pared celular de los hongos (levaduras y filamentosos) es diferente de la de las bacterias y de la de las plantas. La pared celular de  bacterias está formada por peptidoglicano, mientras que la de hongos por quitina y polisacáridos (glcanos) y la de las plantas por celulosa. Por último hay que recordar que como organismos eucarióticos que son, los hongos tienen su núcleo diferenciado en el interior de la célula, tienen varios cromosomas, la división celular se  produce meiosis. por mitosis (proceso que no ocurre en bacterias) y la producción de células sexuales por  La clasificación de los hongos es muy compleja y aquí vamos a ver sólo lo más simple para  poder seguir el curso. La clasificación se basa en dos criterios: (1) si las hifas están tabicadas (divididas (divi didas en células) o no y (2) dentro de los hongos con hifas tabicadas, tabicadas, en la organización organización de las esporas sexuales. •

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Los hongos con hifas no tabicadas se denominan  Ficomicetos (esta nomenclatura y clsifi cls ificaci cación, ón, repito, repito, pue puede de encont encontrars rarsee de form formaa diferen diferente te en distin distintos tos libros) libros).. Los ficomicetos son hongos inferiores (en algunos casos se discute si son hongos o no) y viven en ambie ambientes ntes acuosos. Destacan los géneros Mucor  que participa en la producción de algunos tipos de alim alimentos entos y  Phytophthora alguno de cuyos miembros son patóge patógenos nos  P. infestans, por ejemplo). vegetales ( P. Los hongos superiores se pueden agrupar en tres clases Ascomicetos. En ellos las esporas sexuales (ascosporas) se encuentran en el interior de una bolsa o asca. Son ej ejem empl plos os de ascom ascomic icet etos os la le leva vadur duraa S. cerevissiae, los hongos filamentosos  Neurospora, y hongos comestibles como las trufas. Son el grupo de hongos más abundante. Basidiomicetos. En ellos las esporas sexuales ( basidiosporas) se encuentran encuentran en el exte exteri rior or de un unas as es estr truc uctu tura rass co com m fo form rmaa de maz azaa de deno nomi mina nada dass basidios. Pertene Pert enecen cen a este este grupo grupo lev levadur aduras as com comoo el patóge patógeno no humano humano Cryptococcus neoformans que produce meningitis en pacientes inmunodeprimidos, el patógeno vegetal Ustilago maydis que produce tumores en los granos del maíz, hongos superiores con cuerpos fructiferos complejos (setas) tales como el champiñón ( Agaricus  Agaricus bisporus) y la seta de chopo ( Pleurotus ostreatus), etc. o

o

 

o

Deuteromicetos. Tradicionalmente se conocían como hongos imperfectos porque en ellos no se había podido encontrar la forma sexual y, por consiguiente, no se sabe si producen ascosporas o basidiosporas. Actualmente y mediante el uso de técnicas de análisis del ADN se ha podido determinar que la mayoría de ellos  pertenecen al grupo de los ascomicetos y, por alguna razón, han perdido la  posibilidad de realizar la reproducción sexual. Alguno de los hongos más im impo porta rtant ntes es en mi micro crobi biol olog ogía ía in indus dustr tria iall son de deut uter erom omic icet etos: os:  Penicillium  productor de la penicilina,  Aspergillus productor de ácido cítrico y de lovastatina; tam tambi bién én se en encu cuen entr tran an en es este te gr grup upoo ho hong ngos os pa pató tóge geno noss ve vege geta tale less co como mo Trichoderma y Verticillium, y hongos patógenos oportunistas animales tales como Candida albicans 

2.2.- Crecimiento celular  En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos que crecen aislados. Esta es la forma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las  bacterias. Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque es necesario  poder predecir vaando a evolucionar cómoción. va aSin ir consumiéndose el substrato cómo se va a ir cómo acumul acumulando el productoun de cultivo, una fermenta fermentación. conocer estos factores es muyy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qué va a pasar, cuándo va a completarse el crecimiento, cómo se va a acumular el producto, etc. La Lass cél célul ulas as aisl aislada adass cul culti tiva vada dass en un vo volu lume menn fi fini nito to de medi medioo de cu cult ltiv ivoo aprop apropia iado do van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto han podido duplicar su masa y su material genético. El tiempo que tarda una célula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos conocem os como tiempo de generación y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones óptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el número de células se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial. Si llamam llamamos os  N0 al nú núme mero ro de cé célu lula lass in inic icia ial, l, y  g  al nú núme mero ro de generaciones transcurridas, el número de células final ( N   N ) será: Llamando T  al tiempo de generación y t  al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuación anterior puede transformarse en la siguiente: Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello es mejor  transformarlas en algo más simple, como puede ser una recta. Para tran Para transfo sform rmar ar la lass ec ecuac uacio iones nes anter anterio iores res en un unaa recta recta,, tomamos logaritmos en los dos términos y resulta:

 

Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generación T es muy grande, el crecimiento tendrá poca  pendiente (será lento) y si T es pequeño pequeñ o el crecimiento será rápido. En un crecimiento equilibrado, todos los parámetros de crecimiento evolucionan en paralelo. Esto es: el incremento en el número de células, en la bioma biomasa sa de cultivo cultivo y en la acumulación acumulación de metabolitos primarios, proteínas, ácidos nucleicos etc., es paralelo. Por tanto, en la ecuación anterior N puede representar cualquiera de estos factores. Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células (dN ) en un intervalo corto de tiempo ( dt ). ). En este caso, la ecuación que describe la cinética es la siguiente: Esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad (µ) se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo así como la probabilidad de que una célula se divida en un tiempo determinado. Integrando la ecuación anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la siguiente función exponencial: la transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente: Esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ. Comparando esta ecuación con la similar presentada más arriba, podemos concluir que µ = ln2/T y, por consiguiente, que T = ln2/µ. Es decir, que hay una correlación inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de generación. Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular, etc. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento µ a partir de medidas medidas experimentales del incremento en el número de células, biomasa, etc.

 

El gráfico represen representa ta la variación de la biomasa (o número de células, células, etc.) de un cultivo cultivo (línea roja) a lo largo del tiem tiempo. po. En este cultivo, cultivo, se va consumiendo consumiendo un substrato cuya concentración concentración (línea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Esta relación de  proporcionalidad puede expresarse expres arse de la forma siguiente:

Donde dS indica indica la variación de la concent concentración ración del substrato. substrato. Al valor  Ys lo denominamos denominamos rendimiento de utilización del substrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puede  producirse por unidad de substrato subs trato consumido:

El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o alimentos, que "engordan" más que otros), varía entre diferentes microorganismos (en un símil antropomórfic antrop omórfico: o: hay personas que engordan más que otras comiendo lo mismo mismo)) y varía también también en función de otras condiciones ambientales o fisiológicas (no engorda lo mismo uno al comer  algo si está sano o enfermo o si está en verano o en invierno). También varía el rendimiento en función de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos serán revisados más adelante). Podemos calcular el rendimiento de la utilización del substrato en función de la cantidad de substrato añadido al cultivo, o en función de la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo). Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total 8gramos de células, por  ejemplo) o de carbono presente en las células (aproximadamente el 505 de la masa celular  corresponde a carbono).

 

Haciendo las transformaciones que se indican a la derecha sobre la fórmula que relaciona la variación de bi biom omasa asa con la de sub subst strat rato, o, ll lleg egam amos os a la definición de un nuevo concepto qs qs   denominado tasa especí tasa específi fica ca de consumo consumo de substr substrato ato por el  organismo.

La tasa específica de consumo de substrato la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor  será la velocidad de crecimiento (µ). Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, también mayor será la tasa de crecimiento. Sin embargo, hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimientos más bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento disminuye). A esta correlación inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur .

Por último, nos faltade relacionar tasa de crecimiento (µ) con ladeconcentración (S). En condiciones substratolaabundante, la concentración este no afectadealsubstrato valor de µ; pero cuando el substrato substrato se hace limita limitante, nte, sí existe ese efecto. La expresión matemáti matemática ca que relaciona ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuación de Monod  y es la siguiente: En esta ecuación la tasa de crecimiento (µ) depende de la máxima qu quee puede puede al alcan canza zarr el mi micro croor organ ganis ismo mo,, de la conce concent ntra raci ción ón de su subst bstra rato to y de un va valo lorr Ks que rep repres resent entaa la co conce ncent ntrac ració iónn de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la máxima.

La ecuación de Monod tendrá mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuación el rendimiento debe ser independiente de la concentración de substrato. 2.3.- Fases del crecimiento de un cultivo En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le denomina cultivo batch y  podríamos traducirlo por  cutivo discontinuo por contraposición con el cultivo continuo que desarrollaremos más adelante. El desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la siguiente figura:

 

Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: (1) la  fase lag  en la que el microorganismo se ad adpa pata ta a la lass nu nuev evas as co cond ndic icio ione ness y po pone ne en marcha su maquinaria metabólica para poder  crecer activamente. La duración de esta fase es va vari riab able le y en ge gener neral al es mayor mayor cu cuan anto to más más grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial  cuy cuyaa ci cinét nétic icaa expli explicam camos os en la  página anterior. (3) La  fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sinio que la aparición de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. (4) La  fase de muerte en la que el número de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k  que de deppende de difere renntes circunstancias. En la  fase de mmuerte de deci cimo moss que el nú núme mero ro de mi micro croorg organ anism ismos os vi vivos vos di dism smin inuy uyee exponen exp onencia cialm lmente ente.. Pero ¿qué ¿qué es un mi microo croorgan rganism ismoo vivo vivo en tér térmi minos nos mi micro crobiol biológi ógicos? cos?.. Consideramos vivo al microorganismo que puede multipicarse (dividirse), y muerto al que ha  perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender es este te concepto porque los micro microorganism organismos os microbiológi microbiológicament camentee muert muertos os no tiene tienenn porqué estar metabólicamente metabólicamente inactivos. 2.4.- Medida del crecimiento microbiano Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parámetros algunos de los cuales  presentaré a continuación. No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos tod os los pará parámet metros ros del culti cultivo vo evo evoluc lucion ionan an de form formaa proporc proporcion ional al y, por consigu consiguien iente, te, midiendo uno de ellos (el de medida más fácil) podemos medir el resto. En este apartado revisaremos los principales métodos de recuento de microorganismos. Una información más completa puede encontrarse en la conexión Métodos de recuento recuento.. Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas (técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de contadores de partículas). Ls métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos. La elección de un método de seguim seguimiento iento del cultivo en concret concretoo depende de las características características del cul culti tivo vo y del proc proceso. eso. Entre los método métodoss princi principal pales es de recu recuent entoo de mi microo croorgan rganism ismos os  podemos destacar:

 

1.- Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste de fase. Para ello se cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una célula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo; pero no  permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas. 2.- Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter . La operación empleo)) y permite rápidamente determinar el número de de estos sistemas es sencilla (método ( método de empleo  partículas presentes en una suspensión y la distribución de sus tamaños. El problema es que no distingue entre células vivas y muertas ni entre células y agregados de material insoluble  presente en la suspensión del cultivo. 3.- Técnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación correspondiente, a una colonia de forma que el número de estas nos permitirá estimar  el número de células presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fácil de utilizar  en el caso de células aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cult cu ltiv ivoo ante antess que qumicroaerófilos e so soli lidi difi fiqu que) e).que . Esta Es úl últi tima ma opci pe perm rmit iteedere real aliz izar ar elde re recu cuen ento toPara de microorganismos notacrecen bienop ención laónsuperficie las placas cultivo. que el sistema de recuento en placa tenga validez validez estadísti estadística, ca, es necesario necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida. 4. Técnicas turbidométrica turbidométricass basadas en la medi medida da de la turbidez de los medios medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar  al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colorímetro,  por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente (nor malmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar  valores de densidad óptica. La limitació limitaciónn de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue células vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 células por mililitro. 5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana que retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema, obviamente, no diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. 6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la luciferasa de luciérnaga ( Photimus  Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se  puede medir la concentración con centración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante  porque la concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas, de forma que esa medida indirecta detecta únicamente las células vivas. Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado técnicamente para poder ser  utilizados como  sistemas online. En una operaci operación ón on line no es necesario extraer la muestra del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermentaciones en gran

 

volu volume menn porq porque ue pe perm rmit itee real realiz izar ar me medi dida dass en ti tiem empo po re real al y di dism smin inuy uyee lo loss ri ries esgo goss de contaminación. Antes de cerrar este apartado hay que señalar que en la naturaleza hay muchísimos más microorganismos de los que podemos detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar únicamente proporciones menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintrofía y la oligotrofia (inhibición por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos microorganismos. 2.5.- Factores ambientales que afectan al crecimiento de microorganismos Una vez visto cómo podemos seguir la evolución de un cultivo, vamos a recordar que en un  proceso de crecimiento equilibrado todos los parámetros del cultivo evolucionan manteniendo unas proporciones constantes. Por tanto, la medida (seguimiento) de cualquiera de los factores nos permite seguir la evolución de los otros. A continuación vamos a revisar los que son estrictamente ambientales y más adelante revisaremos los relacionados con los nutrientes del cultivo. Entre los factores ambientales destacan los siguientes: 2.5.1 Temperatura Cada mi Cada microo croorgan rganism ismoo tie tiene ne una tem tempera peratur turaa de cre crecim cimient ientoo adecuad adecuada. a. Si conside consideram ramos os la variación variac ión de la velocidad de crecim crecimiento iento ( μ  μ) en función de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento (dX/dt = 0); a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que ( μ) es máxima (para las condiciones de concentración de substrato en que se trabaja, (ver la discusión anterior al respe respect cto) o).. Por Por enci encima ma de es esta ta te temp mpera eratu tura ra ópt óptim ima, a, la veloc velocid idad ad de cr crec ecim imie ient ntoo de deca caee  bruscamente (µ → 0) y se produce produ ce la muerte celular. El incremento de µ con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura. Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. En términos generales, la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar. La ausencia de crecimiento ( µ=0) a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de crecimiento y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos (algo parecido a la precipitación del aceite a bajas temperaturas) impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas. Es importante tener en cuenta que a temperaturas muy bajas, el metabolismo celular es muy bajo y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué comenzar a morir. Sin embargo, cuando la

 

temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente (como veremos más adelante) y las células no pueden recuperar su capacidad de división división si baja posteriormente posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío. Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento mínima, máxima y óptima. Tipo de microorganism smoo Psicrófilo Psicrótrofo Mesófilo Termófilo

Temp. mínima Temp. óptima -5 + 5 12 - 15 -5 + 5 25 - 30 5 - 15 30 - 45 40 - 45 55 - 75

Temp. má máxima 15 - 20 30 - 35 35 - 47 60 - 90

Además de los indicados existen organismos hipertermófilos que pueden crecer a temperaturas cercanas o incluso superiores a 100ºC en condiciones de alta presión. Son microorganismos muy importantes desde el punto de vista ambiental; pero no tienen aplicaciones actuales en agronomía o en microbiología industrial. Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Esto es im import portant antee desd desdee el pun punto to de vis vista ta apl aplica icado do porq porque ue cuando cuando se encuent encuentran ran con contam taminan inando do alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de producir  infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 ºC). Los microorganismos deben ser cultivados a la temperatura adecuada para que su crecimiento sea el deseado. En cualquier caso, hay que tener en cuenta los problemas derivados de las altas temperaturas y controlar la de los fermentadores para evitar la esterilización de los cultivos. Es Esta tass al alttas tem empe pera ratu tura ras, s, po porr ot otro ro la lado do,, ti tien enen en in intter erés és ap apllica cado do en el ca cam mpo de la termodestrucción de microorganismos y en algunos procesos de fermentación en los que el incremento de temperatura que se produce es capaz de eliminar los microorganismos mesófilos  patógenos presentes. Importancia de los microorganismos de ambientes extremos La ma mayo yorr pa part rtee de lo loss mi micro croorg organ anism ismos os de im impor porta tanci nciaa aplic aplicada ada ta tant ntoo en mi micro crobi biol ologí ogíaa indust ind ustria riall com comoo ali alime mentar ntaria ia son mesófi mesófilos, los, psi psicróf crófilo iloss o psicró psicrótro trofos. fos. En los procesos procesos de compostaje, compo staje, el papel de los termófilos termófilos es import importante, ante, y también también hay que considerar la presencia de esporas termoresistentes en el estudio de los tratamientos térmicos de termodestrucción de microorganismos en alimentos. Si Sinn em emba barg rgo, o, es cr crec eciien ente te el nú núm mer eroo de pr prod oduc ucttos qu quee se pr prod oduc ucen en pa part rtiien endo do de microor mic roorgani ganismo smoss term termófil ófilos os porque porque prod produce ucenn prot proteín eínas as termorre termorresis sistent tentes es que tie tienen nen gra grann utilidad en procesos aplicados. Quizá el mejor ejemplo de esto es la ADN polimerasa Taq obtenida a partir de la eubacteria termófila Thermus aquaticus. Esta enzima permite sintetizar  in vitro ADN a alata temperatura lo que ha sido esencial para el desarrollo de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (conocida por sus iniciales en inglés: PCR) lo cual ha

 

supuesto un avance en la biología molecular, el diagnóstico y la detección de microorganismos en los ambientes más variados. Aplicación de la temperatura en la termodestrucción de microorganismos Un aspecto aplicado muy importante de la temperatura es su utilización para la esterilización por  calor. Es necesario esterilizar ciertos ambientes o instrumentos, o eliminar de ellos una parte muy importante de su carga microbiana. Esto se puede hacer con facilidad y de forma controlada mediante tratamientos términos. En esta sección veremos cómo se puede predecir cómno será la evol evoluc ució iónn de las las pob pobla laci cion ones es mi micr crobi obian anas as com comoo co conse nsecue cuenc ncia ia de su ex expos posic ició iónn a la lata tass temperaturas. Habíamos visto en su momento que durante la fase de muerte, la desaparición de microorganismos seguía la cinética descrita en la ecuación siguiente:

La fase de muerte también sigue una cinética exponencial y puede ser sometida a un tratamiento matemático similar al usado para el tratamiento matemático del crecimiento. Si representamos la variación del logaritmo del número de células supervivientes a un tratamiento térmico realizado a una temperatura dada en función del tiempo de tratamiento, se obtiene una gráfica como la siguiente:

El descenso del logaritmo de supervivientes es lineal con el tiempo. La recta tiene una pendiente que permite calcular la velocidad de termodestrucción. Se define el valor  D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad). Si consideramos N0 como el número de células al inicio del tratamiento y N x el número de células supervivientes después de un tratamiento de  x  minutos a una temperatura t , el tiempo de termodestrucción se calcula de la siguiente manera:

 

Las unidades del  D son minutos. El tiempo de termodestrucción ( D  D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t ) de forma que a mayores temperaturas el valor de  D es menor, es diferente  para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas. Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de  D disminuye de forma logarítmica tal y como se indica en la siguiente gráfica:

De manera análoga a como el valor  D  D indicaba el tiempo necesario para lograr que el número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor  z  indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor  D  D se reduzca a la décima  parte del inicial. La fórmulaincluida en la gráfica permite calcular el valor  v alor  z   z  cuando conocemos el incremeto de temperatura (t2-t1) y los respectivos valores  D. Los valores d  y  z  varían para cada microorganismo y para cada condición. Las esporas, por  ejempl eje mplo, o, tie tienen nen val valores ores  D mu much choo más más al alto toss qu quee la lass cé célu lula lass vege vegeta tati ticas cas de lo loss mi mism smos os microorganismos. Los microorganismos presentes en los alimentos, por otra parte, suelen tener  valores D más altos que cuando se cultivan en condiciones de laboratorio. Para poder determinar  las condiciones en las que hacer un tratamiento térmico para destruir microorganismos es necesario dominar los conceptos de los valores D y z . Ot Otro ro valo valorr que tien tienee gra grann im impor porta tanci nciaa apl aplic icada ada en el estudi estudioo de la mi micro crobi biol olog ogía ía de la termodestrucción es el parámetro F  que corresponde al tiemp tiempoo equivalente equivalente (medido en minut minutos os de tratamiento a 250ºF, o 121.1ºC) a todo el calor recibido considerando su capacidad de destruir  micr microor oorga gani nism smos. os. Al va valo lorr de la in inte tegra grall de dell calo calorr re reci cibi bido do se la denom denomin inaa  F0. Cuando consideramos que el calentamiento es un proceso instantáneo, se puede calcular usando la siguiente fórmula:

 

Es muy importante saber trabajar correctamente con los conceptos anteriores. Otros tratamientos tecnol tec nológic ógicos os par paraa dest destrui ruirr mi microo croorgan rganism ismos os (radiac (radiación ión,, por ejem ejemplo plo)) son suscept susceptibl ibles es de tratamientos matemáticos similares a los descritos en esta sección. Consideraciones sobre las bajas temperaturas Los microorganismos se comportan a bajas temperaturas de forma diferente según se trate de condiciones de refrigeración (0ºC-8ºC) o de congelaci´0on (por debajo de -20ºC). En cond condici icione oness de refr refrige igeraci ración ón los mi microo croorgan rganism ismos os mesófi mesófilos los y ter termóf mófilo iloss detien detienen en su crecimiento crecim iento (µ=0) y se mantienen durante largo tiem tiempo po sin morir. Los psicrófilos psicrófilos y psicrótrofos psicrótrofos  pueden crecer en estas condiciones con diciones y llegar a producir poblaciones importantes (esta es una causa de deterioro de alimentos conservados en refrigeración). En condiciones de congelación, la formación de cristales en el interior de las células produce unas altas mortalidades que reducen el tamaño de la población. En el momento de la congelación se produce la muerte rápida de muchos microorganismos y, a tiempos más largos, la tasa de muerte se reduce aunque el número de viables sigue disminuyendo. En esta segunda fase, la mortalidad es más rápida cuando la temperatura de congelación es más alta (más próxima a valores de -20ºC) que cuando es menor (valores de -80ºC). La tol tolera erancia ncia a la con congel gelaci ación ón de dif diferen erentes tes microor microorgani ganismos smos puede puede variar. variar. No se puede puede consi consider derar ar la cong congel elac ació iónn un proce procedi dimi mien ento to de est ester eril iliz izac ació iónn si sino no sólo sólo (en el caso caso de microbiología de alimentos) un procedimiento de conservación. Se pueden conservar largo tiemp tiempoo cul cultiv tivos os de mi microo croorgan rganism ismos os o de cél célula ulass eucarió eucarióti ticas cas congel congelado adoss en medios medios que contengan agentes crioprotectores como el glicerol. 2.5.2 Actividad de agua Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0):

El valo valorr de la ac acti tivi vida dadd de ag agua ua no noss da un unaa id idea ea de la ca cant ntid idad ad de ag agua ua di disp spon onib ible le metabólicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disolución saturad saturada a de salde común (NaCl) una parteEn important importante e de las moléculas molécul as de agua participa partici pa en la solvatación los iones de donde la sal disuelta. este último caso, la actividad de agua mucho

 

menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR) de la siguiente forma:

Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua menor que la que necesita, su crecim crecimiento iento se detiene. detiene. Esta detenc detención ión del crecimiento crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser  considerada prácticamente ilimitada. La gran mayo mayoría ría de los microorga microorganismos nismos requiere unos valores de actividad actividad del agua muy altos  para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes: Bactérias Levaduras Hongos filamentosos

aw >0.90, aw >0.85, aw >0.80.

Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua muchos menores (mucos más secos) de la que permite el crecimiento de  bacterias o de levaduras. Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por   bacterias. Existen microorganismos extremadamente tolerantes a las actividades muy bajas (toleran valores de aw=0.60). Algunos de estos microorganismos pertenecen al grupo de las  Arqueas y pueden observarse en las salinas de desecación formando manchas coloreadas en los depósitos de sal. La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. La utilización de almíbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. 2.5.3 Potencial del Ion Hidrogeno (pH) Es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos ya que estos sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica.

 

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Cada tipo de microorganismo tiene un rango de pH en el que puede vivir adecuadamente, fuera de este rango muere. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también, distintos. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalófilos que toleran pH=10.0 El pH interno en la mayoría de los microorganismos está en el rango de 6.0 a 7.0.

Hay que conside considerar rar que, como consecuenc consecuencia ia del metabolism metabolismo, o, el pH del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. Por consiguiente, es necesario controlar el pH de los cultivos industriales para evitar que un descenso excesivo pueda producir la autoesterilización del cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una vent ventaja aja sel select ectiva iva frente frente a otr otros os mi microo croorgan rganism ismos os competi competidore dores. s. Así, Así, por eje ejempl mplo, o, las  bacterias lácticas que producen grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables  por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las  bacterias competidoras mueren y las lácticas se s e convierten en la población dominante. La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cuenta cadenaque corta acético, láctico) ciertas bacterias. este corta sentido, hay que tener en la (fórmico, acción bactericida de estospor ácidos orgánicos de En cadena es más  potente que la debida únicamente a la bajada del pH que producen. Esto es, los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos. En resumen, es necesario controlar el pH de los cultivos y de las fermentaciones industriales para que se mantenga en los niveles adecuados para el crecimiento y metabolismo correcto del microorganismo con el que se trabaja. Por otro lado, el efecto letal del pH ácido sobre los microorganismos tiene aplicación en la conservación de alimentos acidificándolos. De esta forma, la adición de ácido acético en forma de vinagre permite la conservación de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo) y la  producción de ácidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo). 2.5.4. Potencial REDOX y Concentración de oxígeno Este es otro factor determinante del crecimiento y del metabolismo del cultivo. El potencial Redox del medio de cultivo nos indica su capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial Redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno [O 2]. Hay mi microo croorgan rganism ismos os que requ requier ieren en ambien ambientes tes oxi oxidant dantes es para para crecer, crecer, mientr mientras as que otros otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables como veremos más adelante. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras reduct oras no debe confundi confundirse rse con la necesid necesidad ad de presencia presencia o ausencia ausencia de oxígeno oxígeno para que se  produzca el crecimiento.

 

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En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que req requie uieren ren amb ambien ientes tes reducto reductores res (o menos menos oxi oxidant dantes) es) realiza realizann un metabolismo fermentativo. Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando no lo necesita (existen anaerobios facultativos como las bacterias entéricas, o como Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácticas) o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios). Hay microorganismos microorganismos que viven en ambie ambientes ntes carentes de oxígeno oxígeno (anaerobios) (anaerobios) que, sin embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de electrones elect rones que actúa como oxidante ambiental ambiental.. Por ejemplo, las bacterias bacterias que "respiran" 2nitratos (NO3 ), sulfatos (SO4 ) u otros compuestos orgánicos oxidados. Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxígeno, no son capaces de util utiliz izarl arloo co como mo ac acep epto torr fi fina nall de el elec ectr tron ones es y deb deben en de desar sarrol rolla larr un meta metabo boli lism smoo fermentativo (las bacterias lácticas, por ejemplo). Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo. Esto es: en presencia de oxígeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia, fermentativo. ferment ativo. El rendim rendimiento iento ( Ys) de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos, por ejemplo las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando

crecen fermentando que cuando lo hacen respirando. La lev levadu adura ra Sacchar Saccharomyces omyces cerevisiae cerevisiae desa desarrol rrolla la amb ambos os ti tipos pos de metabol metabolism ismo; o; pero sólo  produce etanol en condiciones de crecimiento anaerobio (fermentativo). Por consiguiente, y en general, al preparar un cultivo industrial debemos saber: (1) En qué condiciones metabólicas se produce lo que nos interesa fabricar y (2) Controlar la fermentación industrial para que se produzca en esas condiciones deseadas. En el curso de ciertas reacciones metabólicas Redox, se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres, formas de súperóxido) que pueden dañar las proteínas, membranas y ácidos nucleicos produciendo la muerte de las células. Estas formas reactivas son un subproducto del metabolismo (algo así como el preciodeque haycompuestos que pagar por ser másmediante eficienteslas y tener un (Ys)respirativo mayor. Las células se defienden estos reactivos enzimas siguientes:

Los organismos aerobios tienen SOD y muchos de ellos catalasa. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no  pueden sobrevivir en presencia prese ncia de oxígeno.

 

2.5.5 Radiación La Lass rad radia iaci cion ones es ul ultr trav avio iole leta ta (UV), (UV), Rayo Rayoss X y radia radiaci ción ón Gamm Gammaa (γ) pr produ oduce cenn efect efectos os esteri est eriliz lizant antes es (de (destr strucci ucción ón de mi microo croorgan rganism ismos) os) al alt alterar erar las proteín proteínas, as, membran membranas, as, ácidos ácidos + nucleicos y al generar radicales libres del tipo OH y H . El tratamiento matemático de la destrucción de microorganismos por estos procedimientos es similar al descrito para el uso de altas tipos temperaturas. de radiación. Hay que considerar, sin embargo, los poderes de penetración de los diferentes Así, por ejemplo, la radiación UV tiene un poder de penetración muy bajo y, por consiguiente, se ut util iliz izaa par paraa est esteri erili liza zarr su super perfi fici cies, es, mi mien entr tras as qu quee la radia radiaci ción ón X o la γ   ttien ienee poder poderes es de  penetración mucho mayores. La resistencia de diferentes tipos de microorganismos a las radiaciones varía. Las esporas  bacterianas, las bacterias, levaduras, hongos filamentosos y otras células eucarióticas son  progresivamente más sensibles a las radiaciones. Hay algunos microorganismos especialmente resistentes a las radiaciones, entre ellos destaca  Deinococcus radiodurans. 2.5.6 Presión hidrostática Las altas presiones inhiben el crecimiento de los microorganismos. Esto limita la altura de los fermentadores que se pueden utilizar sin que las altas presiones hidrostáticas del fondo inhiban el crecimiento. La altura de los fermentadores, por tanto, se suele limitar a un máximo de 14.5 m (lo que genera una presión de 1.5 atm). La razón por la que las altas presiones inhiben el crecimiento no está clara, aunque se ha visto que se detiene la síntesis de proteínas y los procesos catabólicos. También en este caso hay una gran variabilidad en la tolerancia de los microorganismos a las altas presiones. En este sentido, hay que señalar a los microorganismos barófilos que han sido aislados de fosas oceánicas y que crecen sometidos a presiones extraordinariamente elevadas. Desde el punto de vista aplicado y a parte de la consideración hecha sobre el tamaño de los ferment ferm entado adores, res, el efe efecto cto de la pres presión ión sobre el crec crecim imient ientoo de los mi microo croorgan rganism ismos os tie tiene ne importancia en el desarrollo de sistemas de eliminación de microorganismos en alimentos median med iante te altas altas pres presion iones es y en la con consid siderac eración ión de los mi microo croorgan rganism ismos os que part partici icipan pan en  procesos en los que aumenta la presión pr esión tales como la fabricación de vinos espu espumosos. mosos.

 

METABOLISMO MICROBIANO: 1.- Introducción Llamamos metabolismo al conjunto de reacciones de un organismo. Para los microorganismos con los que vamos a trabajar, normalmente quimiohetero-(organo)-trofos, podemos hacer el siguiente esquema general del metabolismo:

Los microorganismos microorganismos son sistem sistemas as que necesitan una gran cantidad de energía para mantenerse ordenados. Esta energía se obtiene de la oxidación de compuestos orgánicos reducidos. Los nutrientes proporcionan esos compuestos reducidos y, en el curso de la oxidación, se libera energía (que se acumula en forma de moléculas almacenadoras de energía, especialmente el ATP) y se producen elementos estruct estructurales urales que servirán para la construcci construcción ón de nuevas células células (crecimiento y diferenciación). Al proceso por el que se obtiene energía y eleme elementos ntos estructura estructurales les básicos a partir partir de nutrientes nutrientes se le denomina catabolismo y al que utiliza la energía obtenida en el catabolismo para sintetizar  nuevos componentes celulares se le denomina anabolismo. Es importante tener en cuenta que aunque estudie de forma anabolismo el produciendo catabolismo, elementos ambos tipos de procesosy ocurren se simultáneamente deseparada forma queel conforme se yvan estructurales energía en el catabolismo, esos elementos se usan para formar nuevos componentes celulares en  procesos anabólicos. A los productos metabólicos generados durante el catabolismo y el anabolismo que tiene lugar  durante el crecimiento (trofofase) se les denomina metabolitos primarios y su producción es  paralela al crecimiento celular. Por el contrario, los productos metabólicos que se acumulan cuando no hay crecimiento sino diferenciación celular (idiofase), se les denomina metabolitos secundarios. secunda rios. En general general,, puede decirse que los metaboli metabolitos tos secundarios se producen después de que se han producido los primarios; aunque en ciertas condiciones (como en cultivo continuo) se  pueden producir simultáneamente. Es conveniente considerar el metabolismo como un flujo de materia reducida que puede oxidarse  para la producción de energía o utilizarse para la biosíntesis de nuevos elementos estructurales.

 

 No todo el carbono presente en los nutrientes va a oxidarse completamente ya que parte se utilizará para sintetizar nueva biomasa. Por otra parte, no todo el carbono de los nutrientes se utiliza para la producción de biomasa y, por consiguiente, el rendimiento (medido tal y como se describió en otro apartado de estas notas) es siempre inferior a la unidad (en torno al 50% en muchos casos). La oxidación de los nutrient nutrientes es consiste consiste en la captación captación de electrones electrones de un compuesto reducido  por parte de un agente oxidante que llamaremos aceptor final de electrones electrones.. Este aceptor final 0  puede ser inorgánico: oxígeno (con ∆G `= -237 kJ) o NO3 (con ∆G0`= -163 kJ); o compuestos orgánicos tales como el fumarato (con ∆G0`= -86 kJ). Cuanto más negativo sea el valor de ∆G0`, mayor cantidad de energía se podrá obtener de la oxidación oxidac ión y más eficient eficientee será el proceso. Por esto, puede verse verse que la oxidación oxidación en la que el aceptor final de electrones es el O 2 es la que más rendimiento de producción de energía permite. En las páginas siguientes vamos a seguir el proceso de oxidación biológica de una molécula reducida reduci da señalando los pasos en los que se produce la liberaci liberación ón de energía. energía. El esquem esquemaa general del metabolismo se construye en torno al proceso de oxidación de la glucosa. La ecuación general de oxidación de la glucosa es la siguiente: C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O

G0`= -1330 kJ/mol

∆

En el proceso de oxidación biológica de la glucosa, los productos finales (CO 2, H2O y la energía) se prod produc ucen en en si sittio ioss di dife fere rent ntes es en la cé céllul ula: a: el CO2 se pr prod oduc ucee en re reac acci cion ones es de descarboxilaci descarbo xilación, ón, mientras que el H 2O y la energía se produce producenn principalmente principalmente en la membrana celular celul ar como resultado de la cadena transpo transportadora rtadora de electron electrones es y de la actividad de la ATPasa de membrana. 2.- Catabolismo de la glucosa (glucolisis) El catabolismo de la glucosa (compuesto de seis carbonos al que nos referiremos como C 6) puede ocurrir por cuatro vías diferentes: (1) Ruta de Embden-Meyerhof  (EM). Es la más común en todo tipo de organismos incluyendo hongos filamentosos, levaduras y muchos tipos de bacterias. Esta ruta puede funcionar tanto en condiciones aerobias como en anaerobias y se lleva a cabo por una serie de 10 enzimas ci cito topl plásm ásmic icas as.. La ma mayo yorí ríaa de lo loss pa pasos sos de la ruta ruta so sonn revers reversib ible les, s, aunqu aunquee hay tr tres es (l (los os catali cat alizad zados os por las enzimas enzimas hexoqui hexoquinasa nasa,, fosf fosfofru ofructo ctoqui quinasa nasa y piruvat piruvatoo quinasa quinasa)) que son irreversibles. En los procesos anabólicos hay unos desvíos metabólicos para evitar estos pasos irreversibles. El resultado de la ruta EM es el siguiente: Glucosa (C6) + 2ADP + 2NAD+ → piruvato (C3) + 2ATP + 2NADH + 2H+  Como resultado resultado de esta ruta se obtiene una pequeña cantida cantidadd de energía energía (dos moles de ATP por  mol de glucosa) por procesos de fosforilación a nivel de substrato, se obtienen dos moles de

 

 NAD reducido (NADH+ H+) y se ha logrado una oxidación parcial del carbono de la glucosa  para producir como metabolito final dos moles de piruvato p iruvato por mol de glucosa catabolizada. (2) Ruta de las Pentosas Fosfato  (PF). Esta ruta está presente en muchas bacterias y en la mayoría de los eucariontes. En muchos casos se lleva a cabo simultáneamente a la ruta EM descrita antes. Por ejemplo: en levaduras, entre el 10 y el 20% de la glucosa se metaboliza por la ruta PF (el porcentaje puede ser aún mayor en condiciones de crecimiento rápido) y el resto por  la EM. La ruta PF funciona en condiciones aerobias y anaerobias y tiene importancia en procesos ca cata taból bólic icos os y en ana anabó bóli lico coss ta tale less com comoo en la sí sínt ntes esis is de nucle nucleót ótid idos os y de amin aminoác oácid idos os aromáticos. La ecuación general de la ruta PF es la siguiente: 3 Glucosa Glucosa-6-fosfat -6-fosfatoo (C6) + 6NADP+    H2O→fructosa-6-fosfato (C6) + gliceraldehido-3-fosfato + (C3) + 3CO2 + 6NADPH + 6H   Como resultado, resultado, no se produce energía, energía, aunque sí ocurren una descarboxila descarboxilación. ción. La fructosa-6fructosa-6fosfato y el gliceraldehido-3-fosfato son intermediarios comunes de las rutas EM y PF. Por  último, los seis moles de NADPH+ H + producidos en la ecuación se usan como "poder reductor" en procesos anabólicos. (3) (E (ED) D).. Es un unaa ru ruta tasonus usad adaa po porr Gramnegativas un nú núm mer eroo re redu duci cido do de Ruta de Etner-D Etn er-Doud oudorof microorganismos carentes deoroff  la f ruta EM. La mayoría bacterias tales como  Pseudomonas, Rhizobium, Xhantomonas, Azotobacter y Zymomonas. La ruta ED es muy rara en hongos. El resultado general de la ruta ED es el siguiente: Glucosa (C6) + ADP + NAD+ + NADP+ → piruvato (C3) + ATP + NADH + NADPH + 2H+ Como puede verse, el rendimiento energético es menor que en la ruta EM. (4) Ruta de la Fosfocetolasa o de Warburg-Dickens (WD).Es la ruta que siguen ciertas bacterias lácticas (especialmente  Lactobacillus y  Leuconostoc). Se puede considerar una variante de la ruta de las PF puesto que se forma un azucar C 5 y, po porr co consi nsigui guien ente te,, ti tien enee lu luga garr un unaa descarboxilación. sin embargo, en la ruta WD, la enzima fosfocetolasa rompe el azúcar C5 y da lugar a dos ramas que condicen a la formación de lactato y etanol en un proceso de fermentación heteroláctica. El metabolito final más relevante de esta primera fase del catabolismo de la glucosa es el ácido  pirúvico (piruvato) que se forma en las rutas EM, ED y PF (en esta ruta, tal y como se ha de descr scrit ito, o, se for forma mann in inte term rmed edia iario rioss qu quee pue puede denn co condu nduci cirr a la forma formaci ción ón de pi piruv ruvat ato). o). El metabolismo central continúa, pues, con el catabolismo del piruvato.

 

PROCESOS METABÓLICOS FERMENTATIVOS FERMENTATIVOS 1.- Concepto de fermentación La palabra «fermentación» es confusa en Microbiología porque con ella se hace referencia a cuatro tipos de procesos diferentes: el metabolismo microbiano en ausencia de oxígeno, la  producción de metabolitos secundarios, la modificación compuestos microorganismos en crecimiento y el crecimiento bacteriano en sídecuando el interésquímicos del cultivopor  es la producción de biomasa. El sentido en que vamos a utilizarla en estas notas es el primero: fermentación es el proceso por el que las células pueden obtener energía sin llevar a cabo un  proceso de fosforilación oxidativa.

Esto es: En la fermentación, la energía se obtiene mediante un proceso químico de fosforilación a nivel de substrato sin que se produzca una variación neta del poder reductor de la célula. Los primeros estudios científicos serios sobre procesos de fermentación se llevaron a cabo por  Past Pa steur eur en el aná análi lisi siss de lo loss proce procesos sos de pr produ oducc cció iónn y al alte terac ració iónn de dell al alcoh cohol ol duran durante te la fabricación del vino. Los procesos de fermentación son universales; esto es: se encuentran en todo tipo de organismos y, por consiguiente, probablemente represente una de las formas más antiguas de conservación de la energía.

1.1.- Diferencias entre fermentación y respiración: En los los proce proceso soss de ferme ferment ntaci ación ón la en energ ergía ía qu quím ímic icaa ta tamb mbié iénn deriv derivaa de la ox oxid idac ació iónn de compuestos reducidos. En cualquier proceso de oxidación se produce una transferencia de electrones desde el compuesto reducido que se oxida hasta el compuesto oxidado que se reduce, y en esa transferencia de electrones se produce la liberación de energía. En los procesos oxidativos oxidat ivos el aceptor final de los electro electrones nes de la oxidaci oxidación ón es el oxígeno o, de una manera más general, cualquier compuesto inorgánico oxidado. Sin embargo, en los procesos fermentativos, la transferencia de electrones se produce hasta llegar a un aceptor final que es un compuesto orgánico oxidado. Por consiguiente, en un proceso de fermentación tanto el donador de electrones como el aceptor  son com compue puest stos os or orgán gánic icos, os, mi mien entr tras as qu quee en un proce proceso so de re respi spira raci ción ón el donad donador or de lo loss electrones es orgánico y el aceptor inorgánico. Otra manera de plantear el mismo proceso es considerar que en un proceso de respiración el aceptor final de electrones es siempre externo mientras que en un proceso de fermentación el aceptor final es interno. La respiración es mucho más efectiva energéticamente que la fermentación porque en aquélla la oxidación del compuesto orgánico es más completa que en esta y, como resultado de ello, se liberan 688 kcal/mol ( ∆Go) en la respiración de glucosa y sólo 58 kcal/mol en la fermentación. (Estos valores hay que considerarlos a la luz de la necesidad de 7.3 kcal/mol para la síntesis de ATP). Las rutas fermentativas son anaerobias porque no requieren oxígeno como aceptor final de los electrones. Esto de no los quiere decir que en ausencia de oxígeno inorgánico sólo se pueda producir el aceptor final electrones puede ser un compuesto oxidado quefermentación: los reciba al

 

final de la cadena respiratoria produciéndose un proceso de fosforilación oxidativa en ausencia de oxígeno. En estos procesos decimos que los microorganismos son capaces de respirar otras moléculas diferentes al oxigeno como son los nitratos (NO 3--) y llos os sulfatos sulfatos (SO4=).

2.- Rutas fermentativas para la utilización del piruvato En la oxidación de un mol de glucosa a piruvato se producen en total 2 moles de ATP como rendimiento rendim iento neto (se producen 4 moles de ATP y se consumen dos) y se genera también también un mol + de NADH+H . Cuando se produce la entrada en el ciclo de Krebs del piruvato se va a generar  una gran cantidad de NADH+H + que se reox reoxida ida princi principalm palment entee median mediante te la fosfori fosforilac lación ión oxidativa. Cuando una célula carece de cadena respiratoria, el NADH+H+ no puede reoxidarse a NAD + y,  por consiguiente, no se puede regenerar el agente aceptor de hidrógeno necesario para las  primeras fases de la glicolisis. Los procesos fermentativos reducen el piruvato regenerando el  NAD+ necesario para los procesos metabólicos iniciales del catabolismo de la glucosa. Diferentes tipos de bacterias reducen el piruvato de maneras diversas dando lugar a distintos  procesos de fermentación que se conocen por sus prod productos uctos finales.

2.1.- Fermentación Etanólica o alcohólica : En esta, el piruvato se reduce para formar etanol y CO 2: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi → 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP Este es el proceso de fermentación que lleva a cabo Saccharomyces cerevisiae y algunas (pocas)  bacterias. Su importancia industrial es evidente: la fermentación alcohólica produce el alcohol presente en las bebidas fermentadas (vino, cerveza, etc.) y el CO2 que se libera en esta fermentación es el causante del esponjamiento de la masa de pan durante su fermentación. En este último caso el  proceso de cocción posterior durante la fabricación permite eliminar todo el alcohol de manera que no queda presente en el producto final.

2.2.- Fermentación homoláctica: Se denomina así la fermentación cuyo único producto final es el ácido láctico. Su ecuación global es: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi → 2 ácido láctico + 2 ATP Estas bacterias producen el piruvato por catabolismo de la glucosa siguiendo la ruta de EmbdenMeyerhof Meyerh of (vía glucolítica glucolítica clásica). Es un proceso de fermen fermentación tación presente en muchas bacteria bacteriass del grup grupoo lác láctic tico: o: Streptococcus (gru (grupo po de ent entero erococo cocos), s),  Pediococcus y varios grupos de  Lactobacillus.

 

Su importancia industrial estriba en la bajada del pH de los productos donde se encuentran estas  bacterias: esta bajada del pH como consecuencia de la liberación de ácido láctico es suficiente  para producir unos cambios químicos en el producto (precipitación de proteínas durante el cuajado de la leche), cambios microbiológico (protección del deterioro microbiano de alimentos como consecuencia de la eliminación de la flora competidora) y organolépticos (los ácidos orgánicos de cadena corta, y entre ellos el ácido láctico tienen características de producción de sabor) que hacen de esta fermentación un proceso muy relevante en la producción de alimentos. La fermentación homoláctica es la causante de las agujetas (Sensacion de pinchadas) producidas en los músculos después de un esfuerzo intenso en el que la cantidad de oxígeno aportada a las fibras musculares no es suficiente para asegurar toda la reoxidación del NADH+H +. Las agujetas se prod producen ucen por los depósi depósitos tos de áci ácido do láctic lácticoo entre entre las fibras fibras muscul musculares ares.. Asimis Asimismo, mo, la fermentación ferment ación homoláct homoláctica ica es responsab responsable le de la alteración del esmalte dental en la boca causado  por bacterias láctica (flora habitual).

2.3.- Fermentación heteroláctica: Denominada así porque su producto final no es exclusivamente ácido láctico. El proceso tiene un rendimiento menor al de la fermentación homoláctica como se desprende de la producción de sólo un mol de ATP por mol de glucosa fermentada. La obtención del piruvato en estas bacterias se logra mediante el catabolismo de la glucosa por la ruta de las pentosas. La reacción global es: Glucosa + ADP + Pi → Ac. láctico + etanol + CO2 + ATP Es Este te pro proce ceso so lo ll lleva evann a ca cabo bo ba bact cter eria iass del gru grupo po lá láct ctic icoo pe pert rten enec ecie ient ntes es a lo loss género géneross  Leuconostoc y  Lactobacillus. Industrialmente el proceso es relevante en la producción de alimentos fermentados (por ejemplo el sauerkraut). Otra bacteria productora de este tipo de fermentación es Lactobacillus acidophilus que facilita el metabolismo de la leche.

2.4.- Fermentación del ácido propiónico: Las bacterias que presentan este tipo de fermentación se pueden utilizar tanto azúcares como lactato como puntos de partida para el proceso. La ruta es un proceso complejo en el que se genera acetato, CO2 y ácido propiónico como productos finales. Esta ruta fermentativa la presentan las bacterias del tipo  Propionibacterium y otras anaerobias estrictas presentes en el rumen de herbívoros donde llevan a cabo una fermentación secundaria de los productos de las fermentaciones lácticas primarias. Industrialmente  Propionibacterium es importante en la fermentación del queso para producir el tipo tipo sui suizo: zo: la fer ferme menta ntaci ción ón pro propi pión ónic icaa ut util iliz izaa en es este te ca caso so el la lact ctat atoo produc producid idoo en la lass fermentaciones lácticas primarias produciendo CO2 responsable de los «ojos» del queso suizo y acumulación de ácidos orgánicos de cadena corta responsables de características organolépticas.

2.5.- Fermentación ácido-mixta:

 

La fermentación ácido mixta produce ácido acético, etanol, H 2 ,CO2 y proporciones diferentes de ácido láctico o propiónico (fórmico) según las especies. Es un tipo de fermentación que llevan a cabo las enterobacterias. En esta ruta de fermentación se produce ATP además de la reoxidación del NADH+H+. La producción de formiato o CO2 + H2 depende de la presencia en la bacteria de una enzima denominada denomi nada formiato-l formiato-liasa iasa responsabl responsablee del paso. No todas las bacterias la tienen tienen y su actividad es detectable por la producción de grandes cantidades de gas (el H 2 es insolu insoluble ble)) como como consecuencia de la fermentación del azúcar.

2.6.- Fermentación butanodiólica: Es una variante de la anterior presente en algunas enterobacterias como  Klebsiella, Serratia y  Erwinia, especie en la que se da una fermentación ácida mixta butanodiólica. En esta ruta se desprende CO2 y se logra como producto final el 2.3-butanodiol. Como paso intermedio de la ruta se produce acetoína que puede servir para la identificación de las bacterias que presentan reacción n de Voges-P Voges-Prosk roskaue auer  r  que per esta ruta mediante la reacció permit mitee disting distinguir uir bacter bacterias ias muy semejantes como Escherichia y Enterobacter.

2.7.- Fermentación del butanol: Es un tipo tipo de ferm fermen enta taci ción ón ll lleva evado do a ca cabo bo po porr bacte bacteri rias as an anaer aerobi obias as estri estrict ctas as del gé géne nero ro Clostridium. En el curso de esta fermentación se producen compuestos orgánicos orgánicos disolventes disolventes de gran importancia industrial y que, históricamente, han sido los primeros productos industriales  bacterianos de importancia económica relevante durante la 1ª Guerra Mundial (trabajo de Weizmann). 3.- Rutas fermentativas de utilización de aminoácidos En algunas bacterias del género Clostridium se producen procesos acoplados de oxidación de aminoácidos con el objeto de producción de energía. Como en estos procesos no se utiliza ningún aceptor externo de los electrones de la oxidación, (el aceptor es el segundo aminoácido de la pareja) técnicamente constituyen procesos de fermentación de aminoácidos, en los que se llega a la desaminación y descarboxilación de los aminoácidos que intervienen en la pareja. El ejemplo más representativo es la desaminación y descarboxilación oxidativa de la alanina a acetato, acoplada con la desaminación reductiva de la glicina en el proceso conocido como reacción de Stickland.

4.- Conclusión Los procesos de fermentación, en sentido metabólico, son aquellos en los que se produce una oxidación de compuestos orgánicos reducidos siendo el aceptor final de electrones un compuesto or orgán gánic icoo inte interno rno qu quee se red reduce uce.. En est estos os proce procesos sos puede puede pro produc ducir irse se al algú gúnn re rendi ndimi mien ento to + energético; pero su principal función es la reoxidación del NADH+H a NAD necesario para  poder iniciar los primeros pasos del catabolismo. Los diferentes procesos pueden identificarse  por sus productos finales.

 

EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA 1.- Ciclo del material genético El material genético de cualquier organismo (procarionte o eucarionte) está sometido a una serie de procesos cíclicos que aseguran la realización de sus dos funciones esenciales: (1) La transmisión entre generaciones de la información genética con fidelidad y (2) La expresión de ésa información genética con precisión para que pueda cumplir la misión

 para la que ha sido seleccionada. Por consiguiente, el ciclo del material genético comprende tres procesos: (1) Re Repl plic icac ació iónn

del del ma mate teri rial al ge gené néti tico co para para su tr tran ansm smis isió iónn en co copi pias as id idén énti tica cass a la descendencia, (2) Transcripción del material genético que se transmite entre generaciones para sintetizar el material genético que asegura la expresión de la información en la célula y (3) Traducción de la información genética de la forma de ácido nucleico a la forma de  proteínas. Estos tres procesos ocurren independientemente de cuál sea la molécula transmisora principal de la información genética entre generaciones (ADN en la mayoría de los casos y ARN en el caso de los virus de ARN) y son esencialmente iguales en procariontes y en eucariontes.

1.1.- Replicación:  La replicación replicación del materi material al genético es un proceso complejo en el que participa participa un gran número de proteínas que reconocen la molécula de material genético y llevan a cabo la polimerización de otras moléculas complementarias cada una de sus hebras de forma que, al final, se logra disponer  de dos moléculas idénticas (salvo errores denominados mutaciones) a la inicial. El proceso  presenta ciertas diferencias según el material genético que se transmite entre generaciones sea ADN o A RN y, en el primer caso, si el organismo es eucarionte o procarionte. 1.1. 1.- Replicación del ADN procariótico. En este proceso interviene un grupo de enzimas conocido genéricamente como ADN polimerasa. Este complejo multienzimático va incorporando nucleótidos a la cadena que se va sintetizando utilizando como molde una de las hebras de la cadena antigua. Esta polimerización se produce añadiendo nuevos nucleótidos al extremo 3' de una hebra de ADN en crecimiento. Por ello se dice que la síntesis del ADN se produce en dirección 5'