microbiologia alimentelor volI

ISBN electronic: 978-606-8236-25-4 Coordonatori: Simona Ivana Autori: Alexandru T. Bogdan Simona Ivana

Iulian Ţogoe

Ipate Iudith

Gheorghe Câmpeanu

Traian Enache Stelian Bărăităreanu Alexandru Popescu

MicrobiologiA ALIMENTELOR - volumul II  Patogeni alimentari Ediţie îmbunătăţită şi revizuită

Editura Asclepius Bucureşti, 2011 1

Toate drepturile sunt rezervate editurii. Tipărit în România. Nici o parte din această lucrare nu poate fi reprodusă sub nici o formă, prin nici un mijloc, mecanic sau electronic sau stocată într-o bază de date, fără acordul prealabil, în scris, al editurii. All rights reserved. Printed in Romania. No part of this publication may be reproduced or distributed in any form, by any means or stored in a data base or retrieval system without the prior, written, permission of the editor.

ISBN electronic: 978-606-8236-25-4

Editura Asclepius, Bucureşti Tel: 072.44.66.481, tel/fax: 021/242.11.01 Website: www.asclepius.ro, e-mail: [email protected] 2

Cuprins CAPITOLUL 1 BACTERII PATOGENE CE SE TRANSMIT PRIN ALIMENTE 9 1.1. Patogeni alimentari 9 1.1.1. Introducere 9 1.1.2. Modul de transmitere 10 1.1.3. Patogenitate 11 1.1.3.1. Descrierea Quorum sensing 13 1.1.3.2. Biofilmele 16 1.1.3.3. Factorii sigma alternativi 19 1.1.3.4. Răspunsul la toleranţa acidă (ATR) 19 1.2. Bacteriile Gram pozitive 21 1.2.1. Listeria monocytogenes 21 1.3. Bacteriile Gram negative 22 1.3.1. Genul Salmonella 22 1.3.2. Escherichia coli 24 1.3.3. Genul Yersinia 25 1.3.4. Genul Shigella 26 1.3.5. Genul Vibrio 26 1.4. Concluzii 27 CAPITOLUL 2 TOXIINFECŢII ALIMENTARE PRODUSE DE BACTERII DIN GENUL STAPHYLOCOCCUS 36 2.1. Staphylococcus aureus 36 2.1.1. Istoric 36 2.1.2. Taxonomie 37 2.1.3. Incidenţa speciilor de stafilococi în alimente 38 2.1.4. Condiţii de cultivare şi caractere culturale 40 2.1.4.1. Temperatura 41 2.1.4.2. Efectul substanţelor chimice 41 2.1.5. Caractere morfologice 45 2.1.6. Proprietăţi biochimice 45 2.1.7. Tipurile de enterotoxine stafilococice şi incidenţa lor 47 2.1.7.1. Proprietăţi chimice şi fizice ale enterotoxinelor stafilococice 49 2.1.7.2. Modul de acţiune al enterotoxinelor stafilococice 50 2.1.8. Ecologie 52 3

2.1.8.1. Habitat şi distribuire 52 2.1.9. Patogenitatea 54 2.1.10. Structura antigenică 59 2.1.11. Infecţia naturală 60 2.1.12. Infecţia experimentală 62 2.1.13. Imunoprofilaxie 62 2.1.14. Sindromul gastroenteritelor stafilococice 63 2.1.15. Incidenţa toxiinfecţiilor alimentare produse de stafilococi şi alimentele vehicul 63 2.1.16. Prevenirea sindroamelor de intoxicaţii stafilococice şi de alte intoxicaţii alimentare 64 2.1.17. Staphylococcus aureus meticilino-rezistent (MRSA) 65 2.1.18. Metode de izolare şi identificare a lui Stp. aureus din alimente 66 CAPITOLUL 3 TOXIINFECŢII ALIMENTARE PRODUSE DE BACTERII DIN GENUL BACILLUS 78 3.1. Bacillus anthracis 78 3.1.1. Taxonomie 78 3.1.2. Istoric 79 3.1.3. Morfologie 80 3.1.4. Condiţii de cultivare şi caractere culturale 81 3.1.4.1. Aspecte culturale 81 3.1.5. Proprietăţi biochimice 82 3.1.6. Proprietăţi antigenice 82 3.1.7. Ecologie 83 3.1.8. Sensibilitatea faţă de factorii de mediu 83 3.1.9. Patogenitatea 83 3.1.10. Infecţia naturală 84 3.1.11. Infecţia experimentală 86 3.1.12. Diagnosticul la om 86 3.1.12.1. Diagnosticul diferenţial 86 3.2. Bacillus cereus 91 3.2.1. Introducere 91 3.2.2. Patogenitate 91 3.2.3. Sindromul diareic 92 3.2.4. Sindromul emetic 93 3.2.5. Determinarea numărului cel mai probabil de germeni (most probable number, MPN) 94 4

3.3. Bacillus subtilis 100 3.3.1. Taxonomie 100 3.3.2. Caractere generale 100 3.3.3. Morfologie 100 3.3.4. Proprietăţi biochimice 100 CAPITOLUL 4 TOXIINFECŢII ALIMENTARE PRODUSE DE BACTERIILE DIN GENUL CLOSTRIDIUM 111 4.1. Clostridium botulinum 111 4.1.1. Taxonomie 111 4.1.2. Istoric 112 4.1.3. Morfologie 113 4.1.4. Condiţii de cultivare şi caractere culturale 115 4.1.5. Proprietăţi biochimice 116 4.1.6. Proprietăţi antigenice 117 4.1.7. Ecologie 117 4.1.8. Patogenitate 118 4.1.9. Sensibilitatea faţă de factorii de mediu 119 4.1.10. Intoxicaţia botulinică 120 4.1.11. Situaţia epidemiologică a botulismului 120 4.1.12. Situaţia botulismului în România, între anii 2003 şi 2009, 122 4.1.13. Metode de izolare şi identificare a speciei 133 Clostridium botulinum din alimente 133 4.1.14. Detectarea lui C. botulinum viabil 135 4.2. Clostridium perfringens 138 4.2.1. Introducere 138 4.2.2. Istoric 139 4.2.3. Morfologie 139 4.2.4. Condiţii de cultivare şi caractere culturale 140 4.2.5. Proprietăţi biochimice 142 4.2.6. Proprietăţi antigenice 143 4.2.7. Patogenitate 143 4.2.8. Infecţia experimentală 146 4.2.9. Infecţia naturală 146 4.2.10. Prevenire şi combatere 147 4.2.11. Metode de izolare şi identificare a lui C. perfringens din alimente 148 5

CAPITOLUL 5 IMPLICAŢIILE BACTERIILOR DIN GENUL LISTERIA ÎN PRODUCEREA TOXIINFECŢIILOR ALIMENTARE 160 5.1. Listeria monocytogenes 160 5.1.1. Caractere generale 160 5.1.2. Istoric 161 5.1.3. Taxonomie 162 5.1.4. Morfologie 163 5.1.5. Condiţii de cultivare şi caractere culturale 165 5.1.6. Proprietăţi biochimice 166 5.1.7. Sensibilitatea faţă de factorii de mediu 167 5.1.8. Structura antigenică 170 5.1.9. Patogenitatea 170 5.1.10. Izolarea şi identificarea 173 5.1.11. Listerioza umană 173 5.1.12. Epidemiologie 174 5.1.13. Transmiterea prin alimente 176 5.1.14. Transmiterea listeriozei la animale 178 5.1.15. Toxiinfecţiile alimentare produse de Listeria monocytogenes 184 5.1.16. Profilaxie şi combatere 186 5.1.17. Metoda şi schema de lucru utilizată pentru izolarea şi identificarea lui Lis. monocytogenes 189 CAPITOLUL 6 Implicaţiile bacteriilor din genul Mycobacterium în producerea toxiinfecţiilor alimentare 201 6.1. Mycobacterium avium subspecia paratuberculosis 201 6.1.1. Istoric 201 6.1.2. Morfologie 201 6.1.3. Condiţii de cultivare şi caractere culturale 201 6.1.4. Proprietăţi biochimice 202 6.1.5. Proprietăţi antigenice 202 6.1.6. Ecologie 202 6.1.7. Patogenitate 202 CAPITOLUL 7 Implicaţiile bacteriilor din familia Enterobacteriaceae în producerea toxiinfecţiilor alimentare 208 6

CAPITOLUL 8 Implicaţiile bacteriilor din genul Salmonella în producerea toxiinfecţiilor alimentare 214 8.1. Caractere generale 214 8.2. Istoric 215 8.3. Taxonomie 216 8.4. Morfologie 218 8.5. Condiţii de cultivare şi caractere culturale 218 8.6. Proprietăţi biochimice 221 8.7. Proprietăţi antigenice 223 8.8. Nomenclatura salmonelelor 227 8.9. Ecologie 228 8.10. Patogenitate 229 8.11. Sensibilitatea faţă de factorii de mediu 231 8.12. Infecţia experimentală 231 8.13. Serotipuri de salmonele patogene 232 8.14. Salmoneloza non-tifoidică la om 235 8.15. Epidemiologie 241 8.15.1. Distribuţia cazurilor de salmoneloză umană 243 8.15.2. Supravegherea salmonelozelor 244 8.16. Rezervoare şi căi de infecţie 245 8.17. Contaminarea alimentelor 246 Contaminarea cărnii 246 Contaminarea ouălor 247 Contaminarea laptelui şi produselor lactate 247 Contaminarea în timpul manipulării alimentelor 248 8.18. Măsuri de prevenire şi combatere a salmonelozelor 248 8.19. Diagnosticul de laborator al toxiinfecţiilor alimentare produse de salmonele 253 Recoltarea probelor 253

7

Cuvânt înainte, Anul editorial 2010, în domeniul medicinii veterinare marchează apariţia unei lucrări deosebite, a unui tratat remarcabil de Microbiologie a alimentelor, atât de necesar într-o perioadă, în care, siguranţa şi controlul alimentelor se impune, atât ca prudenţă profilactică cât şi ca necesitate de aliniere acceptată, la tot ceea ce reprezintă reglementările UE. Lucrarea de faţă este realizată pe baza unui material bibliografic extrem de bogat şi recent, care poartă amprenta experienţei profesionale şi ştiinţifice a autoarei, cadru didactic la disciplina de Microbiologie-Imunologie, din anul 1990. O lucrare de asemenea dimensiuni (compusă din cinci volume), acoperitoare a domeniului microbiologiei, a însemnat un adevărat curaj conştient, bazat pe competenţă şi pe obligaţia resimţită de autor, de a pune la dispoziţia celor vizaţi, nu puţini la număr, medici veterinari, medici umani, oameni de sănătate publică, cercetători, specialişti microbiologi. Nu în ultimul rând, tratatul se adresează studenţilor facultăţilor de medicină veterinară şi medicină umană, chemaţi să-i înţeleagă importanţa, din punctul de vedere al sănătăţii animale şi al scopului final, Sănătatea Publică. O asemenea întreprindere de lung respir pune la dispoziţia generaţiilor tinere, un volum de cunoştinţe selecţionate şi reprezintă răspunsul evident, la acumularea informaţiilor microbiologice şi la aplicaţiile rezultatelor cercetării, în domeniul biotehnologiei. Modul de prezentare, fără reproş, fluent, cu grija cadrului didactic şi al omului de ştiinţă, pentru limbaj, exprimarea ştiinţifică într-un stil clar şi corect mărturiseşte calităţile autoarei. Nu-i uşor să-i convingi pe cei vizaţi, să participe la o asemenea lucrare, chiar dacă au motivaţia necesară, nu-i uşor să dai dovadă de perseverenţă de a începe a urmări, redacta, volumele tratatului, într-un stil unitar. Volumul prim al Microbiologiei Alimentelor, cuprinde Bacteriologia Generală, morfologia-structura celulei procariote, elemente de nutriţie şi metabolism bacterian, creşterea şi multiplicarea, utilizări în biotehnologie, influenţa factorilor fizici, chimici şi biologici asupra bacteriilor, genuri bacteriene şi ciuperci microscopice (mucegaiuri, levuri) izolate din alimente, sursele principale de microorganisme prezente în alimente, tipuri de fermentaţii şi produse alimentare. Mai puţin obişnuit, într-un asemenea tratat este pledoaria pentru cercetare, pentru verificarea ideilor, prin observaţii şi experimente, care să susţină ipoteza de lucru, alături de deducţie şi inducţie; sunt enumerate calităţile cardinale ale celor chemaţi să lărgească orizontul cunoştinţelor noastre (curiozitate, lipsa prejudecăţilor, scepticismul, creativitatea şi cooperarea, revizuirea opiniilor). Lucrarea meritorie datorată faptului că pune la îndemână cititorilor avizaţi numeroase informaţii ştiinţifice, deosebit de utile în domeniile microbiologiei alimentelor.

Prof. univ. Dr. Constantin CIUFECU, UMF Carol Davila, Membru titular al Academiei de Ştiinţe Medicale 8

CAPITOLUL 1 BACTERII PATOGENE CE SE TRANSMIT PRIN ALIMENTE 1.1. Patogeni alimentari 1.1.1. Introducere Cu toate ca multe boli infecţioase se pot transmite prin alimente (de exemplu: listerioza, colita hemoragică), ne vom referi în acest capitol la cele care produc îmbolnăviri exclusiv sau predominant prin consumul de produse alimentare (botulism-intoxicaţii stafilococice). Antraxul şi bruceloza sunt două zoonoze temute ce se transmit, însă foarte rar prin consumul unor produse alimentare de la animalele bolnave. În categoria patogenilor alimentari recunoscuţi se încadrează bacterii, virusuri, fungi, prioni, protozoare, precum şi paraziţi animali multicelulari. Tabelul 1.1. Patogeni alimentari Bacterii Gram pozitive Staphylococcus sp. Bacillus cereus B. anthracis Clostridium botulinum, C. argentinensis C. perfringens Listeria monocytogenes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Bacterii Gram negative Salmonella Shigella Escherichia Yersinia Vibrio Campylobacter Aeromonas (?) Brucella Plesiomonas (?) 9

Virusuri Hepatita A Norovirusuri (Norwalk, etc.) Rotavirusuri Prioni Infecţia Creutzfeldt-Jakob (varianta nouă)

1.1.2. Modul de transmitere Este evident că pentru producerea unei toxiinfecţii alimentare trebuie ingerat fie agentul patogen, fie toxinele preformate ale acestuia. Cu excepţia toxinelor botulinice, aminotoxinelor şi a toxinelor fitoplanctonului, aproape toţi agenţii patogeni menţionaţi pot fi contactaţi pe cale fecalorală. Vehicularea acestora se face fie prin intermediul operatorilor din industria alimentară, fie prin vectori (exemplu: insectele), fie prin elemente constituente ale alimentelor, cum ar fi apă contaminată (fig. 1.1.). Figura 1.1. Rute fecal-orale de transmitere a patogenilor intestinali de origine alimentară Gură

Obiecte de joacă ale copiilor

Alimente Hrană, tacâmuri

Insecte Degete

Apă

Fecale 10

1.1.3. Patogenitate Pentru ca gazda să fie invadată sunt necesare o suită de evenimente nedorite, pe care agentul patogen trebuie să le execute: 1. să supravieţuiască trecerii prin mediul acid conferit de pH-ul gastric. Unii agenţi se protejează de acest mediu prin înglobarea în bolul alimentar, iar alţii folosesc mecanisme adaptative proprii de rezistenţa la pH-ul acid; 2. să se ataşeze sau să colonizeze pereţii intestinali, în aşa fel încât să-şi poată mări populaţia; Prima linie de apărare a organismului împotriva invaziei patogenilor alimentari este reprezentată de mucoasa intestinală. De exemplu, Lis. monocytogenes străbate stratul de mucus prin intermediul listeriolizinei (LLO), iar C. perfringens nu are nevoie să învingă această barieră pentru că se pare că nu trebuie să se ataşeze la ţesuturile intestinale. 3. să posede „arme” împotriva mecanismelor de apărare ale gazdei (de exemplu: limfonodurile asociate intestinului); 4. să fie pregătit de lupta cu noua „armată” heterogenă a microflorei intestinale. Acest lucru se realizează pe principiul excluderii competititve, prin faptul că microflora inofensivă odată ataşată la toate situsurile disponibile ale pereţilor intestinali vor exclude alte microorganisme. Deasemenea, tractul gastrointestinal reprezintă un mediu sărac în O2 şi, de aceea, majoritatea microorganismelor de la acest nivel sunt anaerobe. Totuşi, s-a observat că, de exemplu, S. typhimurium poate creşte în astfel de medii datorită capacităţii sale de a pătrunde în celulele mamiferelor. 5. să fie capabili, odată ataşaţi, să elaboreze produşi toxici, ori să treacă de peretele epitelial şi să patrundă în celulele somatice sau în fagocite (de exemplu: Lis. monocytogenes). Capacitatea de a respecta aceste cerinţe nu este la dispoziţia oricărui agent microbian, majoritatea lor neputânt învinge mecanismele defensive ale organismului uman. Aceasta reprezintă probabil motivul pentru care nu se pot încadra în categoria agenţilor patogeni care se transmit prin consumul de alimente. Situsurile de ataşare şi mecanismele de virulenţă ale patogenilor alimentari sunt discutate mai jos: În figura 1.2 este prezentată o diagramă a aparatului digestiv al omului, iar în tabelul 1.2 este prezentată o listă cu agenţii patogeni capabili să colonizeze diferite organe şi aparate. În tabelul 1.2 Helicobacter sp. este prezentată ca fiind singura bacterie capabilă să colonizeze pereţii stomacului. Se ştie că Sarcina ventriculi (germen strict anaerob) se dezvoltă în stomac, dar nu este un patogen alimentar. Acelaşi lucru trebuie demonstrat şi despre H. peglosi. pH-ul stomacului în timpul ingestiei este între 3 şi 5 putând 11

ajunge chiar la 1,5 dacă este privat de hrană. Figura 1.2. Diagrama sistemului digestiv uman. Courtesy of John W. Kimball, © 1965, Andover Massachusetts

Glande salivare

Dinţi Limbă

Faringe Epiglotă Esofag

Ficat

Stomac

Vezică biliară

Sfincterul piloric Pancreas

Duoden

Intestinul gros Intestinul subţire

Cecum Apendice cecal

Rect Anus 12

Tabelul 1.2. Tipuri de toxiinfecţii alimentare localizate la nivelul diferitelor organe la om Musculatura scheletică Trichinella spiralis Stomac Helicobacter pylori Ficat Clonorchis - „viermele de gălbează” (fascioloză) Listeria monocytogenes Hepatita A şi E Intestinul subţire Astrovirusuri Bacillus cereus Campylobacter jejuni (porţiunea distală a ileonului) Clostridium perfringens Cryptosporidium parvum Cyclospora cayetanensis Escherichia coli - tulpinile EPEC şi ETEC Giardia lamblia Hepatita A

Listeria monocytogenes Rotavirusuri Salmonella spp. (nontifoidă) - porţiunea terminală a ileonului) S. Typhi (porţiunea distală a intestinului subţire) Shigella spp. (porţiunea terminală a ileonului şi jejunului producând diareea apoasă) Toxoplasma gondii Cestode Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Yersinia spp. Intestinul gros/colon Campylobacter spp. (colon) E. coli - tulpinile EHEC (enterohemoragică) şi EPEC (enteropatogenă) (colonul ascendent şi transvers) Entamoeba histolytica Plesiomonas shigelloides (formă aparentă) Salmonella Enteritidis Shigella sp., în special S. dysenteriae

1.1.3.1. Descrierea Quorum sensing Această metodă permite exprimarea anumitor funcţii fiziologice şi fenotipice bazate pe densitatea populaţiei bacteriene. Este prezentă aici datorită rolului jucat de densitate în virulenţa unor bacterii şi implicării acesteia în alte infecţii. Sistemul prototip pentru detectarea densităţii este Lux1-LuxR (Lux=gena luminiscentă) descris prima dată în 1970 la Vibrio fisheri. În figura 1.3 este explicată metoda de detectare a densităţii la bacteriile Gram negative. În partea stângă a figurii 1.3. o celulă de V. fisheri secretă moleculele de autoinductor (AI) prin sinteza autoinductorului Lux I. Se continuă (cu un număr mic de celule) producţia de AI, fară să apară vreun efect de comunicare între celule. AI se ataşază proteinei LuxR care este un activator transcripţional ce declanşează expunerea genelor. În tabelul 1.3 sunt prezentate câteva din expresiile fenotipice de la anumite 13

microorganisme. Fig. 1.3. Densitate celulară scăzută

Densitate celulară crescută

Cu transcripţia genei ţintă

Fără transcripţia genei ţintă

Autoinductor (autoinducer) Proteina “R” Quorum sensing la organismele Gram negative are două componente: proteina activator transcripţional (proteina “R”) şi molecula AI care este produsă prin sinteza autoinductor. AI se acumulează în celulă până la nivelul de umplere al acesteia. În acest moment se produce cuplarea moleculelor AI şi activarea proteinei R inducând expresia genei. Proteina “R” este formată din 2 domenii: proteina N-terminală care interacţionează cu AI şi C-terminală implicat în legarea DNA-ului. Moleculele AI ale bacteriilor Gram negative sunt N-acyl-HSL, (American Society of Microbiology). Tabelul 1.3. Câteva răspunsuri fenotipice ale bacteriilor Gram negative, ca o consecinţă a Quorum Sensing Bacterii Gram negative Vibrio fischeri Escherichia coli Escherichia coli mutanta LuxS Escherichia coli Escherichia coli E. coli EHEC şi EPEC Serratia liquefaciens Serratia marcescens Pantoea stewartii Pectobacterium carotovorum Pectobacterium chrysanthemi Burkholderia cepacia Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa

Răspunsuri fenotipice Bioluminiscenţă Producţia toxinei Stx Încetinirea vitezei de înot Formarea de att/eff Răspuns SOS Sistem secretor tipul III Mobilitate foarte activă Producţie de prodigiozină; sinteza carbapenului Creşterea producţiei de polizaharide Producţie de enzime care degradează peretele celular al plantelor Producerea liazelor pectate Proteaze, producerea de siderofori Producerea de exoproteaze Structură de biofilm

Dacă celula din stânga figurii 1.3. se presupune a fi V. fisheri, este non14

luminiscentă, cea din dreapta este bioluminiscentă datorită dobândirii unui „quorum” de AI care se leagă de LuxR. Autoinductorul-2 (AI-2) reprezintă un semnal alternativ al „quorumului” la V. harveyi unde reglează bioluminiscenţa în asociere cu AI-1. Sistemul AI-2 a fost demonstrat la mai multe bacterii patogene Gram negative. Numărul minim de celule necesare pentru a crea un „quorum” a fost foarte rar raportat. Într-un studiu al enterobacteriaceelor pshichotrofe de origine alimentară, pentru a da un răspuns pozitiv biosenzorilor folosiţi, a fost necesar un „quorum” de cel puţin 106 ufc/g. Cele mai studiate şi mai folosite substanţe AI pentru bacteriile Gram negative sunt lactonele – M-acetilhomoserine (AHLs). Aceşti compuşi sunt formaţi din homoserine (cu un inel de lactonă) şi un lanţ acil cu 3 pană la 10 atomi de carbon (fig. 1.4.). Nu toate bacteriile Gram negative folosesc sistemul Lux I-LuxR. De exemplu, V. harveyi, E.coli şi S. typhimurium prezintă un sistem de producere diferit al autoinductorilor. În plus, faţă de AHLS, unele bacterii Gram negative produc dipeptide ciclice implicate în detectarea “quorumului”, fie singure, fie în combinaţie cu AHLS. Fig. 1.4. Structura a 4 autoinductori quorum sensing (Degrassi et al.)

Legendă: A = N-butanoil-L-lactonă homoserină; B = N-hexanoil-L-lactoză homoserină; C = ciclo(L-Tir-L-Pro); D = ciclo(L-Leu-L-Pro).

La patogenii alimentari a fost demonstrată creşterea toxinelor Stx, iar genele pentru Stx au fost induse de detectarea „quorumului”. Anumite bacterii Gram negative psichotrofe produc AHLS în alimente contaminate natural, când numărul de celule a ajuns la 105-107 ufc/g. Detectarea „quorumului” este importantă în formarea biofilmelor, iar 15

acest lucru este prezentat mai jos. În cazul bacteriilor Gram pozitive, AIurile sunt reprezentate de peptide, feromoni peptidici şi nisină. Reglarea densităţii celulelor din aceste sisteme descrise de către Kleerebezen et. al. se pare că urmează o temă comună, în care semnalul molecular este dat de un peptid procesat post translaţional care este secretat de un „ ATP-bendingcasette-exporter” (exportator de casete ce leagă ATP-ul). Feromonul peptidic secretat funcţionează ca un semnal „input” (input signal) pentru un senzor specific dintr-un sistem de transducţie a semnalului (“signal-transduction system”) format din două componente. Este interesant faptul că unele bacterii Gram pozitive cum ar fi Bacillus spp. produc lactonaze care degradează specific AHL-urile produse de către bacteriile Gram negative. Printre alte activităţi fenotipice şi fiziologice demonstrate la bacteriile Gram pozitive se numără răspunsul virulent produs de Stp. aureus, precum şi producerea de peptide antimicrobiene, altele decât nisina. S-a demonstrat că aceasta din urmă îşi induce propria sinteză. Detectarea axonului a fost demonstrată la Stp. aureus şi Stp. epidermidis. Când cele două bacterii au fost cultivate împreună, Stp. epidermidis s-a părut a fi favorit, ceea ce sugerează că acest lucru ar putea fi motivul pentru care această specie predomină pe piele, unde feromonii autoinductori sunt mai eficienţi decât în interiorul corpului. La Stp. aureus un feromon octopeptidic îşi manifestă virulenţa prin activarea locusului agr. Detectarea „quorumului” in vivo este problematică din cauza lipsei generale de oportunităţi pentru ca substanţele AI să ajungă la aceasta. 1.1.3.2. Biofilmele Un biofilm este reprezentat de bacterii, fungi sau protozoare singure sau în combinaţii legate împreună de o matrice extracelulară ataşată de o suprafaţă solidă sau fermă. Exemplele obişnuite includ suprafeţele mucoide (slime surfaces) formate pe pietrele sau buştenii din apele curgătoare, placa dentară şi stratul mucos de pe carne, peşte, păsări care s-au stricat în frigider. Aceste biofilme aderă la suprafeţele respective, în special datorită concentraţiei mari de nutrienţi. În studiile de laborator aderenţa la suprafeţe, este mai mare în mediile îmbogăţite. Ataşarea este facilitată de o excreţie microbiană exopolizaharidică ce poartă uneori denumirea de glicocalix. În acest micromediu se formează colonii care comunică între ele prin canalele de apă formând astfel un sistem circulator primitiv în care nutrienţii sunt aduşi înăuntru, iar subprodusele toxice sunt eliminate. Celulele microbiene din lichide care nu sunt cuprinse în biofilm se află într-o stare de plancton (tree-floating). 16

În timp ce în condiţii naturale biofilmele sunt compuse, de obicei, din culturi mixte, în studiile de laborator acestea sunt formate din culturi pure. Ca exemple de suprafeţe solide folosite pentru studiul bacteriilor patogene din alimente se pot da: adezivul de podea, lamele de sticlă, nylon, policarbonat, polipropilenă, cauciuc, oţel inoxidabil, teflon, sticlă şi oţel inoxidabil sunt folosite pe scară largă. Pe baza numeroaselor studii care au fost făcute pe alimente se pot trage urmatoarele concluzii: 1. Cu toate că biofilmele de culturi pure apar în mediile de îmbogăţire (de exemplu: bulion triptic de soia), după 24 de ore, la temperaturi adecvate creşterii, dezvoltarea maximă apare în 3 zile la 24oC. De exemplu Lis. monocytogenes a crescut la 6-7log10/cm. 2. Nu toate tulpinile din aceeaşi specie sunt capabile în mod egal de iniţierea formării biofilmului, iar ataşarea la suprafeţe şi formarea biofilmului reprezintă procese diferite. 3. Microorganismele din biofilme pot prezenta reacţii fiziologice diferite faţa de formele planctonice, iar biofilmele pot conţine celule viabile, dar care nu se pot cultiva în condiţii de laborator. 4. Microorganismele din biofilme sunt foarte rezistente faţă de agenţii de curăţire şi sanitaţie. Folosiţi în combinaţie aceştia sunt mult mai eficienţi în eliminarea biofilmului. 5. Ataşarea unui patogen la diferite suprafeţe, poate fi ajutată de formarea unui biofilm de cultură mixtă, iar un astfel de exemplu este prezentat mai jos. Într-un biofilm cu cultură mixtă de Lis. monocytogenes şi Flavobacterium sp. pe suprafaţa de oţel inoxidabil Lis. monocytogenes a aderat mai bine şi a persistat mai mult decât în cultură pură. Shewanella putrefaciens a format biofilme pe suprafeţele inerte de procesare ale alimentelor, iar când s-au adaugat nutrienţi au fost formate mai multe straturi de structuri. Tulpinile de Lis. monocytogenes izolate din diferite epidemii umane au produs biofilme unice pe oţelul inoxidabil. Acestea erau în formă de faguri de miere (honey comb) Tulpina Scott a fost cea mai interesantă prin faptul că nu a format biofilme în condiţii de laborator. Într-un alt studiu, tulpinile de Lis. monocytogenes care produc cea mai multă substanţă extrapolimerică (EPS) au produs un biofilm tridimensional în contrast cu tulpinile de control. Formarea biofilmelor nu a putut fi corelată cu serotipul. La Pseudomonas aeroginosa DNA-ul extracelular a fost esenţial pentru formarea biofilmelor folosind un sistem “flow-chamber”. Cu toate că sursa de DNA nu a fost determinată, DNA-aza 1 a dizolvat biofilmul sugerând că 17

DNA-ul reprezintă o parte integrală din structura biofilmului. Celulele de Enterococcus faecalis au aderat la celulele cardiace Caco-2 şi Girardi, dar mai slab decât cele de control. Inhibarea formării biofilmelor de către Bacillus subtilis (izolată din algele marine) a fost demonstrată prin folosirea furanonelor. Formarea biofilmelor pe echipamentele medicale de către bacterii ca Ps. aeruginosa şi Burkholderia cepacia, produc complicaţii grave la pacienţii cu fibroză chistică. Factorii sigma (δ) Sigma reprezintă una din cele 4 subunităţi ale RNA polimerazei, iar rolul său este acela de recunoaştere a protomerului (unde RNA-polimeraza se leagă de DNA şi începe transcripţia). Subunitatea sigma este implicată numai în formarea complexul iniţial DNA-RNA polimerază. După ce a fost formată o cantitate mică de RNAm factorul sigma disociază în sigma A (sau δ70=numărul se referă la greutatea moleculară în kilodaltoni) şi sigma S. Sigma A recunoaşte majoritatea genelor care codifică funcţiile esenţiale ale celulei. Cei mai cunoscuţi factori sigma sunt reprezentaţi de δ28 implicat în sinteza flagelilor la Salmonella şi în sistemul de secreţie tip III . δ32 (RpoH) este implicat în sinteza proteinelor şocului caloric (“heatshock proteins=HSPs). δ54 reglează genele harp (implicate în răspunsul hiperimun şi în patogenicitate) la câteva patovaroruri de Ps. syringae. Sigma B îi conferă rezistenţă lui Lis. monocytogenes la condiţiile acide letale şi lui B. subtilis în răspunsul la stres. Sigma S este prezentată la proteobacteriile din subclasa gamma care includ vibrionii. Îl ajută pe V. vulnificus să reziste la condiţiile de mediu adverse. Expunerea bacteriilor în condiţii acide face ca acestea să dea următoarele răspunsuri: 1. Scăderea pH-ului intracelular prin folosirea unor „pompe” de protoni, atunci când aceştia sunt extrădaţi din citoplasma de PMF („proton motive force” = „forţa mobilizantă de protoni”); 2. Repararea unor macromolecule ca DNA şi proteinele RecA; 3. Schimbări în componentele membranei celulare (de exemplu acizii graşi); 4. Reglarea exprimării genelor de către factorii sigma alternativi; 5. Densitatea celulelor şi formarea biofilmului; 6. Alterarea căilor metabolice. 18

1.1.3.3. Factorii sigma alternativi Dacă apare o schimbare stresantă în mediul celular, acest lucru duce la producerea factorilor sigma alternativi care ajută celulele să reziste în condiţii nefavorabile. Factorul alternativ, sigma 38 este codificat de către gene rpoS şi reglează cel puţin 30 de proteine. Expunerea la stress acid duce la sinteza de proteine care protejează bacteriile. În faza logaritmică (log) a creşterii celulelor la un pH de 4,5 sunt induse cel puţin 43 de proteine. În faza staţionară la un pH de 4,5 sunt sintetizate 15 proteine. 1.1.3.4. Răspunsul la toleranţa acidă (ATR) În cazul a două tulpini de Lis. monocytogenes cultivate într-un mediu definit chimic prin folosirea de HCl, pH-ul minim de creştere a fost de 3,5-4. Mutantele de Lis. monocytogenes care au prezentat ATR crescut au demonstrat letalitate mare pentru şoareci, comparativ cu tulpinile sălbatice, sugerând că în condiţii acide acestea ar putea fi selective pentru tulpinile cu virulenţă crescută. În mod similar celulele de Yer. enterocolitica adaptate la un pH 5 (de la un pH de 7,5) au fost mult mai enteropatogene decât celulele de control, când au fost testate pe şoarecele sugar. Factorul sigma B a fost identificat la Lis. monocytogenes, B. subtilis şi Stp. aureus, iar funcţia sa a fost comparată cu cea a lui δ5/RpoS de la bacteriile Gram negative. La B. subtilis, sigma B influenţează reglarea a 100 gene, ca răspuns la stresul energetic. Mutantele de B. subtilis sunt mai sensibile la căldură, etanol, acid, îngheţ, uscăciune. În mod paradoxal o tulpină de Lis. monocytogenes rezistentă la presiunea hidrostatică, a manifestat rezistenţă la căldură, acid şi peroxid de hidrogen. S-a descoperit că adaptarea lui Lis. monocytogenes la un pH acid ar putea depinde de alţi parametrii de creştere. Proteina sigma B asigură rezistenţa maximă a lui Lis. monocytogenes la doze letale de acid. Sigma B alături de sigma S sunt asociate cu răspunsurile la condiţiile de stres, atât la bacteriile Gram pozitive, cât şi la cele Gram negative. Sigma B joacă un rol important în rezistenţa acidă a celulelor bacteriene din faza staţionară, rezistenţa la stresul osmotic şi oxidativ şi la creşterea la 19

temperatură joasă a Lis. monocytogenes. Adaptarea la mediul acid conferă protecţia împotriva HHP şi îngheţului. Tulpinile adaptate la un pH acid de Shi. flexneri şi Shi. sonnei au supravieţuit pană la 14 zile în sucul de roşii şi mere la 70C. pH-ul minim necesar dezvoltării în BHI acidifiat pentru Shi. flexneri şi Shi. sonnei a fost de 4,75 şi respectiv 4,5. Într-un studiu pe E. coli adaptată la pH acid s-a demonstrat că aceasta a rămas pe carcasele de vită, chiar şi după o spălare a acestora cu acid acetic 2%. Rezistenţa la pH acid a fost foarte bine studiată la Shigella. Gorden şi Small au descoperit în culturile examinate că 9 din 12 bacterii din genul Shigella erau rezistente la pH acid; 11 din 15 tulpini de E. coli (incluzând tulpinile K12 ) au manifestat aceeaşi rezistenţă, iar din 12 salmonele studiate toate au prezentat rezistenţă la pH acid. Aceiaşi cercetători au stabilit şi motivul pentru care boala poate fi produsă de un număr mic de germeni. Ei au ajuns la concluzia că după ce aceste microorganisme părăsesc colonul, ele intră în faza staţionară, în afara gazdei. În urma ingestiei de către altă gazdă, ele sunt deja rezistente la pHul acid al stomacului. Într-un alt studiu tulpinile de E. coli producătoare de Stx, care nu puteau supravieţui la un pH de 2,5 au devenit acidorezistente prin introducerea unei gene rpoS într-o plasmidă. Când tulpinile de E. coli producătoare de Stx s-au dezvoltat pe diferite alimente la un pH de 4,6-4,7 ele au devenit de 2 ori mai rezistente la radiaţii decât culturile de control. În timp ce doza infecţioasă de salmonele pentru om este de aproximativ 5 10 , atunci când este administrată în condiţii definite, boala poate fi provocată prin consumul de alimente ce conţin 50-100 celule (alţi cercetători susţin că poate fi provocată doar de 10 celule). O tulpină virulentă pentru şoareci de S. typhimurium este mult mai acidorezistentă decât tulpina nevirulentă. Într-un studiu asupra rezistenţei relative a lui V. vulnificus şi fagii săi, ambii au fost sensibili la un pH 0,95) şi la temperaturi foarte variabile (0-45°C). Creşterea se produce şi la temperaturi de refrigerare, deşi este relativ lentă, cu un timp de dublare maxim de aproximativ 1 - 2 zile la 4°C. Multiplicarea în alimente este întrucâtva limitată la intervalul de pH de 5 - 9, şi Lis. monocytogenes nu este suficient de rezistentă la căldură pentru a supravieţui pasteurizării laptelui. Toleranţa neobişnuită a bacteriei faţă de clorura de sodiu şi nitritul de sodiu, ca şi capacitatea de a se multiplica, deşi lent, în alimentele refrigerate, fac din Lis. monocytogenes o problemă specială a contaminării post-procesare a alimentelor refrigerate. 7

169

5.1.8. Structura antigenică Pe baza antigenelor somatice (I-XIV) si a celor flagelare (AE), Sealinger şi Danker au stabilit o schemă de clasificare antigenică împărţind genul în 17 serotipuri (serovaruri). Lis. monocytogenes conţine 13 serovaruri din care câteva sunt comune cu Listeria innocua şi Listeria seeligeri. Lis. innocua este reprezentată de 2 serovaruri fiind nepatogenă. Heterogenicitatea sporită a antigenelor din invelişul extern al listeriilor poate fi corelată cu numărul mare de specii gazdă. Cel mai frecvent sunt izolate tipurile ½ si 4. Inainte de 1960 în Europa şi Africa predomina tipul 1, iar în America de Nord tipul 4, dar acest tipar pare să se fi schimbat. Astfel s-a demonstrat că serotipurile de listeria nu sunt legate de procesul patologic al gazdei sau de originea geografică, iar acest lucru este confirmat de bacteriile izolate din hrană cu toate că serovarurile 1/2a şi 4b prezintă unele diferenţe geografice. În SUA şi Canada serovarul 4b reprezintă 6580% din toate tulpinile. Epidemia din SUA din 1998-1999 s-a datorat consumului de cremwurşti ce conţineau o tulpină nouă de serovar 4b. Între 1 ianuarie şi 30 iunie 1996, 60% din 2232 de izolate din cazuri umane în Anglia, au fost 4b şi 11, 17 şi 4% fiind cauzate de 11/2a, 1/ab şi 1/2c. În general tulpinile 4b se asociază cu epidemiile, in timp ce tulpinile 1/2 se asociază cu produsele alimentare. Serovarul 1/2a a fost cel mai frecvent raportat în Europa de Est, Africa de Vest, Germania centrală, Finlanda şi Suedia, pe când serovarurile 1/2a şi 4b au fost raportate în Franţa şi Olanda în proporţii egale. 5.1.9. Patogenitatea Se datorează virulenţei precum şi producerii unei toxine cu efect letal pentru animalele de laborator şi acţiune citopatogenă asupra culturilor celulare. Listeriile au un caracter neinvaziv, putându-se multiplica în enterocite (H. Răducănescu), de unde trec în sânge, iar bacteriemia primară este urmată de localizări secundare (meninge, endocard, uterul gestant, glanda mamară, etc.). O modificare caracteristică o reprezintă mononucleoza, determinată de o monogliceridă din membrana citoplasmatică a bacteriei. Apariţia infecţiei este favorizată de vârsta tânără, starea de gestaţie (la ovine), furajarea necorespunzătoare, factorii zooigenici etc. 170

Listeriolizina O şi ivanolizina O: În general tulpinile patogene/virulente de Lis. monocytogenes produc beta hemolizină pe agarul cu sânge şi acid din ramnoză, dar nu din xiloză. Tulpinile a căror hemoliză poate fi amplificată cu exosubstanţa prepurificată sau direct prin folosirea culturii sunt potenţial patogene. Toate tulpinile virulente de Lis. monocytogenes produc o substanţă specifică care este responsabilă de beta hemoliză asupra eritrocitelor şi de distrugere a celulelor fagocitare care le înglobează şi anume listeriolizina O (LLO). Substanţa respectivă şi perfingolizina O (PFO) sunt omoloage cu streptolizina O (SLO) şi pneumolizina (PLO). Listeriolizina O (LLO) are o greutate moleculara de 60000Da, fiind constituită din 504 aminoacizi. Este produsă în faza de creştere exponenţială (cu niveluri maxime după 8-10 ore). LLO este sintetizată la 37°C în medii cu glucoză 0,2%. Sorbitolul în proporţie de 2% inhibă sinteza LLO la 35°C în condiţii aerobe sau anaerobe de incubare. LLO a fost detectată la toate tulpinile de Lis. monocytogenes chiar şi la unele tulpini nehemolitice. Nu a fost identificată la Lis. welshimeri şi Lis. grayi. Gena care codifică producerea ei este denumită hly şi este de origine cromozomală. Lis. ivanovii şi Lis. seeligeri produc exotoxine tiol dependente care sunt similare, dar nu identice cu LLO. Lis. ivanovii produce cantităţi mari de astfel de exotoxine. Ivanolizina O(ILO) este o citolizină tiol activată produsă de Lis. ivanovi. Antiserul obţinut de la Lis. ivanovi produce reacţii încrucişate cu cel de la Lis. monocytogenes şi SLO. Mutantele deficiente în ILO s-au dovedit a fi avirulente pentru şoarece şi embrionii de găină. LLO purificată prezintă în comun cu SLO si PLO următoarele proprietaţi: 1) sunt activate de compuşii SH cum ar fi cisteina; 2) sunt inhibate de cantităţi mici de colesterol şi prezintă situsuri antigenice comune evidenţiate prin reacţii – cross-imunologice. Spre deosebire de SLO si PLO, LLO este activată la un pH de 5,5 dar nu la un pH 7,0 ceea ce sugerează posibilitatea activitaţii sale în fagolizozomi (fagozomii macrofagelor). DL50 pentru şoarece este de aproximativ 0,8μg şi induce un răspuns inflamator când este injectat intradermic. Se pare ca LLO şi alte toxine  poreforming (formatoare de pori) au evoluat de la o singură genă 171

progenitoare. Când infecţia cu Lis. monocytogenes se produce pe cale orală, în mod aparent colonizează tractul intestinal prin mecanisme neelucidate până în prezent. De la acest nivel invadează ţesuturile, inclusiv placenta la femeile gravide şi intră în torentul sangvin de unde ajunge la alte celule susceptibile. Ca patogen intracelular trebuie să patrundă şi să se replice în aceste celule. Invazia fagocitelor se produce în două faze prin pătrunderea listeriilor direct în fagozomi şi apoi de la aceştia în citoplasma fagocitului. Intrarea Lis. monocytogenes în celulele gazdă care nu au fost fagocitate este facilitată de către proteinele de suprafaţă ale bacteriei, denumite în 1A şi  1B. Prima are o greutate moleculară de 88 KDa, iar cea de-a doua de 65KDa. Proteina 1A (internalina are ca receptor de suprafata F-cadherina), invadează culturile celulare, epiteliale, iar proteina în 1B invadează culturile de hepatocite de şoarece. Alte proteine intalnite la listerii sunt: 1) p60, o proteina de 60 kDa codificată de gena iap. Este secretată de toate speciile de listeria fiind implicate în producerea listeriilor în celulele gazdă; 2) Act A (90kDa) care este necesară pentru polimerizarea actinei şi permite mişcarea intracitoplasmatică a listeriilor în celulele gazdă; 3) Ami (90kDa) este o bacterie lizină care se află pe suprafaţa lui Lis. monocytogenes. Dintr-un studiu de 150 de probe de hrană, Ami a fost prezentă in 149, în timp ce 283 din 300 de probe umane au conţinut această proteină. Toate proteinele pozitive au prezentat LLO, în 1B şi Act A. Lis. monocytogenes supravieţuieşte în interiorul macrofagelor trecând prin membranele fagolizozomale în citoplasmă (citosol) proces facilitat în parte de LLO. O dată ajunsă în citosol proteina de suprafaţă Act A (facilitează formarea cozilor de actină) care propulsează microorganismul către membrana citoplasmatică. La nivelul membranei formează vacuole membranare duble. Cu ajutorul LLO şi a celor 2 fosfolipaze bacteriene, fosfolipaza C fosfotidilinozitol-specific (codificată de plcA) şi fosfolipaza C (broad-rouge phospholipase) (codificată de plcB) bacteriile sunt eliberate, iar procesul se repetă cu intrarea acestora în celulele gazdă adiacente. Ultimul proces apare dupa forţarea membranei în afară şi formarea unui filopodiu care este absorbit de o celulă adiacentă, după care procesul se repetă. Astfel răspândirea lui Lis. monocytogenes de la o celulă la alta are loc fară ca bacteria să părăsească componentele interioare ale celulei. O parte interesantă, dar incomplet studiată a celulei de Lis. monocytogenes este acidul lipoteichoic (LTA) al membranei celulare care se aseamănă cu lipopolizaharidul (LPS) din membrana externă a bacteriilor 172

Gram negative. Datorită acestui factor de producere a monocitozei (monocytosisproducing-activity, MPA) s-a dat şi numele speciei: monocytogenes. Acidul lipoteichoic (LTA-lipoteichoic acid) reprezintă 6% din greutatea uscată a celulei şi este asociat cu membrana plasmatică. Are o greutate moleculară de 1000 Da, nu conţine aminoacizi sau carbohidraţi şi stimulează numai celulele mononucleare. Prezintă toxicitate mică pentru ţesuturi şi este inactivă serologic dar omoară macrofagele in vitro. S-a demonstrat că are următoarele proprietăţi comune cu LPS: este pirogenică şi letală pentru iepure; produce o reacţie Schwartzman locală; conţine acizi graşi hidroxi acilaţi; produce o reacţie pozitivă cu reactivul LAL (Limulus ameobocyte lysatereagent); conţine KDO (2-keto-3 deoxyoctonic acid); conţine heptoză. Reactivul LAL în cantitate de 1mg produce reacţie pozitivă, în timp ce LPS poate fi activat într-o cantitate de picograme. Lis. ivanovii este patogenă pentru oi la care produce avort, fiind un producator prolific de hemoliză pe eritrocitele de oaie. Posedă o hemolizină like-LLO (ILO), sfingomielinază şi lecitinază. Sfingomielinaza are o greutate moleculară de 27000Da. În timp ce hemolizina like-LLO este responsabilă pentru producerea beta hemolizei pe eritrocitele de oaie, alfa hemoliza produsă de Rco. equi se pare că este cauzată de două enzime. 5.1.10. Izolarea şi identificarea Înainte de jumătatea anilor 1980, „îmbogăţirea la rece”, bazată pe capacitatea Listeriei de a depăşi prin creştere la temperaturi scăzute germenii competitivi, a fost utilizată în principal pentru izolarea selectivă. Totuşi, datorită lipsei de specificitate a acestei metode şi a faptului că este lentă (unii cercetători au incubat bulion până la 6 luni), procedurile au fost mult îmbunătăţite. Au fost dezvoltate medii care utilizează diverşi agenţi selectivi, incluzând acriflavină, clorură de litiu, colistin, acid nalidixic, cicloheximidă şi polimixină. Aceste metode au lărgit capacitatea laboratoarelor de microbiologie (în special, a celor implicate în controlul alimentelor) de a izola selectiv Listeria. Pentru detectarea listeriilor în alimente sunt din ce în ce mai mult utilizate hibridizarea acizilor nucleici şi testele imunoenzimatice. 5.1.11. Listerioza umană Listerioza este o infecţie oportunistă care afectează cel mai frecvent persoanele cu afecţiuni intercurente severe, bătrânii, femeile gravide, 173

fetuşii şi nou-născuţii. Cu toate acestea, pacienţii în afara acestor factori de risc pot fi de asemenea infectaţi. Indivizii cu cel mai mare risc de a contracta listerioza sunt bătrânii, cei imunocompromişi prin afecţiuni limfoproliferative (leucemii şi limfoame), persoanele cu alte neoplazii sau care primesc tratament imunosupresiv (corticosteroizi, ciclosporină, azatioprină, iradiere). Alte condiţii predispozante includ sindromul imunodeficitar dobândit (SIDA), alcoolismul, ficatul alcoolic, diabetul şi purtătorii de proteze cardiace valvulare sau proteze articulare. Femeile gravide au un risc crescut de a contracta listerioza, posibil datorită scăderii fiziologice a imunităţii, dar vor prezenta invariabil o formă relativ uşoară a bolii. Infecţia maternă poate disemina la făt, ducând fie la moarte intrauterină, fie la naşterea unui copil sever afectat în primele zile după naştere (infecţie neonatală cu debut precoce). De asemenea, nounăscuţii pot dezvolta septicemie cu debut tardiv, tipic la 10-12 zile după naştere. Listerioza afectează cel mai frecvent conţinutul uterului gravid, sistemul nervos central şi circulaţia. La persoanele negravide, listerioza se prezintă cel mai frecvent ca meningită (cu sau fără septicemie) sau ca septicemie fără afectarea sistemului nervos central. Ultima formă a bolii este în general limitată la indivizii imunocompromişi şi are rareori focare de infecţie identificabile. Meningoencefalita şi encefalita listerică apar mai rar. La femeia gravidă, listerioza este de cele mai multe ori recunoscută sub forma unuia sau mai multor episoade pseudogripale autolimitate, în cursul sau în a doua jumătate a celui de-al doilea trimestru, deşi infecţia poate apărea pe toată durata sarcinii. Listerioza maternă se prezintă, de obicei, cu febră şi alte simptome nespecifice, deşi unele persoane pot fi asimptomatice. Meningita listeriană maternă şi infecţiile recurente la aceeaşi femeie în cursul unor sarcini diferite sunt foarte rare. 5.1.12. Epidemiologie Larga răspândire a Lis. monocytogenes asigură numeroase căi de transmitere a bolii atât la animale, cât şi la oameni. Deşi actualmente s-a acordat un mare interes transmiterii pe cale orală, acesta nu este singurul mod de transmitere. Vârful incidenţei listeriozei umane are loc cel mai adesea la sfârşitul verii şi începutul toamnei, din motive încă neînţelese. Listerioza animală apare cel mai des primăvara, probabil nu numai din cauza fiziologiei şi condiţiei animalelor, ci şi datorită furajării deficitare. Incidenţa raportată a listeriozei umane variază în funcţie de ţară, de 174

la mai puţin de 1 la peste 7 cazuri la un milion de locuitori. Deşi aceste cifre pot reflecta în parte diferenţe ale sistemelor de surpaveghere, ele reprezintă probabil diferenţe reale ale incidenţei. Există diferenţe similare ale incidenţei listeriozei animale între diferite regiuni: de exemplu, în Marea Britanie, listerioza ovinelor reprezintă o problemă deosebită în Scoţia şi nordul Angliei. Aceste diferenţe pot fi datorate parţial capacităţii de a furaja corespunzător animalele. În 2006 au fost raportate 1628 cazuri în 27 de state, Malta şi Islanda nu au raportat cazuri (Portugalia, Romania şi Liechtenstein nu au raportat). Danemarca (1,0 la 100.000), urmată de Finlanda (0,88 la 100.000) şi Luxemburg (0,85 la 100.000) au avut cea mai mare rată a notificărilor. Rata medie a notificărilor a fost de 0,35 la 100.000 locuitori. Distribuţia pe grupe de vârstă şi sex Din 1612 cazuri raportate la care au fost disponibile informaţiile legate de vârstă, 55,8% au avut peste 65 ani şi această grupă de vârstă a avut cea mai mare rată a notificărilor de 1,2 la 100.000 locuitori. Cazurile de listerioză la copii sub 4 ani au reprezentat 7%, constiduind a doua rată a incidenţei pe grupe de vârstă, cu 0,47 la 100.000. Cazuistica a fost relativ egal distribuită la cele 1617 cazuri la care sexul a fost raportat (0,3 la 100.000 la femei şi 0,4 la 100.000 la bărbaţi). Distribuţia pe grupe de vârstă a cazurilor de listerioză umană în EU şi EEA/EFTA în 2006 (n=1612 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea şi Controlul Bolilor, 2008)

Sezonalitatea Cazurile de listerioză au fost mai rar raportate în primul trimestru al anului 2008 decât în restul anului. Cu toate acestea nu se poate discuta despre o evoluţie sezonieră a acestei boli. 175

Distribuţia sezonieră a cazurilor de listerioză umană în EU şi EEA/EFTA în 2006 (Centrul European Pentru Prevenirea şi Controlul Bolilor, 2008)

Analiza ratei notificărilor listeriozei în statele Uniunii Europene în perioada 2003-2006 scoate în evidenţă o creştere semnificativă a cazuisticii. Totuşi, aceste date trebuie analizate cu prudenţă întrucât interpretarea definiţiei de caz şi sistemele de supraveghere specifică diferă în cadrul Uniunii Europene de la un stat la altul. Majoritatea statelor raportează că majoritatea cazurilor au origine domestică (59,7%) sau necunoscută (36,6%). În 2006, Republica Cehă raportează un focar grav în care au fost implicate 78 de cazuri cu 13 morţi. Sursa acestui focar a fost brânza. 5.1.13. Transmiterea prin alimente În prezent este general acceptat faptul că alimentele contaminate reprezintă principala cale de transmitere a acestei toxiinfecţii. Deşi diferite din punct de vedere al constituenţilor şi al proceselor de preparare, alimentele asociate cu transmiterea au următoarele aspecte comune: capacitatea de a susţine multiplicarea Lis. monocytogenes (conţinut relativ mare în apă şi pH aproape neutru); contaminare relativ mare (> 105/g) cu tulpina implicată; procesare cu perioadă de păstrare relativ extinsă; consum fără preparare suplimentară. Datorită faptului că tabletele de lucernă sunt produse uscate, Lis. monocytogenes nu este capabilă să se dezvolte. Cu toate acestea, unul din ingrediente (lucerna) avea proprietăţi similare celor descrise mai sus, în sensul că înainte de uscare şi încapsulare era depozitată în condiţii de umiditate, în care apăreau deteriorarea şi posibil creşterea Lis. monocytogenes. 176

Perioada de incubaţie a infecţiei transmise alimentar variază larg între indivizi, de la 1 la 90 zile, cu o medie de aproximativ 30 zile pentru infecţia intrauterină. Nu se ştie dacă aceste diferenţe după ingestia orală sunt dependente de doză sau de tulpină, sau dacă reflectă diferenţe necunoscute în susceptibilitatea gazdelor. Pe baza datelor de la un număr foarte mic de cazuri, în alimentele consumate de pacienţi înainte de infecţie au fost găsite nivele înalte de Lis. monocytogenes (103->107), sugerând că doza infectantă a fost mare. Totuşi, este necesară multă precauţie, întrucât doza infectantă variază probabil foarte mult de la individ la individ. În plus, alimentele suspecte sunt, în general, disponibile pentru examinare numai perioade scurte de timp şi de aceea este mai probabil să fie examinate cele de la pacienţi cu perioadă de incubaţie scurtă. Aceste observaţii, împreună cu capacitatea Lis. monocytogenes de a se multiplica în alimente (chiar în condiţii ideale de depozitare) dovedesc că există dificultăţi considerabile în stabilirea unui nivel „sigur” de Lis. monocytogenes în alimente, în scopul elaborării unor reglementări. După cum s-a afirmat deja, Lis. monocytogenes este larg răspândită în mediu, inclusiv în alimente, deşi în general este prezentă în număr mic. Acest aspect, împreună cu proprietăţile şi tipurile de alimente asociate infecţiei susţin probabilitatea unei doze infectante mari în cazul infecţiei alimentare. Au fost descrise episoade de listerioza umană implicând peste 100 indivizi. Unele din acestea au continuat pe perioade lungi de timp, între 6 luni şi 5 ani, ceea ce se explică probabil prin colonizarea pe termen lung a unui singur loc din mediul de prelucrare al alimentului, precum şi prin perioada de incubaţie lungă a unor pacienţi. Facilităţile din mediul de prelucrare a alimentelor contaminate cu Lis. monocytogenes au inclus echipamentul de prelucrare din lemn, rafturile metalice şi din lemn, curelele de transmisie poroase şi canalele de scurgere din pardoseală. S-a demonstrat că Listeria monocytogenes supravieţuieşte bine într-o varietate de medii în care se prelucrează alimente, în special în cele umede şi cu materii organice şi că din aceste locuri se produce contaminarea în timpul prelucrării. Tabelul 5.3. Cazuri sporadice de listerioza umană transmisă pe cale alimentară Ţară SUA Anglia

An 1985 1986

Aliment implicat Cârnăciori de curcan Brânză topită 177

Ţară Anglia Anglia Canada SUA Finlanda Italia Italia Danemarca Canada Belgia Italia

An 1988 1988 1989 1989 1989 1989 1989 1989 1989 1989 1994

Aliment implicat Brânză topită Pui prăjit Tablete cu lucerna Salam Ciuperci sărate Salam Peşte Icre de cod afumate Brânză topită Frişca proaspătă şi îngheţată Măsline murate

O comparaţie între numărul de alimente ce conţin Lis. monocytogenes şi numărul cazurilor de listerioza a indicat că majoritatea alimentelor contaminate (chiar cele asociate cu izbucniri epidemice) au o rată de atac foarte mică. Unele tulpini de Lis. monocytogenes pot avea o patogenitate mai mare, dar bazele acesteia sunt puţin înţelese. Date fiind proprietăţile şi distribuţia Lis. monocytogenes, cazurile legate de o sursă comună de infecţie pot avea o distribuţie foarte largă, atât temporal, cât şi geografic. Unele episoade de listerioza de origine alimentară au fost recunoscute în situaţii foarte neobişnuite şi este posibil ca, în pofida sistemelor de supraveghere naţionale şi internaţionale, sursa comună să rămână necunoscută. 5.1.14. Transmiterea listeriozei la animale Avortul şi septicemia animalelor nou-născute sunt în mod clar rezultatul infecţiei intrauterine dobândite de la mamă şi există un paralelism între acestea, avortul şi infecţia neonatală cu debut precoce la om. Septicemia mieilor (însoţită de meningită la unele animale) în primele câteva săptămâni de viaţă a fost atribuită infecţiei ombilicale dobândite în cursul naşterii, posibil din solul sau alimentele contaminate: aceasta corespunde infecţiei neonatale cu debut tardiv la om. Irita şi keratoconjunctivita apar de obicei în timpul iernii, la oile şi bovinele hrănite cu siloz. Ele se pot produce prin introducerea directă în ochi a hranei contaminate şi au fost asociate cu distribuţia furajului în jgheaburi sau iesle situate la nivelul ochilor. 178

Ca şi în infecţia umană, se presupune că majoritatea cazurilor de listerioză animală sunt dobândite pe cale orală. La oi şi bovine există o asociere strânsă între alimentaţia cu siloz şi toate manifestările listeriozei, deşi unele cazuri apar şi când nu se foloseşte acest furaj. Cu toate acestea, mecanismul exact prin care alimentaţia cu siloz duce sau predispune la listerioză este neclar. În condiţii normale, este imposibilă producerea acestui siloz lipsit de Listeria: germenul a fost izolat din siloz cu un pH mai mic de 4, deşi în număr foarte mic. Când se produce siloz de proastă calitate, fără a se realiza condiţiile de pH scăzut şi anaerobioză, Listeria proliferează şi se găseşte în număr mare. Calitatea slabă este adesea datorată calităţii proaste a plantelor sau contaminării cu sol şi fecale. Tehnologia actuală de producere a silozului folosind prelate de polietilenă a dus la o creştere corespunzătoare a listeriozei ovine în Marea Britanie. Deşi această metodă este mai economică decât cele utilizate tradiţional, plantele sunt mai predispuse la alterare şi la creşterea listeriilor: un număr mare de germeni se găsesc în locurile unde s-au produs deteriorări ale prelatei sau la marginea acesteia. Incidenţa maximă a listeriozei animale în cursul primăverii poate reflecta o scădere a calităţii furajelor utilizate pentru hrană. Observaţia că listerioza este adesea asociată cu slaba calitate a furajelor, în care se găsesc cantităţi mari de Lis. monocytogenes, sugerează că doza infectantă este mare. S-a sugerat că silozul ar putea avea un efect imunosupresor, dar mecanismul nu a fost încă elucidat. Atât la oameni, cât şi la animale, majoritatea infecţiilor sunt probabil rezultatul ingestiei unor alimente sau furaje în care s-a produs proliferarea excesivă a Lis. monocytogenes. Este neclar ce proporţie din toate tulpinile de Lis. monocytogenes şi Lis. ivanovii prezente în mediu produc boala şi de ce Lis. ivanovii este atât de rar patogenă pentru om. Deşi au fost identificate unele culturi nepatogene de Lis. monocytogenes, infecţia experimentală a animalelor (deşi în modele mai degrabă „nenaturale”) nu a indicat o variaţie foarte mare a virulenţei. Cu toate acestea, distribuţia „tipurilor” de Lis. monocytogenes printre tulpinile izolate din mediu şi cele care produc boala este variabilă. Atât la oameni, cât şi la animale, proporţia tipurilor de Lis. monocytogenes diferă semnificativ în funcţie de sindroamele produse. In plus, majoritatea tulpinilor responsabile de episoadele aparent necorelate de listerioză umană transmisă pe cale alimentară au fost neaşteptat de asemănătoare. Semnificaţia acestor trei observaţii nu este clară; totuşi, ele pot reflecta adaptări ale tulpinilor (sau speciilor) la diferite nişe ecologice care afectează virulenţa. În afară de infecţia umană dobândită ca rezultat direct al îngrijirii 179

animalelor infectate sau prin hrana direct contaminată de la un animal infectat (cum ar putea fi cazul laptelui de la un animal cu mastită listerică), conexiunile dintre listerioză umană şi animală, dacă există, sunt neclare. Analiza tulpinilor ce produc listerioză umană şi animală „sporadică” indică o largă varietate de „tipuri” în ambele grupuri, care în general nu par să fie înrudite. Vârfurile sezoniere ale listeriozei umane şi animale nu coincid, sugerând, de asemenea, că între aceste două grupuri nu există relaţii cauzale. Acest fapt nu ar trebui poate să fie neaşteptat în cazul unui grup de patogeni marginali, care nu sunt probabil bine adaptaţi şi care sunt distribuiţi larg în mediu, cu multe tipuri diferite. Listeria monocytogenes şi Lis. ivanovii sunt membrii unui grup de bacterii adaptate la medii saprofite din sol şi apă şi au adaptări suplimentare pentru supravieţuirea în mediul intracelular al eucariotelor. Modul de evoluţie a acestor factori suplimentari este neclar. Aceştia ar fi putut evolua pentru a permite supravieţuirea la mamifere sau la un grup foarte diferit de eucariote, cum ar fi protozoarele. La Centrul Naţional de Referinţă pentru Zoonoze din INCDMI „Cantacuzino” - Bucureşti au fost trimise, în perioada 2002-2006, pentru confirmare/identificare, 30 tulpini ca suspiciuni Listeria spp. izolate din produse alimentare de origine animală. În studiul nostru s-au utilizat: - agar cu 5% sânge (defibrinat) de berbec; - trusă coloraţie Gram (violet de genţiană, Lügol, amestec alcoolacetonă, fuxină 1/10 preparată extemporaneu); - geloză moale 3‰ repartizată în tuburi 16/160 mm; - geloză 2% mediu înclinat, repartizat în tuburi 16/160mm; - medii lichide zaharate 1%, cu indicator albastru de bromtimol, conţinând glucoză, lactoză, maltoză, zaharoză, salicină, adonită, trehaloză, D-manită, D-manoză, L-ramnoză, D-xiloză; - tulpini test CAMP: Staphylococcus aureus şi Rhodococcus equi, - seruri hiperimune de iepure adsorbite Lis. monocytogenes la si 4b. S-au efectuat următoarele teste recomandate pe plan internaţional: 1. Însămânţarea tulpinilor pe mediul agar 5% sânge (defibrinat) de berbec, pentru obţinerea de colonii izolate; după termostatare peste noapte la 35-37°C s-a examinat aspectul morfocultural al coloniilor. 2. Însămânţarea agarului 2% mediu înclinat şi incubarea 48 ore la 35-37°C, pentru examinarea culturii în lumină oblică şi observarea apariţiei irizaţiei bleu-verzuie. 3. Efectuarea de frotiuri din cultură pură, colorate după metoda 180

Gram şi examinate microscopic cu obiectiv 90 imersie. 4. Efectuarea testului mobilităţii, prin înţeparea în dublu a mediului geloză moale 3‰, incubare 24 ore la 35-37°C şi, în paralel, la temperatura camerei, cu examinarea modului de creştere a culturii. 5. Efectuarea testului CAMP cu striu de Staphylococcus aureus şi Rhodococcus equi, pentru a urmări apariţia beta-hemolizei. 6. Insămânţarea în medii lichide zaharate 1% - cu indicator albastru de bromtimol - pentru a urmări fermentarea carbohidraţilor, prin producerea de acid după incubare 24 ore la 35-37°C 7. Serotiparea tulpinilor de Lis. monocytogenes prin reacţia de aglutinare cu seruri de iepure adsorbite 1a şi 4b. Tabelul 5.4 Tulpini de Listeria spp. Izolate din produse alimentare (nr./%) Produs

Produse din carne

An 2002 2003 2004 2005 2006 Total tulpini

NR. 7 1 11 7 26

Produse lactate

% 23,33 3,33 36,66 23,33 86,66

NR. 2 2 4

Total tulpini

% 6,66 6,66 13,33

NR. 9 1 11 9 30

% 30,0 3,33 36,66 30,0 100

Tabelul 5.5 Apartenenţa la speciile listeria conform investigaţiilor efectuate (Nr. rezultate pozitive/%) Lis. monocytogenes Lis. Specie Lis. innocua L. gray welshimeri serovar 1 a serovar 4b Test % % % % Nr. % Nr. Nr. Nr. Nr. Beta-hemoliza

7

23,33

-

-

-

-

-

-

-

-

Testul S. aureus CAMP R. equi Mobilitatea Testul oxidazei Testul catalazei

7 7 7

23,33 23,33 23,33

-

3,33 3,33 3,33

19

63,33

1

3,33

2

6,66

181

Tabelul 5.6 Apartenenţa la speciile listeria conform investigaţiilor efectuate (Nr. Rezultate pozitive / %) Lactoză 2 6,66 Zaharoză 2 6,66 Maltoză 7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66 Trehaloză 2 6,66 1 3,33 2 6,66 Salicină 7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66 D-Manită 1 3,33 D-Manoză 7 23,33 1 3,33 19 63,33 2 6,66 L-Ramnoză 7 23,33 1 3,33 1 3,33 1 3,33 D-Xiloză 2 6,66 L.m. 1a 7 23.33 Identificare serologică 1 3,33 L.m. 4b Total tulpini 7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66 Tabelul 5.7

Specii listeria izolate din produse alimentare (nr./%) Specie Produs Carne tocată Pastă mici Cârnati cal porc Ţesut muscular bovina Slănină lucru Costiţă afumată

L.monocytogenes L.innocua L.gray serovar la serovar 4b % % Nr. % Nr. Nr. Nr. % 1 3,33 8 26,66 1 3,33 3 10,0 3 10,0 1 3,33 3 10,0 i i i i 1 3,33 1 3,33 -

Spată porc

-

-

Carcasă pasăre

-

1

Caşcaval

-

-

1

Lapte praf

-

-

-

Lapte crud

-

-

1

Total tulpini

7

23,33

1

1 3,33

3,33 182

3,33

L.welshimeri Nr. -

-

-

-

-

-

-

-

2

3,33

-

-

19 63,33

1

3,33

3,33

%

2

6,66

6,66

În urma studiului efectuat în INCDMI Cantacuzino şi Facultatea de Medicină Veterinară, Bucureşti s-au desprins următoarele concluzii: 1. Confirmarea bacteriologică a genului Listeria s-a obţinut la toate cele 30 tulpini investigate. 2. Testele preliminare, cu caracter diferenţial în cadrul genului, au relevat caracteristicile morfoculturale, microscopice şi biochimice (producerea de acid din D-manoză şi L-ramnoză, fără a ataca D-manita şi D-xiloza ) ale Lis. monocytogenes la 8 tulpini. 3. Serotiparea, prin reacţia de aglutinare cu seruri de iepure adsorbite, a permis evidenţierea a 7 tulpini Lis. monocytogenes serovar 1a şi o tulpină Lis. monocytogenes serovar 4b, 19 tulpini au fost evidenţiate ca fiind Lis. innocua, 1 tulpină a fost identificată ca Lis. grayi, iar 2 tuplini ca Lis. welshimeri. 4. Lis. monocytogenes, specia tip a genului Listeria, condiţionatpatogenă pentru om şi animale, a fost întâlnită în produse de carne în curs de preparare sau netratate termic. De asemenea, 17 din cele 19 tulpini identificate ca Lis. innocua şi o tulpină Lis. grayi, nepatogene, au fost evidenţiate în preparatele de carne. 5. În produse lactate (caşcaval, lapte praf, lapte crud) au fost evidenţiate două tulpini Lis. innocua şi o tulpină Lis. welshimeri, probabil contaminate în timpul procesării sau păstrării. 6. Listeriile pot proveni de la animale purtătoare de germeni sau pot coloniza diversele suprafeţe inerte, ori pot forma “biofilme” pe suprafaţa alimentelor în curs de procesare. 7. Lis. monocytogenes la, serotip frecvent întâlnit în România, unde boala are caracter sporadic, a fost relevat in produse de carne de provenienţă indigenă. 8. Lis. monocytogenes 4b, serotip răspândit în ţările Europei occidentale şi America de Nord, unde boala poate evolua sub aspect epidemic, a fost prezent în produse de origine animală, import Italia. 9. Lis. innocua este considerată specie nepatogenă pentru om şi animale, ca şi Lis. grayi şi Lis. welshimeri. 10. Speciile de Listeria întâlnite în produse lactate provenite din lapte pasteurizat sunt considerate ca germeni de contaminare din mediul extern. 11. Lis. monocytogenes are cel mai important potenţial patogen pentru om şi animale. 183

5.1.15. Toxiinfecţiile alimentare produse de Listeria monocytogenes Pentru prima data Listeria monocytogenes fost descrisă în 1911 de către Hiilphers, după care în 1923 Murray et. al. a facut o descoperire mai amănunţită a acestei bacterii. Primul caz uman de listerioză a fost raportat în 1929, boala având o evoluţie sporadică. Lis. monocytogenes este agentul etiologic cel mai des întâlnit şi a fost izolat în Anglia şi Ţara Galilor în 98% din cazurile umane şi 85% din cele animale. Lis. ivanovii a produs infecţia în 3 cazuri umane, iar Lis. seeligeri numai într-unul. Între 1986-1988 numărul de cazuri de listerioză umană a scăzut în Anglia şi Ţara Galilor. Rata de mortalitate la 558 de cazuri umane în Marea Britanie a fost de 46%. În perioada 1983-1987 au fost raportate 775 de cazuri în Ţara Galilor cu 219 (28%) morţi, fiind neabortigenă. Numărul de cazuri de listerioză la 1 milion de oameni în 1992 a fost în Australia 2, Canada 2-4, Danemarca 4-5, Marea Britanie 2-3 şi în S.U.A de 4. Numărul estimativ total de cazuri, în SUA, în 1993 a fost de 1092 cu 248 de cazuri. Nu toate au fost de origine strict alimentară. În Belgia şi Olanda 10% din vacile sănatoase testate au fost purtătoare de listerii, iar în probele de fecale umane recoltate din diferite centre de prelucrarea hranei au fost pozitive 5%. În Marea Britanie, într-o perioadă de 18 luni, din 5000 de probe de fecale analizate, 32 au ieşit pozitive. Infecţia încrucişată cu Lis. monocytogenes a fost observată în infecţiile congenitale ale noilor născuţi, până la cei aparent sănătoşi. Listeria a fost izolată de la oameni sănătoşi în proporţie de 1% până la aproape de 15%. În cazul  „fast-food”-urilor, carnea şi produsele din carne de pasăre reprezintă principalele sursă de infecţie. Mijloacele de apărare ale organismului: Rezistenţa organismului la patogenii intracelulari (virusuri, paraziţi, Listeria monocytogenes) este mediată de celulele T (limfocite care se formează în măduva osoasă şi a căror maturare are loc în timus). Spre deosebire de celulele B prin care se realizează imunitatea umorală, celulele T activate acţionează direct asupra non-selfului. Atunci când un patogen pătrunde în interiorul celulei gazdă acesta nu mai poate fi distrus de către anticorpii circulanţi, însă prezenţa patogenului 184

este semnalată de schimbările structurale de la nivelul celulei parazitate. Celulele T sunt implicate în distrugerea celulei gazdă care nu mai este recunoscută ca self. Macrofagele leagă şi „prezintă” Lis. monocytogenes celulelor T, în aşa fel încât să fie recunoscute ca non-self. Atunci când celulele T atacă bacteriile, ele se măresc în dimensiuni şi formează clone specifice antigenelor respective. Celulele T pentru a fi activate secretă interleukina-1 (IL-1), iar apoi se multiplică şi se diferenţiază pentru a forma diverse substraturi. Cele mai importante subseturi de celule T sunt cele helper sau CD4(L3T4+) si cele killer CD8(Lyt2+). Celulele TCD4 reacţionează cu antigenul după producerea de linfokine (citokine): IL-1, IL-2, IL-6 sau gamma interferon şi altele. Gamma interferonul (a cărui producţie este asistată de factorul de necroză al tumorilor induce producerea de receptori IL-2 pe monocite. De asemenea IL-2 măreşte activarea celulelor Killer care pot liza macrofagele infectate. IL-2 administrat la şoarece într-o cantitate mai mică de 0,6 micrograme/ şoarece, măreşte rezistenţa acestora la Lis. monocytogenes. Gamma interferonul activează macrofagele şi celulele killer. Acestea din urmă lizează macrofagele infectate. Atât CD4 cât şi CD8 sunt stimulate de Lis. monocytogenes activând macrofagele (prin producţia lor de gamma interferon) şi contribuind la rezistenţa la listerioză. Se pare că infecţia indusă experimental la şoarece este asemănătoare cu cea de la om. O dată cu înglobarea bacteriei de către macrofage acestea secretă la locul infecţiei un factor de creştere a monocitopoezei (factor-increasingmonocytopoiesis) (FIM). Acesta este transportat în măduva osoasă unde stimulează producerea de alte macrofage. Numai listeriile viabile pot induce răspunsul celulelor T şi imunitatea contra listeriozei. LLO reprezintă factorul de virulenţă la Lis. monocytogenes care stimulează reacţia celulelor T şi este o proteina termosensibilă. Subsetul celulelor (CD8) pare a fi principalul component responsabil de imunitatea anti-listeria, stimulând producerea de citokine de către macrofage; imunitatea pasivă poate fi dobândită prin transferul subsetului de celule CD8. Acţiunea Lis. monocytogenes relevă rolul multifuncţional al limfokinelor în imunitatea celulelor T şi importanţa critică aparentă a factorului primar de virulenţă LLO al acestei bacterii. Ceea ce face ca gazdele imunocompromise să fie mult mai susceptibile la acest tip de infecţie este efectul agenţilor imunosupresori asupra sistemului de celule T. Pe baza rolului jucat de limfokine în apărarea organismului au fost sugerate unele terapii posibile, dar efectele acestora la om sunt încă neclare. 185

Rezistenţa bacteriei în alimente: Datorită faptului că Lis. monocytogenes rezistă la temperaturi cuprinse între 1-45°C şi la un pH între 4,1-9,6 este de aşteptat ca aceasta să reziste în alimente o lungă perioadă de timp, iar acest lucru a fost confirmat. Tulpinile Scott A şi V7 inoculate în caşcaval în cantitate de 104-105/g au supravieţuit 28 de zile la 3°C. Când aceste două tulpini au fost inoculate în brânza Camembert împreună cu alte două tulpini creşterea a avut loc în 18 zile de la maturare cu niveluri de 104-105 iar după 65 de zile de 106-107/g. Lis. monocytogenes a supravieţuit în pachetele cu caşcaval cu acid ascorbic 0,3%, 130 de zile. Limitele legale ale numărului de listerii din alimente: Unele ţări au stabilite limite legale ale numărului de listerii din alimente (în special cele de tip fast-food), în timp ce altele nu. Guvernul S.U.A. duce cea mai strictă politică în ceea ce priveşte numărul de germeni din alimente aceştia fiind desemnaţi cu termenul de „adulteranţi”. Acest lucru se traduce prin faptul că orice aliment „fast-food” care conţine acest germen în probele de 50 grame poate fi reţinut sau retras de pe piaţa. Toleranţa 0 în general înseamnă absenţa microorganismului în probele de 25 grame. Comisia Europeana (EC) a dat o directivă pentru produsele şi subprodusele din lapte prin care specifică toleranţa 0 pentru brânzeturile fine şi absenţa bacteriei în probe de 1g pentru celelalte produse. Comisia Internaţională de Microbiologie Specifică Alimentelor (ICMSF) a stabilit că dacă acest microorganism nu depăşeşte 100 germeni/ gram în momentul consumului, alimentul poate fi consumat de către indivizii sănătoşi. În anii 1994-1998 în S.U.A. Lis. monocytogenes a fost responsabilă de 61% din cele 1328 retrageri de alimente, urmată de salmonele cu 11%. Oricum nu este corect să presupunem că toate alimentele confiscate ar fi provocat boala dacă ar fi fost vândute. Nu toate tulpinile produc listerioze la oameni, iar carnea şi produsele de carne de pasăre nu sunt folosite în acelaşi mod de către consumatori. 5.1.16. Profilaxie şi combatere Producătorii de alimente şi de echipament pentru procesarea acestora trebuie să cunoască proprietăţile listeriei. Fabrica şi echipamentul trebuie 186

proiectate astfel încât să faciliteze curăţenia şi igienizarea, pentru a reduce posibilitatea contaminării şi colonizării cu Lis. monocytogenes. Producătorii, transportatorii şi comercianţii alimentelor perisabile trebuie să utilizeze un bun echipament de refrigerare, împreună cu o împachetare adecvată şi informaţii pentru consumator, de tipul termenului de garanţie şi al condiţiilor optime de păstrare. Pentru siguranţa şi calitatea produsului final, este recomandabilă aplicarea unui program de tipul HACCP sau a unei scheme de control şi evaluare similare. În ultimul deceniu, industria alimentară din Europa şi America de Nord a fost activă în investigarea prezenţei listeriei în alimente şi mediul, în implementarea analizelor de risc şi în stabilirea unor coduri de procedură existând dovezi care atestă ameliorarea calităţii microbiologice a unor alimente în această perioadă. Deoarece Listeria monocytogenes este un patogen potenţial, iar detectarea altor specii de Listeria poate indica o contaminare a mediului (în special, în cazul acelor alimente care au trecut printr-un proces bactericid), idealul ar fi excluderea tuturor germenilor din alimente, acţiune care ar trebui întreprinsă viguros. Realizarea acestui obiectiv este probabil impracticabilă pentru toate alimentele şi este în mod clar de neatins în cazul alimentelor crude sau a celor care nu au fost supuse unui proces listericid. Reacţia autorităţilor naţionale faţă de prezenţa Listeriei în alimentele vândute cu amănuntul a variat de la excluderea totală a anumitor alimente (politică aplicată în Statele Unite ale Americii şi în unele ţări din Comunitatea Europeană), până la toleranţa unei anumite contaminări. Listeria monocytogenes se poate multiplica (deşi lent) la temperaturile de refrigerare, de aici rezultând nu numai importanţa excluderii sale din alimente, ci şi a inhibării multiplicării şi supravieţuirii sale. Această problemă poate fi abordată prin îmbunătăţirea reglementărilor privind temperatura şi durata de păstrare. În prezent este posibilă evaluarea nivelului de Listeria din alimente, ceea ce furnizează informaţii suplimentare valoroase asupra calităţii microbiologice a acestora, prin faptul că un nivel mai înalt reflectă probabil încălcări ale normelor de igienă, durată şi temperatură de depozitare. Pentru evitarea listeriozei şi a altor toxiinfecţii alimentare, publicul larg trebuie educat în ce priveşte utilizarea alimentelor de bună calitate şi a măsurilor de igienă personală, din momentul cumpărării hranei până la consum. Aceasta include evitarea contaminării încrucişate între alimentele crude şi cele gătite, utilizarea unor frigidere corespunzătoare şi nedepăşirea duratei de păstrare normale a alimentelor. Întrucât Listeria este larg răspândită în mediu, evitarea totală şi eliminarea completă a germenului din toate alimentele este imposibilă şi este probabil că toţi indivizii vor 187

fi la un moment dat expuşi infecţiei cu Listeria. Cu toate acestea, femeile gravide şi persoanele imunocompromise prezintă un risc mai mare de a contracta listerioza. În multe ţări (incluzând Marea Britanie, Statele Unite ale Americii, Franţa, Noua Zeelandă şi unele regiuni din Australia) indivizii expuşi riscului sunt sfătuiţi să-şi ia măsuri speciale de precauţie. Alimentele preparate sau semipreparate, cum ar fi brânzeturile cu pastă moale şi pateul, s-au dovedit a fi în mod special periculoase. În Anglia şi Ţara Galilor a fost emisă recomandarea generală ca indivizii vulnerabili să nu le consume. O altă recomandare generală a fost emisă în Statele Unite pentru evitarea unor tipuri de brânză (telemea şi brânza de tip mexican), a alimentelor tip „delicatesă” şi pentru reîncălzirea preparatelor din carne. În lumina recentelor pusee epidemice din Australia, ar putea fi, de asemenea, prudentă evitarea unor alimente gătite precum şi a semipreparatelor din peşte şi moluşte. Indivizii susceptibili trebuie să evite consumarea cărnii şi alimentelor de origine marină crude sau inadecvat preparate, să spele fructele şi legumele care vor fi consumate crude şi să reîncălzească atent toate alimentele semipreparate înainte de consum, în special pe cele înalt procesate anterior. O afecţiune pseudogripală inexplicabilă la femeile gravide sau la cei imunocompromişi trebuie investigată prin hemoculturi. În plus, persoanele care îngrijesc animalele infectate trebuie să cunoască posibilitatea listeriozei oculare sau cutanate şi să solicite asistenţă medicală în cazul dezvoltării unor leziuni suspecte. De asemenea, poate fi prudentă avertizarea femeilor gravide şi a celor imunocompromişi să evite asistarea la fătarea mieilor, să nu mulgă oile care au fătat recent, să nu intre în contact cu placentele şi mieii nou-născuţi. Acestea reprezintă în mod clar căi potenţiale de infecţie, deşi, cu excepţia leziunilor oculare şi cutanate, nu s-au observat asociaţii semnificative între cazurile de listerioza şi mediul rural. Pentru prevenirea infecţiei încrucişate în perioada neonatală trebuie întreprinse măsuri stricte de control al infecţiei in momentul naşterii. Aceste măsuri necesită îngrijirea separată a pacienţilor, utilizarea echipamentului sterilizat termic sau a celui de unică folosinţă, ştergerea cu alcool a suprafeţelor, purtarea mănuşilor şi a şorţurilor, care vor fi schimbate înainte de spălarea mâinilor şi asistarea altor pacienţi. Deoarece listerioza umană este o afecţiune rară, schemele de supraveghere şi investigare epidemiologică a cazurilor sunt esenţiale pentru identificarea grupurilor de pacienţi cu aceeaşi sursă şi cale de infecţie. Utilizarea studiilor tip caz-control pentru investigarea puseelor de listerioza a avut rezultate contradictorii, iar episoadele cu sursă comună pot fi recunoscute numai prin recoltarea produselor patologice de la pacienţii 188

infectaţi şi identificarea tulpinilor comune. Întrucât Lis. monocytogenes este larg răspândită în mediu (inclusiv în alimente), este importantă utilizarea schemelor de tipaj discriminatoriu în compararea izolatelor. Metodele de determinare a subtipurilor aplicate la Lis. monocytogenes au inclus serotipajul, tipajul cu bacteriocină, analiza plasmidelor, tipajul fagic, analiza fragmentelor de restricţie DNA (incluzând electroforeza în gel), amplificarea aleatorie a DNA-ului polimorf şi electroforeza enzimatică multiloculară. Metodele tradiţionale de analiză au utilizat serotipajul şi tipajul fagic, deşi combinarea acestora cu metodele moleculare sau cu electroforeza enzimatică multiloculară oferă un grad mult mai înalt de discriminare. Pentru a utiliza aceste metode este necesară o investiţie considerabilă de timp, personal şi echipament, acestea fiind practicabile numai în laboratoarele centrelor naţionale de referinţă cu un interes special pentru Listeria. După cum s-a discutat anterior, pentru prevenirea listeriozei animale trebuie acordată atenţie hranei acestora, în special furajelor. Pentru uz animal au fost elaborate vaccinuri vii atenuate, afirmându-se că acestea oferă o oarecare protecţie, deşi studiile în teren sunt echivoce. Totuşi, o dată cu revoluţia apărută în înţelegerea patogenezei acestei infecţii şi a interacţiunilor agentului etiologic cu imunitatea celulară a gazdei, împreună cu capacitatea de manipulare genetică, pare probabil că Listeria va reprezenta în viitor un domeniu activ de investigaţie. 5.1.17. Metoda şi schema de lucru utilizată pentru izolarea şi identificarea lui Lis. monocytogenes Se obţine omologatul alimentar din amestecarea a 25 grame de aliment cu 225 mililitri de apă peptonată şi se amestecă bine într-un blender steril. Incubarea se realizează la 20°C, timp de 1-2 ore. Preîmbogăţirea. Se amestecă 25 grame de probă cu 225 mililitri bulion Demi-Fraser (M82). Incubarea se realizează la 30°C, timp de 24 de ore. Îmbogăţirea selectivă. Câte 1 mililitru din cultura obţinută prin resuscitare şi preîmbogăţire se însămânţează în 100 mililitri bulion DemiFraser. Incubarea se realizează la 30°C, timp de 24 de ore. Trecerea pe mediul selectiv de izolare. 0,1 mililitri din cultura ca atare sau din amestecul 0,5 mililitri cultură + 4,5 mililitri KOH se striază pe suprafaţa agarului Palcom (M83). Incubarea se realizează la 35°C, timp de 24-48 de ore. Izolarea coloniilor caracteristice. Se selectează 5 colonii tipice şi se pasează în plăci Petri cu agar nutritiv (sau agar TSYEA). Se incubează la 189

35-37°C, timp de 18-24 de ore. Identificarea şi confirmarea lui Lis. monocytogenes 1. Coloraţia Gram: listeriile apar ca bacili Gram pozitivi sau cocobacili. 2. Testul mobilităţii: se transplantează de pe mediile agarizate, selective, 5 colonii caracteristice într-o eprubetă cu bulion creier şi cord de bovină şi 3 colonii într-o eprubetă cu agar nutritiv moale şi se incubează la 25°C, 24 de ore. Se execută, din cultura în bulion, examenul între lamă şi lamelă. Lis. monocytogenes prezintă o mobilitate intensă şi caracteristică şi execută mişcări de rostogolire ce alternează cu scurte perioade de repaus. Pe agarul moale, mobilitatea bacteriei este exprimată prin dezvoltarea culturii sub formă de umbrelă. 3. Testul catalazei: Catalaza este o enzimă hemoporfirinică, ce catalizează reacţia de descompunere a apei oxigenate. Reacţia se evidenţiază, atunci când se pune în contact o ansă de cultură cu o picătură de apă oxigenată. Apariţia bulelor de gaz se interpretează ca reacţie pozitivă, fiind specifică pentru listerii. 4. Fermentarea carbohidraţilor: Se foloseşte apă peptonată cu roşufenol. Listeria monocytogenes fermentează glucoza şi ramnoza, cu producere de acid, fără producere de gaz, dar nu fermentează xiloza şi manitolul. Teste de confirmare: a) Testul hemolizei. Prin acest test se pot diferenţia două specii strâns înrudite şi anume Lis. monocytogenes şi Lis. innocua. Speciile hemolitice de listerii sunt: Lis. monocytogenes, Lis. ivanovii, Lis. seeligeri. Se procedează astfel: suprafaţa agarului cu sânge de oaie se striază cu cultura bacteriană de testat. Se incubează 24 de ore la 35-37°C. Lis. monocytogenes formează colonii mici cu un halou mic, clar, în jur, specific hemolizei beta. Lis. ivanovii are o activitate hemolitică puternică formând în jurul coloniilor zone clare, întinse, iar Lis. seeligeri produce o hemoliză slabă. b) Testul CAMP. Poate evidenţia clar caracterele hemolitice şi se realizează prin însămânţarea lui Stp. aureus şi Rco. equi sub formă de striuri, într-o singură direcţie pe placa cu agar sânge, iar tulpinile de Listeria perpendicular, faţă de traiectoria acestora, fără a le atinge. Hemoliza tulpinilor de Lis. monocytogenes este mai exacerbată în apropierea striului de Stp. aureus, iar pentru Lis. ivanovii, numai în apropierea striului de Rco. equi. 190

Testarea patogenităţii: se realizează pe baza următoarelor teste: • testul lui Anton; • pe şoareci imunocompromişi, infectaţi intraperitoneal cu tulpini virulente de Lis. monocytogenes; • prin inocularea pe membrana corioalantoidiană a oului embrionat. Testul lui Anton: se realizează pe cobai, prin instilare în sacul conjunctival a câtorva picături dintr-o cultură proaspătă de 24 de ore. În cazul reacţiei pozitive apar simptome de cheratoconjunctivită purulentă, care se vindecă spontan în câteva zile.

191

Lis. monocytogenes – frotiu din cultură. Se Lis. monocytogenes microscopie electronică; remarcă polimorfism, forme predominant Bacili scurţi, drepţi sau încurbaţi bacilare, dar şi forme cocobacilare, cocoide.

Lis. monocytogenes – microscopie electronică, coloraţie negativă

Lis. monocytogenes – testul CAMP

Lis. monocytogenes – hemocultură. Listeriile apar fie extracelular, fie fagocitate, ceea ce constituie o probă certă în diagnosticul listeriozei

Lis. monocytogenes – testul mobilităţii. În mediile semisolide, după însămânţarea listeriei prin înţeparea mediului în profunzime şi incubarea la 37°C, aceasta creşte sub forma unei “umbrele”. 192

Nucleu

Listeria în citoplasmă Microscopie electronică a unui macrofag după 8 ore de la infecţia cu Lis. monocytogenes. Bacteria a trecut de bariera lizozomilor şi se divide în citoplasmă. Cromatina nucleului macrofagului apare condensată şi citoplasma se află într-un stadiu progresiv de liză

Mediul OCLA (Oxoid Chromogenic Listeria Listeria monocytogenes – beta hemoliză Agar) coloniile de Listeria monocytogenes 193

Bibliografie selectivă 1. Fenlon, D.R., T. Stewart, and W. Donachie. 1995. The incidence, numbers and types of Listeria monocytogenes isolated from farm bulk tank milks. Lett. Appl. Microbiol. 20:57-60, 2. Focgeding, P.M., and N.W. Stanley. 1990. Listeria monocytogenes P5069 thermal death times in liquid whole egg, y. Food Protect. 33:6-8. 3. Galsworthy, S.B., and D. Fewster. 1988. Comparison of responsiveness to the monocytosis-producing activity of Listeria monocytogenes in mice genetically susceptible or resistant to listeriosis. Infection 16(Suppl. 2):118-122. 4. Geoffroy, C, J.-L. Gaillard, J.E. Alouf, and P. Berche. 1989. Production of thiol-dependent haemolysins by Listeria monocytogenes. J. Gen. Microbiol. 135:481—487. 5. Geoffroy, C, J.-L. Gaillard, J.E. Alouf. and P. Berche. 1987. Purification, characterization, and toxicity of the sulfhydryl-activatcd hemolysin listeriolysin O from Listeria monocytogenes. Infect. Ininiun. 55:1641-1646. 6. George, S.M., B.M. Lung, and T.F. Brocklehurst. 1988. The effect of pH and temperature on initiation of growth of Listeria monocytogenes. Lett. Appl. Microbiol. 6:153-156. 7. Gilbert, R.J. 1992. Provisional microbiological guidelines for some ready-toeat foods sampled at point of sale: Notes for PHLS Food Examiners. Public Health Serv. Lab. Q. 9:98-99. 8. Gilbert, R.J., and P.N. Pini. 1988. Listeriosis and foodborne transmission. Lancet 1:472-473. 9. Gitter, M., R. Bradley, and PH. Blampied. 1980. Listeria monocytogenes infection in bovine mastitis. Vet. Rec. 107:390-393. 10. Glass, K.A., and M.P Doyle. 1990. Fate of Listeria monocytogenes in processed meat products during refrigerated storage. Appl. Environ. Microbiol. 55:1565-1569. 11. Golnazarian, C.A., C.W. Donnelly, S.J. Pintauro, and D.B. Howard. 1989. Comparison of infectious dose of Listeria monocytogenes F5817 as determined for normal versus compromised C57B1/6J mice. J. Food Protect. 52:696-701. 12. Grau, F.H., and P.B. Vanderline. 1990. Growth of Listeria monocytogenes on vacuum-packaged beef. J. Food Protect. 53:739-741. 13. Green, S.S. 1990. Listeria monocytogenes in meat and poultry products. Interim Rept. to Nat’l Adv. Comm. Microbiol. Spec. Foods. FSIS/USDA, Nov. 27. 194

14. Groves. R.D., and H.J. Welshimer. 1977. Separation of pathogenic from apathogenic Listeria monocytogenes by three in vitro reactions. J. Clin. Microbiol. 5:559-563. 15. Haak-Frendscho, M., K.M. Young, and C.J. Czuprynski. 1989. Treatment of mice with human recombinant interleukin-2 augments resistance to the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes. Infect. Immitn. 57:3014-3021. 16. Harrison, M.A., and Y.-W. Huang. 1990. Thermal death times for Listeria monocytogenes (Scott A) in crabmeat. J. Food Protect. 53:878-880. 17. Heisick, J.E., D.E. Wagner, M.L. Nierman, and J.T Peeler. 1989. Listeria spp. found on fresh market produce. Appl. Environ. Microbiol. 55:1925-1927. 18. Hird, D.W. 1987. Review of evidence for zoonotic listeriosis. /. Food Protect. 50:429-433. 19. Hogen, C.J., E.R. Singleton, K.S. Kreuzer, E.M. Sloan, and J.N. Sofos.. 1998. Isolation of catalasc-negative Listeria monocytogenes from foods. Dairy Food Environ. Sanit. 18:424-426. 20. Hof, H., and P. Hefner. 1988. Pathogenicity of Listeria monocytogenes in comparison to other Listeria species. Infection l6(Suppl. 2): 141-144. 21. Igarashi, K.-I., M. Mitsuyama, K. Muramori, H. Tsukada, and K. Nomoto. 1990. Interleukin-1 -induced promotion of T-cell differentiation in mice immunized with killed Listeria monocytogenes. Infect. Ininiim. 58:3973-3979. 22. Jacquet, C, E. Gouin, D. Jcannel, P. Cossart, and J. Rocourt. 2002. Expression of ActA, Ami, InlB. and listeriolysin O in Listeria monocytogenes of human and food origin. Appl. Environ. Mirobiol. 68:616-622. 23. Jay, J.M. 1996. Prevalence of Listeria spp. in meat and poultry products. Food Control 7:209-214. 24. Johnson. J.L., M.P. Doyle, and R.G. Cassens. 1990. Listeria monocytogenes and other Listeria spp. in meat and meat products. A review. J. Food Protect. 53:81-91. 25. Johnson, J.L., M.P. Doyle, and R.G. Cassens. 1988. Survival of Listeria monocytogenes in ground beef. Int. J. Food Microbiol. 6:243-247. 26. Jones, D. 1988. The place of Listeria among Gram-positive bacteria. Infection 16(Suppl. 2):85-88. 27. Junttila, J., J. Hirn, P. Hill, and E. Nurmi. 1989. Effect of different levels of nitrite and nitrate on the survival of Listeria monocytogenes during the manufacture of fermented sausage.,/ Food Protect. 52:158-161. 28. Junttila. JR.. S.I. Nicmcla, and J. Him. 1988. Minimum growth temperatures of Listeria monocytogene* and nonhaemolytic listeria. J. Appl. Bacterial. 195

65:321-327. 29. Kampelmacher, E.H., and L.M. Van Nooble Jansen. 1969. Isolation of Listeria monocytogenes from faeces of clinically healthy humans and animals. Zentral. Bakt. Inf. Abt. Orig. 211:353-359. 30. Kathariou. S. 2002. Listeria monocytogenes virulence and pathogenicity, a food safety perspective. J. Food Protect. 65:1811-1829. 31. Kaufmann, S.H.E. 1988. Listeria monocytogenes specific T-cell lines and clones. Infection 16(Suppl. 2): 128-136. 32. Kaufmann. SHE.. E. Hug. U. Vath. and I. Muller. 1985. Effective protection against Listeria monocytogenes and delayed-type hypersensitivity to listerial antigens depend on cooperation between specific L3T4+ and Lyt2+ T cells. Infect. Immun. 48:263-266. 33. Kouassi. Y.. and L.A. Shelef. 1995. Listeriolysin O secretion by Listeria monocytogenes in broth containing salts of organic acids../. Food Protect. 58:1314-1319. 34. Kreft. J.. D. Funke. A. Haas. F. Lottspeich. and W. Goebel. 1989. Production, purification and characterization of hemolysins from Listeria ivanovii and Listeria monocytogenes Sv4b. FEMS Microbiol. Lett. 57:197-202. 35. Kurtz. R.S., K.M. Young, and C.J. Czuprynski. 1989. Separate and combined effects of recombinant interleukin-1 a and gamma interferon on antibacterial resistance. Infect. Immun. 57:553-558. 36. Kwantes. W., and M. Isaac. 1971. Listeriosis. Br. Med. J. 4:296-297. 37. Leasor, S.B., and P.M. Foegeding. 1989. Listeria species in commercially broken raw liquid whole egg. J. Food Protect. 52:777-780. 38. Lammerding, A.M., and J.M. Farber. 1994. The status of Listeria monocytogenes in the Canadian food industry. Dairy FoodEmiron.Sanit. 14:146-150. 39. Lingnau, A., E. Domann, M. Hudel, M. bock, T. Nichterlein. J. Wehland. and T. Chakraborty. 1995. Expression of the Listeria monocytogenes EGD in IA and iw7B genes, whose products mediate bacterial entry into tissue culture cell lines, by PrfA-dependent and -independent mechanisms. Infect. Immun. 63:3896-3903. 40. Linton, R.H., M.D. Pierson, and J.R. Bishop. 1990. Increase in heat resistance of Listeria monocytogenes Scott A by sublethal heat shock. J. Food Protect. 53:924-927. 41. Liu. Z.. and C. Cheers. 1993. The cellular source of interleukin-6 during Listeria infection. Infect. Immun. 61:2626-2631. 42. Loessner. M.J., and M. Busse. 1990. Bacteriophage typing of Listeria species. Appl. Environ. Microbiol. 56:1912-1918. 43. Lovett, J., I.V. Wesley, M.J. Vandermaaten, J.G. Bradshaw, D.W. Francis, R.G. 196

Crawford, C.W. Donnelly, and J.W. Messer. 1990. High-temperature short-time pasteurization inactivates Listeria monocytogenes. J. Food Protect. 53:734738. 44. Lovett, J. 1988. Isolation and identification of Listeria monocytogenes in dairy products. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71.658-660. 45. Lovett. J., D.W. Francis, and J.M. Hunt. 1987. Listeria monocytogenes in raw milk: Detection, incidence, and pathogenicity. J. Food Protect. 50:188-192. 46. Ludwig, W., K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt. 1984. 16S rRNA analysis of Listeria monocytogenes and Brochothrix thermosphacta. FEMS Microbiol. Lett. 25:199-204. 47. Lund. B.M., M.R. Knox, and MB. Cole. 1989. Destruction of Listeria monocytogenes during microwave cooking. Lancet 1:218. 48. Mackeness, G.B. 1971. Resistance to intracellular infection. J. Infect. Dis. 123:439-445. 49. Mackey, B.M., C. Pritchet, A. Norris, and G.C. Mead. 1990. Heat resistance of Listeria: Strain differences and effects of meat type and curing salts. Lett. Appl. Microbiol. 10:251-255. 50. Mackey, B.M., and N. Bratchell. 1989. The heat resistance of Listeria monocytogenes. Lett. Appl. Microbiol. 9:89-94. 51. Malinverni. R., J. Bille, CI. Perret, F. Regli, F. Tanner, and M.P Glauser. 1985. Listeriose epidemique. Observation de 25 cas en 15 mois au Centre hospitalier universitaire vaudois. Schweiz. Med. Wschr. 115:2-10. 52. McKellar, R.C. 1994. Use of the CAMP test for identification of Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 60:4219^225. 53. McLauchlin, J. 1997. The pathogenicity of Listeria monocytogenes: A public health perspective. Rev. Med. Microbiol. 8:1-14. 54. McLauchlin. J. 1987. Listeria monocytogenes, recent advances in the taxonomy and epidemiology of listeriosis in humans. J Appl. Bacteriol. 63:1-11. 55. McLauchlin, J., A. Audurier, and A.G. Taylor. 1986. Aspects of the epidemiology of human Listeria monocytogene. infections in Britain 1967-1984. The use of serotyping and phage typing. J. Med. Microbiol. 22:367-377. 56. Mengaud, J., M.F. Vincente, J. Chenevert. J.M. Pereira, C. Gcoffroy. B. Giequel-Sanzey, F. Baquero, J.-C. Perez-Diaz and P. Cossart. 1988. Expression in Escherii hia coli and sequence analysis of the listeriolysin () determinant of Listen,, monocytogenes. Infect. Immun. 56:766-772. 57. Mitsuyama, M., K.-I. Igarashi, I. Kawamura, T. Ohmori, and K. Nomoto. 1990. Difference in the induction of macrophage interleukin-1 production between viable and killed cells of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 58:1254197

1260. 58. Moors, M.A., B. Levitt, P. Youngman, and D.A. Portnoy. 1999. Expression of listeriolysin O and ActA by intracellular and extracellular Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 67:131-139. 59. Murray, E.G.D., R.A. Webb, and M.B.R. Swann. 1926. A disease of rabbits characterized by large mononuclear leuco-cytosis caused by a hitherto undescribed bacillus Bacterium monocytogenes (n. sp.). J. Pathol. Bacterial. 29:407-439. 60. Nakane, A., A. Numata, M. Asano, M. Kohanawa, Y. Chen, and T. Minagawa. 1990. Evidence that endogenous gamma interferon is produced early in Listeria monocytogenes infection. Infect. Immun. 58:2386-2388. 61. Nicolas, J.-A., and N. Vidaud. 1987. Contribution a l’etude des Listeria presented dans les denrdes d’origine animale destinces a la consommation humaine. Rec. Med. Vet. 163(3):283-285. 62. Notermans, S., J. Dufrenne, P. Teunis, and T. Chackraborty. 1998. Studies on the risk assessment of Listeria monocytogenes. J. Food Protect. 61:244—248. 63. Parish, M.E., and D.P. Higgins. 1989. Survival of Listeria monocytogenes in low pH model broth systems. J. Food Protect. 52:144-147. 64. Petran, R.L., and E.A. Zottola. 1989. A study of factors affecting growth and recovery of Listeria monocytogenes Scott A. J. Food Sci. 54:458-460. 65. Piccinin, D.M., and L.A. Shelef. 1995. Survival of Listeria monocytogenes in cottage cheese. 7. Food Protect. 58:128-131. 66. Pine, L., G.B. Malcolm, and B.D. Plikaytis. 1990. Listeria monocytogenes intragastric and intraperitoneal approximate 50% lethal doses for mice are comparable, but death occurs earlier by intragastric feeding. Infect. Immun. 58:2940-2945. 67. Pini, P.N., and R.J. Gilbert. 1988. The occurrence in the U.K. of Listeria species in raw chickens and soft cheeses Int. J. Food Microbiol. 6:317-326. 68. Rocourt, J., P. Boerlin, F. Grimont, C. Jaquet, and J.-C. Piffarctti. 1992. Assignment of Listeria grayi and Listeria murrayi to a single species, Listeria grayi, with a revised description of Listeria grayi. Int. J. System. Bacteriol. 42:171-174. 69. Ruhland, G.J., and F. Fiedler. 1987. Occurrence and biochemistry of lipoteichoic acids in the genus Listeria. System. Appl. Microbiol. 9:40-46. 70. Ryser, E.T., and E.H. Marth. 1988. Survival of Listeria monocytogenes in coldpack cheese food during refrigerated storage. J. Food Protect. 51:615-621. 71. Ryser, E.T., and E.H. Marth. 1987. Fate of Listeria monocytogenes during the manufacture and ripening of Camembert cheese. J. Food Protect. 50:372-378. 198

72. Ryser, E.T., E.H. Marth, and M.P. Doyle. 1985. Survival of Listeria monocytogenes during manufacture and storage of cottage cheese. J. Food Protect. 48:746-750. 73. Schmidt. U., H.P.R. Seeliger, E. Glenn, B. Langer, and L. Leistner. 1988. Listerienfunde in rohen Fleischcrzeugmsscn Fleischwirtsch. 68:1313-1316. 74. Seeliger, H.P.R., and K Holme. 1979. Serotyping of Listeria monocytogenes ami related species. Meth. Microbiol. 13:31^19. 75. Shelef, L.A. 1989. Survival of Listeria monocytogenes in ground beef or liver during storage at 4” and 25 C. J. Food Protect. 52:379-383. 76. Simona Ivana, 2002 – Bacteriologie veterinară specială (Ed. Ceres, Bucureşti; 460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5 77. Simona Ivana, 2005 – Bacteriologie generală (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti; 250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2 78. Simona Ivana, 2006 – Tratat de bacteriologie medical-veterinară şi introducere în micologie (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti;768 pagini), ISBN (10) 97386571-5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1 79. Simona Ivana, 2007 – Manual de microbiologia alimentelor (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7 80. Simona Ivana, 2007 – Microbiologie medicală – veterinară, Vol. I (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6 81. Simona Ivana, 2007 – Microbiologie medicală – veterinară, Vol. II (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3. 82. Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978973-736-090-8 83. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi, ISBN: 978-973-736-089-2 84. Singh, S.P., B.L. Moore, and l.H. Siddique. 1981. Purification and further characterization of phenol extract from Listeria monocytogenes. Am. J. Vet. Res. 42:1266-1268. 85. Sizmur, K., and C.W. Walker. 1988. Listeria in prepackaged salads. Lancet 1:1167. 86. Skalka, B., J. Smola, and K. Elischerova. 1982. Routine test for in vitro differentiation of pathogenic and apathogenic Listeria monocytogenes strains. J. Clin. Microbiol. 15:503-507. 87. Skovgaard, N., and C.-A. Morgen. 1988. Detection of Listeria spp. in faeces from animals, in feeds, and in raw foods of animal origin. Inl. .1. Food Microbiol. 88. Vit M, Olejnik R, Dlhý J, Karpísková R, Cástková J, Príkazský V, Príkazská M, Benes C, Petrás P. Outbreak of listeriosis in the Czech Republic, late 2006: preliminary report. Euro Surveill. 2007 Feb 8;12(2):E070208.1. 199

89. European Food Safety Authority (EFSA). The Community summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents, antimicrobial resistance and foodborne outbreaks in the European Union in 2006. The EFSA Journal. 2007(130). Available from: http://www.efsa.europa.eu/EFSA/DocumentSet/ Zoon_report_2006_en,0.pdf. 90. Denny J, McLauchlin J. Human Listeria monocytogenes infections in Europe: an opportunity for improved European surveillance. Euro Surveill. 2008;13 (13).

200

CAPITOLUL 6 Implicaţiile bacteriilor din genul Mycobacterium în producerea toxiinfecţiilor alimentare 6.1. Mycobacterium avium subspecia paratuberculosis (Myb. paratuberculosis) Sinonime: Myb. johnei, Francis, 1943, Bacillus paratuberculosis (Bergey şi col.). Nume comune: Bacilul paratuberculozei, Bacilul lui Johne. 6.1.1. Istoric Germenul a fost izolat pentru prima dată de către Twort şi Ingram în 1912 după ce boala fusese descrisă cu mult timp în urmă de către Johne şi Frothingham (1895). 6.1.2. Morfologie Myb. avium subsp. paratuberculosis este un bacil scurt şi relativ gros, asemănător cu Myb. bovis, de 1-2 microni lungime, imobil, necapsulogen, nesporogen, Gram pozitiv şi acidorezistent. 6.1.3. Condiţii de cultivare şi caractere culturale Bacilul lui Johne este o bacterie pretenţioasă din punct de vedere al condiţiilor de cultivare. Se cultivă greu pe medii speciale (Löwenstein, Petragnani), necesitând adăugarea unor extracte de micobacterii sau chiar de micobacterii inactivate. De regulă, se adaugă suspensii de Myb. phlei. Izolarea germenului este dificilă şi se realizează printr-o tehnică asemănătoare cu cea folosită la tuberculoză. Incubarea culturilor se realizează la temperatura de 37°C şi durează 1-2 luni. Pe suprafaţa mediilor solide formează după minimum 4-6 săptămâni 201

nişte colonii de culoare albă, mici, rotunde, bombate, cu o margine fină, uşor neregulată. Uneori, culturile vechi apar pigmentate în galben sau portocaliu. În mediile lichide formează la suprafaţă o membrană groasă şi încreţită. 6.1.4. Proprietăţi biochimice Nu se examinează practic pentru identificarea acestei specii. 6.1.5. Proprietăţi antigenice S-a observat că între infecţia tuberculoasă şi cea paratuberculoasă, există o relaţie de protecţie încrucişată, datorită înrudirii antigenice a agenţilor etiologici. Extractele obţinute din bacilii paratuberculozei reprezintă un produs revelator, utilizabil în practică, numit paratuberculină sau johnină. Taurinele tuberculoase dau reacţii pozitive la johnină. 6.1.6. Ecologie Bacilul lui Johne este obligatoriu parazit, fiind prezent în intestinul animalelor bolnave. A fost remarcată o relaţie între prevalenţa paratuberculozei într-o zonă geografică şi aciditatea sau conţinutul în fier din sol. Myb. paratuberculosis este un germen foarte rezistent faţă de agenţii nocivi fizici şi chimici, iar în mediul ambiant (păşuni, furaje, sol) poate supravieţui de la un an la altul. 6.1.7. Patogenitate Speciile natural receptive sunt taurinele, ovinele, caprinele adulte, dar şi rumegătoarele sălbatice (cerbul, căprioara, muflonul, yakul, zebra, lama, antilopa, cămila). Foarte rar se pot infecta şi solipedele sau porcii. Infecţia naturală poartă denumirea de paratuberculoză sau enterită hipertrofiantă şi se caracterizează prin îngroşarea mucoasei intestinului gros, care apare încreţită, amintind de aspectul circumvoluţiunilor cerebrale, consecutiv proceselor hiperplazice.

202

Fotiu colorat Ziehl-Neelsen din cultură de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis; colonii crescute în mediu Middlebrook cu mycobactin.

Fotiu colorat Ziehl-Neelsen din amprentă de intestin subţire în paratuberculoză, infecţie naturală. Se observă abundenţa bacililor Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis în frotiurile din material patologic. 203

Bibliografie selectivă 1. Bull, T. J., Hermon-Taylor, J., Pavlik, I., El-Zaatari, F., Tizard, M. (2000). Characterization of IS900 loci in Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and development of multiplex PCR typing. Microbiology 146: 2185-2197 2. Bull, T. J., Hermon-Taylor, J., Pavlik, I., El-Zaatari, F., Tizard, M. (2000). Characterization of IS900 loci in Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and development of multiplex PCR typing. Microbiology 146: 2185-2197 3. Castellanos, E., Aranaz, A., Gould, K. A., Linedale, R., Stevenson, K., Alvarez, J., Dominguez, L., de Juan, L., Hinds, J., Bull, T. J. (2009). Discovery of Stable and Variable Differences in the Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Type I, II, and III Genomes by Pan-Genome Microarray Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75: 676686 4. Collins, D. M., De Zoete, M., Cavaignac, S. M. (2002). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Strains from Cattle and Sheep Can Be Distinguished by a PCR Test Based on a Novel DNA Sequence Difference. J. Clin. Microbiol. 40: 4760-4762 5. de Juan, L., Alvarez, J., Romero, B., Bezos, J., Castellanos, E., Aranaz, A., Mateos, A., Dominguez, L. (2006). Comparison of Four Different Culture Media for Isolation and Growth of Type II and Type I/III Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Strains Isolated from Cattle and Goats. Appl. Environ. Microbiol. 72: 5927-5932 6. Dupont, C., Thompson, K., Heuer, C., Gicquel, B., Murray, A. (2005). Identification and characterization of an immunogenic 22 kDa exported protein of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. J Med Microbiol 54: 1083-1092 7. Enosawa, M., Kageyama, S., Sawai, K., Watanabe, K., Notomi, T., Onoe, S., Mori, Y., Yokomizo, Y. (2003). Use of Loop-Mediated Isothermal Amplification of the IS900 Sequence for Rapid Detection of Cultured Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J. Clin. Microbiol. 41: 4359-4365 8. Fang, Y., Wu, W.-H., Pepper, J. L., Larsen, J. L., Marras, S. A. E., Nelson, Eric. A., Epperson, W. B., Christopher-Hennings, J. (2002). Comparison of Real-Time, Quantitative PCR with Molecular Beacons to Nested PCR and Culture Methods for Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Bovine Fecal Samples. J. Clin. Microbiol. 40: 287-291 9. Griffiths, T. A., Rioux, K., De Buck, J. (2008). Sequence Polymorphisms in a Surface PPE Protein Distinguish Types I, II, and III of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J. Clin. Microbiol. 46: 1207-1212 10. Harris, N. B., Barletta, R. G. (2001). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Veterinary Medicine. Clin. Microbiol. Rev. 14: 489-512 11. Harris, N. B., Barletta, R. G. (2001). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Veterinary Medicine. Clin. Microbiol. Rev. 14: 489-512 12. Hermon-Taylor, J., Barnes, N., Clarke, C., Finlayson, C. (1998). Grand Round: Mycobacterium paratuberculosis cervical lymphadenitis, followed five years later by terminal ileitis similar to Crohn’s disease. BMJ 316: 449-453 13. Hughes, V., Bannantine, J. P., Denham, S., Smith, S., Garcia-Sanchez, A., Sales, J., Paustian, M. L., Mclean, K., Stevenson, K. (2008). Immunogenicity of ProteomeDetermined Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-Specific Proteins in Sheep with Paratuberculosis. CVI 15: 1824-1833 204

14. Kurade, N. P., Tripathi, B. N., Rajukumar, K., Parihar, N. S. (2004). Sequential Development of Histologic Lesions and Their Relationship with Bacterial Isolation, Fecal Shedding, and Immune Responses during Progressive Stages of Experimental Infection of Lambs with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Vet Pathol 41: 378-387 15. Marsh, I. B., Bannantine, J. P., Paustian, M. L., Tizard, M. L., Kapur, V., Whittington, R. J. (2006). Genomic Comparison of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Sheep and Cattle Strains by Microarray Hybridization. J. Bacteriol. 188: 2290-2293 16. Mobius, P., Luyven, G., Hotzel, H., Kohler, H. (2008). High Genetic Diversity among Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Strains from German Cattle Herds Shown by Combination of IS900 Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis and Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number Tandem-Repeat Typing. J. Clin. Microbiol. 46: 972-981 17. Mobius, P., Luyven, G., Hotzel, H., Kohler, H. (2008). High Genetic Diversity among Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Strains from German Cattle Herds Shown by Combination of IS900 Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis and Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number Tandem-Repeat Typing. J. Clin. Microbiol. 46: 972-981 18. Motiwala, A. S., Amonsin, A., Strother, M., Manning, E. J. B., Kapur, V., Sreevatsan, S. (2004). Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Isolates Recovered from Wild Animal Species. J. Clin. Microbiol. 42: 1703-1712 19. Motiwala, A. S., Strother, M., Amonsin, A., Byrum, B., Naser, S. A., Stabel, J. R., Shulaw, W. P., Bannantine, J. P., Kapur, V., Sreevatsan, S. (2003). Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: Evidence for Limited Strain Diversity, Strain Sharing, and Identification of Unique Targets for Diagnosis. J. Clin. Microbiol. 41: 2015-2026 20. Motiwala, A. S., Strother, M., Amonsin, A., Byrum, B., Naser, S. A., Stabel, J. R., Shulaw, W. P., Bannantine, J. P., Kapur, V., Sreevatsan, S. (2003). Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: Evidence for Limited Strain Diversity, Strain Sharing, and Identification of Unique Targets for Diagnosis. J. Clin. Microbiol. 41: 2015-2026 21. Overduin, P., Schouls, L., Roholl, P., van der Zanden, A., Mahmmod, N., Herrewegh, A., van Soolingen, D. (2004). Use of Multilocus Variable-Number TandemRepeat Analysis for Typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J. Clin. Microbiol. 42: 5022-5028 22. Paustian, M. L., Kapur, V., Bannantine, J. P. (2005). Comparative Genomic Hybridizations Reveal Genetic Regions within the Mycobacterium avium Complex That Are Divergent from Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Isolates. J. Bacteriol. 187: 2406-2415 23. Pearce, L. E., Truong, H. T., Crawford, R. A., Yates, G. F., Cavaignac, S., de Lisle, G. W. (2001). Effect of Turbulent-Flow Pasteurization on Survival of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Added to Raw Milk. Appl. Environ. Microbiol. 67: 39643969 24. Pickup, R. W., Rhodes, G., Bull, T. J., Arnott, S., Sidi-Boumedine, K., Hurley, M., Hermon-Taylor, J. (2006). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Lake Catchments, in River Water Abstracted for Domestic Use, and in Effluent from Domestic 205

Sewage Treatment Works: Diverse Opportunities for Environmental Cycling and Human Exposure.. Appl. Environ. Microbiol. 72: 4067-4077 25. Rodríguez, J. G., Fissanoti, J. C., Del Portillo, P., Patarroyo, M. E., Romano, M. I., Cataldi, A. (1999). Amplification of a 500-Base-Pair Fragment from Cultured Isolates of Mycobacterium bovis. J. Clin. Microbiol. 37: 2330-2332 26. Salgado, M., Herthnek, D., Bolske, G., Leiva, S., Kruze, J. (2009). First isolation of mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis from wild guanacos (lama guanicoe) on tierra del fuego island. J Wildl Dis 45: 295-301 27. Semret, M., Turenne, C. Y., de Haas, P., Collins, D. M., Behr, M. A. (2006). Differentiating Host-Associated Variants of Mycobacterium avium by PCR for Detection of Large Sequence Polymorphisms.. J. Clin. Microbiol. 44: 881-887 28. Stevenson, K., Hughes, V. M., de Juan, L., Inglis, N. F., Wright, F., Sharp, J. M. (2002). Molecular Characterization of Pigmented and Nonpigmented Isolates of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J. Clin. Microbiol. 40: 1798-1804 29. Stevenson, K., Hughes, V. M., de Juan, L., Inglis, N. F., Wright, F., Sharp, J. M. (2002). Molecular Characterization of Pigmented and Nonpigmented Isolates of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J. Clin. Microbiol. 40: 1798-1804 30. Thibault, V. C., Grayon, M., Boschiroli, M. L., Hubbans, C., Overduin, P., Stevenson, K., Gutierrez, M. C., Supply, P., Biet, F. (2007). New Variable-Number TandemRepeat Markers for Typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M. avium Strains: Comparison with IS900 and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism Typing. J. Clin. Microbiol. 45: 2404-2410 31. Turenne, C. Y., Collins, D. M., Alexander, D. C., Behr, M. A. (2008). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M. avium subsp. avium Are Independently Evolved Pathogenic Clones of a Much Broader Group of M. avium Organisms. J. Bacteriol. 190: 2479-2487 32. Turenne, C. Y., Semret, M., Cousins, D. V., Collins, D. M., Behr, M. A. (2006). Sequencing of hsp65 Distinguishes among Subsets of the Mycobacterium avium Complex. J. Clin. Microbiol. 44: 433-440 33. Turenne, C. Y., Wallace, R. Jr., Behr, M. A. (2007). Mycobacterium avium in the Postgenomic Era. Clin. Microbiol. Rev. 20: 205-229 34. Turenne, C. Y., Wallace, R. Jr., Behr, M. A. (2007). Mycobacterium avium in the Postgenomic Era. Clin. Microbiol. Rev. 20: 205-229 35. Whittington, R. J., Hope, A. F., Marshall, D. J., Taragel, C. A., Marsh, I. (2000). Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: IS900 Restriction Fragment Length Polymorphism and IS1311 Polymorphism Analyses of Isolates from Animals and a Human in Australia. J. Clin. Microbiol. 38: 3240-3248 36. Whittington, R. J., Hope, A. F., Marshall, D. J., Taragel, C. A., Marsh, I. (2000). Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: IS900 Restriction Fragment Length Polymorphism and IS1311 Polymorphism Analyses of Isolates from Animals and a Human in Australia. J. Clin. Microbiol. 38: 3240-3248 37. Whittington, R. J., Marsh, I., McAllister, S., Turner, M. J., Marshall, D. J., Fraser, C. A. (1999). Evaluation of Modified BACTEC 12B Radiometric Medium and Solid Media for Culture of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from Sheep. J. Clin. Microbiol. 37: 1077-1083 38. Whittington, R. J., Marsh, I., McAllister, S., Turner, M. J., Marshall, D. J., Fraser, C. A. (1999). Evaluation of Modified BACTEC 12B Radiometric Medium and 206

Solid Media for Culture of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from Sheep. J. Clin. Microbiol. 37: 1077-1083 39. Whittington, R. J., Marshall, D. J., Nicholls, P. J., Marsh, I. B., Reddacliff, L. A. (2004). Survival and Dormancy of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in the Environment. Appl. Environ. Microbiol. 70: 2989-3004

207

CAPITOLUL 7 Implicaţiile bacteriilor din familia Enterobacteriaceae în producerea toxiinfecţiilor alimentare Tabelul 7.1 Familia

Genuri Escherichia

Proteus Providencia Enterobacteriaceae

Grupa bacililor Gram negativi facultativ anaerobi

Klebsiella

Morganella

Serratia

Yersinia

Salmonella

Specii E. coli, E. adecarboxylata, E. albertii, E. fergusonii, E. hermannii, E. vulneris, E. blattae K. pneumoniae ( subsp. pneumoniae şi rhinoscleromatis), K. granulomatis, K. mobilis, K. ornithinolytica, K. oxytoca, K. ozaenae, K. planticola, K. rhinoscleromatis, K. singaporensis (Li şi col. 2004), K. terrigena, K. trevisanii, K. variicola (Rosenblueth şi col.. 2004) P. vulgaris, P. hauseri, P. inconstans, P. mirabilis, P. morganii, P. myxofaciens, P. penneri, P. rettgeri (Prov. rettgeri) Prov. rettgeri, Prov. stuartii, Prov. alcalifaciens, Prov. friedericiana, Prov. heimbachae, Prov. rustigianii M. morganii (subsp. morganii şi sibonii) S. marcescens (subsp. marcescens şi sakuensis), S. entomophila, S. ficaria, S. fonticola, S. grimesii, S. liquefaciens sakuensis (Ajithkumar şi col. 2003), S. marinorubra, S. odorifera, S. plymuthica, S. proteamaculans, S. proteamaculans (subsp. proteamaculans şi quinovora), S. quini-vorans, S. rubidaea, S. ureilytica (Bhadra şi col. 2005) Y. pseudotuberculosis (subsp. pseudotuberculosis şi pestis), Y. enterocolitica (subsp. enterocolitica şi palearctica), Y. aldovae, Y. aleksiciae (Sprague şi Neubauer 2005), Y. bercovieri, Y. frederiksenii,Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. philomiragia, Y. rohdei, Y. ruckeri S. enterica (subsp. arizonae, bongori, diarizonae, enterica, houtenae, indica şi salamae), S. bongori, S. choleraesuis ( subp. arizonae, bongori, choleraesuis, diarizonae, houtenae, indica şi salamae), S. enteritidis, S. typhi, S. typhimurium S. arizonae, S. paratyphi, S. subterranea (Shelobolina, 2005), 208

Familia Enterobacteriaceae (44 de genuri) reuneşte bacili Gram negativi, nesporogeni, mobili, prin flageli peritrichi sau imobili. Nepretenţioşi nutritiv, cresc pe medii cu peptonă în prezenţa bilei (tabelele 7.2., 7.3. a, b). Fermentează glucoza, sunt oxidază negativi, produc catalază şi reduc nitraţii în nitriţi (tabelul 7.4). Tabelul 7.2 Caractere de cultivare ale enterobacteriaceelor pe medii nutritive simple (incubate 24 de ore la 35-37°C) (după Negruţ M., 1999) Aspecte comune ale culturii Mediul

Aspecte particulare Forma „S”

Forma „R”

Bulion simplu limpede ori tulbure în tulbure, uniformă, (bulion glucozat, grade diferite, cu inel fără depozit Mediul I) ori văl şi cu depozit

Agar nutritiv

colonii de 2-3 mm, rotunde, bombate, umede, cu suprafaţa netedă şi marginile regulate

colonii de 2-3 mm, rotunde, plate, cu suprafaţa rugoasă şi marginile regulate

VV colonii mucoide de 4-5 mm, rotunde, bombate, cu margini regulate, tendinţă la confluare, aspect mucos (frecvente la Klebsiella şi Escherichia; VV colonii pigmentatea; VV creştere invazivă: în jurul coloniei se dezvoltă zone de migrare concentrice (caracteristică pentru genul Proteus)

Agar-sânge

ca pe agarul nutritiv; unele similare formei „S” tulpini dezvoltă hemoliză

depind de tipul hematiilor

* Pigment roşu (Serratia spp.), galben (Enterobacter spp., Xenorhabdus spp.), brun (Xenorhabdus spp.) 209

Tabelul 7.3 a. Medii folosite în diagnosticul enterobacteriaceelor (după Carp-Cărare M., 1997) Mediul

Substanţa Substanţa hidrocar- Indicator inhibantă bonată

Aspectul coloniilor Pozitiv

Negativ

săruri biliare integrale şi lactoză cristal violet

roşu neutru

roşii, cu halou opalescent

necolorate

săruri biliare (dezoxicolat de Na)

lactoză

roşu neutru

roşii

necolorat (la bact. cu H2S pozitiv, centrul negru)

Salmonella săruri biliare lactoză Shigella (SS) integrale

roşu neutru

roşii, cu centrul opac

necolorate semitransparente

Mac Conkey (MC) Leifson (ADCL)

Istati Meitert (M)

bilă uscată

lactoză

albastru galbene opace verzui sau albastre bromtimol

Geloză verde briliant sau Christensen (V.B.)

verde briliant

lactoză

roşu fenol

Wilson Blair (W.B)

verde briliant

glucoză

sulfit de bismut

Levin (EMB)

-

lactoză

eozină albastru metilen

Drigalski (după Le Minor)

-

lactoză

bromtimol

galbene

albastre

Endo

-

lactoză

fuxină, hiposulfit de Na

roşii

incolore

Geloza lactozată şi albastru bromtimol

-

lactoză

albastru bromtimol

galbene

albastre

lactoză

Metacromgelb şi Wasserblau

albastre

galbene

Gassner

-

210

galbeneverzui

roşii

majoritatea enterobacteriaceelor se dezvoltă greu, exceptând Salmonella negre, cu luciu necolorate sau roz metalic

Tabelul 7.3 b. Aspectul coloniilor la principalele genuri de enterobacteriacee Mediul

Salmonella

Shigella

Escherichia

Proteus

Wilson Blair

colonii umede, negre pentru S. typhimurium; colonii plate, verzui pentru S. suipestifer şi S. typhimurium

nu se dezvoltă (afară de S. flexneri şi S. sonnei, care dau colonii brune)

nu creşte sau dă colonii rare, mici, gri

colonii verzi, neinvadante

Leifson

colonii incolore

colonii incolore

colonii roşii

colonii cu centrul negru

Christensen Lester şi Jurgens

colonii netede, roşii sau roz strălucitoare

colonii groase, colonii netede galbene-verzui roşii, strălucitore strălucitoare

SS

colonii incolore, cu centrul negru colonii incolore pentru salmonelele ce dau H2S

Istrati Meitert

colonii verzi, albăstrui

Geloza verde briliant colonii roşii (Christensen)

rare colonii roz sau roşu aprins

colonii izolate, mucoase, galbene sau roz colonii rare neinvadante

colonii verzi sau colonii galbene verzui-albăstrui opace

colonii izolate, central opace, devenind negre

nu creşte

colonii verzui

uneori colonii rare roşii, neinvadante

Mac Conkey

colonii incolore

colonii incolore

colonii roşii cu inele invadează periferice de bilă precipitată

Levin (E.M.B.)

colonii incolore

colonii incolore

colonii negre sau cu centrul negru, invadează cu reflex metalic

Geloză lactozată turnesolată (Drigalski)

colonii albastre

colonii albastre

colonii roşii

invadează

Endo

colonii incolore

colonii incolore

colonii roşii

invadează

211

Genul

Tabelul 7.4 Familia Enterobacteriaceae: identificarea preliminarăa (după Neguţ M., 1999) Mediul T.S.I. Mediul M.I.L.F. Citrat Glucoza Lizin- Fenil-ala- Urea(SimLactoza/ Mobi(coloana) H2S Indol decar- nindeza- ză mons) Zaharoza litate boxilază minază Acid Gaz

Escherichia

+

+b

-

+c

+b

+d

+

-

-

-

Shigella

+

-

-

-

-

V

-

-

-

-

Salmonella

+

+c

+f

-

+g

-

+f

-

-

+h

Citrobacter

+

+

V

+

+

V

-

-

D

+

Klebsiella

+

+i

-

+i

-

V

+i

-

V

+i

Enterobacter +

+

-

+

+

-

V

-

V

+

Hafnia

+

+

-

-

+22°C

-

+

-

-

-

Serratia

+

V

-

V

+

-

+j

-

-

+

Proteus

+

+

+k

-

+

V

-

+

+

V

Providencia

+

V

-

-

+

+

-

+

V

V

Morganella

+

+

-

-

+ + + + +22Yersinia + V V + 30°C a Simboluri: + = majoritatea tulpinilor pozitive; - = majoritatea tulpinilor negative; V = variaţii în funcţie de specie. b Cu excepţia E. coli inactiv. c Escherichia fergusonii şi majoritatea tulpinilor de E. vulneris şi E. coli inactiv nu formează lactoză/zaharoză. d Exceptând E. vulneris. e Exceptând serovarurile typhi şi tallinarum de S. enterica. f Exceptând serovarul paratyphi A de S. enterica. g Exceptând serovarurile gallinarum şi pulorum de S. enterica. h Exceptând serovarurile tiphy, paratiphy A., gallinarum şi pullorum de S. enterica. i Exceptând K. rhinoscleromatis. j Exceptând Serratia plymuthica. k Tulpinile de P. myxofaciens nu produc H2S, iar cele de P. penneri produc doar în proporţie de 30%. 212

În funcţie de mobilitate şi proprietăţi metabolice sunt redate deosebirile între principalele genuri, în schemele 7.1 şi 7.2 (după Răpuntean Gh., 2001). Schema 7.1

Mobilitate Mobili

Imobili

Citrat

Citrat

+

-

Lactoză

Lactoză -

+

-

Citrobacter

Enterobacter

Citrobacter

Enterobacter

Urează +

+

Urează -

-

-

Urează -

Urează +

Klebsiella

Shigella

-

+

+

+

Citrobacter

Proteus

Schema 7.2 Lactoză Lactozo -

Lactozo +

Glucoză

Indol +

-

Citrat

Uree

+

-

+

-

+ Mobilitate Pseudomonas alcaligenes -

Citrobacter

Escherichia

Klebsiella

Enterobacter

+ Uree

H2S

+

-

Proteus

Salmonella

213

Shigella

CAPITOLUL 8 Implicaţiile bacteriilor din genul Salmonella în producerea toxiinfecţiilor alimentare 8.1. Caractere generale Toxiinfecţiile alimentare produse de salmonele, din punct de vedere al frecvenţei şi al implicaţiilor igienico-sanitare ocupă primul loc în majoritatea ţărilor. Acestea apar mai frecvent în anotimpurile calde (mai-octombrie), când există mai mulţi purtători umani şi animali, temperatura fiind factor favorabil pentru dezvoltarea şi multiplicarea germenilor. Există peste 2700 de serotipuri Salmonella, grupele majore fiind reprezentate de: - grupul I – S. enterica subsp. enterica; - grupul II – S. enterica subsp. salamae; - grupul III – S. enterica subsp. arizonae; - grupul III b – S. enterica subsp. diarizonae; - grupul IV – S. enterica subsp. houtenae; - grupul V – S. enterica subsp. indica. Grupul V a căpătat statutul de specie, ca S. bongori. Aceste schimbări au avut loc pe baza hibridizărilor DNA-RNA şi a electroforezei enzimatice multiloculare. Serovarurile se pot scrie cu literă mare. De exemplu: S. enterica serovar Typhimurium poate fi notată S. typhimurium. Din punct de vedere epidemiologic, salmonelele pot fi plasate într-una din următoarele trei grupe: 1. Serotipuri monopatogene pentru om: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi C, care sunt agenţii febrei tifoide şi paratifoide. 2. Serovaruri adaptate gazdei (patogeni umani ce pot fi contactaţi din alimente). S. Gallinarum (carnea de pasăre), S. Dublin (carnea de vită), S. Abortus-equi (cal), S. Abortus-ovis (oaie), S. Choleraesuis (carnea de porc). 3. Serovaruri inadaptate (fără gazdă preferenţială); patogeni pentru oameni şi animale şi includ majoritatea serovarurilor care produc 214

toxiinfecţiile alimentare. Principalele rezervoare pentru infecţia umană sunt păsările, bovinele, ovinele şi porcinele. La oameni, prezenţa şi severitatea simptomelor depind de doza infectantă. Tipic, apare o diaree apoasă, cu durată de câteva zile, ce duce la deshidratare, cu dureri abdominale şi febră joasă. Septicemia şi formarea abceselor sunt rare. La animale este frecventă infecţia subclinică, multe dintre acestea fiind purtători intermitenţi sau persistenţi. Bovinele, pot prezenta febră, diaree, avorturi. La viţei apar epizootii de diaree, cu o mortalitate înaltă. La porcine, febra şi diareea sunt mai puţin frecvente decât la bovine. Ovinele, caprinele şi păsările infectate nu prezintă de obicei nici un semn de infecţie. Profilaxia şi combaterea toxiinfecţiilor alimentare includ măsuri de educare a celor care manipulează alimentele pentru menţinerea igienei corespunzătoare în bucătării, prepararea adecvată a cărnii, refrigerarea alimentelor preparate şi prevenirea contaminării încrucişate, pasteurizarea laptelui, măsuri de igienă personală şi reducerea contaminării carcaselor de păsări în abatoare. Iradierea cărnii şi a altor alimente înainte de achiziţionare va reduce contaminarea. Salmoneloza umană se poate manifesta sub două forme clinice. Cea mai severă este febra enterică, produsă de S. typhi sau S. paratyphi A, B sau C. Cu puţine excepţii, în cazul febrei paratifoide B transmiterea este interumană, fără implicarea animalelor. Toate celelalte salmonele aparţin în primul rând animalelor şi unele pot fi transmise la om, producând „salmoneloza non-tifoidică”.

8.2. Istoric În 1880, Eberth şi Koch, au evidenţiat în foliculii limfatici necrotici la decedaţii de febră tifoidă, un bacil incriminat în etiologia bolii, pe care ulterior Gartner reuşeşte să-l cultive. Salmon şi Smith, în 1885, izolează Bacillus choleraesuis de la porcii cu pestă, iar Gartner descrie în 1888 în Germania prima toxiinfecţie alimentară, cu 58 de îmbolnăviri în urma consumului de carne de vită tăiată de necesitate şi atribuie acestui microorganism numele de B. enteritidis. În anul 1900, Lignierés, separă pasteurelele de grupul de bacterii descris de Salmon şi constituie un nou gen, în cadrul bacteriilor intestinale Gram negative, pe care îl intitulează Salmonella. 215

În 1899, în Belgia, are loc o izbucnire determinată de un bacil anterior izolat şi descris de Löeffler la şoarecii dintr-o crescătorie de laborator şi pe care îl denumeşte Bacillus aertrycke. În România prima salmoneloză (o toxiinfecţie alimentară determinată de friptură din carne de miel) a fost descrisă de Babeş, în 1905. Pornind de la studiile privind structura antigenică, ale lui Andrews, în 1921-1924, White propune prima schemă de identificare antigenică, extinsă ulterior de Kauffmann, cunoscută azi ca schema Kauffmann-White. Craigie şi Yen, utilizând o serie de bacteriofagi specifici alcătuiesc în 1939 prima schemă de tipizare la Salmonella typhi, utilizarea ei fiind şi astăzi de necontestat în investigarea epidemiologică a febrei tifoide. Studiile de conversie antigenică sub acţiunea bacteriofagilor temperaţi efectuate de Le Minor şi Popoff au modificat radical taxonomia genului, introducând un sistem raţional de clasificare.

8.3. Taxonomie Termenul de „Salmonella” a fost adoptat în onoarea unui medic veterinar american, Daniel E. Salmon, care a participat la studiile iniţiale. Genul Salmonella face parte din familia Enterobacteriaceae. Popoff şi Le Minor propun clasificarea genului Salmonella în două specii: S. enterica şi S. bongori. Tabelul 8.1 Specia

enterica

bongori

Numărul actual al serotipurilor de Salmonella Subspecia Număr de serotipuri Enterica 1435 Salomae 485 Arizonae 94 Diarizonae 321 Houtenae 69 Indica 11 20

S. enterica cuprindea şase subspecii (pe criterii exoenzimatice): enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae şi indica. Clasificarea actuală (J. P. Euzéby, 2006) a genului Salmonella, cuprinde nouă specii, care sunt prezentate în tabelul 8.1. În cadrul speciilor şi subspeciilor au fost descrise serotipuri desemnate 216

taxonomic prin nomenclatura din schema Kauffmann-White. Pentru simplificare, în practică se foloseşte terminologia de gen Salmonella, urmată de denumirea de serotip. Pentru a deosebi termenii care desemnează specia sau subspecia de cei care definesc serotipul, s-a făcut propunerea, ca acesta din urmă să fie scris cu iniţială majusculă (de exemplu: Salmonella anatum). La unele serotipuri se întâlnesc subdiviziuni bazate pe criteriul sensibilităţii la bacteriofagi (fago sau lizotipuri), la bacteriocine (bacteriocinotipuri) şi la antibiotice. În tabelul 8.2, redăm serotipurile de salmonele implicate în patologia veterinară. Toate serotipurile menţionate în tabel, cu excepţia lui S. arizonae fac parte din specia enterica. Tabelul 8.2 Serotipuri de salmonele patogene pentru animale şi om (după Neguţ M.) Gazda

Om

Serotipuri de Salmonella

Infecţia produsă

S. typhi

febra tifoidă

S. paratyphi

febra paratifoidă

S. schottmuelleri

febra paratifoidă

S. enteritidis

toxiinfecţii alimentare

S. typhimurium

toxiinfecţii alimentare

S. dublin Bovine S. typhimurium S. bovimorbificans

excretori subclinici, purtători, enterită, septicemie, meningită la viţei, avort, osteomielită, artrite, cangrenă uscată a extremităţilor la viţel, enterite, septicemie

S. choleraesuis şi izbucniri clinice severe, similare cu cele din pesta porcină; S. choleraesuis complicaţii secundare în pesta porcină Porcine biotip Kunzerdorf

Ovine

S. typhisuis

Enterită cronică la porcii tineri; mai puţin virulentă decât S. choleraesuis; enterită sau septicemie

S. abortus ovis

avort la oaie

S. montevideo S. dublin S. typhimurium

enterite sau septicemii

S. anatum 217

Gazda

Serotipuri de Salmonella

S. abortus equi Cabaline S. typhimurium

Găini şi alte păsări

Infecţia produsă avort la iapă enterite sau septicemie, mai ales la mânji dar şi la adulţii supuşi stresului

S. pullorum

boala pulorică – puloroză

S. gallinarum

tifoza aviară la adulte

S. enteritidis

infecţii severe la găină şi curcan (enterite şi septicemie)

S. typhimurium

„paratifoza găinilor”; poate produce septicemie la puii de porumbel şi artrite ale aripilor

8.4. Morfologie Salmonella (cu excepţia lui S. pullorum-gallinarum) este o enterobacterie mobilă, respectiv un bacil sau cocobacil Gram negativ, cu dimensiuni de 0,6/2-4 microni. Este necapsulogenă şi nesporogenă. Serotipurile de S. enterica subsp. enterica prezintă fimbrii manozosenzitive, cu rol de adezine la celulele epiteliale intestinale. Salmonelele din serotipul pullorum-gallinarum au fimbrii neadezive de tip 2 şi din această cauză sunt apatogene pentru om. S. enterica subsp. arizonae şi diarizonae posedă fimbrii hemaglutinante. Conţinutul în guanină şi citozină al DNA este de 50 moli % (prin analiză biochimică, Hill, 1966). Majoritatea tulpinilor genului sunt sensibile la fagul 01 al lui Felix şi Callow (1943). Acest fag este înalt specializat pentru Salmonella, lizând 99,5% din tulpinile testate (din acest gen) şi numai 0,3% din tulpinile ce aparţin altor membrii ai familiei (Thall şi Kalligs, 1955).

8.5. Condiţii de cultivare şi caractere culturale Salmonelele se dezvoltă în limite largi de temperatură (2-54°C) şi pH (între 4 şi 9,5 – cu un optim de 6,5-7,5). Se dezvoltă pe mediile de cultură uzuale în 18-24 de ore, la temperatura de 37°C. În mediile lichide, variantele „S” tulbură uniform mediul în timp ce variantele „R”, sedimentează pe fundul eprubetei, mediul apărând limpede. 218

Pe agarul înclinat se remarcă disocierea coloniilor în variantele S, R şi M de 2-4 milimetri în diametru. Variantele „S” sunt rotunde, lucioase, cu margini regulate, uşor emulsionabile. Variantele „R” apar mai rar şi sunt rugoase, cu margini neregulate, iar cele de tip „M” sunt mai mari, cu centrul ombilicat şi marginile cu aspect mucoid. Unele tulpini formează colonii pitice. Pentru izolare şi identificare se folosesc medii de cultură speciale, diferenţiale sau selective. În laboratoarele veterinare s-au preconizat scheme restrânse prin care să se poată diferenţia, în prima fază, bacteriile intestinale lactozăpozitive de cele lactoză-negative. În acest sens se foloseşte un sistem constituit din mediile TSI (Triple Sugar Iron) şi MILF (mobilitate, indol, lizină, fenilalanină), care permite diferenţierea principalelor grupări de enterobacterii. Schema 8.1 Circuitul salmonelelor (după Verdeş N., 2001)

FURAJE*

ANIMALE PENTRU CONSUM

ANIMALE IMPORT

ABATOR

PROCE SARE

VECTORI MEDIU APĂ SOL

ALIMENT OM

219

Lactoză pozitive

2-3 mm, roşii, fără 1-2 mm, semi-transparente, halou opalescent; necolorate uneori mucoide

eozină albastru de metilen (Levin)

1-2 mm, roşii, cu sau fără centru 1-2 mm, semi-transparente, închis E. coli necolorate (picături de fuxină)

agar dezoxi-colat citrat lactoză (Leifson)

agar lactoză Mac Conkey

ADCL HE

1-2 mm, roşii (mediul virează în roşu)

XLD

2-3 mm, galbene, opace

1-2 mm, galbene

1-3 mm, verzui1-2 mm, semi-transparente, albastre, albastreopalescente, incolore violet

Salmonella spp. – colonii roşii

1-2 mm, semi-transparente, in-colore (H2S po-zitiv – centrul negru)

Yersinia – colonii 0,5 mm incolore, translucide

Moderat selective (2448 ore, citire agar Salmonella interm. la 24 Shigella (Difco) ore)

SMID (bio Mérieux)

SMID

agar săruri biliare şi pro-pilenglicol (Rambach)

S.S.

agar bilă albastru de bromtimol (Istrate-Meitert

1-2 mm, semi-transparente, S. typhi – colonii necolorate (H2S pozitiv, necolorate; central negru) Yersinia nu se dezvoltă

1-2 mm, roşii; rareori mucoide

IM

Hektoen en-teric Moderat King şi Metzger selective (2448 ore, citire xiloză-lizină interm. la 24 dezoxicolat ore) (Taylor)

Y. cholerae – colonii incolore, translucide ori roz

R.A.

Slab selective (24 ore)

Observaţii

Lactoză negative

MC

Mediul

Dezvoltarea enterobacteriaceelor - colonii -

EMB

Categoria selectivă (incubare 35-37°C)

Abrev.

Tabelul 8.3 Dezvoltarea enterobacteriaceelor lactoză negative şi lactoză pozitive pe mediile selective (adaptat după Duca E., 1977)

1-2 mm, roz

1-2 mm, albastre (H2S pozitiv, cu centrul negru) 1-2 mm, roşii, semitransparente (H2S pozitiv, centrul Yersinia nu se dezvoltă negru) 1-2 mm albastre-verzui (H2S Yersinia nu se dezvoltă pozitiv, centrul negru)

1-2 mm, roşii sau 1-2 mm verzi-albăstrui (H2S gălbui pozitiv – centrul negru)

220

Abrev.

Lactoză pozitive

agar-sulfură de bismut (WilsonBlair)

WB

Mediul

Dezvoltarea enterobacteriaceelor - colonii -

inhibiţie

agar verde briliant

AVB

Categoria selectivă (incubare 35-37°C)

inhibiţie

Observaţii

Lactoză negative 1-2 mm, negre, roşii, halou Shigella şi Yersinia nu negru metalic se dezvoltă

Înalt selective (48 ore) 1-2 mm roşii, halou roşu

Shigella şi Yersinia nu se dezvoltă

Pe mediile de îmbogăţire, selenit acid de sodiu şi bulion tetrationat Müller-Kauffmann se dezvoltă prompt (în 24 de ore şi chiar mai rapid la temperatura de 40 grade Celsius). Pot vira mediul cu selenit în cărămiziu, după 24-48 de ore şi pot decolora mediul Kauffmann-Müller. Pe mediile selective, toate salmonelele formează culturi lactoză-negative. Acestea pot fi ierarhizate astfel:  slab selective: agar-lactoză-săruri biliare (MacConkey); eozină – albastru de metilen (Levin);  moderat selective: agar-dezoxicolat-citrat lactoză (Leifson); agar-bilă-albastru de bromtimol (Istrate Meitert); agar săruri biliare şi propilenglicol (Rambach);  înalt selective: agar-sulfură de bismut (Willson-Blair), agar verde briliant.

8.6. Proprietăţi biochimice Toate salmonelele fermentează glucoza cu producţie de gaz, metabolizează citratul de amoniu, ca unică sursă de carbon, reduc nitraţii în nitriţi, nu produc indol şi nici urează. Reacţiile hidrogenului sulfurat, lizin şi ornitindecarboxilazei sunt pozitive, nu fermentează zaharoza, inozitolul şi salicina. Pe baza proprietăţilor biochimice şi a altor însuşiri, Kauffmann (1960) a împărţit genul Salmonella în patru subgenuri, cărora Le Minor (1984) le-a mai adăugat un gen suplimentar. Caracterele biochimice ale speciilor şi subspeciilor de Salmonella sunt redate în tabelele 8.4 şi 8.5.

221

Tabelul 8.4 Caractere diferenţiale ale speciilor şi subspeciilor de Salmonella (după Neguţ, 1999)

β-galactozidaza Gelatinaza Galacturonat Creşte în mediu cu KCN Malonat Mucat d-tartrat γ-glutamil transferaza β-glucuronidază Dulcitol Salicină Sorbitol Lactoză Liza prin fag O1 Habitat

Salmonella enterica subspeciile:

Salmonella enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica bongori -

+ +

+ + -

+ + +

+ +

d + +

+ +

-

-

-

-

+

-

+

+ +

+ + -

+ + -

+ d -

-

+ -

+ -

+

+

-

+

+

+

+

d + + +

d + + +

+ -75% -

+ + +75% +

+ + -

d d + +

+ + d d

animale cu sânge cald

Testul

animale cu sânge rece

Tabelul 8.5 Salmonella enterica subsp. enterica: diferenţierea biochimică a serovarurilor (după Neguţ, 1999) Serovarurile Celelalte Testul typhi paratyphi A choleraesuis gallinarum pullorm serovaruri Gaz din glucoză + + + + Citrat (Simmnons) d + + H2S ± (48h) + Lizindecarboxi+ + + + + lază Ornitindecarboxi+ + + + lază Mobilitate + + + +

222

8.7. Proprietăţi antigenice Salmonelele posedă trei categorii principale de antigene: 55 antigene somatice „O”; 55 antigene flagelare „H”; 55 antigene de suprafaţă „Vi”. Acestea sunt amplasate în celula bacteriană, astfel: la suprafaţă se găseşte antigenul „Vi”, iar limitrof acestuia, spre interior, antigenul „O”, iar antigenul „H” intră în structura flagelilor. Antigenele somatice „O” sunt termostabile, alcoolorezistente, fiind reprezentate de complexul lipopoliglucidic din membrana externă a peretelui celular. Aglutinarea „O” are un aspect granular fiind inhibată de formol în concentraţie de 0,5%. Antigenele „O” se notează cu cifre arabe. După semnificaţia lor diagnostică, se împart în antigene majore cu specificitate de serogrup şi antigene minore, comune mai multor grupe. Datorită acestei specificităţi, salmonelele au fost încadrate în 46 de grupe notate în schema Kauffmann-White, iniţial cu litere mari ale alfabetului latin, iar după epuizarea acestuia, cu numărul de ordine al factorului specific. În mod excepţional, pot apărea modificări în mecanismele de biosinteză ale salmonelelor care sunt urmate de pierderea specificităţii „O”. Acest fenomen se explică prin apariţia culturilor S-R (de tranziţie) sau R sau sub acţiunea bacteriofagilor convertizori. Efectele acestor modificări se pot traduce prin schimbarea serotipului în cadrul aceleiaşi serogrupe sau chiar într-o altă grupă. De exemplu, degradarea prin conversie fagică indusă de fagul E15 a antigenelor somatice 3,10 şi 3,15, determină schimbarea serotipului şi a numelui acestuia, iar S. anatum consecutiv modificărilor din echipamentul enzimatic devine S. newington. Antigenele flagelare „H” sunt reprezentate de flageline (proteinele structurale ale flagelilor). Sunt termolabile, puternic antigenice şi au o greutate moleculară de 40 Kdal. Aglutinarea „H” are un aspect floconos şi nu este inhibată de formol. S. pullorum şi S. gallinarum nu posedă antigene „H” deoarece sunt imobile. Un număr restrâns de salmonele (S. typhi, S. enteritidis) sintetizează un singur antigen „H” şi se numesc monofazice. Marea majoritate însă produc două categorii de antigene notate cu H1 şi H2 fiind considerate difazice. Acest fenomen a fost descris în 1929, de către Andrewes şi poartă numele de variaţie de fază. Antigenele de faza întâi (H1) considerate specifice au fost notate cu litere mici ale alfabetului latin şi definesc serotipul. Antigenele de faza a doua (H2) sunt nespecifice şi notează cu cifre arabe. 223

Antigenele de suprafaţă „Vi” au fost descrise pentru prima dată la S. typhi, izolată de la bolnavii cu febră tifoidă. Ulterior au fost identificate la S. paratyphi şi excepţional la S. dublin. Edwards, în 1972 remarcă antigenul Vi la S. paratyhi C, izolată de la porc. Antigenul Vi este situat în celulă, exterior antigenului „O” pe care îl maschează împiedicând astfel aglutinarea cu seruri anti „O”. El constituie substratul pentru fixarea bacteriofagilor Vi utilizaţi în lizotipie care au o importanţă mare în epidemiologie. Salmonelele care posedă antigenul „Vi” sunt rezistente la fagocitoză şi prezintă o virulenţă mai mare. S-a mai descris la salmonele şi un antigen de înveliş „M”, iniţial la tulpinile mucoide de S. paratyphi B, iar apoi şi la alte serotipuri. Formula antigenică constă în notarea tuturor antigenelor care intră în structura unui serotip dat. Notarea se face începând cu antigenele somatice, urmată de antigenele flagelare de faza întâi şi antigenele flagelare de faza a doua. De exemplu, S. typhimurium are antigenele somatice 1, 4, 5, 12, antigenul de faza întâi „i” şi de faza a doua 1, 2. Formula ei antigenică este 1,4,5,12:i:1,2. La salmonelele care posedă antigene Vi, acesta se notează după ultimul antigen somatic. De exemplu, S. typhi are formula antigenică 9,12,Vi:d. Antigenele inconstante sunt puse între paranteze mari, iar cele insuficient dezvoltate (slab aglutinabile) între paranteze mici. De exemplu, la S. derby, cu formula antigenică 1,4,[5],12:f,g:(1,2), prezenţa antigenului somatic 1 se datorează lizogeniei, iar antigenul 5 somatic şi 1,2 flagelare sunt inconstant prezente. Grupele serologice sunt constituite pe baza structurii antigenice somatice. Grupele mai vechi au fost notate cu literele mari ale alfabetului de la A la Z, iar cele mai recente cu numere arabe. Cu literele C, D, E şi G sunt notate mai multe grupe. În acest caz, după literă urmează un număr de ordine. De exemplu, litera C este utilizată pentru notarea a patru grupe: C1, C2, C3, C4. Toate salmonelele dintr-o grupă sunt caracterizate printr-unul sau mai multe antigene majore comune, considerate antigene de grupă. De exemplu, pentru grupa A, antigenul de grupă este antigenul 2; pentru grupa B, antigenul 4; pentru grupa C1 antigenul 6 şi 7, pentru C2 6 şi 8, pentru C3 8 etc. La ultimele grupe notate cu numere, numărul grupei corespunde cu al antigenului de grup. Structura antigenică şi serovarurile de salmonele mai frecvent circulante sunt redate în tabelul 8.6. 224

Tabelul 8.6 Structura antigenică a serovarurilor de Salmonella mai frecvent circulantea (după Neguţ, 1999) Structura antigenică Serovarul H O 1 2 Grup A Paratyphi A a 1, 2, 12 Grup B Paratyphi B b 1,2 1,4/5/12 Java 1,4/5/12 b /1,2/ Abony 1,4/5/12 b c, n, x Schleissheim 4, 12, 27 b, z12 Saintpaul 4/5/,12 c, h 1,2 Reading 1,4/5/,12 c, h 1,5 Kaapstad 4,12 c, h 1, 7 Chester 5/5/,12 c, h e, n, x Derby 1,4/5/,12 f, g /1,2/ Agona 1,4,12 f, g, s Essen 4,12 g, m California 4,5,12 m, t Typhimurium 1,4/5/12 i 1,2 Bredeney 1,4,12,27 l, v 1,7 Kimuenza 1,4,12,27 l,v e, n, x Heidelberg /1/,4,5,/12/ r 1,2 Haifa 1,4,/5/,12 z10 1,2 Grup C1 Ohio b l, w 6,7 Paratyphi C 6,7/Vi/ c 1,5 Choleraesuis 6,7 c 1,5 Choleraesuis var. 6,7 /c/ 1,5 kunzendorf Typhisuis 6,7 c 1,5 Isangi 6,7 d 1,5 Livingstone 6,7 d 1, w Lomita 6,7 c, h 1,5 Braenderup 6,7 c, h e, n, z15 Montevideo 6,7 g, m, s /1,2,7/ Weltevreden 3,10 r z6 Amager 3,10 y 1,2 Orion 3,10 y 1,5 Grup E2 Newington c, h 1,6 3,15 225

Serovarul Tucbinger Senftenberg Taksony Aberdeen Rubislaw Poona Durham Grumpensis Worthington Cubana Gaminara Minnesota Adelaide Johannesburg Waycross Houten IV Oranienburg Thompson Concord Irumu Colorado Virchow Infantis Tennessee Lille Müenchen Manhattan Newport Kottbus Chincol Bonariensis Blockley

Structura antigenică H 1 y

O 3,15 Grup E4 1,3,9 1,3,19 Grup F 11 11 Grup G1 1,13,22 Grup G2 13,23 13,12 1,13,23 1,13,23 Grup I 16 Grup L 21 Grup O 35 Grup R 41 Grup S 41 43 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7,/14/ 6,7 6,7 Grup C2 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8

2 1,2

g/s/t

226

i

z6

i

1,2

R

c, n, x

z

1,6/z59

b

c, n, z15

d z z29

1,7 1,w -

d

1,7

b

c, n, x

f, g

-

b

c, n, x

z4, z23

-

z4, z23 m, t k l, v l, v l, w r r z29 z38

z4, z23 1,2 1,2 1,5 1,5 1,2 1,5 -

d

1,2

d c, h c, h g, m, s i k

1,2 1,2 1,5 c, n, x c, n, x 1,5

Serovarul

Structura antigenică H 1 l, v l, v r z10 z10 z10

O

Litchfield Manchester Bovismorbificans Hadar Glostrup Wippra

6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 Grup C3 /8/,20 /8/,20 Grup C4 6,/7/,/4/ 6,/7/,/4/ Grup D1 9,12,/Vi 1,9,12 1,9,12 1,9,12 9,12 1,9,121,122 1,9,121,121 Grup E1 3,10 3,10 3,10 3,10 3,10 3,10 3,10 3,10

Emek Kentucky Eimsbuettel Jerusalen Typhi Enteridis Dublin Javiana Wangata Pullorum Gallinarum Butantan Muenster Anatum Meleagridis Westhampton Sinstorf London Give

2 1,2 1,7 1,5 c, n, x c, n, z15 z6

g, m, s

-

i

z6

d

l, w

z10

l, w

d

-

g, m g, p l, z28 z4z23 -

1,5 /1,7/ -

b

1,5

c, h c, h c, h g, s, t l, v l, v l, v

1,5 1,6 l, w 1,5 1,6 1,7

Simboluri:/ /, poate fi absent.

a

8.8. Nomenclatura salmonelelor În funcţie de etapa în care au fost izolate şi omologate, salmonelele se notează după: ™™ numele speciei receptive, afecţiunea provocată sau o combinaţie între acestea; de exemplu: S. typhi, S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. gallinarum etc.; ™™ numele localităţii de unde au fost izolate: S. nitra, S. helsinki, S. montevideo, S. dublin, S. panama etc.; 227

™™ formula antigenică. Schema Kauffmann-White este un catalog iniţiat de Kauffmann care conţine un inventar al tuturor serotipurilor de Salmonella, aşezate pe grupe serologice. În dreptul fiecărui serotip este notată formula antigenică.

8.9. Ecologie Salmonelele se găsesc în tubul digestiv al omului, mamiferelor, păsărilor şi animalelor cu sânge rece. Cele două surse majore, omul şi animalele sunt responsabile de poluarea solului, apelor reziduale, apelor de suprafaţă în care pot supravieţui luni şi chiar ani (în sol). O suită de factori, printre care intensificarea comerţului şi a călătoriilor la mari distanţe, migraţiile populaţionale, industrializarea alimentaţiei şi a creşterii animalelor de consum (porci, păsări), în mari colectivităţi consumatoare de hrană cu adaosuri proteice, deseori contaminate (făinuri furajere de carne, oase, sânge) au contribuit la răspândirea serovarurilor şi la creşterea morbidităţii prin salmoneloze. Factorii sezonieri şi clima caldă favorizează, în condiţii precare de igienă, nivelul morbidităţii. Cu puţine excepţii – serovarul Typhi şi Paratyphi, pentru om; ser. Abortus ovis, pentru ovine; ser. Typhisuis, pentru porci şi ser. Gallinarum/Pullorum pentru păsări – toate celelalte serovaruri nu au specificitate de gazdă. Numeroşi vectori (insecte, rozătoare, păsări, carnasiere, apele reziduale din ferme, abatoare etc.) constituie verigi importante în declanşarea unor enzootii de salmoneloză. S-a demonstrat că musca domestică, nu numai că vehiculează pasiv salmonelele, dar le şi transmite trasovarian, iar albinele fac o salmoneloză chimică. Gândacul de bucătărie, furnica, ixodidele, argasidele, pot vehicula şi ele infecţia salmonelică. Nu există ecosistem în natură în care salmonelele să nu fie prezente. Şobolanii s-au dovedit a fi unul dintre rezervoarele principale, pentru animalele domestice şi om. Câinii sunt vectori pentru numeroase serotipuri. De la aceştia s-au identificat: S. typhimurium, S. choleraesuis, S. enteritidis, S. anatum. Malnutriţia, avitaminozele, dismineralozele şi micotoxicozele contribuie şi ele prin debilitarea organismului. În afara transmiterii pe orizontală se înregistrează şi infecţii cu transmitere verticală, transplacentară, în special la oaie şi iapă, la care infecţia se exprimă prin avort. Transmiterea verticală este, de asemenea, o caracteristică a salmonelozei păsărilor, dată de serotipuri imobile (ser. Gallinarum/Pullorum).

228

8.10. Patogenitate Salmonelele au grade diferite de patogenitate care variază în funcţie de serotip. În tabelul Kauffmann-White, figurează şi numeroase serotipuri, al căror rol patogen este necunoscut, unele dintre acestea fiind izolate o singură dată. Salmonelele au capacitatea de a se multiplica în organism, atât extracelular cât şi intracelular. Imunitatea faţă de salmonele este mediată celular şi dependentă de imunoglobulinele netransferabile pe cale placentară. Orice infecţie cu salmonele induce o imunitate specifică de serotip. Într-un organism imunizat antisalmonelic (vaccinuri vii, vaccinuri atenuate), macrofagele nu mai permit înmulţirea intracelulară a germenilor, iar faţă de cei aflaţi extracelular sunt active imunoglobulinele şi complementul. Salmonelele îşi datorează patogenitatea, atât virulenţei, cât şi toxicităţii. Acestea posedă mai mulţi factori de virulenţă, care facilitează invazia celulelor non-fagocitare, supravieţuirea în mediul intracelular şi replicarea în interiorul celulei gazdă. După ingestia microorganismului, următoarea etapă a procesului patogen este reprezentată de penetrarea epiteliului intestinal. O dată penetrate, aceste celule, bacteriile sunt incluse în vacuole intracitoplasmatice delimitate de o membrană. Salmonelele virulente supravieţuiesc şi se multiplică în aceste vacuole şi în final lizează celulele gazdă şi diseminează în organism. Supravieţuirea salmonelelor în interiorul incluziilor implică blocarea fuziunii între fagozomi şi lizozomi. Totodată, prin depolarizarea barierelor epiteliale, salmonelele afectează integritatea joncţiunilor intercelulare, fenomen ce se traduce prin favorizarea leziunilor citotoxice (semnificative) ale celulelor epiteliale. Salmonelele nu au nevoie de mobilitate sau de fimbrii (ca speciile Yersinia spp., Escherichia coli), pentru a adera şi invada celulele eucariote (E. J. Threlfall). Pentru invazie este necesară sinteza proteică „de novo”, care este reglată de concentraţia scăzută în oxigen, de faza de creştere sau de suprafaţa celulelor epiteliale. Virulenţa reprezintă mecanismul major de agresiune şi constă în capacitatea de a se ataşa, a se multiplica şi a invada peretele intestinal. Ataşarea salmonelelor la enterocit se realizează prin intermediul fimbriilor (fie manoză sensibile tip 1, fie manoză rezistente tip 3) a adezinelor de suprafaţă şi hemaglutininelor sau prin peptidele induse de enterocit. Zona de ataşare o reprezintă receptorii glicoproteici ai celulei intestinale, localizaţi 229

pe microvili sau glicocalix. Ataşarea la celulele M care căptuşesc plăcile Payer urmează aceleaşi mecanisme. Supravieţuirea şi multiplicarea salmonelelor în celula gazdă, este un alt element important al virulenţei. Finalitatea acestui proces constă în răspândirea bacteriilor în lamina proprie şi declanşarea mecanismului inflamaţiei, cu eliberarea de mediatori celulari cu acţiune vasodilatatoare. În acest sens se remarcă prostaglandinele care, prin mecanisme chimicoenzimatice blochează retroresorbţia sodiului, determinând acumularea de lichide în intestin. Clinic, inflamaţia şi acumularea de lichid intraluminal, determină accentuarea peristaltismului, apariţia crampelor şi a diareei. Plasmidele de virulenţă cu specificitate de serotip (PSS) stimulează bacteria purtătoare la o multiplicare rapidă, depăşind posibilităţile de apărare ale gazdei. Unele serotipuri de salmonele posedă plasmide cu greutate moleculară relativ mare, care pot fi privite ca fiind, „specifice de serotip”. Serotipurile cu astfel de plasmide sunt reprezentate de: S. enteritidis, S. typhimurium, S. dublin, S. cholerae suis, S. pullorum şi S. gallinarum. Rolul acestor plasmide în patogeneza bolii la oameni şi alte specii de animale este neclar. Se pare că sunt necesare pentru declanşarea bacteriană: pentru supravieţuirea intracelulară a salmonelelor în fagocite. De asemenea, s-a sugerat că pot creşte supravieţuirea microorganismelor în infecţia extraintestinală la oameni (T. J. Humphrey). Sideroforii (care au capacitatea de a bloca fierul), intervin prin intermediul enterochelinei în sporirea gradului de virulenţă. De asemenea, antigenul Vi are rol în virulenţă, inhibând opsonizarea bacteriei de către componenta complementului C36, opunându-se fagocitării acesteia de către macrofag. Salmonelele îşi manifestă toxicitatea prin elaborarea de exo şi endotoxine. Exotoxinele sunt reprezentate de o enterotoxină care este o proteină cu o greutate moleculară între 90 şi 110 Kdal. Analizele electroforetice au demonstrat o similitudine între enterotoxina salmonelică şi enterotoxina LT de la Vibrio cholerae, atât în ceea ce priveşte configuraţia cât şi modul de acţiune. Citotoxina din membrana citoplasmatică este o proteină termolabilă, cu greutatea moleculară de 56-78 Kdal. Acţiunea ei se manifestă prin inhibarea sintezei proteice a celulelor gazdă, determinând liza acestora. Endotoxinele îşi exercită activitatea prin activarea complementului 230

având ca efect citoliza, eliberarea de mediatori vasoparalitici TNF (tumor necrosis factor), factorul de coagulare intravasculară şi prin efectul pirogen. Endotoxinele induc manifestări digestive, vasculare, renale şi corticosuprarenale.

8.11. Sensibilitatea faţă de factorii de mediu Salmonelele prezintă o rezistenţă destul de mare la acţiunea factorilor fizici, chimici şi biologici. La 60°C sunt distruşi în 12-20 minute, iar la 100°C în 5-8 minute. Pe păşuni salmonelele rezistă până la 200 de zile, în bălegar 6-11 luni, în fecalele de rozătoare 148 de zile, iar în cele de păsări 200 de zile, în solurile bogate în humus 8-9 luni. În alimente pot rezista până la 180 de zile, în lapte 2-3 luni, în pulberea de ouă 4 ani. În apele reziduale şi în cadavrele în putrefacţie rezistă 2-3 luni (R. M. Mânzat). Antisepticele şi dezinfectantele obişnuite sunt active faţă de salmonele în concentraţii uzuale. Sunt sensibile faţă de antibiotice (cloramfenicol, tetracicline, neomicină, gentamicină, amoxicilină, colimicină, cefalosporine) şi chimioterapice (nitrofuran, sulfametazină, fluorochinolonă). Utilizarea antibioticelor şi chimioterapicelor creează cu uşurinţă tulpini rezistente faţă de acestea. Explicaţia fenomenului constă în existenţa factorului plasmidic „R” care se transferă cu uşurinţă de la o bacterie la alta prin gene extracromozomale, fenomen cunoscut sub numele de „R-infecţie” (R. M. Mânzat).

8.12. Infecţia experimentală Animalul de elecţie este şoarecele infectat intraperitoneal, iar cu unele tulpini cu un grad „ridicat” de patogenitate şi pe cale orală. Infecţia evoluează cronic de la câteva zile la câteva săptămâni. La examenul necropsic şoarecii prezintă focare necrotice caracteristice în ficat şi splenomegalie. Infecţiile experimentale la om şi animale. Poartă denumirea de salmonele sau paratifoze. Pot fi primare sau secundare. Infecţiile salmonelice se caracterizează prin stări febrile, simptome şi leziuni gastroenterice, splenice şi hepatice. O afinitate deosebită o au pentru căile şi vezica biliară, unde se găsesc în cantitate mare şi unde rămân de regulă, localizate la purtători. Se practică pentru speciile cu spectru larg de patogenitate şi anume, şoarecele, prin inoculare intraperitoneală, cu formare de focare necrotice în 231

ficat şi splenomegalie. Pentru salmonelele imobile se folosesc în infecţia experimentală puii de găină.

8.13. Serotipuri de salmonele patogene A. Taurine S. typhimurium, S. dublin, S. enteritidis, S. rostok, S. saint-paul şi rar S. bovismorbificans, produc salmoneloza primară la taurine. Serotipul S. dublin este cel mai adaptat la taurine, devenind purtătoare de lungă durată sau chiar întreaga viaţă. Recent s-a descris infecţia salmonelică la taurine cu S. typhimurium fag DT104, care este implicată în declanşarea unor toxiinfecţii alimentare la om, cu evoluţie destul de gravă, datorită rezistenţei deosebite a acestei tulpini la antibiotice şi chimioterapice (R. M. Mânzat). S-au mai izolat de la taurine şi S. infantis, S. oranienburg, S. aberden, S. minesota, S. havana, S. gyve, S. newport şi altele, care însă nu prezintă implicaţii clinice. Incidenţa infecţiei salmonelice la taurine este mai ridicată în Transilvania. Categoria cea mai afectată sunt viţeii iar infecţia se realizează pe cale digestivă, pulmonară şi excepţional ombilicală. Sensibilitatea noului născut se datorează lipsei unui sistem de apărare specifică, organismul acestuia fiind incapabil de a elabora imunoglobuline. Rezistenţa la infecţia salmonelică depinde de imunizarea mamei şi de ingesta corectă a colostrului de către viţel, în primele ore de viaţă. Profilaxia specifică se realizează prin administrarea de vaccinuri inactivate sau vaccinuri vii din tulpini atenuate. În ţara noastră se folosesc două variante de vaccinuri inactivate: • vaccin acetonat contra salmonelozei şi colibacilozei taurinelor; • vaccin acetonat tribacterian, contra salmonelozei, colibacilozei şi pasteurelozei. B. Ovine S. abortusovis este cea mai importantă şi produce avortul salmonelic al oilor, precum şi îmbolnăviri perinatale la miei. Au mai fost descrise avorturi enzootice la oaie, produse de S. typhimurium în Australia. Mecanismul producerii avortului, se explică prin capacitatea de multiplicare şi invadarea uterului gestant şi implicit, a producerii de endo şi exotoxine. 232

C. Cabaline Se întâlnesc serotipurile: typhimurium, enteritidis, derby, bovis, mortificans, choleraesuis, newport, anatum, dublin şi altele care produc salmoneloza francă a cabalinelor. Infecţia are o evoluţie sporadică, rar enzootică şi afectează de obicei animalele tinere, de 6-18 luni. S. abortusequi, produce avortul salmonelic al iepelor şi a fost izolată în 1893 de Smith şi Kilborne din secreţia vaginală a iepelor care au avortat (R. M. Mânzat). D. Suine Serotipul cu cea mai mare implicaţie în patologie este S. choleraesuis, cu două varietăţi: ™™ monofazică sau Kunzendorf; ™™ bifazică sau americană. Din acestea au derivat prin mutaţii selective S. typhisuis şi S. paratyphi C (tabelul 8.7). Tabelul 8.7 Serotipuri patogene pentru porc (adaptat după Edwards şi Ewing) Specia

Antigen

Antigen H

Vi

O

Specifice

Nespecifice

VI

VI, VII

C

1, 4, 5

-

VI, VII

C

1, 3, 4, 5

-

VI, VII

-

1, 3, 4, 5

4. S. typhisuis

-

VI, VII

C

1, 3, 4, 5

5. S. typhisuis v. voldagsen

-

VI, VII

-

1, 3, 4, 5

Grupa C 1. S. paratyphi C 2. S. choleraesuis v. americană 3. S. choleraesuis v. kunsendorf

S. choleraesuis, cu cele două variante afectează în special tineretul şi acţionează la nivel enteropulmonar, în timp ce S. typhisuis poate afecta şi adulţii. S. paratyphi C are o afinitate deosebită faţă de celula hepatică şi produce icter, fiind totodată şi serotipul cel mai patogen pentru om. Vaccinarea antisalmonelică se realizează cu vaccinuri vii, constituite mai ales din mutante R, nepatogene şi imunogene, capabile să stimuleze atât imunitatea celulară, cât şi pe cea umorală. E. Păsări Infecţiile salmonelice se pot încadra în două grupe. Prima grupă include infecţii cu S. gallinarum şi S. pullorum care afectează în special 233

găinile şi curcile, determinând tifoza şi respectiv puloroza aviară tratate ca o singură entitate tifopuloroza. A doua grupă include serotipuri mobile de salmonele din specia enterica, încadrate sub denumirea de paratifoze. Până acum două decenii, S. gallinarum şi S. pullorum au fost considerate eronat ca două specii distincte de salmonele imobile. Cercetările efectuate de Le Minor şi Popoff, în 1988, precum şi lucrările lui Christensen în 1992 privind caracterizarea lui S. enterica serovar gallinarum, biovar gallinarum şi pullorum, prin analiza profilului plasmidic şi biochimic, aduc unele date suplimentare, dar încadrarea taxonomică propusă de aceştia nu a fost validată oficial. S-a demonstrat prin electroforeza enzimatică multiloculară şi estimarea genotipului că ambele biovarietăţi sunt monofiletice, strămoşul lor comun fiind imobil. Sunt asemănătoare şi din punct de vedere antigenic şi posedă antigenele O1, O9 şi O12 cu specificaţia că biovarul pullorum prezintă o variaţie a antigenului O12 având în plus factorii 122 şi 123 (R. M. Mânzat). Biochimic, ambele varietăţi fermentează arabinoza, dextroza, galactoza, manitolul, ramnoza şi xiloza, cu producere de acid (fără producţie de gaz). Nu fermentează lactoza, sucroza şi salicina. Diferenţa majoră între cele două biovarietăţi este aceea că biovar pullorum produce rapid decarboxilarea ornitinei, în timp ce biovar gallinarum, nu. Biovar pullorum conţine o toxină termostabilă la care sunt susceptibile rozătoarele, nu şi puii, iar biovar gallinarum o toxină letală pentru iepuri şi endotoxină. Tifopuloroza afectează găina, curca, bibilica, fazanul, păunul şi papagalul. Receptivitatea maximă o prezintă puii de găină, în primele săptămâni de viaţă. Infecţia se transmite vertical prin ou (cea mai importantă cale de transmitere), sau orizontal, pe cale conjunctivală şi digestivă. Datorită acestui fapt se impune o severă supraveghere serologică a efectivelor de păsări prin diferite variante ale reacţiei de aglutinare: hemaglutinare rapidă (RHAR), seroaglutinare rapidă, seroaglutinare în tuburi (RSAL) şi microaglutinare. Ultimul test se execută în plăci de microtitrare fiind mai uşor de executat şi mai economic. Alte teste serologice utilizate sunt testul COOMBS, testul de imunodifuzie şi ELISA. În ţara noastră se realizează RHAR şi RSAL, antigenul fiind realizat din tulpini selecţionate de Salmonella biovar pullorum cu o structură antigenică completă (tulpini standard, bogate în fracţiunea antigenică O12 delipidate) (R. M. Mânzat). 234

În cazul depistării de focare, măsura cea mai indicată constă în excluderea ouălor provenite din fermele contaminate şi asanarea focarelor respectându-se cu stricteţe principiul „totul plin, totul gol”, dezinfecţia şi repausul sanitar. În cazul contaminării puternice a unui teritoriu, care face imposibilă eradicarea, se poate aplica în scop imunoprofilactic vaccinarea. Un vaccin viu care a dat rezultate acceptabile se prepară din tulpina atenuată 9R. Aceasta este constituită dintr-o suspensie de germeni vii din biotipul gallinarum, cultivată în mediul lichid şi liofilizată, fiind marcată prin aglutinabilitatea ei cu soluţie fiziologică clorurosodică sau cu soluţie de acriflavină şi neaglutinabilitatea ei cu serul anti O polivalent sau cu serurile de grup. Vaccinarea se face la găinile din efectivele de reproducţie, iar la nevoie pot fi vaccinaţi şi puii de 4-5 zile. Serotipurile de salmonele mobile incriminate în infecţiile paratifice sunt numeroase. În ţara noastră, în ordinea incidenţei se remarcă: S. enteritidis (50,8%), S. typhimurium (30,4%), S. gallinarum (5,8%), S. heidelberg (2,4%), S. agona (2,1%), S. derby (2,9%), S. haifa (2,4%), S. newport (2,4%) (R. M. Mânzat). La palmipede (după Perianu) s-au izolat următoarele serotipuri: anatum, enteritidis, typhimurium, choleraesuis, iar la porumbel typhimurium, un tip antigenic deosebit de cel clasic, deoarece îi lipsesc factorii 1 şi 5 din antigenul somatic.

8.14. Salmoneloza non-tifoidică la om S. typhi şi S. paratyphi produc la om febra enterică, care reprezintă forma cea mai severă de boală. Transmiterea se face de la om la om fără implicarea animalelor. Infecţiile umane sunt determinate, în majoritatea cazurilor de către S. enterica subsp. enterica cu 3 serotipuri: typhi, typhimurium şi choleraesuis. Se cunosc trei tipuri de tablouri clinice ale acestor infecţii: ™™serotipul typhi produce febra tifoidă; ™™serotipul typhimurium produce enterocolita acută; ™™serotipul choleraesuis produce tipul septicemic caracterizat prin bacteriemie şi leziuni focale; Salmonelele care se transmit de la animale la om produc salmoneloza non-tifoidică, care este o infecţie zoonotică extrem de răspândită pe mapamond. Salmoneloza umană, rămâne o problemă majoră, atât din punct 235

de vedere al morbidităţii cât şi din punct de vedere economic. Numărul cazurilor de salmoneloză non-tifoidică a crescut vizibil în ultimii 10 ani. Acestea sunt asociate în mare parte cu S. enteritidis, tipul fagic (TF) 4 care predomină în Europa Occidentală, TF 1, în Europa de Est şi TF 8 în SUA (T. J. Humphrey). Până în prezent au fost identificate peste 2700 de serotipuri, însă foarte puţine dintre acestea sunt implicate în salmoneloza umană. Salmonelele pot prezenta antigene comune cu alte enterobacterii, ceea ce poate crea dificultăţi în diagnostic. Cele mai utilizate tehnici (după E. J. Threlfall) pentru subclasificarea în cadrul serotipului sunt: ™™tipizarea cu bacteriofagi (lizotipizarea); ™™biotipizarea; ™™tipizarea prin antibiogramă (tipizarea R); ™™analiza conţinutului de lipopolizaharide (LPS) sau proteine membranare externe (PME) pentru investigaţii specifice; ™™caracterizarea DNA-ului plasmidic. Lizotipizarea. Pe baza schemelor de tipizare fagică au fost identificate peste 30 tipuri fagice de S. enteritidis şi peste 200 de tipuri de S. typhimurium. Până în prezent s-au realizat astfel de scheme pentru: S. typhi, S. paratyphi A şi B, S. enteritidis, S. typhimurium, S. virchow şi S. hadar. Biotipizarea a fost utilizată pentru subclasificarea mai multor serotipuri de Salmonella. Această metodă se bazează pe următoarele teste: ™™ mobilitate; ™™ prezenţa fimbriilor hemaglutinante; ™™ fermentarea diferitelor substraturi. Tipizarea prin antibiogramă (R tipizarea sau rezistotipia). Reprezintă pentru unele serotipuri şi tipuri fagice (S. typhimurium) un marker epidemiologic util. Analiza conţinutului de LPS. S-a dovedit utilă pentru investigarea interacţiunilor între anumite tipuri fagice. De exemplu, pierderea ireversibilă a capacităţii de a sintetiza LPS s-a dovedit responsabilă pentru conversia S. enteritidis tipul 4, în S. enteritidis tipul 7 (T. J. Humphrey). Caracterizarea DNA-ului plasmidic. Se poate realiza prin următoarele metode: ™™ tipizarea profilului plasmidelor; ™™ amprentarea plasmidică; ™™ identificarea genelor virulenţei mediate de plasmide. Aceste metode sunt aplicabile numai tulpinilor purtătoare de plasmide. Pentru diferenţierea salmonelelor care nu posedă plasmide au fost utilizate 236

următoarele metode: ™™ ribotipizarea; ™™ tipizarea secvenţelor cromozomiale clonate aleator; ™™ tipizarea secvenţei de inserţie 200; ™™ electroforeza în gel în câmp pulsatil. Infecţia salmonelică se realizează prin ingestia microorganismelor din apă, alimente crude, insuficient preparate, contaminate ulterior sau prin transmiterea interumană pe cale fecal-orală. Aceasta din urmă se poate realiza prin contact direct cu excreţiile infectate sau indirect, prin manipularea obiectelor contaminate cu excreţii. Există mai multe tipuri de epidemii produse de către salmonele la om: ™™„tipul sursă punctiformă”, în care majoritatea cazurilor primare apar într-o perioadă de 12-72 de ore de la consumul alimentului contaminat. Acest tip de epidemii apar în cazul în care mai multe grupuri de populaţie (spitale, şcoli, azile, recepţii) sunt deservite de acelaşi furnizor. ™™„tipul sursă comună continuă sau larg răspândită”, în care alimentul (medicamentul) contaminat este distribuit pe scară largă. Aceste epidemii au fost răspândite în Marea Britanie, prin consumul de salam şi păstăi de fasole şi în multe alte ţări prin consumul de ouă şi carne de pui, insuficient preparate. ™™epidemiile cu transmitere interumană, se întâlnesc cel mai frecvent în instituţiile în care există dificultăţi în menţinerea igienei, cum ar fi spitalele psihogeriatrice. ™™epidemii care întrunesc caracteristicile tuturor celor trei tipuri descrise mai sus, întâlnite mai ales în spitale şi extrem de greu de eradicat. Sursele principale de salmonele implicate în infectarea produselor de origine animală sunt reprezentate de: ™™efectivul matcă infectat; ™™alimentele contaminate; ™™mediul. Prezenţa salmonelelor în furaje, duce la infectarea animalelor şi a produselor acestora. În acest sens, se recomandă ca prelucrarea termică a furajelor să fie suficientă pentru distrugerea salmonelelor. Utilizarea excreţiilor animale pe terenurile fermelor, prezintă de asemenea riscuri pentru sănătatea animalelor şi a oamenilor. O mare varietate de salmonele au fost izolate din cursurile de apă şi de la animalele sălbatice din jurul fermelor. Se consideră că, în special, pescăruşii au importanţă în diseminarea salmonelelor. Şoarecii sunt implicaţi în transmiterea lui S. enteritidis la găinile ouătoare (J. G. Cruickshank). 237

Contaminarea cărnii cu salmonele este dependentă de gradul portajului la animalul viu şi de igiena procesului de sacrificare. Contaminarea carcaselor se poate produce aproape în orice stadiu al procesului de sacrificare, cel mai probabil în momentul îndepărtării intestinelor şi a pielii. Contaminarea cu salmonele a carcaselor de păsări reprezintă rezultatul contaminării încrucişate, ce se poate produce în cursul transportului sau pe linia de sacrificare. Cel mai important mijloc de contaminare, îl reprezintă opărirea, care este ineficientă pentru distrugerea sau îndepărtarea microorganismelor ataşate de pielea puilor (T. J. Humphrey). În cazul ouălor, salmonelele pot fi izolate fie de pe coaja oului, fie din conţinutul acestuia. Principalul vehicul în salmoneloza umană asociată consumului de lapte este laptele nepasteurizat. Toate salmonelele descoperite până în prezent sunt sensibile la căldură, fiind uşor distruse prin pasteurizare. Totuşi, în 1956, laptele pasteurizat a fost incriminat într-o epidemie de Salmonella. S-a descoperit însă că dopurile sticlelor erau contaminate cu fecale de şoarece (E. J. Threlfall). Salmonelele pot supravieţui în anumite brânzeturi. În Canada au fost infectate 1500 de persoane care au consumat brânză Cheddar, în Marea Britanie, prin consumul de brânză topită, s-a produs o epidemie cu S. dublin, iar în Franţa (1993), prin brânza de capră, s-au contaminat cu S. java peste 273 de persoane (E. J. Threlfall). Persoanele care manipulează alimente şi au diaree constituie un risc semnificativ în răspândirea infecţiei salmonelice şi trebuiesc excluse de la lucru o perioadă ce se prelungeşte cu 48 de ore după vindecare. Produsele crude contaminate cu Salmonella (carnea) contaminează şi mediul unei bucătării. Salmonelele se pot dezvolta şi pe carnea crudă, păstrată la temperaturi mai mari decât cea de refrigerare. Astfel Luby şi col. 1993, au raportat o epidemie cu S. agona şi S. hadar prin consum de curcan preparat ţinut în bucătăria unui restaurant, clătit cu apă şi apoi reîncălzit şi servit. Uniunea Europeană a adoptat o legislaţie pentru monitorizarea regulată a efectivelor reproducătoare de păsări. Cele la care se confirmă prezenţa lui S. enteritidis sau S. typhimurium vor fi sacrificate. În Marea Britanie, pentru prevenirea recontaminării furajelor este posibilă încorporarea unor compuşi antimicrobieni cum ar fi acizii organici. Pentru tratamentul salmonelozelor la animale se utilizează antibioticele care reuşesc să salveze viaţa animalului, însă de cele mai multe ori acestea 238

rămân purtătoare. La bovine, în marea majoritate a cazurilor, infecţia clinică este produsă de S. dublin şi S. typhimurium, vaccinurile comerciale împotriva acestor serotipuri având o largă utilizare. La păsări, S. enteritidis poate produce manifestări clinice. Un vaccin recent, care utilizează o tulpină de S. enteritidis cultivată în condiţii de depleţie de fier, a redus ratele mortalităţii, şi contaminării conţinutului ouălor la păsări infectate experimental. Diseminarea infecţiei de către păsările sălbatice (pescăruşi) reprezintă un mijloc important de contaminare a mediului. Şansele de a produce animale libere de salmonele cresc prin asigurarea unei biosecurităţi corespunzătoare, prin programe eficiente de combatere a rozătoarelor, igienă şi dezinfecţie. Unul dintre cele mai eficiente tratamente ale produsului finit îl constituie iradierea. Dempster (1985) a demonstrat că aceasta distruge salmonelele din carcasele de pui. În ceea ce priveşte carnea roşie, s-a dovedit că pulverizarea cu apă fierbinte (80°C) sau acid lactic pot fi utilizate cu bune rezultate în decontaminarea carcaselor. Pe lângă măsurile de igienă aplicate în ferme, reducerea timpului de transport şi limitarea timpului de aşteptare înaintea sacrificării, reduc substanţial riscul contaminării cu Salmonella. Trebuiesc instituite programe educaţionale care să accentueze importanţa spălării mâinilor, a depozitării şi refrigerării adecvate a alimentelor, a igienei bucătăriilor şi a prevenirii contaminării încrucişate. Combaterea epidemiilor se bazează pe următoarele aspecte: VVspitalizarea şi tratamentul pacienţilor; VVidentificarea şi supravegherea contacţilor şi a altor persoane expuse aceleaşi surse; VVblocarea transmiterilor ulterioare; VVdepistarea şi eliminarea cauzei epidemiei. Infecţia cu Salmonella are cel mai frecvent ca rezultat o afecţiune de tip gastroenterită, cu diaree şi, uneori, un număr de alte simptome. Într-o epidemie din Canada asociată cu brânza Cheddar, doza infectantă de S. typhimurium la adulţi anterior sănătoşi a fost calculată ca fiind mai mică de 10 celule. Rata medie a atacului în epidemiile de salmoneloză în care vehiculul era carnea de pasăre a fost estimată la 20%. 239

Simptom Procent de cazuri* Diaree 87 Durere abdominală 84 Stare febrilă 75 Greaţă 65 Mialgii 64 Vărsături 24 Cefalee 21 Scaune sangvinolente 6 * Date dintr-o epidemie cu S. enteritidis cu transmitere prin ouă.

Cercetări mai recente, care au analizat 47 de epidemii din Statele Unite, cu diferiţi vectori şi produse de S. enteritidis, S. thompson sau S. typhimurium au calculat o rată medie a atacului de 56%, cu limite între 3-100% din persoanele expuse. Perioada de incubaţie este de obicei în limita a 12-72 ore, dar ocazional se poate prelungi până la o săptămână. Persoanele foarte tinere, vârstnicii, cei cu imunosupresie şi cu boli cronice subiacente sunt mai susceptibile la infecţie şi au o predispoziţie particulară pentru dezvoltarea complicaţiilor. Pentru majoritatea serotipurilor, incluzând S. enteritidis şi S. typhimurium, cele mai frecvente la om, numai o mică proporţie din pacienţi (1-2%), în special cei cu susceptibilitate înaltă şi cei infectaţi cu tulpini invazive, pot dezvolta bacteriemie cu febră şi alte manifestări de septicemie cu germeni Gram negativi. Pentru anumite serotipuri mai puţin frecvente, cum ar fi S. dublin şi S. choleraesuis şi, de asemenea, pentru anumite tulpini de S. virchow, incidenţa infecţiilor extraintestinale este mai mare. Complicaţiile infecţiei diseminate pot include abcese metastatice în diferite organe, cum ar fi: oasele, în special vertebrele, peretele aortic şi rinichii. Se consideră că infecţiile asimptomatice sunt frecvente, deşi proporţia pacienţilor fără manifestări clinice este necunoscută. În investigarea epidemiilor nu este neobişnuit ca până la 50% din contacţii cazurilor să excrete microorganismul, rămânând totuşi asimptomatici. Evoluţia clinică a majorităţii infecţiilor cu Salmonella este spre remisiunea completă a tuturor simptomelor. 240

Aproximativ jumătate din pacienţii cu infecţii necomplicate vor continua să excrete microorganismul în fecale, timp de 5 săptămâni după vindecare, 17%, 9 săptămâni şi mai puţin de 1% după un an. Această stare prelungită de purtător este mică printre infecţiile alimentare fiind cauza investigaţiilor multiple şi a excluderii victimelor de la diferite activităţi ce implică manipularea alimentelor. Forma septicemică a bolii va necesita tratament antibiotic. Deşi, majoritatea tulpinilor sunt sensibile la o mare varietate de antibiotice, ciprofloxacinul, o chinolonă reprezintă actualmente tratamentul de elecţie, dacă există indicaţii dat fiind că este eficient atât în combaterea bolii, cât şi în reducerea duratei portajului consecutiv. Studii recente din Marea Britanie au demonstrat că, începând cu 1990, incidenţa rezistenţei multiple a S. typhimurium şi incidenţa rezistenţei la ciprofloxacin a S. hador şi S. virchow a crescut.

8.15. Epidemiologie Raportările naţionale continuă să semnaleze Salmonella ca cel mai important agent etiologic al toxiinfecţiilor alimentare. Salmoneloza umană continuă să fie o problemă internaţională majoră, atât ca morbiditate cât şi din punct de vedere economic. În multe ţări numărul de cazuri raportate de salmoneloză non-tifoidică a crescut substanţial în decursul ultimilor 10 ani. Acestea sunt asociate în mare parte cu S. enteritidis, tipul fagic (TF)4, predominând în Europa occidentală, (TF)1 Europa de Est şi (TF)8 şi 13 în Statele Unite. În 2006 statele membre ale Uniunii Europene alături de Islanda şi Norvegia (cu excepţia Liechtensteinului care nu a raportat) au avut 171.791 alerte de toxiinfecţii salmonelice din care 168.639 au fost confirmate, aceasta a făcut ca rata medie a notificărilor să fie 34 la 100.000 locuitori. (tabelul 8.8). Tabelul 8.8. Numărul şi rata notificărilor cazurilor de salmoneloză umană în UE şi EEA/EFTA, în 2006 (Centrul European Pentru Prevenirea şi Controlul Bolilor, 2008) Nr. cazuri per Tipul de raporCazuri confirpopulaţii de Ţara Total cazuri tare mate 100.000 de oameni Austria C 4787 4787 57,9 Belgia C 3630 3630 34,5 Bulgaria A 1056 1056 13,7 Cipru C 99 99 12,9 241

Ţara Republica Cehă Danemarca Estonia Finlanda Franţa Germania Grecia Ungaria Irlanda Italia Latvia Lituania Luxembourg Malta Olanda Polonia Portugalia România Slovacia Slovenia Spania Suedia Marea Britanie Total UE Islanda Liechtenstein Norvegia Total

Tipul de raportare C C C C C C C C C C C A C C C A C A C C C C C C N C

Total cazuri

Cazuri confirmate

25102 1662 453 2576 6008 52575 985 9752 422 6272 866 3557 308 63 1667 13362 415 645 8784 1519 5117 4056 14124 169862 116 1813 171791

24186 1662 453 2576 6008 52575 890 9389 420 6272 781 3467 308 63 1667 12502 387 645 8191 1399 5117 4056 14124 166710 116 1813 168639

Nr. cazuri per populaţii de 100.000 de oameni 235,9 30,6 33,7 49,0 9,5 63,8 8,0 93,2 10,0 10,7 34,0 101,9 65,7 15,6 10,2 32,8 3,7 3,0 152,0 69,8 11,7 44,8 23,4 33,8 38,7 39,1 33,9

Sursa: raportări naţionale A = raportare de date agregate; C = raportare de cazuri; N = nici o raportare; N = nespecificat. În nouă din statele care raportează date la ECDC (Austria, Republica Cehă, Finlanda, Germania, Ungaria, Lituania, Luxemburg, Slovacia şi Slovenia) rata notificărilor este mult peste media europeană. Numai patru state au raportat puţin peste 10 cazuri la 100.000 de locuitori (Franţa, Grecia, Portugalia şi România). În 28 de statele analizate numărul cazurilor de salmoneloză umană s-a redus cu 8% între 2005 şi 2006. Douăzeci şi două de state au furnizat informaţii referitoare la posibila origine a infecţiei 242

(domestică sau de import) şi proporţia totală a cazurilor importate a fost de 10,5% din totalul cazurilor informate. Proporţia cazurilor raportate ca infecţii transfrontaliere (de import) a fost de peste 70% în patru state (Finlanda, Islanda, Norvegia şi Suedia), 25% în Regatul Unit şi sub 15% în celelalte state. Malta, Portugalia şi Spania susţin că toate cazurile de salmoneloza cu care s-au confruntat, în aceeaşi perioadă luată în studiu, cel mai probabil au avut origine domestică. 8.15.1. Distribuţia cazurilor de salmoneloză umană pe grupe de vârstă şi sex În toate statele ce raportează date la ECDC rata notificărilor a fost foarte mare la grupa de vârstă 0-4 ani, cu o valoare medie de 180,5 cazuri la 100.000 locuitori. Valori peste această medie au fost semnalate în 9 ţări, cu un maxim de 1.636,5 cazuri la 100.000 locuitori în republica Cehă. Această rată tinde să scadă pe măsură ce vârsta creşte spre 25 ani. Rata rămâne sub 25 cazuri la 100.000 locuitori în restul grupelor de vârstă (25-44 ani, 45-64 ani şi 65 de ani şi peste). Figura 8.1. Distribuţia pe grupe de vârstă a cazurilor de salmoneloză umană în EU şi EEA/EFTA în 2006 (n=142325 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea şi Controlul Bolilor, 2008)

Nu au fost observate diferenţe, în funcţie de sex, ale ratei medii (35,1 bărbaţi şi 35,4 femei - cazuri la 100.000 locuitori) la cele 146.526 cazuri la care aceste informaţii au fost disponibile. 243

Sezonalitatea. Luna cu cele mai multe cazuri de salmoneloză umană raportate a fost septembrie. Când s-au analizat sezonier cazurile de salmoneloză, fără a se lua în calcul Germania, luna cu cele mai multe cazuri a fost august. Totuşi, este evident că un număr semnificativ mai mare de salmoneloză umană este semnalat spre finalul verii.

Cazuri

Figura 8.2. Distribuţia sezonieră a cazurilor de listerioză umană în EU şi EEA/EFTA în 2006 (Centrul European Pentru Prevenirea şi Controlul Bolilor, 2008)

8.15.2. Supravegherea salmonelozelor Din datele supravegherii salmonelozelor umane în Europa a reieşit că cele mai comune serovaruri salmonelice sunt S. Enteritidis şi S. Typhimurium, acestea fiind izolate în 75% din cazurile raportate în 2006 şi în 82% din cazurile raportate în 2006. O serie de rapoarte au scos în evidenţă o variabilitate sezonieră, serovarul S. Enteritidis fiind mult mai frecvent semnalat în perioada de vară/toamnă.

Serovar Enteritidis Typhimurium Infantis Virchow Newport Hadar Sursa: TESSy.

Primele 5 serovaruri Salmonella raportate în 2006 Nr. cazuri % 90362 62,5 18685 12,9 1246 0,9 1056 0,7 730 0,5 713 0,5 244

Tabelul 8.9

Salmonelozele continuă să aibă în statele europene o rată extrem de ridicată a notificărilor (34 cazuri la 100.000 locuitori). Diferenţele între ţări sunt în unele cazuri semnificative şi demonstrează încă odată dificultatea comparării datelor. Salmonella spp. continuă să fie cauza a numeroase focare la nivel multinaţional, naţional şi subnaţional. Unele state europene au mai multe cazuri de salmoneloză importate decât domestice. Alte state pot întâmpina dificultăţi în colectarea sistematică a datelor pentru a stabilii dacă sunt sau nu de import.

8.16. Rezervoare şi căi de infecţie Sursele primare majore de infecţie rămân în continuare animalele, ele contribuind decisiv la contaminarea alimentelor. Caracteristic pentru toxiinfecţiile alimentare produse de Salmonella este faptul că, în orice epidemie, cazurile primare apar prin consumul alimentelor contaminate, iar cazurile ulterioare şi secundare se pot produce prin contactul cu cazurile primare. Epidemiile transmise prin alimente tind să fie de tipul „sursă punctiformă”, majoritatea cazurilor primare apărând într-o perioadă de 1272 de ore de la consumul alimentului contaminat. Mai puţin frecvente sunt epidemiile de tipul „sursă comună continuă sau larg răspândită”, în care un aliment sau medicament contaminat este distribuit pe scară largă şi cazurile sunt corelate prin prezenţa aceleaşi salmonele, dar nu în spaţiu şi timp. Recent, în epidemiile de acest tip, vehiculul a fost reprezentat de salamuri şi păstăile de fasole în Marea Britanie şi de ouă şi carnea de pui insuficient preparate în alte ţări. Epidemiile cu transmitere interumană sunt întâlnite cel mai adesea în instituţiile în care pot exista dificultăţi în menţinerea igienei, cum ar fi spitalele psihogeriatrice. Transmiterea salmonelelor se realizează fie prin ingestia acestora din apă sau alimente crude, insuficient preparate sau contaminate ulterior, fie prin transmiterea interumană pe cale fecal-orală: prin contactul direct cu excreţiile infectate sau indirect, prin manipularea obiectelor, ca aşternuturile, jucăriile şi îmbrăcămintea contaminate cu excreţii. Cele trei surse principale de salmonele implicate în infectarea produselor de origine animală sunt: o efectivul matcă infectat; o alimentele contaminate; o mediul. 245

Importanţa fiecărei căi de infecţie este dependentă parţial de serotipul de Salmonella şi animalul implicat. În cazul anumitor salmonele, de obicei, cele cu adaptare totală sau parţială la gazdă, transmiterea verticală de la efectivul matcă infectat fiind principala cale de infectare. Exemplele în acest sens sunt reprezentate de S. dublin la bovine şi S. enteritidis PT4 la pui, mai ales în producţia de pui de carne. Prezenţa salmonelelor în furaje are adesea ca rezultat infectarea/ colonizarea animalelor şi a produselor acestora. Acest fapt pare să aibă o importanţă deosebită în cazul păsărilor. Prelucrarea tehnică folosită în producţia furajelor trebuie să fie suficientă pentru a distruge salmonelele. Utilizarea excreţiilor animale pe terenurile fermelor prezintă riscuri potenţiale pentru sănătatea animalelor domestice şi a oamenilor. Salmonelele sunt capabile de supravieţuire prelungită în materiile fecale, mâl sau pe păşuni. De asemenea, pot exista dificultăţi în igienizarea şi dezinfectarea clădirilor fermelor, salmonelele fiind izolate din 8% din eşantioanele recoltate din unităţile de creştere a viţeilor, după curăţenie şi dezinfectare. De asemenea, în multe studii, o varietate de salmonele a fost izolată din cursurile de apă şi de la animalele sălbatice din jurul fermelor. Se consideră că în special pescăruşii au o importanţă în diseminarea salmonelelor. Şoarecii pot avea importanţă în diseminarea S. enteritidis la găinile ouătoare, iar infecţia experimentală a şoarecilor sălbatici cu o tulpină de S. enteritidis PT4, a dus la excreţia bacteriei timp de 6 luni.

8.17. Contaminarea alimentelor Contaminarea cărnii Carnea crudă (tranşată sau procesată) trebuie privită ca potenţial contaminată Salmonella spp. Cârnaţii, carnea tocată şi organele procurate din comerţ cu amănuntul, pot avea rate înalte de contaminare. Salmonelele pot contamina carnea carcaselor pe o varietate de căi, dar contaminarea fecală este cea mai importantă. Extinderea contaminării este dependentă de gradul portajului de animalul viu şi de igiena procesului de sacrificare. Prevalenţa animalelor pozitive pentru Salmonella va creşte, ca rezultat al aglomerării în pieţe, iar stresul transportului animalelor poate duce la recrudescenţa infecţiilor latente. De asemenea, salmonelele se pot răspândi 246

rapid în timpul transportului sau în abator, înainte de sacrificare. Grau şi Smith (1974) au demonstrat că prevalenţa carcaselor de miei pozitive pentru Salmonella era corelată cu timpul de aşteptare al animalelor înainte de sacrificare. La animalele cu carnea roşie, contaminarea este mai probabilă în momentul îndepărtării intestinelor şi a pielii. La păsări contaminarea carcaselor o depăşeşte adesea pe cea a păsărilor vii. Acesta este rezultatul contaminării încrucişate, care se poate produce în cursul transportului şi în multe puncte pe linia de sacrificare, dar opărirea înainte de jumulirea mecanică are o importanţă particulară. Un studiu controlat din Marea Britanie, a demonstrat că infecţia cu PT4 era asociată cu consumul de pui fript, pregătit pentru distribuţia la domiciliul clientului. Fie bacteria era prezentă în ţesuturi, fie ca rezultat al bolii invazive, fie în urma pătrunderii apei contaminate din bazinul de opărire. Contaminarea ouălor Se crede că infecţia găinilor ouătoare cu S. enteritidis şi implicit contaminarea ouălor au avut importanţă în creşterea incidenţei salmonelozei umane, observată în multe ţări la mijlocul şi sfârşitul anilor 1980. Salmonelele pot fi izolate din coaja sau conţinutul oului. Prezenţa lor pe coajă, este de obicei rezultatul portajului fecal, deşi, mai ales în cazul lui S. enteritidis, infecţia tractului genital inferior, poate fi de asemenea importantă. Anchetele din SUA şi Marea Britanie, au demonstrat că prevalenţa ouălor cu conţinut pozitiv la vânzarea către publicul larg este redusă (< 0,1%). Cu toate acestea, dat fiind numărul mare de ouă consumate, chiar aceste rate de contaminare, aparent scăzute, pot fi semnificative. Contaminarea laptelui şi produselor lactate Animalele producătoare de lapte, inclusiv bovinele, pot fi infectate cu salmonele. Gibs şi colaboratorii (1989) au descoperit că S. typhimurium DT49 a persistat într-un efectiv de vaci de lapte timp de 3 ani. Principalul vehicul în salmoneloza umană, asociată cu consumul de lapte este laptele nepasteurizat, fiind raportate numeroase epidemii. 247

Toate salmonelele examinate până în prezent sunt suficient de sensibile la căldură pentru a fi distruse prin pasteurizare. De obicei, epidemiile apar ca rezultat al recontaminării produsului tratat termic cu lapte crud. Salmonelele pot supravieţui în anumite brânzeturi, aceste produse fiind implicate în mai multe epidemii. În Canada, 1500 de persoane au fost infectate după ce au consumat brânză Cheddar contaminată. Recent, în Marea Britanie, o epidemie de infecţie cu S. dublin a fost asociată cu brânza topită din lapte de vacă, nepasteurizat. Similar, în Franţa, în 1993, o epidemie S. enterica, serotipul paratyphi B, cu peste 273 de cazuri identificate a fost produsă de brânza de capră contaminată (E. J. Threlfall, 2005). Contaminarea în timpul manipulării alimentelor Persoanele care manipulează alimente şi excretă salmonele sunt adesea acuzate de a fi sursa epidemiei. Salmonelele sunt rapid îndepărtate prin spălarea mâinilor. Persoanele care manipulează alimente şi prezintă diaree, constituie un risc semnificativ şi trebuie excluse de la lucru, timp de 48 de ore, după vindecare. S-a dovedit că produsele crude contaminate cu Salmonella, în principal carnea, contaminează extensiv mediul din bucătării. Multe epidemii de salmoneloză au fost determinate de o practică necorespunzătoare în bucătării şi, Roberts (1986), a estimat că în aproximativ 14% din cazuri, contaminarea încrucişată a avut o contribuţie semnificativă. De asemenea, salmonelele sunt capabile de creştere pe o varietate de alimente preparate sau crude, iar depozitarea la temperaturi mai mari decât cele de refrigerare s-au dovedit a fi un factor important în multe epidemii. De exemplu, Luby şi colaboratorii (1993) au raportat o epidemie extinsă, în care consumatorii au fost infectaţi cu S. agona sau S. hadar, deoarece curcanul preparat fusese păstrat nerefrigerat în bucătăria unui mic restaurant timp de mai multe ore, clătit cu apă pentru îndepărtarea mirosului neplăcut şi incomplet încălzit înainte de a fi servit.

8.18. Măsuri de prevenire şi combatere a salmonelozelor Pentru reducerea sau eliminarea riscului de toxiinfecţii alimentare cu Salmonella este posibilă intervenţia în mai multe puncte ale lanţului 248

alimentar. Fezabilitatea intervenţiei şi eficienţa sa economică pot depinde de serotipul de Salmonella implicat şi de gradul său de diseminare. Astfel, în Marea Britanie, infecţia cu S. typhimurium DT 124, în urma contaminării salamului a fost prevenită prin retragerea temporară de pe piaţă a produsului şi ameliorarea igienei producţiei. Salmoneloza transmisă prin lapte, poate fi prevenită prin simpla pasteurizare corespunzătoare a laptelui şi produselor lactate. Când infecţia este larg răspândită, cum a fost cazul pandemiei multinaţionale produsă de S. enteritidis, combaterea se realizează mai dificil, în special dacă vehiculele infecţiei sunt alimente, cum ar fi ouăle sau puii, care sunt consumate în cantităţi mari. Ca o consecinţă a problemelor economice, se explorează strategii alternative. Excluderea competitivă, în care culturi de microorganisme intestinale, de la găini mature neinfectate sunt administrate puilor în vârstă de o zi, a limitat infecţia cu Salmonella fiind utilizată din ce în ce mai mult. Pentru prevenirea contaminării furajelor animalelor, se poate recurge la încorporarea unor compuşi antimicrobieni, cum ar fi acizii organici. Humphrey şi Lanning (1988) au arătat că acest tratament aplicat furajului pentru păsări de reproducţie reduce transmiterea verticală a salmonelelor. De asemenea, s-a dovedit că tratamentul acid al hranei limitează diseminarea orizontală a S. enteritidis PT4 la unele efective de păsări de carne. Programele de combatere a rozătoarelor trebuie privite, de asemenea, ca o importantă măsură de profilaxie, mai ales în industria avicolă. Bovinele reprezintă principala specie domestică la care salmoneloza produce frecvent manifestări clinice, majoritatea fiind cauzate de infecţia cu S. dublin şi S. typhimurium. Salmoneloza clinică este foarte rară la porcine. La păsări, spre deosebire de alte serotipuri de Salmonella, S. enteritidis poate determina manifestări clinice, în special la rasele de carne. În cadrul programelor de combatere, în cazul animalelor fără manifestări clinice, este necesară identificarea celor pozitive pentru Salmonella. Tehnicile de examinare trebuie să fie sensibile şi cât mai rapide. O abordare eficientă constă în efectuarea unui screening ambiental sau serologic, cu confirmarea rezultatelor pozitive pentru examinarea mai atentă a păsărilor. Pandemia internaţională actuală de infecţie cu S. enteritidis a dus la monitorizarea pe scară largă a efectivelor de păsări. Măsurarea nivelului anticorpilor vitelini împotriva S. enteritidis, este eficace în detectarea efectivelor reproducătoare sau ouătoare pozitive şi reprezintă o tehnică ieftină şi neinvazivă, demnă de utilizare pe scară largă. 249

Diseminarea infecţiei de către păsările sălbatice (în special pescăruşi) de pe lângă gropile de gunoi reprezintă de asemenea un mijloc semnificativ de contaminare a mediului. Unul dintre cele mai eficiente tratamente ale produsului finit este iradierea. Dempster (1985) a demonstrat că acest procedeu poate distruge salmonelele din carcasele de pui. În ceea ce priveşte carnea roşie, s-a dovedit că pulverizarea cu apă fierbinte (80°C) sau acid lactic poate fi utilizată pentru decontaminarea carcaselor. Prevalenţa animalelor pozitive pentru Salmonella, care ajung la abatoare, poate fi diminuată prin reducerea timpului de transport şi limitarea timpului de aşteptare înaintea sacrificării. Alte măsuri, cum ar fi ligaturarea anusului, pentru a împiedica contaminarea carcaselor cu fecale, vor reduce de asemenea riscul la infecţiile salmonelice. Marea majoritate a salmonelelor nu se poate dezvolta pe alimentele păstrate la temperaturi sub 7°C şi cresc lent la temperaturi sub 10°C. Astfel, refrigerarea va prelungi durata de păstrare a alimentelor şi va împiedica multiplicarea salmonelelor. Recent, în Europa, s-a discutat mult despre refrigerarea ouălor, ca mijloc de limitare a riscului de infecţie cu S. enteritidis. Succesul combaterii salmonelozei necesită intervenţii la toate punctele lanţului alimentar. Pentru limitarea riscului, consumatorii şi furnizorii pot face multe privind igiena bucătăriilor şi prepararea adecvată a alimentelor „cu risc”. În perioada 2008-2009 în Facultatea de Medicină Veterinară, Bucureşti şi INCDMI Cantacuzino s-a efectuat un studiu pe 184 de probe, reprezentate de carne şi derivate, lapte şi derivate, ouă şi produse din ouă. Tulpinile izolate au fost testate biochimic şi serologic pentru confirmarea în cadrul Institutului de Diagnostic şi Sănătate Animală, în direcţia determinării bacteriilor din genul Salmonella la produsele alimentare de origine animală şi testelor de sanitaţie. Analizele efectuate pe sortimente de produse şi rezultatele lor sunt cuprinse în tabelul de mai jos: Sortiment Afumături Brânză Carne de pasăre Carne de porc

Anul

2008 Probe Probe analizate pozitive 10 2 8 3 10 2 9 4 250

Probe analizate 8 4 5 4

2009

Probe pozitive 3 2 3 3

Sortiment

Anul

Carne de vită Hamburger Îngheţată Lapte şi derivate Lapte praf Ouă Produse de patiserie Salate cu compoziţie proteică Total

2008

Probe analizate 7 8 5 6 6 10 8 7 94

Probe pozitive 0 2 1 2 2 4 0 2 24

Probe analizate 10 11 5 5 9 10 8 11 90

2009

Probe pozitive 2 2 1 0 0 2 1 3 22

Prelucrând probele şi rezultatele analizelor din tabelul de mai sus, rezultă următorul procentaj: Felul probelor analizate Afumături Brânză Carne de pasăre şi derivate Carne de porc şi derivate Carne de vită şi derivate Hamburger Îngheţată Lapte şi derivate Lapte praf Ouă şi produse din ouă Produse de patiserie Salate cu compoziţie proteică

Numărul total de probe 18 12 15 13 17 19 10 11 15 20 16 18

Dintre care

Negative

%

Pozitive

%

13 7 10 6 15 15 8 9 13 14 15 7

72,22 58,33 66,66 46,15 88,23 78,94 80,00 81,81 86,66 70,00 93,75 38,88

5 5 5 7 2 4 2 2 2 6 1 5

27,77 41,66 33,33 53,84 11,76 21,05 20,00 18,18 13,33 30,00 6,25 27,77

Incidenţa tulpinilor de Salmonella în cele 184 de probe de produse de origine animală prelucrate după metoda IDSA, este prezentată în următorul tabel: Locul după frecvenţă

Serovar

Numărul de tulpini tipizate

Procent

1 2 3 4 5

S. Enteritidis S. Typhimurium S. Thompson S. Anatum S. Agona

27 11 3 2 1

58,69 23,91 6,52 4,34 2,17

251

6 7

S. Dublin S. London

1 1

2,17 2,17

Total

-

46

-

Ansamblul investigaţiilor întreprinse permit formularea următoarelor concluzii: 1. În urma examenelor bacteriologice pentru izolarea germenilor din genul Salmonella din produse alimentare de origine animală s-a observat că procentul probelor pozitive nu depăşeşte 53,84% (în cazul cărnii de porc). 2. În cazul probelor efectuate din afumături, procentul probelor pozitive a fost de 27,77%; din brânză 41,66%, din carne de pasăre şi derivate 33,33%; din carne de porc şi derivate 53,84%; din carne de vită şi derivate 11,76%; hamburger 21,05%; îngheţată 20%; lapte şi derivate 18,18%; lapte praf 13,33%, ouă şi produse din ouă 30,00%; produse de patiserie 6,25%; salate cu compoziţie proteică 27,77% 3. Serovarurile de salmonele izolate în cadrul Institutului de Igienă şi Sănătate Publică Veterinară, Bucureşti, au fost în ordinea incidenţei următoarele: S. Enteritidis 58,69%, S. Typhimurium 23,91%; S. Thompson 6,25%, S. Anatum 4,34%; S. Agona 2,17%; S. Dublin 2,17%; S. London 2,17%. 4. Cea mai înaltă rată de contaminare cu salmonele are loc în abatoare, în cadrul diferitelor operaţiuni, începând de la sacrificare şi până la tranşare şi ambalare. 5. În cadrul unor toxiinfecţii alimentare, factorul uman a avut o importanţă suficient de mare în producerea acestora. 6. În cadrul produselor de patiserie, tratate bine termic incidenţa contaminării acestora cu salmonele a fost scăzută. Incidenţa în cazul produselor de patiserie a fost mai mică (6,25%) decât în cazul celorlalte produse. Acest procent se datorează contaminării ulterioare a produselor de la purtătorii umani sau fabricarea produselor în condiţii neigenice. 7. Dintre toate mediile solide de izolare selectivă folosite, agarul cu roşu fenol şi verde briliant s-a dovedit a fi cel mai eficient. Acest mediu prezintă avantajul că detectarea coloniilor după aspectul lor nu se bazează pe elaborarea hidrogenului sulfurat, ceea ce permite detectarea şi a serotipurilor de salmonele H2S negative. 8. Nu au fost izolate bacterii din genul Salmonella, în cazul produselor alimentare de origine animală, tratate termic, provenite din unităţi mari de producţie, unde sunt implementate reguli stricte de igienă. 9. Deficienţele igienice de prelucrare a cărnii crude de pasăre, 252

pornind de la abator, au creat posibilităţi de contaminare a carcaselor obţinute în urma sacrificării păsărilor. Modul de furajare, densitatea mare din fermele de păsări, aşternutul, ventilaţia, adăpostul, au reprezentat factori ce au generat îmbolnăvirea păsărilor.

8.19. Diagnosticul de laborator al toxiinfecţiilor alimentare produse de salmonele Toxiinfecţiile alimentare fac parte din grupul mare al bolilor transmise prin alimente. În acest cadru se individualizează următoarele particularităţi:  Afectează două sau mai multe persoane, care au servit cel puţin o masă în comun cu circa 72 de ore, înaintea debutului bolii. Alimentul declanşator poate fi suspectat după calculul ratei de atac epidemiologic prin alimentele consumate în perioada posibilă de incubaţie.  Debutează acut pe fondul unei sănătăţi depline.  Se manifestă prin câteva sindroame clinice definite: digestive sau nervoase (survenite după un debut digestiv).  Evoluează acut în câteva ore sau zile spre vindecare sau, ocazional, moarte.  Nu generează cazuri secundare de boală. Cheia diagnosticului etiologic o constituie perioada de incubaţie şi simptomatologia care debutează brusc şi cu caracter epidemic. Recoltarea probelor Reprezintă o acţiune complexă, care impune examinarea a numeroase prelevate: • probe de la bolnavi (fecale, vomă, ser sangvin), eventual de la cadavre (conţinut intestinal, sânge); • probe de la martori (membrii ai colectivităţii, care au servit masa în comun, dar nu s-au îmbolnăvit); • probe de alimente, eventual şi semipreparate sau ingrediente; • probe de la personalul implicat în manipularea alimentelor; • probe de mediu (aerul şi suprafeţele de prelucrare a alimentelor, recipiente din bucătării, laboratoare culinare, de patiserie etc.).

253

Metoda de lucru Controlul curent al alimentelor pentru detectarea salmonelelor se face conform metodelor stabilite de standarde, din care menţionăm pe cea descrisă în ISO 6579/1995. 1. Preîmbogăţire neselectivă: se cântăresc 25 grame de produs alimentar în 225 ml apă peptonată tamponată; 2. Se incubează la 35°C, 24 de ore; 3. Îmbogăţire selectivă: a) se transferă 0,1 ml cultură obţinută în faza de preîmbogăţire într-o eprubetă care conţine 10 ml de bulion tetrationat (M72); b) se transferă 1 ml cultură din mediul de preîmbogăţire selectivă într-o eprubetă cu 10 ml de bulion selenit cistină (SC). Numai în cazul amestecului de probe incubate care conţin moluşte, se transferă 0,1 ml la 10 ml de mediu Rappaport-Vassiliadis (RV) (M59) şi un alt mililitru la 10 ml de bulion TT. 4. Se incubează bulioanele la 35°C, 24 de ore. 5. Izolarea pe medii selective agarizate: a) Se striază cu ajutorul unei anse pe suprafaţa unei plăci Petri mari (140 mm), care conţine primul mediu selectiv de izolare în trei plăci cu agar BS (agar cu sulfit de bismut HE (agar Hektöen enteric) (M43) şi XLD (agar cu xiloză-lizină-dezoxicolat) (M69). Plăcile cu sulfit de bismut se prepară cu o zi înainte şi se păstrează până la însămânţare la întuneric şi la temperatura camerei. Se repetă însămânţarea cu 3 ml de bulion din cultura obţinută în mediul Rappaport-Vasiliadis pe agar cu roşu fenol şi verde briliant Edel şi Kampelmaker, pentru probele de moluşte. b) Se procedează la fel şi cu cel de-al doilea mediu de izolare selectivă SC (bulion selenit cistină) în vederea obţinerii de colonii izolate. Mediul BS este înalt selectiv, iar HE şi XLD sunt moderat selective. 6. Se incubează plăcile la 35°C, 24-48 ore. 7. Se examinează plăcile pentru prezenţa unor colonii suspecte de a face parte din genul Salmonella. a) Agar Hektöen enteric (HE) (M43) – coloniile tipice sunt albastre verzui sau bleu, cu sau fără centru negru; multe culturi de Salmonella pot produce colonii cu centre mari, negre, lucioase sau pot să apară sub forma unor colonii aproape complet negre; în mod atipic, câteva specii de Salmonella produc colonii galbene, cu sau fără centre negre. b) Agar cu sulfit de bismut (BS) (M23) – coloniile tipice de Salmonella pot fi maro, gri sau negre; uneori prezintă luciu metalic; mediul din jurul coloniilor este, de obicei, la început cafeniu, dar poate deveni negru, o dată 254

cu prelungirea incubaţiei, producând aşa numitul „efect de halou”. Unele tulpini pot produce colonii verzi, mediul înconjurător fiind slab negricios. c) Agar cu xiloză-lizină-dezoxicolat (XLD) (M69) – coloniile tipice sunt roz, cu sau fără centre negre; multe culturi de Salmonella pot avea centre mari, negre, lucioase sau colonii aproape complet negre; atipic, câteva specii de Salmonella pot produce colonii galbene, cu sau fără centre negre. 8. Confirmare: Selectarea coloniilor: se recoltează din fiecare placă cu mediu selectiv de izolare 5 colonii caracteristice şi se însămânţează pe agar TSI (M73) şi agar LI (lizină fier) (M74); se incubează mediile la 35°C, 24 de ore, în cazul agarului TSI şi 48 de ore la 35°C (LI agar). Agar TSI: Se însămânţează suprafaţa înclinată a agarului prin striere şi porţiunea dreaptă (baza) prin înţepare; se incubează; se interpretează: a) Masa mediului (porţiunea dreaptă): • galbenă = denotă fermentarea glucozei (G+); • roşie = nu are loc fermentarea glucozei (G-); • neagră = la limita între porţiunea dreaptă şi cea înclinată (formare de hidrogen sulfurat); • bule sau fisuri = formare de gaz din glucoză b) Suprafaţa înclinată (panta): • galbenă = fermentează lactoza şi zaharoza; • roşie = lactoză şi zaharoză negative; Culturile tipice de Salmonella fermentează glucoza şi nu fermentează lactoza şi zaharoza: • panta (porţiunea înclinată) de culoare roşie (alcalină); • baza (porţiunea dreaptă) – galbenă (acidă); • cu formare de bule de gaz (spargerea mediului); • formare de hidrogen sulfurat – înnegrire (90% din cazuri). În agarul LI, Salmonella produce o reacţie alcalină, coloraţie purpurie (violet) în porţiunea dreaptă a mediului. Se consideră reacţie negativă (acidă) numai culoarea galben distinctă în porţiunea dreaptă a mediului. Majoritatea salmonelelor produc H2S în agar LI. Alte teste biochimice: 1. Testul ureazei: Se inoculează câteva colonii prezumptiv pozitive de pe fiecare pantă de agar în tuburi cu bulion cu uree (M75). Se incubează 24 de ore la 35°C. Reacţie pozitivă: în urma însămânţării unei bacterii care hidrolizează 255

ureea mediul iniţial galben se colorează în roşu, datorită virării roşului fenol în prezenţa amoniacului, metabolit rezultat din descompunerea ureei. 2. Mediul cu cianură de potasiu (KCN) (M58): Dacă are loc creşterea bacteriilor (indicată prin turbiditate) reacţia este pozitivă. Majoritatea speciilor de Salmonella sunt negative la acest test. 3. Bulion cu malonat: Se inoculează 3 mililitri de cultură bacteriană de 24 de ore prezumptiv pozitivă în bulion malonat (M76). Se incubează 48 de ore la 35°C, dar se examinează şi după 24 de ore. Dacă testul este pozitiv mediul devine albastru, iar dacă este negativ culoarea bulionului va rămâne nemodificată. 4. Testul indolului – reacţie negativă-inel galben. 5. Reacţia Voges-Proskauer (M68)– reacţia pozitivă este indicată de apariţia unei culori roz, până la roşu în toată coloana mediului. Salmonelele dau reacţii negative la acest test. 6. Testul roşului metil – majoritatea salmonelelor dau test pozitiv, indicat de culoarea roşie, difuză a mediului. Se consideră ca nefiind Salmonella culturile care dau rezultate pozitive la KCN şi VP şi rezultate negative la testul roşului metil. 7. Agar cu citrat Simmons (M64): Test pozitiv: prezenţa creşterii este însoţită de modificarea culorii mediului din verde în albastru; majoritatea culturilor de Salmonella sunt citrat-pozitive. Confirmarea serologică: Punerea în evidenţă a antigenelor O, H şi Vi ale salmonelelor se face prin reacţia de aglutinare pe lamă cu serul corespunzător al coloniilor pure, după eliminarea surselor autoaglutinabile. Eliminarea surselor autoaglutinabile: Se aplică pe o lamă de sticlă bine spălată soluţie salină în care se dispersează o parte din coloana ce urmează a fi testată obţinând o suspensie omogenă şi tulbure. Se oscilează lama în plan orizontal 30-60 secunde; se examinează pe un fond întunecat; dacă bacteriile aglutinează (se adună în grămezi) înseamnă că sursa este autoaglutinabilă şi nu se mai supune încercărilor ulterioare. Punerea în evidenţă a antigenelor „O”: Se foloseşte o colonie pură neautoaglutinabilă şi se procedează ca mai sus, numai că soluţia salină se înlocuieşte cu o picătură de antiser „O”. Test pozitiv: aglutinare în amestecul testat; absenţa aglutinării în martorul salin. Reacţia negativă nu exclude prezenţa unei specii a acestui gen, deoarece Ag „O” poate fi mascat de Ag „Vi” de la suprafaţa bacteriei (antigen 256

de înveliş), în această situaţie fiind necesară aglutinarea rapidă cu ser anti „Vi”. Această reacţie se efectuează în prezenţa unor martori constituiţi din suspensiile de antigen, la care se adaugă ser fiziologic, ser normal şi ser cunoscut pozitiv. Aglutinarea cu seruri de grup „O” se foloseşte pentru stabilirea grupei serologice din care face parte tulpina supusă analizei. Sistemele microtest Micrometodele (microtestele) reduc volumul substratului enzimatic şi permit deseori o citire rapidă între 4 şi 6 ore până la 18 ore de incubare. După izolarea pe medii selective coloniile suspecte se pot identifica biochimic prin intermediul sistemelor „microtest”, folosind scheme, tabele sau sisteme codificate de încadrare. Sistemele microtest sunt cunoscute sub diverse denumiri comerciale. Pentru identificarea salmonelelor din alimente se va folosi oricare din cele 4 sisteme biochimice comerciale (API 20E, Enterotub II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID). Pentru confirmare se recurge apoi la testul serologic somatic (O) şi testul flagelar (H) sau testul flagelar Spicer-Edwards. Se confirmă a fi Salmonella acea cultură clasificată cu kit-urile biochimice comerciale ca prezumptivă, când aceasta este pozitivă la testul somatic (O) şi testul flagelar (H).

257

iZolArEA Şi iDENTiFicArEA gENUlUi SAlMoNEllA

1. omologat alimentar

225 ml mediu de preîmbogăţire 25 g aliment

2. Preîmbogăţire Incubare la 35°C, 24 de ore

10 ml bulion selenit cistină

3. Îmbogăţire selectivă. Incubare la 35°C, 24 de ore

10 ml bulion tetrationat

4. Însămânţare în plăci Petri. Incubare la 35°C, 24-48 de ore

5. Însămânţare pe mediul TSi şi li. Incubare la 35°C, 24 de ore (agar TSI) sau 48 de ore (agar LI).

Agar TSi

Pantă alcalină (roşie) Bază acidă (galbenă) Agar li

5. Confirmare biochimică şi serologică

258

Bază alcalină (purpurie) Cu sau fără înnegrire (producţia de H2S)

Salmonella sp., imagine electrono-microscopică, salmonele izolate dintr-o epidemie determinată de consumul de tomate

Salmonella typhimurium, scanare electrono-microscopică (3200x). 259

Salmonella typhimurium, în circulaţia sanguină

Salmonella enterica serovar Typhimurium. Agar Luria (LA). 260

Salmonella typhi, Agar SS (Salmonella-Shigella). Se remarcă coloniile de salmonele transparente , cu centrul negru

Salmonella spp. Bulion SF (Selenit-F) 261

Mediul cromogen de diagnostic diferenţial (Oxoid Salmonella Rapid Culture Method, OSCM II). Se remarcă coloniile de Salmonella colorate în violet deschis.

S. typhi. Coloraţia Gram. 262

S. typhi. Coloraţia flagelară Leifson.

S. typhi. Coloraţia flagelară Cassares-Gill 263

Salmonella sp. Cultură de 24 de ore pe agar XLD; zonele de culoare neagră indică prezenţa H2S, în condiţii alcaline

Salmonella choleraesuis subsp. arizonae. Cultivată pe agar sânge 264

Salmonella typhimurium. Cultură pe agar Hektoen enteric (HE).

Formează colonii albastre-verzui.

Salmonella sp. Agar Salmonella-Shigella (SS) 265

S. enterica subsp. enterica – mediu cromogen – coloniile de Salmonella sp. apar colorate in vişiniu pe fondul galben-transparent al mediului de cultură (nu pot identificate pe acest mediu S. indiana si S. choleraesuis)

Salmonella sp. pe agar DC (cu citrat-deoxicolat) 266

Bibliografie selectivă 1. Bârzoi D., 1985, Influenţa diferitelor valori de pH asupra dezvoltării şi supravieţuirii unor tulpini de Staphilococcus aureus, Comunicare la Sesiunea de Comunicări ştiinţifice, FMV, Bucureşti. 2. Bârzoi D., Lidia Tuluş, 1984, Eficienţa unor metode de lucru pentru decelarea S. aureus din laptele praf, Rev. creşt. anim., Bucureşti 11, 42. 3. Bârzoi D., 1985, Microbiologia produselor alimentare de origine animală., Ed. Ceres, Bucureşti, 84-93. 4. Bârzoi D., Meica S., Neguţ M., 1999, Toxiinfecţiile alimentare, Ed. Diacon Coresi, Bucureşti. 5. Bârzoi D., 1993, Asigurarea calităţii microbiologice a produselor alimentare prin aplicarea unui sistem de măsuri preventive, Caiet de informare şi documentare tehnică, LCCAF, Bucureşti, 2, 16. 6. Bârzoi D., 1990, Unele metode folosite pentru decelarea enterotoxinei stafilococice, Caiet de informare şi documentare tehnică, LCCAF, Bucureşti 1, 60. 7. Collinson S. K. şi col., 1998, Thin, aggresive fimbriae mediate binding of Salmonella enteritidis to fibronectin, J. Bacteriol. 8. D’Aoust I. Y., 1994, Salmonella and International food Trade, Int. J. Food Microbiol. 9. De Rycke J. şi col., 1990, Evidence for two types of citotoxic necrotizing factor of Escherichia coli., J. Clin. Microbiol. 10. De Rycke J. şi col., 1991, Les colibacilles producteurs de cytotoxines: importance en, médicine vétérinaire et en santé publique, Ann. Rech. Vét. 11. Donnenberg M. S., J. B. Keper, 1992, Enterotoxigenic Escherichia coli, Infect. Immun. 12. Dorn C. R., E. J. Angrick, 1991, Serotype O157:H7 Escherichia coli from bovine and meat source, J. Clin. Microbiol. 13. Dorn C. R., 1995, may 5, Escherichia coli O157:H7 (Review), JAVMA. 14. Farmer J. J., 1995, Enterobacteriaceae – Introduction and identification, Manual of clinical microbiology, Ed. VI by Muray R., ed. ASM Press – Washington D.C. 15. Garcia Dee Portieeo F. Finlayb, 1994, Invasion and intracellular proliferation of Salmonella within nonphagocytic cells, Microbioloaa SEM. 16. Garbutt J., 1997, Essentials of food microbiology RNAOLD, Londra. 17. Guard-Petter şi col., 2002, Molecular pathobiology and epidemiology of egg – contaminating Salmonella enterica serovar Enteritidis In: Current topics in Food Safety in Animal Agriculture (Eds.), ASM Press, Washington DC. 18. Hennessyw W. T., 1996 – A national outbreak of Salmonella enteritidis infection from ice-cream, New Engl. J. Med. 19. Liebana E. şi col., 2002 – Investigation of the genetic diversity among isolates of Salmonella enterica serovar dublin from animals and humans from England, Ţara Galilor and Ireland Journal of Applied Microbiology. 20. Old D.C. Threefale E.J., 2005, Salmonella in Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Systematic Bacteriology, RNAold, London. 267

21. Rankin şi col., 2002 – Molecular characterization of cephalosporin-resistant Salmonella enterica serotype Newport isolates from animals in Pennsylvania, Journal of clinical microbiology. 22. Simona Ivana, 2002 – Bacteriologie veterinară specială (Ed. Ceres, Bucureşti; 460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5 23. Simona Ivana, 2005 – Bacteriologie generală (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti; 250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2 24. Simona Ivana, 2006 – Tratat de bacteriologie medical-veterinară şi introducere în micologie (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1 25. Simona Ivana, 2007 – Manual de microbiologia alimentelor (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7 26. Simona Ivana, 2007 – Microbiologie medicală – veterinară, Vol. I (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6 27. Simona Ivana, 2007 – Microbiologie medicală – veterinară, Vol. II (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3 28. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi, ISBN: 978-973-736-089-2 29. Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978973-736-090-8 30. The Merk Veterinary Manual, 2007, Seventh ed. 31. Adinarayanan, N., V.D. Foltz, and F. McKinley. 1965. Incidence of Salmonellae in prepared and packaged foods. J. Infect. Dis. 115:19-26. 32. Audisio, M.C., G. Oliver, and M.C. Apella. 2000. Protective effect of Enterococcus faecium J96, a potential probiotic strain, on chicks infected with Salmonella Pullorum. J. Food Protect. 63:1333-1337. 33. BRNAhart, H.M., D.W. Dreesen, R. Bastien, and O.C. Pancorbo. 1991. Prevalence of Salmonella Enteritidis and other serovars in ovaries of layer hens at time of slaughter. J. Food Protect. 54:488^191. 34. Bean, N.H., and P.M. Griffin. 1990. Foodborne disease outbreaks in the United States, 1973-1987: Pathogens, vehicles, and trends. J. Food Protect. 53:804-817. 35. Beloian, A., and G.C. Schlosser. 1963. Adequacy of cooking procedures for the destruction of salmonellae. Am. J Public Health 53:782-791. 36. Bradshaw, J.G., D.B. Shah, E. Forney, and J.M. Madden. 1990. Growth of Salmonella Enteritidis in yolk of shell eggs from normal and seropositive hens. J. Food Protect. 53:1033-1036. 37. Brooks, J. 1962. Alpha amylase in whole eggs and its sensitivity to pasteurization temperatures. /. Hyg. 60:145-151. 38. Bryan. F.L. 1977. Diseases transmitted by foods contaminated by wastewater. /. Food Protect. 40:45-56. 39. Centers for Disease Control and Prevention. 2003. Multistate outbreak of Salmonella serotype Typhimurium infections associated with drinking unpasteurized milk—Illinois, Indiana, Ohio, and Tennessee, 2002-2003. Morb. Mort. Wkly. Rep. 52:613615. 40. Centers for Disease Control and Prevention. 2002. Multistate outbreaks of Salmonella serotype Poona infections associated with eating cantaloupe from Mexico— 268

United States and Canada, 2000-2002. Morb. Mort. Wkly. Rep. 51:1044-1047. 41. Centers for Disease Control and Prevention. 2000a. Outbreak of Salmonella serotype Enteritidis infection associated with eating raw or undercooked shell eggs— United States, 1996-1998. Morb. Mort. Wkly. Rep. 49:73-79. 42. Centers for Disease Control and Prevention. 2000b. Outbreak of Salmonella serotiype intentions associated with eating a nationally distributed dip—California, Oregon, and Washington, January 2000. Morb. Mori. Wtiy. Rep. 49:60-61. 43. Centers for Disease Control and Prevention. 1999. Outbreak ol Salmonella serotype Muenehen infections associated with unpasteurized orange juice—United States and Canada, June 1999. Morb. Mori. \\ kty. Rep. 48:582-585. 44. Centers for Disease Control. 1985. Shigellosis—United States, 1984. Morb. Mori. Wkly. Rep. 34:600. 45. Chung. K.C.. and J.M. Goepfen. 1970. Growth of Salmonella at low pH. J. Food Sci. 35:326-328. 46. Chung. Y.H.. S.Y. Kim. and Y.H. Chang. 2003. Prevalence and actibiotic susceptibility of Salmonella isolated from foods in Korea for 1993 to 2001. J. Food Protect. 66:1154-1157. 47. Crockett, C.S., C.N. Hass, A. Fazil. 1996. Prevalence of shigellosis in the U.S.: Consistency with dose-response information. Int. J. Food Microbiol. 30:87-99. 48. D’Aoust, J.Y., and H. Pivnick. 1976. Small infectious doses of Salmonella. Lancet 1:866. 49. Dargatz, D.A., P.J. Fedorka-Cray, S.R. Ladely, and K.E. Ferris. 2000. Survey of Salmonella serotypes shed in feces of beef cows and their antimicrobial susceptibility patterns. J. Food Protect. 63:1648-1653. 50. Fedorka-Cray, P.J., D.A. Dargatz, L.A. Thomas, and J.T. Gray. 1998. Survey of Salmonella serotypes in feedlot cattle. J. Food Protect. 61:525-530. 51. Goepfert, J.M., and R.A. Biggie. 1968. Heat resistance of Salmonella typhimurium and Salmonella Senftenberg 775W in milk chocolate. Appl. Microbiol. 16:1939-1940. 52. Graber, G. 1991. Control of Salmonella in animal feeds. Division of Animal Feeds. Center for Veterinary Medicine, Food and Drug Administration. Report to the National Advisory Commission on Microbiological Criteria for Foods. 53. Hennessy, T.W., C.W. Hedberg, L. Slutsker. 1996. A national outbreak of Salmonella Enteritidis infections from ice cream. N. Engl. J. Med. 334:1281-1286. 54. Hinton. M.. E.J. Threlfall. and B. Rowe. 1990. The invasive potential of Salmonella Enteritidis phage types for young chickens. Lett. Appl. Microbiol. 10:237239. 55. Hobbs, B.C. 1961. Public health significance of Salmonella carriers in livestock and birds. J. Appl. Bacteriol. 24:340-352. 56. Horwitz, M.A., R.A. Pollard, M.H. Merson, and S.M. Martin. 1977. A large outbreak of foodbome salmonellosis on the Navajo Indian Reservation, epidemiology and secondary transmission. Am. J. Public Health 67:1071-1076. 57. Impey, C.S., and G.C. Mead. 1989. Fate of salmonellas in the alimentary tract of chicks pre-treated with a mature caecal microflora to increase colonization resistance. J. Appl. Bacteriol. 66:469^475. 58. Jones, F.T.. R.C. Axtell. D.V. Rives, S.E. Schneideler, F.R. Tarver, Jr., R.L. 269

Walker, and M.J. Wineland. 1991. A survey of Salmonella contamination in modem broiler production. J. Food Protect. 54:502-507. 59. Juven, B.J., N.A. Cox, J.S. Bailey, J.E. Thomson, O.W. Charles, and J.V. Shutze. 1984. Survival of Salmonella in dry food and feed. J. Food Protect. 47:445^*48. 60. Kampelmacher. E.H. 1963. The role of salmonellae in foodbornc diseases. In Microbiological Quality of Foods, ed. L.W. Slanctz et al., 84-101. New York: Academic Press. 61. Keller, L.H., C.E. Benson, K. Krotec, and R.J. Eckroade. 1995. Salmonella Enteritidis colonization of the reproductive tract and forming and freshly laid eggs of chickens. Infect. Immun. 63:2443-2449. 62. Lee, W.-C, M.-J. Lee, J.-S. Kim, and S.-Y Park. 2001. Foodborne illness outbreaks in Korea and Japan studied restrospec-tively. J. Food Protect. 64:899-902. 63. Le Minor. L., and M.Y Popoff. 1987. Designation of Salmonella enterica sp. nov., nom. rev., as the type and only species of the genus Salmonella. Int. J. System. Bacteriol. 37:465^168. 64. Lerche, M. 1961. Zur Lebenfahigkeit von Salmonella bakterien in Mayonnaise und Fleischsalat. Wein. Tierarztl. Mschr. 6:348-361. 65. Ley, F.J., B.M. Freeman, and B.C. Hobbs. 1963. The use of gamma radiation for the elimination of salmonellae from various foods. J. Hyg. 61:515-529. 66. Lillard, H.S. 1986. Role of fimbriae and flagella in the attachment of Salmonella typhimurium to poultry skin. J. Food Sci. 51:54-56.65. 67. Martin, W.J., and W.H. Ewing. 1969, Prevalence of serotypes of Salmonella. Appl. Microbiol. 17:111-117. 68. Matches. JR. and J Liston. 1968. Low temperature growth of Salmonella. J. Food Sci. 33:641-645.

270