Microbiologia Cerealelor

MICROBIOLOGIA CEREALELOR  1. INTR INTROD ODUC UCER ERE E

Cerealele reprezinta inca principala sursa alimentara pentru om si animale. Sunt produse de origine vegetala care, datorita compozitiei lor, au o microflora foarte variata, care depinde de diversi factori. Microflora poate fi originala si de contaminare. Microflora originala este in general de natura saprofita, iar cea de contaminare apare in special din sol, apa de irigare, manipulari, rozatoare, insecte. Boabele de cereale sunt sarace in apa, zaharuri libere, dar sunt bogate in amidon si proteine. Cerealele au un metabolism foarte lent. Cand conditiile devin favorabile, ritmul vital se accelereaza pentru boabe si se produce germinarea. Prezinta sisteme naturale de conservare, fiind protejate de agresiunea factorilor externi prin invelisuri si alti compusi, cum sunt unele proteine, care au actiune antifungica, sau de compusi volatili, cu actiune bactericida si fungicida. Boabele atacate, fisurate sau zdrobite sunt foarte vulnerabile la atacul microorganismelor. Din momentul recoltarii si pana la macinare, ele sunt susceptibile la contaminari produse de bacterii, drojdii si mucegaiuri  parazite sau saprofite. Principalele surse de contaminare a cerealelor sunt: -solul care este principalul rezervor de microorganisme. Prin intermediul solului are loc contaminarea radacinilor plantelor(microflora saprofita); -curentii de aer(microflora epifita); -insecte si rozatoare(microflora epifita). In functie de provenienta microorganismelor si de perioada de dezvoltare  poate exista: -microflora epifita primara, de camp; -microflora epifita secundara, de depozitare. In functie de repartizarea microorganismelor pe boabe, exista: -microflora interna; -microflora externa. Aceasta microflora este foarte eterogena-bacterii, drojdii, mucegaiuri, ea fiind influentata de diferiti factori. La cultivarea si pastrarea cerealelor pot sa apara diferite procese microbiologice.

1

Conditiile climaterice in perioada de recoltare influenteaza considerabil natura si numarul de microorganisme. Operatiile de treierare si eventual de uscare modifica natura contaminantilor. In timpul conservarii, microflora cerealelor si a produselor destinate macinarii se modifica. Microflora cerealelor reprezinta un potential pericol, atat din punct de vedere economic cat si sanitar.

2. COMPONENTA MICROBIOTEI 2.1. BACTERIILE

Provin in cea mai mare parte din sol. Principalele grupe de bacterii intalnite in cereale sunt: -familia Pseudomonadaceae cu genurile Pseudomonas, Xanthomonas, Aeromonas. Din genul Pseudomonas principalele specii care constituie microflora epifita a cerealelor sunt Pseudomonas herbicola si Pseudomonas fluorescens. -familia Micrococaceae cu genurile Micrococcus speciile M.candidus, caseolyticus, zeae, si genurile Pediococcus si Sarcina. -familia Achromobacteriaceae cu genul Flavobacterium. -familia Bacillaceae cu genurile Bacillus subtilis, cereus, pumilus, Clostridium butyricum, perfringens. -familia Enterobacteriaceae cu genurile Aerobacter, Erwinia, Escherichia coli, Proteus. -familia Lactobacteriaceae cu genurile Leuconostoc, Streptococcus, Lactobacillus delbrueckii, Lb. plantarum. Cerealele si derivatele acestora nu constituie un mediu favorabil pentru dezvoltarea microorganismelor patogene sau toxicogene ca: Salmonella, Clostridium, Staphilococcus. Acestea pot fi prezente numai in cazuri accidentale, cand sunt contaminate de rozatoare sau insecte. La recoltare produsele cerealiere sunt putin contaminate de Actinomycete, cunoscute datorita capacitatii lor de a produce antibiotice. Principalele specii de Actinomycete care se pot intalni pe cereale sunt: Streptomyces albus si griseus.

2

2.2. DROJDIILE

Numarul si variabilitatea drojdiilor depinde de conditiile climaterice din momentul recoltarii. Principalele genuri de drojdii intalnite sunt: Saccharomyces, Hansenula, Candida, Pichia. Numarul lor creste considerabil in conditii de umiditate ridicata la recoltare sau prestocare inainte de uscare.

2.3. MUCEGAIURILE

Se pot dezvolta in conditii foarte bune pe cereale. Marea majoritate a mucegaiurilor sunt de origine telurica si sunt xerofite, mezofile si hidrofile. Xerofitele au nevoie pentru crestere si dezvoltare de o umezeala relative a aerului de aproximativ 70%. Ele se inmultesc pe boabe la umiditati de 13,514,5%. Principalele genuri de mucegaiuri care se pot dezvolta pe cereale fac  parte din subdiviziunile: Zygomycotina, Ascomycotina, Deuteromycotina. Microflora externa este considerate ca o microflora de poluare si apartine de obicei subdiviziunii Deuteromycotina. Microflora interna este constituita din diferite specii fitopatogene: Fusarium nivale si roseum, genurile Helminthosporum, Ustilago, si de genurile saprofite: Alternaria, Cladosporium, Penicillium, Aspergillus. Din punct de vedere ecofiziologic, se poate realize o clasificare a mucegaiurilor in functie de etapele de contaminare a cerealelor astfel: -specii care contamineaza cerealele in camp inainte de recoltare, incapabile de a se dezvolta ulterior in timpul conservarii. Acestea formeaza microflora de camp ce cuprinde genurile Alternaria, Cladosporium, Verticillium si genurile cu tendinte parazitare: Septoria, Fusarium; -specii care sunt predominante in perioada de depozitare: Aspergillus, Penicillium, Eurotium. Sunt specii de contaminare secundara care produc diferite transformari cerealelor. Sunt capabile sa se dezvolte pe cereale cu umiditate de 15-16% si pot sintetiza micotoxine. Alte specii din genurile Absidia, Rhizopus, Mucor sau Cladosporium se intalnesc in cantitati mici. In cazul in care aceste mucegaiuri se gasesc in cantitati mari, pastrarea se realizeaza in conditii necorespunzatoare si arata o alterare avansata. 3

2.4. FACTORII CARE INFLUENTEAZA MODIFICAREA MICROFLOREI CEREALELOR LA DEPOZITARE

Acestia sunt: -factori extrinseci: umiditatea relative a aerului, temperature, continutul de oxygen(aerarea); -factori intrinseci: structura boabelor, gradul de integritate, calitatea masei de cereale. Influenta umiditatii asupra dezvoltarii microbiene:

Pe masura cresterii indicelui de activitate al apei, pericolul alterarii cerealelor creste. Daca activitatea apei intr-un produs este diminuata  progresiv, dezvoltarea microbiana este reprimata corespunzator, in trei maniere diferite: faza de latenta se lungeste, viteza de crestere in faza exponentiala este mai mica si nivelul maxim atins de populatia microbiana este redus, rezultatul general fiind o franare a dezvoltarii microorganismelor. Activitatea metabolica si posibilitatea de cresterea microorganismelor  depinde de disponibilitatea in apa. Tabelul 1:Limita de crestere a principalelor microorganisme in functie de a w Specii de microorganisme

Minim de crestere

Specii de microorganisme

Minim de crestere

Majoritatea  bacteriilor 

>0.95

Majoritatea drojdiilor 

>0.85

Bacillus cereus Bacillus subtilis Pseudomonas Lactobacillus

0.93 0.99 0.95 0.88

Debaryomyces hansenii Saccharomyces  bailii Saccharomyces rouxii

0.83

Majoritatea mucegaiurilor 

>0.85

0.8 0.62

4

Aspergillus flavus Aspergillus candidus Penicillium cuclopium Penicillium viridicatum

0.78 0.75 0.81 0.81

In functie de umiditatea relativa a aerului, microorganismele se impart in trei grupe: Tabelul 2 Tipul Umiditatea microorganismelor relativa a aerului (%)

Umiditatea boabelor (%)

Microorganisme

Aspergillus, Penicillium Majoritatea speciilor de mucegaiuri, unele bacterii lactice, Saccharomyces cerevisiae Drojdii, mucegaiuri,  bacterii

Xerofite

65-77

14-17

Mezofile

77-90

17-20

Hidrofile

90-95

20-30

Influenta temperaturii: pe cereale, microflora predominanta din punct de

vedere al temperaturii este cea mezofila(20-40°C). Acest interval de temperature este favorabil mucegaiurilor. La temperature de 10°C dezvoltarea mucegaiurilor este oprita. Exista si mucegaiuri care se pot dezvolta la temperature scazute si unele specii de microorganisme termitolerante: Aspergillus fumigatus, bacterii sporulate. Influenta continutului de oxigen: marea majoritate a microorganismelor 

intalnite pe cereale sunt aerobe. In depozitele de cereale in care nu se

5

realizeaza aerarea se dezvolta microorganisme anaerobe, in special drojdii,  bacterii anaerobe si numai anumite specii de mucegaiuri. Activitatea microorganismelor aerobe si procesul de respiratie a boabelor  favorizeaza formarea CO2, cresterea temperaturii si a umiditatii boabelor. De aceea este necesar sa se realizeze o ventilatie periodica a depozitelor si silozurilor. Influenta structurii boabelor: Boabele de cereale sunt acoperite de

diferite straturi de celuloza, hemiceluloza, care le protejeaza. Zona mai putin  protejata este cea a embrionului care contine sic ea mai mare cantitate de substante nutritive. Din aceasta cauza este sic ea mai expusa la atacul microorganismelor. Gradul de integritate a boabelor: de cele mai multe ori boabele intregi

sunt mai putin atacate de microorganisme, iar boabele zdrobite favorizeaza dezvoltarea microorganismelor, care au acces la substantele nutritive din  bob. Calitatea masei de boabe: In conditiile in care in masa de cereale exista

impuritati de diferite tipuri, acestea favorizeaza dezvoltarea microorganismelor, consecintele fiind reprezentate de pierderi. In conformitate cu statisticile FAO, aproximativ 5% din productia mondiala anuala de cereale se deterioreaza din cauza prezentei microorganismelor.

3. TRANSFORMARI NEDORITE 3.1. MODIFICARI PRODUSE DE MICROORGANISME ASUPRA CEREALELOR DEPOZITATE Incingerea cerealelor: se realizeaza prin cresterea temperaturii in masa de

 boabe, datorita activitatii fiziologice a boabelor, a microflorei specifice din timpul depozitarii si datorita prezentei insectelor. Reducerea masei de cereale are loc datorita activitatii metabolice a

microorganismelor, prin consumul substantelor nutritive si reducerea cantitatii de substanta uscata.

6

Alterarea cerealelor:

-dezvoltarea mucegaiurilor din genul Aspergillus si Penicillium diminueaza facultatea germinativa a boabelor; -modificarea culorii boabelor se datoreaza dezvoltarii mucegaiurilor si a unor specii de bacterii; -modificarea mirosului prin aparitia mirosului de mucegai, de incins, de  putrezit, de fermentat; -aciditatea titrabila a boabelor stocate creste in acelasi timp cu cresterea si  propagarea microorganismelor; -modificarea proprietatilor reologice ale fainurilor destinate panificatiei; -alergii, micoze, micotoxicoze care pot fi induse de microflora cerealiera; -riscul formarii micotoxinelor cum ar fi: aflatoxinele, ochratoxina, thricotecene, zearalenona, fumonizinele este mare in cazul cerealelor  contaminate cu mucegaiuri toxicogene. 3.2. BOLI FITOPATOGENE

Pot fi de natura diferita: micoze, bacterioze, viroze. Micozele sunt produse de mucegaiuri fitopatogene. Mai importante sunt

rugina, malura, taciunele, cornul secarei, fusariozele. Rugina este data de mucegaiuri din genul Puccina. Efectul consta in reducerea continutului proteic, a cantitatii de polizaharide. Boabele afectate sunt zbarcite, de culoare galben deschisa. Exista trei tipuri de rugina: bruna, neagra si galbena. Malura apare la grau si secara si este produsa de mucegaiul din genul Tilletia tritici. Taciunele este boala produsa de mucegaiul din genul Ustilago. Pe grau se dezvolta U. tritici, iar pe porumb U. maydis. Cornul secarei(Claviceps purpurea). Faina provenita din boabe contaminate este necorespunzatoare, contine substante toxice-ergotina-care  produce boala ergotism. Fusariozele sunt date de genul Fusarium, in special la grau, secara,  porumb. Bacteriozele la cereale sunt produse de diferite specii de Pseudomonas, care produce vestejirea bacteriana, bacterioza cenusie, bacterioza neagra.

7

Virozele la plante sunt produse de diferite virusuri care dau diferite boli:

cloroza manifestata prin patarea si decolorarea frunzelor, mozaicul, necroze, deformatii.

Figura 1. Mozaicul dungat al grâului Figura 2 Tăciunele zburător al grâului: Figura 3. Malura comuna

Figura 4. Rugina bruna

8

Figura 5. Rugina neagra (dreapta) si galbena(stanga)

Figura 6. Patarea bruna a frunzelor Figura 7. Innegrirea spicelor

9

Figura 8. Taciunele imbracat al orzului

Figura 9. Arsura frunzelor

Figura 10. Cornul secarei

Figura 11. Inflorirea alba a boabelor

10

4. CONTROLUL MICROBIOLOGIC

Principiile moderne de evaluare a calitatii microbiologice în industria alimentara vizeaza în principal trei categorii de proceduri analitice: -tehnici de evaluare calitativa, pentru evidentierea selectiva a unor  microorganisme indicatori, prin teste care sa ateste prezenta sau absenta acestora; -tehnici de evaluare cantitativa, pentru determinarea încarcaturii microbiene, care sa reflecte microbiota totala sau pe grupe specifice de microorganisme; -tehnici de izolare si caracterizare a unor microorganisme din microbiota nespecifica, în special pentru evidentierea potentialului patogen, toxicogen sau de alterare. Literatura de specialitate prezinta numeroase posibilitati de evaluare rapida a parametrilor microbiologici recomandati pentru aprecierea calitatii materiilor prime, pe faze de fabricatie, precum si a produselor finite. În general, în alegerea celei mai adecvate metode de analiza trebuie sa se tina seama de urmatoarele criterii:  – sensibilitate înalta pentru concentratii reduse de celule;  – acuratete şi precizie;  – rapiditate;  – sa implice o metodologie de lucru simpla, ieftina, nelaborioasa, universal aplicabila;  – sa ofere un raspuns prompt, usor interpretabil si reproductibil. Singurele metode care asigura conditii pentru evaluarea simultana din  punct de vedere cantitativ, calitativ si caracterizare a microbiotei sunt cele  bazate pe examen cultural. Evaluarile de acest tip prevad stabilirea gradului de contaminare microbiana, prin determinarea numarului de unitati formatoare de colonii (ufc), cand examenul cultural este corelat cu studii calitative de izolare si caracterizare a microorganismelor contaminante . Metodele culturale sunt în prezent mult simplificate prin utilizarea unor  sisteme comerciale, denumite Petrifilme, în care mediul de cultura specific (în general, un mediu selectiv), deshidratat este fixat pe un suport adeziv si acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidrateaza mediul si prin termostatare este posibila dezvoltarea microorganismelor.

11

Ofera numeroase avantaje, care se regasesc în reducerea timpului de analiza, reducerea pretului de cost al analizei per proba, cresterea numarului de probe analizate, asigurarea inocuitatii alimentelor si îmbunatatirea substantiala a productivitatii. Analiza calitativa:

Etape: -repartizarea mediului de cultura(MMA) in placi Petri; -solidificarea mediului de cultura; -repartizarea boabelor de cereale pe mediul de cultura( cca. 5 boabe la distante aproximativ egale) -termostatare la 25°C Analiza cantitativa:

5 boabe de cereale se introduc in 45 ml ser fiziologic steril(dilutia 1). Din diluatia 1 se ia 1 ml si se introduce in 9ml ser fiziologic steril.(dilutia 2). Se realizeaza mai multe dilutii si se fac inoculari din ultimele 2 dilutii succesive  pe MMA si BCA. In functie de coloniile care se dezvolta se realizeaza frotiuri pentru determinarea grupelor din care fac parte microorganismele  prezente in cerealele analizate. Tehnica de utilizare a Petrifilmelor în analiza microbiologica este extrem de simpla si presupune parcurgerea urmatoarelor etape (fig.1): -se dilueaza proba prin tehnica dilutiilor decimale pana la o concentratie de celule de aproximativ 10000 celule per ml; -se ridica filmul superior; -se inoculează 1 ml suspensie dintr-o dilutie corespunzatoare în centrul Petrifilmului asezat pe un suport special; -se elibereaza filmul superior, care se lasa sa cada liber; -cu ajutorul dispozitivului de raspandire se preseaza usor deasupra zonei inoculate pentru distributia uniforma a celulelor din suspensie pe toata suprafata circulara a mediului de cultura; -se îndeparteaza dispozitivul de raspandire si se asteapta un minut pentru solidificarea mediului; -se termostateaza (pachete de pana la 20 Petrifilme) în conditii optime, specifice pentru dezvoltarea microorganismelor analizate, în functie de recomandarile din instructiunile de utilizare a Petrifilmului. Eficienta aplicarii Petrifilmelor a condus la extinderea utilizarii acestora  pentru evaluarea calitatii microbiologice a numeroase alimente, precum:

12

lapte si produse lactate (branzeturi, iaurt, înghetata); carne si preparate din carne; peste si alte produse acvatice; oua; legume si fructe (cartofi, soia, mere, cirese, alune, nuci); cereale si produse cerealiere (faina, cereale mic dejun, paste fainoase); condimente .

1.

2.

3. Fig. 12. Etape de utilizare a Petrifilmelor în analiza microbiologica: 1 – inoculare; 2 – raspandire (etalare); 3 – termostatare; analiza

cantitativa si calitativa.

În concluzie, implementarea utilizarii Petrifilmelor în controlul calitatii microbiologice a alimentelor ofera numeroase facilitati care se reflecta în:  – simplitate în utilizare si interpretarea cu acuratete a rezultatelor, prin crearea unor conditii selective de crestere si de evaluare a microorganismelor testate. Evaluarile cantitative sunt facilitate, chiar în cazul dezvoltarii unui numar mare de colonii, prin caroiajul tiparit pe filmul inferior, care delimiteaza suprafete de 1 cm²;  – reducerea semnificativa a costului manoperei per analiza;  – reducerea la jumatate a timpului necesar pentru realizarea analizelor  microbiologice, cu impact pozitiv asupra: controlului eficient al punctelor  critice, optimizarii strategiilor de control, cresterii numarului de analize efectuate, eficientizarii procesarii, îmbunatatirii calitatii si asigurarii inocuitatii produselor finite; 13

 – impact pozitiv asupra organizarii laboratorului de microbiologie, prin eliminarea operatiilor de pregatire si sterilizare a mediilor de cultura si a ustensilelor de laborator, impuse de metodele conventionale de analiza microbiologica;  – riscuri reduse pentru mediul înconjurator dupa utilizare;  – economie de spatiu la transport, pastrare si termostatare.

Fig. 13. Dezvoltarea selectiva a microorganismelor, în functie de natura Petrifilmelor: 1 – drojdii si mucegaiuri; 2 – bacterii aerobe mezofile; 3 – enterobacterii; 4 – bacterii coliforme/ E. coli.

14

Tabelul 3. Normative nationale:

 Nr. total de germeni aerobi mezofili/g Bacterii coliforme E. coli Salmonella Stafilococi coagulazo-pozitivi Bacillus cereus Vibrio parahaemolyticus Bacterii sulfitoreducatoare Drojdii si mucegaiuri

absente absenta absenta absenti 100/g absent absente 1000/g

5. CONCLUZII

Microflora cerealelor reprezinta un potential pericol, atat din punct de vedere economic cat si sanitar datorita: -pericolului de acumulare a micotoxinelor; -pierderilor in greutate; -posibilitatii de acumulare a substantelor toxice de tipul ergotinei; -modificarii culorii si mirosului cerealelor care pot determina respingerea loturilor; -alergiilor, micotoxicozelor, micozelor induse de microflora cerealiera, etc.

15

BIBLIOGRAFIE:

1. Prof. Dr. Ing. CLEMANSA TOFAN- “Microbiologie alimentara”, Ed. Agir, Bucuresti, 2004 2. Buletinul Agir nr. 3/2003- “Evaluarea calitatii microbiologice a alimentelor prin utilizarea petrifilmelor” 3. Conf. Ing. Maria Contoman- “Curs de fitopatologie” 4. Ordinul nr. 975 din 16 decembrie 1998 privind aprobarea normelor  igienico-sanitare pentru alimente.

16