Microbiologia de Alimentos: Practica nº 13-Aislamiento e identificacion de Clostridium botulinum productora de toxina

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTIC A Nº 13 Aislamiento e Identificación de Clostridium botulinum Productora de Tox ina ASIGNATURA

: Microbiología de los Alimentos I

DOCENTE

: Dra. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO

: Rómulo Aycachi Inga

CICLO

: 2007 - II

Lambayeque, 03 de abril de 2008. 1

PRÁCTICA Nº 13

Aislamiento e Identificación de Clostridium botulinum Productora de Toxina I.

Introducción:

Clostridium botulinum es una bacteria Gram positiva, anaerobia, que se encuentra por lo general en microorganismos la tierra y es productora de laforma toxinade botulínica, causalmejor del botulismo. Estos que tienen varillas yelseagente desarrollan en condiciones de poco oxígeno. Las bacterias forman esporas que les permiten sobrevivir en un estado latente hasta ser expuestas a condiciones que puedan sostener su crecimiento. La espora es ovalada subterminal y deformante. Es móvil por flagelos peritricos, no produce cápsula y es proteolíco y lipolítico. Son miembros del género Clostridium, uno de los grupos más numerosos entre las formas Gram positivas. C. botulinum fue descubierto y aislada en 1896 por Emile van Ermengem. Hay siete tipos de toxinas botulínicas designadas por las letras A hasta la G; sólo los tipos A, B, E y F pueden causar enfermedad ( botulismo) en los seres humanos. Esta enfermedad es muy común en muchas partes del planeta. Las esporas de C. botulinum pueden sobrevivir en la mayoría de los ambientes y son difíciles de matar. Pueden sobrevivir temperaturas de ebullición del agua a nivel del mar, de modo que muchos enlatados son hervidos a altas presiones para obtener una mayor temperatura, suficiente para destruir las esporas. El botulismo es una enfermedad de declaración obligatoria. Puede aparecer en cualquier alimento de srcen animal y vegetal. En carnes y alimentos proteicos de baja acidez provoca, a veces, gas y olor desagradable. Con los ahumados y las especias se puede enmascarar el buen olor por el olor propio de dichos alimentos. El crecimiento de la bacteria puede ser prevenida con acidez, una alta concentración de azúcar disuelto, altos niveles de oxígeno o poca humedad. Por ejemplo, en baja acidez, vegetales enlatados como las judías verdes que no hayan sido calentadas lo suficiente para destruir las esporas, puede proveer un medio libre de oxígeno que le permita a las esporas crecer y producir la toxina. Por otro lado, los tomates que sean suficientemente ácidas para prevenir crecimientos, aún si las esporas estuviesen presentes, no presentan peligros para los consumidores. La miel, el jarabe de maíz y otros aditivos dulces pueden contener las esporas de C. botulinum, pero las esporas no pueden crecer en soluciones con tan altas concentraciones de azúcares; sin embargo, cuando el dulce es diluido en el ambiente de bajo oxígeno y baja concentración del jugo gástrico de un infante, las esporas pueden desarrollarse y producir la toxina. Tan pronto como los recién nacidos comienzen a consumir alimentos sólidos, el ácido gástrico se vuelve suficiente para permitir el crecimiento de la bacteria. En neonatos, la enfermedad puede ser secundaria a la colonización del colon por Clostridium botulinum. La neurotoxina de C. botulinum es una proteína de 150.000 daltons con una subunidad A (cadena ligera o A) con actividad neurotóxica y una subunidad B (cadena pesada o B) que protege a la neurotoxina de la acción de los ácidos gástricos. La toxina es ingerida junto con los alimentos, son absorbidas a nivel duodenal y actúan a nivel de las vesículas sinápticas colinérgicas impidiendo la liberación de acetilcolina. Como resultado de esta acción el paciente desarrolla parálisis fláccida, pudiendo morir por parálisis respiratoria.

2

II. -

III. -

IV. -

Objetivos: Determinar la presencia de la toxi na botulínica en muestras de con servas de pescado alterados. Aislar de muestras diversas a C. botulinicum. Familiares con los métodos realizados para la s eguridad alimentaria y conocer los peligros de la toxina en alimentos. Materiales: Medios de cultivo: Muestra: Latas de atún abombadas, chancadas o abolladas Ratones de Laboratorio Triturador mecánico Baño María

-

Tubos de dilución con tapa rosca Mechero bunsen Pipetas Frascos estériles Gradillas Centrifuga Agujas hipodérmicas

Procedimiento: Prueba exploratoria de presencia de la toxina: Triturar u homogenizar el alimento (muestra). o Poner en el tubo de dilución con tapa rosca muestra a igual al peso de la o solución salina a utilizar (dilución 1/1). Centrifugar el homogenizado a alta velocidad, preferentemente en o o

o

o

o

o o

o

centrífuga refrigerada (se tendrán dos tubos, sea, dos muestras). Cogemos uno de los tubos centrifugados y loo sometemos a baño María por 10 min. (agua hervida). Del contenido, inyectamos 0.5 mL al ratón de prueba, esto con aguja de tuberculina (Nº 25), vía intraperitoneal. Del otro tubo centrifugado (al que no se le calienta), se le inyectará (a otro ratón de prueba), la misma cantidad de inóculo y por la misma vía. Se recomienda que antes de inyectarle el sobrenadante sospechoso a los ratones se le debe inocular la antitoxina (en este caso, por carecer de ella, no se hizo). Observar por los sgtes. 4 días. La positividad de la prueba se comprueba por la parálisis motora progresiva, esto es, abdomen contraído, respiración dificultosa , arrastre de las patas, debilidad en aumento. La presencia de la Toxina E causa una muerte mucho más rápida (en menos de 24 h.).

3

-

Aislamiento (en alimentos): o Para el aislamiento usamos medios enriquecidos como el de carne cocida (medio Roberson) o el medio tripticasa-glucosa (ATG). o En tubos de dilución con tapa rosca colocamos 10 mL del medio a usar (este estará previamente calentado, por lo tanto semilíquido). o Previamente en cada tubo hemos agregado un poco de la muestra y luego agregamos en cada tubo el ATG semilíquido calentado previamente. Luego sometemos los tres tubos a temperaturas diferentes: o  El primer tubo no se calienta.  El segundo tubo lo calentamos en baño María a 60 ºC por 10 min.  El tercer tubo lo calentamos a 80 ºC por 30 min. o Luego, incubamos los tubos por tres a 4 días en Jarra de Brewer o

V. -

(anaerobiosis). Se podrá observar (si la muestra es positiva) la presencia de gas y resquebrajamiento del medio.

Resultados: En la Prueba Exploratoria de presencia de la Toxina, se inoculó al ratón albino la dosis indicada del sobrenadante sin calentar, se esperó la acción de ésta hasta el 4º día, pero no obtuvimos resultados, el ratón albino no murió, por lo que 4

podemos concluir que la muestra utilizada (conserva de atún) no presenta la toxina botulínica y lo más probable es que tampoco esté presente el propio C. botulinum.

-

En lo que respecta al aislamiento de C. botulinum, no se pudo llegar a aislar de la muestra de alimento utilizada (conserva de atún), aunque en algunos tubos se puedo observar una pequeña presencia de gas.

Pequeña presencia de gas

-

En el grupo de la otra mes a, la muestra tratada (conserva de atú n) mo stró resultados positivos, como presencia de gas de gas y resquebrajamiento del medio.

Gran presencia de gas

5

VI. -

Preguntas: ¿Qué pruebas bioquímicas se usa para identificar a C. botulinum? o

VII. -

-

Para identificar C. botulinum se realizarán las sgtes. Pruebas bioquímicas:  Utilización de carbohidratos: glucosa, sacarosa, lactosa, manosa, ribosa, arabinosa, adonitol, xilosa, trealosa, manitol.  Producción de lipasas y lecitinazas.  Indol.  Hidrólisis de la gelatina.

Referencias:

Wikipedia, La Enciclopedia Libre (2008) Clostridium botulinum. Obtenido el 15 de marzo de 2008 en http://es.wikipedia.org/wiki/Clostridium_botulinum Apuntes sobre bacteriología (2003) Clostridium perfringens y Clostridium botulinum. Obtenido el 15 de marzo de 2008 en http://www.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf BARILOCHE, E. 2002. Aislamiento y caracterización de cepas de Clostridium botulinum tipos C y D en el Brasil. Publicado en Revista de Med. Vet., Vol 83(2): 55-58 pp. Obtenido el 15 de marzo de 2008 en http://www.inta.gov.ar/bariloche/info/documentos/animal/salud/ct-417.pdf

6