Microbiología Enológica - Fermentaciones (FA y FML)

Fermentación

Microorganismos relacionados con el vino

Las levaduras

son las encargadas de realizar la l a Fermentación Alcohólica (F.A.)

Las bacterias lácticas

llevan a cabo la Fermentación Malo-Láctica Malo- Láctica (F.M.L)

Las bacterias acéticas

 junto con algunas levaduras y algunas bacterias lácticas son causantes de alteraciones en los vinos.

Los mohos

algunas de cuyas especies pueden desarrollarse sobre la uva y en las vides causando mermas importantes en la cantidad y en la calidad de la uva.

Botrytis cinerea, conocido como el moho gris. 

Es uno de los hongos patógenos con mayores consecuencias para las plantas.

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Crea formas de resistencia Tiene la capacidad de permanecer latente durante mucho tiempo y esperar a que las condiciones ambientales sean adecuadas para germinar. Sus esporas pueden ser transportadas por la lluvia y el viento.

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Es capaz de atacar al cultivo prácticamente en cualquier etapa de la producción. Las pérdidas económicas por este hongo son altísimas, especialmente en la viticultura

Si después de la infección de uvas maduras por Botrytis,  en condiciones de mucha humedad, éstas quedan expuestas a condiciones más secas, se produce este tipo de vinos dulces particularmente finos y concentrados (igual que las pasas)

¿Qué se hace? Básicamente deshidratar las uvas (proporcionarle un estrés hídrico) y que la vid acumule azúcares (respuesta de la planta a la sequía). Algunos de los mejores vinos botritizados son literalmente recogidos uva a uva en distintos momentos de selección. La infección en este caso, le da calidad a la uva. La principal diferencia entre estos vinos botritizados y otros vinos dulces, está en el amplio rango y riqueza de los compuestos aromáticos que aporta Botrytis.

Según los entendidos, suelen caracterizarse por un sabor a albaricoque, pera, membrillo, pasas y miel. Esta infección “benévola” causada por Botrytis, es lo que se conoce como “PODREDUMBRE NOBLE”.

LAS LEVADURAS  Son hongos unicelulares (Eucariotas)  Pertenecientes en su mayor parte al grupo de los Ascomicetos (grupo de hongos capaces de formar esporas contenidas en el interior de un asca).  Se hallan diseminadas por toda la naturaleza  Llegan a la uva por el viento y los insectos siendo retenidas en la pruina, una sustancia cérea que recubre la piel de la uva Morfología (criterio de clasificación e identificación) Vistas al microscopio las distintas especies presentan formas muy variadas.    

Elípticas, como las especies del género Saccharomyces Esféricas, como Torula Alargadas, como Torulopsis stellata Apiculadas (con forma de limón) como Hanseniaspora

Reproducción (criterio de clasificación e identificación)  puede ser vegetativa (asexual) por gemación generalmente o por escisión  Cuando las condiciones son adversas la mayor parte de las levaduras pueden reproducirse sexualmente generando ascosporas.

características bioquímicas (criterio de clasificación e identificación)  El tipo de azúcares que pueden fermentar.  El rendimiento en alcohol, algunas para producir 1 grado de alcohol consumen de 17 a 18 g de azúcar, otras en cambio con menor rendimiento metabolizan de 21 a 22 g.  Su poder alcohológeno, o grado máximo de alcohol que pueden alcanzar, algunas detienen su actividad a los 5% vol. mientras que otras llegan a 17 o 18% vol.  Productos secundarios de la fermentación.  Resistencia al anhídrido sulfuroso.  Capacidad para asimilar diferentes sustancias nitrogenadas. La clasificación de las levaduras es compleja y complicada aunque el desarrollo de nuevas técnicas clasificatorias basadas en la Biología Molecular, particularmente en el análisis de secuencias de ADN, ha permitido separar o reagrupar las especies

ESPECIES ESPORÓGENAS DE MAYOR RELEVANCIA ENOLOGICA Saccharomyces cerevisiae (S. ellipsoideus) es una de las más importantes en enología ya que es la responsable de la fermentación de la mayor parte de los azúcares del mosto. Su poder alcohológeno es elevado (17º) y es bastante resistente al SO2 (250 mg/L). Saccharomyces bayanus (S. oviformis), semejante a la anterior resiste también 250 mg de SO2 /L, pero su poder alcohológeno es mayor pudiendo superar los 18º. Es la levadura típica de las etapas finales de la fermentación y a menudo la responsable de refermentaciones de vinos embotellados. Saccharomyces acidifaciens (S. baillii), con un poder alcohológeno de tan solo 10º, su principal característica es su elevada resistencia al SO2 (250 a 400 mg/L) lo que le permite iniciar la fermentación en mostos muy sulfitados, comportándose en estos casos como levadura de primera fase. Torulaspora rosei (S. rosei) tiene un poder alcohológeno de 8 a 14º y su principal característica es su capacidad para fermentar lentamente los azúcares con lo que los niveles de acidez volátil producidos son menores.

ESPECIES NO ESPORÓGENAS (ASPORÓGENAS) DE MAYOR RELEVANCIA ENOLOGICA

Kloeckera apiculata, es la forma imperfecta o haploide de Hanseniaspora uvarum. Junto con S. cerevisiae es la levadura más frecuentemente encontrada en los mostos. Su poder alcohológeno es muy bajo (4-5º) y también lo es su rendimiento en alcohol (21 a 22 g de azúcar/1º de alcohol). Produce mucha acidez volátil por lo que no es deseable en las fermentaciones. Se la elimina fácilmente con el sulfitado dada su baja resistencia al SO2.

Candida stellata (Torulopsis stellata, T. bacillaris) tiene un poder alcohológeno de 10 a 11º y se caracteriza fundamentalmente por aparecer con más frecuencia en mostos de uvas atacadas de podredumbre.

Saccharomyces Cereviciae en Fermentación Temperatura   

La temperatura afecta la capacidad de desdoblar los azucares, la reproducción y el crecimiento celular T. mínimas de 0.3 y 0.5°C T. máximas entre 34 y 47ºC

pH  Cambios en el pH son causantes de la desnaturalización de enzimas y de problemas en el intercambio de iones en la Membrana celular.  En la fermentación de levaduras los valores de pH entre 3 y 6 generalmente favorecen el crecimiento y la actividad fermentativa Aireación y Agitación 

La actividad celular, la secreción de enzimas y la velocidad de fermentación al inicio del proceso, dependen estrechamente de las condiciones de aireación y agitación

LAS BACTERIAS LÁCTICAS  Bacterias cocoides o bacilares inmóviles, GRAM +.  En preparaciones para el microscopio aparecen aisladas o formando cadenas de cocos o de bacilos.  Hábitats muy variados:  Flora normal de la superficie de material vegetal (frutas y verduras)  Alimentos ricos en azúcares  Leche y derivados  Tracto naso-faríngeo (donde viven algunas especies patógenas) y gastrointestinal.  Obtienen energía exclusivamente por fermentación de azúcares  Carecen de ciclo de Krebs funcional  El rendimiento de su cultivo es muy bajo: forman colonias muy pequeñas. una gran cantidad de factores nutritivos (aminoácidos, bases  Requieren nitrogenadas, vitaminas): tienen posibilidades anabólicas muy limitadas, lo que reduce el rendimiento de su crecimiento.  Toleran bien concentraciones relativamente altas de ácidos y valores de pH más bajos que el resto de las bacterias por lo que pueden desplazarlas de los hábitats que colonizan.  Anaerobios aerotolerantes.  Bacterias muy importantes en la producción de alimentos fermentados y en el deterioro

Especies más frecuentes  Sólo 4 géneros son capaces de sobrevivir en las condiciones del vino:  Oenococcus  Lactobacillus  Pediococcus  Leuconostoc Pero sólo Pero sólo Oenococcus oeni soporta pH < 3,5 El número de bacterias lácticas durante la fermentación alcohólica normalmente es muy bajo, como mucho 102  cel/mL, ya que la mayoría son inhibidas por el etanol y por el SO2  añadido al mosto para controlar la población bacteriana, especialmente las acéticas..

Cuando la fermentación alcohólica termina y las levaduras mueren, algunas bacterias lácticas pueden prosperar y conseguir un cierto crecimiento, en ocasiones, hasta 107 cel/mL. Estas bacterias lácticas producen algunas transformaciones en el vino, de las cuales la más interesante es la llamada fermentación maloláctica (FML).

Metabolismo de las Bacterias Lácticas Homofermentativo Azúcares

ác. Láctico y CO2

(Esto ocurre a través de la glucólisis) Glucosa

Piruvato

ác. Láctico y CO2

Los géneros con estas características bioquímicas son Pediococcus y algunos Lactobacillus

Heterofermentativo Azúcares ác. Cítrico Ác Láctico

ác. Láctico, etanol, glicerol, ác. acético, manitol y CO2 ác. Acético, CO2, ác Láctico

(A través de la vía de las pentosa fosfato para degradar hexosas y pentosas)

Los géneros con estas características bioquímicas Oenococcus, Leuonostoc y algunos Lactobacillus

Bioquímica de la fermentación maloláctica 

El papel más beneficioso conocido de las bacterias lácticas en los vinos es la FML, que da lugar a una desacidificación del vino.

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El mosto de la mayoría de las uvas, excepto los de climas muy cálidos, contiene una cierta cantidad de ácido L-málico (1-5 g/L), que tiene un sabor fuerte y áspero.

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 las bacterias lácticas como O. oeni pueden realizar esta FML normalmente después de la fermentación alcohólica, si bien muy ocasionalmente de forma simultánea a esta.

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La FML es la descarboxilación del L-málico en L-láctico, con desprendimiento de CO2 que aparece como pequeñas burbujas en el vino.

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Esta reacción es llevada a cabo porque dichas bacterias tienen la enzima maloláctica, que requiere Mn++ y NAD+

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Como el málico es dicarboxílico y el láctico es monocarboxílico, esto conlleva una

Conversión de L-málico a L-láctico y CO2 por el enzima maloláctico (EML) de células de bacterias lácticas como Oenococcus oeni

¿Qué es la FML? Desde el punto de vista metabólico, la FML no es una fermentación clásica como la misma láctica donde se utilizan azúcares como sustratos y obtienen ATP por fosforilación a nivel de sustrato en las reacciones de la glucólisis. La FML solamente es una descarboxilación que no parece que conlleve, en principio, ningún beneficio energético a las células que la realizan, y donde el único beneficio aparente sería la subida del pH externo. Sin embargo, se ha descubierto que la FML es una de las fermentaciones peculiares con ATP sintasa, ya que la salida del L-láctico de las células se efectúa mediante un simport con protones, y que paralelamente hay una entrada de protones a favor de gradiente (el pH externo es 3-4 y el interior es superior a 6), mediante una ATP sintasa, que lo acopla a la síntesis del ATP.

Así pues, O. oeni puede obtener algunos ATP por la descarboxilación del málico en un medio como el vino donde prácticamente no hay azúcares. Estos ATP, junto con algunos nutrientes remanentes de los restos de las levaduras, pueden permitir un ligero crecimiento de estas bacterias en el vino.

Desde el punto de vista enológico, esta desacidificación del vino conlleva al mismo tiempo una mejora en su calidad, al reducir la sensación de aspereza del málico. Además, el ácido L-láctico que aparece es más agradable y suave a la cata.

Otros aspectos beneficiosos del metabolismo de las bacterias lácticas en el vino Un aspecto interesante desde el punto de vista enológico consecuencia de la pequeña subida de pH de la FML es que el color  del vino tinto, debido sobre todo a los antocianos, evoluciona hacia tonalidades menos intensas y no tan rojas, lo que los hace más interesantes visualmente. Desde el punto de vista organoléptico, la FML conlleva una mejora del vino porque además de la desacidificación, el desarrollo de las bacterias provoca cambios en los contenidos de los diversos compuestos orgánicos del vino. Aparte del L-málico, el cítrico es otro importante ácido orgánico metabolizado por las bacterias lácticas del vino. Se ha comprobado que O. oeni,4 al igual que muchas otras bacterias, capta el citrato y lo metaboliza dando lugar a diversos compuestos:  el diacetilo se considera el más importante por su aroma a mantequilla o nata (aromas lácteos) que caracteriza a muchos vinos que han realizado la FML. Aparece en pequeñas concentraciones (hasta 2 mg/L) aunque tiene un umbral de detección sensorial muy bajo. Las bacterias lácticas del vino también pueden producir pequeñas cantidades de exopolisacáridos, que se unen con los taninos, responsables de la astringencia de los vinos jóvenes, con lo cual baja la astringencia y el vino se vuelve más agradable. Otro beneficio muy importante es la estabilidad microbiológica que se consigue con la FML. Agotan los nutrientes que pueden dar lugar a su desarrollo.

Metabolismo de Ácido Cítrico El metabolismo de los ácidos málico y cítrico depende de la etapa de crecimiento de las bacterias presentes. El metabolismo del ácido cítrico no se inicia hasta que se haya metabolizado más de la mitad del ácido málico. No hay degradación de ácido málico hasta que la población no alcanza 0,5 a 1 x 102 ufc/mL

Evolución del crecimiento bacteriano

Factores que influyen en el crecimiento bacteriano

pH

Temperatura

pH Mínimo pH = 3 ,1 Oenococcus resistente a pH3,5 Catabolismo pH 3,2 se degrada ác Málico