Microbiologia Alimentelor Partea I

Prof. Univ. Dr. SERGIU MEICA

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

1

2

Prof. Univ. Dr.

SERGIU MEICA

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

Editura SITECH Craiova, 2010 3

Corectura aparţine autorului © 2010 Editura Sitech Craiova Toate drepturile asupra acestei ediţii sunt rezervate editurii. Orice reproducere integrală sau parţială, prin orice procedeu, a unor pagini din această lucrare, efectuate fără autorizaţia editorului este ilicită şi constituie o contrafacere. Sunt acceptate reproduceri strict rezervate utilizării sau citării justificate de interes ştiinţific, cu specificarea respectivei citări. © 2010 Editura Sitech Craiova All rights reserved. This book is protected by copyright. No part of this book may be reproduced in any form or by any means, including photocopying or utilised any information storage and retrieval system without written permision from the copyright owner. Editura SITECH din Craiova este acreditată de C.N.C.S.I.S. din cadrul Ministerului Educaţiei, Cercetării, Tineretului şi Sportului pentru editare de carte ştiinţifică. Editura SITECH Craiova, România Aleea Teatrului, nr. 2, Bloc T1, parter Tel/fax: 0251/414003 E-mail: [email protected]

ISBN 978-606-11-0763-6 4

Motto: „Exista o singura binefacere, cunoasterea si un singur rau, ignoranta” Socrate

PREFATA Microbiologia este stiinta care se ocupa cu studiul microorganismelor. Denumirea se datoreaza dimensiunilor foarte mici(micro-mic; bios-viata), deci vietuitoare mici.Acest univers este reprezentat de catre alge, levuri, fungi, bacterii si virusuri. Conform unor studii arheologice in lava vulcanica pietrificata de acum 2000000 ani s-au descoperit unele bacterii metanogene si unele clostridii. Microbiologia a progresat continuu de la simple cunostinte pana la nivelul unei stiinte moderne.Dezvoltarea cunostintelor a permis cunoasterea etiologiei, prevenirii si tratamentului bolilor omului, animalelor si plantelor. Stabilirea unor tehnologii de producere si conservare a alimentelor si a furajelor. Microbiologia a contribuit decisiv alaturi de biochimie la fundamentarea cunostintelor de genetica moleculara. Datorita bogatiei de date acumulate in ultimul timp in prezent s-au individualizat mai multe ramuri ale microbiologiei cum ar fi: microbiologia solului, microbiologia marina, microbiologia industriala, microbiologia umana, microbiologia veterinara, microbiologia plantelor, microbiologia insectelor si microbiologia alimentelor. Microbiologia produselor alimentare a cunoscut progrese semnificative in ultimele decenii datorita cerintelor si exigentelor tot mai severe de a asigura omului alimente salubre. 5

Consumul de alimente nu este lipsit de pericole. Exista posibilitatea transmiterii prin alimente a unor boli cu etiologie microbiana, fungica, virala, parazitara si prionica. Microorganismele pot determina procese alterative ce pot aparea in timpul procesarii, depozitarii si comercializarii produselor alimentare, procese soldate cu pierderi economice si pericole pentru sanatatea consumatorilor. O serie de produse alimentare ca de exemplu unele produse lactate, painea, unele preparate din carne, vinul, alcoolul, otetul, berea sunt de neconceput fara participarea la tehnologia de fabricatie a unor microorganisme (bacterii, levuri, fungi). Controlul tehnologiilor de fabricatie, a parametrilor microbiologici la produsele finite, certificarea conformitatii acestora nu este posibila fara cunoasterea si studierea microorganismelor din produsele alimentare. Managementul sigurantei alimentelor, cerinta primordiala a zilelor noastre in domeniul industriei alimentare, se bazeaza intr-o masura considerabila pe cunostintele de microbiologie alimentara. Cursul a fost structurat in doua parti. Partea a I-a -Ecologia microorganismelor, structurata in 7 capitole ( Factorii intrinseci, Factorii extrinseci, Factorii impliciti, Aparitia mutantelor rezistente la factorii de mediu, Procese metabolice mediate de microorganisme cu aplicatii in industria alimentara, Conservarea alimentelor prin combinatia de factori si Microbiologia previzionala).Studierea acestor capitole permite o buna intelegere a proceselor microbiene din produsele alimentare. Partea a II-a -Microbiologia produselor alimentare cuprinde 17 capitole. In 14 capitole se microflora alterativa si potential patogena din produsele alimentare cat si modificarile pe care le pot suporta produsele alimentare sub influenta microorganismelor.In ultimile 3 capitole se trateaza unele aspecte privind semnificatia prezentei virusurilor si a prionilor din unele produse alimentare, precum si sisteme de recoltare a probelor de produse alimentare pentru examenul microbiologic 6

si interpretarea corecta a rezultatelor acestui examen. In final, am considerat utila prezentarea in anexe a unor date cu semnificatie pentru microbiologia produselor alimentare. Ca, specialist in domeniul controlului sanitar-veterinar al produselor de origine animala, in expertiza acestora sub raport microbiologic, cu o vechime in activitate de peste 40 ani, am dorit prin elaborarea acestei lucrari sa satisfac interesul unui cerc cat mai larg de cititori, de la studenti la participanti la cursurile de masterat si pana la specialistii din industria alimentara. Sunt sigur ca acest deziderat nu a putut fi realizat decat partial. Vor fi studenti care vor aprecia manualul ca prea vast iar unii specialisti ca fiind incomplet. Toti vor avea dreptate din punctul lor de vedere.S-a dorit in primul rand un material didactic, informativ, Cursul de “Microbiologia produselor alimentare“ pentru studentii facultatii “Controlul si Expertiza Produselor Alimentare“ din cadrul Universitatii Bioterra Bucuresti. Autorul

7

8

CUPRINS Prefata .........................................................................................

Partea a I-a Ecologia microorganismelor din alimente Factorii care influenteaza dezvoltarea microorganismelor in alimente ....................................................................................... Cap. I Factorii intrinseci.............................................................. I.1. Continutul de nutrienti ..................................................... I.2. Compusii naturali antimicrobieni din alimente si structurile de protectie ale alimentelor ............................ I.3. Activitatea apei ................................................................ I.4. Aciditatea si pH-ul ........................................................... Cap. II Factorii extrinseci II.1. Factorii fizici .................................................................. II.1.1. Temperatura............................................................ II.1.2. Umiditatea relativa a aerului .................................. II.1.3. Presiunea ................................................................ II.1.4. Continutul de gaze din mediul ambient .................. II.1.5. Pulsurile luminoase ................................................ II.1.6. Radiatiile ultraviolete si radiatiile ionizante ........... II.1.7. Ultrasunetele ........................................................... II.1.8. Campuri electrice pulsatorii ................................... II.2. Factorii chimici .............................................................. II.2.1. Substante chimice adaugate.................................... Conservanti .................................................................. Dezinfectanti ................................................................ II.3. Factorii mecanici ............................................................ II.3.1. Agitarea .................................................................. II.3.2. Filtrarea .................................................................. II.3.3. Centrifugarea .......................................................... II.3.4 Contaminarea alimentelor in timpul prelucrarii ...... 9

Cap. III Factorii impliciti III.1. Rata specifica de inmultire ............................................ III.2. Simbioza........................................................................ III.3. Antagonismul ................................................................ III.4. Succesiuni microbiene .................................................. Cap. IV Aparitia mutantelor rezistente la factorii de mediu ....... Cap. V Procese metabolice mediate de microorganisme cu aplicatii in industria alimentara ....................................... Cap. VI Consevarea alimentelor prin combinatii de factori ....... Cap. VII Microbiologia previzionala ..........................................

Partea a II-a Microorganismelor alimentelor

Cap. VIII Microbiologia laptelui si a produselor lactate ............ Cap. IX Microbiologia carnii si a preparatelor din carne ........... Cap. X Microbiologia oualelor si a produselor din oua .............. Cap. XI Microbiologia mierii de albine ...................................... Cap. XII Microbiologia conservelor alimentare ......................... Cap. XIII Microbiologia condimentelor ..................................... Cap. XIV Microbiologia cerealelor, a fainii de grau si a painii . Cap. XV Microbiologia cartofului si a amidonului de cartof ..... Cap. XVI Microbiologia zaharului si a produselor zaharoase .... Cap. XVII Microbiologia legumelor si fructelor ........................ Cap. XVIII Microbiologia bauturilor racoritoare nealcoolizate . Cap. XVIX Microbiologia berii .................................................. Cap. XX Microbiologia vinului .................................................. Cap. XXI Microbilogia apei potabile .......................................... Cap. XXII Incidenta si semnificatia prezentei virusurilor din alimente .................................................................... Cap. XXIII Incidenta si semnificatia prezentei prionilor din alimente .................................................................... Cap.XXIV Folosirea unui sistem de recoltare a probelor de produse alimentare pentru examenul de laborator si interpretarea corecta a rezultatelor ........................... Anexe ......................................................................................... Bibliografie selectiva .................................................................. 10

Partea a I- a ECOLOGIA MICROORGANISMELOR DIN ALIMENTE Factorii care influenteaza dezvoltarea microorganismelor in alimente Introducere, generalitati, clasificarea factorilor Intr-un produs alimentar exista de regula mai multe specii de microorganisme cu proprietati metabolice si cu diferite posibilitati de multiplicar. Se vor multiplica numai acele specii pentru care conditiile de dezvoltare, ca de exemplu:compozitia chimica, activitatea apei, pH-ul, aciditatea, potentialul oxidoreducator al alimentului, umiditatea si temperatura spatiului in care se afla sunt convenabile. In urma multiplicarii unor specii microbiene in aliment, aceasta isi poate schimba compozitia chimica devenind un mediu convenabil si pentru alte specii microbiene prezente in aliment, aflate la inceput in imposibilitatea de a se dezvolta. Datorita influentei mai multor factori, populatiile microbiene din alimente sunt supuse unor fenomene de concurenta: simbioza si succesiune care determina compozitia microflorei din aliment in diferite etape din existenta sa ca si microflora finala. La un moment dat fiecare aliment are profilul sau microbiologic caracteristic, incepand cu microflora initiala, apoi cea din timpul prelucrarii, transportului si depozitarii. Datorita conditiilor specifice existente in aliment, actiunii antagoniste sau stimulatoare pe care o exercita fiecare din speciile existente asupra celorlalte, a epuizarii unor substante nutritive disponibile sau acumularii de substante metabolice care inhiba dezvoltarea propie si a florei asociate, are loc stabilizarea microbiologica a produsului. Dupa stabilizare, populatia microbiana ramsa incepe sa descreasca. 11

Originea microorganismelor din alimente poate proven din: -sol, apa, praful atmosferic -nise specifice din unitatile de prelucrare, depozitare si comercializare (suprafetele si utilajele neigienizate, cu resturi de alimente in descompunere) -persoanele care prelucreaza si manipuleaza alimentele. Initial, alimentele sunt contaminate cu o microflora asemanatoare, dar ulterior fiecare aliment va contine o anumita multime dominanta de bacterii specifica.Astfel, carnea refrigerata se altereaza datorita multiplicarii bacteriilor cu forma de bastonas, gram negative, ce formeaza la suprafata ei mucusul lipicios;sucurile de fructe datorita fermentarii produse de levuri iar produsele uscate datorita invaziei mucegaiurilor. Microorganismele actioneaza asupra componentelor alimentului pe care le degradeaza pe cai si in moduri diferite in functie de specia microbiana. Hidratii de carbon sunt degradati, de regula, in conditii aerobe, in dioxid de carbon si hidrogen.Acesti compusi nu influenteaza sau influenteaza foarte putin mirosul si gustul alimentelor.In conditii anaerobe, in straturile profunde, sau la alimentele ambalate in recipiente inchise, vacuumate, degradarea hidratilor de carbon se poate realiza in functie de specia microbiana in doua moduri: -homofermentativ-cand hidratii de carbon sunt descompusi in proportie de peste 85% in acid lactic, care da produsului miros si gust de acru -heterofermentativ-cand rezulta cantitati aproape egale de etanol, acid lactic, acid acetic si dioxid de carbon.In acest caz produsul are aspect spongios, miros si gust acru. Proteinele. Numeroase specii de microorganisme (Pseudomonas, Clostridii, Bacillus) produc enzime proteolitice capabile sa hidrolizeze protidele in peptide si acizi aminati. La randul lor aminoacizii sunt descompusi prin decarboxilare, de aminare pana la indol, scatol, amoniac, mercaptan, hidrogen sul12

furat, amine, o serie de produsi volatili. Acesti compusi genereaza miros si gust neplacut alimentelor. Lipidele pot fi alterate datorita numeroaselor specii microbiene (Pseudomonas, Staphylococcus, Bacillus, levuri, mucegaiuri) in doua moduri: -prin hidroliza, sub actiunea lipazelor cu formare de acizi grasi si glicerina.In acest caz creste aciditatea alimentului. -prin oxidarea acizilor grasi deveniti liberi, cu ajutorul oxidazelor, cand rezulta aldehide, cetone, peroxizi. In acest caz produsul capata miros si gust de ranced. In produsele care sufera procesul de rancezire se gasesc un numar mic de microorganisme, deoarece peroxizii formati inhiba multiplicarea lor. Vitaminele, prin dezvoltarea microorganismelor pot creste sau diminua sub raport cantitativ. Exista mai multe specii de microorganisme care pot sintetiza unele vitamine, cat si altele care nu se pot dezvolta decat in prezenta unor vitamine; in special a celor din complexul B (factori de crestere). Aceasta proprietate sta la baza metodelor microbiologice de determinare a prezentei si cantitatii de vitamine din diferite substraturi. Clasificarea factorilor ce influenteaza dezvoltarea microorganismelor in alimente: Factorii care influenteaza starea (multiplicarea sau moartea) microorganismelor din alimente pot fi clasificati astfel: a) Factori intrinseci sunt reprezentati de parametrii ce caracterizeaza mediul de cultura (continut de nutrienti, compusi naturali antimicrobieni din structura alimentului, aciditatea, pH-ul si puterea de tamponare a alimentului, continutul de apa libera, potentialul oxido-reducator) b) Factori extrinseci de natura fizica (temperatura, umiditate relativa, presiunea, continutul de gaze din mediul ambiant, pulsurile luminoase, radiatiile, ultrasunetele, campurile electrice pulsatorii), de natura chimica (substante chimice adaugate) si de natura mecanica (agitarea, filtrarea, centrifugarea, procesarea) 13

c) Factori impliciti sunt factorii de natura biologica, determinati de relatiile ce se stabilesc la un moment dat intre microorganismele aflate pe acelasi substrat limitat cantitativ. Factorii impliciti sunt: rata specifica de inmultire, simbioza, si antagonismul. Factorii intrinseci, extrinseci si impliciti pot actiona pozitiv sau negativ asupra dezvoltarii microorganismelor. Influenta pozitiva a factorilor citati asupra microorganismelor se evidentiaza prin: -durata fazei de latenta a celulelor -panta fazeide multiplicare exponentiala -durata si nivelul fazei stationare Efectul global al influentei negative a factorilor asupra dezvoltarii microorganismelor se evidentiaza prin: -timpul necesar pentru a omori un anumit numar de microorganisme la o anumita valoare a unui factor -timpul de reducere decimala a unei populatii de microorganisme (timpul in care este omorata 90% dintr-o populatie microbiana) -rezistenta unui microorganism la diferite valori distructive ale unui factor Evolutia in timp a densitatii unei populatii de microorganisme pentru un mediu finit este caracterizata de cele patru faze majore: latenta, multiplicarea, stationarea si declinul (fig.1). Faza de latenta (a), numita si faza de inductie sau de crestere zero, incepe in momentul inocularii celulelor in mediul de cultura si dureaza pana cand acestea incep sa se multiplice.Este o perioada de adaptare a celulelor la conditiile de mediu, in care acestea isi elaboreaza enzimele necesare metabolizarii substratului, cresc in dimensiuni, se pregatesc pentru multiplicare.Lungimea fazei de latenta este variabila si depinde de: -compozitia mediului de cultura:astfel daca inoculul a fost obtinut pe un mediu de cultura cu o compozitie identica cu a mediului inoculat, faza de latenta va fi scurta, sau chiar ine14

xistenta, intrucat celulele si-au activat aparatul enzimatic.Daca mediul contine substante nutritive mult diferite cu cele cu care celulele din inocul au fost obisnuite, faza de latenta poate fi mai lunga. -stare fiziologica si varsta celulelor -potentialul enzimatic al celulelor -forma in care se afla inoculul (vegetativ, sporifer) ln x d

e f

c a

b

Fig. 1.1 Curba ce descrie evolutia unei culture micobiene : a-faza de latenta; b-faza de accelerare; c- faza de crestere exponentiala; d-faza de incetinire; e-faza stationara; f- faza de declin.

Faza de accelerare (b) face tranzitia de la faza de latenta catre faza de crestere exponentiala, celulele incepand sa se divida, pe rand, in functie de etapa ciclului vital in care se aflau in momentul inocularii. Faza logaritmica (c) sau de crestere exponentiala, presupune initierea diviziunii la toate celulele culturii, numarul acestora dublandu-se la intervale regulate de timp, numite timp de generatie. In aceasta faza procesele metabolice celulare prezinta 15

intensitate maxima si se deruleaza cu o anumita constanta, stabilindu-se un echilibru dinamic, desi compozitia mediului se modifica permanent, pe masura consumarii substratului si a acumularii de produse de catabolism, motiv pentru care faza mai este denumita si a cresterii echilibrate. In faza logaritmica are loc cresterea in dimensiuni a celulelor, cat si cresterea numerica a populatiei de microorganisme. Faza de incetinire (d) realizeaza trecerea la faza stationara prin incetinirea ritmului de crestere pana la anulare. Faza stationara (e) consta in stabilizarea populatiei de microorganisme la un anumit numar, fapt cauzat de epuizarea unei substante nutritive esentiale din substrat sau acumularii de produse metabolice peste o valoare prag. Faza de declin (f) implica reducerea numarului de microorgansime prin moarte si autoliza

16

Capitolul I –Factorii intrinseci

I.1 Continutul de nutrienti Cresterea si multiplicarea microorganismelor necesita substante care sa furnizeze energia si elementele necesare metabolismului celular. Aceste substante care se mai numesc si nutrienti se pot grupa in: surse de carbon, surse de azot, saruri minerale si factori de crestere. Aceste elemente se gasesc in majoritatea produselor alimentare, partial sau in totalitate cu diferente calitative si cantitative. In laborator sau in practica industriala dezvoltarea microorganismelor nu este lasata la voia intamplarii ci este influentata prin intermediul mediilor de cultura.Pentru a prepara corect un mediu de cultura, este nevoie sa se cunoasca exigentele nutrionale ale microorganismului ce urmeaza a fi cultivat. Exigentele nutritionale ale microoragnismelor sunt determinate de compozitia lor chimica.Compozitia chimica a microorganismelor cuprinde macroelemente nemetalice (C, H, O, N, S, P), macroelemente metalice (Na, K, Mg, Ca) si oligoelemente (Fe, Mn, Zn, Co, Cu, Mo). Aceste alemente se intalnesc la majoritatea microorganismelor sub forma de apa, ioni anorganici, substante organice cu rol structural si functional. In tabelul Nr.1 sunt prezentate elementele celulare majore, compusii sub forma in care se gasesc in celule si functiile lor, dupa Todar, 2004, citat de Anca Nicolau 2006. Cunoasterea exigentelor nutritionale ale microorganiselor sunt determinate si de tipul de metabolism al acestora bazat pe sursele de energie, de carbon si a donatorului de electroni. 17

Particularitatile metabolismului microorganismelor genereaza o diferentiere a microorganismelor astfel: -dupa sursa de energie:fototrofe (energia luminoasa) si chemotrofe (energia din reactii chimice) -dupa sursa de carbon:litotrofe (substante anorganice) si organotrofe (compusii organici) -dupa donatorii de electroni:autotrofe (substante anorganice) si heterotrofe (substante organice) In tabelul Nr.2 prezentam dupa Nicolau (2006) tipurile de metabolism microbian dupa sursa de energie si de carbon utilizate pentru dezvoltare. Tabelul Nr.1

Elemente celulare majore, compusii in care se gasesc si rolul lor Elementul

% s.u.

Compusii care integreaza elemental

Rol

Carbon

50

Compusi anorganici, CO2

Structural

Oxigen

20

Apa, compusi anorganici,

Structural

CO2 si O2

Fiziologic (apa Reprezinta mediu de solubilizare, mediu de reactie si reactant, iar oxigenul este acceptorul de electroni, procesele aerobe)

Azot

14

NH3, NO3, compusi organici, N2 Constituent al aminoacizilor, nucleotidelor din componenta acizilor nucleici, coenzimelor 18

Hidrogen

8

H2O, compusi organici, H2

Principalul constituent al compusilor organici si al apei celulare

Fosfor

3

Fosfati anorganici ( PO4)

Constituent al acizilor nucleic, nucleotidelor, fosfolipidelor, LPS, acizilor teihoici

Sulf

1

SO4, H2S, S0, compusi organici cu sulf

Constituent al cisteinei, metioninei, glutationului, unor coenzime

Potasiu

1

Saruri de potasiu

Principalul cation celular anorganic, cofactor pentru unele enzime

Magneziu

0, 5

Saruri de magneziu

Cation celular anorganic Cofactor pentru unele enzime

Calciu

0, 5

Saruri de calciu

Cation celular anorganic Cofactor enzimatic

Fier

0, 2

Saruri de fier

Component al citocromilor si al unor proteine neheminice Cofactor enzimatic

19

Tabelul Nr.2

Tipuri de metabolism microbian Tipul de Sursa de metabolism energie

Sursa de carbon

Foto-lito Radiatie autotrof luminoasa

CO2

FotoRadiatie Organo luminoasa heterotrof

Compusi organici

Compusi organici

CO2

Compusi anorganici: NH3;NO2H2, Fe2+, H2S, S0

Chemo-lito Oxidarea Autotrof compusilor anorganici

Donorul de Grupe de electroni microorganisme H2O, H2S, S0, H2

Cianobacterii Bacterii din familia Chromatiaceae si Clorobiaceae

Chemo- Oxidarea unor Compusi Compusi Organo compusi organici organic heterotrof organici

Bacterii din familia Rhodospirilaceae Nitrobacterii Ferobacterii Bacterii metanogene si acetogene Majoritatea bacteriilor Fungi

Compozitia mediilor de cultura.Mediile de cultura trebuie sa contina nutrientii necesari dezvoltarii microorganismelor intr-o forma usor accesibila. Sursele de carbon pentru microorganismele litotrofe sunt dioxidul de carbon, carbonatii si bicarbonatii iar pentru cele organotrofe monoglucidele (glucoza, fructoza, galactoza), diglucide (maltoza, zaharoza, lactoza), poliglucide (amidon, celuloza, pectina) precum si alte surse de carbon (glicerol, alcooli, acizi organici, aminoacizi). Pentru cultivarea levurilor se folosesc musturi cu glucide simple, diglucide si dextrine cu masa moleculara redusa. 20

Surse de azot. Azotul este furnizat microorganismelor litotrofe sub forma de azotati, azotiti, azot liber sau amoniu iar pentru cele organotrofe aminoacizii, peptonele si chiar proteinele. Pentru dezvoltarea bacteriilor de putrefactie si a mucegaiurilor, este necesara prezenta initiala a unor surse de azot usor asimilabile (aminoacizi, peptone) iar pentru levuri, care nu pot metaboliza substantele proteice complexe se recomanda utilizarea ureei, peptonei ca substante organice si a sulfatului de amoniu din categoria substantelor anorganice. Sarurile minerale, in cantitati mici au un efect stimulator, iar in cantitati mari un efect toxic. Mediile de cultura trebuie sa furnizeze si fosfor, care poate fi cel mai usor de asimilat din fosfati.Fosfatii au si rol de substante tampon, ceea ce nu permite variatii mari de pH a mediilor de cultura. Sulful de regula provine din sulfitul de fier sau magneziu. Asimilarea sarurilor minerale de catre microorganisme in ordine descrescatoare este urmatoarea: fosfati, sulfati, azotati, carbonati. Factorii de crestere sunt substante de care microorganismele au nevoie pentru dezvoltare si pe care nu sunt capabile sa le produca singure.Au functii specifice in procesele de biosinteza. Cei mai cunoscuti factorii de crestere sunt:bazele purinice si pirimidinice pentru sinteza acizilor nucleici, aminoacizii necesari pentru sinteza proteinelor si vitaminele cu rol de coenzime pentru enzime. Microorganismele cele mai putin pretentioase sub raportul nutrientilor din mediile de cultura sunt mucegaiurile urmate de levuri, bacteriile gram pozitive si bacteriile gram negative. Din punct de vedere al starii de agregare mediile de cultura pot fi lichide si solide. Mediile lichide se utilizeaza pentru obtinerea de biomasa sau pentru producerea unor compusi metabolici valorosi. 21

Mediile solide sunt folosite pentru izolarea, obtinerea de culturi pure, identificarea si numararea microorganismelor.Mediile solide se obtin prin utilizarea unui agent de solidificare intr-un mediu lichid. Cel mai utilizat fiind agarul, un hidrocoloid produs de alge si care are propietatea de a se topi la 1000C si de a se solidifica la 400C. Nu este metabolizabil de microorganisme. Dupa compozitia chimica mediile de cultura pot fi cu o compozitie bine definita sau cu o compozitie nedefinita. Mediile cu o compozitie bine definita, sunt medii sintetice, obtinute din substante chimice pure, pentru care se cunoaste exact compozitia chimica, si reprezinta medii minimale utilizate pentru studiul necesitatilor nutritionale, a proprietatilor metabolice, fiziologice. Mediile cu compozitia chimica nedefinita sunt realizate cu ajutorul materialelor de origine biologica (sange, lapte, extract de carne, extract de malt, etc).Aceste medii se utilizeaza pentru cultivarea bacteriilor cu necesitati nutritionale complexe. Dupa scopul in care sunt utilizate mediile de cultura pot fi:medii generale, medii selective, medii diferentiale si medii de imbogatire. Mediile generale: permit cresterea mai multor grupe de microorganisme.Ca de exemplu mediul cu extract de malt, mediul Sabourd si mediul Czapeck pentru dezvoltarea fungilor sau mediul PCA (Plate Count Agar) un mediu pe baza de peptona, ce permite dezvoltarea mai multor tipuri de bacterii. Mediile selective: contin un component capabil sa inhibe dezvoltarea microorganismelor nedorite si sa favorizeze cresterea unui singur tip de microorganisme.Mediul BBLV (Bulion Lactoza Bila verde Briliant) este un mediu selectiv pentru coliformi.Prezenta sarurilor biliare inhiba dezvoltarea bacteriilor ce nu fac parte din grupa coliformilor. Mediile diferentiale, reprezinta o categorie speciala a mediilor selective, care permit diferentierea unor microorganisme intre ele pe baza caracteristicilor lor metabolice. 22

De exemplu pentru identificarea lui S.aureus se utilizeaza un mediu cu o concentratie ridicata de sare, pe care stafilococii o pot tolera, manitol ca sursa de glucide fermentescibile si un indicator de pH. Un asemenea mediu poate diferentia S.aureus-specie toxicogena de S.epidermidis-specie netoxigena.Fermentarea manitolului de catre S.aureus produce acid care va produce modificarea culorii indicatorului de pH (aparitia unui halou in jurul coloniilor de S.aureus. Speciile de S.epidermidis nu fermenteaza manitolul deci nu se va forma halou in jurul coloniilor). Mediile de imbogatire contin componente care le sunt necesare anumitor microorganisme si care nu pot fi folosite de altele sau au chiar efect inhibitor asupra altora, situatie in care mediul de imbogatire este si selectiv. Cunoasterea compozitiei chimice a mediilor de cultura, corespunzatoare cerintelor nutritionale ale microorganismelor prezinta importanta nu numai pentru cultivarea bacteriilor in laborator ci si in practica industriala (biotehnologie), deoarece permite reglarea activitatii microorganismelor in directia obtinerii de biomasa sau a unor produsi de metabolism. Influenta compozitiei chimice a alimentelor asupra dezvoltarii microorganismelor. Carnea si produsele din carne, laptele si derivatele sale sunt produse foarte nutritive, pe cand unele produse vegetale, cum este varza, sunt sarace in asemenea substante.Pentru a favoriza multiplicarea microbiana substantele nutritive din aliment trebuie sa fie intr-o forma utilizabila, degradabila.Unele componente din alimente sunt rezistente la atacul microorganismelor sau pot fi degradate numai de acelea care elaboreaza enzime specifice. Ca de exenplu:degradarea initiala a structurilor vegetale este produsa numai de microorganismele care secreta celulaze si pectinaze, enzime, care depolimerizeaza polizaharidele din peretele celulelor si elibereaza componente cu masa moleculara 23

mica, metabolizabile de microorganismele cu echipament enzimatic mai sarac. Microflora care se dezvolta initial pe suprafata carnii utilizeaza glucoza si riboza, apoi lactatul rezultat din glucoza.Rezulta in acest mod o cantitate mare de energie folosita de microorganismele proteolitice ce hidrolizeaza proteinele complexe cu molecule mari in compusi cu molecule mici utilizabili si de microflora cu un echipament enzimatic mai putin dotat. Alimentele, sub actiunea echipamentului enzimatic propriu si a celui microbian isi modifica compozitia chimica si structura devenind accesibile pentru o gama mai larga de microorganisme. In acelasi timp, cerintele nutritive ale unei grupe de microorganisme se pot schimba in raport cu conditiile intalnite in aliment.Astfel, unele devin mai pretentioase sub raport nutritiv la temperaturi mai ridicate sau la valori mai mici ale apei active. Este unanim cunoscut faptul ca profilul microbian dominant al unui aliment este determinat de compozitia chimica a acestuia. In lapte si produsele lactate predomina Enterobacteriaceele lactozo pozitive, pe cand in majoritatea celorlalte alimente predomina tipurile lactozo negative. Proteoliza si glicoliza sunt produse in mod obisnuit de flora de alterare a alimentelor, lipoliza este mai putin obisnuita. Aceasta situatie se datoreaza faptului ca substraturile proteice si hidrocarbonate sunt deseori solubile, deci existente in faze apoase a alimentelor si accesibile enzimelor microbiene extra si intra celulare. Grasimile sunt relativ insolubile in faza apoasa din aliment si deci mai greu accesibile enzimelor extra celulare ale microorganismelor. Proteinele cu molecula complexa sunt descompuse de putine microorganisme si nu pot constitui o sursa de azot.Cele mai rezistente proteine la atacul microbilor sunt: cheratina, elastina si colagenul. Alterarea proteolitica a carnii si a unor preparate din carne nu se poate realiza decat de microorganismele care 24

elaboreaza colagenaza.Aceasta enzime poate degrada membrana fibrelor musculare, astfel incat continutul acestora devine accesibil pentru numeroase specii microbiene.Colagenaza este elaborata de specii din genurile Clostridium si Pseudomonas. Descompunerea proteolitica este un proces complex la care participa numeroase specii microbiene cu profiluri metabolice variate, astfel incat rezultatul ei consta intr-un amestec de metaboliti intalniti aproape constant:amoniac, hidrogen sulfurat, indol, scatol, mercaptan. Daca proteoliza este produsa numai de o anumita specie microbiana cu profil metabolic specific, atunci si in produsii finali va predomina un anumit compus metabolic ce va imprima produsului un miros particular: amoniacal in cazul speciilor de Pseudomonas, de hidrogen sulfurat, de branza stricata, de corn ars-in cazul unor Clostridii. Prezenta hidratilor de carbon intr-un aliment intr-o cantitate mai mare de 10% intarzie sau anuleaza descompunerea proteica, determina o economie de proteina (“protein sporing”). In aceste cazuri alterarea alimentului va avea caracter fermentativ cu formare de acizi ce coboara pH-ul alimentului pana la valori inhibitoare pentru microorganismele proteolitice. Se produce o stabilizare a microflorei din produs ca la branzeturile fermentate sau salamurile crud uscate. Temperatura alimentului influenteaza activitatea metabolica a microorganismelor.La temperaturi mai mari de >220C microorganismele desfasoara o activitate dominant glicolitica, pe cand la temperaturi in jur de 120C activitatea dominanta este de proteoliza a aminoacizilor.. Prezenta vitaminelor in alimente in special a celor de complexul B este necesara pentru dezvoltarea unor microorganisme. Ele reprezinta factori de crestere. Prezenta sau absenta vitaminelor determina profilul microbian ce se dezvolta in aliment.In fructele lipsite de vitaminele din complexul B, se vor dezvolta la inceput numai levuri 25

si mucegaiuri capabile sa sintetizeze asemenea vitamine.In salamurile crude, ca si in alte preparate in care exista vitamina B se vor dezvolta prioritar lactobacilii. Toate alimentele contin saruri minerale suficiente pentru multiplicarea microorganismelor. In substraturile lipsite complet de saruri minerale, microorganismele nu se pot dezvolta. S-a observat ca unele sucuri din fructe complet demineralizate prin schimburi de ioni rezista mai mult la atacul levurilor.

I.2. Compusi naturali antimicrobieni si structurile de protectie ale alimentelor Alimentele contin in mod natural o serie de compusi cu proprietati antimicrobiene (bacteriostatice sau bactericide).Acesti compusi au un spectru de actiune asupra tuturor, microorganismelor sau numai asupra unor categorii de organisme (gram pozitiv, gram negativ, fungi sau drojdii). Compusi antimicrobieni din produsele de origine animala Ouale contin mai multe proteine cu efect inhibant, c ele mai multe se gasesc in albus. In galbenus se gaseste o imunoglobina. Proteinele cu efect bacteriostatic din albus sunt: lizozimul (enzima litica, activa fata de bacteriile gram pozitive), avidina (glicoproteina care se combina cu biotina pe care o face indisponibila, conferind un efect bacteristatic), ovotransferina sau conalbumina (glicoproteina al carei efect bacteriostatic este determinat de capacitatea de a lega ionii de fier). Imunoglobulina din galbenus, contine cateva clase de anticorpi ce au proprietatea de a inhiba cresterea microorganismelor prin reactii de precipitare. Laptele contine o serie de compusi cu efect antimicrobian: sistemul lactoperoxidazic alcatuit din lactoperoxidaza, tiocianat si peroxid de hidrogen. Lactoperoxidaza este o enzima abundenta in lapte, rezista la 26

pH-ul acid=3 din sucul gastric si partial la temperatura de 71,70C timp de 15 secunde (Directiva Consiliului Europei prevede ca laptele trebuie pasteurizat la 71,70C timp de minimum 15 secunde). Tiocianatul este un compus natural al laptelui.Peroxidul de hidrogen provine din actiunea bacteriilor lactice (lactobacili, streptococi) si se gaseste in cantitati mici. Lactoperoxidaza oxideaza tiocianatii. Produsii intermediari de oxidare confera efectul antimicrobian al sistemului. Oxidarea gruparilor tiolice (-SH) ale enzimelor si proteinelor are importanta cruciala in efectul bacteriostatic si/sau bactericid al sistemului. Efectul sistemului lactoperoxidazic (L.P.) asupra bacteriilor poate fi reversibil sau ireversibil.Multe bacterii gram pozitive (streptococi, lactobacili) sunt inhibate de sistemul LP:capacitatea de a se recupera in urma inhibarii depinde de conditiile de mediu (pH, temperatura) si de tulpina. Bacteriile gram negative (E.coli, Salmonella, Listeria, Campylobacter) sunt distruse de sistemul LP. Lactoferina este o proteina din grupa transferinelor capabila sa lege ionii de fier.Este secretata de glanda mamara si are rol antimicrobian.Acest efect se datoreaza blocarii fierului ceea ce il face indisponibil bacteriilor, cat si modificarii permeabilitatii membranei bacteriilor gram negative.Laptele mai contine si lizozim. Carnea contine si ea o serie de compusi cu efect inhibitor: - acidul lactic acumulat dupa taierea animalelor are efect inhibant prin pH-ul scazut imprimat mediului (dupa moartea animalului are loc o activitate glicolitica anaeroba cu formare de acid piruvic, care este transformat in acid lactic). In prezenta acidului lactic, carnea manifesta o rigiditate (rigor mortis). Pe durata acestei stari carnea este protejata de actiunea microorganismelor. Continutul sangelui in properdina, hematina, complement, diversi anticorpi confera carnii reduse proprietati bacteriostatice. Multe din aceste substante antimicrobiene sunt termolabile, deci se inactiveaza in urma tratamentelor termice sau 27

odata cu prelungirea termenului de stocare a alimentelor. De aceea, importanta acestor substante ca factori limitatori a proliferarii microbiene este redusa si de scurta durata, iar la alimentele intens poluate este nesesizabil. Compusii antimicrobieni din plante Plantele contin o gama variata de compusi cu actiune antimicrobiana.Se apreciaza ca exista aproximativ 14000 de plante cu potential de a produce compusi antimicrobieni. Astfel: ovazul produce avecina. Avecinele sunt un grup de sopanine triterpenoidice ce confera plantei rezistenta la mucegai. Mandarinul si grapefruitul produc flavone cu proprietati fungistatice. Cartoful produce solanina, iar planta de tomate produce alfa-tomatina-saponina, steroida ce o protejeaza fata de fungii patogeni. Plantele aromatice condimentare contin de asemenea compusi cu proprietati antimicrobiene. In tabelul Nr. 3 prezentam cativa compusi vegetali cu activitate antimicrobiana. Tabelul Nr.3 (dupa Nicolau 2006)

Compusi vegetali cu activitate antimicrobiana Compusul

Planta

Aldehida cinamica

Scortisoara

Acid cafeic

Compusul

Planta

Carvacro

Chimion

Cafea

Eugenol

Cuisoare

Acid siringic

Mustar

Linalol

Citrice

Alicina

Usturoi

Lupulon

Hamei

Cafeina

Cafea

Mentol

Menta

Catehine

Ceai

Timol

Cimbru, Oregano

Cumarina

Cumina

Vanilina

Vanilie

28

Ardeiul iute contine capsicidina cu proprietati antimicrobiene.Usturoiul prezinta actiune antibacteriana si antifungica datorita alcinei, cu activitate oxidativa si reactivitate fata de gruparile tiolice.Ceaiul (Camellia sinesis) prezinta in vitro proprietati antibacteriene si antivirale datorate catehinelor si polifenolilor. Polifenolii din ceai inhiba cresterea si aderenta lui Porphyromonas gingivalis la celulele epiteliale din cavitatea bucala. Substantele active din citrice si plantele aromate (cimbru, busuioc, menta, ceapa, cuisoare) intarzie cresterea lui S.aureus, bacteria cea mai utilizata in studiile de activitate antimicrobiana a uleiurilor esentiale.C.botulinum, C.sporagenes si C.perfringens sunt inhibate de uleiurile esentiale din usturoi, ceapa, cimbru, scortisoara, piper negru si ardei iute. Uleiul esential din menta prezinta o activitate antimicrobiana moderata fata de Listeria monocytogenes in timp ce uleiurile esentiale din scortisoara, cuisoare, cimbru prezinta un efect intens. Cresterea salmonelelor este inhibata de uleiurile esentiale din busuioc, cimbru, dafin, coriandru, citrice, migdale, cuisoare, scortisoara si piper. Efectul antimicrobian al comdimentelor si plantelor aromatice, se apreciaza pe baza concentratiei minime (CIM) fata de un microorganism si este greu de cuantificat deoarece: -concentratiile de condimente variaza de la un aliment la altul -eficienta condimentelor (substantele lor active), variaza in functie de compozitia alimentului in care au fost adaugate. De exemplu, in laborator, pe mediile de cultura in care s-a adaugat ulei esential de menta, cresterea S.enteridis si a Listeriei monocytogenes a fost inhibata, iar in salata tzatziki (pH 4, 2), pate (pH 6) si salata de icre (pH 5) la care s-a adaugat ulei esential de menta efectul inhibant s-a micsorat semnificativ. O situatie asemanatoare s-a constatat si la uleiul esential de busuioc si sosul de carne fata de S.typhymurium.In general condimentele manifesta o eficienta mai redusa in alimente 29

decat in mediile de cultura, iar extractele lor sunt mai putin inhibitorii decat ele insele deoarece substantele volatile nu se mai elibereaza (Jai 1992). Bacteriile gram pozitive sunt mai sensibile la actiunea compusilor antimicrobieni din alimente decat bacteriile gram negative. Fungii sunt mai sensibili decat bacteriile gram negative. Compusi cu efect antimicrobian produsi de microorganisme Microorganismle pot sintetiza o serie de compusi cu proprietati antimicrobiene.Printre acesti compusi se numara: -acizii organici: acidul lactic si acidul acetic produsi prin fermentatia lactica de culturile starter utilizate la fabricarea branzeturilor si a salamurilor crud uscate.Acesti acizi determina prin scaderea pH-ului produselor respective, inhibarea bacteriilor coliforme, a salmonelelor, listeriilor, stafilococilor si a clostridiilor. Eficienta acestei inhibari depinde de tipul de microorganisme, nivel de contaminare, viteza de fermentare si durata procesului.Adaugarea unei cantitati de zahar produce cresterea cantitatii de acizi formata. Acizii organici distrug membrana celulara si inactiveaza enzimele.Deoarece acizii organici nu se gasesc in forma disociata in mediile de cultura, pentru aprecierea cantitatii de acizi formati de culturile lactice se recomanda determinarea aciditatii titrabile si nu a pH-ului. -diacetilul (2, 3 butan dioda) si formele sale reduse (acetoina si 2, 3 butan diolul) sunt produsi ai metabolismului glucidic.Valoarea optima a pH-ului pentru producerea de diacetil este 4, 5-5, 5.Diacetilul actioneaza inhibitor la concentratii ridicate mai puternic asupra bacteriilor gram negative drojdiilor si a mucegaiurilor. -ruterina (3-hidroxipropionaldehida) este produsa de lactobacilii heterofermentativi in metabolizarea anaeroba a glicerolului sau gliceraldehidei . Prezinta un spectru larg antimicrobian (levuri, mucegaiuri, protozoare, bacterii gram pozitive si gram negative). 30

-antibioticele sunt metaboliti secundari produsi de microorganisme cu proprietati bacteriostatice si/sau bactericide fata de altele decat cele ce i-au produs.Unele mucegaiuri din genul Penicillium produc peniciline, unele mucegaiuri din genul Cephalosporium-cefalosporine, bacteriile din genul Streptomyces produc streptomicine, kanamicine, neomicine si tetracicline iar bacteriile din genul Bacillus produc bacitrocina, polimixina. Toxicitatea antibioticelor este selectiva datorita faptului ca acestea actioneaza asupra unor structuri specifice procariotelor sau eucariotelor.A se vedea tabelul Nr.4. Tabelul Nr.4

Clase de antibiotice si categorii de celule tinta (Stanier, 1977) Clasa de Antibiotice

Mod de actiune

Activitate manifestata fata de procariote

Peniciline

Blocheaza sinteza peptidoglicanului constituent al peretelui celular

+

Antibiotice polienice

Se combina cu sterolii din membrane celulara afectandu-i permeabilitatea

-

Glutaramide

Blocheaza sinteza proteinelor la nivelul ribozomilor 80 S

Aminoglicozide, Blocheaza sinteza tetracycline, proteinelor la nivelul macrolide, ribozomilor 80 S cloramfenicol 31

eucariote -

+

-

+

+

-

-bacteriocinele sunt substante de natura proteica si spectru mai larg sau mai ingust, in functie de structura lor chimica.Exista numeroase bacteriocine ca de exemplu nizina, pediocina, enterocina, lactacina. -toxinele Killer sunt substante de natura proteica produse de drojdii cu spectru antifungic ingust, actioneaza tot asupra drojdiilor, chiar asupra speciilor aceluiasi gen.Toxinele produc ruperea peretelui celulelor de natura gluconica, intr-un interval de pH foarte ingust 4, 6-4, 8, cu pierderea ionilor din celula si in final moartea celulelor. -etanolul este un produs final al glicolizei, are efect inhibitor pentru toate microorganismele, prin afectarea structurii membranei celulare. Structurile de protectie a alimentelor Dezvoltarea si multiplicarea microorganismelor este influentata si de structura fizica si biologica a alimentelor:starea lichida sau congelata a apei din aliment, distributia fazei apoase in emulsii, prezenta unor bariere biologice. Substraturile lichide cu apa activa 0, 75-0, 62 (siropuri de zahar) permit dezvoltarea levurilor, dar acestea nu se pot dezvolta in produse solide cu aceasi valoare a apei active.Aceste produse vor fi alterate de fungi, deci pentru conservarea acestora se impune crearea unui mediu anaerob. Invelisurile naturale ale structurilor morfologice ale plantelor si animalelor constituie o bariera in calea dezvoltarii microorganismelor.Intre aceste structuri se numara invelisul semintelor (testa), coaja nucilor si a alunelor, coaja fructelor si a unor legume. Coaja si membrana cochiliera la oua, pielea la carcasele de pasari si solzii la peste nu permit patrunderea microorganismelor in straturile profunde.Aceste structuri au insa si puncte slabe, fisuri (stomate in cuticula fructelor si legumelor, pori in coaja oualelor) prin care microorganismele pot patrunde in interiorul elementelor protejate.Structurile de protectie pot fi 32

deteriorate in timpul recoltarii, transportului sau depozitarii lor, ceea ce faciliteaza patrunderea microorganismelor. Pe langa aceasta microorganismele poseda sisteme enzimatice capabile sa penetreze aceste bariere naturale. Carnea in carcasa, refrigerata, se altereaza intr-un timp mai indelungat decat aceeasi carne taiata in piese sau tocata.Cu cat gradul de maruntire este mai mare, cu atat vor aparea mai repede fenomenele de alterare microbiana.In carcasa tesutul muscular este protejat de fascii, iar miofibrelele, sunt adapostite in sarcolema lor.In conditiile de igiena fasciile se zvanta si formeaza la suprafata carcaselor o pelicula uscata cu activitatea apei scazuta, ce are rol protector.Aceasta cu atat mai mult cu cat alterarea carnii refrigerate este produsa de bacterii gram negative care nu se dezvolta la valori mici ale apei active. La carnea transata, tocata, dispare integritatea fasciilor a sarcolemei, suprafata de actiune a bacteriilor creste, iar o parte din sucul interfibrilar devine accesibil direct microflorei de putrefactie, ceea ce explica alterarea mai rapida. I.3 Activitatea apei Apa este utilizata de microorganisme ca solvent pentru nutritienti, ceea ce permite transportul lor in citoplasma si ca agent chimic in reactiile metabolice. Numeroase molecule si macromolecule prezente in alimente poseda grupari functionale (-OH, -COOH, -NH2 si –SH) cu afinitate pentru apa pe care o fixeaza prin legaturi intermoleculare. Moleculele de apa fixate prin legaturi chimice nu vor fi disponibile pentru metabolismul celulelor microbiene din alimente. Spre deosebire de umiditate, care reprezinta continutul procentual de apa al unui mediu, aliment, activitatea apei este o masura a cantitatii de apa libera din acel mediu, aliment. 33

Pentru a evalua dezvoltarea microorganismelor sau activitatea enzimelor este necesar sa se cunoasca valoarea activitatii apei, si nu a umiditatii. Disponibilitatea apei dintr-un mediu de cultura, aliment pentru transferul de substante si reactii chimice este exprimat prin activitatea apei (aw).Acest parametru ia valori de la 0 la 1 si se poate calcula dupa formula:raportul dintre presiunea de vapori a solutiei (p) si presiunea de vapori a apei pure (po) p aw = po Activitatea apei este corelata cu umiditatea relativa a aerului, cu concentratia solvatilor, cu continutul de apa si temperatura produsului. Membrana celulara este semipermeabila, fapt ce permite procese de osmoza (difuzia unui solvent dintr-o solutie mai diluata spre una mai concentrata pana la izotonie). Cand celulele microorganismelor sunt plasate in medii hipotonice (presiune osmotica scazuta, bogate in apa libera), apa patrunde in celula determinand fenomenul de turgescenta (marirea volumului celular).Daca celulele microorganismelor sunt plasate in medii hipertonice (medii cu presiune osmotica ridicata, cu continut scazut de apa libera), apa iese din celula determinand fenomenul de plasmoliza (micsorarea volumului celular). Microorganismele se comporta diferit fata de activitatea apei.Majoritatea microorganismelor se multiplica rapid la valori ale apei active de 0, 99-0, 98.Sub 0, 95 valoare apa activa, bacteriile gram negative scad ca numar si devin dominante bacteriile gram pozitive. La valori ale apei active mai mici de 0, 88 dezvoltarea bacteriilor si a majoritatii levurilor este practic oprita.Se mai dezvolta doar mucegaiurile.Nu s-a observat producerea de aflatoxine in substraturi cu valori ale apei active mai mici de 0, 83. 34

Microorganismele care se pot multiplica in produse cu valori ale apei active sub 0, 90 se pot clasifica astfel: -halofile:cele adaptate la concentratii mari de NaCl.Ele pot creste pana la valori ale activitatii apei de 0, 75. -osmofile:cele adaptate la concentratii mari de glucide -xerofile:cele adaptate sa se dezvolte in medii cu un continut scazut de apa libera. In tabelul Nr.5 se prezinta valorile activitatii apei la care se pot dezvolta diverse microorganisme, dupa Jay (1992) citat de Anca Nicolau (2006) Valorile din tabel sunt orientative, ele fiind dependente si de alti factori ca de exemplu: -domeniul de apa activa in care se pot multiplica microorganismele este mai larg la temperatura optima de dezvoltare -prezenta nutrientilor in cantitati optime dezvoltarii, largeste domeniul de apa activa in care microorganismele se pot multiplica -in conditii de temperatura si pH nefavorabile dezvoltarii microorganismelor, acestea au nevoi de cantitati sporite de apa libera -natura substantelor ce determina scaderea apei active influenteaza valoarea minima a acestui parametru pentru cresterea microorganismelor. In tabelul Nr.6 prezentam dupa Nicolau (2006) valorile aproximative ale apei libere din cateva produse alimentare. Proprietatea inhibitoare a valorii reduse a apei libere din alimente asupra inmultirii microorganismelor este folosita in practica de productie pentru stabilizarea microbiana a unor produse alimentare, in vederea conservarii lor pe perioade lungi de timp.Reducerea continutului de apa libera se poate realiza prin:sarare (uscata si umeda), adaugare de siropuri de zahar, uscare (la soare, cu aer cald, prin pulverizare, etc), liofilizare, concentrare. 35

Tabelul Nr.5

Valori ale activitatii apei la care se pot dezvolta microorganismele Microorganismul

aw

Bacterii

> 0, 9

Clostridium botulinum Pseudomonas spp Acinetobacter spp Escherichia coli Enterobacter aerogenes Vibrio parahaemolyticus Bacillus subtilis Staphyloccocus aureus Holobacterium spp.

0, 97 0, 97 0, 96 0, 95 0, 95 0, 94 0, 90 0, 86 0, 75

Drojdii

> 0, 87

Candida utilis Candida scotii Saccharomyces cerevisiae Rhodotorula Trichosporon pullulans Zygosachharomyces rouxii

0, 94 0, 92 0, 90-0, 94 0, 90 0, 61 0, 62

Mucegaiuri Botrytis cinerea Rhizopus Fusarium Mucor Penicillium expansum Alternaria citri Aspergillus flavus Aspergillus glaucus Xeromyces bisporus

> 0, 7 0, 93 0, 93 0, 90 0-0, 9 0, 85 0, 84 0, 78 0, 70 0, 61 36

Tabelul nr. 6

Valoarea aproximativa a activitatii apei in cateva produse alimentare Aliment

aw

Aliment

Carne de vita 0,990-0,980

Rosii

aw 0,991

Carne de porc 0,990

Mere

0,980

Peste

0,994-0,900

Cirese

0,997

Produse din carne uscate

0,995-0,850

Struguri

0, 986-0,963

Lapte

0,095

Lamai

0,984

Morcovi

0,989-0,983

Castraveti

0,998-0,983

Pepeni galbeni 0,991-0,988 Piersici

0,985

Ciuperci

0,995-0,989

Dulceata

0,800-0,750

Cartofi

0,985

Cereale

0,700

I.4 Aciditatea si PH-ul Aciditatea unui mediu de cultura sau a unui aliment este apreciata de cele mai multe ori prin determinarea valorii pHului si nu prin masurarea ei. In microbiologie, valoarea pH-ului nu este intotdeauna suficienta pentru a defini conditiile fiziologice ale mediului, caci proprietatile intrinsece ale moleculelor acizilor prezenti pot influenta direct microorganismele din mediu. 37

Acizii de origine vegetala (citric, tartric si malic), nu au proprietati antimicrobiene intrinsece, pe cand altii de origine microorganica (lactic, acetic) au aemenea proprietati destul de pronuntate. Ph-ul se defineste drept logaritmul negativ al concentratiei ionilor sau protonilor de hidrogen.

pH = -log10 (H+) Aciditatea titrabila este cantitatea de solutie 0, 1 N de NaOH necesara pentru a neutraliza o solutie, raportata la suta. Acizii foarte puternici se disociaza aproape in intregime in solutii ceea ce explica faptul ca ei coboara mai mult pH-ul unei solutii fata de acizii slabi. Microorganismele dintr-un mediu acid sunt afectate pe de o parte de ionii liberi de hidrogen (H+), adica de pH, iar pe de alta parte de concentratia acizilor slabi nedisociati prezenti in mediu, adica de aciditate.Acizii slabi( acetic, lactic) sunt metabolizati in interiorul celulelor microbiene, punand in libertate ioni de hidrogen, ce determina acidifierea interiorului celulei microbiene, inhibarea metabolismului si moartea celulelor.Alti acizi nu sunt metabolizati de celule si nu pot determina acidifierea continutului celular. Valoarea pH-ului citoplasmei este in mod normal 7-7, 2 atat la procariote cat si la eucariote.Celula microbiana are capacitatea de a-si regla pH-ul intern. Microorganismele se dezvolta intr-un domeniu de pH delimitat de valori maxime si minime, dar prefera anumite valori optime. Dupa datele din literatura de specialitate prezentam in tabelul nr.7 valorile de pH la care se pot dezvolta unele microorganism din alimente 38

Tabelul Nr.7

Valorile de pH la care se pot dezvolta unele microorganisme din alimente Microorganism

pH minim

maxim

optim

Mucegaiuri

1, 5- 3, 5

8-11

4, 5-6, 8

Drojdii

1, 5-3, 5

8-8, 5

4, 5-6, 5

Bacterii

4, 5

11

6, 5-7, 5

Zymomonas lindneri

3, 5

7, 5

5, 5-6, 0

Staphylococcus aureus

4, 2

9, 3

7, 0-7, 5

Escherichia coli

4, 4

9, 0

6, 0-7, 0

Erviwinia carotovora

5, 6

9, 3

7, 1

Streptococcus pneumonia

6, 5

8, 8

7, 8

Nitrobacter sp.

6, 6

10

7, 6-8, 6

Majoritatea bacteriilor se dezvolta in medii cu pH cuprins intre 4, 5-11 dar prefera mediile cu pH intre 6, 5-7, 5.Drojdiile se dezvolta in intervalul de pH 1, 5-1, 8 iar mucegaiurile 1, 511, pH-ul optim pentru ambele categorii fiind 4, 5-6, 5. In functie de valorile pH-ului la care se pot dezvolta microorganismele se clasifica in: -acidofile-se dezvolta optim la pH-uri mai mici de 3 -acidotolerante-se pot dezvolta la pH-uri mai scazute de 4 cu optim la 5, 5-6, 5 -alcalotolerante-se pot dezvolta la pH-uri mai mici de 9 cu optim 6, 5-7, 5 -alcalofile-se pot dezvolta la valori de pH peste 10 cu optim 11 39

Limitele de pH in care se dezvolta microorganismele, prezentate de literatura de specialitate nu trebuie considerate ca valori absolute, deoarece ele depind si de alti factori precum:natura acidului ce determina pH-ul, temperatura mediului, starea celulelor.prezenta in mediu a anumitor nutrienti in anumite concentratii. In tabelul Nr.8 prezentam valorile pH-ului din unele alimente dupa Anca Nicolau (2006) Tabelul Nr.8

Valorile pH-ului din unele alimente Aliment Fructe Mere Banane Smochine Prune Pepene rosu Pepene galben Struguri Portocale(suc) Grapfruit (suc)

pH

Aliment Legume Fasole Varza verde Morcovi Conopida Telina Ceapa Cartofi Tomate Spanac

2, 9-3, 3 4, 5-4, 7 4, 6 2, 8-4, 6 5, 2-5, 6 6, 3-6, 7 3, 4-4, 5 3 3, 4-4, 5

pH 4, 6-6, 5 5, 4-6 4, 9-5, 2 5, 6 5, 7-6 5, 3-5, 8 5, 3-5, 6 4, 2-4, 3 5, 5-6

Produse lactate Peste si fructe de mare Unt Lapte Smantana Branza Chedar Carne Vita (tocata ) Vitel Pui

6, 1-6, 4 6, 3-6, 5 6, 5 4, 9/5, 9 5, 1-6, 2 6 6, 2-6, 4

Peste( cele mai multe specii) 6, 6-6, 8 Scoici 6, 5 Crab 7 Somon 6, 1-6, 3 Ton 5, 2-6, 1 Creveti 6, 8-7

40

Dezvoltarea microorganismelor este influentata de pH prin actiunea acestuia asupra: -mediului de cultura.Echilibrul ionic mai ales ai celor metalici (Mg, Zn) modifica disponibilitatea anumitor nutrienti din mediul de cultura. -permeabilitatii plasmalemei, care este afectata de variatia concentratiei de ioni de H+ si OH- din mediu, ceea ce afecteaza transportul de substante prin aceasta membrana. -activitatea metabolica, care este optima la un anumit pH si perturbata de variatiile de pH ale citoplasmei. In practica, prin scaderea pH-ului se asigura inhibarea dezvoltarii microorganismelor deci conservarea alimentelor . Acidifierea alimentelor se poate realize prin : -acidifiere naturala, cel mai ades fermentatia lactica, determinata de bacteria lactice ( Lactobacillus ) care se intalneste la fabricarea unor sortimente de branzeturi, la fabricarea preparatelor din carne asa-zise crud-uscate, la legumele murate. -acidifiere artificial prin adaugare de acizi organic ( acetic, lactic, citric, gluconic ) utilizati mai ales pentru a scadea PH-ul sub 4, 6 in vederea prevenirii germinarii sporilor de C. Botilinum si a aplicarii unor tratamente termice mai moderate. -acidifierea mixta, care combina efectul aciditatii rezultat dijn fermentatii cu actiunea unui acid adaugat in aliment. I.5 Potentialul de oxido-reducere Metabolismul celulelor microbiene presupune reactii de degradare a substratului-catabolism-purtatoare de energie si reactii de sinteza a materiei vii-reactii anabolice-consumatoare de energie.Aceste reactii au la baza reactii enzimatice, determinate de caracteristicile fizico-chimice ale mediului, printre care si potentialul oxido-reducator. 41

Potentialul de oxido-reducere a unui substrat abreviat POR, O/R sau Eh poate fi definit prin usurinta cu care acesta pierde sau castiga electroni.Atunci cand electronii sunt transferati de la un compus (agent reducator) la altul (agent oxidant) intre cei doi compusi se creeaza o diferenta de potential electric, ce poate fi masurata:electrometric (exprimata in V) si colorimetric. Potentialul oxido-reducator al unui mediu dat reprezinta logaritmul cu semn schimbat al concentratiei moleculelor de hidrogen (tensiune de hidrogen) Eh = -log (H2) Intr-un mediu cu un anumit pH, care contine produsi oxidanti (PO) si produsi reducatori (PR) valoarea raportului PO/PR se poate caracteriza prin notiunea de Eh, care exprima tensiunea hidrogenului din mediu si oglindeste puterea si intensitatea sistemului reducator. Potentialul oxido-reducator al unui mediu este determinat de: -potentialul oxido-reducator al componentelor mediului -rezistenta mediului la schimbarile de potential -tensiunea de oxigen exercitata de atmosfera (aer) asupra mediului -accesul aerului in mediu Dupa potentialul redox critic necesar multiplicarii si activitatii metabolice, microorganismele se impart in aerobe, anaerobe si facultativ anaerobe. Alimentele contin anumite substante cu capacitate reducatoare cum sunt grupele mercapto-din proteine, acidul ascorbic, unii cationi si glucide reducatoare.Datorita compozitiei lor chimice, a pH-ului, a modului de preparare, alimentele au potential oxido-reducator diferit, ceea ce influenteaza spectrul microflorei care se poate dezvolta in ele. Alimentele umede si compacte, precum carnea si laptele, sunt medii reducatoare (cu potential de oxido-reducere de 42

250…-200 m.V).In profunzime, ele sunt favorabile dezvoltarii microorganismelor acidifiante (bacterii lactice, enterobacterii) sau a celor de putrefactie (clostridii).In schimb, la suprafata, prezenta oxigenului gazos asigura existenta unui potential de oxido-reducere pozitiv si permite dezvoltarea bacteriilor aerobe mezofile sau psihotrofe. Produsele vegetale proaspete, integre, sunt vii si respira datorita circulatiei aerului in tesuturile lor (prin intermediul stomatelor si parenchimului lacunar).Potentialul lor de oxidoreducere este pozitiv, ceea ce permite dezvoltarea mucegaiurilor in cazul fructelor si legumelor, sau a bacteriilor aerobe, in cazul legumelor.Cand aceste produse sunt zdrobite, presate pentru a se obtine piureuri sau sucuri, ori cand sunt tratate termic se produce o dezaerare, incat mediile respective capata caracter reducator.In mediile rezultate din fructe se dezvolta, in aceste conditii levurile fermentative, iar in cele de legume bacteriile lactice. Produsele sub forma de pulbere (fainurile de cereale, praful de oua) in functie de apa libera vor favoriza dezvoltarea mucegaiurilor si/sau a bacteriilor aerobe. Pe baza acestor date specialistii din industria alimentara aplica o serie de masuri pentru a impiedica dezvoltarea microorganismelor si de a prelungi durata de pastrare a alimentelor.Aceste masuri constau in: -modificarea atmosferei din jurul unui produs plasat intrun ambalaj (ambalare in atmosfera modificata, ambalare in atmosfera controlata, ambalare in vacum) -adaos de substante cu caracter antioxidant -adaos de enzime (oxidaze):catalaza, peroxidaza.

43

Capitolul II –Factorii extrinseci

Factorii extrinseci sunt reprezentati de parametrii care caracterizeaza mediul ambiant in care are loc dezvoltarea microorganismelor. Factorii extrinseci pot fi de natura fizica (temperatura, umiditate, continutul de gaze, radiatiile, presiunea), chimica (substantele chimice adaugate) si mecanici (agitarea, ultrasonarea). Dupa alti autori (Barzoi 1985) acesti factori se pot clasifica in doua grupe: -factori de prelucrare (tratarea termica, iradierea, substante de conservare) -factori extrinseci (temperatura de depozitare, umiditatea aerului din spatiul de depozitare, presiunea gazelor din spatiul de depozitare) Factorii de prelucrare sunt acei factori care intervin in procesul de prelucrare al alimentelor, care pot contamina suplimentar alimentele sau pot inhiba sau distruge partial sau integral populatia microbiana prezenta in aliment. Uneori prelucrarea schimba compozitia chimica a alimentelor, ceea ce influenteaza profilul microflorei contaminate. Am preferat abordarea clasificarii factorilor extrinseci dupa natura lor:fizica, chimica si mecanica. II.1.Factori fizici II.1.1.Temperatura Clasificarea microorganismelor in functie de temperatura de dezvoltare Fiecare specie sau tulpina bacteriana se poate multiplica numai in anumite limite de temperatura, intre ele situandu-se temperatura optima de dezvoltare, adica temperatura la care 44

timpul/generatie este cel mai mic. Pe baza temperaturilor minime, maxime si optime de inmultire, microorganismele se pot clasifica in cinci grupe fiziologice, dupa cum se vede in tabelul alaturat. Clasificarea microorganismelor dupa temperatura de Grupa termica de microorganisme

Temperatura de inmultire 0C minima

optima

maxima

Termofile

40

45-55

60-80

Termotrofe (mezotermofile)

15

42-46

50

Mezofile Psihotrofe Psihrofile

5-10 -5 -15

30-38 25-30 10

45 30-35 15-20

multiplicare In esenta procesele metabolice ale microorganismelor sunt influentate in limite destul de stricte de temperatura, specifice fiecarui microorganism. Efectul temperaturii asupra dezvoltarii microorganismelor are la baza influenta pe care acest factor o exercita asupra: -starii de agregare a apei (marind sau micsorand disponibilitatea acesteia) -vitezei reactiilor enzimatice -plasticitatii membranei celulare si a citoplasmei -macromoleculelor (proteine, acizi nucleici) pe care le poate denatura. Adams si Mos (2000) considera drept limite de crestere pentru microorganisme -80C si 1000C. Se considera ca la temperaturi negative se evidentiaza mai ales activitati matabolice decat cresteri la bacterii.De exemplu, lipazele si proteazele extracelulare, considerate cele mai termostabile enzime sunt produse in cantitati apreciabile, timp de 21 zile, la temperaturi de -180C (Burgeois 1966). Microorganismele psihrofile, au dat nastere la numeroase discutii cu privire la limitele de temperatura la care se dezvolta.Sunt dificil de studiat, greu identificabile. 45

Se intalnesc in reuginile polare, se dezvolta la 00C in 1-2 saptamani si au optimul de crestere in jur de 100C. Psihotrofele sunt microorganismele cele mai raspandite in natura si au o semnificatie deosebita in procesele de alterare a alimentelor.Acest fapt se datoreaza regimului termic (4-80C), la care se pastreaza alimentele. Bacteriile psihotrofe apartin grupului de bacterii gram negative (Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes, Flavobacterium, Erwinia, Chormobacterim) dar si celor gram pozitive (Lactobacillus). Majoritatea drojdiilor si mucegaiurilor sunt psihotrofe. Se cunosc si specii de microorganisme patogene (Y.enterocolitica, C.botilinum tip E, L.monocytogenes, S. panama) cu pronuntat caracter psihotrof. In tabelul Nr.9 sunt prezentate temperaturile cardinale pentru dezvoltarea unor bacterii. Tabelul nr. 9

Temperaturile cardinale pentru dezvoltarea unor bacterii (Todar, 2004) Bacteria Listeria monocytogenes Vibrio marinus Pseudomonas maltophilia Thiobacillus novellus Staphylococcus aureus Escherichia coli Clostridium kluyveri Streptococcus pneumoniae Bacillus flavothermus Thermus aquaticus Methanococcus jannaschii Sulfolobus acidocaldarius Pyrobacterium brockii

Temperatura de dezvoltare, 0C minima optima maxima 1 4 4 5 10 10 19 25 30 40 60 70 80 46

30....37 15 35 25....30 30....37 37 35 37 60 70....72 85 75.....85 102....105

45 30 41 42 45 45 37 42 72 79 90 90 115

Adaptarea microorganismelor la temperatura si reactia celulara la stresul termic Starea de agregare a acizilor grasi din membrana celulara, influenteaza fluiditatea membranei celulare, ceea ce influenteaza si fiziologia celulei microbiene. Bacteriile psihotrofe sunt adapte la temperature scazute prin continutul ridicat de acizi grasi nesaturati din plasmalema.Unii psihrofili, in special cei din Antarctica contin anumiti acizi grasi nesaturati care nu se intalnesc la alte bacterii.Gradul de nesaturare al acizilor grasi se coreleaza cu temperatura de solidificare sau starea de tranzitie termica (temperatura la care lipidele se topesc sau solidifica).Acizii grasi nesaturati raman in stare lichida la temperatura scazuta, dar sunt denaturati la temperatura moderata.Psihotrofii au enzime care pot media reactii chimice cu viteze reduse, la temperaturi apropiate de 00C (Jai 1992;Anca Nicolau 2006). Bacteriile termofile contin in membrane acizi grasi nesaturati, care raman functionali la temperaturi ridicate, dar care pot solidifica la temperaturi moderate.Membranele bacteriilor hipertermofile nu contin acizi grasi nesaturati, ci subunitati repetitive de fitan (compus din clasa izoprenoidelor, cu cinci straturi de carbon ramificat, saturat).Mai mult, proteinele hipertermofilelor, cele structurale (ribozomale, proteine de transport, enzime) sunt foarte termostabile, datorita unor modificari a structurii primare, si a unui proces de deshidratare. Socurile reci si socurile termice subletale produc: -perturbari ale cresterii -sinteza de proteine ale socului termic (heat shock proteins) sau ale socului rece (cold shock proteins) -refaceri de straturi celulare deteriorate -dobandirea termotolerantei Inducerea sintezei proteinelor socului termic este produsa la 350C-450C la mezofile si la 600C la termofile.Proteinele de soc protejeaza proteinele functionale. Adaptarea la diferite temperaturi se produce atat la nivelul plasmalemei cat si la nivelul sistemelor enzimatice si de biosinteza a proteinelor. 47

Plasmalema, se compune dintr-un dublu strat fosfolipidic iar functionalitatea acestuia depinde de integritatea si fluiditatea ei. Exista diferente semnificative in functie de categoria bacteriilor (psihrofile, psihotrofe, termotrofe.etc.) in privinta procentelor de acizi grasi saturati, nesaturati, etc. Microorganismele termofile au enzime cu o termostabilitate superioara celor apartinand mezofilelor (malatdehidrogenaza si lactatdehidrogenaza). Lipazele psihotrofelor au o activitate mai mare la temperaturi scazute fata de mezofile. Aplicatiile si semnificatiile factorului temperatura in microbiologie Microbiologii se bazeaza pe influenta temperaturii in examenele microbiologice pentru a evalua numeric o specie microbiana.Termostatarea la anumite temperaturi a microorganismelor inoculate in placi cu medii de cultura adecvata permite izolarea si evoluarea numerica a unor microorganisme. Ce de exemplu:inocularile realizate din probele de apa pe mediul PCA (Plate Count Agar) evidentiaza psihotrofii, cand termostatarea placilor se realizeaza la 220C si mezofilii, cand termostatarea se realizeaza la 370C.Psihotrofele au temperatura maxima de dezvoltare de 150C, de aceea, cand se urmareste izolarea lor, temperatura de incubare a mediilor inoculate trebuie sa fie de 100C. -optimizarea proceselor biotehnologice.Cultivarea microorganismelor trebuie realizata la temperaturi optime, fie pentru obtinerea de biomasa, fie pentru obtinerea unor metaboliti valorosi. -pastrarea culturilor de microorganisme.Culturile pure de microorgansime sunt pastrate in conditii de refrigerare, congelare sau liofilizare. Durata de pastrare a culturilor in conditii de refrigerare este de 2-3 saptamani, in conditii de congelare de 2-3 luni iar sub forma liofilizata este practic nelimitata. In cazurile de congelare sau liofilizare se recomanda utili48

zarea de substante ca glucoza, zaharoza, deglicocolul, eritritolul sau polietilenglicolul pentru a mari gradul de supravietuire al celulelor. -sterilizarea mediilor de cultura, a sticlariei si ustensilelor de laborator.Sterilizarea mediilor de cultura se realizeaza cu caldura umeda, la 1210C timp de 20 minute.Sterilizarea sticlariei si ustensilelor de laborator se realizeaza cu aer uscat, prin mentinerea acestora la 1600C timp de 2 ore sau la 1800C timp de 1 ora. Aplicatiile si semnificatiile factorului temperatura in industria alimentara In industria alimentara specialistii utilizeaza temperaturile scazute si temperaturile ridicate pentru conservarea produselor alimentare . Racirea, refrigerarea si congelarea sunt metode de conservare ce utilizeaza temperaturile scazute, iar termizarea, pasteurizarea si sterilizarea metode ce utilizeaza temperaturile ridicate. Influenta temperaturilor de refrigerare asupra dezvoltarii microorganismelor. Refrigerarea este unul din cele mai raspandite mijloace de conservare a alimentelor.Prin refrigerare se intelege mentinerea alimentelor la temperaturi de la 00C pana la 40C. Cu cat temperatura este mai mica fata de cea optima, viteza de multiplicare a microorganismelor se reduce pana la oprire. Barzoi (1985), urmarind viteza de multiplicare pe carnea de vita, porc si pasare a diferitelor categorii de bacterii a observat ca timpul/generatie dupa o depozitare la 40C a fost de 8-9 ore pentru bacteriile aerobe mezofile, 6-11 ore pentru bacteriile psihotrofe, de 6-9 ore pentru Pseudomonas si de 1127 ore pentru Enterobacterii. O serie de factori influenteaza actiunea temperaturii de refrigerare asupra microorganismelor ce contamineaza alimentele:compozitie si numarul initial, Ph-ul, activitatea apei, umiditatea relativa a aerului din spatiul de depozitare, compozitia chimica a alimentului. 49

Eficacitatea refrigerarii asupra dezvoltarii bacteriilor contaminate este influentata in cel mai inalt grad de umiditatea relativa a atmosferei in care este depozitat alimentul.Valoarea mare a UR scade din eficienta temperaturii joase, pana aproape de anulare.O carne de vita in carcasa depozitata intr-un spatiu de refrigerare cu UR de 100% se va altera dupa 4 zile cand temperatura este de 40C si in 5 zile cand temperatura este de 00C. Aceasi carne depozitata intr-o atmosfera cu UR de 85% se va altera dupa 5 zile la 40C si abia dupa 30 zile la 00C (Barzoi 1985). Pe baza celor mentionate se poate afirma ca refrigerarea alimentelor si in special a carnii si preparatelor de carne, pentru a fi cat mai eficiente trebuie facuta in anumite conditii dintre care cele mai importante sunt:UR a aerului din spatiul de depozitare sa fie cat mai mica, iar suprafata carnii si preparatelor cat mai uscata. Prezenta umezelii pe suprafata lor ca urmare a lipsei de zvantare, ambalarii in folii de polietilena impermeabila pentru vaporii de apa, transpiratiei datorita trecerii bruste prin niveluri termice diferite sau excesul de umiditate a atmosferei din spatiul de depozitare, reduce pana la anulare eficienta refrigerarii prin aparitia alterarii superficiale. Aceasta se manifesta prin aparitia mucusului lipicios (mazga) la suprafata carnii sau preparatelor, a mirosului putrefactiv si descompunera straturilor superficiale. Compozitia chimica ca si alte proprietati ale alimentului influenteaza diferit microorganismele de specii diferite.In produsele lactate cu lapte, zahar, oua, amidon, cu un continut redus de sare si condimente si cu pH de cca 7, cum sunt cremele, inghetate, cocktail-urile cu lapte tinute la 70C, stafilococii nu incep multiplicarea in 5 zile.Daca produsele se pastreaza la 90C, stafilococii incep sa se multiplice dupa 4 zile, iar la 100C dupa 3 zile. In aceleasi conditii salmonelele nu se multiplica, din contra, numarul lor scade. Nivelul termic la care se depoziteaza un produs alimentar influenteaza categoria de microorganisme selectate.Astfel, in laptele crud depozitat la +100C, dupa cateva zile vor domina 50

streptococii lactici, in timp ce in cel depozitat la 00C se vor dezvolta si domina bacteriile gram negative psihotrofe generatoare de defecte organoleptice. Multiplicarea microorganismelor la temperaturi mai joase decat cele optime poate determina aparitia unor modificari morfologice si fiziologice, cum sunt : marimea celulei, formarea de filamente, dublarea peretelui celular, sintetizarea unor cantitati mari de pigmenti, ceea ce explica aparitia defectelor de culoare la alimentele refrigerate. Temperaturile joase pot modifica partial profilul metabolic al unor microorganisme. S-a observat ca unele tulpini de S.aureus coagulaza pozitiv, pastrate timp indelungat la temperaturi de refrigerare, nu mai elaboreaza plasma-coagulaza, chiar daca se paseaza de mai multe ori pe medii convenabile. S.aureus desi se multiplica la 8-100C nu elaboreaza enterotoxina decat la temperaturi mai mari de 180C;de asemenea, C.botulinum elaboreaza toxine la temperaturi mai mari decat cele minime de multiplicare. Microflora psihotrofa de pe alimente poate avea consecinte importante pentru biochimia procesului de alterare. De exemplu, la carnea pastrata la refrigerare, microorganismele psihotrofe si psihrofile micsoreaza aciditatea ei datorita proteolizei pe care o produc, in timp ce la temperaturile mai mari bacteriile sporogene si lactobacilii vor predomina si la inceput vor produce acid din hidrati de carbon disponibili. Schimbarile de temperatura pot influenta de asemenea activitatea metabolica a asociatiilor bacteriene de alterare. Evolutia lipolizei la temperaturi joase poate fi complet diferit de acela de la temperaturile inalte si se poate deduce ca asemenea efecte ar putea fi valabile si pentru alte procese. Majoritatea bacteriilor patogene fiind mezofile, nu se multiplica in alimentele refrigerate. Activitatea microorganismelor producatoare de toxiinfectii alimentare este stopata in conditii de refrigerare, asa cum se poate observa din fig.2. 51

Fig. 2. Temperaturile de inhibare a dezvoltarii unor microorganisme 52

Dupa cum rezulta din figura 2 temperaturile de inhibare a dezvoltarii microorganismelor generatoare de toxiinfectii alimentare sau de inhibare a toxinogenezei sunt urmatoarele: -S.aureus (toxinogeneza):100C -C.botulinum A si B (toxicogeneza): 100C -S.aureus (multiplicare):6, 70C -C.perfringens (multiplicare):6, 50C -Salmonella (multiplicare):5, 20C -C.botulinum E (toxinogeneza):3, 30C -Psihotrofii: Listeria monocytogenes, Yersenia enterocolitica, E.coli, Streptococcus:30C Refrigerarea asigura conservarea produselor alimentare pe perioade limitate de timp si opreste dezvoltarea germenilor patogeni, cu exceptie C.botulinum tip E si tip B neproteolitic, Y.enterocolitica si V.parahemoliticus.In general microflora saprofita de alterare se multiplica mai bine la temperaturi joase decat germenii patogeni pe care ii concureaza. In acest fel la majoritatea alimentelor mentinute la refrigerare vor aparea semne de alterare inainte ca numarul germenilor patogeni sau toxinele acestora sa atinga nivelele nocive pentru consumatori si deci, ele nu vor fi consumate.Exista si unele exceptii, in sensul ca lipsa alterarii nu este intotdeauna un criteriu sigur al lipsei de nocivitate a alimentului.Alimentele tratate termic, lipsite de microorganisme de alterare, daca inainte de refrigerare sufera un proces de contaminare cu germenii patogeni de pe utilaje, ambalaje, de la personal, pot deveni periculoase dupa o perioada de pastrare, la temperaturi de refrigerare.In asemenea produse, cand temperatura de refrigerare este catre limita ei superioara (70C) unii germeni patogeni cum sunt C.botulinum tip E, Y.enterocolitica se pot multiplica si elabora toxine la nivel nociv pentru consumator.De retinut ca temperatura optima de germinare a sporilor de C.botulinum tip E este de 90C. In carnea de mamifere ambalata in pachete vacuumate si pastrata la temperaturi de refrigerare, pericolul multiplicarii 53

speciei C.botulinum tip E este foarte redus sau nul, pe de o parte datorita frecventei lui reduse la asemenea carnuri, pe de alta parte din cauza inhibarii lui de catre flora saprofita contaminata.Riscul la aceste carnuri provine de la Y.enterocolitica germene patogen psihotrof, care se poate multiplica in carnurile pastrate mai mult timp la refrigerare. Refrigerarea nu asigura conservarea alimentelor decat un timp limitat deoarece chiar si la temperaturi apropiate de 00C, nu se asigura inhibarea multiplicarii tuturor categoriilor de microorganisme. Psihotrofele si psihrofilele se pot multiplica in conditii de refrigerare si pot produce alterarea. Din aceasta categorie fac parte numeroase specii din genurile: Pseudomonas, Alcaligenes, Lactobacillus, Moraxela, Acinetobacter, Corynebacterium, unele levuri si numeroase mucegaiuri ca de exemplu: Cladosporium, Sporotrichum, Penicillium, 0 Thaminidium care se pot dezvolta si la -5 C. Stabilitatea termenului de valabilitate pentru produsele refrigerate trebuie sa se bazeze pe aceste realitati, pentru a nu pune in pericol sanatatea publica. Influenta temperaturilor de congelare asupra microorganismelor: Congelarea alimentelor presupune introducerea si mentinerea lor la temperaturi sub -150C.La aceste temperaturi alimentele lichide sau fazele apoase din cele solide, isi schimba starea de agregare, devenind solide prin inghetarea apei.Alimentele se congeleaza si la temperaturi mai putin joase, intre -20C si -50C, dar in industria alimentara nu se aplica asemenea niveluri de temperaturi, deoarece prezinta o serie de inconveniente pentru aliment.I n tehnologia actuala se practica congelarea rapida in tunele la temperaturi sub -300C si apoi depozitarea intre -150C si -200C. In alimentele congelate, multiplicarea microorganismelor inceteaza. 54

Raspunsul microorganismelor la congelare este diferit.Unele mor in timpul congelarii, altele supravietuiesc fara vatamari, altele supravietuiesc, dar sufera unele vatamari.Altele rezista la congelare, dar devin sensibile in timpul depozitarii la temperaturi de congelare sau la decongelare. Atunci cand discutam despre rezistenta si sensibilitatea microorganismelor la congelare, trebuie sa realizam deosebirea intre capacitatea microorganismelor de a se inmulti si aceea de a supravietui la congelare.Rezistenta la congelare a microbilor are semnificatii in alterarea produselor dupa decongelare. Daca ne referim la microflora totala ce contamineaza in mod obisnuit carnea, procentul de distrugere al acesteia la congelare este de aproximariv 90%, 1 logaritm.Distrugerea microorganismelor are loc in toate cele trei faze (si trepte) ale procesului de congelare:in timpul congelarii, in timpul depozitarii la temperaturi de congelare si in timpul decongelarii. In principal distrugerea microorganismelor se realizeaza datorita a trei cauze: a)-socul termic (trecerea de la un nivel de temperatura la altul) b)-microleziunile mecanice, provocate de cristale de gheata ce apar in aliment ca urmare a inghetarii apei.Cristalele mari de gheata au un efect distructiv mai pronuntat decat cele mici.Marimea cristalelor depinde de modul in care se realizeaza congelarea.Cand congelarea se face brusc la temperature foarte joase (sub -300C), cristalele de gheata sunt foarte mici si nu lezioneaza celulele microbiene si desigur nici fibrele musculare.In acest caz distrugerea microorganismelor este redusa.In cazul congelarii lente, la temperaturi insuficient de joase (intre -30C si -100C) se formeaza cristale mari cu efecte distructive pronuntate. Trebuie mentionat ca in cazul carnii un asemenea procedeu de congelare nu este adecvat, deoarece se distrug si fibrele 55

musculare, din care la decongelare se va scurge sucul muscular in cantitate mare si odata cu el proteine, vitamine, saruri minerale, deci o reducere a valorii nutritive. c)-modificarile fizico-chimice din produsul supus congelarii, se pare ca au cea mai mare importanta in distrugerea microorganismelor.Ele pot fi asemanate cu o veritabila deshidratare.Constituentii membranelor celulare (protide, lipo-protide) sunt sensibile la variatia concentratiei solutiilor cu care sunt in contact. Maximum de distrugere microbiana se realizeaza in doua zone ale temperaturii de congelare: -zona intre -20C si -80C ce corespunde temperaturii optime de distrugere fizica datorita formarii cristalelor mari de gheata -zona intre -180C si -250C in care distrugerea este consecinta modificarilor fizico-chimice ale proteinelor. In conditiile de congelare numarul levurilor scade cu 28%, cel al bacteriilor de putrefactie cu 34% iar cel al enterobacteriilor cu 39%. Bacteriile gram negative (E.coli, Pseudomonas, Vibrio, Salmonella) sunt mai sensibile decat cele Gram pozitive. Majoritatea bacteriilor gram pozitive : Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus-sunt destul de rezistente la congelare si la depozitarea la temperaturi de congelare. Nici congelarea prelungita nu va elimina aceste bacterii din produs. Toxinele produse de C.botulinum si de S.aureus nu sunt afectate de congelare.Alimentele contaminate cu asemenea toxine, congelate si consumate dupa decongelare pot produce toxiinfectii alimentare. Multe enzime naturale sau de origine microbiana prezente in alimente raman active la temperaturile obisnuite de congelare si de depozitare la congelare, ceea ce limiteaza durata de conservare a alimentelor.Unele enzime pot fi active chiar si la -300C. 56

Multiplicarea microorganismelor in alimentele congelate in general este redusa, deoarece limita inferioara de temperaturi la care se mai pot multiplica putine specii bacteriene este de 150C.La -180C este oprita orice multiplicare bacteriana, iar la 400C a oricarei levuri sau mucegai. Multiplicarea microorganismelor dupa decongelarea alimentelor depinde de numarul si tipurile de microorganisme care au supravietuit congelarii, depozitarii si decongelarii, ca si de proprietatile alimentului. Intr-un aliment decongelat dupa o perioada de depozitare de mai multe luni, predomina bacteriile gram pozitive. La decongelarea carnurilor viteza aerului din spatiul de decongelare prezinta o importanta deosebita.De exemplu decongelarea pulpelor de porc in aer la 100C cu o miscare de 0, 25m/s nu permite o multiplicare semnificativa a bacteriilor de la suprafata, pe cand aceasi temperatura dar cu o miscare a aerului de 5, 5m/s determina o multiplicare intensa a bacteriilor de la suprafata (>1000 ori) pe durata decongelarii. Miscarea mai rapida a aerului in atmosfera de decongelare are un rol nefavorabil, contrar atmosferei in care se realizeaza congelarea.Cu cat viteza aerului din spatiul de decongelare este mai mare, cu atat suprafata alimentului va avea o temperatura egala cu aerul, deci convenabila multiplicarii microorganismelor. Folosirea pentru decongelare a temperaturilor mai mari de 200C-300C in scopul de a urgenta decongelarea este riscanta deoarece poate permite multiplicarea germenilor patogeni si aparitia de procese alterative. Pentru a reduce cel mai mult riscul multiplicarii germenilor patogeni si a celor de alterare, decongelarea trebuie sa se realizeze la temperaturi mai mici de 100C, in incaperi igienice, cu o circulatie minima a aerului de 0, 25-0, 5m/s. Influenta temperaturilor ridicate asupra microorganismelor: Utilizarea temperaturilor ridicate (temperaturi mai mari decat din mediul ambient) pentru conservarea alimentelor se 57

bazeaza pe efectul lor letal asupra microorganismelor.Tratamentele termice posibil de aplicat sunt urmatoarele:termizarea, pasteurizarea si sterilizarea. Termizarea este un tratament termic de scurta durata (15-20 sec) realizat la 630C-650C.Aplicata la lapte, termizarea are ca scop reducerea numarului de bacterii psihotrofe care s-au multiplicat in timpul pastrarii laptelui in conditii de refrigerare. Pasteurizarea este un tratament de incalzire a produselor timp de cateva minute la temperaturi ce nu depasesc 1000C cu scopul de a omori bacteriile alterative. In functie de temperatura la care se realizeaza pasteurizarea si de durata mentinerii la acea temperatura, exista mai multe regimuri de pasteurizare: -pasteurizare tip LTLT-temperatura scazuta timp lung 0 (63 C/30 minute) - pasteurizare tip HTST-temperatura ridicata timp scurt 0 (72 C/15 sec, 890C/ 1 sec, 900C/0, 5 sec, 1000C/0, 01 sec ). Sterilizarea este tratamentul termic realizat la temperaturi de peste 1000C care vizeaza omorarea tuturor microorganismelor indiferent de forma in care se afla si a virusurilor. Pentru alte categorii de alimente, rezultate echivalente pasteurizarii se pot obtine prin operatii ca afumarea, fierberea, prajirea, frigerea si coacerea. Distrugerea pe cale termica a microorganismelor se poate aprecia pe baza urmatorilor parametri : Timpul de distrugere termica(TDT)- timpul necesar pentru a omori un numar dat de microorganisme la o anumita temperatura. Valoarea D – timpul de reducere deci mala, adica timpul necesar pentru a distruge 90% dintr-o populatie.Valoarea D reflecta rezistenta unor microorganisme la o anumita temperatura. Valoarea F0 sau valoare de sterilizare a unui proces termic, reprezinta numarul de minute necesar pentru a distruge un numar specificat de spori la temperatura de 1210C cand 58

valoarea Z este egal cu 10.Aceasta valoare reprezinta efectul termic total al tratamentului termic de sterilzare, si furnizeaza informatii cu privire la rezistente relative a unor microorganisme la diferite temperaturi. Microorganismele prezinta o rezistenta diferita la temperatura ridicata.Cele mai sensibile sunt psihotrofele, urmate de mezofile si de cele termofile. Bacteriile gram pozitive sunt mai termorezistente decat cele gram negative.Drojdiile si fungii sunt sensibili la incalzire. Rezistenta la caldura a microorganismelor de alterare este similara cu cea a germenilor patogeni, si este conditionata de urmatorii factori : - factori dependenti de tipul de microorganisme :specie, tulpina, forma de existenta(vegetativa sau sporulata) - factori dependenti de conditiile in care au crescut multiplicat microorganismele inainte de tratamentul termic. - factori dependenti de mediul in care se realizeaza tratamentul termic(Ph, activitatea apei, diluant, sunstante protectoare). Nivelul tratamentului termic ce se aplica alimentelor depinde de starea sub care se prezinta alimentul, tratarea termica a lichidelor este mai eficace decat cea a solidelor. II.1.2. Umiditatea relativa a aerului Umiditatea relativa este marimea fizica care exprima procentual cantitatea de vapori din aer, si se poate determina cu ajutorul higrometrelor. Intre aer si un substrat au loc schimburi de apa, pana la stabilirea unui echilibru.Umezeala relativa a aerului influenteaza dezvoltarea microorganismelor, in special a celor de la suprafata substratului.Pentru o anumita temperatura si un anumit produs, la echilibru, exista o relatie intre continutul de apa al produsului si umezeala relativa a aerului.Cu alte cuvinte, daca U% a aerului este mai mare produsele aflate in atmosfera respectiva se hidrateaza(absorb apa), iar daca aceasta este re59

dusa, produsele se deshidrateaza.Variatia umiditatii aerului, detrmina variatia continutului de apa din produse, iar aceasta la randul ei determina variatia activitatii apei. Influenta apei absorbite asupra dezvoltarii microorganismelor Relatia dintre continutul de apa si activitatea apei dintrun produs nu este o relatie liniara.Nelinearitatea izotermei de sorbitie se traduce in fapt prin fazele succesive prin care trece un produs pe masura ce se hidrateaza.Cand activitatea apei are valori scazute, apa se gaseste fixata de moleculele substratului si nu este disponibila ca mediu de difuzie pentru reactiile in care intervine ca reactant.In partea mediana a curbei continutul de apa si activitatea apei cresc in paralel.La nivel molecular – in aceasta faza moleculele de apa se fixeaza in substraturi succesive peste monostratul constituit la inceputul hidratarii.Fixarea se realizeaza prin legaturi de hidrogen.In cea de a treia parte a curbei continutul de apa creste mai repede decat activitatea apei. Se considera ca in aceasta zona incepe sa existe apa care nu mai este strans legata de substrat, si in consecinta, devine disponibila pentru reactii chimice sau pentru microorganisme. Existenta apei libere este indispensabila dezvoltarii microorganismelor si, in consecinta, pe baza izotermei de sorbitie, este relativ simplu sa se stabileasca valorile continutului de apa de la care va incepe dezvoltarea lor.In fig. sunt prezentate zonele in care incepe dezvoltarea microorganismelor.Pe baza izotermelor de sorbitie, se pot stabili zone de hidratare in care apare riscul dezvoltarii microorganismelor, dar nu se pot oferi date referitoare la cinetica microbiana si la viteza de producere a alterarilor.La valori ridicate ale activitatii apei alterarile se produc mai rapid. Scaderea activitatii apei dintr-un produs diminueaza dezvoltarea microorganismelor prin : 60

- lungirea perioadei de latenta - scaderea vitezei de crestere in faza exponentiala - scaderea nivelului la care se atinge faza stationara de crestere. Un alt exemplu, in care se poate observa influenta umiditatii relative a aerului asupra dezvoltarii microorganismelor o constituie depozitarea carnii in conditii de refrigerare.Pentru aceeasi temperatura de depozitare, durata de pastrare a carnii, exprimate in zile, este mai lunga cu cat umiditatea relativa a mediului este mai scazuta si pentru aceeasi valoare a umiditatii, este mai lunga cu cat temperatura este mai scazuta. La temperaturi scazute, in aer uscat(umiditate mai mica de 85%) se pot dezvolta doar unele mucegaiuri apartinand genurilor Asprgillus, Penicillum, Thaminidium, Cladosporium si Sporatrichum. In practica tinand cont de semnificatia umiditatii relative a aerului asupra dezvoltarii microorganismelor, trebuie sa se asigure : - un aer cu o umiditate relativa ridicata in fermentatiile din biotehnologii pentru a se evita pierderile de apa din substrat, prin evaporare. - umiditati relative scazute ale aerului in depozitele de pastrare a produselor.Umiditatea relativa a aerului este dependenta de temperatura( cu cat temperatura este mai mare cu atat umiditatea relativa este mai scazuta si viceversa).Prin modificarea compozitiei aerului, a proportiilor se realizeaza conditii impropii cresterii microorganismelor. - valoarea activitatii apei, care nu se poate masura direct, se calculeaza prin intermediul umezelii relative a aerului. II.1.3 Presiunea Presiunile inalte sunt capabile sa inactiveze microorganismele si enzimele, astfel ca pot fi utilizate la conservarea unor produse alimentare supuse in mod normal la tratmentele termice. Incepand cu anul 1990 in Japonia s-au lansat o serie de 61

produse: iaurt cu fructe, jeleuri cu fructe, sosuri de fructe, dresinguri pentru salate, sucuri de fructe obtinute prin tehnologia presiunilor inalte. Alimentele sunt supuse la presiuni inalte prin comprimarea mediului care inconjoara produsul.Acest mediu realizeaza transmiterea presiunii de la dispozitivul de presurizat( vase cilindrice cu pereti grosi din otel ) la produsul aflat intr-un ambalaj flexibil. Efectul de inactivare al microorganismelor si al enzimelor, de catre presiunile inalte stimuleaza reactiile ce au ca rezultat o scadere a volumului, in timp ce reactiile ce presupun o crestere a volumului sunt intarziate. Presiunile inalte distrug structura tridimensionala a moleculelor mari sau a structurilor celulare (proteine, enzime poliglucide, ribozomi, membrane celulare), responsabile de schimburi functionale, pe cand moleculele mici (aminoacizii, vitaminele, componentele de aroma, colorantii), raman neafectate.Acestea din urma sunt responsabile de calitalile nutritionale si senzoriale. Principalele efecte produse de presiunile inalte sunt : - denaturarea macromoleculelor(proteice, poliglucidice) la 150 MPa se produce o depliere si o disociere a structurilor proteice. - inactivarea enzimelor - distrugerea formelor vegetative a microorganismelor, dar si a sporilor datorita leziunilor de la nivelul membranelor - modificarea propietatilor fizico-chimice ale apei - modificari in structurile cristaline ale unor compusi. Rezistenta microorganismelor la presiuni inalte este diferrita si variaza in functie de mai multi factori. Celule eucariote sunt mai sensibile decat celulele procariote. Drojdiile sunt cele mai sensibile microorganisme( un tratament cu 300-400 MPa timp de cateva minute, produce o reducere de 6 log a numarului lor). 62

Pa ( pascali ) este o unitate de masura pentru pesiune, din sistemul international de unitati de masura. 1 Pa =1 N ( newton ) /m2. M( mega) factor de multiplicare =106. Exista diferente in comportamentul bacteriilor la presiuni inalte, de aceea este indicat ca aceste tratamente sa fie asociate cu alte tehnici de conservare pentru a se obtine un nivel acceptabil de inactivare al alimentelor. S-au propus tratamente cu presiuni inalte – cicluri in care presiunile indicate alterneaza cu presiuni scazute- drept o metoda eficienta de inactivare a sporilor. Teoretic o presiune relative scazuta se utilizeaza pentru a induce germinarea sporurilor, apoi se aplica o presiune inalta pentru a omori celulele germinate.Procedeul se poate aplica de cateva ori.Aceasta abordare poate reduce intensitatea tratamentului termic necesar pentru inactivarea sporilor. Efectul total al presiunilor inalte asupra microorganismelor este rezultatul mai multor procese care au loc simultan, incalzind deteriorarea membranei celulare, inactivarea unor sisteme enzimatice, reducerea volumului straturilor fosfolipidice din structura plasmalemei. Este unanim recunoscut ca microorganismele in forma vegetativa sunt inactivate eficient la presiuni de 300-400 MPa la temperatura ambianta.Efectul total al presiunilor inalte fiind puternic influentat de compozitia alimentului(Ph, indice de activitate al apei), prezenta unor constituienti alimentari ca proteinele, poliglucidele, unii acizi organici care pot avea un efect protectiv sau sinergic la inactivarea microorganismelor( Butz, 1995). Cercetarile au demonstrat ca presurizarea alimentelor acide (ph= 2, 5 - 4, 5) la 300 MPa timp de 5-10 minute, la temperatura ambianta a condus la reducerea numarului de drojdii, mucegaiuri si bacterii in forme vegetative, la mai putin de 1/105 din incarcatura initiala. Se realizeaza astfel un fel de” pasteurizare”, care poate 63

asigura o conservare pe termen lung pentru sucurile din fructe, cu mentinerea intacta a aromei, culorii si a valorii nutritive a produsului proaspat, prin inactivarea partiala a enzimelor. Alimentele neacide, presurizate la 300- 800 MPa la temperature ambianta, suporta o distrugere selective a bacteriilor patogene, o reducere a incarcaturii microbiene, concomitent cu prelungirea duratei de conservare in stare refrigerata. Ca aplicatii practice posibile citam: prepararea branzeturilor din lapte crud presurizat, de contaminarea condimentelor, distrugerea parazitilor din carne si pestele crud.(Cheftel 1991). In stadiul actual al dezvoltarii tehnologiei, un tratament de pasteurizare sau sterilizare numai prin presurizare nu se justifica economic.Pe viitor presurizarea se va folosi asociata cu alte metode, procedee de conservare(tratament termic, adaos de substante conservante, antibacteriene (Hauben 1955; Ray 1955), fapt ce permite tratamente termice mai blande in costuri reduse. II.1.4 Continutul de gaz din mediul ambiant Gazele prezente in atmosfera influenteaza dezvoltarea microorganismelor.Atmosfera terestra este alcatuita din aer (amestec de gaze si vapori de apa).Amestecul de gaze contine azot(78, 08%) oxigen (20, 95%) dioxid de carbon (0, 03%) si gaze inerte.Microorganismele se pot dezvolta, unele numai in prezenta oxigenului, iar altele si in lipsa acestuia. Avand in vedere cerintele microorganismelor pentru anumite gaze, specialistii din domeniul biotehnologiei si industriei alimentare, modifica atmosfera stimuland sau inhiband dezvoltarea microorganismelor. Conservarea alimentelor prin ambalarea in atmosfera controlata Ambalarea, pastrarea alimentelor in atmosfera modificata consta in inlocuirea atmosferei existente intr-un ambalaj sau depozit cu un gaz sau un amestec de gaze, si inchiderea 64

produsului alimentar in ambalajul sau depozitul respectiv in scopul conservarii acestuia.Si ambalarea produselor in vid se considera ca o tehnica din aceeiasi categorie de ambalare a produselor in atmosfera controlata.Conservarea alimentelor in atmosfera modificata se poate realiza prin urmatoarele tehnici: - ambalarea in atmosfera modificata (MAP, modified atmosphere packaging).Conservarea se asigura prin inlocuirea aerului dintr-un ambalaj cu gaze, proportia stabilindu-se in functie de specificul microbiologiei produsului.Asupra compozitiei initiale a aerului nu se mai intervine. - Ambalarea in atmosfera controlata(CAP, controlled atmosphere storage).In aceasta situatie proportia fiecarui gaz este mentinuta, controlata la valoarea introdusa initial pe tot parcursul lantului de distributie a alimentului.Aceste tehnici sunt utilizate in special la depozitarea si distributia produselor vrac. - Ambalarea in atmosfera modificata de echilibru (EMA. Equilibrium modified atmosphere).Este o tehnica utilizata in special la pastrarea legumelor si fructelor proaspete.Procedeul consta fie in introducerea unui jet din amestecul de gaze dorit, fie in inchiderea ermetica a produsului fara modificarea aerului. - Datorita respiratiei vegetalelor si permeabilitatii la gaze a ambalajelor se atinge o atmosfera modificata de echilibru.Din acest motiv, EMA mai este denumita si modificarea pasiva a atmosferei(PMA, passive modified atmosphere). - Ambalarea in vaccum (VP, vaccum packaging). Produsul este introdus intr-un ambalaj putin permeabil la oxigen, dupa care are loc evacuarea aerului si inchiderea ambalajului. Deoarece nu este posibil sa se evacueze tot aerul, (0, 3-3% in porii produsului sau dizolvat in masa sa) atmosfera din ambalajul vidat se poate modifica in tmpul depozitarii (ca urmare a reactiilor biochimice din produs si a metabolismului microbian), incat se ajunge tot la o atmosfera controlata Ambalarea activa (AP, active packaging).Produsul 65

este ambalat impreuna cu substante active (silicati, sulfiti, cloruri, permanganati, zeoliti, glucide, glicerol) capabile sa absoarba oxigenul sau umezeala din atmosfera ambalajului. Gazele utilizate la ambalarea in atmosfera modificata sunt oxigenul, dioxidul de carbon si azotul, adica cele care se gasesc in mod normal in aer.In scopul obtinerii efectului dorit pentru pastrarea produsului alimentar se intervine asupra proportiei acestor gaze la ambalare. Fructele si legumele pot fi pastrate in stare proaspata pe o durata mai mare de timp, daca respiratia lor este incetinita prin micsorarea continutului de oxigen din mediul inconjurator.Daca concentratia de oxigen scade sub 2% apare riscul aparitiei proceselor fermentative, in timp ce concentratia de CO2 nu trebuie sa depaseasca 10% pentru a evita modificarile fiziologice generatoare de mirosuri neplacute. Genurile de Fusarium, Geotrichum si Mucor sunt putin afectate de modificarea concentratiei de oxigen si dioxid de carbon.Pe cand speciile de mucegai din genurile Botrytis, Alternaria si Penicillium sunt puternic sau total inhibate cand continutul de oxigen se situeaza la valori de aproximativ 2%. Ca urmare, la ambalarea in atmosfera modificata este recomandabil a se folosi concentratii de 2, 5-10% dioxid de carbon si de 2-5% oxigen. Semnificatia gazelor in atmosfera modificata este urmatoarea:azotul, gaz inert, insipid, cu o slaba solubilitate in apa si lipide, este utilizat pentru a inlocui oxigenul din ambalaje, cu scopul de a se evita oxidarea pigmentilor, aromelor si/sau substantelor grase.Azotul mai are si proprietatea de a inhiba dezvoltarea microorganismelor aerobe. Dioxidul de carbon este un agent bacterisotatic si fungistatic, el putant intarzia, creste sau reduce viteza de multiplicare a bacteriilor aerobe si a mucegaiurilor, indeosebi in absenta oxigenului. Este eficient la concentratii mai mari de 20%, nu are 66

nici un efect asupra microorganismelor patogene.Dioxidul de carbon este foarte solubil in apa si grasimi, poate induce un gust usor acid la produse cand nu este utiliza corespunzator.Diferite cercetari au evidentiat comportamentul microorganismelor fata de dioxidul de carbon. Astfel: pseudomonele sunt foarte sensibile, la fel si mucegaiurile, in timp ce drojdiile si lactobacilii sunt mai putin sensibili. In ceea ce priveste bacteriile patogene, s-a observat ca:o atmosfera saracita in oxigen favorizeaza dezvoltarea Yerseniei enterocolitica precum si a speciei Campylobacter jejuni.C.botulinum isi reduce producerea de toxine la presiuni de dioxid de carbon, in timp ce C.perfringens nu isi inceteaza producerea de toxina nici in atmosfera bogata in dioxid de carbon. Presiunile ridicate de CO2 inhiba cresterea salmonelelor. Oxigenul este utilizat drept component al amestecului de gaze doar pentru unele produse.Prezenta oxigenului mentine culoarea rosie a carnii si inhiba dezvoltarea anaerobilor. II.1.5.Pulsurile luminoase Tratarea cu pulsuri luminoase (P.L) a alimentelor, constituie o metoda de conservare a acestora prin utilizarea unor pulsuri intense si de scurta durata de “lumina alba”. Lumina utilizata in acest tratament include lungimi de unda din domeniul ultraviolet al spectrului si apropiata de rosu. Alimentul este supus de obicei la 1-20 pulsuri/secunda (Nisoli 2003).Pulsul are o densitate energetica de pana la 50 g/cm2.Durata unui puls luminos este cuprinsa in intervalul 1μso, 1s (Dunn 1995) iar lungimea de unda variaza in domeniul 170-2600 nm. Pulsurile luminoase sunt produse cu ajutorul unei tehnologii capabile sa multiplice consumul de putere de multe ori.Practic se acumuleaza energia electrica in condensatori intrun interval de timp relativ lung (fractiuni de secunda) si elibe67

rarea acestei energii intr-un timp mult mai scurt (10-6-10-2 dintr-o secunda) fapt ce mareste mult puterea aplicata. Tratamentele cu P.L. sunt utilizate in special pentru sterilizarea sau reducerea populatiei microbiene de pe suprafata materialelor de ambalaj, a produselor farmaceutice transparente sau a altor suprafete. In conditii de igiena necorespunzatoare, materialele destinate ambalarii alimentelor isi pot spori incarcatura microbiologica initiala. Pentru materialele celulozice, depozitate in conditii necorespunzatoare de igiena si umiditate, prezenta sporilor de miceti reprezinta un pericol care se poate manifesta fie prin scurtarea termenelor de valabilitate, alterare prin mucegaire sau datorita producerii de micotoxine. Pulsurile luminoase pot fi utilizate pentru reducerea sau eliminarea necesarului de dezinfectanti chimici sau conservanti contribuind la marirea termenului de valabilitate si imbunatatirea calitatii alimentelor ambalate. Producerea pulsurilor luminoase se poate realiza cu doua tipuri de generatori:tip laser si lampi flash. Tinand cont ca lampile flash au un randament energetic mai mare 60-70%, necesita echipamente mai simple, au o suprafata mai mare de in cm2, si nu prezinta pericol pentru sanatate, au o utilizare mai extinsa. Aplicarea iradierii cu laser in industria alimentara este o problema de perspectiva.Radiatiile laser, in functie de intensitate pot atenua proprietatile fiziologice, altera metabolismul sau potentialul patogen, pot realiza transformari ireversibile si determina moartea celulei. Pentru materialele de ambalare se recomanda sa se utilizeze pulsuri luminoase imbogatite cu ultraviolete, la care cel putin 30% din energia luminii provine de la lungimi de unda mai mici decat 300 nm.Tratarea cu PL asociata cu UV asigura inactivarea microorganismelor si virusurilor printr-un mecanism combinat fotometric-fotochimic. 68

Atunci cand produsele alimentare sunt afectate din punct de vedere calitativ de lungimile de unda din domeniul UV, portiunea spectrului UV este eliminata, iar cea mai mare parte din energia luminoasa provine din spectrul vizibil si infrarosu. Levan (1990) considera ca efectul P.L asupra microorganismelor este indeosebi fotometric.Se realizeaza transferul unei cantitati mari de energie termica la suprafata materialului, astfel incat in stratul superficial se realizeaza temperaturi sufiecient de mari pentru a inactiva microorganismele si virusurile de suprafata. In practica procedeul “Steril-Pulse XL”, care utilizeaza lumina din spectrul vizibil/UV sub forma de impulsuri scurte controlate, de mare intensitate, mai intense de 100000 ori decat lumina solara (Xenon 2003) se utilizeaza pentru: -igienizare spatiilor, cu ajutorul lampilor UV/VIS -decontaminarea suprafetelor netede uscate -sterilizarea si decontaminarea lichidelor care permit trecerea luminii ultraviolete ca de exemplu:apa, solutii chimice, solutii tampon, saramuri. -sterilizarea produselor lichide farmaceutice limpezi, a ustensilelor medicale si a materialelor de ambalaj. O conditie pentru utilizarea sistemului Steril-Pulse XL consta in aceea ca produsele tratate nu trebuie sa devina instabile sau sa fie distruse.Acest deziderat se realizeaza prin utilizarea de nivele de energie diferite (numar de pulsuri si energia specifica raportata la puls). Expunerea la energii mari determina aparitia unor pete negre. In alegerea materialelor pentru ambalaje, trebuie sa se tina cont de necesitatea asigurarii trecerii luminii cu nivel ridicat de energie.Asemenea materiale sunt:polietilena de joasa densitate, poliamidele (nylonul) si polietilena de inalta densitate. Materialele care blocheaza trecerea luminii UV sau o ab69

sorb nu sunt potrivite pentru asemenea tratamente.Ambalajele din sticla permit patrunderea luminii din spectrul vizibil dar nu permit trecerea luminii ultraviolete.Radiatiile ultraviolete cu energie mai mare sunt esentiale pentru inactivarea microorganismelor si sterilizare. II.1.6 Radiatiile ultraviolete si radiatiile ionizante Energia radianta sub diferitele ei forme este nociva pentru microorganisme intr-un grad mai mare sau mai mic, in functie de felul energiei si specia microbiana.Radiatiile cu lungime de unda mai mica sunt mai active asupra microorganismelor decat cele cu lungime de unda mai mare.Sunt active numai cele cu lungime de unda mai mica de 1200 nm (12000 A0) Pentru industria alimentara prezinta interes numai radiatiile ultraviolete si cele ionizante. Radiatiile reprezinta emisia si transmiterea energiei, sub forma de unde, in spatiu sau printr-un mediu natural. Radiatiile se diferentiaza intre ele pe baza frecventei sau a lungimii de unda. Radiatiile UV sunt radiatii neionizante, au lungimea de unda relativ mare, sub 450 nm si o frecventa joasa 107-1010 Hz. Radiatiile ionizante (corpusculare) au lungime de unda mai mica de 200 nm (2000 A0), continut foarte mare de energie, putere mare de patrundere si letalitate pronuntata la nivel celular.Ele transforma atomii in ioni prin dislocarea electronilor de pe orbitele lor. Radiatiile alfa, beta, gama, X si cele cosmice sunt radiatii ionizante si toate au efect letal asupra microorganismelor. Radiatiile beta sunt fascicule de electroni emise de substante radioactive si au o capacitate slaba de penetrare. Radiatiile gama sunt radiatii electromagnetice emise de un nucleu excitat de Cobalt sau Cesiu.Sunt radiatiile cele mai ieftin de obtinut.Au putere mare de penetrare, dezavantajul 70

consta in faptul ca sursa emite radiatii in toate directiile si nu poate fi “pornita” sau “oprita”. Radiatiile X sunt produse prin bombardarea cu electroni cu viteze mari (raze catodice) a unor tinte constituite din metale grele.Faptul ca la acest tip de radiatii li se pot modifica usor nivelul de energie si ca pot fi directionate spre anumite zone ale produsului, inseamna flexibilitate in procesul de iradiere, la care se adauga posibilitatea opririi acceleratoarelor de particule la sfarsitul zilei. Radiatiile induc in principal modificari chimice ale AND-ului si ARN-ului ca urmare a hidratarii citozinei, ruperii lanturilor nucleotidice sau a legaturilor de hidrogen intre cele doua catene ale acizilor nucleici.Aceste modificari au drept consecinta blocarea multiplicarii AND-ului precum si a sintezei proteinelor. Se produce astfel o inhibarea a reproducerii si cresterii microorganismelor.Radiatiile ionizante pot fi responsabile si de oxidari distructive a structurilor lipoproteice din membrane. Daca efectele radiatiilor sunt comune tuturor microorganismelor, radiosensibilitatea lor difera de la unul la altul.Radiosensibilitatea poate fi evaluata pornind de la valorile D10 (doza absorbita care produce o distrugere a populatiei in proportie de 90%) si care sunt specifice pentru fiecare gen, specie si tulpina. Bacteriile gram negative cu forma de bastonase (Aeromonas, Proteus, Pseudomonas, Serratia si Vibrio) sunt cele mai radiosensibile, in timp ce bacteriile cu forma de cocobacili ca cele din genul Acinetobacter si Moraxella sunt cele mai rezistente bacterii gram negative. Bacteriile sporulate au o radiorezistenta mai mare fata de cele nesporulate. Drojdiile sunt mai rezistente decat mucegaiurile si ambele mai putin sensibile ca bacteriile. Cele mai rezistente microorganisme la radiatii sunt patru 71

specii ale genului Deinococcus si cate o specie din genurile Deinobacter, Rubrobacter si Acinetobacter. Deinococii sunt bacterii gram pozitive, contin pigmenti rosii, au optimul de crestere de 300C, au o membrana externa ce nu exista la alte bacterii gram pozitive.Deinococii au fost izolati din carnea de vita tocata, carnati de porc, par de animale, pesti, fecale, rumegus.Deinococcus radiophilis este cel mai rezistent microorganism la radiatii poate suprevietui la 15 KGy (Gy-gray unitatea de masura a dozei de radiatii din sistemul international pentru unitati de masura, 1Gy=1J x kg-1). Genul Deinobacter cuprinde bacterii gram negative sub forma de bastonas si au fost izolate din fecalele animalelor si de la pestii de apa dulce. Radiorezistenta microorganismelor este determinata de capacitatea lor genetica, care la randul ei poate fi influentata de mai multi factori.Printre acesti factori se numara: -compozitia chimica a mediului de cultura.Prezenta proteinelor si a poliglucidelor in mediile de cultura asigura o protectie microorganismelor supuse iradierii.Prezenta clorurii de sodiu in concentratiile utilizate in alimente poate amplifica efectul letal al radiatiilor ionizante.Aceasta sensibilitatea crescuta in prezenta sarii este legata de incapacitatea de reparare a AND-ului.Prezenta nitritilor reduce rezistenta sporilor bacterieni la radiatii.Continutul scazut de apa al unui mediu mareste radiorezistenta bacteriilor. -valoarea pH-ului mediului.Acest efect se poate explica prin efectul pH-ului asupra radiolizei apei si asupra biopolimerilor ce intra in structura sporilor. -prezenta oxigenului.Radiosensibilitatea bacteiilor este diminuata in conditii de anaerobioza si crescuta in prezenta oxigenului.Efectul letal al radiatiilor ionizante este crescut in prezenta oxigenului deoarece acesta determina oxidarea lipidelor, inclusiv a celor din membrana celulelor. -temperatura.Cresterea temperaturii amplifica efectul inhibitor al radiatiilor ionizante 72

-numarul de microorganisme si starea fiziologica a celulelor.Cu cat numarul de indivizi dintr-o populatie este mai mare cu cat atat doza de radiatii este mai putin eficienta.Microorganismele aflate in starea de latenta sunt mai radiorezistente fata de faza exponentiala de crestere. Aplicatiile radiatilor ultraviolete (UV) si a radiatiilor ionizante (corpusculare) in industria alimentara Utilizarea radiatiilor UV in industria alimentara este foarte limitata la: -tratarea unor suprafete, ambalaje si spatii de lucru -tratarea suprafetei unor alimente si a unor obiecte cu care se manipuleaza alimentele -tratarea saramurei de injectie sau a apei folosite in industria laptelui. Datorita penetratiei reduse a razelor UV, lichidele ce se sterilizeaza cu ajutorul lor trebuie sa se expuna in straturi foarte subtiri. La sterilizarea suprafetelor de lucru, acestea prealabil trebuie spalate si expuse un timp suficient de mare la actiunea radiatiilor. Unele ambalaje de plastic (pungi) pot fi sterilizate prin UV fara a fi deschise.Dintre alimentele solide doar zaharul si carnea se supun sterilizarii prin radiatii UV.La carne tratamentul se aplica numai in depozitele frigorifice pentru a prelungi timpul de conservare prin distrugerea unei parti a microflorei de pe suprafata carcaselor. Radiatiile UV au si efecte nedorite asupra alimentelor:cea mai importanta este oxidarea grasimilor nesaturate si aparitia mirosului de ranced. De aceea utilizarea lor in industria laptelui si la carnea de porc este restrictionata.Radiatiile UV sunt periculoase pentru operatori la care pot produce arsuri daca nu se iau masuri de protectie. In general utilizarea radiatiilor UV in industria alimentara este redusa. 73

Radiatiile ionizante la nivelul aplicat la alimente nu induc radioactivitate.Caracteristica lor principala este penetratia instantanee cu intensitati care depind de felul radiatiei si densitatea materialului expus. Nivelul dozelor de radiatii ionizante care asigura distrugerea microorganismelor este mai mare decat nivelurile care omoara omul.Unitatea de masura a radiatiilor gama este rad-ul care reprezinta o absorbtie de 100 ergi/g de substrat.Kilorad-ul (K.rad)=1000 rad iar megarad-ul (M.rad)=1000000 rad. Puterea sursei de radiatii se masoara in Curie (Ci=3, 7 x 10 10 ) dezintegrari/sec. Apa este usor ionizata si poate fi sursa primara de ionizare in alimente cu efecte secundare asupra altor molecule din alimente de alta natura. Dozele letale pentru microorganisme nu inactiveaza multe sisteme enzime.In produsul iradiat se formeaza radicali liberi si alte molecule reactive in special in faza apoasa. Microorganismele au o sensibilitate mai mica fata de radiatia ionizanta decat vietuitoarele cu organizatie superioara. Radiatiile ionizante pot fi folosite pentru conservarea unor alimente fie sub forma pasteurizarii fie a sterilizarii prin radiatii. Pasteurizarea prin radiatii presupune folosirea unor doze mici si este de doua feluri:radurizarea care prelungeste durata de conservare a alimentelor si radicizarea care determina omorarea unor germeni patogeni. Radurizarea omoara microorganismele de putrefactie si o parte din germenii patogeni iar radicizarea omoara unii germeni patogeni si o parte din microflora de putrefactie. Alimentele acide sau uscate de regula de origine vegetala se altereaza datorita dezvoltarii pe ele a fungilor.Pentru a intarzia alterarea lor se trateaza cu doza de 100-500 K rad. Radicizarea carnii si pestelui presupune tratamente cu 250 K rad.Sterilizarea prin radiatii sau radapertizarea urmareste distrugerea tuturor microorganismelor din alimente. 74

Pana in prezent iradierea ionizanta s-a aplicat in industria alimentelor pentru distrugerea salmonelelor de pe suprafata carcaselor de pasare, pentru intarzierea alterarii fungice a painii taiata in felii si preambalata, prelungirea duratei de conservare a carnii si pestelui si la sterilizarea condimentelor.Pentru a nu influenta caracteristicile organoleptice ale produselor, dozele aplicate nu trebuie sa depaseasca 250 Krad.Aceste doze omoara majoritatea bacteriior gram negative si sporii de mucegai, dar nu si sporii bacterieni si nici bacteriile gram pozitive nesporulate.De aceea alimentele tratate cu radiatii ionizante trebuie pastrate la temperaturi joase. Aplicarea radiatiilor ionizante la conservarea alimentelor prezinta unele avantaje dar si inconveniente. Avantaje: -penetratie instantanee, profunda si uniforma -aplicarea lor nu este insotita de incalzirea alimentului, ceea ce permite folosirea lor si la alimentele refrigerate sau congelate cu pastrarea caracteristicilor de crud a produselor -nu creaza reziduuri -in doze mici, mai putin de 500 K rad nu produc modificari organoleptice ale alimentelor -se pot aplica la alimente ambalate ca tratament final Inconveniente: -nu inactiveaza enzimele si virusurile in doze bactericide -la doze mai mari produc modificari organoleptice -dozele necesare pentru distrugerea microorganismelor sunt letale pentru om. -microorganismele care supravietuiesc tratamentului prin radiatii pot suferi unele leziuni, vatamari care le fac dificil de decelat. II.1.7 Ultrasunetele Ultrasunetele sunt unde acustice cu frecventa cuprinsa intre 16 si 106 KHz produse cu ajutorul unor emitatoare ultrasonice. 75

In ultima perioada se constata tot mai multe utilizari ale ultrasunetelor in diferite aplicatii industriale in domeniul alimentelor ca de exemplu: -evaluarea nedistructiva a calitatii interne si a defectelor latente pentru fructe si legume -imbunatatirea monitorizarii proceselor de productie a alimentelor prin accelerarea procesului de difuzie (masurarea texturii, vascozitatii si concentratiei unor alimente lichide si solide; masurarea consistentei debitului pentru monitorizarea unor procese; determinarea compozitiei oualelor, carnii, fructelor produselor lactate; -imbunatatirea unor procese cum sunt:curatirea suprafetelor, uscarea si filtrarea, inactivarea microorganismelor si enzimelor, degazarea lichidelor, accelerarea proceselor de extractie. Inactivarea microorganismelor prin ultrasonare se produce prin trei mecanisme:cavitatie, incalzire locala si formarea de radicali liberi. Cavitatia se produce la trecerea undelor ultrasonore printr-un lichid si consta in aparitia de bule de gaz.Cavitatia poate fi tranzitorie sau stabila, cu efecte diferite asupra microorganismelor. Cavitatia tranzitorie se produce cand undele ultrasonore au frecventa redusa.In timpul cavitatiei tranzitorii, dimensiunea bulelor de gaz creste rapid in decursul a catorva cicluri oscilatorii.Bulele mari colapseaza generand presiuni locale foarte mari (pana la 100 MPa) si temperaturi mari (pana la 50000 K).Presiunile produse cand bulele colapseaza sunt capabile sa determine ruperea structurilor celulare, in timp ce temperaturile locale mari pot provoca deteriorari termice (denaturarea proteinelor si enzimelor). Cavitatia stabila se produce ca urmare a oscilarii undelor ultrasonore cu frecventa ridicata, ceea ce determina formarea in lichid de bule de gaz fine. 76

Aplicarea de ultrasunete unui lichid poate genera formarea de radicali liberi care pot actiona asupra AND-uluipe care il poate fragmenta. Efectele tratamentului cu ultrasunete pot fi influentate de urmatorii factori: -frecventa si amplitudinea undelor ultrasonice -durata de expunere/contact a microorganismelor la ultrasunete -tipul si starea microorganismului -volumul de produs supus tratamentului -compozitia chimica a produsului -temperatura de lucru Frecventa ultrasunetelor influenteaza marimea bulelor de gaz.La frecvente reduse de pana la 20 KHz bulele care se formeaza au dimensiuni mari, ceea ce face ca la colapsul lor sa fie pusa in libertate o cantitate mare de energie. La frecvente mai mari de 20 KHz formarea bulelor devine mai dificila iar la frecvente si mai mari de peste 2, 5 MHz se formeaza bule cu dimensiuni mici (cavitatie stabila). Intensitatea cu care colapseaza bulele depinde de temperatura mediului in care se gasesc microorganismele, vascozitatea sa si frecventele ultrasunetelor.Pe masura ce temperatura creste, bulele de cavitatie se dezvolta mai rapid, dar intensitatea colapsurilor se reduce.Acest lucru are drept cauza cresterea presiunii de vapori.Efectul generat de cresterea temperaturii poate fi depasit prin aplicarea unei suprapresiuni in sistemul tratat.Combinarea presiunii cu ultrasunete si incalzirea creste amplitudinea undelor ultrasonore si implicit, eficienta inactivarii microbiene. Sensibilitatea microorganismelor la ultrasunete este diferita, unele fiind mai susceptibile decat altele. S-a demonstrat ca in general celulele cu dimensiuni mari sunt mai sensibile decat cele cu dimensiuni mici, deoarece au o suprafata mai mare care este supusa la presiuni inalte produse in timpul cavitatiei, ceea ce le face mai vulnerabile. 77

Bacteriile cu forma sferica sunt mai rezistente decat cele cilindrice iar cele sub forma de spori sunt mai rezistente decat cele sub forma vegetativa. Rezistenta microorganismelor la ultrasunete este mai mica in medii de laborator decat in alimente.Dat fiind structura alimentelor, compozitia grasimii, proteinelor, vascozitatii ce influenteaza penetrarea ultrasunetelor comparativ cu mediile de cultura din laborator. Ultrasunetele pot fi utilizate singure (ultrasonare) sau in combinatii cu alte procedee pentru distrugerea microorganismelor din alimente, in special din cele lichide, in operatii denumite: termoscanare (combinarea incalzirii cu ultrasonarea) si monotermosonare (combinarea presiunii, incalzirii si ultrasonarii).Ultrasonarea se mai poate asocia cu acidifierea sau cu o serie de tratamente chimice. Ultrasunetele nu reprezinta o metoda suficienta de inactivare a microorganismelor in scopul conservarii daca sunt utilizate singure.Doar daca sunt utilizate in combinatie cu alti factori (substante dezinfectante, conservanti, presiune statica, iradiere, caldura, pulsuri electrice), ultrasunetele pot contribui la inactivarea microorganismelor din alimente.Dar pentru astfel de aplicatii in industria alimentara, mai sunt necesare cercetari in faza de laborator, deci este o problema de viitor. II.1.8 Campuri electrice pulsatori Campurile electrice pulsatorii (pulsed electric fieldsPEF) de mare intensitate aplicate celulelor genereaza fenomenul fizic de electroporare, care consta in formarea de pori in membranele celulare.Formarea porilor poate fi reversibila sau ireversibila, in functie de intensitatea campului electric aplicat. Cand unei celule i se aplica un camp electric extern (E), se acumuleaza sarcini electrice, ceea ce face sa creasca potentialul de transfer prin membrana celulei.Sarcinile electrice de sens opus se atrag, determina comprimarea membranei ce78

lulare, deci reducerea grosimii ei.Exista o forta elastica sau vascoelastica care se opune acestei compresii dar distanta dintre sarcini descreste, potentialul transmembranar creste fortat ce determina ruperea membranei celulare sau la formarea de pori (electropori). Proteinele si lipidele membranei celulare sunt sensibile la PEF aplicat.Electroporarea membranei celulare conduce la distrugerea membranei celulare cand marimea si numarul porilor este mare, comparativ cu dimensiunile celulei.Distrugerea celulelor se produce atunci cand este depasit un anumit prag al campului electric.Daca se aplica un camp electric de 2-20 Kv/cm-1 porarea membranei este ireversibila deoarece se depaseste pragul de potentialul transmembranar de 1.V. Inactivarea microorganismelor prin PEF este influentata de trei categorii de factori: -dependenti de microorganism -dependenti de conditiile de tratare -dependenti de modul de tratare a mediului Factorii dependenti de microorganisme sunt: -tipul de microorganism-in general bacteriile sunt mai putin sensibile la tratamentul PEF fata de drojdii iar bacteriile gram pozitive sunt mai rezistente decat cele gram negative. -stadiul de dezvoltare al celulelor-celulele aflate in faza exponentiala de crestere sunt mai sensibile la PEF fata de celulele aflate in faza de latenta sau in faza stationara de crestere. -dimensiunea celulelor-potentialul transmembranar indus de un anumit tratament este invers proportional cu dimensiunea celulelor.Pe masura ce dimensiunea celulelor creste valoarea critica a campului electric extern descreste si celula este mai susceptibila la PEF. Factorii dependenti de conditiile de tratament: -intensitatea campului electric-este unul din cei mai importanti factori care influenteaza activitatea microorganismelor prin PEF.Gradul de inactivare creste pe masura cresterii intensitatii campului. 79

-durata tratamentului-inactivarea microorganismelor prin PEF este influentata de durata tratamentului (nr pulsuri x durata pulsului).Pentru o anumita durata a pulsurilor gradul de inactivare creste cu cresterea numarului de pulsuri. -formarea pulsurilor-pentru o anumita valoare maxima a intensitatii campului electric, inactivarea microorganismelor prin PEF este influentata de forma pulsurilor, care pot fi:descrescatoare exponential, descrescatoare oscilatoriu, bipolare sau patrate. -temperatura de tratare-intre campurile electrice si temperatura exista un efect sinergic privind gradul de inactivare al microorganismelor chiar si la temperaturi neletale.De exemplu, inactivarea celulelor de E.coli prin PEF creste de la doua cicluri logaritmice la trei cand temperatura creste de la 70C la 400C. Factorii dependenti de mediul in care are loc tratamentul: -conductivitatea-conductivitatea unui lichid este dependenta de taria ionica a mediului respectiv.Cresterea tariei ionice determina cresterea conductivitatii lichidului.Cu cat este mai mare conductivitatea unui aliment, cu atat este mai mica intensitatea campului electric generat.In consecinta, o crestere a tariei ionice a unui aliment, determina reducerea vitezei de inactivare a microorganismelor pe care le contine. -pH-ul-ajustarea pH-ului in domeniul 5-9 nu influenteaza efectul campului electric pulsatoriu.Totusi, ajustarea pH-ului spre mediul acid determina o crestere usoara a gradului de inactivare. -prezenta substantelor cu efect antimicrobian (prezenta pediocinei, a nizinei in mediu creste gradul de letalitate al PEF) Actiunea PEF asupra microorganismelor isi gaseste aplicatii in: -genetica-electroporarea reversibila, in ingineria gene80

tica, permite modificarea permeabilitatii membranelor, ceea ce faciliteaza introducerea de fragmente de AND si totodata influenteaza fenomenele de fuziune celulara. -industria alimentara-electroporarea ireversibila sta la baza pasteurizarii alimentelor prin campuri electrice pulsatorii. Inactivarea pe cale atermica a microorganismelor utilizand PEF a fost demonstrata inca din 1960(Calderon-Miranda). Conservarea alimentelor prin expunerea la PEF de inalta intensitate constituie o tehnologie noua, de perspectiva, deoarece tratamentul determina inactivarea enzimelor si microorganismelor fara a afecta culoarea, aroma, textura si valoarea nutritiva a alimentelor.Utilizarea PEF se dovedeste o alternativa la metodele termice de conservare (pasteurizare) in care pe langa inactivarea microorganismelor, au loc pierderi de nutrienti si modificarea parametrilor senzoriali.In plus, de regula PEF este mai putin energofaga fata de pasteurizare, fapt ce aduce economii semnificative pe termen lung. La ora actuala exista pe piata diferite instalatii ce asigura lezarea celulelor animale si vegetale, pentru pasteurizarea alimentelor lichide (suc de mere, de afine, supa de mazare, lapte degresat, iaurt, oua lichide, apa potabila).Se obtine marirea termenului de valabilitate fara afectarea propietatilor senzoriale a alimentelor. II.2. FACTORII CHIMICI Substante chimice adaugate A. Conservanti De-a lungul anilor, una din preocuparile majore ale oamenilor a fost aceea de a conserva alimentele, astfel inact sa se poata hrani indiferent de anotimp.Dezvoltarea anumitor microorganisme constituie principalul risc alimentar si principala cauza de alterare a alimentelor.Descoperirea de procedee efici81

ente de stopare a dezvoltarii microorganismelor a reprezentat victorii importante in istoria alimentara a umanitatii.Dintre aceste procedee, unele sunt fizice (uscare, pasteurizare, sterilizare, refrigerare, congelare, iradiere, etc) iar altele chimice (sarare, confiere, adaos de substante conservante, etc). Din cele mai vechi timpuri s-au folosit diferite substante pentru conservarea alimentelor, in principal a carnii, pestelui si branzeturilor. Un conservant este un aditiv alimentar, care nu este consumat in mod normal in alimente, dar care adaugat in acestea, prin actiunea manifestata fata de microorganisme, reuseste sa le mareasca gradul de siguranta si stabilitate. Conservantii nu pot transforma un produs lipsit de inocuitate biologica intr-un produs sigur pentru consum, nici sa amelioreze calitatea unui produs alterat. Un conservant poate mentine calitatile initiale ale unui produs pentru o perioada mai mare decat cea obisnuita:substantele conservante sunt utile in mod special pentru prelungirea duratei de pastrare a produselor cu umiditate ridicata sau a celor pastrate la temperatura ambianta. Utilizarea conservantilor in industria alimentara este conditionata de avizarea lor sub raport toxicologic de catre autoritatile competente (sa fie admisi de prevederile legale). In functie de natura lor, conservantii se impart in conservanti minerali si conservanti organici iar in fuctie de efectul lor se clasifica in conservanti cu spectru larg sau cu spectru ingust (bacteriostatic, fungistatic sau levuristatic). Conservanti minerali.Principalele substante considerate astazi saruri de conservare sunt clorura de sodiu si nitratul de sodiu.Alaturi de aceste substante se mai folosesc si alte substante numite aditivi sau adjuvanti (ascorbati, polifosfati, zaharul si glucono-delta-lactona). Clorura de sodiu se foloseste pentru sarare sau saramurare. Nitritul si nitratul de sodiu se utilizeaza alaturi de clorura de sodiu in amestecurile de sarare pentru carne.Ionul nitrit are un rol mai important decat ionul nitrat.Acesta este foarte reactiv si este capabil sa actioneze atat ca reducator cat si ca oxidant. 82

Sarea si nitritul prin actiunea lor asupra carnii influenteaza:modificarea culorii, imbunatatirea aromei si inhiba dezvoltarea unor microorganisme. Nitritul are un rol importantin asigurarea mentinerii culorii carnii.El transforma pigmentii carnii, in principal mioglobina si mai putin hemoglobina in oxid rosu nitric de mioglobina, de culoare rosie, insolubil in apa. In timpul tratarii termice acest pigment se transforma in nitrosilhemocrom de culoare roza care in prezenta ascorbitilor se stabilizeaza. Ionul nitrit este reactiv, actioneaza atat ca reducator cat si ca oxidant.In mediu acid formeaza acid nitros, care apoi se descompune in oxid nitric.Oxidul nitric reactioneaza cu mioglobina si formeaza pigmentul rosu nitrozmioglobina.De asemenea ionul nitric poate reactiona cu gruparile porfirinice din centrii activi ai catalazei,, peroxidazei si citocromilor inhibandu-le activitatea, mecanism ce explica efectul antimicrobian. Nitratul se adauga in amestecul de sarare singur sau in amestec cu nitritul de sodiu.Nitratul ca atare nu are nici un efect asupa carnii si microorganismelor din carne.El se foloseste ca rezerva de nitrit, microorganismele denitrifiante transformandu-l treptat in nitrat.De regula el se adauga in carne in cantitate dubla (200-300 ppm) fata de nitrit (100-150 ppm) si in acest mod mentinerea culorii roz-rosii a carnii se prelungeste ca si efectul nitritului asupra unor microorganisme. Nitritul sau combinatia nitrat-nitrit adaugat in carne este convertit permanent intr-un amestec echilibrat de NO3-NO2NO.Nitratul si nitritul in cele din urma dispar ca rezultat al reactiilor chimice cu compusii carnii si activitatii microbiene.Disparitia nitritului din carne depinde de pH, temperatura (cu cat pH-ul este mai mic si temperatura mai mare cu atat disparitia lui este mai rapida). In timpul gatirii, prelucrarii produselor din carne ce contin nitriti, prin reactia acestora cu acizii aminati, se pot pro83

duce nitrozamine, substante cu efect cancerigen.Cu toate acestea nitritii continua sa se utilizeze ca agenti antibotulinici si pentru mentinerea culorii carnii pe considerentul ca aportul lor la prezenta nitrozaminelor in organismul nostru este minor, fata de alte surse (tutun, bauturi, alte alimente).De aceea continutul in nitrati, nitriti a fost strict reglementat 70mg/kg produs La nivel mondial se desfasoara cercetari pentru gasirea de modalitati de reducere a dozelor de nitriti prin combinarea cu alti conservanti, in special cu acid ascorbic.S-a descoperit ca utilizarea alfa-tocoferolului permite blocarea formarii nitrozaminelor, fara a reduce eficienta antibotulinica.Acelasi efect s-a dovedit ca il are si sorbatul de potasiu. Aroma produselor din carne este influentata de clorura de sodiu, zahar, fum si nitrit.Aroma carnii de porc ce contine mai multe lipide nesaturate, este alterata de nitrit, motiv pentru care se recomanda ca ea sa fie tratata numai cu sare. Efectul negativ al nitritului asupra aromei se pare ca se datoreaza micsorarii ratei de oxidare a lipidelor nesaturate.Ori aroma este data in primul rand de oxidarea lipidelor nesaturate, oxidare accelerata de sare si fier.Deci o carne cu nitrit va avea o oxidare redusa a lipidelor nesaturate. Acest efect, in practica este anulat prin folosirea sarii, a fumului si a condimentelor. Capacitatea antioxidanta a nitritului asupra lipidelor nesaturate mai este folosita in practica pentru a preveni defectul numit “aroma de supraincalzire” ce apare la carnurile gatite si refrigerate si la care cantitatea de lipide oxidate este exagerat de mare.Acest defect poate fi prevenit prin folosirea unor antioxidanti. Se poate afirma ca desi oxidarea lipidelor nesaturate determina pana la un anumit punct imbunatatirea aromei carnii, ea poate sa o si altereze cand depaseste anumite limite. Zaharul contribuie la formarea aromei carnii conservate, prin favorizarea dezvoltarii microflorei lactice ce poate produce metaboliti (aldehide, diacetil) cu importante proprietati aromatizante. .Nu se cunoaste exact mecanismul de inhibare microbi84

ana a ionului nitrit.El nu impiedica germinatia sporilor bacterieni, ci numai inmultirea lor. Actiunea bacteriostatica a nitritului este influentata de concentratia de nitrit si de pH.La un pH de 5, 5-4, 0 formele vegetative sunt distruse repede si chiar sporii unor specii. O exceptie o formeaza salamurile crude fermentate la care desi se adauga nitrit in concentratii mari (150 ppm) si au un pH 5, 5-4, 5 supravietuieste un numar mare de bacterii.Aceasta se datoreste probabil descompunerii rapide a nitritului in timpul fermentarii. Se presupune ca actiunea bacteriostatica a nitritului s-ar datora reactiei lui cu gruparile aminice sau sulfhidrice ale compusilor celulei bacteriene ca si inhibarii unor enzime glicolitice.Dupa unii cercettori oxidul nitric provenit din nitrit reactioneaza cu fierul si da ferodoxinul, compus implicat in transferul de electroni la clostridii. La carnurile cu continut ridicat in fier, ca de exemplu miocardul, dezvoltarea clostridiilor nu poate fi inhibata de cantitatile de nitrit admise tehnologic, din aceasta cauza asemenea carnuri nu se folosesc in fabricarea de conserve, semiconserve inchise in cutii ermetice. Actiunea bacteriostatica a nitritului se mai explica prin aceea ca el este un precursor al factorului de tip Perigo (PTF) mult mai stabil, care este un produs antimicrobian ce se formeaza in timpul tratarii termice a carnii ce contine nitrit si are proprietati active asupra sporilor de clostridii ramasi in numar mic dupa tratarea termica. Ascorbatii “per se” nu au actiune antimicrobiana, prin neutralizare ei se autoxideaza si formeaza un compus sporicid. Polifosfatii nu inhiba clostridiile dar inhiba pseudomonele din carnea cruda. Glucono-delta lactona prin scaderea pH-ului creaza conditii favorabile inmultirii bacteriilor lactice, care prin concurenta inhiba dezvoltarea florei de alterare si a celei patogene. Zaharul determina ca si sarea scaderea factorului apa activa, formand un substrat pentru bacteriile lactice care 85

metabolizandu-l formeaza acid lactic si scade pH-ul produsului. Fumul prin substantele organice pe care le contine, unele cu proprietati antimicrobiene (fenoli, formaldehida, crezoli) omoara microorganismele cu care vine in contact, acidifica si usuca suprafata produselor. Afumarea este de doua feluri:calda la 650C-850C si rece la 0 25 C-350C.Efectul antimicrobian al fumului este mai pronuntat asupra bacteriilor gram negtive, micrococilor, stafilococilor. Sporii de mucegaiuri si cei bacterieni sunt mai rezistenti. Fumul, de asemenea, prin substantele antioxidante si oxizii de azot pe care ii contine contribuie la aparitia si mentinerea culorii roscate placute a carnii.Acest efect apare mai evident la carnatiii afumati fara nitriti. Dioxidul de sulf si sulfitii-dioxidul de sulf (SO2) si sulfitii (-SO3), bisulfitii (-HSO3) si metabisulfitii (-S2O5) de sodiu si potasiu se utilizeaza in vinificatie si la conservarea unor fructe uscate si a sucurilor de fructe. Dioxidul de sulf se utilizeaza in stare gazoasa sau lichida.Activitatea sa este favorizata de valori de pH mai mici e 3, a bisulfitilor la pH 3-5 iar a sulfitilor la pH mai mare de 6. Efectul se bazeaza pe blocarea unor reactii enzimatice la bacterii, levuri, mucegaiuri. Conservanti organici.Cei mai utilizati conservanti organici in alimente sunt:acidul benzoic (C6H5COOH) si benzoatul de sodiu (C7H5NaO2) impreuna cu esterii acidului parahidroxibenzoic (parabenii), acidul ascorbic si sorbatii, acizii grasi saturati si sarurile lor, oxidul de etilena si propilena. Benzoatul, a fost prima substanta chimica admisa a se utiliza in alimente.Activitatea antimicrobiana este conditionata de pH, cea mai mare activitate este inregistrata la un pH scazut. Activitatea antimicrobiana rezida din faptul ca moleculele sale raman nedisociate la pH 4 in proportie de 60%, in timp ce la pH 6 doar 1, 5% este disociat.Acest fapt restrictioneaza utilizarea lui si a sarii de sodiu la produsele acide (cidru, bauturi racoritoare, sosuri pentru salate). La concentratii de 50-500 ppm, acidul benzoic inhiba dezvoltarea levurilor, mucegaiurilor si chiar a bacteriilor.In 86

concentratii de 0, 1% in sucurile de fructe prouce modificari de gust dezagreabile. Parabenii permisi in alimente sunt formule cu resturi de metil, etil, propil, butil si heptil.Ca esteri ai acidului benzoic, difera de benzoati prin activitatea lor antimicrobiana care ete mai putin sensibila la pH.In concentratii de 10-100 ppm heptil parabenul inhiba complet unele bacterii gram pozitive si gram negative si bacteriile malolactice. Parabenii sunt mai eficienti impotriva mucegaiurilor si sunt permisi in alimente in concentratii de maximum 0, 1%. Acidul sorbic si sorbatii.Acidul sorbic ese utilizat drept conservant sub forma de sare de sodiu, sorbatii sunt mai eficienti in alimentele acide decat in cele neutre si actioneaza ca inhibitori fungici.Acidul sorbic este ineficient la valori de pH de peste 6. Sorbatii sunt mai eficienti decat benzoatul de sodiu la valori de pH cuprinse intre 4 si 6.Se utilizeaza la prajituri, fara a afecta aroma produselor. Sorbatii sunt eficienti fata de mucegaiuri si drojdii, dar cercetarile au demonstrat ca au efect si asupra bacteriilor (S.aureus, salmonele, coliformi, pseudomone).Prin utilizarea sorbatilor s-au obtinut durate de pastrare mai mari pentru carne de pui proaspata, carne de pui ambalata in vacum, peste proaspat, fructe perisabile. Sorbatii se mai utilizeaza ca fungistatici la branzeturi, produse de panificatie, sucuri de fructe. Acizii grasi saturati si sarurile lor.Aceasta grupa de conservanti este deosebit de importanta fiind reprezentata de: -acidul formic (HCOOH) si formiati -acidul acetic (CH3-COOH) si acetati -acidul propionic (CH3-CH2-COOH) si propionati -acidul caprilic (CH3-(CH2)6-COOH) Efectul de inhibare a microorganismelor, generat de acesti acizi, se datoreaza atat acidifierii pe care o produc cat si formelor nedisociate care predomina la pH scazut.Ei sunt adaugari in produsele alimentare sau sunt utilizati pentru dezinfectarea supreafetelor, sau eliberati in situ prin procese fermentative. 87

Acidul acetic, sub forma de otet este utilizat pentru conservarea unor legume (castraveti, gogosari), marinarea pestelui, condimentarea maionezelor. Efectul conservant se manifesta in special asupra bacteriilor si drojdiilor si mai putin asupra mucegaiurilor. Acidul propionic si sarurile lui de calciu si sodiu sunt permise pentru utilizarea in paine si produse de patiserie, cofetarie, branzeturi, ca inhibitor fungic si pentru prevenirea “intinderii” la paine, defect produs de B.mezentericus. Oxidul de etilena si propilena.Oxizii de etilena si propilena exista in stare gazoasa si se utilizeaza ca fumigatii in industria alimentara.Se folosesc ca agenti antifungici pentru fructele uscate, condimente, alune, nuci.Se mai utilizeaza ca agent sterilizant in ambalarea aseptica, in etapa de presterilizare, este un gaz toxic ce poate penetra materialele poroase.Este folosit pentru presterilizarea cartoanelor aseptice preconfectionate in incinte speciale inainte de masina de ambalare aseptica. Observatii privind utilizarea conservantilor in alimente. Utilizarea conservantilor in alimente, permite reducerea tratamentelor termice, a refrigerarii ceea ce aduce economii substantiale de energie.Tot odata conservantii mentin in stare proaspata alimentele o perioada de timp mai mare. Cu toate aceste avantaje, adaugarea in alimente a substantelor cu rol conservant, este puternic contestata de consumatori, pe motivul efectelor toxice insidioase ale substantelor utilizate drept conservanti.Din aceasta cauza se impun garantii pentru consumatori: -respectarea prevederilor legale (numai acei conservanti admisi, pentru grupa respectiva de produse) si desigur respectarea limitelor maxime admise in produs. -utilizarea ori de cate ori este posibila a conservantilor a caror prezenta in alimente este normala (condimente, metabolitii bacteriilor lactice, acizii grasi) compusi ce au origine naturala. -este bine sa se utilizeze efectul sinergic pe care-l pot manifesta diferite combinatii de conservanti astfel incat sa se 88

reduca concentratia in care acestia se folosesc si tot odata sa se evite dobandirea rezistentei de catre bacterii, situarie frecvent intalnita cand se utilizeaza o singura subtanta chimica. -substantele de conservare singure trebuie considerate numai ca niste componente ale sistemului de securitate a unor produse conservate, temperatura de prelucrare si de depozitare ramanand factorii cei mai importanti de inhibare microbiana.Ele determina pentru o perioada de timp inhibarea microflorei reziduale din produsele tratate termic.Aceasta devine foarte necesara in conditii de depozitare necorespunzatoare a acestor produse. Eficienta substantelor de conservare asupra inhibarii microflorei din produsele tratate termic este marita prin vatamarea celulelor microbiene. B. Dezinfectantii Asigurarea securitatii produselor alimentare si prevenirea proceselor alterative a acestora presupune reguli stricte de igiena in spatiile de productie (aeromicroflora, echipamente, personal, etc). Dezinfectia este operatia de eliminare, de distrugere a microorganismelor de pe suprafete, aer, apa, etc. Aceasta se poate realiza in mai multe moduri.Printre acestea se numara si utilizarea substantele chimice denumite dezinfectante. Dezinfectantii utilizati in industria alimentara trebuie sa indeplineasca o serie de conditii .Dupa Tofan (2001), acestia trebuie : sa nu fie toxici pentru om in dozele utilizate, sa nu imprime gust sau miros strain produselor, sa nu prezinte actiune coroziva, sa fie stabile in apa, sa posede un spectru larg de actiune, sa aiba o buna capacitate e patrundere, sa fie ieftini. Spectrul de actiune al dezinfectantilor prezinta o importanta deosebita.Dupa spectrul de actiune dezinfectantii pot avea efect bactericid, sporicid, fungicid si virucid. Utilizarea eficienta a dezinfectantilor presupune pe langa cunoasterea spectrului de actiune si testarea eficientei fata de anumite microoganisme.Microorganismele pentru asemenea testari trebuie sa apartina urmatoarelor categorii: -microorganisme indicatoare contaminarii umane 89

-microorganisme cu incidenta tehnologica -microorganisme patogene. Testarea eficientei dezinfectantului pentru aceste categorii de microorganisme constituie grantia alegerii corecte, eficiente a unui dezinfectant. Prezentam mai jos in tabelul Nr.10 spectrul de activitate al principalelor substante cu efect dezinfectant dupa Guyader 1996 . Tabelul Nr.10

Spectrul de activitate al principalelor substante cu efect dezinfectant Dezinfectantul Bacterii Mico- Spori Mucegaiuri Drojdii Virusuri bacterii Gram + Gram Acid +++ +++ peracetic Alcooli ++ ++ Alcool 700 ++ ++ 0 Glutaraldehida +++ +++ ++ Saruri NH4+ +++ +* 0 Amfoteri +++ + Biguanidina ++ ++ Clorhexidina +++ ++ + Clor +++ +++ ++ Derivati de Hg ++ ++ 0 Derivati fenolici v v v Apa oxigenata +++ +++ Iod +++ +++ ++

++

++

++

++

0 +

++ +

++ ++

++ +

+ 0 0

+++ + + (+) + ++ + v + ++

0 0 ++ 0 v + ++

++ + + (+) + ++ + v + ++

+++ actiune foarte buna ++ actiune buna + actiune moderata *inactive asupra speciilor de Pseudomonas V actiune variabila, in functie de compus (+) actiune inconstanta 0 actiune nula 90

++ + 0 0 0 ++ v 0 ++

Eficienta actiunilor de dezinfectie printre alti factori depinde in principal de:concentratie, durata de aplicare, temperatura, solubilitate, stare de agregare, sinergism, antagonism. Obtinerea unei eficiente maxime de la dezinfectant este dependenta de actiunile sinergice sau antagonice ale substantelor folosite. Efectele antagonice apar intre dezinfectanti si substantele organice. Dezinfectantii trebuie aplicati pe suprafete curate, operatia de curatire, spalare trebuie sa preceada operatia de dezinfectie. In tabelul Nr.11 se prezinta dupa Guyader 1969, antagonisme si sinergii la principalele categorii de dezinfectanti. Tabelul Nr.11

Antagonisme si sinergii ale principalelor categorii de dezinfectanti Categoria

de dezinfectanti

Substante antagonice

Substante sinergice

Halogeni Compusi clorinati Substante organice Tiosulfati Sulfuri Saruri feroase Compusi iodurati Acizi tari Substante organice Sapunuri Compusi cu mercur Saruri NH4+ Tiosulfat de sodiu Aldehide Amoniac Apa Alcooli Substante organice Apa Fenoli Substante organice Saruri de sodiu si potasiu (grasimi, galbenus) Saruri NH4+ Sapunuri pentru anumiti fenoli 91

Saruri metalice

Tabelul Nr.11

Antagonisme si sinergii ale principalelor categorii de dezinfectanti (continuare) Categoria

de dezinfectanti

Agenti Anionici tensioactivi

Cationici Amfoterici

Substante antagonice

Substante sinergice

Alcool pentru hexaclorofen Substante organice Saruri NH4+ Hexaclorofen Substante organice Crezol Grasimi, sapunuri, calciu magneziu, aluminiu Sapunuri Compusi cu sulf

Biguanidine Clorhexidina Hexamidina

Substante organice Saruri NH4+ Sapun, lecitina, galbenus Amfoteri Ioni fosfat

Alcooli, halogeni Excipienti de umidificare

Carbamide

Substante organice

KMnO4

Substante organice

Agenti tensioactivi

Nu exista dezinfectanti eficienti si ineficienti, ci doar conditii corecte sau incorecte de utilizare.Aplicarea conditiilor corecte de utilizare a unui dezinfectant va determina o eficienta maxima a acestuia II.3 Factorii mecanici Agitarea, filtrarea si centrifugarea sunt factoriI fizici de natura mecanica ce pot influenta dezvoltarea microorganisme92

lor.De asemenea prelucrarea alimentelor influenteaza profilul si continutul microbian al alimentelor. II.3.1. Agitarea favorizaeaza si accelereaza schimbul de substante dintre celule si mediul de cultura, ceea ce determina cresterea dezvoltarii microorganismelor. La cultivarea fungilor in culturi submerse, agitarea influenteaza forma de crestere iar aceasta la randul ei influenteaza cinetica de crestere.La o agitare intensa, miceliul are filamente dispersate in mediul de cultura iar cresterea lui se desfasoara exponential iar mediul respectiv se comporta ca un fluid nenewtonian.La agitare lenta, mucegaiurile formeaza peleti iar mediul se comporta ca un fluid newtonian.Pentru a preveni formarea peletilor se intensifica agitarea. Formarea peletilor este insa dorita la producerea unor metaboliti fungici (penicilina, acidul itaconic, acidul citric). II.3.2. Filtrarea este operatia care are ca scop separarea fazei continue (lichida sau gazoasa) dintr-un amestec, care contine si o faza discontinua (solida sau lichida).Daca microorganismele reprezinta faza discontinua ele pot fi recuparate sub forma de biomasa celulara in vederea obtinerii unui inocul concentrat sau separat pentru a obtine o faza continua lipsita de microorganisme asa cum se procedeaza la filtrarea aerului sau sterilizarea la rece a produselor lichide. Eficienta filtrarii depinde de caracteristicile fizice ale celulelor, de caracteristicile filtrelor precum si de modul de operare. Dimensiunea celulelor este un parametru care trebuie luat in considerare la filtrare.Pot fi indepartate usor prin filtrare fungii care au dimensiuni de ordinul milimetrilor, in timp ce levurile au (2-6μm), bacteriile (0, 1-3 μm) iar virusurile (0, 030, 1 μm) ce sunt mai greu de indepartat. Separarea microorganismelor dintr-un lichid este dependenta de: 93

-concentratia celulelor -morfologia celulelor -sarcina electrica a celulelor fata de mediul inconjurator -plasticitatea si capacitatea de compresie a celulelor (ce permite trecere acestora prin porii filtrului) -modalitatea de asociere a celulelor (lungimea lanturilor) care mareste dimensiunea particulelor -prezenta asa ziselor exopolizaharide care influenteaza aderarea celulelor la filtru Filtrarea mai este influentata de parametrii fazei continue: temperatura vascozitate, comportament newtonian sau nenewtonian al mediului, pH-ul, prezenta altor particule decat celulele microbiene, agresivitatea chimica, volatilitatea. Cele mai importante caracteristici ale unui filtru sunt:capacitatea de filtrare, tipul materialului filtrant, dimensiunile porilor, viteza de scurgere si presiunea de lucru. Acumularea celulelor pe suprafata filtranta, scade viteza de filtrare, pentru eliminarea, reducerea acestui inconvenient se utilizeaza adjuvanti de filtrare (pamantul de diatomeeKizelguhr-ul si perlita) care pot mari viteza de filtrare de pana la 20 de ori. Aplicatii ale filtrarii in industria alimentara.Utilizarea filtrarii in vederea separarii microorganismelor, prelungirii duratei de pastrare a unor alimente, bauturi, se practica curent.De asemenea, filtrarea se utilizeaza pentru abtinerea apei potabile si la tratamentul apelor uzate. In industria laptelui, pentru distrugerea microflori patogene se utilizeaza pasteurizarea sau sterilizarea, aceste tratamente sunt eficiente, dar produc modificari senzoriale asupra laptelui.Prin microfiltrare se pot indeparta microorganismele fara afectarea calitatilor senzoriale. In industria vinului, tehnologia vinurilor de calitate se incheie cu operatia de filtrare care confera limpiditate si stabilitate. 94

Filtrarea se realizeaza in doua etape:prefiltrare si filtrare de finisare. Prefiltrarea retine cea maimare parte de microorganisme, protejeaza filtrul utilizat la filtrarea finala.Prefiltrarea utilizeaza cartuse filtrante cu prag de retinere de 1-2μm, confectionate din fibra de sticla, acoperite cu rasini de uz alimentar.Membranele filtrante au sarcina electrica pozitiva, ceea ce favorizeaza atractia electrostatica a particulelor fine. La filtrarea finala se utilizeaza membrane cu prag de retentie de 0, 45-1, 2μm pentru eliminarea bacteriilor si drojdiilor. In industria berii, filtrarea este utilizata pentru indepartarea celulelor de drojdie si a substantelor generatoare de turbiditte.Limpiditatea berii se obtine printr-o filtrare grosiera, urmata de o filtrare de clarificare si o filtrare de finisare. In industria alimentelor filtrarea mai este utilizata la clarificarea bauturilor (otet, cidru, sucuri de fructe), la filtrarea aerului si la filtrarea apei potabile. In biotehnologii filtrarea este utilizata la sterilizarea mediilor de cultura, pentru a proteja componentele termosensibile (antibiotice, vitamine), la numararea microorganismelor (numararea celulelor din medii lichide), la obtinerea unor metaboliti in bioreactoare cu functionare continua si densitate mare de celule.Comparativ cu sistemele discontinue, care au productivitati scazute, sarje de calitate variabila, sistemele cu functionare continua prin sisteme de filtrare asigura o productie volumetrica mare si o tehnologie post-procesare simplificata. II.3.3.Centrifugarea-eliminarea microorganismelor din unele alimente mai ales cu componente termosensibile, se poate realiza prin centrifugare.Cele maimulte aplicatii in industria alimentara realizate in scopul indepartarii microorganismelor se intalnesc in industria laptelui si a produselor lactate. 95

Separarea bacteriilor in industria laptelui prin centrifugare se bazeaza pe diferenta de densitate intre componentele laptelui si celulele bacteriene, densitatea laptelui (1, 03 kg/L), respectiv a smantanii cu 40% grasime (0, 99 kg/L) fiind mai mica decat cea a bacteriilor (1, 07-1, 13 kg/L) sau a sporilor.Centrifugarea la forte foarte mari (9000 sau 10000 g) are ca finalitate indepartarea celulelor bacteriene din lapte. Pentru o forta constanta g de centrifugare eficienta indepartarii bacteriene depinde de mai multi factori: -tipul de bacterii (densitati celulare diferite ale bacteriilor) -temperatura de centrifugare (cresterea temperaturii produce scaderea vascozitatii fapt ce faciliteaza migrarea celulelor prin lichidul centrifugar iar la temperaturi de peste 750C sunt inactivate si aglutininele, fapt ce limiteaza fenomenul de atasare a sporilor de globulele de grasime marindu-se astfel eficienta centrifugarii).Pentru sucul de mere nu este importanta cresterea temperaturii la 70C, se realizeaza o eficienta de 0, 9%, fapt ce constituie un avantaj-se mentine aroma naturala a sucului) In industria laptelui centrifugarea este utilizata pentru eliminarea bacteriilor din lapte ca masura suplimentara la tratamentele termice. Centrifugarea laptelui mareste termenul de valabilitate a laptelui pasteurizat cu 3-5 zile. Centrifugarea nu inlocuieste pasteurizarea sau sterilizarea, care inactiveaza lipazele din lapte, ce produc alterarea laptelui, si care nu pot fi indepartate prin centrifugare. Indepartarea bacteriilor sporogene din lapte (B.cereus) si a sporilor prezinta interes la obtinerea laptelui UHT in care sporii de B.cereus supravietuiesc la tratamente termice si care produc defecte la depozitare. In tehnologia branzeturilor, prezenta in laptele materie prima a peste 300 spori de Clostridium tyrobutyricum/litru, la 96

fabricarea branzeturilor Gaude sau a 2000 spori/litru in cazul branzeturilor Emmental, produce asa numita “balonare tarzie” a branzeturilor. In tarile in care nu este admisa adaugarea de nitrati sau formaldehida in lapte, centrifugarea a contribuit la reducerea numarului acestor bacterii. La prelucrarea zerului, centrifugarea este utilizata in vederea obtinerii concentratelor proteice, cu mentinerea proprietatilor functionale ale proteinelor zerului care pot fi afectate usor de temperatura. Centrifugarea mai este utilizata si la obtinerea de culturi starter de bacterii si drojdii.Culturile starter se utilizeaza la fabricarea produselor lactate acidofile si a brenzeturile.Culturile starter concentrate contin (5-10)x1010 celule microbiene/g. Bacteriile selectionate sunt cultivate pe medii nutritive specifice.Lichidul cultural este centrifugat in vederea separarii bacteriene.In acest caz utilizand bactofrigorul (masa concentrata de celule) in vederea obtinerii unui inocul standardizat.Concentratul celular este congelat cu azot lichid la -1960C si ambalat steril. Centrifugarea mai este utilizata la fabricarea drojdiei de bere (obtinerea unei mase concentrate de celule). Astazi, centrifugarea ca metoda de indepartare a bacteriilor, sporilor si celulelor somatice din lapte, are o alternativa deosebit de eficienta, microfiltrarea pe membrane specifice la temeperaturi scazute. II.3.4. Contaminarea alimentelor in timpul prelucrarii Contaminarea alimentelor in diferite faze de prelucrare de la obtinerea materiei prime si pana la produsul finit, constituie o realitate.Din aceasta cauza in decursul timpului, perfectionarea tehnologiilor a proceselor de prelucrare a fost intotdeauna conditionata de desfasurarea lui in conditii igienice, prin care sa se evite contaminarea alimentelor. Evitarea contaminarii carcaselor nu este posibila fara 97

igienizarea procesului de taiere.Eviscerarea necorespunzatoare a mamiferelor si pasarilor, determina contaminarea suprafetei carcaselor cu enterobacterii, E.coli si Salmonella. Folosirea de instrumente, echipamente igienizate necorespunzator la obtinerea si prelucrarea carnii determina transferul microorganismelor de la carnea contaminata la cea necontaminata. Laptele dupa pasteurizare se poate recontamina cu microorganismele existente pe conducte sau dela recipientele in care se introduce. Conservele si semiconservele se pot contamina dupa sterilizare, pasteurizare cu microorganismele din apa de rcire daca nu se asigura o ermeticitate perfecta a cutiilor. Alimentele se pot contamina in timpul procesarii si prin adaosuri de condimente, sare, zahar ce sunt de regula contaminate cu bacterii sporulate (spori) ce sunt rezistenti la tratamentele termice moderate (pasteurizari). Personalul muncitor poate fi o sursa importanta de contaminare a alimentelor pe timpul prelucrarii. Contaminarea in timpul prelucrarii prezinta o semnificatie deosebita pentru conservabilitatea si securitatea alimentelor din urmatoarele motive: -microorganismele contaminate, provenite de pe suprafetele si utilajele din intreprindere sunt de obicei microorganisme adoptate la conditiile de depozitare a alimentelor, aflate in faza de multiplicare logaritmica, ceea ce determina aparitia rapida de fenomene alterative, chiar in conditii de depozitare corespunzatoare -o parte din microorganismele contaminate provenite de la personalul care prelucreaza si manipuleaza alimentele, pot fi patogene, fapt ce mareste riscul pentru consumatori. -frecvent, contaminarea se realizeaza dupa ce alimentele au suferit tratamente termice.Microorganismele recontaminante gasind in alimentul prelucrat conditii mai bune de multiplicare.Substratul tratat termic sufera unele simplificari proteice 98

foarte convenabile multiplicarii microbiene iar concurenta bacteriana nu exista.Se subintelege ca un aliment recontaminat dupa tratarea termica constituie un mediu mai favorabil pentru dezvoltarea salmonelelor, stafilococilor si altor germeni patogeni. -alimenetele supuse diferitelor tratamente se considera de catre nestiutori mai stabile decat cele netratate si din aceasta cauza ele nu se tin in conditii in care microorganismele sunt inhibate, ceea ce poate determina multiplicarea rapida a acestora, urmata de alterarea produsului sau de cresterea riscului pentru consumatori. Se poate afirma ca in timpul procesarii alimentelor se produce o selectie a microorganismelor, prin efectele combinate ale proprietatilor fizico-chimice ale alimentului si a proprietatilor microorganismelor. Prin susccesiuni microbiene se produc modificari ale microflorei din aliment .

99

Capitolul III –Factorii impliciti

In afara factorilor intrinseci, extrinseci dezvoltarea microorganismelor sau a asociatiilor microbiene din alimente este influentata de o serie de proprietati ale fiecarei grupe, specii, tulpini si chiar mutante microbiene care determina in cele din urma dominanta uneia sau alteia din acestea.Aceste influente care au la baza insusirile biologice ale microorganismelor sunt cunoscute in ecologia microbiana sub denumirea de factori (parametrii) impliciti si sunt reprezentati de rata specifica de inmultire, simbioza si antagonismul. III.3. Rata specifica de inmultire.O specie sau o tulpina microbiana pe un anumit mediu se multiplica intr-un anumit mod cu o rata caracteristica.Rata de inmultire a unui anumit microorganism reprezinta un factor implicit de influentare a altor microorganisme numai in masura in care ea se desfasoara in conditii optime, conditii care nu sunt aceleasi pentru toate grupele si speciile de microorganisme. Multiplicarea unui microorganism poate fi determinata in general de trei parametrii:lungimea fazei de multiplicare logaritmica, timp / generatie sau rata de multiplicare si numarul total de celule rezultat la sfarsitul perioadei de multiplicare. Acesti parametrii depind atat de proprietatile biochimice ale microorganismelor cat si de factorii genotipici si fenotipici specifici prezenti incidental.Unele specii se inmultesc greu, incet si neregulat, chiar cand conditiile de crestere sunt optime. Acumularea de produse metabolice limiteaza de obicei multiplicarea speciei care le-a produs.Daca aceste produse metabolice limitante pot fi folosite ca substrat nutritiv de alte 100

specii, acestea pot forma impreuna cu primele „asociatii” sau „succesiuni”.Alteori produsele metabolice rezultate din multiplicarea unei specii microbiene inhiba total sau partial dezvoltarea altora. Pe parcursul dezvoltarii microflorei microbiene dintr-un produs, aceasta interactioneaza ceea ce confera dominatiei microbiene dintr-un produs un caracter dinamic.Interactiunile dintre microorganisme pot fi sinergice (favorizare reciproca) sau antagonice (dezvoltarea uneia inhiba dezvoltarea celeilalte). III.2. Simbioza.Reprezinta o interactiune intre specii microbiene diferite caracterizta prin stimularea reciproca a dezvoltarii lor.Aceste proces are loc cand un microorganism produce modificari ale coditiilor de crestere in care se afla, modificari care sunt favorabile dezvoltarii altei specii sau grupe. Simbioza se poate produce prin mai multe mecanisme: - disponibilizarea unor substante nutritive de catre un microorganism, substante necesare si utilizabile pentru altul; - modificarea valorii pH-ului alimentului.Ca urmare a activitatii metabolice unele specii sau grupe microbiene metabolizeaza diferiti acizi, altele datorita activitatii proteolitice dau nastere la substante alcaline, ambele procese soldandu-se cu modificari ale pH-ului; - modificarea valorii potentialului redox.Multiplicarea bacteriilor este insotita de o scadere a tensiunii oxigenului datorita eliberarii gruparilor sulfhidrice (SH) prin descompunerea unor substante proteice, grupari care fixeaza oxigenul ceea ce duce la scaderea potentialului redox; - modificarea valorii apei active.Prin actiunea microorganismelor asupra unui substrat se produce apa, care mareste valoarea apei active din substrat; - metabolizarea unor substante antimicrobiene. Substantele inhibitoare pentru o specie microbiana prezente la 101

un moment dat in aliment pot fi metabolizate (descompuse) de alta specie, care produce in acest fel conditii favorabile pentru dezvoltarea primei specii; - stimularea reciproca a dezvoltarii.In unele asociatii microbiene simbiotice, activitatea metabolica si multiplicarea nu este maxima daca nu sunt prezenti ambii parteneri: fiecare partener produce substante care stimuleaza dezvoltarea celuilalt. - denaturarea sau permeabilizarea unor structuri biologice.Unele specii microbiene datorita proprietatilor lor biochimice hidrolizeaza unii compusi din care sunt formate unele structuri tisulare, facandu-le accesibile si altor specii lipsite de asemenea posibilitati(coaja la fructe, fasciile si sarcolema la muschi).Integritatea fasciilor si sarcolema poate fi distrusa numai de catre bacteriile colagenolitice. III.3. Antagonismul.In microbiologia alimentelor, procesele antagonice sunt destul de frecvente.Ele includ inhibarea directa a unui microorganism de catre altul, concurenta sau competitia pentru spatiu si substantele nutritive si parazitismul intermicrobian. Mecanismele prin care se realizeaza antagonismul microbian sunt asemanatoare cu cele ce actioneaza in simbioza(folosirea competitiva a substantelor nutritive, modificarea valorii apei active, schimbarea valorii pH-ului si a potentialului redox, modificarea compozitiei chimice a alimentului). Formarea de substante antimicrobiene constituie un mecanism de baza cu particularitati in antagonismul microbian.Numeroase microorganisme produc metaboliti cu activitate antimicrobiana.Unii dintre acestia au o structura chimica simpla si o actiune nepecifica ca de exemplu: ionii de hidrogen, dioxidul de carbon, apa oxigenata, etanolul, diferiti acizi organici (lactic, acetic, formic, propionic) care inhiba in 102

general microflora de putrefactie.Alti metaboliti cum sunt antibioticele prezinta o structura chimica complexa si au o actiune inhibitoare specifica. Un asemenea antibiotic ce se formeaza in alimente ca rezultat al dezvoltarii unor microorgnisme este Nisina. In prezent se cunosc numeroase antibiotice produse de cele mai diverse microorganisme ca de exemplu: Enterobacteriaceae (bacteriocina, colicina) Micrococcaceae (stafilina, stafilococina) Streptococaceae ( nisina si enterocina) Bacillaceae (subtilina, clostocina, boticina). Liza bacteriilor de catre fagi constituie un alt mecanism de relatie antagonica.Exista numeroase situatii in care microorganismle sunt lizate de catre fagi specifici.Bacteriofagia nu are semnificatie in asociatiile microbiene generatoare de procese alterative la alimente.O semnificatie deosebita o capata acest fenomen in cazul culturilor Starter. Mossel (1977) precizeaza ca intre unele bacterii patogene si unele bacterii saprofite de alterare din alimente, exista urmatoarele antagonisme: Bacterii patogene Bacterii saprofite Salmonella E. colli, Pseudomonas S. aureus Aeromonas, Bacillus C. botulinum B. Subtilis, C. Sporogenes C. perfringens C. Sporogenes, streptococi Antagonismul ca interactiune microbiana, prezinta semnificatii deosebite pentru tehnologia alimentelor, conservarea lor ca si pentru sanatatea publica. Majoritatea germenilor patogeni pentru om, producatori de toxiinfectii alimentare sunt inhibati de microflora saprofita de alterare. Frecventa relativ rara a toxiinfectiilor stafilococice se 103

datoreaza cel putin in parte si acestui fenomen. S. aureus este deosebit de sensibil la competitia microbiana, nu numai fata de Pseudomonas, Enteriobacteriaceae si Lactobacillaceae.De asemenea enterotoxina stafilococica pare a fi inactivata de bacteriile lactice. Dezvoltarea saprofitilor in alimente prodece modificari organoleptice asupra acestora si deci respingerea lor de catre consumatori.Industria alimentara este capabila sa produca alimente lipsite de microorganisme saprofite, cu un continut total de microorganisme redus, ca de exemplu alimentele tratate termic.Asemenea alimente contin frecvent specii de clostridii si bacillus care au supravietuit tratamentului termic si care in conditii favorabile de temperatura se vor dezvolta rapid in absenta microflorei concurente. Lipsa saprofitilor pe post de avertizori poate determina aprecieri gresite privind riscul unor asemenea alimente pentru sanatatea consumatorilor. Contaminarea produselor cu germeni patogeni (S. aureus, Salmonella) dupa tratarea termica reprezinta riscuri deosebit de mari pentru consumatori. III.4. Succesiuni microbiene.Profilul microbian al unui aliment se schimba continuu, o asociatie microbiana urmand alteia.Inlocuirea unei asociatii microbiene cu alta se numeste succesiune microbiana si ea este determinata de interactiunea factorilor intrinseci, extrinseci si impliciti sub influenta carora se afla alimentul. Alterarea unui aliment implica o succesiune de microorganism Una din cele mai cunoscute succesiuni microbiene este succesiunea microflorei din carnea cruda sau pestele proaspat pastrat la temperaturi de 5-10 0C formata dintr-un complex de bacterii din genurile Pseudomonas - Acinetobacter – Moraxella.. In alimentele ambalate in lipsa aerului succesiunea observata in mod obisnuit este: bacili Gram-negativi-streptococi-lactobacili. 104

Succesiunea microbiana din laptele crud, in timpul alterarii lui, depinde in mare masura de temperatura la care se desfasoara procesul de alterare. Daca laptele este pastrat la temperaturi cuprinse intre 1020° C, dupa faza bactericida sau bacteriostatica scurta, incep sa se multiplice unele specii proteolitice care produc o usoara alcalinizare a laptelui.Simplificarile proteice produse de aceste bacterii creeaza conditii favorabile multiplicarii sptreptococilor lactici – S. lactis, Str. cremolis care produc o acidifiere totala.Urmeaza o alta faza de alcalinizare, produsa de multiplicarea bacteriilor Gram-pozitive sporogene-bacillus, Clostridium. Aceasta faza este urmata de o alta faza de acidifiere produsa de dezvoltarea streptococilor si lactobacililor, acidifiere care determina coagularea spontana a laptelui, datorita atingerii unui pH scazut.In acest moment bacteriile gram negative isi inceteaza in totalitate activitatea. Daca laptele crud se depoziteaza la temperatura de refrigerare succesiunea microbiana este diferita ca si transformarile pe care le sufera laptele.Microflora initiala predominant Grampozitiva este treptat acoperita de bacterii Gram-negative psihotrofe, in special de cele din genurile Pseudomonas si Alcaligenes, cu proprietati proteolitice insemnate.Efectul dezvoltarii acestei microflore este alterrarea laptelui care are caracter mai mult proteolitic decat glicolitic. In alimentele cu pH neutru, cu valori ale apei active mari si cu continut bogat in proteine si sarac in hidrati de carbon, se dezvolta bacteriile Gram-negative, proteolitice, alterarea avand un caracter dominant de putrefactie. In alimentele cu pH mic si cu valori ale apei active mici si in care sunt prezenti hidratii de carbon se vor dezvolta in special bacteriile Gram-pozitive.

105

Capitolul IV –Aparitia mutantelor rezistente la factorii de mediu

Orice nisa ecologica este contaminata initial cu microorganisme din sol, apa de suprafata si din praful atmosferic.Caracteristicile fiecarei nise vor determina pana la urma care microorganisme sau asociatie microbiana va domina in final. Frecvent in alimente sau pe utilajele si suprafetele din unitatile de industrie alimentara se intalnesc un numar important de microorganisme cu o rezistenta neobisnuit de mare fata de factorii inhibitori sau letali.Acestea apar ca o consecinta a selectiei exercitata de factorii caracteristici ai acelei nise ecologice. Astfel in alimentele cu pH scazut sunt prezente in numar mare microorgnisme rezistente la aciditate mare (lactobacili, levuri si mucegaiuri).In fabricile unde se prelucreaza alimente conservate cu otet se vor intalni levuri rezistente la acid acetic (S. bailli, Pichia membranaefaciens) daca nu se executa spalari si dezinfectii eficiente ale suprafetelor de lucru si utilajelor. In unitatile de procesare a carnii unde se foloseste nitratul si nitritul ca aditivi se vor intalni frecvent lactobacili si levuri tolerante la aceste substante, sau specii de Bacilaceae nitrit-reducatoare.In fabricile de conserve, unde se utilizeaza tratarea termica la nivel inalt (sterilizarea) se pot intalni spori de Bacillus foarte rezistenti la caldura. Levurile osmotolerante si mucegaiurile xerofile se intalnesc frecvent in fabricile ce prelucreaza produse cu continut mare de zahar si cu umiditate relativ mica. In depozitele frigorifice se vor gasi un numar mare de bacterii, levuri si mucegaiuri psihotrofe si psihrofile. 106

Combaterea acestor microorganisme cu rezistenta deosebita prin nivelele factorilor intrinseci si extrinseci care sa opreasca multiplicarea lor nu este posibila. Tratamentele termice la nivele mai mari, marirea concentratiei unor substante adaugate, scaderea pH-ului sau a apei active peste anumite valori nu este posibila datorita modificarilor organoleptice, ce pot aparea in alimente. Combaterea acestor microorganisme cu rezistenta particulara este posibila numai prin masuri ca: - evitarea sau limitarea contaminarii alimentelor cu o asemenea microflora.Materiile prime trebuie alese cu grija si supuse controlului microbiologic sistematic.Se impune depistarea surselor de contaminare (locuri, utilaje, faze tehnologice, manipulari, etc). - executarea operatiunilor de spalare si dezinfectie, zilnic dupa fiecare schimb, a suprafetelor ce vin in contact cu alimentele.Orice rest alimentar lasat mult timp pe suprafete si utilaje contribuie la multiplicarea mutantelor microbiene ultrarezistente; - de regula o sursa principala de contaminare cu microorganisme ultrarezistente o formeaza ambalajele murdare si produsele returnate in intreprindere sau depozite din cauza diferitelor reclamatii.In conditiile actuale se pot receptiona ambalaje in special navete si de la alti furnizori de alimente deci si din alte nise ecologice.Trebuie interzisa introducerea unor astfel de ambalaje in salile de fabricatie.Aceasta masura contribuie substantial la evitarea alterarii produselor de catre microorganismele, mutantele rezistente la diferiti factori ce influenteaza dezvoltarea microorganismelor.

107

Capitolul V – Procese metabolice mediate de microorganisme cu aplicatii in industria alimentara

Celula bacteriana ca orice organism viu, se constitue intr-un sistem cu organizare complexa, dotata cu continuitate genetica, deci cu capacitate de a se reproduce in mod independent.Aprovizionata cu hrana, ea isi sintetizeaza constituentii proprii folosind pentru aceasta energia eliberata din degradarea enzimatica a substratului ei nutritiv.Metabolismul bacterian reprezinta totalitatea reactiilor biochimice implicate in activitatea biologica a celulei bacteriene prin intermediul carora energia si elementele biogene ca atare sau sub forma de combinatii mai mult sau mai putin complexe, sunt preluate din mediu si utilizate pentru biosinteza si crestere, ca si pentru alte diferite activitati fiziologice secundare ( mobilitate, luminiscenta). Existenta microorganismenlor, continuitatea lor genetica este conditionata de desfasurarea concomitenta a celor doua laturi independente ale metabolismului: catabolismul si anabolismul. Catabolismul, caracterizat prin reactii ce elibereaza energie (exotermice), ce insotesc procesele de dezasimilatie, prin care se degradeaza enzimatic substantele nutritive din mediu. Anabolismul, caracterizat prin reactii ce consuma energie ( endotermice), ce insotesc procesele de asimilare in care energia este folosita in biosinteza constituentilor celulari. Aceste tipuri de reactii sunt in stransa dependenta, astfel incat degradarea substantelor nutritive, care furnizeaza energie asigura in acelasi timp si aprovizionarea celulei cu compusi de constructie biochimica sau precursori ai lor, in vederea 108

realizarii biosintezei prin asambalarea lor sub forma de macromolecule proprii celulei. Aceasta particularitate functionala de intersectie a cailor catabolice cu cele anabolice, din cadrul metabolismului, l-a determinat pe Davis sa o denumeasca drept cale amfibolica. Reactiile metabolismului indeplinesc patru functii esentiale : -producerea de compusi folositi pentru constructia constituentilor celulari pornind de la substante nutritive -eliberarea de energie si stocarea ei sub forma de compusi macroergici. Principalii compusi macroergici sunt: ATP-ul, acetilfosfatul si fosfoenolpiruvatul, compusi care pot disponibiliza, prin ruperea legaturii macroergice, cantitati variabile de energie. -activarea subunitatilor de constructie, monomere pe seama energiei de legatura din compusii macroergici. -formarea constituentilor celulari, macromoleculari prin polimerizarea monomerilor, proces care in unele cazuri (proteine, acizi nucleici, polizaharide), decurge conform informatiei genetice a celulei. Una din caracteristicile distinctive ale activitatilor metabolice microbiene este intensitatea lor exceptional comparativ cu aceea a activitatilor analoage ale organismelor superioare.Astfel, activitatea respiratorie a unui gram ( raportat la substanta uscata) de bacterii aerobe este de cateva sute de ori mai intensa decat cea a omului, iar potentialul metabolic al microorganismelor din 25 de cm superficiali ai solului de pe o suprafata de un hectar este echivalenta cu cea a catorva zeci de mii de oameni.Dupa Hawker si colab., un gram de bacterii lactice hidrolizeaza intr-o ora 200-14890 g lactoza.Bacteriile dispun de o imensa capacitate metabolica si o aptitudine cu totul deosebita de a supravietui in conditii de viata foarte variate. Pentru a atinge un asemenea nivel de activitate metabolica, organismul uman ar avea nevoie de mai multe mii de tone 109

de alimente pe ora.O asemenea activitate metabolica, putin comuna in lumea vie, este posibila in buna parte, datorita suprafetei foarte mari a celulelor microbiene in raport cu greutatea lor.Aceste microorganisme au o suprafata foarte mare de contact cu mediul inconjurator, de schimb de substante intre celula si mediu, precum si o serie de proprietati fizico-chimice caracteristice sistemelor coloidale.Dupa Starka viteza metabolismului, viteza de crestere este invers proportinala cu marimea organismului.Ca atare, cu cat corpul unui microorganism este mai mic, cu atat meabolismul sau este mai intens si cresterea sa mai rapida. Considerate in asamblu, bacteriile sunt microorganism, tipic omnivore, deoarece isi pot realiza metabolismul folosind cele mai diferite substante nutritive de la azot molecular, dioxid de carbon, sulf si pana la substante organice complexe. Orice substanta din mediu, organica sau anorganica, din care se poate obtine energie este accesibila metabolismului bacterian.Exista microorganisme care, pentru sinteza constituentilor celulari, pot folosi substante lipsite de orice inrudire structurala cu componentele chimice ale celulei sau care sunt chiar toxice, substante si materiale care acopera o gama larga de complexitate chimica, incepand de la acizi formic, oxalic si sulfuric si pana la fenoli, asfalt, parafine, petrol, chitina, piele, cauciuc, lemn si substante antibiotice.In lumea bacteriilor exista insa si mari diferente individuale . P. fluorescens poate mtaboliza peste 200 de substante organice naturale, in timp ce Nitrosomonas sp., nu poate utiliza decat NH3 si O2. Aceste particularitati ale metabolismului microbian explica de altfel si faptul ca diferitele substante organice provenite din materiale reziduale si din cadavre au fost degradadate inca de la aparitia vietii pe pamant, fapt ce nu a permis acumularea acestora.Se poate considera ca celula microbiana este ca o fabrica biochimica, care prelucreaza nutrienti, cu producere de energie si de compusi rezultati din 110

prelucrare ce pot fi folositi pentru biosinteza, iar reziduurile sunt eliminate din celula. Dupa Banu si colaboratorii(1980) produsii de metabolism rezultati pot fi impartiti in: -produsi primari, care se formeaza in faza de crestere exponentiala a celulelor si sunt produsi esentiali pentru celule -produsi secundari, care se formeaza in faza de declin a cresterii celulelor care nu sunt esentiali celulei( toxine, alcaloizi). Produsii de metabolism microbian se pot forma in mod natural din diferite habitaturi in care traiesc microorganismele sau in mod dirijat in conditii industriale, in vederea obtinerii de produse de metabolism microbian cu valoare economica. In tabelul de mai jos prezentam dupa Banu si colaboratorii (1980) procesele fermentative utilizate in industria alimentara, produse de culturile selectionate. Fermentatii anaerobe; Produsi de fermentatie Alcoolica; Alcool etilic;CO2 Lactica Acid lactic; diacetil Propionica; Acid propionic, acetic, CO2 Butirica; Acid butiric, CO2; H2

Microorganisme selectionate Saccharomyces Lactobacillus Propionibacterium

Clostridium

111

Fermentatii oxidative Produsi de fermentatie Acetica; Acid acetic, H2O Gluconica Acid gluconic Citric Acid citric

Microorganisme selectionate

Oxalica, fumarica

Aspergillus

Acetobacter Gluconobacter Aspergillus Aspergillus

Fermentatia alcoolica-este un proces anaerob prin care glucidele fermen-tescibile sunt metabolizate prin reactii de oxido-reducere, sub actiunea echipamentului enzimatic al drojdiei, in produsi principali (alcool etilic si CO2) si produsi secundari (alcooli superiori, acizi, aldehide). Agentii tipici ai fermentatiei alcoolice sunt drojdiile din genul Saccharomyces, care prin fermentatia glucidelor, poate sa produca ma mult de 80 alcool etilic. Si alte specii microbiene ( B. macerans, Cl. acetonoetilicus, Zymonas mobilis) pot produce fermentatia alcoolica dar cu producere de alcool etilic in cantitati mai reduse. Fermentatia lactica este un proces anaerob in cursul caruia glucidele fermen-tescibile sunt metabolizate sub actiunea echipamentului enzimatic al microorganismelor in acid lactic, ca produs principal, si diacetil, acetoina, acid acetic, alcool etilic si CO2, ca produsi secundari. Fermentatia lactica este produsa de mai multe microorganisme, dar randamente superioare de transformare a glucidelor in acid lactic se intalnesc la bacteriile lactice si unele mucegaiuri. Bacteriile lactice sunt utilizate in industria laptelui, a carnii, in panificatie, la conservarea produselor vegetale si la obtinerea acidului lactic. Acidul lactic se poate obtine si cu ajutorul unor specii selectionate de Aspergilllus, Penicillium, Mucor, cultivate submers cu arerare dirijata. Activitatea excesiva a bacteriilor lactice in unele alimente genereaza alterarea acestora ( acrirea berii, borsirea vinului ) si pierderi de zaharoza la difuzie in industria zaharului. Fermentatia propionica este un proces anaerob prin care substratul fermentescibil, acidul lactic este transformat sub actiunea complexului de enzime al bacteriilor propionice in acid propionic, acid acetic si CO2. Pe langa bacteriile propionice, agentii tipici ai fermentatiei propionice si unele 112

bacterii anaerobe precum Cl. propionicum si reprezentanti ai genului Veillonella pot produce prin catabolism acid propionic. Fermentatia butirica reprezinta un proces anaerob, prin care diverse surse de carbon sunt metabolizate sub actiunea bacteriilor butirice, in produsi principali ai fermentatiei acid butiric si gaze: CO2 si H2.In functie de specie si conditii se mai pot forma diversi solventi ca: butanol, propanol, etanol si acetona. Acidul butiric sub forma esterificata este folosit la fabricarea unor esente ( butirat de metil cu aroma de mar, butirat de etil cu aroma de para sau ananas). Fermentatia butirica poate produce si deprecieri calitative la unele alimente . La fabricarea unor branzeturi, cand laptele este contaminat cu bacterii butirice, rezistente la pasteurizare, in timpul maturarii se produce germinarea sporilor si asa-zisa “ balonare tarzie” a branzeturilor, caracterizata prin deformare, ruptura in pasta si miros neplacut de acid butiric. Demn de retinut este faptul ca fermentatia butirica in spatii inchise poate genera explozii. Spre deosebire de fermentatiile anaerobe, fermentatiile acetica, gluconica si citrica sunt procese oxidative, care au loc in prezenta oxigenului si se deosebesc de metabolismul oxidativ (respiratie ) prin aceea ca oxidarea este limitata si are drept rezultat formarea unor acizi organici cu valoare economica ridicata. Fermentatia acetica este un proces prin care substratul (alcoolul etilic), este oxidat in prezenta oxigenului din aer, sub actiunea enzimelor bacteriilor acetice in acid acetic. Hennerberg citat de Banu si colaboratorii (2008) propune o clasificare a bacteriilor acetice, in patru grupe, in functie de cantitatea de acid acetic produsa: -bacterii acetice din plamada( Gluconobacter suboxidans, Acetobacter industrium ) -bacterii acetice din bere( pot produce 6, 6% acid aceticA. pasteurianum, A. rancens) 113

-bacterii acetice din vin( pot produce 9, 3% acid aceticA. ascendens, A. xilinum -bacterii acetice de fermentatie rapida ( cu mare putere de acidifiere 11-140 acetice –A. acetigenum, A. curvum) Fermentatia gluconica este un proces oxidativ prin care glucoza, sub actiunea enzimelor bacteriilor selectionate, in prezenta aerului, este transformata in acid gluconic.Bacterii tipice apartin genului Gluconobacter, Moraxella si mucegaiurile Aspergillus si Penicilllium. Acidul gluconic are multiple intrebuintari ca de exemplu: -in terapeutica (gluconati de Fe si Ca) -in obtinerea prafului de copt -glucono-lactona in tehnologia carnii, confera gust acrisor, activitate bacteriostatica, contribuie la mentinerea culorii -in amestec cu soda caustica la indepartarea sarurilor insolubile de magneziu -la producerea unor antioxidanti ( acid D araboascorbic). Fermentatia citrica este un proces oxidativ complex, prin care substratul glucidic (zaharoza), este metabolizat in acid citric.Agentii tipici ai acestei fermentatii sunt tulpinile selectionate de Aspergillus niger. Acidul citric este principalul acid folosit in industria alimentara la fabricarea bauturilor racoritoare si la fabricarea bauturilor zaharoase ca stabilizator al culorii si ca anticoagulant al sangelui precum si in componenta pulberilor efervescente in industria farmaceutica. Metabolizarea compusilor organici macromoleculari. Energia radiatiilor solare care cade pe pamant anual (echivalenta cu 3*1024 J) este convertitra prin fotosinteza in energia chimica a combinatiilor organice cu acumularea a aproximativ a 2*1011 tone de carbon /an. Aceasta biomasa vegetala este constituita in mare parte din celuloza, substante pectice, amidon si in cantitati mai reduse lipide, acizi nucleici- (Banu si colaboratorii (2008)). 114

Dupa moartea acestei biomase vegetale si animale in conditii naturale, in diferite habitaturi (sol, apa) se produc degradari microbiene specifice cu formare de compusi intermediari( in anaerobioza) si compusi finali ca CO2 si H2O in conditii de aerobioza. 1. Descompunerea amidonului si glicogenului . Descompunerea acestor polioze are loc sub actiunea unor microorganism ce produc enzime extracelulare ce hidrolizeaza acesti compusi macromoleculari in molecule simple (glucoza, maltoza), ce pot traversa membrane celulara fiind utilizati in nutritia celulei. Unele microorganisme (bacteria, mucegaiuri si levuri ) pot hidroliza amidonul cu ajutorul enzimelor extracelulare αamilaza, β-amilaza si glucoamilaza.Printre asemenea microorganism se numara reprezentanti ai genului Bacillus( B. subtilis, B.licheniformis, B.cereus, B. megaterium, B. polimixa), mucegaiuri apartinand genurilor Aspergillus, Mucor si Rhizopus, precum si unele levuri din genurile Saccharomyces, Trichosporum si Candida. Hidroliza enzimatica a amidonului cu enzime vegetale sau microbiene, cu formare de glucide fermen-tescibile, este utilizata in biotehnologia spirtului, a berii, in panificatie, si la obtinera siropurilor dulci, a dextrinelor, a glucozei, a maltozei, etc. 2. Descompunerea celulozei . Celuloza este un poliglucid foarte raspandit in compozitia materiei vii (1/3) precum si in structura peretilor celulari la fungi.Celuloza de pe sol si din ape, dupa moartea plantelor, este transformata in timp sub actiunea microorganismelor ce produc enzime celulozolitice (bacterii, fungi) . Aceste transformari se pot produce prin: -degradare aeroba, cu formare de celobioza sau glucoza in prima etapa, urmata de oxidarea hidroxiacizilor cu formare de CO2 si H2O.Bacteriile capabile de asemenea transformari apartin genurilor Cytofaga, Cellvibrio, Cellulomonas. Exista si fungi cu activitatea celulozolitica cu reprezentanti in genurile Fusarium, Mucor, Rhizopus, Trichoderma, Aspergilllus. 115

-degradarea anaeroba, ce se produce permanent in sedimentele, malul apelor, la fermentarea compostului, in rumenul rumegatoarelor, in lacurile termale, in profunzimea solului. Procesul cuprinde mai multe faze: hidroliza celulozei cu acumulare de alcool, acizi, CO2, H2. Acesti produsi sunt transformati de bacteriile acetogene in acid acetic . In etapa a 3-a bacteriile strict anaerobe-metanogene transforma acidul acetic in metan. In ultimile decenii a luat amploare metanogeneza in scopul obtinerii de biogaz prin prelucrarea dejectiilor animaliere prin care se asigura protectia mediului si valorificarea puterii energetice a metanului si hidrogenului. 3. Degradarea substantelor pectice. Substantele pectice se gasesc in cantitati mari in fructe, legume, tulpini radacinoase sub forma de protopectina, asociata cu arabanii peretilor celulari, cu celuloza si alte polioze.Dupa recoltarea fructelor, in timpul conservarii prin activitatea microorganismelor, se produce hidroliza substantelor pectice –tesutul vegetal se inmoaie, isi pierde rezistenta fata de agentii putrefactiei.Pectina este transformata in acizi pectici –acizi poligalacturonici.Bacteriile ce pot media asemena transformari apartin genurilor Ervinia, Bacillus, Xantomonas. Fungii din genurile Aspergillus, Penicillium si Fusarium pot si ei sa degradeze substantele pectice. 4. Degradarea chitinei. Chitina este un poliglucid cu azot, prezent in compozitia aripilor insectelor, la viermi, moluste, in structura peretilor celulari la fungi. Chitina poate fi degradata sub actiunea chitinazei produsa de Pseudomonas chitinovorans. 5. Degradarea altor compusi: acizii nucleici de la eucariote, procariote si din particulele virale pot fi degradati de catre microorganismele ce sectreta ribonucleaze si dezoxiribonucleaze. Bacteriile din genurile Staphylococcus, Bacillus si Clostridium pot degrada acizii nucleici. 116

Compusii organici aromatici (hormoni, vitamine, aminoacizi) pot fi si ei descompusi de catre bacterii si mucegaiuri in compusi mai simpli (fumarat, acetoacetat, succinat). Practic nu exista compus organic care sa nu fie degradat in compusi mai simpli de catre microorganisme. Acest fapt a permis evitarea acumularii in timp a unor compusi, evitarea dezechilibrelor naturale, a catastrofelor ecologice. 6. Transformarile biochimice a unor compusi din alimente sub actiunea microorganismelor. Componentele de baza din alimente sunt reprezentate de proteine, glucide si lipide.Transformarea acestor compusi de catre ehipamentul enzimatic al microorganismelor si de enzimele existente in compozitia alimentelor sta la baza proceselor de maturare iar dupa o perioada de timp determina alterarea alimentelor. a. Degradarea lipidelor. Lipidele, prezente in alimentele de origine vegetala si animala, sub actiunea microorganismelor ce produc lipaze extracelulare pot suferi doua procese: -hidroliza care consta in descompunerea acestora in glicerol si acizi grasi cu fixarea unei molecule de apa de catre triglicerina. Aceste reactii pot fi mediate de lipazele produse de Bacterium prodigiosum, Aerobacter Cloace, B. pyocyaneus, B. butiri, M.lypolyticus, Sarcina lutea, Pseudomonas si de catre fungi din genurile Aspergillus, Penicillium, Mucor, Fusarium, Geotrichum. -alterarea oxidativa (rancezirea) a acizilor grasi prin βoxidare cu eliberare de acetil-coA.Prin oxidarea complete a acizilor se ajunge in final la CO2 si H2O. Alterarea oxidativa poate fi aldehidica (cu formarea de aldehice) si cetonica (cu formarea de cetone). Rancezirea cetonica are loc prin β-oxidare, mai ales la acizii grasi saturati (caproic, caprilic, capric, lauric) cu transformarea lor in metilcetone. Aceasta rancezire se mai numeste si parfumata . Formarea cetonelor este mediata in special de miceti din genurile Aspergillus si Penicillium. Din unele genuri de mucegai Rhizopus si Aspergillus se pot obtine preparate enzimatice cu activitate lipazica ce sunt 117

utlizate la fabricarea branzeturilor pentru imbunatatirea aromei precum si in terapeutica impreuna cu lipaza pancreatica. b. Descompunerea proteinelor . Proteinele sunt compusi macromoleculari ce contin C., H, O, N, S, P, elemente cu rol vital pentru toate formele de viata. Dupa moartea fiziologica a organismelor, prin procese de proteoliza enzimatica, acestea sunt transformate in compusi mai simpli ce pot fi utilizati de catre microorganisme. Proteinele din material organic, ce se acumuleaza in sol si in ape, dupa moartea plantelor, animalelor si microorganismelor, pot fi hidrolizate sub actiunea proteazelor extracelulare, produse de bacterii si mucegaiuri. Drojdiile nu pot folosi proteinele in procesul de nutritie deoarece ele contin proteaze intracelulare care nu se pot elibera decat prin dezintegrarea invelisurilor celulei ( dupa moartea, autoliza acestora). Descompunerea aminoacizilor in produsi finali de putrefactie se realizeaza prin reactii de dezaminare si decarboxilare. Trebuie remarcat faptul ca in celula microbiana proteoliza prezinta aspecte particulare, determinate de starea fiziologica a celulei. In celula vie are loc fenomenul de turnover prin care, proteinele “vechi” fara rol functional, sunt degradate intracelular pana la stadiul de aminoacizi, care vor servi ca elemente constructive pentru proteinele noi –enizme adaptative, etc. In conditii neprielnice de viata (absenta nutrientilor, a apei, a energiei) aminozcizii rezultati din descompunerea proteinelor sunt catabolizati in continuare cu formare de produsi finali de putrefactie, de fapt are loc o proteoliza intracelulara ireversibila –autoliza. Descompunerea proteinelor este produsa de bacterii aerobe, facultative anaerobe si strict anaerobe.Procesul are loc in conditii optime la un pH de aproximativ 7 si este stopat la un pH mai mic de 4.Acest proces este initiat de bacteriile aerobe care pregatesc terenul pentru bacteriile anaerobe prin consum de oxigen si cu formare de produsi intermediari( peptide, 118

aminoacizi) prin hidroliza. Bacteriile aerobe responsabile de proteoliza apartin genurilor : Pseudomonas (P. fluorescens, P. aeruginosa , P. putida, P. alcaligenes), Bacillus (B. subtilis, B. cereus, B. megatherium), si Proteus (Pr. vulgaris, Pr. mirabilis). Bacteriile facultative anaerobe responsabile de procese proteolitice apartin genurilor: Escherichia, Enterobacter, Enterococcus, de regula de origine fecala. Bacteriile strict anaerobe sporulate si nesporulate capabile sa produca proteoliza se dezvolta intr-o anumita succesiune : in primele 2 zile se dezvolta bacteriile din genurile Micrococcus si Staphylococcus; dupa 3-4 zile predomina B. putidum si Cl. sporogenes, ca dupa 7-8 zile dominatia sa revina Cl. putrificus, Diplococcus griseus si B. postumus, care desavarsesc descompunerea proteinelor pana la produsii finali ai proteolizei ( NH3, H2S, indol ) . c. Descompunerea glucidelor. Majoritatea microorganismelor pot descompune glucidele cu ajutorul enzimelor glicolitice . In conditii de aerobioza acestea sunt transformate in CO2 si H2O, acesti produsi nu pot influenta semnificativ proprietatile organoleptice ale alimentelor. In conditii de anaerobioza, in functie de specia microbiana degradarea glucidelor se poate realiza: -homofermentativ (cu formare de acid lactic preponderant, fapt ce confera produselor un miros si gust acru) -heterofermentativ (cu formare in cantitatin egale de acid lactic, etanol, acid acetic si CO2), produsi ce imprima produselor un caracter spongios precum si miros si gust de acru.

119

Capitolul VI – Conservarea alimentelor prin combinatii de factori (Tehnologia obstacolelor)

Conceptul tehnologiei obstacolelor „multitinta”. Calitatea si siguranta alimentelor depinde de modificarile fizico-chimice si microbiologice pe care le sufera acestea. Prezenta microorganismelor in alimente constitue un pericol doar cand alimentele ofera conditii prielnice de dezvoltare a acestora. Daca valoarea unui parametru ce caracterizeaza matricea alimentara (pH, activitatea apei, potentialul redox) se situeaza sub limita ce asigura cresterea unui microorganism, acesta va fi incapabil sa supravietuiasca si sa produca procese alterative. Regimul termic la care se efectueaza tratamentele termice, si durata acestuia determina efecte diferite asupra microorganismelor (inactivare, distrugere). Industria alimentara utilizeaza diferite procese si tehnici de conservare. Multe dintre acestea actioneaza prin inhibarea dezvoltarii microorganismelor (refrigerare, congelare, uscare, sarare, ambalare in vacuum, ambalare in atmosfera modificata, acidifiere, fermentare, adaos de conservanti). Alte metode inactiveaza microorganismele (pasteurizare, sterilizare, iradiere) sau restrictioneaza accesul lor la produse (prelucrarea aseptica, ambalarea aseptica). Pe langa metodele de conservare traditionala specialistii creeza metode noi de conservare, ca cele care utilizeaza presiunile inalte, impulsurile de lumina, electroporarea si adaosul de enzime litice. Industria alimentara este angajata intr-o competitie de gasire a unei tehnologii de conservare perfecta dar nici una din tehnicile mentionate nu se dovedesc a fi o astfel de tehnologie. Consumatorii prefera alimente prelucrate cat mai putin, cat mai naturale si cat mai sanataoase. 120

Siguranta si stabilitatea alimentelor mai poate fi asiguata prin sarare si conservanti chimici, dar si aceste procedee pot modifica uneori proprietatile organoleptice ale produselor si, in plus, displac consumatorilor. Consumatorii, opinia publica, exercita presiuni asupra fabricantilor pentru a reduce utilizarea conservantilor alimentari.Utilizarea procedurilor de conservare ce au un impact redus asupra calitatii produselor, dar care reusesc sa mentina siguranta produselor au condus la definirea conceptului de „ tehnologia obstacolelor”. Tehnologia obstacolelor sau tehnologia barierelor isi datoreaza numele anumitor valori ale factorilor ce influenteaza dezvoltarea microorganismelor, valori care nu sustin cresterea acestora, constituindu-se in adevarate obstacole, bariere in calea dezvoltarii lor. Pana in prezent au fost identificate cca. 50 de obstacole diferite, posibile de folosit la conservarea alimentelor. Dupa Leistner si Gorris (1995) si Anca Nicolau (2006) prezentam in tabelul nr.12, obstacolele posibile de utilizat la conservarea alimentelor. Tehnologia obstacolelor mai este denumita si conservare prin metode combinate deoarece pledeaza pentru combinarea a doua sau mai multe tehnici de conservare. Prin actiunea concertata a mai multor obstacole se poate realiza conservarea unui aliment in conditii mai blande decat ar putea sa o realizeze un obstcaol individual. Cand se utilizeaza mai multe obstacole, microorganismele trebuie sa depuna un efort substantial pentru a depasi fiecare obstacol. Cu cat obstacolul este mai „ inalt” cu atat va fi mai greu de depasit si va solicita in masura mai mare microorganismele. La utilizarea tehnologiei obstacolelor fabricantii de produse alimentare aleg un set de obstacole specifice alimentului pe care doresc sa-l conserve sau a procesului tehnologic prin care acesta este obtinut. Specificitatea unui obstacol se refera la natura si la marimea lui. 121

Tabelul nr. 12

Obstacole posibil de utilizat la conservarea alimentelor Categoria obstacolului

Denumirea obstacolului

Obstacole fizice

Temperatura ridicata, temperatura scazuta, radiatii ultraviolete, radiatii ionizante, energie electromagnetica (microunde, unde cu frecventa radio, camp electric intens pulsatoriu, camp magnetic intens pulsatoriu), presiune ridicata, ultrasonare, pelicule de ambalare (plastic, pelicule multistrat, invelisuri active, invelisuri comestibile), ambalare in atmosfera modificata (atmosfera cu alta compozitie decat cea a aerului, vacuum, vacuum moderat, atmosfera activa ), ambalare aseptica. Ph acid, aw scazut, potential de oxidoreducere scazut, Na Cl, nitriti, nitrati, CO2, O2, ozon, acizi organici, acid lactic, lactati, acid acetic, acetati, acid ascorbic, sulfiti, fosfati, glucono-δ-lactona, fenoli, agenti chelanti, agenti tensioactivi, etanol, propilen-glicol, produsii reactiei Maillard, condimente, plante cu proprietati aromatizante . Microbiota competitiva, culturi cu actiune protectoare, bacteriocine, antibiotice, lactoperoxidaza, lizozim.

Obstacole fizico- chimice

Obstacole biologice

122

Selectarea obstacolelor individuale pentru un anumit set de obstacole si valoarea puterii sau intensitatii acestora este dependenta de compozitia materiilor prime si nivelul preconizat de contaminare microbiana. Optimizarea selectiei de factori individuali in tehnologia obstacolelor depinde de cunoasterea compozitiei alimentului si impactul obstacolelor individuale asupra diferitelor tipuri de microorganisme. Disponibilitatea surselor de carbon si energie poate diferi intre loturile de produse alimentare sau tipurile de produse.De asemenea in alimente pot fi prezente urme de compusi cu actiune protectoare sau stimulatoare a dezvoltarii microorganismelor (substante osmoprotectoare, aminoacizi esentiali, vitamine). Tehnicile de conservare interfereaza cu mecanismele homeostatice ale microorganismelor, cele pe care acestea le-au dezvoltat pentru a supravietui in conditii de stres. Homeostazia reprezinta tendinta sistemelor biologice de a-si mentine mediul intern, neschimbat, in conditiile in care conditiile din mediul exterior lor se modifica. Microorganismele depun eforturi pentru asi mentine pHul intern neutru in conditiile modificarii pH-ului din alimente. Intr-un aliment acid microorganismele vor genera protoni. Un al mecanism homeostatic regleaza presiunea osmotica, intracelulara (osmohomeostazie), celulele trebuie sa-si mentina o presiune pozitiva pentru a putea mentine osmolaritatea citoplasmei la valori mai mari decat cele din mediul de cultura, cerinta ce se realizeaza cu ajutorul compusilor osmoprotectori (prolina, betaina). Tehnologia obstacolelor este mai eficienta cand obstacolele utilizate vizeaza sisteme diferite, cum ar fi peretele celular, membrana celulara, structurile genetice sau sistemul enzimatic. Aceasta abordare „multitinta „ este fundamentala pentru tehnologia obstacolelor deoarece este mult mai eficienta decat abordarea uni-tinta si permite utilizarea de obstacole de intensitate scazuta, ceea ce minimalizeaza pierderile de calitate. 123

Prin utilizarea de obstacole diferite la conservarea unui anumit aliment este posibil sa se obtina stabilitatea microbiologica dorita si siguranta alimentara necesara printr-o combinatie de tratamente mai putin severe.In practica acest lucru se traduce prin aceea ca este mai eficient sa se utilizeze o combinatie de diferiti factori de conservare cu intensitate scazuta cand aceasta vizeaza mai multe tinte sau actioneaza sinergic, decat sa se utilizeze un singur factor conservant cu valoare ridicata. Prin utilizarea tehnologiei obstacolelor multitinta, se evita sansa ca microorganismele sa dezvolte toleranta sau rezistenta la tratamentul conservant. Aplicatiile tehnologiei obstacolelor.Alimentele conservate prin tehnologia obstacolelor sunt produse ale caror durata de pastrare si calitati microbiologice sunt extinse prin utilizarea concertata a catorva factori de conservare care individual n-ar avea efect letal asupra patogenilor sau microorganismelor de alterare. De exemplu, la fabricarea preparatelor din carne asa zise „crud-uscate”, sarea si nitritii inhiba mai multe categorii de microorganisme din amestecul de carne, cele doua substante reprezentand obstacole importante pentru faza initiala de maturare.Bacteriile neafectate de aceste obstacole prin consumul de oxigen, reduc potentialul oxido-reducator al mediului si inhiba dezvoltarea bacteriilor aerobe, favorizand astefel dezvoltarea florei lactice adaugate.Dezvoltarea florei lactice determina scaderea pH-ului, un obstacol suplimentar in calea dezvoltarii microorganismelor.In faza finala de maturare intensitatea obstacolelor scade (nitritii sunt epuizati, numarul de bacterii lactice scade, pH-ul si potentialul redox cresc) dar parametrul activitatea apei scade, devenind principalul obstacol in calea dezvoltarii microorganismelor. Un alt exemplu, in Marea Britanie s-a introdus pe piata sortimentul mazare conservata in cutii metalice sau borcane cu durata nedeterminata.Fata de produsul clasic in care doar tratamentul termic si pH-ul erau singurele obstacole utilizate, la 124

noul produs se utilizeaza un obstacol suplimentar „nizina” o bacteriocina termostabila ce inhiba dezvoltarea speciilor de clostridii ce pot determina bombajele biologice. In cazul alimentelor de consum realizate din diferite tipuri de legume, dintre care unele crude iar altele minim prelucrate, unele intregi, altele tocate, feliate, pentru a le asigura inocuitatea biologica se recurge la refrigerare si ambalare in atmosfera modificata, drept principale obstacole pentru stabilizarea produselor. La temperaturi scazute se pot dezvolta psihotrofii, unii chiar patogeni (Listeria monocytogenes, Aeromonas hydrophyila), chiar daca exista atmosfera modificata trebuie sa se introduca si un alt obstacol.In asemenea situatii se poate apela la „bioprezervare” adica la utilizarea de bacterii lactice.Bacteriile lactice alese pentru bioconservare produc cantitati mici de acid lactic, care nu afecteaza calitatea produselor si cantitati apreciabile de bacteriocine cu efect antilisterial. In situatiile in care se urmareste combaterea unui spectru microbian mai larg complementar la alte obstacole se poate apela la compusii antimicrobieni naturali existenti in plantele aromatice si condimente.Multi asemenea compusi au proprietati inhibante asupra salmonelelor, listeriilor, clostridiilor si chiar asupra stafilococilor. Utilizarea compusilor antimicrobieni naturali, ca de exemplu bacteriocinele se pot folosi la realizarea cuverturilor comestibile.Cuverturile comestibile sunt realizate din biopolimeri naturali, (poliglucide, proteine, grasimi) si se aplica direct pe suprafata unor produse alimentare.Acestea constituie un element de protectie fizica la contaminarea alimentelor.Daca cuvertura va contine bacteriocine, bacteriile vor ramane imobilizate la suprafata produsului, migrarea in interior va fi mult ingreunata, iar efectele, eliminate sau mult reduse in intensitate. Utilizarea de substante antimicrobiene in cuvertura, asigura folosirea unor cantitati mai reduse de substanta fata de pulverizare sau imersie, fapt ce reduce impactul asupra calitatii, inocuitatii produsului. 125

In tabelul numarul 13 se prezinta dupa Gorris(2000) si Anca Nocolau (2006) produsele alimentare conservabile prin tehnologia obstacolelor. Tabelul nr. 13

Produse alimentare conservate prin tehnologia obstacolelor (Gorris, 2000) Salata amChipsuri Gem de balata in Branza de Sunca portocale atmosfe proaspata cartofi (Meida) ra modifiObstacole cata Principala cauza de alterare Microbiologica X X X Biochimica X X X X Fizica x x Tip de obstacol Temp. ridicata x x Temp. scazuta x x pH scazut x x aw scazut x x Eh scazut x Conservant (i) x x Microbiota x competitiva Atmosfera modificata x Ambalaj folie Presiune ultrainalta x Originea produsului Traditional x x x Nou creat X X Tara de origine sau Franta, UK comercializare SUA Japonia UK, SUA SUA Durata de pastrare 2 >25 >2 12 1 (zile ) Produse

126

Mazare conservat a prin sterilizare si adios de nizina

x x

x

X UK ∞

Produse alimentare conservate prin tehnologia obstacolelor (Gorris, 2000) (continuare) Produse

Chec ambalat in atmosfera de vapori de etanol

Paine Somon Sos ambalata afumat pentru in curent la rece paste de CO2

Obstacole Principala cauza de alterare Microbiologica Biochimica x Fizica Tipul de obstacol Temp. ridicata Temp. scazuta pH scazut aw scazut x Eh scazut Conservant (i) x Microbiota competitiva Atmosfera x modificata Ambalaj folie Presiune ultrainalta Originea produsului Traditional Nou creat x Tara de origine sau comerciJaponia alizare Durata de 12 pastrare (zile)

x

x x

Paste Legume fainoase pasteurizate proaspete, acidifiate ambalate in atmosfera modificata

x

x

x

x x x

x x

x x x

x x

x x x x

x x

x x

12

x

x

x

UK SUA

UK

UK SUA

Europa

8

4

>4

Limitele tehnologiei obstacolelor in conservarea alimentelor. Tehnologia obstacolelor nu elimina in totalitate microorganismele prezente in alimente, ci doar le inactiveaza temporar.Din acest motiv ea introduce un risc, un nivel de 127

nesiguranta in privinta inocuitatii biologice a produselor.De aceea specialistii din industria alimentara care proceseaza alimente minim prelucrate pe baza tehnologiei obstacolelor trebuie sa evalueze, aprecieze nivelul de nesiguranta, riscul, si sa inteleaga limitele utilizarii combinatiei de obstacole in conservarea unui aliment.Aceasta cu atat mai mult cu cat microorganismele poseda diferite mecanisme pentru a depasi conditiile nefavorabile (sistemele homeostatice si de reactie la stres). Este bine cunoscuta reactia unor bacterii care la conditii nefavorabile dezvoltarii lor, sporuleaza.Prezenta sporilor limiteaza impactul caldurii si blocheaza accesul acizilor sau conservantilor la structurile celulare vegetative.Exista si alte adatari tranzitorii initiate in conditii de stres: modificari structurale, biochimice (la nivelul sistemelor de transport prin membrane), functionarii receptorilor, controlul exprimarii genelor, utilizarea substantelor de rezerva. Cunoasterea proceselor de adaptare la stres poate oferi indicii pretioase pentru imbunatatirea tehnologiei obstacolelor in vederea obtinerii de produse minim procesate. Un mecanism homeostatic bine cunoscut este mentinerea pH-ului intracelular al microorganismelor.Sistemele de transport a ionilor de hidrogen localizate in membrana celulara lucreaza continuu pentru a echilibra pH-ul intern cu cel extern.Cand pH-ul extern scade, ionii de hidrogen sunt importati in citoplasma, in timp ce la cresterea pH-ului extern ionii de hidrogen sunt exportati din citoplasma.Adaptarea la stresul determinat de scaderea pH-ului este un fenomen observat frecvent la patogenii capabili sa se dezvolte in alimente. De exemplu, celulele de Salmonella tratate 2-3 generatii cu acid clorhidric (pH 5, 8) s-au dovedit mai rezistente la inactivare cu acizi organici fata de celulele netratate.Celulele de Listeria monocytogenes adaptate la nivele subletale de acid lactic au un grad de supravietuire mai buna in produsele lactate acidifiate cu acid lactic( branza, iaurt). 128

Reactiile la stres ale microorganismelor pot genera efecte nespecifice ceea ce inseamna ca microorganismele expuse la stresuri subletale isi pot imbunatati raspunsul la alte tipuri de stres. Ca de exemplu, toleranta celulelor de L. monocytogenes fata de stresul osmotic, prin prelevare de proteina din matricea alimentara.Prezenta prolinei, carnitinei, betainei in alimente constituie osmoprotectori si diminueaza eficienta obstacolului stres osmotic in tehnologia obstacolelor. Stresul termic si osmotic declanseaza procese de semnalizare care activeaza preluarea osmoprotectorilor din mediu pentru a contracara conditiile nefavorabile. La stabilirea unui sistem adecvat de conservare bazat pe tehnologia obstacolelor, trebuie sa se tina cont de reactiile de toleranta posibile care ar putea facilita supravietuirea unor patogeni. Desigur tehnologia obstacolelor in fabricarea si conservarea alimentelor prezinta unele limite, dar asigura produse procesate mult mai apreciate de consumatori.Se impun perfectionari pentru a se realiza prelucrari si tratamente de conservare care sa nu fie detectate de consumatori fara compromisuri fata de siguranta alimentelor.

129

Capitolul VII – Microbiologia previzionala

Conceptul microbiologiei previzionale.Microbiologia previzionala constituie un domeniu al microbiologiei in care raspunsul microorganismelor la actiunea controlata a diversilor factori ce le influenteaza dezvoltarea sunt exprimate sub forma de modele matematice, pe baza carora se anticipeaza comportamentul microorganismelor in conditii ce nu au fost cercetate practic.Evaluarea anticipata a posibilei dezvoltari a microorganismelor in alimente la procesare, pe durata depozitarii, in timpul transportului prezinta un interes deosebit.Evaluarea dezvoltarii microorganismelor se refera la multiplicarea celulelor, moartea lor sau producerea de toxine. Analizele microbiologice la produsele alimentare sunt costisitoare, iar rezultatele neconforme cu limitele maxime admise, de regula se obtin tarziu cand alimentul este deja consumat. S-a sugerat necesitatea realizarii unor modele matematice previzionale privind dezvoltarea microorganismelor in alimente. Astfel in deceniul 70 s-au studiat valorile unor parametrii a mediilor de cultura precum si a unor factori de mediu care pot limita multiplicarea microorganismelor.In deceniul 80 s-a trecut la studierea vitezei de crestere a productiei de toxine de catre unele microorganisme.Aceste preocupari s-au soldat cu o serie de date, cuprinse intr-o serie de programe realizate in Anglia si in SUA. In Marea Britanie s-a realizat programul „Food Micro Model” (FMM), initiat in anul 1988 sub coordonarea Ministerului Agriculturii, Pescuitului si Alimentatiei. 130

In SUA s-a realizat programul „Pathogen Modeling Program” (PMP), in cadrul Departamentului pentru Agricultura al SUA (USDA). Astfel a luat fiinta o baza de date intitulata Com Base si care a devenit accesibila prin intermediul internetului, fara taxa, la adresa www.combase.cc. Prin sprijinul financiar al UE s-a realizat o cooperare si cu alte institutii europene pentru largirea bazei de date si de programe. In luna Mai 2003 s-a incheiat un acord intre USDA-ARS (Serviciul de Cercetari pentru Agricultura) din SUA si FSA (Food Standard Agency) din Marea Britanie prin institutul de Cercetari Alimentare pe termen lung in vederea realizarii unei baze de date si difuzarea acestora in interesul sigurantei alimentare Programul Combase a fost lansat oficial in Iunie 2003, in cadrul celei de-a IV a Conferinte Internationale privind Modelarea Previzionala pentru Alimente ce a avut loc in Franta. La acea data Combase continea 2400 de curbe de crestere, supravietuire si 8000 de inregistrari de parametrii cinetici. In Combase sunt inregistrate doua tipuri de raspunsuri microbiologice: - curbe de crestere sau supravietuire, inactivare ale unor microorganisme; -parametrii cinetici ce definesc cresterea sau inactivarea microorganismelor patogene, de alterare sau producatoare de toxine. In tabelul numarul 14 prezentam dupa Anca Nicolau (2006). microorganismele pentru care s-au realizat modele incluse in programele Food MicroModel.

131

Tabelul nr. 14

Microorganisme incluse in Food Micro Model si domeniile lor de operare Domeniile de operare Temperatura 0C Microorganismul Glicerol, %

Bacillus cereus Bacillus subtilis

5……..30 -

pH

aw

NaCl %

Nitrit

de sodiu, % ppm 5, 4- 7, 2 0, 95-1 0, 5-6, 5 -

10……34 28

4, 8- 7, 0 0, 90-1

Campylobacter jejuni

5……..42

4, 5- 8, 5

-

Clostridium botulinum

5……...30

5, 0- 7, 0

-

-

-

0, 5- 4, 5 0- 5

0-

-

-

-

-

-

-

Escherichia coli Listeria monocytogenes

10…….30

-

3……...30

4, 7- 7, 4

0, 5-6, 5 0, 5-0, 8

-

0-200

-

0- 200

-

Salmonella 10…….30

4, 0- 6, 8

-

0, 5- 4, 5

Staphylococcus Aureus

10…….30

4, 5- 7, 0

-

0, 5- 13, 5

-

-

Yersinia Enterocolitica

0……..30

4, 5- 7, 0

-

0- 8, 0

-

-

Aeromonas hydrophyla

2……..30

4, 0- 7, 5

-

0- 7, 0

-

-

Utilizatorii Combase pot realiza cautari de date pentru orice combinatie, microorganism, tip de aliment, conditii de dezvoltare (temperatura, pH, activitatea apei, etc). 132

Avantajele si limitele microbiologiei previzionale. Exigentele consumatorilor asupra produselor alimentare determina procesatorii sa produca alimente cat mai naturale, cat mai putin prelucrate, dar in acelasi timp cu un grad ridicat de inocuitate biologica. Aceste cerinte impun o intelegere si o abordare cantitativa fiziologiei si ecologiei microorganismelor la tehnologiile de fabricatie si de conservare. Analiza cantitativa a ecologiei si fiziologiei microorganismelor in alimente este posibila prin microbiologia previzionala care permite: - previziunea consecintelor modificarilor operate in retetele de fabricatie asupra sigurantei si a duratei de pastrare; - proiectarea cat mai stiintifica a produselor noi pentru a indeplini cerintele propuse si pe cele din reglementarile oficiale; - aprecierea obiectiva a consecintelor in cazul violarii limitelor critice din cadrul Sistemului de Siguranta a Alimentelor; - combinarea cu tehnicile de modelare stocastica in scopul evidentierii etapelor din procesul de prelucrare a alimentelor care contribuie in mod semnificativ la riscul alimentar; - creearea de materiale didactice care sa asigure intelegerea proceselor si a realitatilor dintre tehnologiile de fabricatie, parametrii produselor si proprietatile lor microbiologice. Datele furnizate de microbiologia previzionala sunt contestate de unii specialisti datorita faptului ca: - se porneste de la presupunerea ca in alimente exista un anumit numar de microorganisme aflate intr-o anumita stare fiziologica; - elaborarea modelelor matematice se realizeaza pe baza datelor colectate din testari pe sisteme model de alimente; - raspunsurile microorganismelor din alimente la actiunea factorilor ce le influenteaza dezvoltarea este foarte variat si greu predictibil; - exista o nota empirica la modelele utilizate in prezent. 133

Cu toate criticile ce se aduc microbiologiei previzionale aceasta continua sa se dezvolte, se acumuleaza tot mai multe date, tot mai multe firme si tari apeleaza la aceste date, fapt stimulat si de unele cerinte ale Organizatiei Mondiale pentru Comert (WTO), FAO si OMS. Metode utilizate in microbiologia previzionala.Modelele matematice utilizate in microbiologia previzionala se pot clasifica in functie de mai multe criterii: - modul de realizare a modelului; - modul de studiere al evenimentului microbiologic; - modul in care se exprima matematic, dependenta dintre microorganisme si parametrii ce le influenteaza dezvoltarea. Dupa modul de realizare al modelului se pot distinge modelele: - empirice, ce deriva dintr-o abordare practica si descriu datele printr-o relatie matematica simpla; - mecaniciste realizate pe baze teoretice usor de dezvoltat odata cu acumularea de noi date despre evolutia cantitativa si calitativa a microorganismelor. Din punct de vedere al modalitatii de studiere a evenimentelor microbiologice exista modele cinetice, modele probabilistice si modele de interfata, prezenta crestere/absenta crestere. Modelele cinetice incearca sa evalueze viteza de crestere sau de omorare a microorganismelor din alimente.De exemplu, modele pentru distrugerea termica a microorganismelor realizate pentru industria conservelor inca din anul 1929, sau modele pentru omorarea atermica a microorganismelor bazate pe activitatea apei, pH-ului si a acizilor organici. Modelele probabilistice, considera probabilitatea producerii unui eveniment intr-o anumita perioada de timp. Probabilitatea ca un microorganism sa creasca sau sa produca toxina intr-o perioada determinata de timp.Aceste modele se 134

bazeaza pe ipoteza ca probabilitatea multiplicarii unei celule microbiene intr-un anumit mediu este dependenta de parametrii ce definesc mediul respectiv si mediul inconjurator. Probabilitatea este o functie de timp (timp necesar pentru germinarea sporilor), viteza de crestere, numarul de celule existente initial. Modelele de probabilitate incorporeaza si elemente stocastice, cum ar fi variabilitatea perioadelor de latenta si vitezele de crestere. Modelele de interfata (prezenta crestere/absenta crestere) au fost concepute din dorinta de a defini combinatii minime de factori de conservare care sa impiedice dezvoltarea unui microorganism cu mentinerea sigurantei aimentare in conditiile minimalizarii gradului de procesare. In functie de modul in care se exprima matematic dependenta dintre dezvoltarea microorganismelor si parametrii ce definesc mediul de cultura si mediul inconjurator modelele matematice pot fi primare, secundare si tertiare.Toate aceste modele matematice se exprima conform unor relatii matematice.Pentru obtinerea modelelor matematice ce caracterizeaza evolutia microorganismelor din alimente sunt necesare parcurgerea unor etape: identificarea parametrilor semnificativi, delimitarea campului experimental (intervale de valori, limite de variatie), planificarea experimentelor, colectarea de date, modelarea propriu-zisa, validarea modelelor si utilizarea modelelor (previziuni microbiologice).Validarea modelelor consta in evaluarea capacitatii de a previziona corect raspunsul microorganismelor la diverse valori ale parametrilor ce caracterizeaza mediul de cultura sau mediul ambiant. In privinta utilizarii modelelor validate, introduse intr-o baza de date, prin intermediul careia sunt puse la dispozitia diferitilor utilizatori pentru previziuni microbiologice trebuie precizat. Predictiile privind raspunsul microoganismelor la diferite conditii pe baza unor modele nu se pot utiliza decat pentru 135

conditiile in care s-a realizat modelul respectiv.Cu alte cuvinte modelele se pot utiliza numai pentru interpolari nu si pentru extrapolari. Utilizatorii de modele nu trebuie sa realizeze predictii in situatii pentru care modelul nu a fost testat (extrapolari).De asemenea utilizatorii de modele matematice trebuie sa tina cont si de limitele oricarui model privind evaluarea microorganismelor din alimente. Aplicatiile microbiologiei previzionale.Microbiologia previzionala se poate utiliza pentru: a. proiectarea de produse alimentare.Previziunea microbiologica permite sa se determine daca o anumita reteta confera unui produs alimentar o rezistenta intrinseca la actiunea microorganismelor sau daca este necesara modificarea ei.Practic se elimina problemele potentiale inca inainte de inceperea fabricarii unui produs; b. proiectarea de lanturi de fabricare, conservare si distributie prin evaluarea modelistica inainte de a fi realizat practic; c. elaborarea de tehnologii noi sau revizuirea celor vechi astfel incat sa se minimalizeze riscurile pe cai mai rafinate decat tratamentele termice brutale sau adaugarea de conservanti.In acest caz previziunea microbiologica se constituie intr-un mijloc pretios de creare a unui produs cu siguranta si calitate superioara; d. determinarea termenului de valabilitate.Modelele matematice pot contribui la stabilirea termenelor de valabilitate pe baze stiintifice prin modificari ale retetei sau a proceselor tehnologice; e. implementarea Sistemului HACCP.Previziunea microbiologica intervine in trei etape de implementare a sistemului HACCP: - in analiza riscurilor care necesita colectarea de date tehnice intr-o varietate de conditii; 136

- in punctele critice de control pentru inlocuirea criteriilor microbiologice ce necesita timp mare de raspuns, cu criterii fizico-chimice masurabile pe flux. Inlocuirea este posibila datorita relatiei pe care modelele o stabilesc intre cele doua tipuri de criterii.Aceasta substitutie permite determinarea in avans a actiunilor corective ce trebuie aplicate in cazul unui accident tehnologic; - in etapa de verificare, modelarea permite furnizarea de dovezi ca un anumit tratament aplicat in fabricarea unui produs este suficient pentru a garanta siguranta produsului; f. formarea specialistilor. Modelele microbiologice ofera studentilor, specialistilor posibilitatea de a intelege corelatia dintre caracteristicile produselor, procesele de fabricatie si proprietatile microbiologice ale alimentelor; g. elaborarea de reglementari. Previziunile microbiologice ofera un fundament stiintific pentru elaborarea de reglementari ce vizeaza siguranta (inocuitatea microbiologica a produselor alimentare). In concluzie se poate afirma ca microbilogia previzionala constituie o abordare stiintifica, logica, exprimata prin relatii matematice a relatiei dintre dezvoltarea microorganismelor si diferiti factori ce poate fi utilizata la obtinerea unor produse cu siguranta si calitate superioara.

137