DOCÊNCIA EM SAÚDE
MICROBIOLOGIA GERAL
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MIicrobiologia / Portal Educação. - Campo Grande: Portal Educação, 2012. 130p. : il. Inclui bibliografia ISBN 978-85-8241-073-8 1. Microbiologia. I. Portal Educação. II. Título. CDD 576
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO......................................................................................................................................7 1
QUISITOS
BÁSICOS
PARA
INSTALAÇÃO
E
FUNCIONAMENTO
DE
UM
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA ...............................................................................................9 2 1.1
BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO .................................................................................................9
1.2
REGRAS PRÁTICAS LABORATORIAIS ..............................................................................................14
1.3
GENCIAMENTO DAS BOAS PRÁTICAS ..............................................................................................14
1.4
ROTINA NOS LABORATÓRIOS........................................................................................................17
1.4.1 DESINFECÇÃO .............................................................................................................................17 1.4.2 ESTERILIZAÇÃO ...........................................................................................................................18 1.5
NORMAS DE SEGURANÇA NOS LABORATÓRIOS ...............................................................................19
1.5.1 RISCO FÍSICO ...............................................................................................................................20 1.5.2 RISCO QUÍMICO ............................................................................................................................20 1.5.3 RISCO BIOLÓGICO ........................................................................................................................21 1.5.4 RISCO AMBIENTAL........................................................................................................................21 1.5.5 RISCO ERGONÔMICO ....................................................................................................................21 1.5.6 PROTEÇÃO CONTRA INCÊNDIO.......................................................................................................21 1.6
SINALIZAÇÃO DE SEGURANÇA .......................................................................................................22
2
COLETA DE AMOSTRAS .........................................................................................................23
3
TRANSPORTE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS .......................................................................24
4
RECEPÇÃO DE AMOSTRAS E OBSERVAÇÕES PRELIMINARES ........................................26
4.1
CRITÉRIOS DE REJEIÇÃO DAS AMOSTRAS .........................................................................26
5
CULTIVO DE MICRO-ORGANISMOS ......................................................................................27
5.1
PREPARO DO MEIO DE CULTURA .........................................................................................27
5.2
ISOLAMENTO E OBTENÇÃO DE CULTURA PURA ................................................................27
6
MICROSCOPIA .........................................................................................................................29
7
PRINCIPAIS MÉTODOS DE COLORAÇÃO .............................................................................30 3
8
CONTROLE DE QUALIDADE ...................................................................................................34
9
BIOSSEGURANÇA ...................................................................................................................35
10
AS BACTÉRIAS ........................................................................................................................36
10.1 ESTRUTURA.................................................................................................................................36 10.2 TAXONOMIA: CLASSIFICAÇÃO, NOMENCLATURA E IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS .........................38 10.3 MORFOLOGIA ..............................................................................................................................38 10.4 CRESCIMENTO .............................................................................................................................39 10.5 FISIOLOGIA ..................................................................................................................................40 10.6 COLORAÇÃO ...............................................................................................................................40 10.7 ESPOROS ....................................................................................................................................40 10.8 SOROLOGIA .................................................................................................................................41 10.9 METABOLISMO .............................................................................................................................41 10.10 PATOGENICIDADE ........................................................................................................................41 11
ESTAFILOCOCOS ....................................................................................................................43
11.1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS .........................................................................................................44 11.2 STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ...................................................................................................45 11.3 STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS .............................................................................................46
12
ESTREPTOCOCOS ..................................................................................................................47
12.1 ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLÍTICOS ..........................................................................................47 12.2 ESTREPTOCOCOS ALFA-HEMOLÍTICOS ..........................................................................................49 12.3 ESTREPTOCOCOS GAMA-HEMOLÍTICOS (NÃO HEMOLÍTICOS) ..........................................................50 13
ENTEROCOCOS.......................................................................................................................51
14
NEISSERIAS .............................................................................................................................52 4
15
BACILOS ..................................................................................................................................54
15.1 GÊNERO CORYNEBACTERIUM.......................................................................................................60 15.2 GÊNERO BACILLUS ......................................................................................................................55 15.3 GÊNERO LISTERIA........................................................................................................................57 15.4 GÊNERO CLOSTRIDIUM .................................................................................................................57 15.5 GÊNERO MYCOBACTERIUM ...........................................................................................................59 15.6 GÊNERO ACTINOMYCES ...............................................................................................................60 15.7 GÊNERO NOCARDIA .....................................................................................................................60 16
ENTEROBACTERIACEAE .......................................................................................................62
16.1 GÊNERO ESCHERICHIA .................................................................................................................62 16.2 GÊNERO PROTEUS .......................................................................................................................63 16.3 GÊNEROS KLEBISIELA, SERRATIA E ENTEROBACTER .....................................................................63 17
SALMONELA, SHIGELA E PSEUDOMONAS ..........................................................................64
17.1 GÊNERO SALMONELLA .................................................................................................................64 17.2 GÊNERO SHIGELLA ......................................................................................................................64 17.3 GÊNERO PSEUDOMONAS ..............................................................................................................64 18
BACILOS GRAM NEGATIVOS CURVOS .................................................................................66
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OUTRAS BACTÉRIAS GRAM NEGATIVOS ANAERÓBIOS ...................................................67
20
BACTÉRIAS ESPIRALADAS ...................................................................................................69
21
MICOPLASMAS ........................................................................................................................71
22
RICKETTSIAE ...........................................................................................................................72
23
CULTURA BACTERIANA .........................................................................................................73
24
OS VÍRUS .................................................................................................................................83 5
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PARVOVÍRUS ..........................................................................................................................87
26
PAPILOMAVÍRUS .....................................................................................................................88
27
HERPESVÍRUS .........................................................................................................................89
28
ADENOVÍRUS ...........................................................................................................................90
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HEPADNAVÍRUS ......................................................................................................................91
30
POXVÍRUS ................................................................................................................................92
31
PICORNAVÍRUS .......................................................................................................................93
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ORTHOMYXOVÍRUS ................................................................................................................94
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PARAMYXOVÍRUS ...................................................................................................................95
34
TOGAVÍRUS .............................................................................................................................96
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RETROVÍRUS ...........................................................................................................................97
36
RHABDOVÍRUS ........................................................................................................................98
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ARENAVÍRUS ...........................................................................................................................99
38
REOVÍRUS ...............................................................................................................................100
39
CORONAVÍRUS .......................................................................................................................101
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PRÍONS (SCRAPIE) .................................................................................................................102
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OS FUNGOS ............................................................................................................................103
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ESTUDO VISUAL DOS FUNGOS ............................................................................................113
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IDENTIFICAÇÃO E ISOLAMENTOS DOS FUNGOS ...............................................................115
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MICOSES SUPERFCIAIS ........................................................................................................116
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MICOSES PROFUNDAS..........................................................................................................117
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PNEUMOCYSTIS CARINII ...............................................................................................................120
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PROTOZOÁRIOS.....................................................................................................................121 6
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CONSIDERAÇÕES FINAIS .....................................................................................................125
GLOSSÁRIO ......................................................................................................................................126 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................................129
INTRODUÇÃO
A microbiologia é definida como a biologia dos organismos microscópicos que relaciona os organismos “invisíveis a olho nu”, pelo seu tamanho, com as principais doenças infecciosas do homem e de seus animais domésticos. Os micro-organismos são encontrados em todos os ambientes, incluindo solo, água, ar e participam de todas as funções vitais. Embora não possam existir dúvidas de que bactérias e vírus sejam os patógenos mais numerosos e importantes, o estudo da microbiologia também está ligado à micologia e parasitologia. A relação entre o hospedeiro e o microrganismo pode se estabelecer de diversas maneiras. Essa associação ou simbiose (viver juntos) pode ter uma conotação de benefício ou prejuízo para o hospedeiro. Tentando categorizar especificamente essas associações, os pesquisadores conseguiram, por conveniência, identificar três categorias, que foram nomeadas como: comensalismo (uma espécie utiliza a outra como seu ambiente físico, como, por exemplo, microbiota); mutualismo (as duas espécies se beneficiam, como, por exemplo, as bactérias entéricas de ruminantes); e parasitismo (apenas uma espécie se beneficia trazendo prejuízo ao hospedeiro, como o vírus da raiva). Estamos, agora, diante da oportunidade de ampliar e aprofundar temas considerados essenciais dentro do estudo da microbiologia. Nossa expectativa é a de que os usuários desta apostila de microbiologia geral possam assimilar e alcançar novos níveis de complexidade laboratorial. Não tivemos a pretensão de alcançar o conteúdo e a profundidade dos livros-texto de microbiologia tradicionalmente consultados e que também nos serviram de referência, mas sim incluir apenas uma pequena parte de uma explosiva base de dados que se expande em forma exponencial, concernente ao número e classes de micro-organismos e às propriedades que lhes permite causar doenças. O material apresentado aqui é apenas um “instantâneo” da microbiologia atual, com respeitosa mesura aos avanços científicos dos anos passados e com a visão de que as novas tecnologias descritas neste e nos próximos módulos já revolucionaram as práticas laboratoriais e continuarão a afetar as abordagens atuais e futuras da arte e da ciência da microbiologia.
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O primeiro passo para o conhecimento dos micro-organismos é o mesmo que se deve seguir para conhecer uma pessoa: é necessário saber seu nome. No estudo do mundo dos micro-organismos como agentes de doenças no homem, é primeiramente importante assimilar como as bactérias e outros micro-organismos são denominados, isto é, a ciência da taxonomia.
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1 REQUISITOS BÁSICOS PARA INSTALAÇÃO E FUNCIONAMENTO DE UM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
Os requisitos básicos para um laboratório de microbiologia visam elaborar e viabilizar boas práticas, normas para coleta, conservação e transporte de material de interesse clínico. Além de estabelecer e executar rotinas microbiológicas, dentro dos padrões técnico-científicos vigentes, que permitam o isolamento e identificação dos principais agentes infecciosos de importância clínica, por gênero, e, se possível, por espécie. O laboratório ainda precisa determinar a sensibilidade às drogas antimicrobianas, efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos de esterilização. E ainda divulgar e implementar normas de biossegurança. Os equipamentos mínimos para funcionamento de um laboratório de microbiologia consistem em: estufa bacteriológica, forno de Pasteur, autoclave, microscópio binocular, centrífuga de baixa rotação, homogeneizador, banho-maria de pequena dimensão, destilador para água, balança para tarar tubos, balança comum com uma ou duas casas decimais, bico de Bunsen, geladeira e capela de fluxo laminar. Além desses equipamentos, o laboratório poderá contar com outros aparelhos, como: microscópio estereoscópico, congelador (-20oC ou -70oC), bomba de vácuo para filtração com membranas, potenciômetro e balança analítica.
1.1 Boas Práticas de Laboratório
O trabalho laboratorial executado de forma adequada e bem planejado previne a exposição indevida a agentes considerados de risco à saúde e, sem dúvida, evita acidentes. Manipulação de agentes considerados contaminantes é regida por leis federais, estaduais e municipais. A manipulação, armazenamento e transporte de agentes de risco requerem licenças especiais que são controladas por órgãos federais. O Regulamento Técnico de Funcionamento do Laboratório Clínico foi elaborado a partir de trabalho conjunto de técnicos da ANVISA, com o grupo de trabalho instituído pela Portaria nº. 864, de 30 de setembro 2003.
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Esse grupo de trabalho foi composto por técnicos da ANVISA, secretaria de atenção à saúde (SAS/MS), secretaria de vigilância à saúde (SVS/MS), vigilâncias sanitárias estaduais, laboratório de saúde pública, sociedade brasileira de patologia clínica/medicina laboratorial, sociedade brasileira de análises clínicas, provedores de ensaio de proficiência e um consultor técnico com experiência na área. A proposta de Regulamento Técnico elaborado pelo grupo de trabalho foi publicada como consulta pública nº 50 em 6 de agosto de 2004. As sugestões recebidas foram consolidadas pelos técnicos da gerência geral de tecnologia em serviços de saúde (GGTES/ANVISA), pelos componentes do grupo de trabalho juntamente com o consultor. Após discussões, as sugestões pertinentes foram incorporadas ao texto do Regulamento Técnico, sendo produzido o documento final consensual sobre o assunto. Esse Regulamento Técnico, discriminado na resolução da diretoria colegiada - RDC nº. 302, de 13 de outubro de 2005, regulamenta:
“A Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no uso da atribuição que lhe confere o art.11, inciso IV, do Regulamento da ANVISA aprovado pelo Decreto 3.029, de 16 de abril de 1999, c/c o § 1º do art.111 do Regimento Interno aprovado pela Portaria nº. 593, de 25 de agosto de 2000, republicada no D.O.U. de 22 de dezembro de 2000, em reunião realizada em 10 de outubro de 2005; considerando as disposições constitucionais e a Lei Federal nº. 8080, de 19 de setembro de 1990, que trata das condições para a promoção, proteção e recuperação da saúde, como direito fundamental do ser humano; considerando a necessidade de normalização do funcionamento do Laboratório Clínico e Posto de Coleta Laboratorial; considerando a relevância da qualidade dos exames laboratoriais para apoio ao diagnóstico eficaz, adota a seguinte Resolução da Diretoria Colegiada e eu, Diretor-Presidente substituto, determino a sua publicação”:
Art. 1º Aprovar o Regulamento Técnico para funcionamento dos serviços que realizam atividades laboratoriais, tais como Laboratório Clínico e Posto de Coleta Laboratorial, em anexo. Art. 2º Estabelecer que a construção, reforma ou adaptação na estrutura física do laboratório clínico e posto de coleta laboratorial deve ser precedida de aprovação do projeto junto à
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autoridade sanitária local em conformidade com a RDC/ANVISA nº 50, de 21 de fevereiro de 2002, e RDC/ANVISA nº. 189, de 18 de julho de 2003, suas atualizações ou instrumento legal que venha a substituí-las.
Art. 3º As Secretarias de Saúde Estaduais, Municipais e do Distrito Federal devem implementar os procedimentos para adoção do Regulamento Técnico estabelecido por esta RDC, podendo adotar normas de caráter suplementar com a finalidade de adequá-lo às especificidades locais.
Art. 4º O descumprimento das determinações deste Regulamento Técnico constitui infração de natureza sanitária sujeitando o infrator a processo e penalidades previstas na Lei nº. 6437, de 20 de agosto de 1977, suas atualizações, ou instrumento legal que venha a substituí-la sem prejuízo das responsabilidades penal e civil cabíveis.
Art. 5º Esta Resolução entra em vigor na data de sua publicação.
Há necessidade de que os profissionais sejam previamente conscientizados sobre os riscos, assim como das medidas de controle e proteção adotadas para a manutenção e respeito às normas de segurança. E o cuidado tomado pelos administradores deve ser maior e mais rigoroso para prevenir ou reduzir o risco de desenvolver alguma doença profissional por exposição. A organização das atividades e o respeito às normas de segurança é um aspecto fundamental para segurança de todos os usuários e para a garantia da qualidade e dos resultados precisos. As medidas de controle e proteção laboratorial são divididas em medidas coletivas (descarte e remoção de lixo, extintores de incêndio, lavador de olhos e sinalização), como mostra a Figura 1.
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FIGURA 1 – MATERIAIS RELACIONADOS COM AS MEDIDAS COLETIVAS DE CONTROLE E PROTEÇÃO LABORATORIAL. (A) REMOÇÃO DO LIXO; (B) LAVADOR DE OLHOS; (C) DESCARTE DE MATERIAIS PERFUROCORTANTES; (D) EXTINTOR DE INCÊNDIO
A
B
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C
D
FONTE: O autor
E medidas individuais que se referem ao emprego de equipamentos de proteção individual - EPIs (luvas, máscara, avental de manga comprida, pró-pés, óculos de proteção), como são mostradas na Figura 2.
FIGURA 2 – MATERIAIS RELACIONADOS COM AS MEDIDAS INDIVIDUAIS DE CONTROLE E PROTEÇÃO LABORATORIAL: (A) ÓCULOS; (B) MÁSCARA; (C) AVENTAL; (D) LUVAS; (E) PRÓ-PÉS
A B C D
E
D
E FONTE: Do autor
É difícil quantificar o risco no trabalho em laboratórios com relação aos agentes infecciosos. Tem-se por base, porém, que o risco individual aumenta com a frequência e com os níveis de contato com o agente infeccioso. O primeiro cuidado a ser tomado no laboratório que trabalha com espécimes clínicas é com o risco de exposição à infecção. Por outro lado, deve-se considerar que os riscos são influenciados por uma relação variável entre o agente infectante, o hospedeiro e a atividade desempenhada. Fatores aplicáveis ao agente incluem a virulência, a carga infectante, o ciclo e a toxigenicidade. As principais variáveis que influem no risco do hospedeiro são: idade, sexo, etnia, gravidez, uso de antimicrobianos, imunidade (vacinação prévia) e o uso de drogas imunossupressoras. Finalmente, a natureza da atividade laboratorial (por exemplo: diagnóstico,
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produção, pesquisa) pode afetar significativamente o risco pessoal devido ao tipo, quantidade e concentração dos agentes empregados, a manipulação dos agentes e a eficácia primária e secundária dos equipamentos de proteção e práticas de laboratório.
1.2 REGRAS BÁSICAS DAS BOAS PRÁTICAS LABORATORIAIS
14 As regras básicas de segurança em laboratório serão descritas na Figura 3, logo a seguir. Estes itens são inegociáveis e devem ser respeitados rigorosamente e sem exceção.
1.3 Gerenciamento das boas práticas
Uma organização de gerenciamento das boas práticas, ou melhor, a garantia da qualidade dentro do laboratório faz-se necessário para ajudar a manter a ordem minimizando os riscos de contaminação, além de elaborar planos de gerenciamento de rejeitos químicos. Essa organização deve estar ligada à Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), segundo a Lei 8.974 de 05 e janeiro de 1995. A CTNBio regulamenta os procedimentos de segurança por meio de instruções normativas, conforme o grau de periculosidade, bem como estabelece os níveis de concentração e de tratamento dos resíduos, a liberação planejada para o ambiente, transporte, importação, comercialização de organismos geneticamente modificados e intervenções genéticas em humanos e animais. As práticas de biossegurança baseiam-se na necessidade de proteção ao operador, seus auxiliares e a comunidade local contra riscos que possam prejudicar a saúde. Embasado nesses itens, a CTNBio responsabiliza-se por todos os procedimentos institucionais, mediante os quais inspecionará e fornecerá licenças para áreas de nível 1. E as solicitações de licenças para nível 2, 3 e 4 serão encaminhadas pela Comissão Interna de Biossegurança para CTNBio e serão sujeitas às inspeções da CTNBio. As áreas de nível de
laboratório estão classificadas no sistema de grupo de risco dos micro-organismos e está baseada na potência do micro-organismo de causar doença em seres humanos e contaminar o ambiente. Os micro-organismos dividem-se em grupos quanto à patogenicidade para o homem, a virulência, o modo de transmissão, a endemicidade e a existência de profilaxia e/ou de terapêutica eficazes. Segundo a Resolução no. 1 de 1998 do Conselho Nacional de saúde, Cap. X art. 64, os microrganismos podem, portanto, ser classificados em classes de risco de 1 a 4 por ordem crescente: Classe 1 - onde se classificam os agentes que não apresentam riscos para o manipulador, tampouco para a comunidade (ex.: Escherichia coli, Bacillus subtilis, vírus adenoassociados); Classe 2 – onde se classificam os agentes que apresentam risco moderado para o manipulador, havendo sempre um tratamento preventivo (ex.: Clostridium tetani, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus; Epstein-Barr Vírus - EBV, Herpesvírus; Candida albicans; Plasmodium sp, Schistosoma sp); Classe 3 – onde se classificam os agentes que apresentam risco grave para o manipulador e moderado para a comunidade, sendo as lesões ou sinais clínicos graves e nem sempre há tratamento (ex.: Bacillus anthracis, Brucella sp, Chlamydia psittaci, Mycobacterium tuberculosis; vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, HTLV 1 e 2, HIV, flavivírus; Blastomyces dermatiolis, Histoplasma; Echinococcus sp, Leishmania sp, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi); Classe 4 - onde se classificam os agentes que apresentam risco grave para o manipulador e para a comunidade; não existe tratamento e os riscos em caso de propagação são bastante graves (ex.: arenavírus, certos arbovírus, vírus da encefalite de St. Louis e Coxiella burnetii).
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FIGURA 3 – BOAS PRÁTICAS EM LABORATÓRIO
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1.4 A ROTINA NOS LABORATÓRIOS
Agora relacionaremos as rotinas que auxiliam na otimização do serviço dos usuários: a) manter as bancadas sempre limpas e livres de materiais estranhos ao trabalho; b) fazer uma limpeza prévia, com o solvente adequado, ao esvaziar um frasco de reagente antes de colocá-lo para lavagem; c) rotular imediatamente qualquer reagente ou solução preparada utilizando etiquetas adequadas; d) retirar da bancada os materiais, as amostras e os regentes após o término do trabalho; e) jogar papéis e outros materiais dispensáveis que não ofereçam riscos em lixos específicos; f) usar pinças e materiais de tamanho adequado e em perfeito estado de conservação; g) limpar, imediatamente, qualquer derramamento de produtos e reagentes, protegendo-se, se necessário, para fazer essa limpeza; h) tomar as seguintes providências em caso de derramamento de líquidos inflamáveis, produtos tóxicos, biológicos, tóxicos e/ou corrosivos: interromper o trabalho e advertir as pessoas próximas sobre o ocorrido; solicitar ou efetuar a limpeza imediata, verificar e corrigir a causa do problema.
1.4.1. Desinfecção
A desinfecção é definida como a eliminação parcial dos micro-organismos presentes em um determinado ambiente. Os métodos de desinfecção visam principalmente destruir as formas microbianas patogênicas ao homem por meio da utilização de um agente desinfetante ou antimicrobiano. Os diversos tipos de agentes antimicrobianos podem ser divididos em três grupos: agentes físicos, agentes químicos e agentes quimioterápicos. O grau de eficiência de cada um deles é dependente da concentração ou intensidade, das condições do ambiente e do estado
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das células.
1.4.2 Esterilização
A esterilização é um processo de eliminação completa de todas as formas vivas de um material ou ambiente. Por meio da esterilização dos meios de cultura e do instrumental usado nos trabalhos, o isolamento e a manutenção das culturas puras de micro-organismos tornaramse possíveis. A esterilização pode ser feita por diferentes processos que emprega métodos físicos (calor, atrito, radiação e filtração) e métodos químicos. Normalmente são utilizadas embalagens para acondicionar os materiais durante a esterilização para evitar contaminação posterior. A eficácia da esterilização é monitorada por meio do emprego de indicadores. A maioria dos protocolos requer treinamento especial para adequada preparação dos instrumentos com remoção de toda matéria orgânica, o correto preenchimento da câmara e operação do ciclo de esterilização dentro de parâmetros estritamente definidos. Os métodos mais utilizados são: calor úmido, que provoca a inativação ou coagulação das proteínas dos micro-organismos (autoclavagem e tindalização) e o calor seco, que provoca a eliminação dos micro-organismos pela oxidação e queima das proteínas (forno de Pasteur e chama). Em microbiologia a autoclavagem é utilizada na esterilização de material usado na preparação de meios de cultura e esterilização em geral. O vapor d’água sob pressão e uma temperatura superior a 1000C destroem os micro-organismos e seus esporos (quando produzidos) em um curto espaço de tempo. A tindalização é um processo de esterilização fracionada para substâncias que não podem ser aquecidas acima de 1000C. O processo consiste em aquecer o material três vezes consecutivas em intervalos de 24 horas. Tanto o forno de Pasteur quanto as esterilizações pela chama são processos que requerem temperaturas elevadas por longos períodos. Outros métodos de esterilização são utilizados, tais como: a) irradiação pela luz ultravioleta (30
Fonte : Arquivo pessoal do autor.
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24 OS VÍRUS
Os vírus infectam todas as formas de vida, desde bactéria, fungos e plantas até os animais e o homem. O termo vírus vem do latim que significa veneno. Esse termo foi utilizado como sinônimo de veneno e se referia a agentes de natureza desconhecida que provocavam diversas doenças. No ano de 1935, cristais de vírus foram isolados e observados ao microscópio pela primeira vez. A sua composição parecia principalmente proteica, porém constatou-se mais tarde uma pequena quantidade de ácidos nucleicos. No início dos anos 40, generalizou-se que todos os vírus continham ácidos nucleicos, o que foi confirmado por estudos com bacteriófagos, que eram vírus bacterianos. Em 1952, foi demonstrado para o bacteriófago T4 que somente o DNA do fago, e não a proteína, penetrava na célula bacteriana hospedeira, iniciando os eventos de replicação que levavam à produção de centenas de vírus em cada célula infectada. Uma grande contribuição para a virologia foi a descoberta de que os vírus podem ser cristalizados. Quando o vírus do Mosaico do Tabaco foi cristalizado, forneceu um poderoso argumento para que se pudesse pensar nos vírus como estruturas químicas simples, consistindo somente de proteína e ácido nucleico. Dessa forma, se pensarmos nos vírus fora das células, podemos considerá-los como estruturas moleculares excepcionalmente complexas. No interior das células, a informação levada pelo genoma viral faz com que a célula infectada produza novos vírus, levando-nos a pensar nos vírus como organismos excepcionalmente simples. Dessa forma, os vírus só são replicados dentro de células vivas. O ácido nucleico viral contém informações necessárias para programar a célula hospedeira infectada, de forma que esta passa a sintetizar várias macromoléculas necessárias à produção da progênie viral. Fora da célula susceptível, as partículas virais são metabolicamente inertes. Três propriedades principais distinguem os vírus de outros micro-organismos: o tamanho – os vírus são menores que outros organismos, embora eles variem consideravelmente em tamanho; o genoma, que pode ser formado de DNA ou RNA, nunca ambos (os vírus contêm apenas um tipo de ácido nucleico); e o metabolismo – os vírus não possuem atividade
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metabólica fora da célula hospedeira, mas sim atividade ribossomal ou aparato para síntese de proteínas. Os vírus diferem de outros parasitas intracelulares porque o ciclo de infecção viral inclui um "período cego" durante o qual não se detecta a presença do vírus, o que não ocorre com os outros parasitas intracelulares. ESTRUTURA VIRAL Os vírus são os menores agentes infecciosos, de 20 a 300 nm de diâmetro. A estrutura viral (Figura 20) é composta por: a) capsídeo: é o invólucro proteico que protege o genoma viral; b) nucleocapsídeo: é o conjunto capsídeo com genoma viral; c) capsômeros: são aglomerados de polipeptídios; d) envoltório: é uma membrana de lipídio que envolve as partículas virais.
FIGURA 20 – ESQUEMA REPRESENTATIVO DOS COMPONENTES DE UMA PARTÍCULA VIRAL
FONTE: Alterado de http://ec.europa.eu/health/opinions/en/energy-saving-lamps/glossary/ghi/hivaids.htm
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Também é importante definir a palavra vírion, que é a partícula viral completa que em algumas instâncias pode ser idêntica ao nucleocapsídeo. E ainda vírus defectivo, que é uma partícula viral funcionalmente deficiente em algum aspecto da replicação.
CULTIVO E QUANTIFICAÇÃO VIRAL
O cultivo in vitro de vírus pode ser feito em culturas de células ou em ovos embrionários sob condições estritamente controladas. O crescimento in vivo é empregado para o isolamento primário de certos vírus e para o estudo das viroses e da ontogênese viral. A quantificação das partículas viral pode ser contada diretamente no microscópio eletrônico por comparação com uma suspensão padrão de partículas de látex de tamanho similar. A hemaglutinação é outra forma de se quantificar as partículas virais, que ocorre por meio da aglutinação das hemácias humanas ou de alguns animais por estes vírus. Esse teste mensura a quantidade total de vírus presente. E ainda podemos mensurar a quantidade viral por meios biológicos por meio da morte dos animais, infecção dos animais ou efeitos citopáticos em culturas de tecidos (diluição final do vírus teste – ensaio de plaques).
CLASSIFICAÇÃO VIRAL
A nomenclatura viral segue as regras do International committeeon taxonomy of viruses (ICTV). A classificação dos vírus baseia-se nas seguintes características: tipo de ácido nucleico (fita simples ou dupla e estratégia de replicação), tamanho e morfologia (simetria, quantidade de capsômeros e ausência ou presença de envoltórios) (Figura 21), presença de enzimas específicas, susceptibilidade a agentes físicos e químicos (principalmente éter), métodos naturais de transmissão, tropismo celular ou tecidual ou preferência por hospedeiro, patologia (inclusão de corpúsculos), sintomatologia e propriedades imunológicas.
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FIGURA 21 – CLASSIFICAÇÃO DOS VÍRUS SEGUNDO AS CARACTERÍSTICAS: TIPO DE ÁCIDO NUCLEICO (FITA SIMPLES OU SUPLA) E MORFOLOGIA (SIMETRIA, QUANTIDADE DE CAPSÔMEROS E AUSÊNCIA OU PRESENÇA DE ENVOLTÓRIOS, SINAIS + = PRESENÇA / - = AUSÊNCIA)
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FONTE: http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=leonjuhee&logNo=150047742272&redirect=Dlog&widgetTypeCall=true
25 PARVOVÍRUS
Nos membros desta família Parvoviridae, o material genético é composto por fita simples de DNA e a forma é icosaédrica. Essa família contém o parvovírus humano B19 e os vírus adenoassociados. Os vírus adenoassociados são defectivos e sua infecção ocorre concomitantemente com os vírus do herpes e outros adenovírus auxiliares. A doença causada pelo parvovírus B19 pode ser representada por um eritema infeccioso brando (vermelhidão local), até uma crise aplásica (em paciente portador de anemia falciforme). A transmissão faz-se via gotículas respiratórias.
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26 PAPILOMAVÍRUS
A família Papilomaviridae compreende micro-organismos com DNA, dupla fita (circular) com forma icosaédrica. Esses vírus podem persistir latentes no ambiente e serem reativados. As espécies incluídas nessa família são o papilomavírus, o poliomavírus e o vírus símios vacuolizantes. O papilomavírus, HPV 16 e HPV 18 causam verrugas na pele e na região genital masculina e feminina. A transmissão é sexual. O poliomavírus causa infecções brandas nas vias aéreas superiores.
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27 HERPESVÍRUS
Os micro-organismos dessa família Herpesviridae têm a forma icosaédrica, são envelopados e o DNA é composto por fita dupla. Esse vírus permanece por longos períodos de tempo no organismo, frequentemente latentes e depois podem ser reativados. O isolamento desses vírus pode ocorrer em cultivo celular, em células multinucleadas ou em inclusões intranucleares. Os principais membros dessa família são os: a) HHV1 (HSV1), causador da gengivoestomatite e úlcera fria. Transmitido por meio da saliva, fluido vesical e parto normal (contato vaginal com recém-nascido); b) HHV2 (HSV2), causador do herpes genital, herpes cutâneo, encefalite e meningoencefalite. Transmitido principalmente por meio da saliva; c) HHV3 (VZV), causador da varicela. Transmitido por meio de gotículas respiratórias e fluido vesical; d) HHV4 (EBV), causador da mononucleose (febre glandular) e encefalite. Transmitido por meio da saliva. e) HHV5 (CMV), causador da mononucleose, hepatite, pneumonite. Transmitido por meio da saliva, urina, sêmen, secreções cervicais e leite. E ainda pode ser transmitido por tecidos transplantados e via placenta.
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28 ADENOVÍRUS
Os membros dessa família Adenoviridae, o material genético é composto por fita dupla de DNA e a forma é icosaédrica. Seus 41 membros causam febre faringoconjuntival, adenite mesentérica e epidemias de doenças respiratórias. Os tipos 3, 4, 7, 14, 21 também podem causar pneumonia. A transmissão ocorre por gotículas respiratórias e fezes. 90
29 HEPADNAVÍRUS
Os membros dessa família Hepadnaviridae têm a forma esférica, mas seu nucleocapsídeo é isocaédrico, e são envelopados. O DNA é do tipo dupla fita e circular. O envelope (antígeno HBs) circunda o cerne que apresenta os antígenos HBc e Hbe. Esse vírus é o causador da Hepatite B e não cresce em cultivo celular. A identificação dos antígenos HBs e HBc ocorre apenas na fase de incubação, e a presença do antígeno Hbe indica que o sangue do indivíduo é altamente infeccioso. Após a exposição do organismo ao vírus, a identificação deste ocorre pela presença dos anticorpos específicos formados. A transmissão ocorre pela transfusão sanguínea, agulhas contaminadas, via sexual e gestação.
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30 POXVÍRUS
São os maiores vírus dermatóficos e causam pústulas na pele. Os membros da família Poxviridae possuem forma ovoide ou retangular e o nucleocapsídeo tem uma estrutura complexa. Algumas espécies são envelopadas. O genoma é composto por fita dupla de DNA. Esses vírus são encontrados em microscopia eletrônica de biópsias ou fragmentos das lesões cutâneas. É uma zoonose, e a transmissão ocorre pelo contato com a lesão contaminada.
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31 PICORNAVÍRUS
Os membros dessa família são os Picornaviridae, cujo material genético é composto por fita simples de RNA e a forma é icosaédrica. Os principais representantes dessa família são os Rhinovírus (com mais de 100 sorotipos diferentes), causadores do resfriado comum; os Enterovírus ou poliovírus (com três sorotipos diferentes), causadores da meningite asséptica e poliomelite paralítica; Echovírus (com 32 sorotipos diferentes), causadores da meningite assética e exantemas; Coxsackievírus (com 29 sorotipos diferentes), causadores da meningite asséptica, herpangina e miopericardite. A disseminação ocorre por exposição a gotículas respiratórias (Rhinovírus e Coxsackievírus tipo A), e para os outros a transmissão ocorre via fecal-oral.
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32 ORTHOMYXOVÍRUS
Os membros dessa família são os Orthomyxoviridae, e o material genético é composto por fita simples de RNA (oito segmentos lineares com fita sense negativa). Seus representantes são encapsulados, a forma é esférica e o nucleocapsídeo é helicoidal. Esses vírus podem ser isolados em cultivo laboratorial e a identificação do antígeno viral é feita por imunoflorescência. Durante o período de incubação do vírus, o hospedeiro apresenta os sintomas: febre, mialgia, mal estar, descarga nasal, dor de garganta, tosse e pneumonia.
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33 PARAMYXOVÍRUS
As espécies que representam a família dos Paramyxoviridae são os agentes causadores da caxumba, influenza e sarampo. São vírus encapsulados com forma pleomórfica e núcleocapsídeo helicoidal. O genoma é composto por uma fita simples de RNA (fita sense negativa). A sorologia para o sarampo e influenza é limitada. A infecção inicial ocorre pelo trato respiratório. Não há lesão no local da infecção. O sarampo causa febre, descarga nasal e exantema. A caxumba causa parotidite e meningite asséptica. A influenza causa resfriado comum, bronquiolite e pneumonia.
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34 TOGAVÍRUS
Os togavírus humanos incluem os vírus da rubéola, dengue e febre amarela. Eles fazem parte da família Togaviridae, com forma esférica e nucleocapsídeo isocaédrico. A fita de RNA é simples com fita sense positiva. A transmissão ocorre entre os seres humanos pela via de gotículas respiratórias. A rubéola causa uma doença exantematosa branda em adultos e algumas vezes complicada por artralgia e em mulheres grávidas (infecção fetal e malformações congênitas). Os demais togavírus causam doenças febris que podem ser graves quando há comprometimento hepático (febre amarela) ou quando há comprometimento imunopatológico (febre hemorrágica dengue).
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35 RETROVÍRUS
Os representantes da família Retroviridae apresentam fita simples de RNA. Esses vírus são possuidores de envelope e têm forma esférica com nucleocapsídeo icosaédrico. As espécies que representam esta família são os lentivirus (HIV1 e HIV2), os oncovírus (HTLV1 e HTLV2), o vírus humano espumoso (pouco conhecido). 97 A transmissão ocorre por transfusão de sangue contaminado, via placentária e sêmen. E no caso do HTLV1, pode também ser transmitido pelo leite materno. O HIV resulta numa doença de imunossupressão grave, levando a infecções oportunistas. Já o HTLV1 causa uma doença em nível do sistema nervoso central e leucemia numa fase mais adiantada da doença. O diagnóstico laboratorial ocorre pela identificação dos anticorpos pesquisados nos ensaios por ELISA, aglutinação em látex e western blotting.
36 RHABDOVÍRUS
Os membros da família Rhabdoviridae são envelopados com formato de bala e nucleocapsídeo helicoidal. A fita de RNA é simples. Os micro-organismos dessa família são os causadores da raiva. A transmissão ocorre após a mordida de cães, gatos e morcegos, principalmente. Após a replicação viral no local da mordida, ascende por meio dos axônios para o sistema nervoso central, onde se dissemina e então desce por meio dos nervos periféricos para a pele e glândulas salivares. O diagnóstico ocorre por meio da autópsia do tecido cerebral e fragmentos de pele ou córnea que contenham pelos para pesquisa de antígenos ou inclusões.
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37 ARENAVÍRUS
Essa família Arenaviridae é composta por vírions pleomórficos, contendo dois segmentos de RNA fita simples. São também envelopados de forma esférica e possuem nucleocapsídeo helicoidal. 99 Esses vírus são transmitidos por excretas de roedores que causam a doença febril (Febre Lassa), às vezes complicada por meningite asséptica ou doença hemorrágica grave.
38 REOVÍRUS
As espécies que representam a família dos Reoviridae são os agentes causadores da doença diarreica (rotavírus). São vírus de forma icosaédrica com nucleocapsídeo de camada dupla icosaédrico. Seu genoma é composto por fita dupla de DNA. A infecção ocorre via fecal-oral. E o vírus resiste muito bem aos ácidos estomacais. 100
39 CORONAVÍRUS
A família Coronaviridae possui indivíduos RNA fita simples, é envelopada com a forma esférica (coroa) e o nucleocapsídeo é helicoidal. Os representantes dessa espécie causam o resfriado comum e são contraídos por gotículas respiratórias. 101
40 PRÍONS (SCRAPIE)
Provavelmente não são vírus. O agente infectante replica-se inexoravelmente nos tecidos linfoides, e então nas células cerebrais onde produz vacúolos intracelulares. As doenças causadas são: encefalite espongiforme, doenças de príons e doença de Creutzfeldt-Jacob. Por muito tempo, as doenças causadas por príons cujo protótipo é o scrapie de carneiros foram classificadas como vírus lentos devido ao longo período de incubação. Isso porque são doenças infecciosas, esporádicas ou genéticas.
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41 OS FUNGOS
Os fungos (do latim fungus = cogumelo) têm sido tradicionalmente considerados como "semelhantes a plantas". A maioria das espécies cresce por extensão continua e ramificação de estruturas filiformes. Em adição, eles são imóveis em sua maioria e suas paredes celulares assemelham-se às de plantas em espessura e, até certo ponto, em composição química e em estrutura ultramicroscópica. São seres heterotróficos, essencialmente aeróbicos, com limitada capacidade anaeróbia. O material de reserva é o glicogênio. Os fungos crescem como células únicas, as leveduras, ou como colônias filamentosas multicelulares, os bolores e cogumelos (Figura 22). As formas multicelulares não possuem folhas, caules ou raízes e são muitas menos diferenciadas do que as plantas superiores, porém são muito mais diferenciadas do que as bactérias. Contudo, os fungos não possuem pigmentos fotossintéticos e, assim, eles estão restritos a uma existência saprofítica ou parasita. Uma única célula uni-nucleada pode produzir cordões multinucleares filamentosos, leveduras, órgãos de frutificação com diversos esporos e células que são diferenciadas sexualmente (em muitas espécies). Ainda mais, algumas espécies formam notáveis armadilhas para a captura de vários microrganismos. FIGURA 22 – FIGURA QUE REPRESENTA AS FORMAS DE CRESCIMENTO DOS FUNGOS. À ESQUERDA, FORMA UNICELULAR (LEVEDURA); À DIREITA, FORMA FILAMENTOSA MULTICELULAR (BOLOR DE PÃO)
FONTE: Alterado de http://www.infoescola.com/biologia/leveduras/ e http://ciencias3c.cvg.com.pt/setimo/reinos.html
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Os fungos são abundantes no solo, nos vegetais e em massas de água, onde vivem em folhas mortas ou em madeira (Figura 23). Seus esporos ubíquos, transportados pelo ar, são frequentemente incômodos contaminadores de culturas de bactérias e de células de mamíferos. De fato, foi um desses contaminadores numa cultura de estafilococos que eventualmente levou a descoberta da penicilina.
FIGURA 23 – LOCALIZAÇÃO DOS FUNGOS. (A) CRESCIMENTO EM MADEIRA; (B) CRESCIMENTO EM MASSA DE ÁGUA; (C) CRESCIMENTO EM SOLO; (D) CRESCIMENTO EM RESTOS DE VEGETAIS
A
B
C
D
FONTE: O autor
ESTRUTURA E CRESCIMENTO Bolores
O principal elemento da forma vegetativa ou de crescimento de um bolor é a hifa (do grego hyphe= teia), uma estrutura tubular ramificada com cerca de 2 a 10 µm de diâmetro, isto é, muito maior do que as bactérias. À medida que uma colônia, ou talo, cresce, suas hifas formam uma massa de filamentos enovelados, chamadas micélio (do grego mykes= cogumelo). As hifas crescem pelo alongamento de suas pontas (crescimento apical) e pela produção de ramificações laterais (Figura 24). As hifas que penetram no meio, onde absorvem
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nutrientes, são coletivamente conhecidas como o micélio vegetativo, enquanto que aquelas que se projetam acima da superfície do meio constituem o micélio aéreo; como esse último. Via de regra, tem células reprodutivas ou esporos e é também chamado micélio reprodutivo.
FIGURA 24 – CRESCIMENTO DA HIFA A PARTIR DE UM ESPORO
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FONTE: http://www.uygardergi.com/kavramlar/0cimlenme.gif A maioria das colônias cresce na superfície de meios líquidos ou sólidos como lençóis irregulares, secos e filamentosos. Devido ao enovelamento das hifas filamentosas, as colônias são mais resistentes do que as de bactérias. No centro das colônias micelianas, as hifas são frequentemente necróticas devido à falta de suprimento de nutrientes e de oxigênio e talvez ao acúmulo de ácidos orgânicos. Na maioria das espécies, as hifas são divididas por paredes transversas, chamados septos (do latim septum = cerca, divisão). Contudo, os septos possuem finos poros centrais; daí mesmo as hifas septadas serem cenocíticas, isto é, seus múltiplos núcleos estarem incluídos numa massa contínua de citoplasma (Figura 25).
Leveduras As leveduras são fungos unicelulares ovais ou esféricos, geralmente de 3 a 4 µm de diâmetro. Às vezes as leveduras e sua progênie aderem entre si e formam cadeias ou "pseudohifas".
FIGURA 25 – A FIGURA À ESQUERDA REPRESENTA UMA ESPÉCIE DE HIFA COM PAREDES TRANSVERSAS CHAMADAS SEPTOS, HIFAS SEPTADAS. E A FIGURA À DIREITA REPRESENTA UMA HIFA CENOCÍTICA COM MÚLTIPLOS NÚCLEOS
FONTE: Alterado de http://www.ebah.com.br/content/ABAAAA0-sAG/fungos
Citologia Tanto as leveduras e como os bolores assemelham-se a plantas superiores e a animais na complexidade anatômica de suas células. São eucarióticos, com vários cromossomos diferentes e uma membrana nuclear bem definida, possuindo mitocôndrias e um retículo endoplasmático. Ainda mais, suas membranas contêm esteróis, assemelhando-se, assim, a formas superiores e não a bactérias. PAREDE CELULAR
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A parede celular de um fungo, como a de bactérias, fica do lado imediatamente externo da membrana limitante do citoplasma e, em algumas leveduras, está envolvida por um polissacarídeo capsular externo. Contudo, ao contrário das bactérias, cujas paredes celulares frequentemente contêm unidades estruturais como se fossem tijolos, as paredes celulares dos fungos parecem ser entrelaçadas. Do mesmo modo que nas bactérias, os polissacarídeos da parede celular dos fungos são sintetizados de vários nucleotídeos de açúcares. A quitina-sintetase está ligada à membrana celular. In vitro, Ela necessita de um iniciador, que deve conter pelo menos seis ou sete resíduos conectados, como acontece na quitina. Um antibiótico nucleotídico a poloxina D é um inibidor seletivo da quitina-sintetase. Ele inibe a incorporação de 14C-glicosamina na parede celular de Neurospora crassa, o que resulta num aumento do acúmulo de uridina-difosfato-N-acetilglicosamina. As paredes de várias leveduras contêm complexos de polissacarídeos com proteínas ricas em resíduos de cistina e a redução reversível de ligações tem sido implicada na formação de brotos. Em algumas leveduras, lipídeos contendo fósforo e nitrogênio também são abundantes na parede (até 10% do peso seco). As paredes celulares dos fungos podem ser digeridas por enzimas contidas nos sucos digestivos do caracol Helix pomatia. Esses sucos contêm mais de 30 atividades enzimáticas conhecidas, incluindo glucanase, quitanase e mananase. Foram também isoladas, de amostras de solo, bactérias que produzem enzimas líticas para essas paredes pela aplicação da técnica de enriquecimento com paredes celulares purificadas, como fonte de carbono. Como nas bactérias, a digestão das paredes das leveduras e dos bolores em solução hipertônica produz protoplastos viáveis. Também se produzem protoplastos pelo crescimento em meios que inibem a síntese da parede celular. Os protoblastos de leveduras são deficientes em algumas das hidrolases das células intactas, como invertase e β-fructosidase. Essas observações sugerem que, assim como nas bactérias, as enzimas secretadas estão localizadas no espaço periplasmático. REPRODUÇÃO Além de crescerem por extensão apical e por ramificação, os fungos reproduzem-se por meio de ciclos sexuais e assexuais e também por um processo parassexual. A grande maioria dos fungos patogênicos para o homem não possui sexualidade.
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Reprodução assexuada
O crescimento vegetativo de um micélio cenocítico envolve divisão nuclear sem divisão celular, sendo que o processo clássico de mitose assegura a transmissão de um complemento total de cromossomos para cada núcleo resultante. O passo seguinte da divisão celular leva a reprodução assexuada (vegetativa), isto é, a formação de um novo clone sem envolvimento de gametas e sem fusão nuclear. São conhecidos três mecanismos: (I) esporulação, seguida da germinação dos esporos; (II) brotamento; e (III) fragmentação das hifas. Os esporos assexuados são às vezes chamados conídios; mais frequentemente, esse termo é reservado para os esporos assexuados que se formam nos terminais ou nos lados das hifas. Outros esporos assexuados (clamidósporos e artrósporos) desenvolvem-se dentro das hifas. Os esporos germinam quando plantados num meio congenial, isto é, eles se tornam alargados e, se destinados a formar um bolor, emitem um ou mais tubos germinativos. Os tubos alongam-se em hifas dando surgimento a uma nova colônia. Os clamidósporos, que podem ser formados por muitos fungos, apresentam parede espessa e são excepcionalmente resistentes ao calor e à dessecação; eles são provavelmente formados da mesma forma que os esporos bacterianos, por endosporulação verdadeira e, de modo semelhante, promovem a sobrevida em ambientes desfavoráveis. Em contraposição, os artrósporos, que se formam pela fragmentação das hifas, e os conídios, que se formam por um processo semelhante à gemulação, não são excepcionalmente resistentes; é provável que eles ajam para promover a disseminação aérea. Os esporos, que contêm um ou vários núcleos, variam bastante em cor, tamanho e forma. Sua morfologia e modo de origem constituem a principal base para a classificação dos fungos que não possuem sexualidade. Algumas espécies produzem somente uma espécie de esporos e outras produzem até quatro tipos diferentes. Brotamento é o processo de reprodução assexuada prevalente nas leveduras, apesar de algumas espécies dividirem-se por fissão (leveduras de fissão). Enquanto que nesta (o
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processo reprodutivo comum em quase todas as bactérias) um antecessor se divide em duas células-filhas de tamanho essencialmente igual, no brotamento a célula-filha é a principio muito menor do que a célula primitiva. À medida que o broto sai da célula primitiva, o núcleo desta divide-se e um deles passa para o broto. O material da parede celular, então, interpõe-se entre o broto e a célula primitiva e eventualmente aquele desliga-se. Pela micrografia eletrônica, podemos ver uma cicatriz de nascimento na parede da célula-filha e uma cicatriz de brotamento na parede da célula primitiva. Como resultado de repetidos brotamentos, velhas células de levedura apresentam muitas cicatrizes de brotamento, mas têm apenas uma cicatriz de nascimento. Os fragmentos de hifas (p. ex., formados pela ruptura de um micélio) são também capazes de formar novas colônias. Essa capacidade é frequentemente explorada no cultivo dos fungos, mas é provável que não seja importante na natureza.
Reprodução sexuada
Os fungos que apresentam reprodução sexuada seguem os seguintes passos: (I) um núcleo haploide de uma célula doadora (macho) penetra no citoplasma de uma célula receptora (fêmea); (II) os núcleos macho e fêmea fundem-se para formar um núcleo zigoto, diploide; (III) por meio de meiose, o núcleo diploide do surgimento a quatro núcleos haploides, sendo que alguns deles podem ser recombinantes genéticos. Na maioria das espécies, a condição haploide é a que está associada a um crescimento vegetativo prolongado e o estado diploide é transitório, mas em outras espécies, como nos animais superiores, o inverso é verdadeiro.
Dimorfismo
Algumas espécies de fungos crescem somente como bolores e outras apenas como leveduras. Muitas espécies, contudo, podem crescer em ambas as formas, dependendo do meio ambiente. Essa capacidade e conhecida como dimorfismo. Ela é clinicamente importante, pois a
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maioria dos fungos mais patogênicos para o homem é dimórfica; vias de regra aparecem nos tecidos infectados por leveduras, mas quando cultivados in vitro, em condições convencionais, aparecem como bolores típicos. O dimorfismo pode ser experimentalmente controlado pela modificação das condições culturais. Alguns fungos produzem formas micelianas ao crescerem na superfície de meios líquidos de cultura, e formas de levedura quando o crescimento se dá na profundidade desses meios. Para o seu desenvolvimento, os fungos exigem sempre uma fonte orgânica de carbono, que será utilizada como material plástico ou energético. A fonte de nitrogênio pode ser inorgânica. Por exigirem carbono orgânico exógeno para as reações oxidativas na produção de energia necessária ao seu desenvolvimento, os fungos são classificados como heterotróficos e quimiorganotróficos. Os fungos podem ser saprófitas e parasitas (facultativos ou obrigatórios), conforme vivam de fontes de alimento existentes livres ou em hospedeiros. As fontes orgânicas podem ser bastante simples, como os álcoois, cetonas, aldeídos, gorduras, ácidos. Ou complexas como proteínas, polissacarídeos e polipeptídeos. De modo geral, essas substâncias de moléculas grandes são digeridas por enzimas até formas mais simples, num processo semelhante à digestão estomacal do homem, sendo o processo, porém, sempre externo, isto é, no próprio meio circundante, o que permite a assimilação fácil do alimento. Algumas vezes, certas substâncias, como os aminoácidos, podem funcionar como fontes de carbono e nitrogênio, podendo ser utilizadas como substâncias energéticas ou plásticas.
FATORES DE CRESCIMENTO
O fator de crescimento é: "qualquer composto orgânico que não pode ser sintetizado por um dado organismo e que deve ser fornecido ao mesmo, intacto". Muitas espécies de fungos, para o seu desenvolvimento, podem exigir os chamados fatores de crescimento, ou os chamados "bios” de WILDIERS, os quais, geralmente, devem ser
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fornecidos em pequeníssimas quantidades. Esses fatores podem ser classificados em essenciais, estimulantes e condicionais. Uma determinada espécie pode não exigir um fator de crescimento, porém algumas amostras podem sofrer mutações e perder a capacidade de sintetizá-lo, passando assim, a depender do mesmo. Os fungos exigem certos microelementos, isto é, elementos químicos inorgânicos em pequenas quantidades, como o ferro, zinco, manganês, cobre, molibdênio, cálcio, potássio. Esses elementos podem ser adicionados ao meio. De modo geral, os íons metálicos agem favoravelmente em pequenas concentrações, tornando-se, porém, quando adicionados além de determinado limite, prejudiciais ao crescimento.
METABOLISMO
Os fungos têm sido instrumentos interessantes no estudo dos processos metabólicos, tanto plasmático como energéticos, sendo de fácil manejo, tendo crescimento rápido e utiliza-se de meios bem caracterizados quimicamente. A via glicolítica ou da fermentação alcoólica, ou via de EMBDEMMEYERHOFFPARNAS, é um dos exemplos de via metabólica conhecida em profundidade e que serve de padrão para as pesquisas em outros mecanismos metabólicos. Ela apresenta interesse, ainda, porque o organismo animal pode utilizar uma via semelhante para a degradação do açúcar. Na fermentação alcoólica, há produção de energia que pode ser acumulada em moléculas de ATP, responsáveis por importantes reações de óxido-redução. Aliás, os carboidratos representam as principais fontes de energia e carbono para os micro-organismos de modo geral. Observa-se, nessa via, a formação de inúmeros produtos intermediários, com a intervenção de muitas enzimas que catalisam reações de quinase, mutase, aldolase e isomerase.
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A via glicolítica, porém, não é a única via de degradação de carboidratos, havendo outras, como o ciclo oxidativo das fosfopentoses, o ciclo de KREBS, entre outras. Os mecanismos de óxido-redução, sistemas reversíveis de transferência de energia por meio de hidrogênio ou de transporte eletrônico, são exercidos nas células dos fungos pelo mitocôndrio.
CLASSIFICAÇÃO 112 Os fungos de interesse médico estão incluídos atualmente em quatro subdivisões: Zygomycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina e Deuteromycotina (a classificação dos fungos é baseada principalmente nas características dos esporos sexuados e dos corpos de frutificação assexuados).
42 ESTUDO VISUAL DOS FUNGOS
Os fungos podem ser observados como colônias em placas ou ao microscópio.
ESTUDO MACROSCÓPICO 113 O estudo macroscópico deve ser baseado nas seguintes características: a) velocidade de crescimento (lento, médio ou rápido); b) aspecto cotonoso, algodonoso, lanoso, penugento, cremoso, céreas, membranosas, coriáceas, gomosas, aveludadas, granulosa ou terrosa; c) cor; d) verso e anverso; e) pigmento da colônia; f) pigmento difusível; g) consistência (duras, moles, friáveis, pastosas); h) contorno arredondado, ameboide, rizoide, festonada; i) bordos limitados ou não, elevados, franjados, adentram no meio; j) topografia da superfície (dobras, sulcos, elevados, plana estriada); l) presença de micélio aéreo ou profundo; m) topografia do reverso.
ESTUDO MICROSCÓPICO
O estudo microscópico deve ser baseado nas seguintes características: a) hifas tubulares, simples ou ramificadas, constituindo em seu conjunto o micélio; b) hifas não septadas; c) hifas septadas, parciais, completas ou perfuradas; d) hifas vegetativas e aéreas; e) leveduras redondas ou ovais.
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43 IDENTIFICAÇÃO E ISOLAMENTOS DOS FUNGOS
O diagnóstico laboratorial de infecções fúngicas no homem segue procedimentos gerais abaixo discriminados: a) coleta do material clínico e transporte ao laboratório especializado; b) preparação e exame microscópico direto de uma parte do material a analisar; c) culturas em meios de enriquecimento; d) culturas em meios de isolamento e posteriormente isolar o agente em cultura pura; e) avaliação quantitativa do fungo no material clínico a analisar; f) diferenciação das colônias quanto à morfologia macroscópica, morfologia microscópica, bioquímica, experimentação em animais, tipagem, determinação da sensibilidade do agente causal a agentes antifúngicos; g) testes sorológicos para detecção de antígenos fúngicos (no soro, na urina, no líquido cefalorraquidiano) e detecção de anticorpos no soro e no líquido cefalorraquidiano. O isolamento de fungos deve ser recomendado em função da identificação do isolado e sua correlação com o achado em exame direto, da realização de testes de sensibilidade a drogas no seguimento do tratamento. Por isso, uma alíquota do material é semeada em meio para isolamento. O meio padrão empregado é o Agar Sabouraud glicose a 2%, com antibióticos para supressão da microbiota bacteriana. A maioria dos cultivos devem ser deixados a temperatura ambiente.
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44 MICOSES SUPERFCIAIS
Os fungos causadores das micoses superficiais são os classificados como dermatófitos. Este é um termo genérico para aqueles fungos que invadem as camadas superficiais da pele. Dentre os fungos envolvidos, os que mais têm importância são: Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton. Estes são fungos filamentosos que invadem as estruturas ceratinizadas de superfície (pele, cabelo e unhas). As hifas penetram entre as células. A transmissão ocorre por meio do material fúngico das escamas da pele. Após a contaminação ocorre a inflamação cutânea, pruridos e algumas reações localizadas de hipersensibilidade.
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45 MICOSES PROFUNDAS
Os fungos causadores das micoses profundas compreendem os gêneros: Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides e Histoplasma.
ASPERGILLUS
Existem três espécies de importância Aspergillus flavus, Aspergillus niger (Figura 26) e Aspergillus fumigatus (a mais importante). Esses são fungos filamentosos que provocam infecções oportunistas em hospedeiros imunocomprometidos. Estão também bem difundidos no ambiente externo. E quando infectam, difundem-se para o pulmão e vasos sanguíneos. A infecção ocorre pela inalação dos conídeos (fase aerógena) e provoca trombose e infarto (quando nas veias sanguíneas) e provoca bloqueio das vias aéreas por massa fúngica e reação alérgica broncopulmonar (quando nos pulmões).
BLASTOMYCES
Dentro desse gênero, a principal espécie é a Blastomyses dermatitidis. Este fungo dimórfico invade o pulmão e pode se disseminar por todo o organismo. Causador da blastomicose por inalação de esporos aerógenos. A infecção fúngica dos pulmões pode se apresentar na forma de tuberculose e produzir abscessos.
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FIGURA 26 – CRESCIMENTO EM MEIO SÓLIDO DE ASPERGILLUS NIGER. AS SETAS MOSTRAM HIFAS AÉREAS E VEGETATIVAS
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FONTE: O autor.
CÂNDIDA
A Candida albicans com características dimórficas apresenta-se como leveduras nas superfícies mucosas como componente da microbiota. Quando invadem o tecido, podem formar hifas provocando lesões mucocutâneas localizadas em pacientes estressados. A doença que causa comumente é a candidíase.
COCCIDIOIDES
Dentro desse gênero (Figura 27), temos os Coccidioides immitis, que crescem como hifas no solo, mas são semelhantes a leveduras em cápsulas nos tecidos. A via de contaminação ocorre pela inalação de artroconídeos. Se a infecção ficar contida no pulmão, provoca uma doença branda, mas a disseminação pode acarretar uma doença grave.
FIGURA 27 – ESFREGAÇO EM LÂMINA MOSTRANDO AS FORMAS COCCIDIOIDES
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FONTE: http://acd.ufrj.br/LabImgBio/Micologia/ HISTOPLASMA
O Histoplasma capsulatum, é um fungo dimórfico que cresce no formato de hifas no solo em fezes de pássaros. A infecção ocorre pela inalação de esporos via aerógena, causando a uma doença pulmonar aguda ou crônica e uma doença grave que pode resultar da disseminação para outros órgãos. Uma vez no pulmão, os fungos crescem como leveduras e podem sobreviver intracelularmente após fagocitose.
46 Pneumocystis carinii
São organismos que invadem o trato respiratório e vivem extracelularmente nos alvéolos. Antigamente eram classificados como protozoários esporozoários, mas atualmente são classificados dentro do reino Fungi. Esses fungos causam uma doença semelhante à pneumonia e pode ser graves em pacientes imunocomprometidos. E a sua transmissão ocorre presumivelmente por gotículas.
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47 PROTOZOÁRIOS
O estudo da microbiologia abrange todos os organismos microscópicos, ou seja, os micro-organismos invisíveis a olho nu. Portanto, o termo micro-organismos é usualmente empregado de maneira restrita, primariamente aos vírus, bactérias e organismos relacionados. Algumas vezes, protozoários (parasitas) também têm sido incluídos como agentes secundários, mas em geral, são tratados como objetos de outras disciplinas, como a parasitologia. Os protozoários são eucariotos unicelulares, abundantes como organismos de vida livre no ambiente, mas são importantes parasitas do homem. A prevalência das infecções é maior em países de clima quente. A transmissão dos parasitos protozoários ocorre de maneiras variadas, mas as duas vias mais comuns são: picada de insetos hematófagos e da ingestão acidental dos estágios infectantes. Os protozoários infectam todos os tecidos e órgãos importantes do hospedeiro e vivem como parasitos intracelulares em uma ampla variedade de células, ou ainda, como parasitos extracelulares no sangue, no intestino e no sistema genitourinário. A transmissão entre hospedeiro depende da produção de estágios resistentes que são expelidos por um hospedeiro e subsequentemente ingeridos por outros. Os insetos vetores também estão envolvidos nesta transmissão e os estágios infectantes desenvolvem-se depois de o inseto alimentar-se em um indivíduo infectado, para então serem introduzidos no novo hospedeiro durante a próxima hematofagia.
CLASSIFICAÇÃO
Os protozoários são classificados em quatro grandes divisões que refletem sua estrutura, motilidade e modo de vida. A divisão: a) esporozoários: contém apenas parasitos intracelulares; b) flagelados: locomove-se pela movimentação de um ou mais flagelos;
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c) amebas: locomove-se por pseudópodos, não apresentam forma fixa; d) ciliados: locomove-se por meio da movimentação dos vários cílios.
Cryptosporidium parvum
Essa espécie é um esporozoário intestinal que invade e reproduz-se nas células epiteliais do intestino delgado. Formam oocistos que são eliminados nas fezes. A forma de infecção é por meio da ingestão de oocistos infectantes.
Entamoeba histolytica
É uma ameba intestinal, e vive como trofozoito produzindo cistos resistentes que são eliminados nas fezes. A transmissão ocorre via fecal oral.
Giardia lamblia
É um micro-organismo flagelado que vive no intestino e habita a mucosa do intestino delgado. A forma de infecção ocorre após ingestão de cistos, por meio da água contaminada.
Leishmania
Esse gênero compreende várias espécies de importância médica. Tais espécies são: Leishmania brasiliensis, Leishmania donovani, Leishmania amazonensis.
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Os micro-organismos que fazem parte desse gênero são esporozoários de vida intracelular. Eles são transmitidos por mosquitos flebótomos.
Plasmodium
O gênero contém quatro espécies causadoras de doença: Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e Plasmodium vivax. Os micro-organismos que fazem parte desse gênero são esporozoários de vida intracelular. Eles são transmitidos pela picada do mosquito anofelino infectado.
Toxoplasma gondii
São esporozoários intracelulares que formam cistos teciduais grandes. O hospedeiro natural é o gato, onde o parasita apresenta um ciclo entérico produzindo oocistos nas fezes. No homem, os micro-organismos podem invadir muitos tecidos. A transmissão ocorre por meio da ingestão de oocistos eliminados pelos gatos, ingestão de cistos tecidual em carne crua ou mal cozida e transmissão vertical.
Trichomonas vaginalis
Esse parasita é um flagelado do sistema urogenital de mulheres e ocasionalmente de homens. Não há cistos, apenas trofozoitos. A transmissão é venéria.
48.9 Trypanosoma
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Esse gênero contém três espécies que causam doenças: Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma cruzi. São micro-organismos flagelados do sangue e tecidos (intracelulares). A transmissão ocorre após o repasto sanguíneo de insetos hematófagos.
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48 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Hoje há uma certa pressão para que nós reconsideremos nossa opinião sobre o enfoque do estudo da microbiologia, em termos de micro-organismos que usualmente devem ser considerados em um livro texto. E também em termos do contexto que eles, e as doenças que causam, são discutidos. Existem duas razões para se chegar a essa conclusão: a) um conhecimento mais abrangente das bases biológicas da infecção, da doença, interações parasito-hospedeiro e da epidemiologia da doença infecciosa; b) com os atuais conhecimentos disponíveis, sabe-se que a resposta do hospedeiro é uma interação coordenada e sutil que envolve os mecanismos inatos e adaptativos de resistência, independente da natureza e identidade do micro-organismo envolvido.
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GLOSSÁRIO
Abscesso: acúmulo de pus em tecido ou órgão situado em uma cavidade; consequência de um processo infeccioso. Aeróbio: micro-organismo que tem necessidade de oxigênio para viver; que só se desenvolve em presença do ar. Aerossol: solução em que a fase dispersora é gasosa e a fase dispersa é gasosa ou líquida. Agar: extrato polissacarídeo de algas marinhas do gênero Gelidium, constituído de unidades monomérica de galactose e ácido galacturônico. Aglutinação: formação de agregados suficientemente grandes, de células interligadas por pontes moleculares de anticorpos que se combinam simultaneamente com determinantes antigênicos específicos. Alça de platina: instrumento de metal com alça na extremidade sustentada por um cabo. Utilizado para a inoculação de micro-organismos (ou amostras clínicas) em meios de cultura. Alfa Hemólise: hemólise incompleta causada por micro-organismos, na qual as hemácias do meio Agar retraem-se e tornam-se esverdeadas, ocorrendo apenas na presença do oxigênio devido à redução da hemoglobina. Anaeróbio: micro-organismos que não necessitam de oxigênio para o seu crescimento. Antibiograma: método utilizado para determinar a sensibilidade de um micro-organismo a antibióticos/quimioterápicos, por meio de difusão em Agar. Antimicrobiano: substância química capaz de matar ou suprimir o crescimento de microorganismos. Antibiótico. Antisséptico: substância que impede a proliferação de micro-organismos; desinfetante. Antissepsia: ato de matar, prevenir e/ou inibir o crescimento de micro-organismos na pele ou mucosas. Assepsia: processo no qual se afastam os micro-organismos infecciosos ou contaminantes, por meio do calor e agentes químicos. Autoclavagem: processo mais efetivo de esterilização que utiliza a técnica do calor úmido, por meio do vapor saturado sob pressão. Autoclave. Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR): bacilos resistentes à descoloração por uma solução álcool-ácida, durante a coloração pelo método de Ziehl-Neelsen. Bacitracina: antibiótico utilizado em teste microbiológico para identificação presuntiva de
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Streptococcus pyogenes. Bacteriemia: presença de bactérias no sangue. Bactericida: agente antibacteriano capaz de destruir bactérias. Bacteriostático: agente antibacteriano que inibe o crescimento de bactérias. Bacteriúria: presença de bactérias na urina. Beta Hemólise: hemólise completa causada por micro-organismos, no qual ocorre o clareamento do meio Agar sangue ao redor das colônias. Beta Lactamases: enzimas que destroem ou inativam penicilinas e/ou cefalosporinas. Podem ser produzidas por uma variedade de micro-organismos Gram positivos e Gram negativos. Cápsula bacteriana: camada viscosa, geralmente incolor, que envolve a parede celular de algumas bactérias. Usualmente são de natureza polissacarídea. Catalase: enzima produzida por algumas bactérias capaz de degradar o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. Cateter: estrutura tubular flexível usada para drenar fluídos de cavidades ou vasos. Cistite: infecção localizada na bexiga. Coagulase: enzima com atividade semelhante à da protrombina, capaz de produzir a coagulação sanguínea. Coleta: obtenção de amostras biológicas para exame laboratorial. Colônia bacteriana: crescimento macroscopicamente visível de micro-organismos na superfície de meios de cultura sólida. Colonização: crescimento bacteriano em determinadas áreas do organismo do hospedeiro. Coloração de Gram: método de coloração que consiste basicamente em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool e fucsina. Coloração Ziehl-Neelsen: método de coloração específico para bactérias álcool-ácido resistentes. Contaminação: introdução de micro-organismos em artigos, materiais, meios de cultura ou tecidos estéreis. Cultura: população de micro-organismos em crescimento, em determinado meio. Desinfecção: processo que mata ou remove micro-organismos patogênicos, com exceção de esporos bacterianos. Diplococos: cocos agrupados aos pares após a divisão. Esfregaço: suspensão ou amostra bacteriana espalhada de maneira uniforme e em uma fina camada sobre uma lâmina de vidro. Estéril: totalmente isento de qualquer micro-organismo.
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Esterilização: ato ou processo que destrói ou elimina todos os micro-organismos vivos de um material ou ambiente. Exsudato: líquido orgânico seroso, fibrinoso ou mucoso, proveniente de locais inflamados. Gastroenterite: síndrome caracterizada por sintomas como náusea, vômito, diarreia e desconforto abdominal. Gram Positivo: coloração de bactérias onde o tratamento com álcool não retira o complexo cristal violeta+lugol Gram Negativo: coloração de bactérias onde o tratamento com álcool extrai o complexo cristal violeta+lugol deixando as células descoradas. Hematúria: presença de hemácias na urina. Hemólise: destruição de hemácias com liberação da hemoglobina. Incubação: manutenção das culturas bacterianas em condições de temperatura e aeração favoráveis ao seu crescimento. Infecção: invasão, multiplicação e disseminação de micro-organismos em tecidos resultando em uma reação do hospedeiro. “In Vitro”: reação que ocorre fora do corpo ou realizado em meios artificiais. “In Vivo“: reação que ocorre no interior do corpo ou dentro de organismos vivos. Inoculação: introdução ou transferência de amostras biológicas ou micro-organismos para uma cultura estéril ou organismo, para subsequente identificação. Meio de Cultura: preparação líquida ou sólida que contém nutrientes. Optoquina: antibiótico utilizado em teste microbiológico na identificação presuntiva de Streptococcus pneumoniae. Piogênico: adjetivo que se refere à presença de infecção. Piúria: presença de leucócitos polimorfonucleares na urina. Placa de Petri: recipiente circular de vidro ou plástico utilizado na cultura de micro-organismos em meio sólido Sensibilidade: capacidade de um teste detectar corretamente a presença de uma doença. Septicemia: doença sistêmica na qual micro-organismos multiplicam-se livremente. Termoestável: que resiste ou não à inativação pelo calor. Termolábil: inativado ou destruído pelo calor, geralmente a 560C durante 30 minutos. Virulência: propriedade relativa à capacidade dos micro-organismos em causar doença.
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REFERÊNCIAS
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