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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA Metodología analítica para alimentos y bebidas
MARÍA DEL ROSARIO PASCUAL ANDERSON VICENTE CALDERÓN Y PASCUAL
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA Metodología analítica para alimentos y bebidas 2.a Edición
© M.a del Rosario Pascual Anderson y Vicente Calderón y Pascual, 2000 Reservados todos los derechos. «No está permitida la reproducción total o parcial de este libro, ni su tratamiento informático, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de los titulares del Copyright» Internet: http://www.diazdesantos.es E-mail:
[email protected] Edita: Díaz de Santos, S. A. Juan Bravo, 3-A 28006 MADRID (España) ISBN: 978-84-7978-424-9 Depósito legal: M. 43.288-1999
Diseño de cubierta: Ángel Calvete Compuesto e impreso en Fernández Ciudad, S. L. Encuadernación: Rústica-Hilo. S. L.
A Vicente Calderón Díaz, nuestro querido esposo y padre. LOS AUTORES
Agradecimiento
Los autores agradecen a la Comisión Interministerial para la Ordenación Alimentaria (C.I.O.A.), del Ministerio de Sanidad y Consumo, los datos sobre legislación que tan generosamente les han proporcionado.
Contenido
Agradecimiento .........................................................................................
IX
Introducción ..............................................................................................
XIX
PRIMERA PARTE 1.
Muestreo ........................................................................................... Número de muestras .......................................................................... Método de muestreo aleatorio ........................................................... Normas generales para el muestreo .................................................. Condiciones para el muestreo ............................................................ Preparación de la muestra para su envío al laboratorio .................... Transporte y conservación de las muestras........................................
3 3 3 4 6 7 8
2.
Preparación de las muestras para su análisis ................................ Trituración y homogeneización de alimentos ................................... Preparación de diluciones decimales ................................................
9 9 11
3.
Recuento de microorganismos aerobios mesófilos (31 ± 1 °C) revivificables ......................................................................................... Métodos de recuento en placas ......................................................... Recuento por siembra en masa ..................................................... Recuento por siembra en superficie .............................................
13 13 14 15
4.
Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) ....................................................................................... Investigación y recuento en medio líquido .................................. Investigación y recuento en medio sólido ....................................
17 18 19
5.
Investigación y recuento de Escherichia coli ................................. Material ........................................................................................
21 24
XI
XII
CONTENIDO
Medios de cultivo y reactivos ............................................................ 25 Técnica................................................................................................ 26 Pruebas de confirmación .............................................................. 27 Prueba rápida para investigación de Escherichia coli (MUG) .......... 28 Otras pruebas rápidas para la identificación de Escherichia coli y Es cherichia coli enterovirulentos (EVEC) ....................................... 29 Control de Escherichia coli enterovirulentos (EVEC) ...................... 30 6.
Investigación de Enterobacteriaceae totales ................................... Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales en medio líquido ............................................................................................. Material ........................................................................................ Medios de cultivo y reactivos ....................................................... Técnica........................................................................................... Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales en medio sólido ............................................................................................. Material ........................................................................................ Medios de cultivo y reactivos ....................................................... Técnica...........................................................................................
33
7.
Investigación de Salmonella ............................................................ Material .............................................................................................. Medios de cultivo y reactivos ............................................................ Aislamiento e identificación de Salmonella ...................................... Pruebas rápidas para la identificación de Salmonella ........................ Prevención y control de Salmonella .................................................. Prueba de la alfa amilasa ...................................................................
41 41 41 49 54 55 60
8.
Investigación de Shigella ................................................................. Material ............................................................................................... Medios de cultivo y reactivos ............................................................ Aislamiento e identificación de Shigella ........................................... Pruebas rápidas para la identificación de Shigella ............................. Prevención y control de Shigella .......................................................
63 64 64 66 69 70
9.
Investigación y recuento de Clostridium sulfíto-reductores........... Material .............................................................................................. Medios de cultivo ............................................................................... Investigación y recuento de formas vegetativas y esporuladas de Clostridium sulfíto-reductores conjuntamente ............................. Investigación y recuento de formas esporuladas de Clostridium sulfito-reductores ................................................................................
73 73 73
10.
Investigación y recuento de Staphylococcus aureus ..................... Material ............................................................................................... Medios de cultivo y reactivos ............................................................ Método de enriquecimiento en tubos para conocer Presencia-Ausencia (P-A) ..................................................................................
34 34 34 35 39 39 39 39
74 75 77 77 78 80
CONTENIDO
XIII
Método de recuento en placas ..................................................... Método del Número Más Probable (NMP).................................... Detección de termonucleasa en alimentos ........................................ Pruebas rápidas para la identificación de Staphylococcus aureus y sus toxinas............................................................................................ Prevención y control de Staphylococcus aureus enterotoxigénico ...
82 83 83 84 87
11.
Investigación y recuento de Bacillus cereus .................................. Material............................................................................................... Medios de cultivo y reactivos ............................................................ Técnica ............................................................................................... Técnica de recuento en placas...................................................... Técnica del Número Más Probable (NMP) .................................. Pruebas confirmativas ................................................................. Pruebas rápidas para la identificación de Bacillus cereus ................ Prevención y control de Bacillus cereus ...........................................
93 93 94 97 97 98 98 99 100
12.
Investigación y recuento de Clostridium perfringens ................... Material .............................................................................................. Medios de cultivo y reactivos ............................................................ Técnica ............................................................................................... Método de recuento en tubos ....................................................... Método por la técnica del Número Más Probable (NMP) .......... Técnica para la numeración en medio líquido ............................ Pruebas rápidas para la identificación de Clostridium perfringens tipo A ............................................................................................ Prevención y control de Clostridium perfringens tipo A ...................
105 105 106 109 109 110 111
13.
Recuento total de microorganismos psicrotróficos......................... Material .............................................................................................. Medios de cultivo ............................................................................... Técnica ...............................................................................................
117 118 118 119
14.
Investigación de estreptococos fecales............................................. Material .............................................................................................. Medios de cultivo y reactivos ............................................................ Investigación y recuento de Streptococcus D de Lancefield .............. Investigación de Streptococcus D de Lancefield en medios sólidos. Investigación de Streptococcus D de Lancefield en medios líquidos ................................................................................................. Otro método para la investigación de Streptococcus D de Lancefield
121 121 122 124 124
Investigación y recuento de Vibrio parahaemolyticus .................... Material............................................................................................... Medios de cultivo y reactivos ............................................................ Técnica ............................................................................................... Técnica del Número Más Probable (NMP) ................................. Técnica de enriquecimiento para investigar Presencia-Ausencia .
127 128 128 133 134 136
15.
111 112
125 126
XIV
CONTENIDO
Diferenciación entre Vibrio parahaemolyticus y Vibrio alginolyticus Reacción de Kanagawa ....................................................................... Pruebas rápidas para la identificación de Vibrio parahaemolyticus . Prevención y control de Vibrio parahaemolyticus ............................
136 137 137 137
16.
Hongos ................................................................................................ Mohos y levaduras ............................................................................. Significado de la contaminación fúngica de los alimentos ................ Recuento total de mohos y levaduras ................................................. Material .......................................................................................... Medios de cultivo .......................................................................... Técnica........................................................................................... Estudio de la micoflora: aislamiento e identificación ........................
141 142 142 143 144 144 145 146
17.
Investigación de toxinas botulínicas ............................................... Material ............................................................................................... Tampón gel fosfato y sueros antitoxinas ............................................ Técnica................................................................................................ Técnicas rápidas para la detección de toxinas botulínicas ................. Prevención y control del botulismo ...................................................
149 150 150 151 153 153
18.
Investigación de Aeromonas hydrophyla ........................................ Método para la detección de especies de Aeromonas móviles del grupo Aeromonas hydrophyla ....................................................... Recuento directo en placas ........................................................... Técnica de recuento directo en placas.......................................... Prueba de Presencia-Ausencia (P-A)..................................................
155 157 157 161 163
19.
Investigación de Plesiomonas shigelloides....................................... Método para la detección de Plesiomonas shigelloides .................... Recuento directo en placas ................................................................ Técnica................................................................................................ Prueba de Presencia-Ausencia............................................................
165 167 167 168 169
20.
Investigación de Listeria monocytogenes ....................................... Poder patógeno de Listeria monocytogenes para el hombre .............. Investigación de Listeria monocytogenes en alimentos .................... Investigación de Listeria monocytogenes en leche y productos lácteos .......................................'......................................................... Material ........................................................................................ Medios de cultivo y reactivos ....................................................... Aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes en leche y productos lácteos .......................................................................... Investigación de Listeria monocytogenes en carne y productos cárnicos .............................................................................................. Método NGFIS para aislamiento de Listeria monocytogenes .......... Técnica ................................................................................................
171 175 178 179 179 179 189 193 202 205
CONTENIDO
Técnica de Presencia-Ausencia ................................................... Prevención y control de histeria monocytogenes ............................. 21.
Investigación de residuos de antibióticos por métodos microbiológicos ................................................................................................ Introducción ....................................................................................... Técnicas de cribado de residuos de antibióticos.......................... Técnica de cribado de residuos de antibióticos de las cuatro placas ............................................................................................. Técnica de cribado de residuos de antibióticos en leche ............ Técnica de post-cribado de residuos de antibióticos por bioensayo múltiple .........................................................................................
XV
207 207 209 209 210 210 213 215
SEGUNDA PARTE 22.
Carnes ............................................................................................... Vías de contaminación....................................................................... Definiciones ...................................................................................... Protocolo de análisis microbiológico de la carne ............................. Detección de triquinas ........................................................................ Norma microbiológica para carne picada ...........................................
219 220 223 224 225 225
23.
Derivados cárnicos .......................................................................... Productos cárnicos crudos adobados ................................................ Embutidos crudos curados ................................................................ Productos cárnicos tratados por el calor ........................................... Gelatinas comestibles ........................................................................ Caldos y sopas deshidratados ...........................................................
227 227 229 232 235 236
24.
Aves y caza ........................................................................................ Definiciones ...................................................................................... Protocolo de análisis microbiológico de canales y carne de ave ...... Preparación de la muestra .................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para canales y carne de ave ........................
239 241 243 243 245 245
25.
Pescado y derivados ........................................................................ Definiciones ...................................................................................... Protocolo de análisis microbiológico de pescado y derivados ........... Preparación de la muestra .................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para pescados y derivados........................... Método de la digestión para la localización de nematodos en los músculos del pescado ...................................................................
247 250 253 254 255 256
Mariscos (crustáceos y moluscos) .................................................. Definiciones .......................................................................................
259 262
26.
256
XVI
CONTENIDO
Protocolo de análisis microbiológico y biológico de mariscos y derivados .......................................................................................... Preparación de la muestra .................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para mariscos (crustáceos y moluscos) y derivados ...................................................................................... Método analítico biológico para determinación de la toxina paralizante del marisco (Paralytic Shellfísh Poisoning: PSP) .............. Método analítico biológico para la determinación de enterotoxinas (Diarrhetic Shellfísh Poisoning: DSP) en moluscos.....................
263 263 264 264 266 270
27.
Huevos y derivados .......................................................................... Definiciones ...................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de huevos y derivados .... Preparación de la muestra .................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para huevos y derivados .............................
273 277 278 278 279 279
28.
Leche y derivados ............................................................................. Definiciones ...................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de leche y derivados ...... Preparación de la muestra .................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterios microbiológicos para la productos lácteos y leche de con sumo ............................................................................................. Determinación de la flora específica del yogur ................................ Investigación de Pseudomonas aeruginosa ......................................
281 284 288 288 290
29.
Grasas comestibles .......................................................................... Definiciones ...................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de grasas comestibles...... Preparación de la muestra .................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para grasas comestibles............................... Investigación y recuento de flora lipolítica........................................
307 308 310 311 311 311 312
30.
Cereales.............................................................................................. Definiciones ....................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de cereales ..................... Preparación de la muestra .................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para cereales ................................................
315 316 318 319 319 319
31.
Leguminosas ..................................................................................... Definición .......................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de legumbres secas.......... Preparación de la muestra ..................................................................
321 322 322 322
291 301 302
CONTENIDO
XVII
Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para legumbres secas .................................
322 322
Tubérculos y derivados .................................................................... Definiciones ...................................................................................... Protocolo para el análisis de patatas fritas y productos de aperitivo Preparación de la muestra.................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para patatas fritas y productos de aperitivo ...............................................................................................
325 326 327 327 327
33.
Harinas y derivados ........................................................................ Definiciones ...................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de harinas y derivados .... Preparación de la muestra.................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para harinas y derivados .............................
329 330 333 334 334 334
34.
Hortalizas y verduras ...................................................................... Definiciones ...................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de hortalizas y verduras .. Preparación de la muestra.................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para hortalizas y verduras ..........................
337 338 339 339 339 339
35.
Frutas y derivados............................................................................ Definiciones ...................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de frutas y derivados ...... Preparación de la muestra.................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para frutas y derivados ...............................
341 342 345 345 345 345
36.
Edulcorantes naturales y derivados .............................................. Definiciones ...................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de edulcorantes naturales y derivados ...................................................................................... Preparación de la muestra.................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para edulcorantes naturales y derivados ......
347 347
32.
37.
Condimentos y especias .................................................................. Definiciones ...................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de condimentos y especias ................................................................................................ Preparación de la muestra.................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para condimentos y especias.......................
328
350 350 350 351 353 355 357 358 358 359
XVIII
38.
39.
CONTENIDO
Alimentos estimulantes y derivados ............................................... Definiciones ....................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de alimentos estimulantes y derivados .................................................................................... Preparación de la muestra .................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para estimulantes y derivados ....................
361 361 365 365 365 366
Conservas animales y vegetales ...................................................... Definiciones ....................................................................................... Clasificación ...................................................................................... Características de las conservas de pH inferior y superior a 4.5 ...... Alteraciones de origen microbiano: procedencia de la flora alterante .............................................................................................. Control microbiológico de las conservas .......................................... Análisis microbiológico de las conservas .........................................
367 367 368 369
Platos preparados ............................................................................. Definiciones ....................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de platos preparados y productos dietéticos y de régimen ................................................ Preparación de la muestra ................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para platos preparados y productos dietéticos y de régimen .................................................................................
395 396
41.
Aguas y hielo ..................................................................................... Definiciones ....................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de aguas y hielo............... Preparación y análisis de la muestra .................................................. Criterio microbiológico para aguas y hielo .......................................
405 407 409 409 410
42.
Helados............................................................................................... Definiciones ....................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de helados........................ Preparación y análisis de la muestra .................................................. Criterio microbiológico para helados ................................................
415 417 417 418 418
43.
Bebidas no alcohólicas: bebidas refrescantes y horchata de chufa .................................................................................................. Definiciones ....................................................................................... Protocolo para el análisis microbiológico de bebidas no alcohólicas ................................................................................................. Preparación de la muestra .................................................................. Análisis .............................................................................................. Criterio microbiológico para bebidas refrescantes y horchata de chufa ..............................................................................................
40.
Bibliografía ................................................................................................
370 376 377
400 401 401 402
421 423 426 426 427 427 429
Introducción
Al imprimir la 2.a edición de este libro, se han corregido y actualizado algunos datos del anterior, sobre todo en lo que concierne a las Reglamentaciones. Por otra parte, se han incorporado nuevos Capítulos que estimamos de interés en Microbiología Alimentaria. Se aconseja al lector que, para estar al día, se informe de las nuevas reglamentaciones que puedan surgir en el ámbito nacional o internacional. Es evidente que, al mejorar el nivel de vida de los pueblos, se ha incrementado la aparición de toxiinfecciones alimentarias como consecuencia de cambios en algunos hábitos sociológicos como, por ejemplo: — La utilización de comedores colectivos. — La preparación industrializada de comidas. — El empleo de máquinas expendedoras de alimentos, etc. Este hecho exige realizar un control de calidad bacteriológica de los alimentos que incluye la investigación de especies, familias o grupos bacterianos cuya presencia refleja sus condiciones higiénico-sanitarias. Es igualmente importante el control que requiere la industria para conocer la calidad bacteriológica de la materia prima que utiliza en la elaboración de sus productos, así como en las etapas intermedias hasta la obtención del producto terminado. La información que se obtiene al estudiar la microflora alimentaria permite: — Conocer las fuentes de contaminación del alimento que se analiza. — Valorar las normas de higiene utilizadas en la elaboración y manipulación de los alimentos. — Detectar la posible presencia de flora patógena que suponga un riesgo para la salud del consumidor, siendo éste uno de los objetivos más importantes en Microbiología Alimentaria. — Establecer en qué momento se producen fenómenos de alteración en los distintos alimentos, con el fin de delimitar su período de conservación. XIX
XX
INTRODUCCIÓN
En la calidad microbiológica de los productos alimentarios se consideran, principalmente, dos aspectos: — calidad higiénico-sanitaria — calidad comercial Los alimentos no son productos absolutamente estériles. Sus poblaciones microbianas varían, desde un escaso número en la mayoría de las conservas, a cifras importantes en alimentos fermentados. En ocasiones pueden vehicular agentes microbianos patógenos o sus toxinas, con riesgo para la salud del consumidor. El examen microbiológico de alimentos está basado, esencialmente, en tres aspectos: — Muestreo. — Elección de técnica analítica. — Interpretación de los resultados analíticos. En este libro se expone una sistemática analítica razonada, resultado de una amplia experiencia, que se basa en la recopilación y contraste de técnicas internacionales elegidos por sus buenos resultados hasta el momento actual. Sin duda, estas técnicas deberán ser revisadas con los nuevos avances que puedan surgir. Es deseo de la autora que su experiencia sirva como ayuda eficaz para todas las personas interesadas en temas relacionados con la Microbiología Alimentaria y, dentro de esta ciencia, en Bacteriología. Se trata de técnicas básicas que, con frecuencia, conducirán a estudios más profundos. En los capítulos dedicados al estudio de cada alimento o grupo de alimentos se hará mención a la Norma Microbiológica, de obligado cumplimiento, señalada en la Legislación. Para los alimentos que no estén incluidos en la Legislación, se orientará al microbiólogo para la interpretación de los análisis, marcando unos limites que la experiencia hace que se consideren ideales para que el alimento pueda calificarse como aceptable. Esta calificación, al no estar marcada por la ley, es exclusivamente un intento de ayuda para el técnico especializado que tiene que decidir sobre la calidad higiénico-sanitaria de un producto determinado. El técnico es el único capacitado para poder interpretar su análisis, teniendo en cuenta que solamente él conoce las circunstancias que concurren en el mismo. Previamente a los temas de los capítulos que integran este libro, y con fines meramente prácticos, como corresponde en todo momento a la intención que me guía al escribirlo, se expondrán algunas normas de conducta que puedan evitar el riesgo permanente que existe en el Laboratorio de Bacteriología Alimentaria respecto a: — La contaminación por posibles bacterias patógenas, que supone un peligro, directo o indirecto, para las personas que trabajan en el laboratorio. — La contaminación de los medios de cultivo, material de laboratorio ambiente, etc., con gérmenes procedentes del exterior, cuyo desarrollo supone una mala manipulación que contribuiría a dar resultados erróneos.
INTRODUCCIÓN
XXI
Los riesgos en el Laboratorio de Bacteriología Alimentaria son escasos si se respetan las consignas de seguridad. Son inútiles los consejos si no existe voluntad de cumplir ciertas normas de conducta. Las precauciones que hay que tomar para evitar cualquier clase de contaminación corresponden más bien a una disciplina general de trabajo que a unas reglas precisas. Siempre que se trabaje con bacterias son necesarias unas precauciones que serán de obligado cumplimiento en laboratorios donde se manejen gérmenes patógenos. El bacteriólogo es responsable de actuar correctamente dentro del laboratorio en lo que se refiere a evitar los riesgos de contaminación a los que está expuesto él mismo y el personal de su entorno, así como el trabajo que tiene encomendado, cuyos resultados analíticos no deben depender de la negligencia de un mal comportamiento. Está obligado a advertir a todas las personas que de cualquier forma colaboren en su trabajo, de los peligros de infección que existen y de lo incorrecto de una contaminación de las muestras a la hora de calificar unos resultados analíticos Deberá informar sobre la manera de prevenir las contaminaciones haciendo, por otra parte, que se respeten estrictamente las normas establecidas para evitar todo tipo de contaminación. En el laboratorio de bacteriología, especialmente cuando se procede a la toma de muestras, realización de siembras y otras técnicas de laboratorio similares, es imprescindible: — Evitar la entrada en el laboratorio de personas ajenas a él cuando se está trabajando. — Evitar entradas y salidas en el laboratorio con una frecuencia innecesaria, procurando preparar previamente material, medios de cultivo, etc., en la cantidad que se vayan a utilizar. — Evitar hablar, toser, estornudar, etc., durante las fases analíticas más delicadas (toma de muestras, siembras, etc.) siempre que no sea estrictamente inevitable y, en este caso, nunca sobre el trabajo que se esté realizando, sino fuera de su área. — Evidentemente, no se podrá fumar en el laboratorio ni en sus proximidades. También se evitará comer. — Las manos de todas las personas que manipulen las muestras, en el transcurso de los distintos pasos analíticos, deberán estar limpias, así como sus uñas. — Mientras se realiza el análisis, sobre todo en las fases más delicadas del mismo en cuanto a peligro de contaminación se refiere, se evitará tocar con las manos la ropa, cara, pelo, objetos personales como bolsos, pañuelos, etc. — Se evitará estrechar la mano a posibles visitas, abrir grifos, abrir y cerrar puertas, y tocar el teléfono y todo aquello que exija contacto manual ajeno al análisis cuando se están ejecutando fases delicadas de éste. — El lavado de manos y el cepillado de uñas serán cuidadosos y frecuentes. El secado se hará con toallas desechables. — El personal masculino conviene que trabaje en el laboratorio de bacteriología afeitado y con el pelo corto o recogido durante el trabajo. — El personal femenino con pelo largo, igualmente, conviene que lo lleve recogido mientras trabaja.
XXII
INTRODUCCIÓN
— Los cultivos bacterianos inservibles se someterán a esterilización en autoclave para que los tubos, matraces, etc., donde estaban contenidos se puedan lavar sin peligro y ser nuevamente utilizados. — La manipulación de muestras y otras operaciones delicadas se pueden llevar a cabo en cámaras de flujo laminar. — Después de la centrifugación de un producto contaminado, la decantación del centrifugado se hará sobre un líquido antiséptico y nunca sobre un fregadero, por ejemplo. La última gota de la decantación se recogerá con papel de filtro y se sumergirá en un líquido antiséptico. — La rotura de placas o tubos que contengan cultivos bacterianos requiere que se proceda inmediatamente a su recogida cuidadosa, adecuadamente protegidos, y a depositar los restos en cubetas con antisépticos, lavando a continuación el lugar del accidente con desinfectante. — Teniendo en cuenta la posibilidad de que las mesas de trabajo estén contaminadas, en ningún caso se depositarán pipetas ni objetos personales sobre ellas. Los antebrazos estarán cubiertos por las mangas de la bata de laboratorio. — Terminado el trabajo, hay que procurar que no quede en la mesa ningún material más que el estrictamente necesario para facilitar la limpieza y desinfección diarias. — Evitar llevar a la boca lapiceros, rotuladores, etiquetas, etc., sobre todo si han estado en contacto con la mesa de trabajo. — Se hará una limpieza periódica a fondo de frigoríficos centrifugas, estufas y aparatos similares. — Las jarras para anaerobios se limpiarán en profundidad después de cada uso. — Es imprescindible que el bacteriólogo y las personas que trabajen en el Laboratorio de Bacteriología se protejan utilizando una bata cerrada con preferencia de algodón, que se cambiará a menudo. Esta prenda se utilizará exclusivamente para el trabajo de laboratorio y se cambiará por otra para desplazamientos fuera del recinto de trabajo. Nunca se llevará puesta para salir a la calle. — Para evitar la contaminación por corrientes de aire, son desaconsejables las idas y venidas injustificadas; es necesario aprender a moverse en el laboratorio, evitando movimientos bruscos y rápidos de cualquier tipo que contribuyan a crear corrientes de aire favorables a la contaminación. Finalmente, es necesario resaltar que el trabajo de bacteriología es eminentemente vocacional, adecuado sólo para personas con unas condiciones especiales en cuanto a responsabilidad y que sean capaces de realizar y hacer que se realicen tareas que conllevan orden y minuciosidad. El mal hacer de una sola persona puede conducir a resultados y consecuencias desastrosos.
PRIMERA PARTE
1
Muestreo
El muestreo de alimentos destinados al análisis microbiológico es la operación que consiste en separar un número determinado de muestras de un lote, remesa, partida, etc., con el fin de obtener unos resultados analíticos fiables. Se pretende con ello obtener una muestra representativa del total. La necesidad de un muestreo adecuado se hace patente cuando cabe la posibilidad de que existan gérmenes patógenos o sus toxinas, distribuidos de forma escasa o irregular en un alimento o conjunto de alimentos del mismo origen. Es igualmente necesario para saber si una remesa de productos alimentarios cumple o no las normas microbiológicas legales establecidas para dichos productos. NÚMERO DE MUESTRAS Para que el muestreo tenga utilidad estadística, se debe realizar sobre un número apreciable de unidades de un lote o cualquier otra porción. El número de muestras destinadas a un análisis microbiológico está en relación con la precisión que se desee obtener en los resultados. Este número se suele fijar cuando se dispone de muchas unidades, sobre todo en forma de lote. Se suele sugerir que el número de muestras se corresponda con la raíz cuadrada del número total de unidades constituyentes del lote. También que, teniendo en cuenta el volumen del lote, se tome el 1 por 100 del total cuando el lote es grande y el 10 por 100 cuando el lote es pequeño. Estos sistemas citados son aplicables a lotes procedentes de industrias cuyo control se desconoce. Si se trata de productos sometidos a un control regular, es suficiente analizar 5-10 muestras de cada lote. El número de muestras recogidas en el muestreo constituye la «muestra de campo o población». MÉTODO DE MUESTREO ALEATORIO
Este método consiste en separar del lote un número de muestras calculado previamente, utilizando la tabla de números al azar. Dicha tabla está in-
4
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
tegrada por columnas y filas de dígitos obtenidas mediante cálculos estadísticos. Tablas de números al azar
Una vez establecido el número de muestras que se deben tomar del lote (véase apartado anterior), se numeran ordenadamente cada uno de los paquetes, contenedores o unidades del producto por maestrear. Si, por ejemplo, el lote está integrado por 200 unidades, su numeración se marcará del 1 al 200, correlativamente. Con un lápiz se señala un lugar cualquiera en la tabla de números al azar, coincidiendo con un dígito o su proximidad. Este dígito sirve de punto de partida para la separación del número de muestras destinadas al análisis. Supongamos que se ha punteado con el lápiz un lugar que corresponde a la fila 15 y a la columna 10. Este número es el 7 y los que le siguen en las columnas 11 y 12 son el 4 y el 6. En este caso, la unidad que se tiene que separar del lote es la marcada con el número 146. A continuación se pasa a la fila 16 y a las mismas columnas 10, 11 y 12, a las que corresponde el número 078, una nueva unidad que se separa del lote. Pasando a la fila 17, columnas 10, 11 y 12, figura el número 152, que será también separado del lote. Se procede de la misma forma hasta obtener el número de muestras señalado previamente. NORMAS GENERALES PARA EL MUESTREO Como la finalidad del muestreo en Microbiología Alimentaria es, principalmente, obtener una muestra representativa del alimento para su análisis inmediato y conseguir resultados fiables sobre su estado higiénico sanitario, es necesario
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que el producto, en el momento de su análisis, reúna las mismas condiciones microbiológicas que tenía al ser maestreado. Por esta razón, son necesarias unas pautas para conseguir la muestra idónea.
Material utilizado en el muestreo Envases para la toma de muestras Los envases estarán perfectamente limpios, secos y estériles. Su tamaño guardará relación con la muestra que se vaya a tomar. Serán herméticos e inaccesibles a cualquier contaminación posterior a su esterilización. Se pueden utilizar: — — — —
Envases de vidrio de boca ancha. Envases de plástico esterilizable. Bolsas de plástico esterilizable. Envases metálicos.
Instrumentos para la apertura de envases — — — — — — — —
Tijeras estériles. Pinzas estériles. Cuchillos estériles. Sondas estériles. Taladros estériles. Cucharas estériles. Espátulas estériles. Sierras y otros.
Etiquetas y material para marcar — — — — —
Etiquetas de cartulina. Etiquetas adhesivas de papel. Lápiz graso. Rotuladores. Bolígrafos.
Equipo de esterilización — Autoclave pequeño. — Horno. — Mechero, quemador de gas o estufa eléctrica. Refrigeración — Neveras portátiles. — Cajas de plástico aislantes para muestras refrigeradas y congeladas. — Congelador portátil.
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Líquido desinfectante — Alcohol etílico al 70 por 100. — Algodón hidrófilo. Control de temperatura — Termómetro que marque entre -20 °C y +100 °C. Esterilización El material de toma de muestras para el análisis microbiológico debe ser estéril; es necesario que se haya sometido previamente a los métodos habituales de esterilización por calor seco (horno) o calor húmedo (autoclave). CONDICIONES PARA EL MUESTREO Para obtener la muestra representativa que se va a analizar posteriormente en el laboratorio, se deben cumplir ciertas condiciones: — La persona destinada a hacer el muestreo debe conocer perfectamente su finalidad e importancia, por lo que estará bien entrenada para actuar como corresponda en cada caso. Dicha persona deberá estar debidamente auto rizada para ejercer su labor. Una práctica de toma de muestras correcta influirá muy positivamente en la valoración objetiva de los resultados de los análisis. — A ser posible, las unidades de muestra se tomarán en sus envases originales, en los que se enviarán al laboratorio. — En ocasiones, las muestras que se deben recoger son únicas, circunstancia frecuente cuando se trata de alimentos sospechosos de toxiinfección alimentaria. — El muestreo sobre lotes, partidas, remesas, etc., se puede hacer siguiendo la técnica del muestreo aleatorio, aplicando la tabla de números al azar, sobre un número de muestras preestablecido. — Si se trata de cajas grandes que contienen paquetes pequeños, se escogen al azar dichas cajas y, por el mismo procedimiento, se separan los paquetes pequeños. — Cuando los envases son muy grandes y difíciles de transportar, se toman, asépticamente, muestras representativas y se pasan a envases estériles más pequeños. — Los alimentos a granel se maestrean tomando porciones de distintas zonas con material estéril y pasándolas, asépticamente, a envases esterilizados. — Si el producto por maestrear tiene salida por un conducto, se desechan las primeras porciones antes de tomar la muestra. Si son productos líquidas, se agitarán en su envase y se pasarán, asépticamente, a recipientes estériles.
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Si la toma es de agua de un grifo, se desinfecta éste con alcohol. Luego se abre y se desecha el agua que sale en las primeras porciones. Se cierra de nuevo el grifo y se flamea la gota que queda pendiente hasta que emita vapores. A continuación se vuelve a abrir el grifo, dejando fluir el agua durante 1-2 minutos antes de recogerla en el recipiente estéril de la toma de muestras. Este será cerrado convenientemente en condiciones asépticas. Para productos sólidos (queso, jamón cocido, productos congelados y similares) se tomarán las muestras en varias zonas con sacabocados, taladros, sierras, etc., estériles. Las muestras se introducirán, asépticamente, en recipientes estériles. Es conveniente anotar la temperatura de almacenamiento del producto e incluso su propia temperatura. Estos datos serán remitidos al laboratorio.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA SU ENVIÓ AL LABORATORIO Una vez tomadas las muestras, se empaquetan de forma adecuada, según su naturaleza, para evitar su rotura o deterioro. Los paquetes se etiquetarán y marcarán correctamente, cuidando de que la etiqueta quede bien fijada para evitar que se pierda. La etiqueta irá numerada y adecuadamente identificada para que concuerde con el informe del maestreo que debe acompañar siempre a la muestra representativa. Este informe se identificará con los datos del envase y recopilará todos los datos que puedan ser interesantes para el microbiólogo: — Nombre y dirección de la persona que ha tomado las muestras. — Nombre y dirección de la persona, empresa, etc., donde se han tomado las muestras. — Fecha, lugar y hora en que se han tomado las muestras. — Clase de alimentos que integran las muestras. — Nombre del fabricante, importador, vendedor, comprador, etc. — Razón por la cual se ha procedido al muestreo. — Número, tamaño y marca de las unidades que forman el lote. — Forma de transporte. Punto de origen y lugar de destino. — Fecha de embarque y llegada del lote. — Método de muestreo utilizado. — Temperatura del producto en el momento del muestreo. — Temperatura ambiental de almacenamiento. — Forma de transporte y condiciones del envió de las muestras al laboratorio. Todos estos datos, y otros que se consideren oportunos en cada caso, contribuirán a obtener unos resultados analíticos correctos y coherentes. Cuando las muestras sean restos de alimentos sospechosos de toxiinfección alimentaria, es imprescindible remitir, junto con ellas, un protocolo debidamente cumplimentado donde se incluyan los datos más precisos sobre la sintomatología de la enfermedad y otros detalles, así como el estudio epidemiológico del caso.
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Todos estos datos son una ayuda extraordinaria para el microbiólogo, que le conducirán a obtener resultados en el menor tiempo posible. Las muestras, debidamente preparadas, etiquetadas e informadas, se precintarán, de tal forma que, para abrirlas, sea preciso romper el precinto. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS El espacio de tiempo transcurrido entre la toma de muestras y el comienzo del análisis en el laboratorio debe ser lo más corto posible, para que en los resultados de los análisis quede reflejada, con la mayor fidelidad, la flora que, cualitativa y cuantitativamente, estaba presente en el alimento en el momento del muestreo. Respecto al transporte, además de rápido, deberá mantener temperaturas de refrigeración o congelación para los productos que lo requieran.
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Preparación de las muestras para su análisis
Llegadas las muestras al laboratorio, es necesario seguir unos pasos, dentro de la sistemática analítica, que serán establecidos por el microbiólogo teniendo en cuenta la clase de alimento, procedencia y fines del análisis. Estos pasos conducirán a unos resultados que deberán ser interpretados adecuadamente por el microbiólogo experto. La operación de preparación de muestras para el análisis microbiológico exige unas reglas de manipulación aséptica muy estrictas, así como la utilización de material y diluyentes estériles, para evitar la contaminación exterior del alimento. Actualmente se utilizan cámaras de flujo laminar adecuadas para la toma de muestras, que suponen una gran ayuda para evitar el riesgo de cualquier contaminación exterior. TRITURACIÓN Y HOMOGENEIZACION DE ALIMENTOS Cuando se trata de alimentos sólidos, es necesario someterlos previamente a una suspensión, utilizando un diluyente estéril. Toma de muestras para el análisis La fracción de alimento destinada al análisis microbiológico debe ser representativa de la totalidad de la muestra. En general, la muestra analítica debe estar constituida, aproximadamente, por 200 g de la misma. Para la puesta en marcha de las distintas determinaciones se utilizan 100 g; el resto sirve de reserva, por si es necesario repetir el análisis. Siempre que sea posible, y para lograr una mayor representatividad, el tamaño de la muestra que se prepara para el análisis será todo lo voluminosa que permita una buena trituración y homogeneización. Si el alimento está integrado por distintos componentes, se tomarán fracciones representativas de cada uno de ellos en superficie y profundidad.
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La toma de la muestra se hará en condiciones asépticas muy estrictas y con material estéril, utilizando, a ser posible, cámaras de flujo laminar y, siempre, en las proximidades de la llama de un mechero o instrumento similar. El material utilizado en la apertura de envases y en la toma de muestras estará de acuerdo con la naturaleza del producto: abridores, pinzas, bisturíes, tijeras, espátulas, etc.
Pesada de la muestra Como no resulta fácil pesar la muestra con exactitud sin que se pueda evitar una excesiva manipulación, la técnica más sencilla consiste en: — Tarar el recipiente estéril que se vaya a utilizar para la trituración. — Introducir, asépticamente, una porción de un volumen adecuado en dicho recipiente. — Pesar de nuevo para determinar el peso neto del alimento. — Con probeta graduada estéril, se añadirá la cantidad de diluyente estéril para obtener la dilución deseada. Por ejemplo, si la suspensión madre debe tener un título de 1:10, la cifra de pesada obtenido del alimento se multiplica por 9 y el resultado de la multiplicación será el número de mililitros de diluyente que hay que incorporar a la muestra para obtener dicha dilución. Si la suspensión madre debe tener un título de 1:5, la cifra de pesada del alimento se multiplica por 4 y el resultado de la multiplicación será el número de mililitros de diluyente que hay que añadir a la muestra para obtener dicha dilución.
Diluyente La característica principal de un buen diluyente es que no produzca modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la flora de los alimentos que van a ser analizados, es decir, que mantenga lo más fielmente posible la flora de la muestra, sin suprimirla ni favorecer su desarrollo. En Microbiología Alimentaria se utilizan varios diluyentes, habitualmente los siguientes: — Agua de triptona con sal (Tryptone Water: TW). — Solución de Ringer 1/4. — Agua de peptona tamponada. Este último diluyente se emplea normalmente en técnicas para la investigación de Salmonella y, a veces, para investigación de histeria monocytogenes. El diluyente utilizado para la preparación de la suspensión madre se suele emplear, posteriormente, para efectuar las diluciones decimales.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS
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Triturado de la muestra Se trata de una operación importante dentro de la preparación de la muestra para su análisis. En el triturado hay que evitar la destrucción de los gérmenes por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo. Además de una perfecta trituración de los alimentos, es necesario obtener una mezcla homogénea para lograr la distribución equilibrada de los gérmenes y sus toxinas. Existen varios tipos de trituradores: — Jarra, que consiste en un envase de vidrio o acero provisto de una hélice que funciona cuando se adapta a un motor. — Vastago provisto de una hélice en su extremo, que se introduce en la mezcla que se va a triturar. Funciona eléctricamente y necesita un envase de vidrio o acero que se adapte especialmente al vastago. — Triturador de paletas (Stomacher), que actúa golpeando rítmicamente la mezcla de alimento y diluyente que ha sido introducida previamente en una bolsa de plástico estéril. Los choques producidos por las paletas dislaceran el alimento y ponen a las bacterias en suspensión. El último procedimiento es utilizado con éxito en los Laboratorios de Microbiología Alimentaria por su sencillez de uso, considerando que sus resultados son equiparables o superiores a los de los otros métodos. PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES La preparación de diluciones decimales a partir de una muestra tiene por objeto efectuar diluciones progresivas de dicha muestra, para poder realizar recuentos microbianos posteriores. Material — — — — —
Triturador homogeneizador. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Matraces Erlenmeyer. Pipetas estériles de 10 y 1 ml. Agitador excéntrico.
Diluyente (agua de triptona) Agua de triptona (Tryptone Water. TW) Composición: Triptona Cloruro sódico Agua destilada
10 g 5g 1.000 ml
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Mezclar y disolver los ingredientes en el agua. Ajustar el pH a 7,2. Distribuir en tubos de ensayo de 16 x 160 mm, a razón de 9 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Técnica Pesar, asépticamente, una porción representativa de la muestra analítica. La cifra de pesada obtenido se multiplica por 9 y el resultado dará el volumen en mililitros de diluyente (TW) (véase apartado anterior) que es necesario añadir para obtener la dilución 1:10. Esta mezcla, homogeneizada y/o triturada en triturador homogeneizador o triturador de paletas (Stomacher), constituye la suspensión madre y primera dilución de la serie (1:10). A un tubo que contenga 9 mi de agua de TW (véase apartado anterior) se transfiere 1 mi de la suspensión madre. Mezclar 30 segundos en agitador excéntrico. Así se obtiene la dilución 1:100. Desechar la pipeta usada. De la mezcla anterior, y con nueva pipeta estéril, se incorpora 1 mi a otro tubo que contenga 9 mi de agua de triptona estéril (TW). Mezclar 30 segundos en agitador excéntrico. Así se obtiene la dilución 1:1.000. Desechar la pipeta usada y repetir la operación en varios tubos, hasta lograr las diluciones deseadas. De esta forma se obtiene la «serie de diluciones decimales» (10-1; 10-2; 10-3; 1CH; etc.), que servirá para iniciar las determinaciones en las que sea necesario obtener recuentos. Los tubos de la serie se mantendrán en frigorífico hasta el comienzo del análisis, el cual, aun en condiciones de refrigeración, no deberá demorarse más de dos horas a partir del momento en que se haya preparado la «serie de diluciones decimales».
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Recuento de microorganismos aerobios mesófilos (31 ± 1 °C) revivificares
En el recuento de microorganismos aerobios mesófilos se estima la flora total, pero sin especificar tipos de gérmenes. Esta determinación refleja la calidad sanitaria de los productos analizados indicando, además de las condiciones higiénicas de la materia prima, la forma como fueron manipulados durante su elaboración. Tiene un valor limitado como indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas. Un recuento total de aerobios mesófilos bajo no asegura que un alimento esté exento de patógenos o sus toxinas; tampoco un recuento total alto significa, inevitablemente, presencia de flora patógena. Excepto en productos que se elaboran por fermentación, altos recuentos microbianos se consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos. Su significado es diverso: — Materia prima excesivamente contaminada. — Deficientes métodos de manipulación durante la elaboración de los productos. — La posibilidad, por tratarse de microorganismos mesófilos de que entre ellos pueda haber patógenos, dado que esta flora suele ser mesófila. — Altos recuentos suelen ser signo de inmediata alteración del producto. Tasas superiores a 106-107 gérmenes por gramo suelen ser ya inicio de descomposición. En general, el recuento de la flora aerobio mesófila es una prueba para conocer las condiciones de salubridad de algunos alimentos.
MÉTODOS DE RECUENTO EN PLACAS Se utilizan para determinar el número de gérmenes por gramo o mililitro del alimento en estudio, partiendo de la «serie de diluciones decimales», mediante el empleo de técnicas en placas de agar. 13
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Recuento por siembra en masa Material — — — — — —
Placas de Petri estériles de 90 mm. Pipetas de 10 y 1 ml. Asa de siembra. Asas de vidrio estériles. Estufa de cultivo. Contador de colonias.
Medio de cultivo Agar nutritivo de recuento (Plata Count Agar. PC A) Composición: Triptona Extracto de levadura Dextrosa Agar Agua destilada
5g 2,50 g 1g 12 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento. Ajustar el pH a 7. Distribuir en tubos o matraces y esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Técnica — A partir de la «serie de diluciones decimales» y por duplicado, depositar, con pipeta estéril, 1 mi de cada dilución en otras tantas placas de Petri es tériles de 90 mm de diámetro. — Añadir a cada placa unos 15 mi de PC A (v. pág. 14) previamente licuado y atemperado a 47 ° C. El tiempo transcurrido entre el momento de depositar las distintas diluciones en las placas y verter sobre ellas el medio de cultivo no debe ser superior a 10 minutos. Del mismo modo, no se superarán los 20 minutos desde que se prepara la primera dilución en la «serie de diluciones decimales»hasta que se vierte el agur en la última placa. — Mezclar perfectamente medio e inoculo sobre la mesa de trabajo, haciendo movimientos circulares con la placa, a favor y en contra del sentido de las agujas del reloj y en forma de cruz, evitando al mismo tiempo que el medio impregne la tapa. Dejar solidificar el agur de las placas sobre una superficie horizontal. Cuando se ha solidificado perfectamente el agur, se invierten las placas y se introducen en la estufa, evitando que se apilen en exceso y que entren en contacto con sus paredes. Incubar a 31 ± 1 ° C durante un período de 72 horas. — Transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias en aquellas placas que muestren entre 30 y 300 colonias aisladas. Las colonias contadas se irán marcando para evitar contarlas de nuevo.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS (31 ± 1 ° C) REVIVIFICABLES
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El número total de colonias contadas, multiplicado por el factor de dilución de la placa elegido, da como resultado el recuento total de gérmenes por gramo o mililitro de la muestra analizada. Recuento por siembra en superficie Material (v. pág. 14) Medio de cultivo (v. pág. 14) Técnica — En varias placas de Petri estériles se vierten unos 15 ml de agur nutritivo de recuento (v. pág. 14), previamente licuado y enfriado a 47 ° C, y que se deja que se solidifique en una superficie horizontal. — Para secar la superficie del agur, se introducen las placas abiertas en la estufa, colocando la parte que lleva el agur en posición invertida y apoyada en la tapa. Estarán dispuestas para el uso cuando se haya secado el agua de condensación de la superfcie. Nunca se deben secar a temperatura superior a 45 °C. — Partiendo de la «serie de diluciones decimales», y por duplicado, se transfiere 0,1 ml de cada una de las diluciones a placas con agur nutritivo PCA. Desechar la pipeta utilizada. El inoculo se disemina por toda la su perficie del agur, sin romperlo, con ayuda de un asa de vidrio estéril. Desechar el asa de vidrio utilizada. — Dejar que el inoculo sea absorbido y colocar todas las placas en estufa regulada a 31 ± 1 ° C, evitando que estén apiladas en exceso y que entren en contacto con las paredes de la estufa. El periodo de incubación será de 72 horas. — Transcurrida la incubación, se hace el recuento de colonias en las placas donde estén perfectamente aisladas. El número total de colonias contadas, multiplicado por el factor de dilución de la placa elegido, da como resultado el recuento total de gérmenes en 0,1 g del producto analizado. Esta cifra, multiplicada por 10, expresará el recuento total de gérmenes por gramo o mililitro.
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Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosapositivas (coliformes)
Las Enterobacteriaceae lactosa-positivas o grupo coli-aerogenes constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae v se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 3O-37° C. Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo «coliformes» forman parte varios géneros: — — — —
Escherichia. Enterobacter. Klebsiella. Citrobacter.
Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. Aunque su especificidad como indicadores no es buena, se suelen usar como índice de contaminación fecal por: — Su frecuencia en heces. — Su fácil detección en el laboratorio. — Sus características semejantes, en algún aspecto, a las de algunos miembros patógenos de la familia Enterobacteriaceae. Dentro de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario y, por consiguiente, los que más interesan en el análisis microbiológico de alimentos. Se considera a los coliformes fecales como presuntos Escherichia coli. Sus principales características son: — Aptitud para desarrollarse entre 43,5-45,5 ° C. — Capacidad para crecer en presencia de sales biliares. — Facultad para producir indol en agua de peptona. 17
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En general, niveles altos de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) indican manipulación y elaboración deficientes de los alimentos. INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE LACTOSA-POSITIVAS (COLIFORMES) Investigación y recuento en medio líquido Para la detección de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes), se aprovechan ciertas características que las diferencian de otras Enterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas en presencia de sales biliares. Material — — — —
Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Gradillas. Pipetas estériles de 10 y 1 ml. Estufa de cultivo.
Medio de cultivo Caldo lactosado biliado verde brillante (Brilliant Green Bile Lactose: BGBL) Composición: Peptona Lactosa Bilis de buey Verde brillante Agua destilada
10 g 10 g 20 g 0,0133 g 1.000 ml
Disolver. Ajustar el pH a 7,4. Distribuir en tubos de ensayo con campana Durham a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 20 minutos. Técnica Se preparan en una gradilla tres series de tres tubos cada una. Cada tubo contendrá 10 mi de BGBL (véase apartado anterior). En cada uno de los tubos de la primera serie, se vierte 1 mi de la dilución de la muestra al 1:10. En cada uno de los tubos de la segunda serie, se vierte 1 mi de la dilución de la muestra al 1:100. En cada uno de los tubos de la tercera serie, se vierte 1 mi de la dilución de la muestra al 1:1.000. Incubar las tres series a 31 ± 1 ° C, haciendo lecturas a las 24 y 48 horas. La reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durham, por lo menos en 1/10 parte de su volumen, como consecuencia de la fermentación de la lactosa con formación de ácido y gas en presencia de sales biliares a una temperatura comprendida entre 30-37 ° C.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE LACTOSA-POSITIVAS
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Con el número de tubos positivos en cada serie, se recurre a la Tabla del Número Más Probable (NMP), donde se obtendrá el recuento por gramo o mililitro de muestra. Tabla del Número Más Probable (NMP) por gramo o mililitro utilizando tres series de tres tubos cada una, conteniendo 10 ml de medio líquido y sembrando 1 ml de la dilución 1:10, 1 mi de la dilución 1:100 y 1 mi de la dilución 1:1.000 Tres tubos 1 ml 1:10 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Tres tubos 1 ml 1:100 0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3
Tres tubos 1 ml 1:1.000 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3
NMP de gérmenes g o ml 2.400
Investigación y recuento en medio sólido En la técnica que se describe a continuación se utiliza el medio selectivo agur biliado rojo neutro cristal violeta (Violet Red Bile Agar: VRBA).
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Material — — — —
Placas de Petri estériles, de 90 mm de diámetro. Pipetas estériles de 1 ml. Estufa de cultivo. Cuenta colonias.
Medio de cultivo Agar biliado-rojo neutro-cristal violeta (Violet Red Bile Agar: VRBA) Composición: Extracto de levadura Peptona Cloruro sódico Sales biliares Lactosa Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada
3g 7g 5g 10 g 5g 0,03 g 0,02 g 15 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes por calentamiento. Mantener en ebullición dos minutos. Ajustar el pH a 7,4. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Para preparar placas de Petri, se enfriará a 45 ° C. Técnica A partir de la «serie de diluciones decimales» (v. pág. 11) y por duplicado, se añade 1 mi de cada dilución en placas de Petri estériles, a continuación se vierten unos 15 mi de agar VRBA (véase apartado anterior) atemperado a 47 ° C. Mezclar cuidadosamente. Una vez solidificado el medio en una superficie horizontal, se vierten 3-4 ml del mismo medio estéril sobre cada placa, formando una capa que evita el excesivo crecimiento y la extensión de las colonias, lo que facilita su recuento. Incubar las placas en posición invertida a 31 ± 1 ° C durante 24 horas. Las sales biliares y el cristal violeta del medio inhiben la ñora acompañante grampositiva. La fermentación de la lactosa hace que vire el indicador rojo neutro a un color rojo púrpura. También se produce una precipitación de las sales biliares. La lectura consiste en contar las colonias rojo púrpura rodeadas de una zona de precipitación de las sales biliares color violeta. Para el recuento se eligen placas que contengan entre 30 y 150 colonias típicas El número de colonias contadas, multiplicado por el factor de dilución de la placa elegido, da como resultado el número total de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) por gramo o mililitro de muestra.
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Investigación y recuento de Escherichia coli
Escherichia coli es huésped constante del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente. Por su especificidad está considerado como un buen índice de contaminación fecal. Tiene el inconveniente de vivir poco tiempo en el ambiente extraentérico, por lo que su presencia en los alimentos indica contaminación reciente. Se destruye a temperatura de pasteurización y también durante su almacenamiento en frío, sobre todo a temperatura de congelación. Su escasa resistencia hace que no sea un buen indicador de flora patógena; así, por ejemplo, es mucho menos resistente que la Salmonella a las condiciones ambientales y a la acción del frío. Pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Es un germen de forma bacilar, casi siempre móvil, gramnegativo. Posee estructura antigénica. La mayoría de las bacterias pertenecientes a la especie E. coli, forman parte de la microflora normal del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente, encontrándose, habitualmente, en sus heces. Su detección en los alimentos sirve como índice de contaminación fecal de los mismos. La mayor parte de las cepas son inocuas, pero existen algunas que son patógenas para el hombre. Al final del siglo pasado se comprobó que algunas cepas de E. coli eran la causa de diarreas en niños, lo que fue comprobado en 1950 por Kauffmann y Dupont. Se prosiguieron los estudios y Lupski y Feigin, en 1988, sugieren que este grupo de E. coli patógenos se denomine, en general, Escherichia coli enterovirulentos (Enteric Virulent Escherichia coli: EVEC). Existía la creencia de que E. coli enterovirulento (EVEC) afectaba, únicamente a bebés y niños en general. Es a partir de 1952 cuando se comprueba que los adultos también sufren con cierta frecuencia diarrea por E. coli: Cepas E. coli enterotoxigénicas (ECET): Muchas cepas de E. coli elaboran una toxina lábil (LT) y/o una toxina estable (ST). La toxina lábil (LT), se inactiva a temperatura de 60 °C aplicada durante 30 minutos; la toxina estable (ST) resiste más de 100 °C aplicados durante 30 minutos. El germen actúa colonizando el epitelio del intestino delgado, donde elabora la o las toxinas. La toxina lábil (LT) rompe la función celular del epitelio intestinal, produciendo secreción de agua y electrólitos que vierten en la luz intestinal pro21
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duciendo diarrea acuosa profusa. La toxina termoestable (ST), menos estudiada, probablemente actúa de forma análoga. Estas toxinas son causa de la diarrea infantil, así como de la denominada diarrea de los turistas. Los síntomas de la enfermedad dependen de la toxina implicada. En el caso de la toxina lábil (LT), los síntomas se asemejan a los del cólera. Los brotes por toxina estable (ST) son menos frecuentes. Los síntomas producidos por las cepas E. coli enterotoxigénicas (ECET), se inician entre las 8 y 44 horas que siguen a la ingestión del producto contaminado con el germen. La enfermedad se manifiesta con una diarrea acuosa, no sanguinolenta, a veces con mucosidad. Hay retortijones, dolor abdominal, malestar general, nauseas, vómitos y, si se origina fiebre, ésta es leve. Los síntomas duran entre 3-9 días. De las cepas E. coli enterovirulentas (EVEC) existen portadores asintomáticos que pueden contagiar a niños y adultos, sobre todo en casas con condiciones higiénicas deficientes, guarderías, residencias, etc. por la misma causa. Aunque E. coli es un microorganismo habitual del intestino humano y otros animales, las cepas que producen diarrea, exceptuando las enterohemorrágicas, son de origen humano. En cuanto a los alimentos, la transmisión de cepas enterotoxigénicas que han dado origen a enfermedad están en el agua de bebida, leche, ensaladas vegetales, queso de pasta blanda, etc. Cepas E. coli enteroinvasivas (ECEl): dentro de los E. coli enterovirulentos (EVEC), las cepas enteroinvasivas del mismo (ECEI), además de poseer las propiedades comunes de los otros tipos patógenos tienen, por otra parte, ciertas propiedades atípicas que se relacionan con las Shigella (inmovilidad, similitud bioquímica, algunas cepas no producen gas de la glucosa ni de otros azúcares, su fermentación lenta de la lactosa). Las cepas citopatogénicas penetran en el intestino e invaden las células epiteliales del colon donde se multiplican y producen su muerte. Esto da lugar a la producción de ulceraciones cuya consecuencia es una diarrea sanguinolenta. La enfermedad que producen estas cepas es más grave que la de cepas enterotoxigénicas (ECET). Los síntomas que ocasionan las cepas E. coli enteroinvasivas (ECEI) aparecen entre las 8 y 24 horas posteriores a su ingestión. Se manifiestan con escalofríos, malestar, dolor de cabeza, mialgia, fiebre, retortijones abdominales y diarrea profusa sanguinolenta. Es muy parecido a la Shigella y, en su identificación, se puede confundir con ella. La enfermedad dura días y, aun, semanas. No se conoce bien la existencia de portadores asintomáticos de cepas ECEI. Su transmisión se hace de persona a persona por manipulaciones poco higiénicas y falta de higiene personal, también a través de agua, leche, queso, carne de ave y otros. Cepas E. coli entewpatógenas (ECEP): dan lugar a una patología entérica muy parecida a la de las cepas enterotoxigénicas (ECET). Se trata de un gran número de tipos de E. coli. Han sido la causa de numerosos brotes en guarderías y otras comunidades infantiles donde no se contaba con buenas condiciones higiénicas. Son los niños los más afectados. La enfermedad es más frecuente en países subdesarrollados, con condiciones de vida muy deficientes. Los clásicos tipos de dispepsia infantil por E. coli pertenecen a este grupo. Se han citado algunos casos en adultos, aunque excepcionalmente, ya que parece que las personas van adquiriendo inmunidad con el transcurso del tiempo.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI
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Al llegar al intestino se adhieren al epitelio intestinal y destruyen los microvilli lesionándolos, pero sin invadir los tejidos. Los síntomas se inician entre las 17 y 72 horas que siguen a la ingestión del germen. Se manifiestan con dolor abdominal, vómitos, fiebre, diarrea acuosa con abundante moco pero sin sangre. La enfermedad dura entre 1 y 12 horas. Su transmisión se puede producir de persona a persona a través de portadores humanos asintomáticos que contagian a niños y ancianos por falta de higiene (guarderías, residencias, países subdesarrollados). A través de alimentos se conocen brotes producidos por consumo de queso de pasta blanda, agua, carne y otros. Cepas E. coli enterohemorrágicas (ECEH) (O157:H7): las cepas E. coli enterohemorrágicas (ECEH), serovar 0157:H7 son, probablemente, las más importantes entre los E. coli enterovirulentos (EVEC) alimentarios. El tipo predominante en estas cepas es el serovar 0157:H7 y la toxina involucrada en la enfermedad se denomina verotoxina. La presencia de E. coli serovar 0157:H7 se identifica como causa de colitis hemorrágica que, con frecuencia, se asocia con la ingestión de carne picada vacuna poco cocinada, principalmente, aunque pueden tenerse en cuenta también otras carnes de abasto (cerdo, ovino y aves). El germen, después de ingerido, coloniza en el intestino grueso, dando lugar a varias formas de manifestación patógena: — Colitis hemorrágica. — Síndrome hemolítico urémico (Hemolytic Uremic Syndrome: HUS). — Púrpura trombótica trombocitopénica (Thrombotic Thrombocytopenic Purpura: TTP). En la colitis hemorrágica se produce dolor abdominal, a veces vómitos, diarrea acuosa sanguinolenta y poca o ninguna fiebre. Los síntomas aparecen a los 3-9 días después de la ingestión del alimento contaminado. La enfermedad dura 2-9 días. En el síndrome hemolítico urémico (HUS), hay diarrea sanguinolenta y, sobre todo en niños, fallo renal agudo que puede terminar en muerte. No hay fiebre. La púrpura trombótica trombocitopénica (TTP) es, en cierto modo, parecida al síndrome hemolítico urémico (HUS), no hay fiebre, existe hemorragia gastrointestinal y, en este caso, puede ser afectado el sistema nervioso central. A los enfermos se les pueden formar coágulos en el cerebro, con el peligro de muerte. Como esta cepa procede, principalmente, del ganado vacuno son, la carne poco cocinada, sobre todo la picada y la leche cruda los alimentos más involucrados en esta enfermedad. Los brotes son más frecuentes en guarderías, residencias de ancianos etc. por la mayor sensibilidad de estos seres. En todos los casos la aparición de la enfermedad se corresponde con falta de higiene. E. coli serovar 0157:H7 tiene unas características propias que se pueden usar en su aislamiento e identificación: — No fermentan el sorbitol. — No producen la enzima beta de la glucuronidasa (en la prueba MUG estas cepas no dan fluorescencia por carecer de la enzima citada).
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Escherichia coli se ajusta a las siguientes características: Prueba
Reacción
Movilidad
+ (casi siempre)
Indol Rojo de metilo Voges Proskauer Betagalactosidasa Citrato de Simmons SH2 Lisina Urea Fermentación de la glucosa Fermentación de la lactosa
+ + + + + +
Material — — — — — — —
Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Gradillas. Asa de cultivo. Baño María. Placas de Petri de 90 mm. Pipetas de 1 ml. Estufa de cultivo.
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Caldo lactosado biliado verde brillante (Brilliant Grcen Bile Lactose: BGBL) (v. pág. 18) Agar Levine Composición: Peptona Lactosa Fosfato dipotásico Eosina Azul de metileno Agar Agua destilada
10 g 10 g 2g 0,40g 0,065 g 1 5g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,1. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Atemperar para preparar placas de Petri.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI
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Agua de triptona (Tryptone Water: TW) (v. pág. 11) Reactivo de Kovacs Composición: Paradimetil-amino-benzaldehído Alcohol amílico Acido clorhídrico puro
5g 75 ml 25 ml
Se disuelve el aldehído en el alcohol, calentando a 60 ° C en baño Maria. Dejar enfriar y añadir, gota a gota, el ácido. Se obtiene un líquido de color amarillo dorado que debe conservarse en frasco topacio, al abrigo de la luz y en frigorífico. Agar nutritivo (Plata Count Agar: PCA) (v. pág. 14) Medio de Clark y Lubs (MR-VP) Composición: Peptona Glucosa Fosfato dipotásico Agua destilada
7g 5g 5g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 6,9. Distribuir en tubos de 16 x 160 mm a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Reactivo para la prueba rojo de metilo Composición: Alcohol de 90° Agua destilada Rojo de metilo
65 ml 35 ml 0,20 g
Se disuelve el colorante en el alcohol y se completa con el agua destilada. Reactivos para la investigación de acetil-metil-carbinol (prueba de Voges Proskauer: VP) Composición: Reactivo A: Alfa-naftol Alcohol absoluto
40 g 100 ml
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
La solución se conserva en oscuridad. Reactivo B: Hidróxido potásico Agua destilada
40 g 100 ml
Creatinina Agar citrato de Simmons Composición: Sulfato magnésico Dihidrógeno fosfato amónico Fosfato sódico amónico Citrato sódico Cloruro sódico Azul de bromotimol Agar Agua destilada
0,20 g 0,20 g 0,80 g 2g 5g 0,08 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7. Distribuir en tubos de 16 x 160 mm a razón de 7 mi. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Dejar solidificar con una inclinación que permita obtener un fondo de 2-3 cm y una superficie inclinada de 4-5 cm. Caldo lauril sulfato (MUG) Composición: Triptosa 20 g Lactosa 5g Cloruro sódico 5g Lauril-sulfato sódico 0,10 g Hidrógeno-fosfato dipotásico 2,75 g Hidrógeno-fosfato potásico 2,75 g L-Triptófano 1g 4-Metil-umbiferil ß-D-glucurónico 0,10 g Agua destilada 1.000 ml Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,1. Distribuir en tubos con campana Durham a razón de 10 mi. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. TÉCNICA Para la investigación y recuento de E. coli se parte de los resultados obtenidas en la investigación de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes). de acuerdo con los siguientes pasos:
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI
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Con asa de siembra se subcultivan todos los tubos positivos (con gas) que se han detectado en la investigación de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes), a otros que contengan 10 mi de caldo lactosado verde brillante (BGBL) con campana Durham (v. pág. 18). Incubar los tubos sembrados en baño María regulado a 44,5 ± 0,5 ° C con lectura a las 24 y 48 horas. La temperatura de incubación es selectiva para Eschenchia coli Se presume que todo tubo que presente gas después de la incubación es Eschenchia coli. Para su confirmación a partir de los tubos positivos, se hacen siembras sobre agar Levine (v. pág. 24), con el fin de obtener colonias aisladas fácilmente identificables. Incubar a 44,5 ± 1°C con lecturas a las 24 y 48 horas. Las colonias de E. coli sobre agur Levine miden 2-3 mm de diámetro, son planas o ligeramente cóncavas, con centros oscuros, casi negros, que ocupan las 3/4 partes de la colonia. Con luz reflejada, se observa un brillo metálico verdoso; a veces, este brillo metálico no se manifiesta. Para investigar la producción de indol se siembran 1-2 colonias de cada placa en tubos con TW (v. pág. 11). Incubar en baño María a 44,5 °C durante 24 horas. Pasado este tiempo se incorporan 0,5 mi del reactivo de Kovacs (v. pág. 25) a cada tubo. La reacción positiva se manifiesta por la formación de un anillo rojo bermellón en la superficie del medio; la reacción negativa muestra anillo amarillento. Eschenchia coli al desaminar e hidrolizar el triptófano del medio, produce indol que se pone de manifiesto al añadir el reactivo de Kovacs. Cuando coincide crecimiento positivo (gas) en caldo BGBL a 44,5 C producción de indol y crecimiento característico sobre agar Levine, se hace la lectura en la tabla del NMP para obtener el número de E. coli por gramo o mililitro de muestra. Otras pruebas de confirmación Normalmente, basta con las pruebas anteriormente expuestas para la investigación y recuento de E. coli No obstante, en ocasiones es necesario realizar más pruebas de confirmación como, por ejemplo, las IMVC, previa purificación de las colonias en agur nutritivo PCA (v. pág. 14): I = indol M = rojo de metilo V = Voges Proskauer C = citrato Para llevar a cabo las pruebas de rojo de metilo y Voges Proskauer, se siembran dos tubos de medio de Clark y Lubs (MR-VP); (v. pág. 25) por cada colonia que haya que identificar. Incubar a 37 ° C durante 4 días. En uno de los tubos se investiga el rojo de metilo y en el otro el acetil-metil-carbinol (prueba de Voges Proskauer). Reacción del rojo de metilo A uno de los tubos que contienen el cultivo sobre el medio de Clark y Lubs (MR-VP), se añaden 1-2 gotas del reactivo rojo de metilo (v. pág. 25).
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
En caso positivo, se produce una coloración roja; en la reacción negativa, el color es amarillo. E. coli es un organismo rojo de metilo (RM) positivo. Investigación de acetil-metil-carbinol (prueba de Voges Proskauer) Al cultivo obtenido en el otro tubo del medio de Clark y Lubs (MR-VP) se añaden 0,6 mi de reactivo A (v. pág. 25) y 0,2 mi del reactivo B (v. pág. 25). Agitar la mezcla e intensificar la reacción con unos cristales de creatinina. Hacer la lectura entre los 15 minutos y las 4 horas posteriores a la terminación de la prueba. La reacción positiva se manifiesta por un fuerte color rojo. E. coli es un germen Voges Proskauer negativo. Asimilación del citrato A partir de un cultivo reciente en PC A (v. pág. 14) de la colonia en estudio, se siembra en estría única sobre la superficie inclinada de agar citrato de Simmons (v. pág. 26). Incubar a 37 °C durante 24 horas. La reacción es positiva cuando se produce crecimiento en el medio. E. coli es una bacteria citrato-negativa, es decir, no crece sobre agar citrato de Simmons, por no utilizar el citrato como única fuente de carbono. Escherichia coli responde a las pruebas IMVC de la forma siguiente: Indol (I) = positivo; a veces, negativo. Rojo de metilo (M) = positivo. Voges Proskauer (V) = negativo. Citrato (C) = negativo. PRUEBA RÁPIDA PARA INVESTIGACIÓN DE ESCHERICHIA COLI (MUG) Dentro de la familia Enterobacteriaceae, E. coli posee, junto con algunas especies de Salmonella y Shigella, la enzima ß-D-glucuronidasa, que tiene la facultad de romper el sustrato 4-metil- umbeliferil ß-D-glucurónico (MUG). Esta sustancia, incorporada al medio de cultivo, libera como producto final 4-metil-umbeliferona, por acción de la enzima. Este producto tiene la propiedad de emitir fluorescencia azul/verde cuando se ilumina con luz ultravioleta. Aprovechando esta característica se utilizan medios de cultivo a los que se ha incorporado el sustrato MUG, con la ventaja de poder realizar una prueba rápida para la investigación de E. coli Técnica en medio líquido Se preparan tres series de tres tubos cada una, cada tubo con 10 ml de caldo lauril sulfato con MUG y campana Durham. A cada uno de los tres tubos de la primera serie se le añade 1 mi de la dilución del alimento al 1:10.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI
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A cada uno de los tres tubos de la segunda serie se le añade 1 mi de la dilución del alimento al 1:100. A cada uno de los tres tubos de la tercera serie se le añade lml de la dilución del alimento al 1.-1.000. Incubar las tres series de tubos a 37 ° C durante 24 horas. En la lectura se tendrá en cuenta: — Si se ha producido gas en la campana Durham por fermentación de la lactosa. — Si se produce fluorescencia azul/verde por presencia de la enzima ß-D-glucuronidasa. — Si la reacción de indol es positiva al añadir el reactivo de Kovacs. Deben coincidir: la aparición de gas en la campana Durham, la fluorescencia azul/verde al observar los tubos con luz ultravioleta y la presencia de indol. Para obtener el número total de E. coli por gramo o mililitro, se recurre a la Tabla del NMP (v. pág. 19). En la investigación de cepas patógenas de Escherichia coli hay que tener en cuenta que las cepas enterohemorrágicas (ECEH) no dan fluorescencia cuando se investigan por una técnica MUG, debido a que no poseen la enzima ß-D-glucuronidasa. PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ESCHERICHIA COLI Y ESCHERICHIA COLI ENTEROVIRULENTOS (EVEC) Las técnicas rápidas, inmunológicas o de otro tipo, aplicadas a la identificación de E. coli enterovirulento o no enterovirulento, se utilizan como ayuda y complemento a los métodos clásicos de aislamiento e identificación. Se trata de técnicas variadas basadas en unos principios que ayudan al microbiólogo de alimentos, en unos casos, a detectar enterotoxinas y, en otros, a confirmar por técnicas miniaturizadas los resultados de los métodos analíticos clásicos: — Rapidec coli (API), para E. coli no enterovirulento. — API 20E, para E. coli no enterovirulento. — API IOS, para E. coli no enterovirulento (identificación del género). Ante la sospecha de E. coli enterovirulentos, se utilizan algunos bioensayos: Para la detección de toxinas producidas por E. coli enterotoxigénico (ECET) se usan varias técnicas: — Kit comercial Denka Seiken (Unipath). — Kit comercial RPLA (Reverse Passive Látex Agglutination), capaz de de tectar la enterotoxina LT. — Precipitación: reacción antígeno-anticuerpo, LT. — Gel difusión, poco sensible, para enterotoxina LT. — Método ELISA, sobre membrana de nitrocelulosa, LT.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— — — — —
Radioinmunoensayo (RÍA), LT. Prueba de hibridación DNA, LT. Prueba de hibridación DNA, para enterotoxina ST. Radioinmunoensayo (RÍA), para enterotoxina ST. Método ELISA (anticuerpos monoclonales), para enterotoxina ST.
Para la detección de cepas de E. coli enteroinvasivo (ECEI) se utiliza: — Serotipificación. — Método ELISA. — Prueba de hibridación del DNA. En la identificación de cepas E. coli enteropatógeno (ECEP) se utiliza: — Serotipificación. — Prueba DNA por plásmidos. Para la identificación de cepas E. coli enterohemorragico (ECEH) se utiliza: — Serotipificación. — Prueba DNA. — Método ELISA, basado sobre un anticuerpo monoclonal altamente específico para este serovar. (E. coli O157:H7).E1 procedimiento ha sido modificado por Organon Teknica con un kit comercial: EHEC-TEK. — Test de aglutinación por látex (Oxoid). Para la identificación de E. coli 0157:H7. CONTROL DE ESCHERICHIA COLI ENTEROVIRULENTO (EVEC) Las infecciones de E. coli enterovirulento (EVEC) tienen su origen en la contaminación fecal a partir de portadores sintomáticos o asintomáticos de estos microorganismos. Las cepas E. coli ECET, ECEI y ECEP de origen humano son causa de distintas alteraciones intestinales en el hombre. Estas cepas, albergadas en el intestino de portadores, son excretadas con sus heces. Los alimentos se pueden contaminar a partir de los manipuladores-portadores o por contacto con agua que contenga residuos fecales humanos. Después de la contaminación del alimento, debe haber una fase en la que sea posible la multiplicación del germen, teniendo en cuenta que E. coli, como el resto de las Enterobacteriaceae, es una bacteria termotrófica, es decir, crece bien entre 7-42 ° C. La multiplicación depende de que no se almacene el alimento a temperatura que no inhiba su crecimiento. Las medidas para controlar el crecimiento de los E. coli enterovirulentos ECET, ECEI y ECEP se basan en las mismas normas útiles para todas las toxiinfecciones de origen alimentario: — Evitar el consumo de alimentos crudos de origen animal. — Calentar adecuadamente los alimentos para destruir la flora patógena.
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— Llevar a cabo una higiene personal meticulosa por parte de los manipula dores, en el ambiente y en las prácticas de manipulación de los alimentos. — Conservar correctamente los alimentos preparados, utilizando su refrigeración inmediata a temperatura inferior a 7 ° C. — Utilizar agua clorada para la limpieza de los utensilios del procesado de los alimentos y el lavado de las superficies de contacto. — No utilizar abonos humanos. Respecto a las cepas de E. coli enterohemorrágico (ECEH), el tracto intestinal del ganado vacuno y, quizá, de otros animales de abasto, es un reservorio muy importante de E. coli serovar 0157:H7. Es fácil suponer que algunos productos de origen animal se contaminen con el germen durante el sacrificio de las reses o el ordeño de las vacas. El control de este tipo de cepas se basa en: — Extremar los cuidados en las fases de sacrificio y ordeño de los animales. — Calentar adecuadamente los alimentos de origen animal para destruir el germen antes del consumo del alimento. — Evitar el consumo de carnes crudas, poco cocinadas y leche no pasteurizada. — Evitar la contaminación post procesado de los alimentos terminados por utilización de utensilios o equipos usados en la preparación de alimentos crudos de origen animal. — Teniendo en cuenta que la dosis infectante de E. coli 0157:H7 es baja, se debe controlar su multiplicación sobre la carne o la leche mediante un enfriamiento rápido inferior a 7 ° C después del sacrificio, procesado y ordeño.
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Investigación de Enterobacteriaceae totales
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son gérmenes de forma bacilar, gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, móviles o inmóviles, que fermentan la glucosa, reducen nitratos a nitritos, son citocromooxidasa negativos y crecen en medios que contienen sales biliares. De los integrantes de esta familia, unos fermentan la lactosa y otros no. Incluye los siguientes géneros:
No termentadores de la lactosa
Fermente/dores de la lactosa
Salmonella Shigella Edwarsiella Hafnia Proteus
Escherichia Enterobacter Citrobacter Serratia (a veces, Kelbsiella (excep. Kb. rhinocleromatis)
Providencia Yersinia Morganella
Erwinia (fermenta excepcionalmente)
Las Enterobacteriaceae son indicadoras de contaminación fecal, y su uso como «índice» ha adquirido gran aceptación en Europa. Se utilizan, preferentemente, para señalar la calidad sanitaria de alimentos procesados. Su presencia a niveles altos en estos productos indica elaboración poco higiénica, contaminación posterior a su fabricación o ambas cosas. En productos no procesados o con tratamiento insuficiente para eliminar la mayoría de las formas vegetativas, es preferible el uso como indicadores de contaminación fecal de coliformes fecales o E. coli 33
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE TOTALES EN MEDIO LÍQUIDO Material — — — — — — —
Pipetas estériles de 1 ml. Asa de cultivo. Estufa de cultivo. Cuenta colonias. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Gradillas. Placas de Petri de 90 mm.
Medios de cultivo y reactivos Caldo triptona-soja (Tryptone Soy Broth: TSB) Composición: Triptona Soja Dextrosa Cloruro sódico Fosfato dipotásico Agua destilada
17 g 3g 2,50 g 5g 2,50 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,3. Distribuir en matraces de 100 mi a razón de 9 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Caldo EE de Mossel simple Composición: Peptona Fosfato sódico Dextrosa Fosfato potásico Bilis de buey Verde brillante Agua destilada
10 g 6,50 g 5g 2g 20 g 0,125 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,2. Distribuir en tubos de ensayo de 16 x 160 mm a razón de 10 ml. Calentar en baño María a 100° C durante 20 minutos, exactamente. Enfriar inmediatamente en agua del grifo. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE.
INVESTIGACIÓN DE ENTEROBACTERIACEAETOTALES
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Agar biliado rojo violeta glucosa (Violet Red Bile Glucose: VRBG) Composición: Extracto de levadura en polvo 3g Peptona 7g Cloruro sódico 5g Sales biliares 1,50 g Glucosa 10 g Rojo neutro 0,03 g Cristal violeta 0,002 g Agar 12 g Agua destilada 1.000 ml Disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7,3- NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Atemperar el medio y preparar placas de Petri. Reactivo para la prueba de citocromo-oxidasa: CO Composición: Clorhidrato de N-dimetil-parafenilendiamina Agua destilada
100 g 100 ml
Esta solución se usa recién preparada. En el comercio existen discos, tiras y varillas. Medio Kliger Iron Agar: KIA Composición: Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Cloruro sódico Sulfato ferroso Tiosulfato sódico Lactosa Glucosa Rojo fenol Agar Agua destilada
3g 3g 20 g 5g 0,30 g 0,30 g 10 g 1g 0,05 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,4. Repartir en tubos de 16 x 160 mm a razón de 7 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Dejar solidificar en posición inclinada con un fondo de 3-5 cm. El medio se puede utilizar en el transcurso de 5-6 días después de terminar su preparación. Agar nutritivo (Plata Count Agar: PC A) (v. pág. 14)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Técnica Preenriquecimiento Se parte de la suspensión madre del alimento (1:10) en caldo triptona soja (TSB) (v. pág. 34). El matraz que contiene la suspensión se deja a temperatura ambiente durante dos horas, agitando de vez en cuando. Enriquecimiento A partir de la suspensión madre (1:10) del alimento, se hacen diluciones al 1:100 y 1:1.000, utilizando como diluyeme caldo TSB (v. pág. 34). Se preparan tres series de cinco tubos, conteniendo cada uno de ellos 10 ml de caldo de enriquecimiento EE de Mossel simple (v. pág. 34). Usando distinta pipeta para cada dilución, se procede de la siguiente forma: — En la primera serie de cinco tubos se añade a cada tubo 1 ml de la dilución del alimento al 1 :10. — En la segunda serie de cinco tubos se añade a cada tubo I mi de la dilución del alimento al 1 :100. — En la tercera serie de cinco tubos se añade a cada tubo I mi de la dilución del alimento al 1:1.000. Agitar para mezclar e incubar todas las series a 37 °C durante 24 horas. Identificación de colonias típicas en medio sólido Agitar para mezclar bien el contenido de los tubos que presenten crecimiento bacteriano. Con asa de cultivo, sembrar sobre la superficie bien seca de agur biliado rojo violeta (VRBG) (v. pág. 35) contenido en placas de Petri. Incubar a 37 °C durante 24 horas. Las sales biliares y el cristal violeta que forman parte del medio inhiben el crecimiento de la flora competitiva. Todas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa con producción de ácido, lo que se pone de manifiesto por un viraje al rojo y la precipitación de las sales biliares alrededor de las colonias. Hay que tener en cuenta que esta misma reacción la dan en este medio las Aeromonas. Las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitación, también violeta, se consideran Enterobacteriaceae. Pruebas confirmativas De las colonias típicas crecidas sobre el medio VRBG, se siembran, como mínimo, dos colonias sobre PCA (v. pág. 14). Incubar a 37 °C durante 24 horas. Partiendo de este cultivo se realizan las siguientes pruebas confirmativas: Prueba de la citocromo-oxidasa Para la detección de esta enzima, se coloca un trozo de papel Whatman de unos 5 cm2 en una placa de Petri vacía. En el centro del papel se depositan tres go-
INVESTIGACIÓN DE ENTEROBACTERIACEAETOTALES
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tas del reactivo (v. pág. 35). Con una pipeta Pasteur con la punta cerrada, se toma una porción del cultivo obtenido sobre agur nutritivo y se extiende sobre el papel impregnado de reactivo, en una zona de 4-5 mm. En la reacción positiva aparece un color violeta oscuro en la extensión del cultivo. Las Enterobacteriaceae son citocromo-oxidasa negativas. Prueba sobre agar Kliger (KIA) El medio lleva incorporados dos azúcares: glucosa y lactosa. También contiene sulfato ferroso, que sirve de indicador de SH2 cuando, al reducirse, se transforma en sulfuro, de color negro. En el fondo del tubo se refleja la fermentación de la glucosa, al virar el medio a amarillo por acidificación. Esta fermentación puede ir acompañada de desprendimiento de gas, en cuyo caso se cuartea el medio o se separa del tubo. En la zona inclinada del medio se refleja la fermentación de la lactosa, al virar el medio a amarillo por acidificación. Se siembra la cepa en estudio con asa de cultivo, en la superficie inclinada por diseminación y, en el fondo, por picadura. Incubar en estufa a 37 °C: La lectura de los resultados se hará SIEMPRE a las 24 horas: Fermentación de la glucosa: fondo amarillo. No fermentación de la glucosa: fondo sin cambio (rojo grosella). Fermentación de la lactosa: superficie inclinada amarilla. No fermentación de la lactosa: superficie inclinada alcalina (rojo grosella). Gas: burbujas en la masa del medio, entre el medio y el tubo y, a veces rotura del medio. Producción de SH2: ennegrecimiento en la zona que separa el fondo de la pendiente o en toda la parte inferior del tubo. Interpretación del medio Kliger Iron Agar Microorganismo
Fondo
Superficie
SH2
Enterobacter aerogenes
AG
A
-
Enterobacter cloacae Escherichia coli Proteus vulgaris Proteus morganii Shigella sonnei Salmonella typhi Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis
AG AG AG
A A SC SC SC SC o ALC SC o ALC SC o ALC
-
A o AG A A AG AG
AG = formación de ácido y gas (amarillo y burbujas). A = formación de ácido (amarillo). SC = sin cambios. ALC = alcalino (rojo). + = producción de SH2 (ennegrecimiento). - = sin ennegrecimiento.
+ + + +
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Lectura de resultados Se calcula el número de Enterobacteriaceae totales por gramo o mililitro de alimento consultando la Tabla del NMP de tres series de cinco tubos, en los tubos que muestren crecimiento en caldo EE de Mossel, los gérmenes sean citocromooxidasa negativos y el crecimiento sobre agar Kliger (KIA) corresponda al de las Enterobacteriaceae. Tabla del NMP por gramo o mililitro, utilizando tres series de cinco tubos cada una conteniendo 10 ml de medio líquido y sembrando 1 ml de la dilución 1:10,1 ml de la dilución 1:100 v 1 ml de la dilución 1:1.000 5 tubos 1 ml 1:10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 2
5 tubos 1 ml 1:100 0 0 0 1 1 1 2 2 3 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1
5 tubos NMP de 1 ml gérmenes 1:1.000 g o ml 0 0 1 2 2 4 0 2 1 4 7 6 0 4 1 6 0 6 0 2 1 4 2 5 3 8 0 4 1 6 2 6 0 6 1 8 2 10 0 8 1 10 0 11 0 5 1 7 2 9 3 12 0 7 1 9 2 12 0 9 1 12 2 24 0 12 1 14 0 15 0 8 1 11 2 13 0 11 1 14
5 tubos 1 ml 1:10 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
5 tubos 1 ml 1:100 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 5 0 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4
5 tubos NMP de 1 ml gérmenes 1:1.000 g o ml 0 13 1 17 2 21 3 25 0 17 1 21 2 26 0 22 1 26 2 32 0 27 1 33 2 39 0 34 1 40 0 41 1 48 0 23 1 31 2 43 3 58 4 76 0 33 1 46 2 63 3 84 0 49 1 70 2 94 3 120 4 148 5 177 0 79 1 109 2 141 3 175 4 212 5 253 0 130 1 172
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INVESTIGACIÓN DE ENTEROBACTERIACEAE TOTALES
Tabla del NMP por gramo o mililitro, utilizando tres series de cinco tubos cada una conteniendo 10 ml de medio líquido y sembrando 1 ml de la dilución 1:10,1 ml de la dilución 1:100 y 1 ml de la dilución 1:1.000 (Continuación) 5 tubos 1 ml 1:10
5 tubos 1 ml 1:100
5 tubos 1 ml 1:1.000
NMP de gérmenes g o mi
S tubos 1 ml 1:10
5 tubos 1 ml 1:100
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
1 1 2 2 2 3
2 3 0 1 2 0 1 0 1 0
17 20 14 17 20 17 21 21 24 25
5 5 5 5 5
4 4 4 4 5
5 5 5 5 5
5 5 5 5 5
3 4 4 5
S tubos NMP de 1 ml gérmenes g o /w/ 1:1.000 2 3 4 5
0 1 2 3 4 5
221 278 345 426 240 348 542 920 1.600 > 1.600
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE TOTALES EN MEDIO SÓLIDO Material — — — — — —
Pipetas estériles de 1 ml. Asa de cultivo. Placas de Petri de 90 mm estériles. Estufa de cultivo. Cuenta colonias. Pipeta Pasteur de punta cerrada.
Medios de cultivo y reactivos Agar biliado-rojo violeta-glucosa (Violet Red Bile Glucose: VRBG) (v. pág. 35) Reactivo para la prueba de citocromo-oxidasa (CO) (v. pág. 35) Medio Kliger Iron Agar (KIA) (v. pág. 35) Agar nutritivo (PCA) (v. pág. 14) Técnica Aislamiento en medio sólido A partir de la «serie de diluciones decimales», y por duplicado, se deposita 1 mi de cada dilución en placas de Petri estériles. A continuación se vierten 15 ml
40
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
de VRBG (v. pág. 35) atemperado a 45-47 °C. Mezclar cuidadosamente y dejar solidificar sobre una superficie horizontal. El agar solidificado se cubre con 10 ml del mismo medio estéril y se deja solidificar de la misma forma. Incubar en estufa a 37 °C durante 18-24 horas. Contar las colonias de color rojo violeta rodeadas de un precipitado también violeta. Confirmación de las colonias Sembrar, como mínimo dos colonias típicas sobre PCA (v. pág. 14). Incubar a 37 °C durante 18-24 horas. Con el crecimiento obtenido, se realizan las siguientes pruebas: — Prueba de la citocromo-oxidasa (v. pág. 35). — Pruebas de fermentación, gas y SH2 sobre agar Kliger (v. pág. 35). Recuento de colonias Las colonias características confirmadas se multiplican por el factor de dilución de la placa y darán el número de Enterobacteriaceae totales por gramo o mililitro de muestra.
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Investigación de Salmonella
Salmonella es un género bacteriano, perteneciente a la familia Entembacteriaceae integrado por gérmenes de forma bacilar, no esporulados, habitualmente móviles mediante flagelos peritricos, aunque existen mutantes inmóviles. El serotipo Salmonelía pullorum-gallinarum es siempre inmóvil. Gramnegativos, aerobios-anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con producción de gas. No fermentan la lactosa. Reducen nitratos a nitritos. Son citocromo-oxidasa negativos. Forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas definidas. MATERIAL — — — — — — — —
Matraces Erlenmeyer. Pipetas estériles de 10 y 1 ml. Gradillas. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Asa de cultivo. Placas de Petri de 90 mm. Estufa de cultivo. Portaobjetos. Baño María.
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Agua de peptona tamponada (Buffer Peptone Water: BPW) Composición: Peptona Cloruro sódico Fosfato disódico Fosfato potásico Agua destilada
10 g 5g 9g 1,50 g 1.000 ml 41
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7 + 0,1. Distribuir en matraces Erlenmeyer de 500 mi a razón de 225 mi. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 minutos.
Caldo de enriquecimiento selectivo liquido, tetrationato-bilis-verde brillante (Müller-Kauffmann) Composición: Caldo base: Polipeptona Carbonato calcico Sales biliares Tiosulfato sódico 5 H2O Agua destilada
5g 10 g 1g 30 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 8,4 ± 0,2. Mantener a 5-8 °C. Solución de yodo-yoduro potásico: Yodo Yoduro potásico Agua destilada
20 g 25 g 100 ml
Disolver el yoduro potásico en un pequeño volumen de agua y añadir el yodo Agitar hasta su disolución. Añadir el resto del agua. Conservar la solución en frasco topacio y lugar oscuro. Solución verde brillante: Verde brillante Agua destilada
0,1 g 100 ml
Disolver perfectamente. Dejar un día en oscuridad para su autoesterilización. Medio completo: Caldo base Solución de yodo yoduro potásico Solución de verde brillante
1.000 ml 20 ml 10 ml
Mezclar bien con agitación para resuspender el precipitado que se forma. Distribuir, de forma aséptica, en matraces Erlenmeyer estériles, a razón de 100 ml. Este medio se conserva, como máximo, durante 1 semana a 4 °C.
INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA
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Caldo Rappaport-Vassiliadis-peptona de soja (RVS) Composición: Solución A: Triptona Cloruro sódico Fosfato potásico Agua destilada
5g 8g 1,60 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento suave (aproximadamente a 70 °C). Esta solución se prepara el mismo día en que se vaya a hacer el medio. Solución B: Cloruro magnésico Agua destilada
400 g 1.000 ml
Disolver el cloruro magnésico en el agua. Esta solución se conserva durante un año a temperatura ambiente y frasco topacio. Solución C: Oxalato verde malaquita Agua destilada
0,40 g 100 ml
Disolver el colorante en el agua. Esta solución es estable durante 6 meses a temperatura ambiente y frasco topacio. Medio completo: Solución A Solución B Solución C
1.000 ml 100 ml 10 ml
Una vez mezcladas las tres soluciones, ajustar el pH a 5,2 ± 0,2. Distribuir el medio, a razón de 10 mi en tubos con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 115 °C durante 15 minutos. Se conserva en refrigeración durante un mes. Caldo de enriquecimiento selectivo líquido, selenito cistina Composición: Triptona Lactosa Selenito de sodio Fosfato disódico Fosfato potásico L-Cistina Agua destilada
5g 4g 4g 5,50 g 4,50 g 0,01 g 1.000 ml
44
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7 ± 0,2. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Distribuir, asépticamente, en matraces Erlenmeyer estériles, a razón de 100 ml. Si se precipita el selenito de sodio en forma de un sedimento rojo, el medio no es utilizable. Se usa exclusivamente el día de su preparación. Medio de aislamiento diferencial selectivo, agar verde brillante-rojo fenol (Brilliant Green Agar: BGA) Composición: Medio base: Extracto de carne Peptona Extracto de levadura en polvo Fosfato disódico Fosfato sódico Agar Agua destilada
5g 10 g 3g 1g 0,60 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Distribuir en tubos o matraces. Solución azúcares-rojo fenol: Lactosa Sacarosa Rojo fenol Agua destilada
10 g 10 g 0,09 g 100 ml
Disolver los ingredientes en el agua. Calentar en baño María a 70 °C durante 20 minutos. Enfriar a 55 °C para su uso inmediato. Solución verde brillante: Verde brillante Agua destilada
0,05 g 100 ml
Mezclar el colorante con el agua y dejar la mezcla en oscuridad, como mínimo, durante un día, para que se produzca su autoesterilización. Medio completo: Medio base Solución azúcares rojo-fenol Solución verde brillante
900 ml 100 ml 1 ml
INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA
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Añadir, asépticamente, la solución de verde brillante a la solución de azúcares rojo-fenol, previamente enfriada a 55 °C. Incorporar esta mezcla al medio base. Con el medio se preparan placas de Peni. Una vez secas se utilizarán en el transcurso de 4 horas. Mantenidas en refrigeración se conservan 24 horas. Agar-xilosa-lisina-desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD) Composición: Extracto de levadura Xilosa L-Lisina Desoxicolato sódico Lactosa Sacarosa Cloruro sódico Tiosulfato sódico Citrato férrico amónico Rojo fenol Agar Agua destilada
3g 3,75 g 5g 2,50 g 7,50 g 7,50 g 5g 6,80 g 0,80 g 0,80 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición. Ajustar el pH a 7.4 ± 0,2. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Preparar placas de Petri. Este medio se debe utilizar el mismo día de su preparación. Agar Hektoen (Hektoen Enteric: HE) Composición: Peptona Extracto de levadura Cloruro sódico Sales biliares Sacarosa Lactosa Salicina Citrato férrico amónico Tiosulfato sódico Fuchina acida Azul de bromotimol Agar Agua destilada
12 g 3g 5g 9g 12 g 12 g 2g 1,50 g 5g 0,10 g 0,064 g 14 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición, dejando hervir durante 1 minuto, como máximo. Ajustar el pH a 7,6 ± 0,2. Preparar placas de Petri. El medio se debe utilizar el mismo día de su preparación.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Agar sulfito bismuto: SB Composición: Peptona Extracto de carne Glucosa Sulfato de hierro Fosfato disódico Sulfato de bismuto Verde brillante Agar Agua destilada
10 g 5g 5g 0,30 g 4g 8g 0,025 g 20 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición, dejando hervir durante 1 minuto. Ajustar el pH a 7,6 ± 0,2. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Agitar el medio para que se suspenda bien el precipitado y preparar placas de Petri, distribuyendo en cada una de ellas 20 mi. Las placas se preparan de un día para otro y se conservan en oscuridad. Agar manitol Usina cristal violeta verde brillante (Manitol Lysine Crystal Violet Brilliant Green: MLCB) Composición: Peptona Lab Lemco Extracto de levadura Cloruro sódico Manitol L-Clorhidrato lisina Tiosulfato sódico Citrato férrico amónico Cristal violeta Verde brillante Agar Agua destilada
10 g 2g 5g 4g 3g 5g 4g 1g 0,01 g 0,0125 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición. Ajustar el pH a 6.8 ± 0,2. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Atemperar a 50 °C y preparar placas de Petri con porciones de 20 ml. Agar-hierro-triple azúcar (Triple Sugar Iron Agar: TSI) Composición: Peptona Extracto de levadura
15 g 3g
INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA
Extracto de carne Proteosa peptona Glucosa Lactosa Sacarosa Sulfato de hierro Cloruro sódico Tiosulfato de sodio Rojo fenol Agar Agua destilada
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3g 5g 1g 10 g 10 g 0,20 g 5g 0,30 g 0,024 g 12 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación losingredientes. Ajustar el pH a 7,4 ± 0,2. Distribuir en tubos de 16 x 160 mm y dejar solidificar el medio en posición inclinada para obtener 4-5 cm de pendiente y 2 cm de fondo. Agar lisina hierro (Lysine Iron Agar: LIA) Composición: Peptona Extracto de levadura Glucosa L-Lisina Citrato férrico amónico Tiosulfato de sodio Púrpura de bromocresol Agar Agua destilada
5g 3g 1g 10 g 0,50 g 0,04 g 0,02 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 6,7 ± 0,2. Distribuir en tubos con tapón de rosca de 13 x 100 mm, a razón de 4 ml. Dejar solidificar en posición inclinada para obtener una pendiendo de 2,5 cm y mantener un fondo de 4 cm. Caldo urea Composición: Urea Extracto de levadura Fosfato potásico Fosfato di sódico Rojo fenol Agua destilada
20 g 0,10 g 0,09 g 0,095 g 0,01 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes SIN CALENTAMIENTO. Ajustar el pH a 6,8 ± 0,2. Esterilizar por filtración, utilizando membrana filtrante de 0,45 cm. Distribuir en tubos estériles de 13 x 100 mm, a razón de 3 ml.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Caldo lisina-decarboxilasa Composición: Peptona Extracto de levadura Glucosa L-Lisina Púrpura de bromocresol Agua destilada
5g 3g 1g 5g 0,02 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 6,7 ± 0,2. Distribuir en tubos de 15 x 125 mm, con tapón de rosca, a razón de 5 ml. Caldo rojo fenol dulcitol Composición: Tripticasa Cloruro sódico Rojo fenol Dulcitol Agua destilada
10 g 5g 0,018 g 5g 1.000 ml
Disolver. Ajustar el pH a 7,4 ± 0,2. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm con campana Durham, a razón de 2,5 ml. Esterilizar en autoclave a 115 °C durante 15 minutos. Caldo rojo fenol lactosa El medio tiene la misma fórmula que el caldo rojo fenol dulcitol, sustituyendo el dulcitol por 10 g de lactosa. Caldo rojo fenol sacarosa El medio tiene la misma fórmula que el caldo rojo fenol dulcitol, sustituyendo el dulcitol por 10 g de sacarosa. Medio de Clark y Lubs (MR-VP) (v. pág. 25) Agar-citrato de Simmons (v. pág. 26) Agua de triptona (Tryptone Water: TW) (v. pág. 11) Reactivo de Kovacs (v. pág. 25)
INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA
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Caldo cianuro potásico (KCN) Composición: Cianuro potásico Proteosa peptona Cloruro sódico Fosfato potásico Fosfato disódico Agua destilada
0,50 g 3g 5g 0,225 g 5,64 g 1.000 ml
Todos los ingredientes, excepto el cianuro potásico, se disuelven en el agua. Ajustar el pH a 7,6 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar el medio a 5°C. Aparte, disolver 0,5 g de cianuro potásico en 100 ml de agua destilada enfriada a 5°C. CON LAS MÁXIMAS PRECAUCIONES, Y SIN PIPETEAR CON LA BOCA, añadir 15 ml de la solución fría de cianuro potásico a 1.000 ml del medio base enfriado. Distribuir la mezcla en tubos estériles de 13 x 100 mm, a razón de 1 ml. Obturar los tubos con tapones de corcho estériles y sellar con parafina. El medio se conserva en refrigeración durante 15 días, como máximo. Sueros aglutinantes polivalentes anti O y anti H
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA Dentro de la sistemática analítica para el aislamiento e identificación de bacterias del género Salmonella se utilizan, habitualmente, varias etapas: — — — — —
Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas. Confirmación serológica de las colonias sospechosas.
Preenriquecimiento en medio liquido no selectivo En la etapa de preenriquecimiento no selectivo se logra la revivificación de las Salmonella lesionadas, se incrementa su vitalidad y se adquieren las condiciones fisiológicas adecuadas para su perfecto desarrollo. El medio de elección es el agua de peptona tamponada que, al mantener un pH constante, favorece el desarrollo de las Salmonella Por otra parte, la peptona y los fosfatos revitalizan al germen. Pesar, asépticamente y en envase estéril, 25 g del producto por analizar. Añadir 225 ml de agua de peptona tamponada (v. pág. 41) para obtener una solución al 1:10. Mezclar bien e incubar a 37 °C durante 16-20 horas.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Enriquecimiento en medios líquidos selectivos En la etapa de enriquecimiento selectivo, se estimula y favorece el crecimiento de las Salmonella y se restringe la proliferación de la flora competitiva: Agitar el cultivo de preenriquecimiento y sembrar, con pipeta estéril, en los siguientes medios líquidos selectivos: — 10 mi de cultivo sobre 100 mi de caldo tetrationato-bilis-verde brillante (Müller Kauffmann) (v. pág. 42), incubando a 42-43 °C durante 18-24 horas; o bien: — 0,1 mi de cultivo sobre 10 mi de caldo Rappaport-Vassiliadis peptona de soja (RVS) (v. pág. 43), incubando a 42° ± 1 °C durante 18-24 horas. — 10 mi de cultivo sobre 100 mi de caldo selenito-cistina (v. pág. 43), incubando a 37 °C durante 18-24 horas. En el medio selectivo caldo tetrationato-bilis-verde brillante (Müller Kauffmann), el tetrationato inhibe el crecimiento de coliformes y otras bacterias intestinales. La bilis, por su parte, estimula el crecimiento de las Salmonella e inhibe el de la flora competitiva. El verde brillante impide el desarrollo de la flora grampositiva y el carbonato calcico actúa de tampón para mantener el pH. La recuperación óptima de las Salmonella se obtiene entre los 42-43 °C. En el medio selectivo RVS, el verde malaquita inhibe el crecimiento de la flora competitiva, pero no el de las Salmonella. Los fosfatos monopotásico y dipotásico mantienen inalterable el valor del pH durante el almacenamiento del medio. La concentración de cloruro magnésico es óptima para lograr un buen enriquecimiento del caldo y favorecer el desarrollo de las Salmonella La recuperación óptima de las Salmonella en el medio Rappaport-Vassiliadis se obtiene a 42 °C. En el medio selectivo caldo selenita cistina, el selenita inhibe el crecimiento de gran parte de la flora intestinal competitiva (E. coli enterococos), sin afectar a las Salmonella, Shigella, Pseudomonas y Proteus. La cistina favorece el crecimiento de las Salmonella. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos En esta etapa se restringe, aún más, el crecimiento de la flora competitiva y se estimula el de las Salmonella. Por otra parte, la composición de los distintos medios permite el crecimiento de colonias con aspecto característico en cada uno de ellos: A partir de los cultivos obtenidos en los distintos medios líquidos selectivos, sembrar, por duplicado y sin recargar el asa en la segunda placa, sobre: — — — — —
Agar-verde brillante-rojo fenol (BGA) (v. pág. 44). Agar-xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) (v. pág. 45). Agar Hektoen (HE) (v. pág. 45). Agar sulfito bismuto (SB) (v. pág. 46). Agar-manitol-lisina-cristal violeta-verde brillante (MLCB) (v. pág. 46).
Incubar en estufa a 37 °C todas las placas sembradas, durante 24-48 horas.
INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA
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NOTA: Se citan varios medios sólidos selectivos, con distintas fórmulas, para la elección, al menos, de dos de ellos. Las colonias de Salmonella crecidas sobre agar BGA son de color rosado, transparentes, rodeadas de un halo rojo, al no fermentar la lactosa. Las bacterias fermentadoras de la lactosa forman colonias amarillo-verdosas al virar el rojo fenol del medio por producción de ácido. Las colonias de Salmonella crecidas sobre agar XLD son rojas con centros negros debido a un cambio de pH por fermentación de la xilosa y decarboxilación de la lisina. Los centros negros se deben a la producción de SH2. A veces no se forman centros negros o, por el contrario, las colonias son negras casi por completo. Las colonias de Salmonella crecidas sobre agar HE son verde azuladas, con centro negro o sin él. En este medio, las sales biliares inhiben el crecimiento de la flora competitiva. En la fórmula del medio hay dos indicadores: azul de bromotimol y fuchina acida que, según actúen, sirven para diferenciar las colonias lactosa-positivas y las lactosa-negativas. La combinación del tiosultato sódico con el citrato de hierro hace que se manifieste un color negro en las colonias productoras de SH2. Las colonias de Salmonella crecidas sobre agar sulfito bismuto (SB) SH2 positivas muestran un centro negro rodeado de un borde claro; están bordeadas también de un precipitado negro con brillo metálico, por la reducción de iones de bismuto que se transforman en bismuto metálico. A veces, las colonias son marrones, grises o verdes. Las colonias de Salmonella crecidas sobre agar MLCB son grandes, de color púrpura negro, debido a la producción de SH2. El germen, al fermentar el manitol hace descender el pH e iniciar la decarboxilación de la lisina, como consecuencia de lo cual aparece una coloración negra. Aislar, como mínimo, dos colonias con aspecto típico de Salmonella de cada uno de los medios de aislamiento selectivo utilizados. Sembrar cada colonia en agar hierro triple azúcar (TSI) (v. pág. 46), con asa de cultivo, primero en la superficie inclinada por diseminación y, luego, en el fondo por picadura. Sin flamear ni recargar el asa, sembrar, por picadura en el fondo y por diseminación en la superficie inclinada del medio agar lisina hierro (LIA) (v. pág. 47). Incubar los tubos de TSI a 37 °C durante 24 horas y los de agar LIA a 37 °C durante 48 horas. Las Salmonella dan la siguiente reacción sobre TSI: — Alcalina (rojo) en la superficie inclinada. — Acida (amarillo) en el fondo. — Con o sin producción de SH2 (ennegrecimiento o no del medio). Las Salmonella dan la siguiente reacción sobre LIA: — Alcalina (rojo) en el fondo del tubo. — Producción de SH2 (ennegrecimiento del medio). Seleccionar todos los cultivos que muestren crecimiento característico de Salmonella sobre agar TSI, se correspondan o no con la reacción de dichos cultivos en agar LIA.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
No desechar los cultivos atípicos sobre agar TSI cuando la reacción sobre agar LIA es típica (fondo alcalino: rojo). Desechar los cultivos que no se correspondan con el crecimiento típico de las Salmonella sobre agar TSI ni con el de agar LIA. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas Sembrar las colonias sospechosas sobre agar nutritivo (v. pág. 14), contenido en placas de Petri. Incubar a 37 °C durante 18-24 horas. Comprobar la pureza del cultivo, que servirá para efectuar las pruebas confirmativas bioquímicas y serológicas. Prueba de la ureasa A partir del cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), sembrar abundantemente con asa en tubos que contengan caldo urea (v. pág. 47). Incubar los tubos sembrados en baño María a 37 °C durante dos horas. Los gérmenes que poseen ureasa crecen en el medio y hacen virar el indicador a rojo. Las Salmonella no crecen en este medio, por carecer de ureasa y no utilizar la urea como única fuente de carbono. Si la cepa en estudio da prueba de ureasa positiva, se desecha por no ser Salmonella, cuando la prueba es negativa, se prosigue el estudio de la cepa problema para confirmarla como Salmonella con otras pruebas. Caldo lisina-decarboxilasa Si la reacción en agar LIA ha sido claramente positiva, es suficiente para considerar que la cepa en estudio es positiva a la lisina decarboxilasa. Cuando la reacción en agar LIA es dudosa, sembrar, a partir de un cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), en caldo lisina-decarboxilasa (v. pág. 48). Incubar a 37 °C durante 48 horas, haciendo una lectura a las 24 horas. Las Salmonella dan reacción alcalina en este medio, que se manifiesta por la aparición de un color rojo púrpura; la reacción es negativa cuando el medio muestra color amarillo. Caldo rojo fenol dulcitol A partir de un cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), sembrar en el medio caldo rojo fenol dulcitol (v. pág. 48). Incubar a 37 °C durante 48 horas y hacer una lectura a las 24 horas. La mayoría de las Salmonella fermentan el dulcitol con formación de ácido (viraje a amarillo) y gas. Caldo rojo fenol lactosa A partir de un cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), sembrar en el medio caldo rojo fenol lactosa (v. pág. 48). Incubar a 37 °C durante 48 horas y hacer una lectura a las 24 horas. Las Salmonella no fermentan la lactosa, por lo que no se modifica el medio.
INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA
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Caldo rojo fenol sacarosa A partir de un cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), sembrar en el medio caldo rojo fenol sacarosa (v. pág. 48). Incubar a 37 °C durante 48 horas y hacer una lectura a las 24 horas. Las Salmonella no fermentan la sacarosa, por lo que no se modifica el medio. Medio de Clark y Lubs (MR-VP) (Técnicas para investigar rojo de metilo y acetil-metil-carbinol, en páginas 26 y 27.)
Las Salmonella son positivas al rojo de metilo y negativas al acetil-metilcarbinol (prueba Voges Proskauer). Agar curato de Simmons (v. pág. 26) Las Salmonella reaccionan de forma variable en la asimilación del citrato. Otras pruebas A partir de un cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), sembrar tubos que contengan agua de triptona (v. pág. 11). Incubar a 37 °C durante 24 horas. En uno de los tubos, añadir 0,5 ml del reactivo de Kovacs (v. pág. 25), para investigar si se ha producido o no indol. La reacción es positiva si aparece un anillo rojo en la superficie. La mayoría de las Salmonella no producen indol. Del cultivo obtenido en otro tubo de agua de triptona (TW), sembrar en caldo cianuro potásico (v. pág. 49). Incubar a 37 °C durante 48 horas y hacer una lectura a las 24 horas. La aparición de turbidez en el medio refleja resultado positivo. Las Salmonella no crecen en caldo cianuro potásico. No se considerarán Salmonella los cultivos que crezcan en caldo cianuro potásico y/o sean indol-positivos. Confirmación serológica de las colonias sospechosas Con la confirmación serológica se puede identificar a nivel de especie. Sobre un portaobjetos de vidrio bien limpio, señalar tres áreas. Depositar en una de ellas una gota de la suspensión del cultivo en estudio y mezclarla con suero polivalente 0. En otra de las áreas señaladas, hacer lo mismo, pero utilizando suero polivalente H. Finalmente, en una tercera, depositar únicamente una gota de la suspensión del cultivo, que servirá de testigo. Mover cuidadosamente el portaobjetos y observar si se produce o no aglutinación en el transcurso de un minuto: — Si hay aglutinación en las secciones del porta donde se han mezclado cultivos y antisueros, el resultado es positivo. — Si se aglutina el cultivo testigo, es señal de que la cepa en estudio es autoaglutinable. En este caso, la prueba, en conjunto, no es válida.
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— Si hay aglutinación solamente con el suero polivalente H, se añade a la tercera gota (testigo) un asa de antisuero Vi y se observa si se produce aglutinación. También se puede repetir la prueba con antisuero polivalente 0, habiendo hervido previamente la suspensión bacteriana durante un minuto. Los cultivos bioquímicamente típicos de Salmonella y serológicamente negativos a este género no se consideran Salmonella y requieren más pruebas. Los cultivos bioquímica y serológicamente típicos de Salmonella se consideran Salmonella. En el caso de ser necesaria una identificación completa de la cepa, se recurre a laboratorios de referencia autorizados. Reacciones de las Salmonella Fermentación glucosa (TSI)
+
Fondo tubo amarillo
Lisina-decarboxilasa SH2 Ureasa Caldo Usina decarboxilasa Caldo rojo fenol dulcitol Caldo rojo fenol lactosa Caldo rojo fenol sacarosa Caldo KCN Rojo metilo (RM) Voges Proskauer (VP) Citrato
+ + + + + V
Fondo tubo rojo Ennegrecimiento Color sin cambio Color rojo Color amarillo y gas Color sin cambio Color sin cambio No crece Color rojo Color sin cambio Azul: crecimiento (+) Sin cambio de color ni crecimiento (-)
V: reacción variable.
PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA Es evidente que los casos de salmonelosis a través de los alimentos se han incrementado con el paso del tiempo. La Salmonella es un género perteneciente a la familia Enterobacteriaceae y su identificación está basada, principalmente, en la tipificación serológica. Se caracteriza por sus antígenos: somático (O), flagelar (H) y capsular (Vi), que sirven para clasificar al género dentro del esquema de Kauffman-White. Como en los métodos tradicionales de aislamiento e identificación de Salmonella son necesarios una fase de enriquecimiento y el cultivo en medios selectivos. Para la confirmación de resultados positivos se requieren más de 7 días, por lo que es importante encontrar pruebas rápidas con métodos más baratos y más rápidos que los convencionales. Se han desarrollado distintos procedimientos nuevos para detectar a las Salmonella más rápidamente. Aunque estas pruebas son, evidentemente, más cortas que las convencionales, todas requieren preenriquecimiento y/o enriquecimiento
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del alimento antes de ser aplicadas. Por otra parte, en microbiología alimentaria ninguna tiene la seguridad que proporcionan las técnicas convencionales. De entre todas las pruebas rápidas de identificación de Salmonella, y de forma general, hasta el momento son las técnicas ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) las que más se acercan a las técnicas convencionales. Este método inmunoenzimático identifica el 98 por 100 de las cepas y permite un screening de las mismas en 48 horas. Los kits comerciales API son una ayuda en la identificación rápida de Salmonella: — Kit API 20 E — Kit Rapid 20 E API — Kit API ATB 32GN (material automático ATB) Otros métodos rápidos son: — Inmunofluorescencia — Método inmunoenzimático (ELISA). De este método existen varios kits comerciales: • • • •
Tekra Salmonella Visual Immunoassay. Bioenzabead Bactelisa Tekra sandwich ELISA
— Radioinmunoensayo (RÍA), utilizando dulcitol marcado 14 CO, — Sondas de DNA — Pruebas DNA comerciales (Gene Trak Systems, Framingham, MA) PREVENCIÓN Y CONTROL DE SALMONELLA Se puede afirmar que todos los productos crudos de origen animal y el ambiente en que se preparan, pueden estar contaminados con Salmonella. De aquí que los alimentos que con más frecuencia dan lugar a casos de salmonelosis son: carnes y productos cárnicos, algunos productos de charcutería, carnes de aves y subproductos, huevos y ovoproductos, leche y productos derivados de la leche. Puesto que, a veces, un bajo número de Salmonella (por ejemplo, inferior a 100 gérmenes por gramo) puede ser causa de enfermedad, lo más importante es asegurar su ausencia en los alimentos listos para el consumo. El mayor control se requiere en los siguientes pasos: — Etapa del sacrificio de los animales que proporcionan alimentos de con sumo humano. — Prevención para evitar que se contaminen los productos terminados. — Almacenamiento de los alimentos a baja o alta temperatura, según los casos. Los animales cuyas carnes se destinan al consumo humano, sobre todo terneros, cerdos y aves considerados sanos, son portadores de Salmonella en una tasa
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que oscila entre el 20-30 por 100. Este microorganismo se aloja en el contenido intestinal y ganglios mesentéricos de los animales de abasto. Su presencia en los productos de origen animal se debe a: — La existencia de portadores sanos en rebaños y gallineros. La infección de animal a animal es posible cuando existe un contacto muy directo y poca higiene. La ruta fecal oral se produce a través de heces, camas, alimentos o agua contaminados. — La utilización de piensos contaminados con Salmonella. Estos productos son una fuente de infección muy importante, permaneciendo en ellos muchos serovars de Salmonella, principalmente los que tienen como fuente proteínas animales (harinas de pescado, etc.). En este caso los pollitos son muy sensibles a esta vía de infección. — La contaminación ambiental con Salmonella en mataderos y aguas residuales. La maquinaria, el ambiente y las aguas residuales de los mataderos son proclives a la persistencia de este microorganismo. — La contaminación a través de roedores e insectos. Además de éstos, ciertos animales salvajes como tejones y gaviotas pueden ser transmisores de Salmonella. — La contaminación a partir del hombre. Se produce, principalmente, como consecuencia de la falta de higiene de los operarios y/o sus malas manipulaciones. La transmisión de Salmonella se realiza, en este caso, a través de manos, ropa y calzado contaminados. Las operaciones de preparación de canales conducen a problemas de contaminación cruzada. Atención aparte merecen las aves como reservorio de Salmonella y causa de la mayoría de brotes de salmonelosis. Son un vehículo muy importante en la diseminación de este microorganismo. En, aproximadamente, el 30-40 por 100 de los criaderos de aves se encuentra Salmonella, transmitiéndose de unas a otras y multiplicándose en su interior. Respecto a los huevos, una fuente importante de su contaminación es el tracto intestinal o las heces de las aves. Este es el camino de la contaminación de la superficie del huevo. En circunstancias especiales, el contraste entre una temperatura exterior más fría y el calor del contenido del huevo da lugar a la creación de un vacío que puede absorber las posibles Salmonella de la cascara, haciéndolas llegar a la yema. En otros casos (rotura de la cáscara, suciedad de la misma) existe una probabilidad cierta de que las Salmonella se introduzcan en el interior del huevo. Cuando una yema está infectada con Salmonella puede ocurrir que: — El pollito muera antes de salir del cascarón. — El pollito nazca débil y con la posibilidad de morir. — El pollito nazca normalmente, con apariencia de sano, pero que en su interior desarrolle abundantes Salmonella que excretará por las heces. En este último caso, la Salmonella se extenderá a otras aves, sobre todo al ingerir heces contaminadas con esta bacteria. Otra fuente de contaminación de las aves con Salmonella está en los piensos, sobre todo los ricos en proteínas animales (restos de bóvidos, aves, pescados). Aunque se tratan por el calor para destruir la flora patógena, a veces, el calor aplicado es insuficiente o se recontaminan en un proceso posterior.
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El ambiente es también una fuente de contaminación con Salmonella para las aves, en la que intervienen: — Jaulas para el transporte de las aves al matadero que no han sido previa mente desinfectadas. — Gallineros y baterías de cría y ponedoras mal tratados higiénicamente. — Roedores y pájaros que pueden contener Salmonella y que, con sus excrementos, contaminan los piensos. — Contaminación a partir del procesado de las aves (sacrificio, sangrado, desplumado, evisceración). Es sabido que Salmonella pullorum y Salmonella gallinarum, causantes de la salmonelosis aviar, colonizan en sus ovarios por lo que han supuesto un problema durante mucho tiempo. La industria aviar ha logrado eliminar la presencia de estos dos géneros que han ocasionado grandes pérdidas. Una vez lograda, en gran parte, la eliminación de las Salmonella citadas, se ha venido creyendo que la presencia de Salmonella en el interior del huevo era excepcional. No obstante, en los últimos años se han detectado cepas de Salmonella enteritidis que colonizan en los ovarios de las aves, pasando a la yema del huevo. La mayoría de las veces, el contenido del huevo sano está libre de microorganismos o se encuentran en una tasa inferior a 10/g (Berquist, 1984). No obstante, pueden entrar patógenos en el interior del huevo por dos caminos: — Desde el exterior a través de la cáscara. — Por infección transovárica durante el desarrollo del huevo. El huevo completo está protegido por la cáscara y sus membranas internas. Los gérmenes patógenos, especialmente las Salmonella, pueden entrar debido a una contaminación excesiva de la cáscara o si ésta y sus membranas están dañadas. Hasta hace relativamente poco tiempo, se ha considerado que la contaminación del huevo a partir de la cáscara tenía un gran significado en las infecciones alimentarias por Salmonella, considerándose la infección transovárica como excepcional. Posteriormente a esta creencia, se le está dando mucha importancia a la infección transovárica que, en el caso de S. enteriditis fagotipo 4, está suponiendo un gran problema (Humphrey, T. J., 1989, 1990) (Mawer, 1989). Los factores que más contribuyen a la aparición de brotes de salmonelosis son: — Que el alimento (huevo) esté a una temperatura favorable para el crecimiento de Salmonella. — Que la cocción del alimento (huevo) haya sido insuficiente para la destrucción de Salmonella. — Que para la preparación del alimento (huevo) se hayan utilizados otros ingredientes contaminados con Salmonella. — Que se haya producido una contaminación cruzada. Los métodos de control de la Salmonella, bien sea en la industria, en el comercio, en la restauración o en el hogar, son numerosos y se basan, esencialmente, en:
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— Prevenir la entrada del germen a través de materiales crudos contamina dos. — Aplicar una temperatura suficiente durante un tiempo determinado para destruir al germen. — Prevenir la contaminación post-procesado mediante: • Higiene escrupulosa del personal, lo que debe conllevar una información adecuada de los motivos de esta exigencia. • Higiene en la manipulación de los alimentos terminados para lo cual los manipuladores deben recibir enseñanzas especiales de acuerdo con la higiene, desinfección de utensilios, separando los que han servido para la preparación de los productos crudos de los alimentos tratados por el calor o cocinados. Con ello se evita la contaminación cruzada (por ejemplo, partir un pollo crudo y, con el mismo cuchillo, sin limpiar, trocear el pollo cocinado). • Separación bien delimitada entre zonas para la manipulación de productos crudos y alimentos terminados, para evitar la contaminación cruzada. • Inhibición del crecimiento de Salmonella en el alimento durante su conservación, utilizando distintos procedimientos, según el producto: a) b)
Almacenamiento por refrigeración a temperatura inferior a 7 °C, para productos crudos o terminados. Almacenamiento por calentamiento a temperatura no inferior a 60 °C hasta su consumo en alimentos cocinados y calientes.
• Respetar la cadena del frío. En general, todo se reduce a educar la conciencia colectiva respecto a la higiene; de un modo especial en la etapa final de la preparación de los alimentos. Un alimento de origen animal, el huevo, es en numerosas ocasiones la causa de brotes de salmonelosis. El modo de cría actual de las aves, ponedoras o de carne, facilita que una determinada especie de Salmonella se transmita de unos animales a otros; como consecuencia de ello aparecen brotes de salmonelosis en el hombre achacables al consumo de huevos contaminados con esta misma especie. Esto ha ocurrido con numerosos serovars: S. montevideo, S. agona, S. hadar, etc.. Algunos de ellos suelen desaparecer, pero otros permanecen: S. dublin, S. typhimurium y S. enteritidis, principalmente. La contaminación externa de los huevos se reduce sensiblemente con buenas prácticas de higiene y desinfección de gallineros, baterías y animales. Es también importante la higiene a partir de la recogida de los huevos, evitando su almacenamiento a temperaturas elevadas y con alta humedad. Siempre son desechables los huevos sucios o rotos. Ya se ha citado la importancia de 5. enteritidis fagotipo 4 en el caso de infección transovárica, circunstancia que está creando algunos problemas. S. enteritidis fagotipo 4, microorganismo invasivo, puede colonizar fuera del intestino de las aves, pudiéndose localizar en ciertos órganos como: hígado, bazo, oviducto y folículos ováricos. Debido a la invasión de estos órganos, pueden aparecer en las aves síntomas clínicos que, incluso, son capaces de conducir a la muerte de estos
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animales. Esto ocurre, sobre todo, en aves jóvenes (broiler). Las ponedoras adultas quedan infectadas pero, salvo raras excepciones, no suelen presentar síntomas clínicos de enfermedad. No obstante, el germen se encuentra en visceras y contenido del huevo. El problema de las gallinas ponedoras es algo menor si se tiene en cuenta que, a pesar de que S. enteritidis fagotipo 4 es un serovar muy extendido, se encuentra en el huevo en una tasa pequeña (inferior a 10 gérmenes). A pesar de ello, no hay que olvidar el gran consumo de huevos dentro de la alimentación humana y que, ciertos platos elaborados con huevos pueden ser causa de brotes de salmonelosis importantes. La prevención y control en el caso de S. enteritidis fagotipo 4 se resuelve, únicamente, eliminándolo de gallineros y baterías, gallinas ponedoras y broilers, ambiente, etc. Previamente a la limpieza y desinfección a que se deben someter estos lugares, hay que apartar y desechar todas las aves infectadas que, en su momento, serán sustituidas por crías sanas, con las precauciones necesarias para evitar una reinfección. Después de la puesta y selección de los huevos, se llevan a almacenar de inmediato y se mantienen a una temperatura de unos 8 °C, pero no superior, porque a los 10 °C se inicia la multiplicación de la flora que pueda contener el huevo, tanto en la cáscara como en su interior. La cifra de S. enteritidis fagotipo 4 en los huevos recién puestos es inferior a 10, lo que no supone excesivo riesgo para las personas sanas, a no ser por deficiente almacenamiento o malas manipulaciones posteriores. La supervivencia de las Salmonella y otros patógenos es mayor en la yema por su naturaleza viscosa que, en el cocinado, retrasa la penetración del calor. También influye la composición nutritiva de la yema y el efecto protector de la grasa (Humphey, 1989) La base para la prevención de la salmonelosis a partir de los huevos está: — En el cocinado adecuado de estos productos. — En su correcta manipulación posterior para evitar la contaminación cruzada. Contraviniendo la costumbre que aún practican algunas personas, no se deben consumir huevos crudos como reconstituyente. También es preciso desconfiar de algunas recetas dadas por profesionales de la restauración u otras personas, cuando en su fórmula intervengan huevos crudos: helados de preparación casera, mousse, etc. S. enteritidis fagotipo 4 constituye, igualmente, un peligro con huevos y alimentos a base de huevos insuficientemente cocinados ya que este microorganismo se muestra más insensible al calor que otros serovars de Salmonella. Un mínimo de 7 minutos de cocción es suficiente para matar al germen en el interior de la yema. Un tiempo inferior hace posible que la Salmonella sobreviva en algunos alimentos: huevos revueltos, huevos fritos, tortillas poco cuajadas, etc. En algunos ovoproductos (huevo líquido, huevo congelado, huevo desecado), además de la infección inicial con Salmonella por vía de la cáscara o transovárica, es muy importante la contaminación posterior por malas manipulaciones del personal, así como de los utensilios utilizados y la maquinaria requerida. Por todo ello, en los ovoproductos citados se impone su pasteurización para obtener una salubridad perfecta. Los huevos enteros y las yemas se tratan térmicamente a
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64,5 °C durante 2,5 minutos. La albúmina líquida de huevo no se puede pasteurizar, pero se calienta a 55-57 °C durante 2,5 minutos Con la temperatura de pasteurización aplicada al huevo se inactiva el enzima alfa amilasa de la yema. Esta circunstancia se aprovecha para comprobar si el huevo entero y la yema han sido pasteurizados. La investigación de la alfa amilasa se puede utilizar también para la investigación de Salmonella en la albúmina del huevo, teniendo en cuenta que un tratamiento inferior a 64,5 °C no destruyen la alfa amilasa, en cuyo caso la investigación de este género bacteriano en la albúmina se hace por el método convencional, de acuerdo con un plan de muestreo. PRUEBA DE LA ALFA AMILASA Sirve para comprobar la eficacia del proceso de pasteurización en huevo entero y yema. La combinación temperatura/tiempo (64,5 °C durante 2,5 minutos) debe inactivar el enzima alfa amilasa, que no aparecerá al realizar la prueba. Es aplicable únicamente a huevo líquido entero y yema. Reactivos Solución reciente de almidón Se pesan 0,7 g de almidón soluble y se mezclan con un poco de agua caliente para que se disuelva y forme una crema. Añadir la mezcla a un recipiente que contenga 50 ml de agua hirviendo y dejando hervir durante 1 minuto. A continuación hacer un enfriamiento rápido. Se añaden 3 gotas de tolueno y se completa todo ello con agua hasta los 100 ml. Conservar la solución a 4 °C y desecharla pasados 14 días después de su preparación. Solución de yodo 0,001 M Disolver 3,6 g de yoduro potásico en 20 mi de agua. Añadir 1,27 g de yodo y completar con agua hasta los 100 ml. Así se obtiene la solución stock. Esta solución se mantiene estable durante 6 meses. Antes de su uso, se prepara la solución de trabajo, diluyendo 1 ml de la solución stock hasta completar hasta 100 ml con agua. Solución 15 por 100 (peso/volumen) de ácido tricloroacético Técnica –Se pesan 15 g de huevo líquido en un matraz y se añaden 2 ml de solución reciente de almidón. Mezclar bien y calentar en baño de agua regulado a 44,5 °C durante 30 minutos. –A continuación se enfría la mezcla y se transfieren 5 ml de la misma a un
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tubo de ensayo que contenga 5 mi de solución de ácido tricloroacético. Mezclar bien y añadir 15 ml de agua destilada, volviendo a mezclar perfectamente. — La mezcla obtenida se filtra a través de papel Whatman n.º 12, decantando las primeras gotas del filtrado o bien centrifugando la mezcla. Transferir 10 mi del filtrado claro o del sobrenadante de la centrifugación a un tubo de ensayo que contenga 2 mi de solución de yodo 0,001 M. — Se examina el color. Si es azul-violeta indica la presencia de almidón y, por tanto, ausencia de la enzima alfa amilasa que, al no estar presente, no ha podido desdoblar el almidón. El huevo se utiliza como integrante de muchos alimentos pero, en la mayoría de los casos, en cantidades pequeñas. La mayonesa es una excepción importante. Se trata de una emulsión de aceite en agua que contiene huevo, aceite vegetal y un acidulante, preferentemente ácido acético (vinagre). La salubridad de la mayonesa está estrechamente relacionada con el valor del pH. Algunas Salmonella, entre las que se encuentran S. enteritidis fagotipo 4 y S. muenchen sobreviven y crecen a pH 4,0 y mueren a pH 3,0-3,5, lo que supone un peligro. Además, algunas Salmonella se habitúan a la acción del ácido y sobreviven. Sin duda alguna, la mayonesa elaborada con huevos crudos es la que más riesgo tiene respecto a poder contraer la salmonelosis. La producida comercialmente suele tener un pH algo inferior a 4,0, ya que se acidula normalmente con un 0,3-0,5 por 100 de vinagre. Por otra parte tiene la seguridad de ser elaborada con huevos pasteurizados. Para controlar la Salmonella en otro producto de origen animal, la leche, se parte inicialmente de precauciones a nivel de granja, evitando la infección en los animales lecheros, ya que la salmonelosis padecida por este ganado puede persistir largos periodos de tiempo. Las infecciones persistentes de salmonelosis en el ganado lechero suelen estar relacionadas con 5. dublin (otros serovars son más raros), y se pueden asociar con incidentes de salmonelosis humana. La contaminación de la leche con microorganismos patógenos y, por tanto, Salmonella, se produce de diversas formas, principalmente por las heces durante el ordeño: — — — —
Defecación del animal en la leche. Contaminación de la mama por distintos caminos (suelo, etc.). Contaminación a partir de las manos del ordeñador. Contaminación del equipo de ordeño, etc.
Se ha adelantado mucho en la mejora de las instalaciones y condiciones de higiene en general. La pasteurización es un método de garantía que proporciona leche libre de microorganismos peligrosos, excepción hecha de histeria monocytogenes. En los métodos de pasteurización se utiliza el calor por distintos procedimientos: — Procesado a baja temperatura durante largo tiempo (LTLT: Low Temperature Long Time). — Procesado a alta temperatura durante corto tiempo (HTST: High Temperature Short Time).
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En la mayoría de los países la combinación tiempo/temperatura se define por ley. El proceso de pasteurización más utilizado es el de alta temperatura corto tiempo (HTST). En la leche esterilizada (UHT: Ultra High Temperature) desaparecen todas las formas vegetativas, patógenas o no, y la temperatura utilizada es de 132 °C aplicada durante un segundo. Para el control de los siguientes derivados de la leche, se utilizan distintos tratamientos: — Nata y mantequilla (pasteurización e higiene en su elaboración). La nata también se esteriliza. — Leche concentrada (calentamiento para restarle agua). — Leche en polvo (deshidratación e higiene en su preparación). — Productos fermentados (yogures, quesos blandos y duros). En su elaboración se utilizan antiguos métodos de conservación. El tratamiento térmico de la leche utilizada en la elaboración del queso es una garantía de salubridad. Sin embargo, algunos piensan que cuando se calienta la leche no se pueden elaborar algunas variedades de este producto dado que se destruyen componentes de la microflora láctea que son responsables del sabor peculiar del producto y de su textura especial. Según ellos, estas características desaparecen cuando la leche no es cruda. El método alternativo al tratamiento térmico para quesos duros elaborados con leche cruda consiste en mantenerlos en refrigeración durante 60 días. Sin embargo, este procedimiento no parece tener mucho éxito, ya que en el producto pueden sobrevivir algunos serovars de Salmonella y Listeria monocytogenes. La realidad es que se conocen brotes de toxiinfecciones ocasionadas por Salmonella, Listeria monocytogenes y otros patógenos como consecuencia de la ingestión de quesos elaborados con leche cruda.
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Investigación de Shigella
Shigella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriacene, integrado por gérmenes de forma bacilar, no esporulados, inmóviles, pero animados de movimiento pendular (oscilación) in situ. Son gramnegativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sin producción de gas; no obstante, debido a su afinidad con E. coli, se han encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. No decarboxilan la Usina. No fermentan la lactosa. No utilizan el citrato como única fuente de carbono. No crecen en el medio cianuro potásico. Su actividad bioquímica es muy reducida. El género Shigella se divide en cuatro especies que pertenecen a subgrupos serológicos distintos: Subgrupo
Especie Sh. dysenteriae
A
B C D
Sh.flexneri Sh. hoydii Sh. sonnei
Existen algunas cepas de E. coli inmóviles y que no fermentan la lactosa que se confunden con las Shigella. Se pueden diferenciar por las pruebas siguientes:
E. coli inmóvil no fermentador lactosa Shigella
Citrato
Acetato
Mucato
+
+
+
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Fermentación de azúcares + pocos
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MATERIAL — — — — — — —
Matraces Erlenmeyer. Pipetas de 10 y 1 ml. Asa de cultivo. Estufa de cultivo. Portaobjetos de vidrio. Baño María. Jarra para anaerobios.
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Caldo gramnegativo (GN) Composición: Polipeptona Dextrosa D-Manitol Citrato sódico Desoxicolato sódico Fosfato dipotásico Fosfato monopotásico Cloruro sódico Agua destilada
20 g 1g 2g 5g 0,5 g 4g 1,50 g 5g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7 ± 0.2 Distribuir en matraces Erlenmeyer de 500 mi a razón de 225 mi. Esterilizar a 115 °C durante 15 minutos. Caldo EE de Mossel simple (v. pág. 34) Caldo Shigella Composición: Triptona Fosfato dipotásico Fosfato potásico Cloruro sódico Tween80 Dextrosa Agua destilada
20 g 2g 2g 5g 1,50 mi 1g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7 ± 0,2. Distribuir en matraces Erlenmeyer de 500 ml a razón de 225 mi. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
INVESTIGACIÓN DE SHIGELLA
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A cada matraz con 225 ml del medio base estéril se añaden 2,5 ml de una solución de novobiocina (50 mg de novobiocina + 1.000 ml de agua destilada) esterilizada por filtración. Agar MacConkey Composición: Polipeptona Peptona Lactosa Sales biliares Cloruro sódico Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada
3g 17 g 10 g 1,50 g 5g 0,03 g 0,001 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición, que deberá mantenerse durante 2 minutos. Ajustar el pH a 7,1 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Atemperar a 47 °C y preparar placas de Petri con porciones de 15-20 mi por placa. Agar Hektoen (Hektoen Enteric: HE) (v. pág. 45) Agar-xilosa-lisina-desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD) (v. pág. 45) Agar nutritivo (Plata Count Agar: PCA) (v. pág. 14) Agar hierro triple azúcar (Triple Sugar Iron Agar: TSI) (v. pág. 46) Caldo lisina-decarboxilasa (v. pág. 48) Agar movilidad Composición: Extracto de carne Peptona Cloruro sódico Agar Agua destilada
3g 10 g 5g 4g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición, que se mantendrá durante 2 minutos. Ajustar el pH a 7,4 ± 0,2. Distribuir a razón de 8 ml en tubos de 16 x 160 mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
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Agua de triptona (Tryptone Water: TW) (v. pág. 11) Medio de Clark y Lubs (MR-VP) (v. pág. 25) Agua oxigenada de 10 volúmenes Agar acetato (Trabulsi y Edwards) Composición: Acetato sódico Fosfato amónico Fosfato dipotásico Cloruro sódico Sulfato magnésico Azul de bromotimol Agar Agua destilada
2g 1g 1g 5g 0,20 g 0,08 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición. Ajustar el pH a 6,7. Distribuir en tubos de 16 x 160 mm a razón de 8 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Dejar solidificar en posición inclinada, de tal forma que se obtenga una superficie de 5 cm. Caldo mucato Composición: Peptona Acido múcico Azul de bromotimol Agua destilada
10 g 10 g 0,024 g 1.000 ml
Disolver la peptona en el agua. Disolver el ácido múcico añadiendo hidróxido sódico 5 N muy lentamente y agitando. Mezclar con la peptona diluida en agua y añadir el azul de bromotimol. Ajustar el pH a 7,4 ±0,1. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm a razón de 5 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 10 minutos. Sueros aglutinantes anti-Shigella AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SHIGELLA Enriquecimiento en medios líquidos selectivos En esta fase, se limita la proliferación de la flora competitiva y se estimula el crecimiento de Shigella.
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Pesar, asépticamente, 25 g del producto en estudio y mezclar con 225 ml (solución 1:10) de cada uno de los siguientes caldos de enriquecimiento: — Caldo para gramnegativos (GN) (v. pág. 64). — Caldo EE de Mossel (v. pág. 34). — Caldo Shigella (v. pág. 64). Mezclar e incubar a 37 °C durante 16-18 h. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos A partir del cultivo obtenido en cada uno de los medios líquidos selectivos de enriquecimiento, se siembra con asa de cultivo sobre: — La superficie bien seca de agar MacConkey (v. pág. 65). — La superficie bien seca de agar HE (v. pág. 45). — La superficie bien seca de agar (XLD) (v. pág. 45). Incubar a 37 °C durante 24-48 horas. Las colonias de Shigella crecidas sobre agar MacConkey son incoloras y transparentes. Como se trata de un género de la familia Enterobacteriaceae, del grupo de no fermentadoras de la lactosa, el indicador rojo fenol del medio no vira al rojo al no fermentarse este azúcar integrante del medio. Las Shigella crecidas sobre agar HE son verdes, planas y transparentes. Las sales biliares del medio inhiben el crecimiento de la flora competitiva. Los indicadores (azul de bromotimol y fuchina acida) sirven para diferenciar las colonias lactosa-positivas y las lactosa-negativas. Las Shigella crecidas sobre agar XLD son transparentes y del mismo color que el medio de cultivo. Este género bacteriano, al no fermentar la xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol. Como tampoco decarboxilan la lisina, no se produce color rojo púrpura alrededor de las colonias, al no haberse producido cadaverina. Confirmación de las colonias Se seleccionan, como mínimo, 2-3 colonias de cada placa donde aparezca un crecimiento colonial característico. Las colonias seleccionadas se siembran, individualmente, en agar nutritivo (v. pág. 14). Incubar a 37 °C durante 24 horas. Agar-hierro-triple azúcar (TSI) A partir del cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), se siembra con asa de cultivo en agar TSI (v. pág. 46), primero en la superficie inclinada por diseminación y, luego, en el fondo por picadura. Incubar a 37 °C durante 48 horas. Las Shigella típicas en agar TSI dan la siguiente reacción: — Alcalina (rojo) en la superficie inclinada (no fermentan la lactosa). — Acida (amarillo) en el fondo (fermentan glucosa). — Sin ennegrecimiento (no producen SH2).
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Caldo lisina-decarboxilasa A partir de un cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), se siembra, con asa de cultivo, en caldo lisina-decarboxilasa (v. pág. 48). Incubar a 37 °C durante 48 horas y hacer una lectura a las 24 horas. Las Shigella dan reacción negativa en este medio (color amarillo). Agar movilidad A partir del cultivo reciente en agar nutritivo (v. pág. 14), se siembra con asa o aguja de cultivo por picadura sobre agar movilidad (v. pág. 65). Incubar a 37 °C durante 18-24 h. Los crecimientos de los gérmenes móviles se difunden desde la línea de siembra, dando lugar a un enturbiamiento del medio. Los gérmenes inmóviles crecen únicamente en la línea de la picadura. Las Shigella son inmóviles. Agua de triptona (TW) A partir de un cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), se siembra con asa de cultivo en TW (v. pág. 11). Incubar a 37 °C durante 24 horas. Después de la incubación, añadir 0,5 ml. aproximadamente, del reactivo de Kovacs (v. pág. 25). La reacción positiva se manifiesta por la aparición de un anillo rojo en la superficie. En la reacción negativa, el anillo es amarillo. Las Shigella no producen indol. Medio de Clark y Lubs (MR-VP) Para efectuar las pruebas de rojo de metilo y acetil-metil-carbinol (Voges Proskauer), consúltense las páginas 27 y 28. Las Shigella son positivas al rojo de metilo y negativas a Voges Proskauer. Catalasa La catalasa, enzima bacteriana que poseen algunos gérmenes, tiene la propiedad de descomponer el agua oxigenada con desprendimiento de oxigeno. Sobre un portaobjetos, se deposita una gota de agua oxigenada de 10 volúmenes donde se emulsiona un poco del cultivo reciente de la cepa crecida sobre agar nutritivo (v. pág. 14). En caso positivo, se desprenden burbujas. Las Shigella son catalasa-positivas, excepto Shigella dysenteriae 1. Diferenciación de Shigella con cepas de Escherichia coli inmóviles y lactosa-negativas Existen cepas de E. coli que, al ser inmóviles y no fermentar la lactosa, se pueden confundir con las Shigella. Se diferencian en su crecimiento positivo o negativo en agar acetato y caldo mucato.
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Agar acetato A partir de un cultivo reciente en agar nutritivo (v. pág. 14), se hace una siembra sobre agar acetato (v. pág. 66). Incubar a 37 °C durante 7 días, con lecturas cada 24 horas. Las cepas que oxidan el acetato del medio dan lugar a una elevación del pH, que se manifiesta por un viraje al color azul. Las Shigella no crecen en este medio; la mayoría de las cepas de E. coli crecen en el transcurso de 24 horas. Caldo mucato En esta prueba se investiga la fermentación del mucato por algunas especies bacterianas. A partir de un cultivo reciente sobre agar nutritivo (v. pág. 14), se siembra con asa de cultivo en tubos de caldo mucato (v. pág. 66). Incubar a 37 °C. Los resultados se leen a las 48 horas y, periódicamente, hasta los 8 días. La fermentación del mucato se traduce por un viraje del medio al amarillo. Las Shigella no fermentan el mucato; E. coli sí lo hace. Confirmación serológica Sobre porta bien limpio se coloca una gota de suero anti-Shigella polivalente del grupo D. En otra zona del mismo porta, se pone una gota de solución salina. Una porción del cultivo se mezcla con la gota de suero anti Shigella polivalente de! grupo D. Mezclar y observar si se produce aglutinación. La cepa mezclada con la solución salina debe permanecer perfectamente emulsionada, sin presentar aglutinación. Si no se produce aglutinación con el suero anti Shigella polivalente del grupo D, se siguen haciendo pruebas con los grupos polivalentes: anti-A, anti-B y anti-C. PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE SHIGELLA Las especies del género Shigella no son habitantes normales del ambiente, proceden del hombre y otros primates. Para la identificación de Shigella se han desarrollado técnicas rápidas que, en su utilización para los alimentos, no son tan fiables como los métodos microbiológicos tradicionales. Su utilización preferente es para muestras clínicas (heces y suero) de personas enfermas de disentería. Se ha conseguido buena especificidad con una prueba látex, usando el kit comercial Bactigen (Agglutination Slide from Wampole Laboratory, Cragury, N.J., USA). El método ELISA se utiliza en clínica humana para investigar alguna de las especies del género Shigella en muestras de heces y suero. Recientemente se ha descrito una técnica ELISA para detectar Shigella y Escherichia coli enteroinvasivo
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(ECEI), inmunizando conejos con una cepa invasiva de E. coli 0143, siguiendo por absorciones con un derivado avirulento (Pal, 1989). El método de hibridación DNA se usa con fines epidemiológicos o cuando no se ha logrado identificar la Shigella correctamente con sueros de referencia. Como ayuda en la identificación de Shigella se pueden usar los API 20E y API Rapid 20E. PREVENCIÓN Y CONTROL DE SHIGELLA Las Shigella son causa de una diarrea en el hombre denominada disentería bacilar y, más recientemente, shigelosis. Las distintas especies de este género son huéspedes adaptados al hombre y a otros primates. La transmisión de la enfermedad se produce, normalmente, por contacto de persona a persona y vía fecal oral. Otra forma muy importante de contagio es por contaminación del agua y los alimentos con heces humanas de enfermos. Las moscas sirven, a veces, de vehículo en la transmisión de las Shigella desde heces contaminadas a cualquier tipo de alimento. Las Shigella actúan de forma invasiva una vez ingeridas. Después de pasar por el estómago, alcanzan el intestino grueso y se multiplican, luego penetran en el epitelio del colon donde ulceran su mucosa. Las heces de los enfermos son mucosas y, a veces, sanguinolentas. La dosis infectante necesaria para que se produzca la shigelosis suele ser baja, entre 10-100 gérmenes. Este microorganismo se puede encontrar en el ambiente: aguas en general, aguas de ríos o estuarios, suelo y cualquier material contaminado con heces de enfermos, particularmente donde la shigelosis humana es endémica. Igualmente se puede encontrar en lodos y suelos fertilizados. La permanencia de las Shigella en los portadores convalecientes es de 3-5 semanas después de haber desaparecido los síntomas de la enfermedad, aunque algunas personas continúan excretando Shigella incluso hasta 5-6 meses. Aunque siempre se ha considerado que las Shigella son microorganismos particularmente delicados y poco resistentes a las condiciones ambientales, lo cierto es que pueden sobrevivir largos periodos de tiempo en distintas condiciones: — — — — —
A temperatura ambiental en heces, vegetales y frutas contaminados. A temperaturas inferiores a-20 °C en alimentos. A temperatura de refrigeración en alimentos. A 80 °C durante varios segundos. De alimentos con pH neutro inoculados con Shigella se ha recuperado este microorganismo pasados 100 días cuando se han mantenido a-20 °C y + 4°C. — Sobrevivieron más de 50 días al ser inoculados en huevos, leche, marisco y harina. — En queso contaminado sobreviven las Shigella varias semanas. El papel de los alimentos en la transmisión de la shigelosis es muy importante, aunque actúan, únicamente, como vectores no específicos. Las Shigella se transmiten a los alimentos a través de las manos de portadores o enfermos si están
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manchadas con heces, vegetales, frutas, etc., lavados con agua contaminada y moscas que han contactado con heces de enfermos. Los alimentos implicados en brotes de shigelosis casi siempre han estado contaminados con heces de personas que están padeciendo la enfermedad, son convalecientes, o bien, portadores asintomáticos. La contaminación se debe a malas manipulaciones por parte de estas personas. Las aguas contaminadas con este microorganismo pueden conducirle a contaminar verduras y frutas si son lavadas con dichas aguas. Para que se produzca un brote es necesario que manipuladores asintomáticos o enfermos manejen con sus manos alimentos que requieren mucha manipulación y no son sometidos después a ningún tratamiento que pueda destruir al germen; también puede ocurrir que, alimentos ya preparados, se contaminen posteriormente. Las personas más afectadas son niños, principalmente que asisten a guarderías con poca higiene y otras instituciones o grupos socioeconómicos con malas condiciones de vida, falta de agua potable y deficientes cuidados sanitarios. El tipo de alimentos implicados con más frecuencia en la aparición de brotes de shigelosis son: ensaladas de todo tipo ( patatas cocidas, pollo, atún, marisco, lechuga), ostras crudas, frutas (fresa), judías, hamburguesas, leche, leche acida, queso, pescado, marisco, arroz cocido, sandwiches, etc. En todos los casos la contaminación se produce en alimentos preparados, listos para el consumo, mal manipulados por portadores de Shigella en sus heces, asintomáticos o enfermos. El control de las Shigella y sus distintas especies comienza educando a las personas que, de un modo u otro, manipulan los alimentos: — En un lugar muy preferente está que las personas que sufren cualquier tipo de diarrea deben ser excluidas de la manipulación de alimentos. — Es necesario cumplir estrictamente las medidas higiénicas exigibles a los manipuladores en lo que se refiere a su higiene personal. — Exigir un lavado de manos y uñas escrupuloso antes y después de manipular alimentos, así como posteriormente a la micción y defecación. — Supervisar el lavado de las manos de los niños antes de comer y después de orinar y defecar. — Tener cuidado de no tocar con las manos los alimentos ya preparados o cocinados. — En escuelas y centros similares destinados a niños o ancianos se harán esfuerzos exhaustivos de control en todo lo referente a higiene. — Prevenir la contaminación con el uso de utensilios de cocina y comedor limpios que sustituyan a las manos. — Supervisar el cumplimiento de las normas higiénicas preestablecidas. — Evitar la refrigeración inadecuada para la conservación de los alimentos. — Evitar la presencia de moscas, otros insectos y roedores como norma preventiva. Todas estas medidas se reducen a: mantener una buena higiene personal de los manipuladores; proporcionar una educación sanitaria completa y razonada a estas personas; llevar a efecto un tratamiento correcto del agua utilizada (cloración); realizar un tratamiento sanitario adecuado para las aguas residuales y, sobre todo, evitar que las personas enfermas con manifestaciones entéricas, manipulen los alimentos.
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Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores
El grupo bacteriano de los sulfito-reductores está integrado por gérmenes pertenecientes al género Clostridium, que tienen en común reducir el sulfito a sulfuro. Se suelen usar para apreciar la calidad higiénica del agua y productos animales o de origen animal. Su número es escaso en productos frescos. La capacidad de esporular de los microorganismos pertenecientes a este grupo les confiere una gran resistencia. MATERIAL — — — — —
Tubos de 90 x 12,5 mm. Pipetas de 1 ml. Estufa de cultivo. Gradillas. Jarra para anaerobios. Baño María.
MEDIOS DE CULTIVO Agar-sulfíto-polimixina-sulfadiazina (SPS) Composición: Peptona de caseína Extracto de levadura Citrato férrico Sulfilo de sodio Sulfato de polimixina B Sulfadiazina sódica Agar Agua destilada
15 g 10 g 0,50 g 0,50 g 0,01 g 0,12 g 14 g 1.000 ml 73
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Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7 ± 0,1. Distribuir en tubos de 90 x 12,5 mm a razón de 15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Enfriar rápidamente a la salida del autoclave. Parafina estéril Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores La detección de Clostridium sulfito-reductores, así como su recuento, se puede hacer: — Investigando la presencia de formas vegetativas y esporuladas, conjunta mente. — Investigando la presencia de formas esporuladas, únicamente. La detección se logra utilizando medios de cultivo en cuya fórmula interviene el sulfito de sodio en los que, por la capacidad de estos microorganismos para reducir tal sustancia, se produce sulfuro de hierro al actuar sobre el compuesto de hierro. La presencia de sulfuro de hierro se pone de manifiesto por la aparición del color negro de las colonias. El cultivo de los Clostridium exige una atmósfera exenta de oxígeno, lo que se consigue: — Con la regeneración de los medios de cultivo antes de ser sembrados. Por el cultivo en anaerobiosis: • Mediante la utilización de jarras para anaerobios. • Por la obturación del medio sembrado con una capa de parafina estéril. • Por siembra en la profundidad del medio. INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS Y ESPORULADAS DE CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTORES, CONJUNTAMENTE El SPS (v. pág. 73), licuado y regenerado, se enfría a 47-50 °C. A partir de la «serie de diluciones decimales» (v. pág. 11), y por duplicado, se siembra 1 ml de cada dilución, con pipeta estéril, en los tubos con el medio acondicionado previamente. La siembra se hace introduciendo la pipeta con el inoculo hasta el fondo del tubo y depositándolo lentamente de abajo arriba. Una vez hecha la siembra en cada tubo y con cada dilución, se obturan con una capa de parafina estéril. Ya solidificado el medio en posición vertical, se llevan los tubos a la estufa dentro de una Jarra para anaerobios. Incubar a 46 °C durante 24-28 horas. Se cuenta el número de colonias negras crecidas y se multiplica por el factor de dilución del tubo para obtener el recuento total de colonias de formas vegetativas y esporos de Clostridium sulfito-reductores, conjuntamente, por gramo o mililitro demuestra El medio utilizado es selectivo para gérmenes sulfito-reductores. El sulfato sódico, por la acción sulfito-reductora de la mayor parte de los Clostridium, se re-
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTORES
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duce a sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro, da lugar a sulfuro de hierro, que se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias. La sulfadiazina sódica es selectiva e inhibe el crecimiento de gérmenes gramnegativos. INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTORES Para obtener únicamente las formas esporuladas de Clostridium sulfito-reductores, se aprovecha su termorresistencia calentando a 80 °C el producto, la suspensión madre o las diluciones decimales. De esta manera, se destruyen las formas vegetativas. Destrucción de formas vegetativas Se toman 5 ml de cada una de las diluciones decimales y se calientan en baño María regulado a 80 °C durante 5 minutos. Enfriar inmediatamente bajo el grifo. Regeneración del medio de cultivo El medio agar SPS (v. pág. 73), se funde y regenera calentándolo en agua hirviendo durante 10 minutos para expulsar el oxígeno. Después se enfria hasta alcanzar 47-50 °C, bajo un chorro de agua fría Técnica A partir de la «serie de diluciones decimales» (v. pág. 11), calentada 80 °C durante 5 minutos y por duplicado, se siembra 1 mi de cada dilución, con pipeta estéril, en tubos con SPS (v. pág. 73) licuado, regenerado y atemperado. Para la siembra, se introduce la pipeta con cada dilución hasta el fondo del agar y se va depositando el inoculo lentamente de abajo arriba. Cubrir la superficie con una capa de parafina estéril. Solidificado el medio, incubar en estufa a 46 °C, en anaerobiosis, durante 24-48 horas. Contar el número de colonias negras crecidas en el agar y multiplicarlo por el factor de dilución del tubo. Esta cifra dará el número de esporos de Clostridium sulfito-reductores por gramo o mililitro de muestra.
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Investigación y recuento de Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocáceas de 0,8-1,0 ym de diámetro, que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y carecen de esporos. Son grampositivas. Es una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes. Su presencia o la de sus toxinas en los alimentos es signo evidente de falta de higiene. Una característica muy importante de este germen es que sus toxinas pueden ser causa de intoxicación cuando se ingieren con los alimentos. En general, la presencia de un número elevado de Staphylococcus aureus en un alimento refleja higiene defectuosa por mala manipulación. Si, además, los St. aureus aislados son cepas enterotoxigénicas, suponen un riesgo para la salud. Puede ocurrir que no se detecte St. aureus en un alimento, que el número detectado sea pequeño y que, sin embargo, exista cantidad detectable suficiente de enterotoxina estafílocócica. En este caso, los gérmenes que originaron la toxina han ido descendiendo en número e, incluso, desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor resistencia, permanece en el alimento. MATERIAL — — — — — — — — — — — — —
Tubos de ensayo de 16 x 160 mm Pipetas de 1 mi estériles Estufa de cultivo Asa de vidrio estéril Asa de cultivo Tubos de 10x75mm Placas de Petri de 90 mm de diámetro Placas de Petri de 15 x 60 mm Sacabocados de 1 cm de diámetro Pipetas Pasteur Centrífuga Tubos de 20 x 200 mm Baño María 77
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MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Caldo de enriquecimiento Giolitti Cantoni Composición: Triptona Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro de litio Manitol Cloruro sódico Glicina Piruvato sódico Agua destilada
10 g 5g 5g 5g 20 g 5g 1,20 g 3g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición. Ajustar el pH a 6,9 ± 0,2. Distribuir en tubos de 20 x 200 mm, a razón de 19 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Enfriar rápidamente y añadir, a cada tubo, 0,3 ml de una solución de telurito potásico al 3,5 por 100, esterilizada por filtración Para la técnica del NMP, el medio se distribuye en tubos de 16 x 160 milímetros, a razón de 10 ml. Parafina estéril Medio sólido selectivo Baird Parker (B P) Composición: Triptona Extracto de carne Extracto de levadura Piruvato sódico Glicina Cloruro de litio Agar Agua destilada
10 g 5 g 1 g 10 g 12 g 5 g 20 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 6,9 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 20 minutos. Enfriar a 50 °C y añadir 50 ml de emulsión estéril yema de huevo-telurito (apartado siguiente). Mezclar uniformemente y preparar placas de Petri. Emulsión de yema de huevo-telurito-sulfametazina Composición: Emulsión de yema de huevo Telurito potásico 3,5 por 100 Sulfametazina 0,2 por 100 Agua destilada
50 ml 3 ml 25 ml 1.000 ml
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
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La yema de huevo se prepara partiendo de huevos frescos de gallina, bien lavados y que hayan permanecido en alcohol al 70 por 100, entre 2-3 horas. Se extrae el huevo asépticamente, y, de la misma forma, se separan las claras de las yemas. La emulsión se obtiene mezclando 50 mi de yema de huevo con la misma cantidad se solución salina estéril. La mezcla se homogeneiza en homogeneizador estéril. La solución de telurito potásico al 3,5 por 100 se esteriliza por filtración. Para preparar la solución de sulfametazina, se disuelven 0,5 g del producto puro en 25 ml de hidróxido sódico N/10, completando hasta 250 ml con agua destilada. Caldo cerebro corazón (Brain Heart Infusión: BHI) Composición: Extracto de cerebro de ternera Extracto de corazón de buey Triptosa Cloruro sódico Fosfato disódico Agua destilada
12,50 g 5,00 g 10,00 g 5,00 g 2,50 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7,4 ± 0,2. Distribuir en tubos de ensayo a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Plasma de conejo con ácido etilodiamino tetraacético (EDTA) Plasma de conejo, desecado y titulado, que evita reacciones falsas en las pruebas de coagulasa. Este producto se adquiere en casas comerciales. Agar desoxirribonucleasa (DNsa) Composición: Triptona Acido desoxirribonucleico Cloruro sódico Agar Agua destilada
20 g 2g 5g 12 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición. Ajustar el pH a 7,3 ± 0,2. Distribuir en tubos a razón de 15 ml y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Preparar placas de Petri con el medio.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Acido clorhídrico 1 N Solución de azul de toluidina Composición: Azul de toluidina Agua destilada
1 g 100 ml
Agar DNsa azul de toluidina Composición: Acido desoxirribonucleico Cloruro calcico 0,01 mol/litro Agar Tampón tris (0,05 mol/litro, pH 9)
0,3 ml 10 g 10 g 1.000 ml
Tampón tris Composición: Tris (hidroximetilamino metano) (0,5 M) Agua destilada
121,14 g 1.000 ml
Disolver el tris en parte del agua destilada. Ajustar el pH a 9 con ácido clorhídrico concentrado. Completar con el resto del agua hasta 1.000 ml. Medio completo Disolver el medio agur DNsa por calentamiento y agitación hasta ebullición. Añadir 3 ml de solución de azul de toluidina. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Distribuir en matraces estériles donde se pueda conservar el medio hasta su utilización, para preparar placas de Petri. Su conservación en estas condiciones es de 2-3 meses. Equipo de coloración de Gram MÉTODO DE ENRIQUECIMIENTO EN TUBOS PARA CONOCER LA PRESENCIA-AUSENCIA Este procedimiento se utiliza: — Cuando no interesa conocer exactamente el número de Staphylococcus aureus existente en el alimento. — Cuando se sospecha que existe un número pequeño de estos gérmenes. — Cuando se trata de gérmenes lesionados debido a que el producto ha sido sometido a técnicas industriales.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
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Se parte de la suspensión madre del producto que se va a analizar, sembrando, por duplicado, 1 ml de dicha suspensión en tubos que contengan 19 ml de caldo de enriquecimiento Giolitti Cantoni (v. pág. 78). Cubrir la superficie con parafina estéril para evitar el crecimiento de Micrococcus. Incubar en estufa a 37 °C durante 18-24 horas. Se consideran positivos los tubos que presenten ennegrecimiento. El cloruro de litio del medio inhibe el crecimiento de los gérmenes gramnegativos. El telurito potásico inhibe a los grampositivos. El piruvato sódico, la glicina y el manitol favorecen el crecimiento de St. aureus. La anaerobiosis conseguida con la capa de parafina no altera el crecimiento de los Staphylococcus y, sin embargo, inhibe el desarrollo de Micrococcus. La coloración negra del medio cuando crecen St. aureus se debe a que estos gérmenes originan la reducción del telurito a teluro, que se manifiesta por la aparición de color negro en el medio. De los tubos positivos, se resiembra 0,1 ml. por diseminación con asa de vidrio estéril, sobre placas con medio sólido selectivo Baird-Parker (v. pág. 78). Incubar las placas en estufa a 37 °C durante 48 horas, con lectura a las 24 horas. El aspecto de las colonias típicas de Staphylococcus aureus sobre agar BairdParker es el siguiente: redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro, húmedas, brillantes, negras, con un borde blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm. El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben el desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicina favorecen el crecimiento de los estafilococos. El medio de cultivo es opaco, debido a que se le incorpora emulsión de yema de huevo. El St. aureus elabora una lipasa que, al actuar sobre la lipoproteína de la yema de huevo, produce un aclaramiento alrededor de las colonias y una zona opaca como consecuencia de la formación de un precipitado de sales de calcio y magnesio, insoluble en ácidos grasos. Esta zona opaca se hace visible a partir de las 24 horas de incubación. Pruebas confirmativas Se seleccionan, como minino, dos colonias típicas para su confirmación. Con este fin, se investiga la capacidad de la cepa en estudio para producir: — Coagulasa. — Desoxirribonucleasa. Investigación de coagulasa Las colonias típicas seleccionadas se siembran en caldo cerebro corazón contenido en tubos (v. pág. 79). Incubar a 37 °C durante 18-24 horas. En un tubo de 10 x 75 mm se vierten 0,3 mi de plasma de conejo EDTA (v. pág. 79) reconstituido. Se añade 0,1 mi del cultivo obtenido en caldo BHI. Incubar a 37 °C y examinar a las 6 horas de incubación. La reacción es positiva cuando el coágulo formado es firme (3 + 4 +).
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Investigación de desoxirribonucleasa (DNsa) La desoxirribonucleasa es una poderosa enzima elaborada por las cepas patógenas de St. aureus. Se caracteriza por depolimerizar el ADN y por su termorresistencia, razón por la que se denomina termonucleasa. El pH óptimo para la elaboración de la DNsa por St. aureus es 8,3- Parece existir una correlación entre producción de DNsa y formación de coagulasa, aunque recientemente se ha demostrado la presencia de termonucleasa en cepas 5/. aureus coagulasa-negativas. Autores como Lachica manifiestan que el 95-100 por 100 de cepas de Staphylococcus aureus enterotoxigénico producen termonucleasa. Método A: A partir de las colonias típicas crecidas sobre el medio Baird-Parker, se siembra, en estrías radiales o en una sola estría, sobre la superficie de agar DNsa (v. pág. 79). Incubar a 37 °C durante 18-24 horas. Sobre el crecimiento se vierte ácido clorhídrico 1 N (v. pág. 80) y se espera unos minutos a que se produzca la reacción, que consiste en la aparición de una zona transparente a su alrededor, lo que indica que el germen en estudio ha liberado desoxirribonucleasa (DNsa). Se puede sustituir el ácido clorhídrico I N por solución de azul de toluidina (v. pág. 80). En este caso, la reacción positiva se manifiesta por la aparición de un halo rosa que rodea la zona de crecimiento. Método B: La cepa en estudio se siembra sobre el medio Baird-Parker (v. pág. 78). Incubar a 37 °C durante 16-18 horas. Cuando las colonias se hacen visibles, sin tener en cuenta la formación del halo de aclaramiento, se calienta la placa en estufa a 60 °C durante 2 horas. Pasado este tiempo, se cubre la superficie del medio con una capa de agar DNsa-azul de toluidina (v. pág. 80). Cuando se solidifica la capa de agur superpuesta, se incuba la placa a 37 C durante 3-4 horas. La reacción positiva se manifiesta por la aparición de un halo rosa alrededor de las colonias, lo que indica que la cepa en estudio ha elaborado una DNsa termorresistente (termonucleasa). Método de recuento en placas Se utiliza cuando se sospecha que el alimento por analizar contiene más de 100 St. aureus por gramo. A partir de la «serie de diluciones decimales» (v. pág. 11), y por duplicado, se siembra 0,1 mi de cada dilución sobre la superficie bien seca de agar Baird-Parker (v. pág. 78) contenido en placas de Petri. Diseminar con asa de vidrio estéril. Incubar en estufa a 37 °C durante 48 horas. Seleccionar para el recuento placas que contengan entre 20 y 200 colonias típicas. Una vez contadas estas colonias en las placas elegidos, la cifra obtenida se multiplica por el factor de dilución de la placa, lo que da como resultado el re-
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
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cuento total de St. aureus en 0.1 gramo del producto analizado. Esta cifra, multiplicada por 10, expresa el recuento total de St. aureus por gramo o mililitro de muestra. Pruebas confirmativas
(v.pág. 81 y 82). Método del Número Más Probable (NMP) Se utiliza cuando se sospecha que la cifra de Staphylococcus aureus es < 100 gérmenes por gramo o mililitro. A partir de la «serie de diluciones decimales» (v. pág. 11), se siembra 1 mi de la dilución 1:10 en cada uno de una serie de tres tubos conteniendo 10 mi de caldo Giolitti Cantoni (v. pág. 78). De la dilución 1:10 se siembra 1 mi en cada tubo de una segunda serie de tres tubos con 10 mi del mismo medio y, finalmente, de la dilución 1:1.000 se siembra 1 mi en cada tubo de una tercera serie de tres tubos con 10 mi de caldo Giolitti Cantoni. Cada tubo se cubre con una capa de parafina estéril para evitar el crecimiento de Micrococcus. Una vez solidificada la parafina, se incuban todos los tubos en estufa a 37 °C durante 48 horas. El ennegrecimiento del medio pone de manifiesto la posible presencia de St. aureus. Se hace la lectura de los tubos que muestren ennegrecimiento en cada serie de tres tubos y los resultado se leen en la Tabla del NMP para tres series de tres tubos cada una (v. pág. 19). De los tubos que a las 48 horas presenten ennegrecimiento, se siembra 0,1 mi en placas de Petri conteniendo medio Baird-Parker (v. pág. 78). Incubar a 37 °C durante 48 horas, con lectura a las 24 horas. Anotar las colonias características crecidas en el medio. Estas colonias se resiembran en caldo cerebro-corazón (v. pág. 79) para su confirmación: — Investigación de coagulasa (v. pág. 81). — Investigación de desoxirribonucleasa (DNsa) (v. pág. 82). Leer de nuevo en la Tabla del NMP (v. pág. 19) los tubos confirmados en el medio selectivo (agur Baird-Parker) que son, además, coagulasa y DNsa positivos. Los resultados obtenidos se expresan como gérmenes por gramo o mililitro en la muestra analizada. DETECCIÓN DE TERMONUCLEASA EN ALIMENTOS Se ha comprobado que existe una estrecha relación entre producción de termonucleasa y enterotoxinas estafilocócicas. Para detectar termonucleasa en alimentos, se procede de la forma siguiente: La muestra por analizar se mezcla, a partes iguales, con agua templada a 3040 °C. Triturar y homogeneizar. Ajustar el pH a 5,5. Calentar a 100 °C durante 20 minutos. Enfriar.
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La muestra así tratada se centrifuga a 27.000 rpm durante 20 minutos o a 7.500 rpm durante 45 minutos. El sobrenadante se utiliza para la investigación de termonucleasa. En placas de Petri de 15 x 60 mm estériles, se vierten, asépticamente, 5 mililitros de agar DNsa-azul de toluidina (v. pág. 80). Una vez solidificado el medio, se hacen en él pocilios de 1 cm de diámetro. Con pipeta Pasteur, se llenan los pocilios con el sobrenadante del centrifugado de la muestra. Incubar, sin invertir las placas, a 50 °C durante 2-4 horas. Pasado este tiempo, se vierte sobre la superficie del medio solución de azul de toluidina (v. pág. 80). En caso positivo, aparecen zonas rosadas alrededor de los pocilios. PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y SUS TOXINAS La intoxicación estafilocócica o estafiloenterotoxicosis, es consecuencia de la ingestión de enterotoxinas preformadas en un alimento y liberadas en el mismo durante el desarrollo de cepas St. aurciis enterotoxigénicas. Se trata de una de las intoxicaciones más comunes de origen microbiano en los alimentos. La especie St. aureus se detecta por el análisis microbiológico clásico: siembra en medios selectivos, aislamiento e identificación. La presencia de St. aureus en un alimento no significa exactamente que pueda ser causa de intoxicación estafilocócica. Por lo general, una cifra elevada de St. aureus en un alimento refleja una manipulación defectuosa que significa falta de higiene y no tiene, necesariamente, relación con una intoxicación. Un determinado alimento puede ser tóxico a pesar de poseer escasos o ningún germen pertenecientes a esta especie; por otra parte, no todas las cepas de St. aureus producen enterotoxinas. En la identificación de St. aureus enterotoxigénico se utilizan técnicas para detectar productos procedentes del metabolismo del germen: coagulosa, termonucleasa (TNasa, nucleasa estable al calor) y proteína A. La detección de coagulasa y termonucleasa se utiliza como método de rutina ya que existe relación entre ambas y su capacidad para elaborar enterotoxinas estafilocócicas. La prueba de investigación de termonucleasa (TNasa) es particularmente útil para diferenciar las cepas enterotoxigénicas de las que no lo son y de otras especies del género Staphxlococcus ajenas a St. aureus que dan también reacción coagulasa positiva. En el trabajo rutinario de laboratorio no siempre es posible investigar la presencia de enterotoxinas en el alimento, por lo que, durante años, se vienen utilizando pruebas para la detección de coagulasa y termonucleasa (TNasa), principalmente. Sobre todo interesa detectar la coagulasa, mientras que la investigación de termonucleasa (TNasa) constituye una prueba auxiliar de la coagulasa, a la que no sustituye sino que la apoya cuando las reacciones son dudosas. Al contrario que la coagulasa, la termonucleasa (TNasa) se puede investigar también en extractos de alimentos. La enzima persiste después de la muerte de los St. aureus enterotoxigénicos que lo han producido. La investigación de la termonucleasa (TNasa) se ha propuesto como medio indirecto para determinar la posible presencia de enterotoxinas en alimentos fermentados (queso, embutidos y otros).
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En general, los resultados de la investigación de termonucleasa (TNasa) se deben interpretar con precaución. Puede ocurrir que en un alimento exista enterotoxina y la reacción de termonucleasa (TNasa) sea negativa. Existen kits comerciales miniaturizados para la identificación de St. aureus: — Medio rápido Kit API Rapidec Staph. Se basa en la detección de la enzima coagulosa preformada y permite la detección de St. aureus y otras especies en 2 horas. — Kit API Staph Ident (diferencia St. aureus de St. hyicus). — ATB 32 Staph. Este sistema sirve para la identificación completa de especies de Staphylococcus, se basa en pruebas convencionales, o bien, en pruebas convencionales y en la determinación de enzimas específicas. El sistema ATB 32 Staph identifica totalmente gran número de especies de Staphylococcus y Micrococcus. En las pruebas se combinan reacciones bioquímicas convencionales y determinaciones enzimáticas específicas, como ya se ha sugerido. Los resultados se obtienen después de 24 horas de incubación. — Staphilase (detecta el factor de coagulación). Se utilizan en la prueba partículas de látex coloreadas, que ayudan al reconocimiento de las cepas coagulasa positivas. El Kit lleva un control coagulosa negativo. — Staphaurex (detecta la coagulación y la proteína A). La prueba se hace sobre una plantilla especial que permite reconocer fácilmente reacciones positivas y negativas. Se han descrito otros métodos alternativos para la identificación de St. aureus (Isigidi, 1989). Los más interesantes son los medios de agar conteniendo plasma de conejo o cerdo para la detección directa de la coagulosa. Los esfuerzos hechos para conseguir una metodología rápida para la investigación de St. aureus enterotoxigénico se han concentrado en la búsqueda de enterotoxinas estafilocócicas. Las enterotoxinas estafilocócicas son metabolitos excretados en el medio de cultivo, alimentos u otro medio en el transcurso del crecimiento de 5/. aureus enterotoxigénico. Una misma cepa puede producir, simultáneamente, 2-3 tipos de toxina. Las enterotoxinas de St. aureus son un grupo heterogéneo de proteínas globulares de cadena simple. Son termoestables, solubles en el agua y con un peso molecular que oscila entre 28.000 y 35.000 daltons. Se conocen actualmente 9 enterotoxinas estafilocócicas serológicamente distintas: A, B, C1, C2, C3 D, E, F y G. Como ya se ha citado, algunas cepas tóxicas de St. aureus pueden elaborar más de una enterotoxina. Se identifican cada una de ellas en contacto con sus anticuerpos correspondientes. Las enterotoxinas estafilocócicas se caracterizan por ser altamente resistentes al calor y a los rayos gamma. A 121 °C se destruyen en el transcurso de 5-10 minutos y perduran durante horas a 80 °C. Su termorresistencia varía en función del serotipo, grado de pureza, concentración y naturaleza del medio, principalmente. A veces, las enterotoxinas no se inactivan completamente en condiciones normales de cocción o pasteurización en prácticas culinarias. Para la detección de enterotoxinas estafilocócicas se han utilizado numerosos métodos. El único método biológico que se ha empleado hace tiempo y ahora está en desuso, es la administración por sonda gástrica al mono (rhesus o chimpancé) o por vía intraperitoneal o intravenosa al gato, del sobrenadante del cultivo de la cepa en estudio. El método fue sustituido por pruebas serológicas. En la actuali-
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dad, todos los métodos para la detección de enterotoxinas estafilocócicas se basan en el uso de anticuerpos específicos para cada enterotoxina. Entre las pruebas serológicas utilizadas para la detección de enterotoxinas estafilocócicas durante años, han tenido preferencia las de gel difusión en agar, como el método microslide. Este procedimiento, además de no ser muy sensible (su sensibilidades de 100 ng/ml de cultivo) tampoco es fácil de ejecutar. La sensibilidad en alimentos es de 5 ng/g, cantidad escasa para la detección de enterotoxinas en estos productos. Otro inconveniente es que necesita una extracción a partir de una muestra importante de alimento (100 g ). Las técnicas de aglutinación látex detectan entre 0.1 y 10 ng de enterotoxina en 1 mi de extracto de alimento (Rose, 1989 ). Son más fáciles de usar que los métodos ELISA, pero menos sensibles. Ambos métodos, ELISA y Látex, son apropiados en la rutina de laboratorio; no obstante, hay que tener en cuenta que, aun con el más desarrollado ELISA, pueden aparecer algunos falsos positivos y negativos (Park, 1992; Becker, 1994). En los últimos años la investigación de enterotoxinas estafilocócicas se basa en técnicas de coaglutinación y enzimoinmunoensayo. En el método OSP (Optimum Sensivity Plates) se usan filtrados del cultivo que se va a probar para ver si existen enterotoxinas cuando se los enfrenta con enterotoxinas estándar. Se trata de una reacción de precipitación y su sensibilidad es de 100 ng/ml. Es una modificación del método original de gel difusión. La técnica de aglutinación RPHA (Reversed Passive Haemagglutination) se ha utilizado también para la detección de enterotoxinas estafilocócicas, no obstante, algunos autores han encontrado en ella mucha menos sensibilidad que la que se consideraba que tenía en un principio y, por otra parte, produce un alto nivel de reacciones cruzadas no específicas. Hay suficientes razones para desechar su uso. Otra alternativa basada en la aglutinación, la RPLA (Reversed Passive Látex Agglutination) ha sustituido a la anterior. Su sensibilidad es de 0.25 ng/ml. Los resultados se obtienen a las 16 horas. Para realizar es prueba existe un Kit comercial: Denka-Serken; Unipath. Su sensibilidad es análoga a ELISA y RÍA. Da falsos positivos. Se necesita partir de un extracto del alimento. A pesar de la buena aceptación del Kit comercial utilizado para el método RPLA, la mayoría de los esfuerzos han derivado hacia las técnicas de enzimoinmunoensayo (ELISA), que se consideran fáciles y de alta sensibilidad y especificidad. Existen Kits comerciales para la detección de enterotoxinas estafilocócicas basados en pruebas de enzimoinmunoensayo (ELISA): — Polestyreno Ball Assay (Laboratory Diagnostic, Dr. W. Bommeli) — Ensayo en placa minititer de TECRA. El último método citado es más sencillo y los resultados se pueden leer visualmente; su inconveniente está en que no distingue las diferentes enterotoxinas lo que, a veces, es muy importante. Se detectan 0.1 ng/g en alimentos en 48 horas y 0.3 ng/ml en cultivos. El radioinmunoensayo (RÍA) es un método rápido y altamente sensible. Tiene el inconveniente de no estar al alcance de todos los laboratorios y que es necesario manejar radioisótopos y enterotoxinas purificadas para la preparación de toxinas yodadas. Se detectan con esta técnica 0.3 ng/ml en cultivos y 0.5 ng/g en alimentos.
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Las técnicas de radioinmunoensayo (RÍA) y enzimoinmunoensayo (ELISA) exigen previamente una fase de extracción. Se necesitan para ello 5-10 gramos de alimento: — Se tritura el alimento y se mezcla con 1 mi de agua por cada gramo utilizado del producto a analizar. Ajustar el pH a 4.5 con C1H 6 N. — Centrifugar la mezcla y ajustar el pH del líquido sobrenadante a 7.5 con NaOH 5N. — Al extracto obtenido se le añade CHC1, y se centrifuga. Este extracto está en condiciones de ser analizado, bien por el método RÍA o por ELISA.
PREVENCIÓN Y CONTROL DE ST. AUREUS ENTEROTOXIGENICO Los microorganismos integrantes del género Staphylococcus son ubicuitarios, parásitos saprofitos del hombre y los animales en piel y mucosas. Algunas especies son patógenas. En microbiología alimentaria sólo las especies capaces de producir enterotoxinas se consideran patógenas, como la especie St. aureus. St. aureus, como el resto de las especies del género Staphylococcus, es un germen ubicuitario que se encuentra en piel y mucosas de la mayoría de los animales de sangre caliente, así como en los alimentos de origen animal. Existen portadores sanos ocasionales, intermitentes o permanentes de este microorganismo. Las fosas nasales del hombre constituyen el reservorio principal del germen, desde donde se disemina a piel, manos, rostro, pelo, etc.. La tasa de portadores nasales se considera del 20-50 por 100. Haciendo una toma de las fosas nasales con un hisopo estéril, se obtienen cantidades de 5/. aureus que exceden 103 colonias/hisopo. Por otro lado, su ubicuidad hace que se encuentren en el ambiente: aire, suelo, aguas, vestidos, etc. Al menos el 50 por 100 de las personas son portadoras, de vez en cuando, de St. aureus en fosas nasales, garganta, heces y manos, distribuyéndose a otras zonas del cuerpo y vestimenta. Los alimentos expuestos a la manipulación humana tienen la posibilidad de contaminarse con esta especie bacteriana. Como ya se ha señalado, existen portadores sanos ocasionales, intermitentes o permanentes de este microorganismo. St. aureus es un germen mesófilo cuyo crecimiento se inhibe, generalmente, en presencia de una flora competitiva abundante por lo que es difícil que se produzca intoxicación estafilocócica a partir de alimentos crudos. Una excepción es la leche cruda de vacas enfermas con mastitis. En este caso los niveles de St. aureus pueden ser muy altos. Es sensible a la acidez del medio y tolera concentraciones elevadas de cloruro sódico y reducidas de actividad de agua (aw). 5/. aureus es fácilmente destruido por la cocción, pero no así sus toxinas, que sobreviven a este tratamiento. Las toxinas, a veces, pueden resistir, incluso, el proceso de esterilización de los alimentos. También sobreviven durante largo tiempo en alimentos deshidratados y congelados. Esta especie bacteriana crece entre 7 y 47.8 °C, con temperatura óptima a 3537 °C. La producción de enterotoxina se realiza entre 10 y 46 °C, con temperatura óptima a 37-45 °C. El germen se suele destruir a temperatura de pasteurización,
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pero no siempre. Respecto al pH se multiplica a valores comprendidos entre 4.0 y 9.8, con un óptimo de 6.0-7.0. Crece entre amplios límites de aw, aunque dependiendo siempre del pH y la temperatura de incubación. El crecimiento del germen se realiza a una aw comprendida entre 0.83 y 0.99; la elaboración de enterotoxina requiere 0.86-0.99 de aw. 5/. aureus es una especie halotolerante, con unos límites de sal en medios artificiales de 0-10-20 por 100. En alimentos la tolerancia es similar, aunque el límite superior puede ser algo más bajo por la presencia de otros factores inhibidores. En muchos alimentos, con concentraciones de sal superiores a 5-7 por 100, la reducción del germen es muy pequeña. También es resistente a la acción del nitrito. Esta especie bacteriana es causa de algunas infecciones extraintestinales pero, sobre todo, de una intoxicación alimentaria en el hombre a través de sus toxinas. Es un importante patógeno de la piel, estando presente en forúnculos y heridas infectadas, etc.. También se encuentra en animales domésticos y de abasto: perro, aves, oveja, vaca, cerdo y cabra. Está presente en casos de mastitis de vaca, oveja y cabra. La intoxicación estafilocócica es el resultado del consumo de un alimento en el cual ha crecido St. aureus produciendo, como consecuencia de ello, enterotoxina/s. La mayoría de los brotes de intoxicación estafilocócica son producidos por cepas de esta especie que elaboran enterotoxinas A y/o D. La que con menos frecuencia se ha encontrado en casos de estafiloenterotoxicosis es la cepa B. Las enterotoxinas son las responsables de la aparición de síntomas de intoxicación estafilocócica (estafiloenterotoxicosis) ocasionados por la ingestión de alimentos contaminados. También, ciertas cepas de St. aureus están capacitadas para producir coagulosa y, en menor amplitud, termonucleasa (TNasa). Ambas se usan como marcadores de la producción de enterotoxinas y como medio de identificación del germen. La producción de enterotoxinas se ha asociado siempre con 5/. aureus. Sin embargo, recientemente, se ha demostrado que existen otras cepas que también poseen esta capacidad como: St. chromogenes, St epidermidis, St. haenwlyticus, St. capitis, St. cohnii, St hyicus, St. intermedias, St. xilosus, St. lentus, St. warner, entre otras. No hay informes sobre casos de intoxicación producidos por estas especies pero son, sin duda, agentes potenciales. Los síntomas de la intoxicación estafilocócica se caracterizan por aparecer con bastante rapidez, son de durarión relativamente corta y sus efectos cesan pronto. Los brotes suelen ser de pequeña magnitud afectando, principalmente, a grupos familiares o de otro tipo dándose, también, casos individuales. La sintomatología se presenta entre 1-7 horas (por término medio 2-4 horas) después de la ingestión de un alimento conteniendo enterotoxina estafilocócica. No obstante existen periodos de incubación tan cortos como 30 minutos y tan largos que pueden alcanzar las 8 horas. Las manifestaciones habituales de la intoxicación estafilocócica son: nauseas, vómitos profusos, dolor abdominal y diarrea. En algunos casos, infrecuentes, hay dolor de cabeza, mareo y debilidad. En casos graves la intoxicación puede dar lugar a colapso. No suele haber fiebre e, incluso, la temperatura puede estar por debajo de lo normal. La recuperación es rápida; el enfermo se restablece a las 24 horas. La intoxicación no es realmente preocupante en el sentido clínico y, raras veces es mortal. Sin embargo resulta incómoda e incapacita al que la padece du-
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rante 48 horas. La susceptibilidad es variable entre adultos, siendo mayor en niños y ancianos. La cantidad de enterotoxina necesaria para que se desencadene la intoxicación depende del peso y la sensibilidad del individuo; se estima, en general, en 0.1 microgramo/kg en el hombre. La estafiloenterotoxicosis es más frecuente cuando un alimento terminado se contamina como consecuencia de manipulaciones poco escrupulosas por parte de una persona que está colonizada y dicho alimento se mantiene varias horas a temperatura comprendida entre 20-40 °C. En esta fase temperatura/tiempo, si St. aureus ha llegado al alimento a través de las malas manipulaciones del portador, se multiplica abundantemente y elabora toxina/s. No todas las cepas de St. aureus están capacitadas para producir enterotoxinas. La enfermedad se debe a la acción tóxica de las enterotoxinas preformadas en el alimento El crecimiento del germen no se produce en el intestino sino que la toxina ingerida activa unos receptores en el intestino que generan unos impulsos que son los que excitan el centro subcortical del vómito. Las enterotoxinas no actúan como toxinas clásicas, sino más bien como neurotoxinas. La salubridad de un alimento respecto a St. aureus depende de la presencia de sus enterotoxinas pero no del microorganismo en sí. En este último caso tendría, más bien, papel de germen indicador. St. aureus se encuentra en diversos alimentos crudos: carnes de abasto y ave. Esta especie bacteriana se encuentra en ambos casos de forma inevitable, unas veces como cepas de origen animal y otras como cepas de origen humano. En el último caso si ha habido un alto nivel de manipulación en las distintas etapas de sacrificio y preparación de los productos, seguido de un almacenamiento incorrecto (falta de refrigeración adecuada) Otra forma de contaminación del producto es a través del equipo de procesado que, a veces, puede estar colonizado por cepas enterotoxigénicas de St. aureus. Como el germen es resistente a la desecación, puede mantenerse en algunas zonas de los equipos de procesado, difícilmente accesibles a la limpieza. También son frecuentes en los sistemas de ventilación. En algunas explotaciones avícolas se han encontrado cepas de St. aureus resistentes al cloro. La presencia de este microorganismo en carne cruda es de escaso significado ya que es incapaz de crecer como consecuencia de la abundante flora competitiva que existe en este alimento. Sólo tiene importancia en este caso como indicador de falta de higiene si su número es elevado. En todos los casos, la presencia de un patógeno en cantidad elevada en un alimento crudo, puede dar lugar a enfermedad achacable al producto procesado, debido a que se puede producir una contaminación cruzada. Se ha citado anteriormente que vacas, ovejas y cabras pueden contener en su leche cierto número de este microorganismo; la cifra aumenta si se trata de leche de hembras con mastitis. En este caso cabe el riesgo de que existan cepas enterotoxigénicas en cifras elevadas. Puede ocurrir que dé tiempo al germen para multiplicarse y elaborar enterotoxinas antes de someter a la leche a tratamiento térmico. La leche pasteurizada adecuadamente, no suele ser causa de intoxicación estafílocócica. Sin embargo, algunos productos de pastelería rellenos con crema elaborada con leche, han sido causa en muchas ocasiones de intoxicación estafilocócica. Existen distintos factores que conducen a que se produzcan intoxicaciones estafilocócicas:
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— Malas prácticas de higiene en el obrador y en el despacho. — Instrumentos utilizados para elaborar y rellenar los pasteles con crema difíciles de limpiar, por lo que en su interior permanecen acantonados los gérmenes. — Almacenamiento o exposición inadecuada del producto. En los últimos años ha decrecido el número de casos de intoxicación estafilocócica debido al creciente uso de la refrigeración como medio de conservar los alimentos, aunque aún se producen casos esporádicos. En carnes cocidas se puede encontrar St. aurcus en pequeño número (1 x 102/g). Niveles más altos indican una manipulación posterior a su elaboración poco cuidadosa, o que el control de refrigeración ha sido inadecuado. Estas carnes (jamón cocido, pollo asado, etc.) consumidas en frío pueden ser causa de intoxicación estafilocócica que se suele desencadenar en pequeños brotes, por ejemplo, en el hogar, o en mayor escala en servicios de catering (bodas, bautizos, restauración, vuelos aéreos, etc.). Igualmente se puede introducir St. aureus en productos cocinados cuando se les añaden posteriormente ingredientes que en su momento han sufrido una contaminación con el germen que nos ocupa (adornos de coco, frutos secos, gelatina, etc.). La gelatina ha sido en muchos casos un ingrediente añadido causante de intoxicación estafilocócica. Brotes ocasionales se han producido con platos de pescado cocinado mal manipulados después de su preparación. Los huevos cocidos y los huevos líquidos, así como platos cocinados a base de pasta fresca o seca han sido, a veces, causa de algún brote de intoxicación. En los vegetales crudos, la presencia de St. aureus está controlada por una alta flora competitiva; en vegetales cocinados se puede producir la contaminación con St. aureus por malas manipulaciones higiénicas (por ejemplo, patatas fritas). Respecto a productos cárnicos obtenidos por fermentación (salami. chorizo y otros embutidos), St. aureus es. a veces, causa de un importante problema si la fermentación inicial no ha sido correcta. St. aureus desaparece totalmente de los productos cárnicos fermentados durante la fase de maduración, pero su ausencia o presencia en escaso número en el producto terminado no significa seguridad si ha fallado de algún modo la fermentación. Es práctica aconsejable que la industria realice en embutidos fermentados acabados la prueba de termonucleasa (TNasa) para determinar la posible presencia de enterotoxinas. St. aureus se puede aislar en escaso número en productos lácteos fermentados. La posible intoxicación estafilocócica está asociada solamente con algunos tipos de queso duro, como el cheddar y similares. En este tipo de queso, el drenaje del suero se realiza a una temperatura y un tiempo apropiados para el crecimiento del germen antes de someter al producto a salazón. Si existen St. aureus, cabe la posibilidad de que se multipliquen y. si es enterotoxigénico, que elabore toxinas. Algún caso de intoxicación estafilocócica por consumo de queso elaborado con leche pasteurizada, ha sido consecuencia del acantonamiento de St. aureus enterotoxigénico tipos A y D en las válvulas de la maquinaria utilizada en la elaboración del queso. Si se contamina el producto, se forma la toxina durante su maduración.
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En vegetales fermentados se conocen casos de intoxicación estafilocócica, sobre todo si son de elaboración casera (choucrout, cebollas, pepinillos en vinagre y similares). En las conservas, sobre todo de carne, el germen puede introducirse a través de fisuras si el envase está alterado. De forma muy concreta, la contaminación de los alimentos con St. aureus suele ser consecuencia de escasas o malas prácticas de higiene en alguna o algunas de las fases de la cadena alimentaria. Si a esto se une un almacenamiento posterior del alimento a temperatura y tiempo que permitan un crecimiento significativo del germen, tiene lugar la elaboración de enterotoxinas capaces de ocasionar intoxicación si el alimento es consumido. La intoxicación estafilocócica se puede evitar impidiendo el crecimiento de St. aureus enterotoxigénico en los alimentos. Para ello es necesario respetar normas de higiene estrictas a lo largo de la cadena alimentaria, especialmente en el momento de preparación de las comidas. Se puede minimizar extraordinariamente la contaminación de los alimentos por St. aureus de origen humano apartando de la manipulación y preparación de alimentos a personas infectadas o enfermas. También, reduciendo al máximo las manipulaciones, con buena higiene personal de los manipuladores éstos deben conocer la existencia de microbios y sus consecuencias, siendo un deber sensibilizarlos en problemas de higiene. La contaminación con St. aureus de origen animal se reduce controlando las mastitis. Además, es necesario evitar en el matadero contaminaciones cruzadas entre piel y canales, así como en el hogar y establecimientos de restauración (catering, etc.) entre alimentos crudos y cocinados. Los St. aureus en el ambiente (aparatos, utensilios de cocina, etc.) se eliminan con buenas prácticas de limpieza e higiene. Estas medidas preventivas no son suficientes para eliminar totalmente los Staphylococcus de los alimentos, es preciso: — Destruirlos por el calor antes de que se multipliquen (pasteurización, cocción). — Frenar su multiplicación llevando rápidamente los alimentos a temperatura inferior a 6 °C para que se conserven. — Respetar la cadena del frío, que es el punto clave para la prevención del crecimiento de St. aureus y, por tanto, se evita la intoxicación estafilocó cica a través de los alimentos. El control para evitar que se produzca una estafiloenterotoxicosis, consiste en: — Utilizar productos crudos sanos. — Usar técnicas higiénicas adecuadas durante el procesado de los alimentos para evitar que se contaminen posteriormente. — Evitar la colonización del alimento manteniéndolo por debajo de 6 °C. — En alimentos crudos fermentados (embutidos y queso) el control se debe realizar en la fase de fermentación. Ya se ha citado que gran parte de brotes de intoxicación estafilocócica se suelen producir al ingerir carne cocida fría, sobre todo: pollo frío, jamón cocido y jamón curado. También productos elaborados con leche: pasteles rellenos con crema, quesos, productos del mar cocidos (gambas y similares) y, con menos
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frecuencia, pescado y productos envasados, éstos últimos se contaminan a través de fisuras, sobre todo en las costuras del envase. Los motivos por los cuales los alimentos citados pueden ser causa de intoxicación, son: — Que no llevan, habitualmente. un número elevado de flora contaminante que, cuando existe, es antagonista de St. áureas; en caso contrario, esta especie bacteriana crece sin obstáculos, produciendo niveles tóxicos de enterotoxinas antes de que pueda crecer otra flora contaminante. — Que la aw de los alimentos de referencia es lo suficientemente baja para que no puedan crecer los microorganismos Gram negativos y algunos Gram positivos. De esta forma también se reduce la flora competitiva, favoreciendo con ello el crecimiento de St. aureus. — Que en la mayoría de los alimentos citados se necesita una gran manipulación, lo que propicia que se contaminen con St. aureus. La elaboración se hace a temperatura ambiente y durante un tiempo más o menos largo que facilita el crecimiento de esta especie bacteriana, en cuyo caso, aunque el producto elaborado se someta a calentamiento culinario, éste no será capaz de inactivar la/s toxina/s existente/s.
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Investigación y recuento de Bacillus cereus
El Bacillus cereus es una bacteria perteneciente a la familia de las Bacillaceae. Está integrada por gérmenes de forma bacilar voluminosos: miden 1 — 1,2 x 3 — 5 / 10 B. cereus por gramo de alimento. A partir de la «serie de diluciones decimales» (v. pág. 11), y por duplicado, se deposita 0,1 mi de cada dilución en la superficie bien seca de agar MYPA de Mossel (v. pág. 94). Diseminar el inoculo con asa de vidrio estéril, procurando no romper el medio. Desechar el asa y utilizar otra nueva para extender cada dilución. Dejar las placas durante 15 minutos sobre la mesa de trabajo para que se absorba el inoculo. Incubarlas en estufa a 31 ± 1 °C durante 48 horas, con lectura a las 24 horas. Las colonias de B. cereus aparecen sobre un sustrato rosado. Están rodeadas de un halo de precipitación blanco denso y una gama de tonos rojo violeta. A las 24 horas de incubación, las colonias son circulares y lisas, y miden 2-3 mm de diámetro. Pasadas las 24 horas, las colonias son más grandes, rugosas, rizoides, con diferenciación en forma de estrías. Este medio lleva incorporado sulfato de polimixina B, que sirve de inhibidor para el crecimiento de la flora competitiva. El manitol sirve para distinguir los gérmenes que fermentan este azúcar de los que no lo fermentan. Los microorganismos manitol-positivos hacen que vire el
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rojo fenol del medio al amarillo por fermentación del azúcar. Los manitol-negativos no viran a amarillo, como es el caso de B. cereus. La incorporación al medio de emulsión de yema de huevo sirve para detectar la lecitinasa. Esta enzima degrada la lecitina de la yema de huevo y hace que se acumulen los productos insolubles de la degradación alrededor de las colonias. B. cereus posee lecitinasa. Para el recuento, se seleccionan las placas que contengan entre 15-150 colonias típicas. Las colonias contadas se multiplican por el factor de dilución de la placa, y se obtiene así el número de colonias de B. cereus en 0,1 g o mililitro de muestra. Esta cifra, multiplicada por 10, da el número de colonias por gramo o mililitro. Las colonias típicas aisladas se transfieren a agar nutritivo (v. pág. 14) para su confirmación. Incubar a 31 ± 1°C durante 24 horas. Técnica del Número Más Probable (NMP) Se utiliza cuando se sospecha que el alimento contiene < 10 B. cereus por gramo de alimento. A partir de la «serie de diluciones decimales», se procede como sigue: En una primera serie de tres tubos con caldo tripticasa soja polimixina (v. pág. 96), se siembra 1 mi de dilución de la muestra al 1:10. En una segunda serie de tres tubos con caldo tripticasa soja polimixina (v. pág. 96), se siembra 1 mi de dilución de la muestra al 1:100. En una tercera serie de tres tubos con caldo tripticasa soja polimixina (v. pág. 96), se siembra 1 mi de dilución de la muestra al 1.000. Incubar las tres series a 31 ± 1 °C durante 48 horas. Al cabo de este tiempo, B. cereus produce un crecimiento muy denso en el caldo. De tubos que presentan crecimiento denso, se siembra sobre la superficie bien seca de agar MYPA (v. pág. 94). Incubar a 31 ± 1 °C durante 48 horas, con lectura a las 24 horas. Una o más colonias características, crecidas sobre agar MYPA, se siembra sobre agar nutritivo (v. pág. 14). Incubar a 31 + 1 °C durante 24 horas. Este cultivo se utiliza para efectuar pruebas confirmativas. Los tubos con crecimiento positivo denso y confirmados, se leen en la Tabla del NMP de tres series de tres tubos (v. pág. 19). Pruebas confirmativas Partiendo del crecimiento obtenido en agar nutritivo, se realizan las pruebas siguientes: Con aguja de cultivo, y por picadura hasta el fondo, sembrar en tubos con agar para anaerobios (v. pág. 95). Cubrir con parafina estéril. Incubar a 31 ± 1 °C durante 7 días, con lectura diaria. El crecimiento a lo largo de la línea de siembra indica la capacidad del germen para crecer en anaerobiosis. B. cereus, al ser anaerobio facultativo, es capaz de desarrollarse en la atmósfera del medio.
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Sembrar en un tubo con caldo glucosa sin fosfato (v. pág. 95). Incubar a 31 ± 1 °C durante 4 dios. En este cultivo se investiga la presencia de acetil metil carbinol (prueba de Voges Proskauer), de la siguiente forma: Mezclar 3 ml de solución acuosa de NaOH al 40 por 100 con el cultivo obtenido en caldo glucosa sin fosfato. A 0,5 ml de esta mezcla se añaden unos cristales de creatinina. Pasados 30-60 minutos a temperatura ambiente, la reacción positiva se manifiesta por la apuración de un color rojo. B. cereus es un germen Voges Proskauer-positivo. En el caso de B. cereus, esta reacción se debe efectuar de la forma descrita por las interferencias que ocasiona el fosfato dipotásico de la fórmula habitual. Este es el motivo de que se use caldo glucosado sin fosfato en la prueba de Voges Proskauer empleada en su confirmación Sembrar la cepa en estudio sobre agar nutritivo glucosado (v. pág. 95). Incubar a 31 ± 1 °C durante 24 horas. A partir de este cultivo, se hace una extensión sobre porta, que se colorea con fuchina ligeramente diluida. Observar la preparación al microscopio. B. cereus presenta unas vacuolas no teñidas. Del mismo cultivo sobre agar nutritivo glucosado, se hace una preparación y se colorea por el método de Gram. Observar al microscopio para confirmar las características morfológicas del germen. De un cultivo joven sobre agar nutritivo, sembrar 3 asas en el medio caldo nitrato (v. pág. 96). Incubar a 31 ± 1 °C durante 24 horas. Añadir 0,25 ml de cada uno de los reactivos A y B (v. pág. 96). Cuando el nitrato se reduce a nitrito, aparece una coloración anaranjada en el transcurso de 10 minutos. B. cereus reduce los nitratos a nitritos. De un cultivo joven sobre agar nutritivo, sembrar por picadura en el medio movilidad (v. pág. 97). Incubar a 31 ± 1 °C durante 18-24 horas. Los gérmenes móviles producen un crecimiento difuso; los gérmenes móviles crecen exclusivamente a lo largo de la picadura. La mayoría de los B. cereus son móviles, mediante flagelos peritricos. PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACILLUS CEREUS La detección y numeración de B. cereus en alimentos utilizando medios de cultivo selectivos, es bastante fácil. El método clásico se puede complementar, si es necesario, con técnicas serológicas para la tipificación del germen. Existen técnicas miniaturizadas para la identificación del germen y sus toxinas. En los laboratorios Analytab Products Inc. (API) existen unos Kits de identificación que confirman rápidamente las cepas aisladas en agar selectivo. Se utilizan el API 20E y el API 50 CHB. El Kit API 20E, utilizado habitual mente para la identificación de especies de la familia Enterobacteñaceae, se puede usar también para la identificación de especies del género Bacillus en sustitución de los métodos convencionales. Los resultados se interpretan de acuerdo con la taxonomía del germen respecto a pruebas bioquímicas y fermentación de hidratos de carbono. Este Kit puede completarse con el 50 CBH, en cuya galería se estudian solamente pruebas de fermentación de carbohidratos.
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La enterotoxina diarreica se identifica por técnicas inmunológicas, utilizando métodos miniaturizados: — Kit Tecra. — Kit Oxoid (Unipath. Denka Seiken) BCET-RPLA (Reversed Passive Látex Agglutination). La prueba se lleva a cabo a partir de un filtrado de cultivo. La enterotoxina emética, que carece de antigenicidad, se detecta por técnicas de cultivos celulares, que ofrecen buenos resultados, para sustituir a la prueba de rhesus monkey (Hughes, 1988). PREVENCIÓN Y CONTROL DE BAC1LLUS CEREUS Badilas céreas es una especie microbiana integrada por bacilos voluminosos, esporulados, con esporo central o subterminal, que no aumenta el tamaño del germen. Generalmente móvil, mediante flagelos peritricos, aunque existen especies inmóviles. Con frecuencia aparecen agrupados en cadenas. Gram positivos. Las colonias crecidas sobre agar tienen aspecto mate y escarchado. Formas vegetativas y esporos están ampliamente extendidos en la naturaleza y en los alimentos. Se encuentran en una amplia gama de ambientes: suelo, polvo, barro, fango, sedimentos, aguas naturales, vegetación, pelo de animales. Puesto que es un germen esporulado, su amplia distribución en el ambiente da lugar a su acceso a varios alimentos crudos: leche y productos lácteos, superficie de carnes crudas, incluida la de pollo, cereales y derivados, especias, materias fecales del hombre y los animales, etc. En productos cárnicos la incidencia del germen es mayor debido a que, en muchos de ellos, se incorporan aditivos, como las especias, que incrementan el número de B. céreas. En leche y productos lácteos se aisla en: leche cruda, leche pasteurizada, nata y leche UHT. En este último caso, si antes de la esterilización de la leche existían cepas termorresistentes en cantidad adecuada. La contaminación por B. céreas, habitualmente de origen telúrico, tiene una estrecha relación en la leche con vacas enfermas de mastitis aguda. Alimentos en cuya composición entra a formar parte leche en polvo, como en el caso de fórmulas preparadas para la alimentación infantil, pueden contener grandes cantidades de gérmenes y esporos de B. céreas. La incidencia de B. céreas en arroz es alta, siendo un producto que se asocia con mucha frecuencia a brotes de intoxicación. Al principio, las alteraciones digestivas ocasionadas por B. céreas se atribuían a la ingestión de un número elevado de gérmenes o a la acción de la fosfolipasa. En realidad, los síndromes producidos por B. céreas se deben a dos tipos distintos de toxinas que actúan como verdaderas exotoxinas, ya que pasan al medio exterior después de atravesar la membrana del germen: — Toxina diarreica. — Toxina emética. La toxina diarreica, denominada también agente diarreico, factor de acumulación de líquido, factor de permeabilidad vascular, toxina dermonecrótica y toxina intoxinonecrótica, es una molécula proteica. Se elabora en la fase exponencial del crecimiento del germen y la toxicidad se pierde después de esta fase.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE BACILLUS CEREUS
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Actúa estimulando el sistema AMP cíclico adenilato ciclasa, con lo que se provoca una acumulación de líquido en el intestino. Se libera en los alimentos o en el intestino delgado. Esta toxina tiene un peso molecular de 38.000-46.000 daltons. Como ya se ha señalado, se produce durante el crecimiento activo del germen y se inactiva con la tripsina y la pronasa, así como por la exposición a 56 °C durante 30 minutos. Es sensible a la acción de ácidos y álcalis, Es antigénica y puede causar alteraciones de permeabilidad en la piel del conejo y dermonecróticas en el cobaya. Causa acumulación de líquido en el asa ileal del conejo y es letal para el ratón cuando se le inyectan grandes cantidades por vía intravenosa (30 microgramos). La toxicidad de la cepa se puede demostrar por medio de cultivos celulares. La toxina emética es un pequeño péptido con peso molecular inferior a 5.000 daltons. Está presente en los filtrados de cultivo. No es antigénica, pero sí extraordinariamente resistente al calor (120 °C durante 90 minutos), a los ácidos, álcalis y enzimas proteolíticas. Almacenada a 4 °C, sobrevive durante 2 meses. Se produce en la fase estacionaria del crecimiento del germen. Las dos toxinas citadas dan lugar a dos tipos de intoxicación alimentaria. Ambas se pueden elaborar en el alimento por multiplicación del germen; la toxina del síndrome diarreico se suele producir con más frecuencia en el intestino delgado (Kramer y Gilbert, 1989). Por sus características, es la toxina emética la que con más frecuencia se ve involucrada en casos de intoxicación. Existen serotipos de B. cereus que no producen toxinas. Como hay cepas de este microorganismo que elaboran las dos toxinas citadas, existen dos tipos principales de intoxicación alimentaria producidas por B. cereus: — Síndrome diarreico — Síndrome emético El síndrome diarreico tiene características análogas a las de Cl perfringens, aunque se diferencian en que B. cereus esporula muy fácilmente en los alimentos, al contrario que Cl. peifringens. Por otra parte, B. cereus sobrevive más al proceso de calentamiento y germina, se multiplica, elabora toxinas y se involucra en incidentes de intoxicación alimentaria con más frecuencia que Cl. perfringens. En el caso del síndrome diarreico, los síntomas se presentan entre las 8-16 horas (término medio 10-12 horas) que siguen a la ingestión de alimentos variados (carne, sopa, pudding, etc). La enfermedad se manifiesta clínicamente con: diarrea acuosa profusa, dolor abdominal, nauseas que, rara vez, dan lugar a vómitos, tenesmo rectal. La evolución suele ser apirética. Los síntomas desaparecen, normalmente, antes de 24 horas. En las heces de los enfermos se puede encontrar B. cereus en grandes cantidades hacia los dos días de aparecer los síntomas. Inmediatamente después de la recuperación del enfermo, el germen desaparece de las heces. El síndrome emético tiene características análogas a las de la intoxicación causada por la enterotoxina estafilocócica. Los síntomas se presentan entre los 30 minutos y las 6 horas que siguen a la ingestión del alimento contaminado. Van acompañados, principalmente, de nauseas y vómitos, con o sin diarrea o dolor abdominal. Los síntomas eméticos son causados por una enterotoxina estable producida durante el crecimiento de cepas de B. cereus enterotoxigénicas en el alimento, normalmente arroz cocido o frito. Por esta causa, al síndrome emético se
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le denomina vulgarmente «síndrome del restaurante chino». Los síntomas desaparecen en el transcurso de 12-24 horas. El síndrome diarreico está asociado con distintos alimentos: platos de carne guisada, ensaladas, puré de patata, salsas, potajes de legumbres, etc. En Europa Central es frecuente la intoxicación diarreica por B. cereus al consumir un plato típico de la zona, el gulash. Para condimentar este plato se utilizan especias que pueden estar contaminadas con esporos de B. cereus. Aunque B. cereus persiste en ciertas conservas no abombadas (pescado en aceite, legumbres) en número no elevado, no parece que produzcan sustancias tóxicas, por lo que se estima que este microorganismo no es un enteropatógeno transmitido por conservas. El síndrome emético se asocia, sobre todo, con el consumo de arroz cocido o frito mantenido a temperatura ambiental elevada varias horas después de ser cocinado (Gingsberg, 1994). También tienen que ver con este síndrome platos a base de pasta. En restaurantes chinos, por ejemplo, se acostumbra a cocer gran cantidad de arroz que mantienen a temperatura ambiente antes de freirlo, circunstancia que influye favorablemente en la producción del síndrome emético. Las condiciones que favorecen el crecimiento de B. cereus en alimentos influyen las formas de cocción en las que se pueden activar los esporos. Si a esto sigue un enfriamiento lento y el almacenamiento de grandes cantidades de alimentos a temperatura entre 10-50 °C, se produce la multiplicación de B. cereus en grandes cantidades. La leche, leche en polvo y similares son alteradas, a veces, por el crecimiento de B. cereus (formación de grumos). El producto en estas condiciones es rechazado por el consumidor. La prevención y el control se deben encauzar a impedir la germinación de los esporos y la multiplicación de grandes cantidades de B. cereus en productos cocinados listos para el consumo. Los alimentos se deben enfriar rápidamente a temperatura inferior a 7 °C y, si se deben mantener calientes, hacerlo a temperatura superior a 60 °C hasta su consumo. La presencia de este microorganismo en un alimento no es suficiente para considerarlo contaminado. El germen debe multiplicarse (106-108 gérmenes) para causar enfermedad. Esto implica mala conservación del alimento en condiciones incorrectas de temperatura. Ya se ha citado que en el arroz, conservado a temperatura ambiente durante largo tiempo, persiste la toxina termoestable del síndrome emético, que puede dar lugar a intoxicación. Normalmente, en lotes de arroz crudo puede haber una contaminación que oscila entre el 46-100 por 100. de formas esporuladas. En las especias la contaminación por esporos es del 10-35 por 100. La mayoría de las cepas de B. cereus es termotropa, por lo que la intoxicación alimenticia que resulta de su crecimiento en los alimentos, se puede controlar evitando el abuso de la temperatura (Gingsberg, 1994), por ejemplo, mediante el almacenamiento inmediato de los alimentos cocinados en condiciones adecuadas de frío. Hay que tener en cuenta que, ocasionalmente, existe una cepa psicrotrófica que se suele encontrar en productos lácteos (van Netten, 1990) Para prevenir y controlar la intoxicación por B. cereus, es necesario: — Cumplir las reglas generales de higiene en la manipulación de alimentos. — Controlar la germinación de los esporos. — Prevenir la multiplicación de las formas vegetativas en alimentos cocidos listos para el consumo.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE BACILLUS CEREUS
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— En el caso del arroz se recomienda, especialmente en restaurantes: • • • •
Preparar pequeñas cantidades de arroz; evitar restos. Llevar a temperatura elevada (superior a 55 °C). Enfriamiento rápido. Recalentamiento a temperatura elevada antes de su distribución.
Los alimentos cocinados correctamente, ingeridos calientes después de su elaboración, no ocasionan problemas. La mayoría de los procedimientos de cocción: a presión de vapor, fritura, hervido, asado, etc. matan a las células vegetativas y, probablemente, a los esporos. La cocción por debajo de los 100 °C hará que sobrevivan algunos esporos. Su germinación se puede frenar aplicando condiciones desfavorables: baja temperatura, bajo pH, baja aw. El mayor problema para la salud pública es el de la multiplicación celular durante un enfriamiento inadecuado. Es necesario un enfriamiento rápido, inferior a 7 °C, para prevenir el crecimiento del germen: — Se fraccionarán las grandes porciones del alimento, dividiéndolas en pequeños lotes. — Los alimentos calientes se mantendrán a temperatura superior a 60 °C hasta su consumo. — Si los platos de arroz llevan huevos batidos, éstos se añadirán en el momento del consumo, recién preparados. Límites de crecimiento de Bacillus cereus Las cepas de B. cereus varían ampliamente en sus características de crecimiento y supervivencia: Mínimo
Temperatura (°C) pH aw
4 5,0* 0,93
Óptimo 30-40 6,0-7,0
Máximo
55 8,8
* Puede ser más bajo.
Algunas cepas son psicrotróficas, siendo capaces de crecer entre 4-5 °C, pero no a 30-35 °C. Las bacterias acidilácticas son inhibitorias para B. cereus. La temperatura óptima de crecimiento de este microorganismo es de 37 °C y la temperatura máxima para la germinación de esporos es 50 °C.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Datos comparativos de intoxicaciones alimentarias (Cl. perfringens, B. cereus, St aureus) B. ce re us Cl. perfringens
S. diarreico
S. emético
St, aureus
Síntomas (horas)
8-22
8-6
1-5
2-6
Duración (horas)
12-24
12-24
6-24
6-24
Diarrea, dolor abd. Predominante
Predominante
Poco común
Común
Nauseas, vómit.
Raro
Ocasional
Predominante
Predominante
Patogénesis
Tox. elab. intest.
Tox. alim. Intes. delg.
Tox. elab alim. Tox. elab. alim.
Alim. involuc
Carne cocida, aves
Prod. cárnicos, Arroz cocido y Carne cocinada pasta enfriada, pollo, sopas, salsas, lácteos veget., etc
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Investigación y recuento de Clostridium perfringens
El Clostridium perfringens, o Clostridium welchii, es una especie bacteriana perteneciente a la familia Bacillaceae. Está integrada por gérmenes de forma bacilar de 4-8 x 0,3-1,5//m. Aparecen aislados o en cadenas cortas. Esporulados, con esporo oval subterminal que no aumenta el tamaño del germen o lo hace ligeramente. Son capsulados, inmóviles, anaerobios estrictos y grampositivos. Reducen nitratos a nitritos. Producen SH2. Fermentan muy rápidamente la lactosa (con producción de ácido y gas), glucosa, galactosa fructosa, maltosa, manitol, inositol y sacarosa. Producen lecitinasa. Elaboran toxinas A, B, C, D y E. El Cl. perfringens es un germen telúrico ampliamente distribuido en la naturaleza (suelo, polvo, sedimento marino, moscas...) que se encuentra en el intestino de hombres sanos, así como en ganado porcino y bovino, también sanos. Por otra parte, es un germen patógeno para los animales (enterotoxemias) y para el hombre (toxiinfecciones alimentarias: Cl. petfringens tipo A, y enteritis necrótica, Cl. perfringens tipo C). Para que sea causa de toxiinfección alimentaria, debe estar presente en el alimento en cifras elevadas, superiores a 105 Cl. perfringens por gramo. Los esporos de la cepa tipo A tienen una resistencia muy elevada. La intoxicación por el tipo A se debe a una enterotoxina que se produce en el citoplasma de los gérmenes en esporulación. Esta enterotoxina se libera junto con los esporos al romperse el esporangio.
MATERIAL — — — — — — —
Tubos de ensayo con tapón de rosca de 10 x 150 mm. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Gradillas. Pipetas de 1 ml estériles. Estufa de cultivo. Asa de cultivo. Hilo de cultivo. 105
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Agar triptona sulfito neomicina (Tryptone Sulphite Neomicin: TSN) Composición: Peptona de caseína Extracto de levadura Sulfito sódico Citrato de hierro Sulfato de polimixina B Sulfato de neomicina Agar Agua destilada
15 g 10 g Ig 0,50 g 0,02 g 0,005 g 14 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7,2 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 10 minutos. El medio debe ser utilizado el mismo día de su preparación.
Parafina estéril Medio para Clostridium reforzado (Reinforced Clostridial Mediará: RCM) con neomicina Composición: Extracto de levadura Extracto de carne Peptona Dextrosa Almidón soluble Cloruro sódico Acetato sódico Clorhidrato de cisteína Agar Agua destilada
3g 10 g 10 g 5g 1g 5g 3g 0,50 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7 + 0,1. Distribuir en tubos de ensayo a razón de 10 mi. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Atemperar a 50 °C y añadir asépticamente en cada tubo 0,25 ml de solución acuosa de sulfato de neomicina (5,7 g de neomicina por litro, que equivale a 100 µg de sulfato de neomicina activa por mililitro).
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
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Agar-triptosa-sulfito-cicloserina con yema de huevo (Tryptose Sulphite Cicloserine Egg Yolk: TSCY) Composición: Triptosa Soja Extracto de levadura Metabisulfito sódico Citrato férrico amónico Agar Agua destilada
15 g 5g 5g 1g 1g 20 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7,6 ±0,1. Distribuir en frascos con tapón a rosca a razón de 90 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 10 minutos. Para su uso, atemperar a 50 °C y añadir a cada frasco 4 ml de solución acuosa de D-cicloserina al 1 por 100 y 6 ml de emulsión de yema de huevo (v. pág. 65), asépticamente. Mezclar bien y preparar placas de Petri. Agar para la fermentación de la lactosa (FL) Composición: Triptona Extracto de levadura Lactosa Fosfato disódico Solución acuosa rojo fenol Agar Agua destilada
15 g 10 g 10 g 5g 0,51 g 3g 900 ml
Disolver todos los ingredientes excepto la lactosa y el rojo fenol. Ajustar el pH a 7,5 ± 0,1. Añadir la lactosa y el rojo fenol. Distribuir en tubos con campana Durham a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Medio triptona extracto de levadura (TEL) Composición: Triptona Extracto de levadura Fosfato disódico Agar Agua destilada
15 g 10 g 5g 3g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,5 ± 0,1. Distribuir en tubos a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Agar-lactosa-leche-yema de huevo (LYL) Medio basa! Composición: Lactosa Sol. acuosa rojo neutro (10 g/1) Agar Caldo de carne
12 g 3,25 ml 12 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,5. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Emulsión de yema de huevo (v. pág. 65) Leche desnatada estéril Solución de tioglicolato sódico Composición: Tioglicolato sódico Agua destilada
12 g 1.000 ml
Esterilizar por filtración. Medio completo Composición: Medio basal Emulsión de yema de huevo Leche desnatada Solución de tioglicolato sódico
1.000 ml 37,50 ml 150 ml 10 ml
Al medio basal, licuado y atemperado a 50 °C, se añaden la emulsión de yema de huevo y la leche desnatada estéril, previamente calentada a 50 °C. Inmediatamente después se añade la solución de tioglicolato, todo ello en condiciones asépticas. Mezclar bien y preparar placas de Petri. Solución de Ringer con cisteína Composición: Cloruro sódico Cloruro potásico Cloruro calcico Carbonato sódico L-Cisteína Agua destilada
2,25 g 0,105 g 0,12 g 0,05 g 0,30 g 1.000 ml
Disolver. Ajustar el pH a 7. Distribuir en tubos de ensayo a razón de 9 mililitros. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
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Caldo lactosa sulfito (CLS) Composición: Peptona de caseína Extracto de levadura Cloruro sódico Lactosa L-Cisteína Agua destilada
5g 2,50 g 2,50 g 10 g 0,30 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH a 7,1. Distribuir en tubos de ensayo con campana Durham, a razón de 8 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Este medio se conserva a temperatura de refrigeración (4 °C). En el momento de su utilización, se lleva a un baño de agua en ebullición durante 5 minutos. Enfriar y añadir, a cada tubo, 0,5 ml de solución acuosa al 1,2 por 100 de metabisulfito sódico anhidro y 0,5 ml de solución acuosa al 1 por 100 de citrato férrico amónico. Las dos soluciones acuosas se esterilizan por filtración en el momento de ser incorporadas al medio, utilizando membranas filtrantes de 0,45 µm. TÉCNICA Método de recuento en tubos La siembra de la muestra, preparada adecuadamente, se hace en la masa de medios de cultivo que llevan sulfito en su composición. A partir de la «serie de diluciones decimales», y por duplicado, se siembra 1 mi de las distintas diluciones en tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapón a rosca, estériles. Inmediatamente se vierten, en cada tubo, 15 ml de agar-triptona- sulfito-neomicina (TSN) (v. pág. 106), licuado y atemperado a 45 °C-50 °C. Una vez solidificado el agar, se vierten sobre su superficie unos 3 mi de parafina estéril. Incubar a 46 °C durante 24 horas. Esta temperatura es selectiva para el aislamiento de Clostridium perfringens. El medio TSN es selectivo para Cl. perfringens. En su composición intervienen: polimixina B, neomicina y sulfito sódico, sustancias que inhiben el crecimiento de la flora competitiva y otros Clostridium. Algunos otros Clostridium sulfito-reductores son inhibidos por los antibióticos y por la temperatura selectiva para Cl. perfringens que se utiliza (46 °C). El sulfito sódico, en presencia de las sales de hierro del medio, es reducido a sulfuro de hierro y da lugar a colonias negras. El recuento de Cl. perfringens se obtiene contando el número de colonias típicas crecidas en el tubo y multiplicando por su factor de dilución: se obtiene así el número de colonias por gramo o mililitro del alimento en estudio. El procedimiento, muy selectivo, sirve para obtener recuentos, exclusivamente. No se aconseja cuando sea necesario tomar colonias para ser confirmadas, puesto que, al oxidarse en contacto con el oxigeno del aire, palidecen por oxidación del sulfuro de hierro.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Método por la técnica del Número Más Probable (NMP) (Procedimiento cuantitativo en medio líquido) A partir de la «serie de diluciones decimales», se procede como sigue: Sembrar 1 mi de la dilución 1:10, en cada uno de los 5 tubos que constituyen una primera serie y que contienen 10 mi de RCM (v. pág. 106). Sembrar 1 ml de la dilución 1:100, en cada uno de los 5 tubos que constituyen una segunda serie y que contienen 10 ml de RCM (v. pág. 106). Sembrar 1 ml de la dilución 1:1.000, en cada uno de los 5 tubos que constituyen una tercera serie y que contienen 10 ml de RCM (v. pág. 106). Incubar las tres series de cinco tubos a 46 °C durante 48 horas, con lectura a las 24 horas. De cada tubo con crecimiento, se siembra 0,5 mi por diseminación con asa de vidrio, sobre la superficie bien seca de placas que contienen agar triptosa-sulfitocicloserina con yema de huevo (TSCY) (v. pág. 107). Una vez seca la siembra diseminada, se cubre el agar con una capa del medio de cultivo agar-triptosa- sulfíto-cicloserina sin yema de huevo, estéril. Incubar en anaerobiosis a temperatura de 46 °C durante 24 horas. Las colonias típicas (colonias negras de 1-3 mm, rodeadas de un halo blanco debido a la reacción de la yema de huevo) se confirman. Según el número de tubos positivos confirmados como Clostridium perfringens, se hace la lectura en la Tabla NMP de tres series de cinco tubos (v. pág. 39). Esta lectura expresará la cantidad de gérmenes por gramo o mililitro de muestra en estudio. Confirmación Los distintos medios que se utilicen para la confirmación deben ser regenerados previamente, por calentamiento en agua hirviendo durante 10 minutos. Todo medio de cultivo cuya superficie está en contacto con la atmósfera lleva en su interior aire disuelto, que perjudica el desarrollo de la flora anaerobio. Con la regeneración se logra expulsar este aire, al producirse dilatación. Durante la permanencia en el baño de agua hirviendo es conveniente dar pequeños golpes de vez en cuando para facilitar la evacuación de las burbujas. Se selecciona un mínimo de 2 colonias típicas crecidas sobre agar TSCY y se siembran individualmente en tubos con agar LYL (v. pág. 108), para comprobar su pureza. Incubar a temperatura de 46 C en anaerobiosis durante 24 horas. Las colonias crecidas después de la incubación se siembran por picadura en agar para la fermentación de la lactosa (FL) (v. pág. 107) y en tubos con medio TEL (v. pág. 107). Incubar a 46 C, en anaerobiosis, durante 24 horas. En los cultivos obtenidas, se pueden observar las siguientes reacciones: — Fermentación de la lactosa con producción de gas: se manifiesta por un viraje del medio FL del rojo al amarillo, con formación de burbujas de gas. — Movilidad, se manifiesta por un crecimiento difuso a lo largo de la línea de siembra en el medio TEL. Cl. perfringens fermenta la lactosa con producción de gas y es inmóvil. — Prueba de Willis: placas con agar LYL (v. pág. 108) bien secas se marcan con rotulador en la parte inferior y externa de la placa. En una de las mitades se extienden unas gotas de antitoxina diagnóstica de Cl. perfringens
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tipo A y se dejan secar. Se extienden por toda la placa, incluidas las dos mitades, colonias crecidas sobre el agar de aislamiento TSCY, comenzando por el lado que no tiene antitoxina y marcando en toda la placa cuatro líneas espaciadas. Incubar en anaerobiosis a temperatura 46 °C de 18-24 horas. El crecimiento de Clostridium perfringens en esta prueba se manifiesta por un área de crecimiento blanco y denso que rodea las líneas de siembra, únicamente de la mitad de la placa en la que no existe antitoxina Cl. perfringens tipo A. La fermentación de la lactosa hace que aparezca color rojo en el medio de cultivo, a lo largo de la línea de siembra. Técnica para la numeración en medio líquido A partir de la «serie de diluciones decimales», utilizando como diluyente solución de Ringer con cisteína (v. pág. 108), regenerado durante 10 minutos en baño de agua hirviendo y enfriado inmediatamente, se procede como sigue: Sembrar 1 ml de cada uno de los tubos de la serie, por duplicado, en otros tantos tubos con caldo CLS (v. pág. 109) regenerado, evitando que se mezcle en exceso para mantener correctamente las condiciones de anaerobiosis. Incubar a 46 °C durante 18-24 horas en anaerobiosis. La presencia de Cl. perfringens se manifiesta por un precipitado de sulfuro de hierro que señala su poder sulfito-reductor. La aparición de gas en la campana Durham revela la fermentación de la lactosa con producción de gas. Los tubos positivos se multiplican por el factor de dilución para saber el número de Cl. perfringens por gramo o mililitro de alimento. Es un método sencillo, que selecciona a Cl. perfringens de otros Clostridium sulfito-reductores. Únicamente tiene interferencias con Cl. parapeifringens, pero hay que tener en cuenta que la presencia de este último germen en los alimentos es muy rara. PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TIPO A Para la detección de cepas enterotoxigénicas de Cl. peifringens tipo A, existen pruebas DNA que se utilizan en laboratorios especializados (Van Damme, 1990). Para el manejo en laboratorios con menos recursos, existen métodos miniaturizados preparados comercialmente, que se utilizan para la identificación de las formas vegetativas: — API 20A (galería de identificación bioquímica de bacterias anaerobias estrictas). — API ATB 32A8 (galería de identificación rápida de bacterias anaerobias estrictas). — An IDENT (identificación de anaerobios) — Minitek anaerobios. Son una alternativa a los métodos convencionales, con la ventaja de poder estudiar gran cantidad de caracteres y utilizar menos tiempo.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Para la puesta en evidencia de las enterotoxinas elaboradas por Cl. peifiingens tipo A, se han utilizado diversos métodos: — — — —
Métodos biológicos. Métodos serológicos. Métodos inmunoenzimáticos. Métodos de cultivos celulares.
Los métodos biológicos incluyen: — La medida del líquido acumulado en el asa ileal ligada del conejo. Es la técnica biológica más antigua. — La ingestión oral (con resultado de diarrea) o la inoculación de la toxina a analizar en el estómago de ratones (con resultado de muerte). — La medida de la actividad eritematosa y el incremento de la permeabilidad capilar en la piel de cobayas por inoculación intradérmica de la toxina. Estos primeros métodos han sido sustituidos por técnicas serológicas. Estas técnicas se utilizan para la detección de enterotoxina de Cl. perfringens tipo A a partir de filtrados de cultivo. Durante cierto tiempo se utilizaron métodos basados en técnicas de inmunoprecipitación: — — — —
Doble gel difusión en agar. Electroinmunodifusión. Contrainmunoelectroforesis. Gel difusión simple.
Recientemente, basándose en la prueba RPLA (Reversed Passive Látex Agglutination) se ha elaborado un Kit sensible y sencillo. Se utiliza para la detección de enterotoxinas en heces y en filtrados de cultivos bacterianos. Este Kit RPLA (Denka-Seken; Unipath), permite a los laboratorios corrientes determinar la producción de enterotoxina en el sobrenadante de filtrados de cultivos bacterianos y en muestras de heces, como ya se ha señalado. El método se considera eficaz para la determinación y cuantificación de la enterotoxina. Su sensibilidad alcanza, aproximadamente, 3 ng/ml. Es menos sensible que el método ELISA, pero tiene la ventaja de ser de fácil manejo y utilizar reactivos sencillos. El método ELISA para la investigación de enterotoxina elaborada por Cl. perfringens tipo A, requiere una técnica estándar aplicada sobre el crecimiento colonial obtenido en una placa de agar. Es una técnica inmunoenzimática. Las colonias crecidas durante 48 horas se separan con papel de filtro. En su lugar se colocan discos de nitrocelulosa para absorber la enterotoxina que se detecta en 24 horas por el método ELISA (Stelma, 1985). En años recientes, han adquirido mucho interés las pruebas con tejidos celulares (Mahoney, 1989). PREVENCIÓN Y CONTROL DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TIPO A Cl. perfringens tipo A, como ya se ha señalado, es una bacteria esporulada (los esporos no se suelen ver in vitro), inmóvil, anaerobia, con cápsula la mayoría de
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las veces, que se encuentra muy distribuida en el suelo y que reside normalmente en el tracto intestinal del hombre y algunos animales. En el suelo se ha aislado a niveles de 103-a 104 cfu/gramo de las muestras examinadas. Se caracteriza por su capacidad para producir toxiinfección alimentaria, y los factores biológicos que posee para llevar a cabo esta capacidad, incluyen su formación de endosporos resistentes que sobreviven a la cocción de los alimentos, el crecimiento extraordinariamente rápido de sus formas vegetativas a temperatura elevada y su síntesis de enterotoxina en el intestino humano. Los brotes de intoxicación producidos por Cl. perfiingens tipo A no tienen una localización geográfica específica, dada su ubicuidad. Por causas que se desconocen, son más frecuentes los casos de intoxicación producidos por este microorganismo en primavera y otoño. La intoxicación alimentaria producida por Cl. perfringens tipo A suele ser de carácter benigno y se manifiesta, principalmente, con diarrea profusa y dolor abdominal. Son raros otros síntomas como fiebre y nauseas. La enterotoxina no produce lesiones en la mucosa intestinal y la enfermedad remite espontáneamente en 24-48 horas, sin dejar secuelas. El periodo de incubación oscila entre 6-24 horas, con una media de 12 horas. Existen informes de aparición de síntomas tan baja como 2 horas y tan alta como 26 horas. La aparición de síntomas en estos tiempos después de la ingestión de la comida causante de la intoxicación, se explica por ser el tiempo necesario para que se produzca la esporulación de las formas vegetativas en el intestino. La intoxicación aparece cuando se ingieren gran cantidad de células vegetativas de Cl. perfringens tipo A enterotoxigénico (aproximadamente 108), que eluden las condiciones acidas del estómago. Las células ingeridas crecen y esporulan en el intestino delgado, fase en la que se elabora la enterotoxina que luego se libera por estallido del esporangio. La formación de la enterotoxina en el intestino conlleva ciertos efectos patológicos, incluyendo secreción de agua y sal en el lumen y una rápida motilidad intestinal. Dicha enterotoxina es termolábil, inactivándose a 60 °C aplicados durante 5 minutos. Se localiza con toda probabilidad en la pared del esporo (Stelma, 1985). Es una proteína con peso molecular aproximado a 34.000 daltons. Pierde su actividad por tratamiento con pronasa. No todas las cepas de Cl. perfringens tipo A son capaces de producir una enterotoxina responsable de enterotoxigenicidad. La mayoría de los brotes de intoxicación por Cl. perfringens tipo A se producen por la ingestión de preparados cárnicos o ave cocinados en forma de asado o guiso, dejados varias horas a temperatura ambiente en la cocina, o bien refrigerados en grandes masas lo que no permite que llegue el frío rápidamente al interior, con lo que se crea un ambiente propicio para que se produzca el crecimiento y multiplicación del germen. Los alimentos más propicios para que se origine una intoxicación alimentaria de este tipo, son productos proteicos, como carne de bóvido, pollo, pato y otras aves. Las especias y similares contienen esporos con mucha frecuencia. Los esporos presentes en los alimentos crudos no se destruyen al ser cocinados los productos sino que, incluso, el calor puede favorecer su germinación. Por otra parte, la cocción de los alimentos destruye gran cantidad de la flora vegetativa contaminante que los acompaña por lo que, al no tener competición, Cl. perfringens crece en libertad y en las mejores condiciones. Ocurre también que un alimento cocinado y contaminado posteriormente a su preparación, no se recalienta sufi-
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cientemente antes de ser consumido, práctica imprescindible para destruir las formas vegetativas de Cl. perfringens tipo A. Este microorganismo está muy extendido en la naturaleza: suelo, barro, vegetación, etc., desde donde se dispersa a través del polvo o mediante insectos que contactan con el suelo o heces. Está invariablemente presente en aguas residuales y sedimentos marinos. La presencia de Cl. perfringens en agua potable sirve de índice de polución fecal antigua. La temperatura óptima de crecimiento de la mayoría de las cepas de Cl, perfringens tipo A es, aproximadamente, 45 °C. No crece de forma significativa por debajo de 20 °C. Crece a pH comprendido entre 5.5 y 8.0-9.0. El pH óptimo está entre 6.5-7.0. Su aw óptima está entre 0.95-0.96.
Condiciones de crecimiento de Cl. perfringens tipo A Mínima Temperatura (°C) PH 12 5,5-5,8 aw 0,97
Óptima 43-45 6,5-7,0 0,95-0,96
Máxima 50 8,0-9,0 0,93
Condiciones óptimas de esporulación: temperatura óptima 35-40 ºC. pH 6.0 – 8.0
Por su carácter ubicuitario es imposible eliminar a este microorganismo como contaminante de la mayoría de los alimentos. La temperatura es el factor más importante en el control de Cl. perfringens; el enfriamiento por debajo de 10 °C es, normalmente, un medio de control muy eficaz. El crecimiento del germen no se produce durante las 2 primeras horas posteriores al cocinado, pero dicho crecimiento se hace extraordinariamente rápido cuando se alcanza la temperatura óptima de crecimiento (43-45 °C), con un tiempo medio generacional de 10-12 minutos. Como el germen es capaz de crecer a temperatura tan alta como 50 °C, las formas vegetativas se destruyen calentando el alimento a 75 °C. Esta temperatura se alcanza con el recalentamiento del producto cocinado, pero frío, antes de ser consumido. Casi todas las intoxicaciones ocasionadas por la enterotoxina de Cl.peifringens tipo A, se podrían haber evitado con buenas prácticas de manipulación referidas a un enfriamiento rápido y un recalentamiento completo que llegue hasta lo más profundo antes de ser consumido el alimento. El objetivo de la prevención es evitar el crecimiento excesivo de las formas vegetativas. Como los esporos, tan ampliamente distribuidos en la naturaleza, son termorresistentes, sobrevivirán a la cocción por lo que los alimentos, siempre que sea posible, se prepararán y consumirán recién cocinados. Los alimentos calientes se mantendrán en estas condiciones a temperatura superior a 60 °C hasta su consumo. Los alimentos que deban ser sometidos a conservación, se enfriarán rápidamente a temperatura inferior a 7 °C en toda su masa y se recalentarán entre 71 -100 °C para destruir las formas vegetativas antes de su consumo.
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Para evitar la aparición de toxiinfecciones alimentarias por Cl. perfringens tipo A conviene, además, limitar la contaminación de los alimentos en su estado crudo. En el caso concreto de las carnes, es necesario respetar estrictamente las condiciones higiénicas del sacrificio y las manipulaciones posteriores efectuadas en el matadero, transporte y venta. En todos los casos, el control de la temperatura es el punto primordial para afianzar la seguridad del consumidor (Hall, 1986).
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Recuento total de microorganismos psicrotróficos
Microorganismos psicrotróficos son los que pueden formar colonias visibles (o enturbiamiento) a temperaturas de refrigeración. En términos generales, psicrotrofo significa desarrollo a bajas temperaturas, por lo que, en un sentido amplio, son psicrotróficos todos los microorganismos que pueden crecer y multiplicarse en frío. De forma más concreta, se puede decir que son psicrotróficos los microorganismos que exigen o toleran temperaturas bajas para su crecimiento, comprendidas entre 4 y 20 °C. Para ser más precisos, serían psicrotróficos los gérmenes que, aunque se multiplican a temperaturas propias de refrigeración (0 y + 6 °C), su temperatura óptima de crecimiento se estima entre + 10 y +20 °C; son psicrófilos los que exigen temperaturas bajas y tienen su óptimo crecimiento a 0 °C o sus proximidades. Dentro del grupo de los psicrotróficos, hay especies de los géneros: — — — — — — — — — — — —
Achromobacter. Pseudomonas, pigmentadas o no. Flavobacterium. Alcaligenes. Aeromonas. Klebsiella. Enterobacter. Escherichia. Proteus. Hafnia. Serratia. Acinetobacter.
Todas las especies tienen en común ser bacilos gramnegativos. Entre los gérmenes grampositivos, son psicrotróficas algunas especies de los géneros: — Bacillus. — Corynebacterium. — Lactobacillus. 117
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— Streptococcus. — Staphylococcus. — Micrococcus. Hay que tener en cuenta que, entre las bacterias psicrotróficas, algunas especies son patógenas para el hombre, como Yersinia entemcolitica, Listeria monocytogenes y Clostridium botulinum tipo E. Su aislamiento necesita técnicas especiales. Se entiende por recuento total de microorganismos psicrotroficos revivificables, según la técnica que se describe en este capitulo, el número de colonias no puntiformes que se desarrollan a partir de 1 g ó 1 mi de alimento, sobre los medios agar King y/o agar GSP durante 5 días a temperatura de 17 °C. MATERIAL — — — — —
Pipetas estériles de 1 ml. Placas de Petri de 90 mm de diámetro. Estufa de cultivo regulada a 17 °C. Cuenta colonias. Asas de vidrio estériles.
MEDIOS DE CULTIVO Solución de Ringer 1/4 Composición: Cloruro sódico Cloruro cálcico anhidro Hidrógeno carbonato sódico Agua destilada
9g 0,42 g 0,20 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua y, para su uso, diluir una parte de esta solución con tres partes de agua destilada, para obtener la solución de Ringer 1/4. Distribuir en tubos a razón de 9 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Medio agar King F G Composición: Peptona Maltosa Fosfato potásico Sulfato magnésico Cloruro sódico Agar Agua destilada
20 g 10 g 1,50 g 0,75 g 5g 15 g 1.000 ml
RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS PSICROTRÓPICOS
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Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Enfriar a 50 °C y añadir, asépticamente, 2 mi de una solución de cristal violeta al 0,05 por 100, esterilizada por filtración Mezclar bien antes de su distribución en placas de Petri. Agar GSP (selectivo para Pseudomonas y Aeromonas) Composición: Glutamato sódico Almidón hidrosoluble Dihidrogenofosfato potásico Sulfato de magnesio Rojo fenol Agar Agua destilada
10 g 20 g 2g 0,50 g 0,36 g 12 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7,2 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45 °C e incorporar, asépticamente, 100.000 Ul de penicilina G sódica/litro. Mezclar bien y preparar placas de Petri. TÉCNICA Antes de describir la técnica, hay que decir que se puede utilizar cualquier medio de los que se emplean para el recuento total de aerobios, siempre que la incubación se realice a 5 °C durante 7-10 días. En este capítulo se describen dos medios selectivos (v. antes) que se utilizan en la investigación y recuento de psicwtróficos, teniendo en cuenta la flora predominante dentro de este grupo. A partir de la «serie de diluciones decimales», utilizando como diluyente solución Ringer 1/4 (v. antes), se siembra, por duplicado, 0,1 mi de cada dilución, sobre la superficie bien seca de placas de Petri con agar King FG (v. antes) y/o agar GSP (v. antes). Diseminar cuidadosamente con asa de vidrio estéril. Incubar a 17 °C durante 5 días. Finalizada la incubación, se cuentan, en las placas de ambos medios, las colonias no puntiformes que hayan crecido. El número se multiplica por el factor de dilución de la placa elegido para el recuento. Esta cifra corresponde a 0,1 ml que, al ser multiplicada por 10, da el recuento total de microorganismos psicotróficos por gramo o mililitro del alimento en estudio.
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Investigación de estreptococos fecales
Dentro del grupo de cocos grampositivos, según clasificación de Bergey 9.a edición, 1984), se encuentra el género Streptococcus. Los miembros de este género se caracterizan por su forma cocoide y por su agrupación en parejas o en cadenas. Son, generalmente, inmóviles, no esporulados, grampositivos y catalasanegativos, microaerófilos o anaerobios facultativos. De acuerdo con el esquema de Lancefield, se agrupan antigénicamente mediante las letras A, B, C, D, etc. Al grupo D de Lancefield pertenecen los estreptococos fecales, por ser su habitat normal el tubo digestivo de animales de sangre caliente. Entre sus características peculiares, está el poder crecer a temperatura de 45 °C y en medios con 4 por 100 de bilis. Dentro de los estreptococos fecales, están los enterococos (Streptococcus faecalis y sus variedades Str.faecium y Str. durans) que viven generalmente en el intestino humano. Otros estreptococos fecales viven en los animales (Str. equi y Str. bovis). Los estreptococos son considerados indicadores de contaminación fecal y su presencia en los alimentos indica falta de higiene o condiciones de conservación defectuosas, excepto en alimentos en los que interviene como flora habitual de procesos fermentativos. Son muy resistentes a las condiciones adversas (congelación, desecación, tratamiento térmico, etc.) por lo que se consideran buenos indicadores para valorar, precisamente, las condiciones higiénicas y de conservación de alimentos congelados y desecados cuando aparecen en cifras elevadas. De todas formas, su utilización como índice de contaminación fecal del agua viene siendo habitual desde hace tiempo; su valor como indicador en los alimentos es más discutido. MATERIAL — — — —
Pipetas estériles de 1 ml Estufa de cultivo Asas de vidrio estériles Asa de cultivo 121
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MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Caldo presuntivo kanamicina-aesculina-azida (KAA) Composición: Triptona Extracto de levadura Cloruro sódico Citrato sódico Esculina Citrato férrico amónico Azida sódica Sulfato de kanamicina Agua destilada
20 g 5g 5g 1g 1g 0,50 g 0,15 g 0,02 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7 ± 0,2 y distribuir en tubos de ensayo a razón de 10 mi. Esterilizar en autoclave a temperatura de 121 °C durante 15 minutos. Agar confirmativo kanamicina-aesculina-azida (KAA) Composición: Triptona Extracto de levadura Cloruro sódico Citrato sódico Esculina Citrato férrico amónico Azida sódica Sulfato de kanamicina Agar Agua destilada
20 g 5g 5g 1g 1g 0,50 g 0,15 g 0,02 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7 ± 0,2 y distribuir a razón de 15 mi en tubos o matraces. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Preparar placas de Petri. Caldo cerebro corazón (Brain Heart Infusión: BHI) (v. pág. 79) Agar-esculina-bilis Composición: Extracto de carne Peptona Sales biliares
3g 5g 40 g
INVESTIGACIÓN DE ESTREPTOCOCOS FECALES
Citrato férrico amónico Esculina Agar Agua destilada
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0,50 g 1g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento el extracto de carne, la peptona y el agar en 400 ml de agua destilada. Por otra parte, se disuelven las sales biliares en 100 ml de agua destilada y el citrato férrico amónico en otros 100 ml de agua destilada. Mezclar todas las soluciones y completar hasta 1.000 ml con agua destilada. Calentar la mezcla hasta la completa disolución de los ingredientes. Ajustar el pH a 7,4 y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Enfriar a temperatura de 50 °C y añadir 100 mi de solución de esculina al 1 por 100, esterilizada por filtración. Distribuir, asépticamente, en tubos de ensayo y dejar solidificar en posición inclinada. Caldo cerebro corazón (Brain Heart Infusión: BHI) con 6,5 por 100 de cloruro sódico La misma fórmula que el caldo BHI (v. pág. 79), añadiendo 65 g de cloruro sódico por litro de medio. Caldo de Rhote simple Composición: Peptona Glucosa Cloruro sódico Hidrógeno fosfato dipotásico Dihidrógeno fosfato potásico Azida sódica Agua destilada
20 g 5g 5g 2,70 g 2,70 g 0,20 g 1.000 ml
Disolver. Ajustar el pH a 6,8 ± 0,2. Distribuir en tubos a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Caldo de Litsky Composición: Peptona 20 Glucosa Cloruro sódico Hidrógeno fosfato dipotásico Dihidrógeno fosfato potásico Azida sódica
g 5g 5g 2,70 g 2,70 g 0,30 g
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Violeta de etilo Agua destilada
0,0005 g 1.000 ml
Disolver. Ajustar el pH a 6,8 ± 0,2. Distribuir a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Medio de Barnes al trifenil tetrazolio Composición: Peptona Extracto de carne Glucosa Agar Agua destilada
10 g 10 g 10 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 6,0 ± 0,2. Distribuir en matraces a razón de 100 ml. Esterilizar en autoclave al 21 °C durante 15 minutos. Atemperar o fundir a 50 °C y añadir, por cada 100 ml de medio: Acetato de talio al 2 por 100: Cloruro trifenil tetrazolio 0,2 por 100
5 ml 5 ml
Mezclar bien y preparar placas de Petri. Equipo de coloración de Gram Agua oxigenada de 10 volúmenes INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE STREPTOCOCCUS D DE LANCEFIELD Investigación de Streptococcus D de Lancefield en medios sólidos Prueba presuntiva A partir de la suspensión madre del alimento, y por duplicado, sembrar 1 mililitro de dicha suspensión en tubos con 10 ml de caldo presuntivo (KAA) (v. pág. 122). Incubar en estufa a 37 °C durante 24 horas. Los tubos positivos muestran ennegrecimiento por hidrólisis de la esculina, característica propia de este organismo. Prueba confirmativa De los tubos positivos en caldo KAA se siembra 0,1 mi sobre la superficie bien seca de agar KAA (v. pág. 122) contenido en placas de Petri, diseminando el inoculo con asa de vidrio estéril. Incubar a 37 °C durante 24 horas. Son positivas
INVESTIGACIÓN DE ESTREPTOCOCOS FECALES
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las pequeñas colonias que muestran un halo negro a su alrededor, por hidrólisis de la esculina. La azida sódica y el sulfato de kanamicina inhiben el crecimiento de la flora acompañante. Otras pruebas confirmativas Tinción de Gram El aspecto microscópico de los integrantes de este grupo bacteriano es de cocos agrupados en cadenas cortas y grampositivos. Catalasa Se determina la presencia de catalasa añadiendo 1 ml de agua oxigenada de 10 volúmenes en un cultivo reciente del germen problema en caldo BHI (v. pág. 79), pero nunca en medios que contengan azida sódica. En caso positivo, se producen burbujas por desprendimiento de oxígeno. El grupo Streptococcus D de Lancefield es catalasa-negativo. Crecimiento en agar-esculina-bilis Todos los Streptococcus D de Lancefield crecen en el medio agar esculina bilis (v. pág. 122), al tolerar la bilis en su crecimiento y ser capaces de hidrolizar la esculina. Crecimiento en presencia de cloruro sódico al 6,5 por 100 Los enterococos, dentro del grupo Streptococcus D de Lancefield, crecen en caldo BHI con 6,5 por 100 de cloruro sódico (v. pág. 123), previa incubación a 37 °C durante 72 horas. Streptococcus equi y Streptococcus bovis no crecen en este medio. Crecimiento a 45 °C Todo el grupo crece a 45 °C. Investigación y recuento de estreptococos del grupo D de Lancefield en medio líquido Investigación por la técnica del Número Más Probable (NMP) Prueba presuntiva A partir de la «serie de diluciones decimales», y por duplicado, sembrar 1 mililitro de la dilución 1:10 en cada uno de una primera serie de tres tubos conteniendo 10 ml de caldo presuntivo KAA (v. pág. 122). De la dilución 1:100, sembrar I ml en cada uno de una segunda serie de tres tubos con 10 ml del mismo medio. De la dilución 1:1.000, sembrar 1 ml en cada uno de una tercera y última serie de tres tubos con 10 ml de caldo KAA. Incubar las tres series de tubos en estufa a 37 °C durante 24 horas. Aquellos tubos en los que aparezca un ennegrecimiento del medio, por hidrólisis de la esculina se considerarán positivos.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Prueba confirmativa A partir de los tubos positivos en caldo KAA, se resiembra 1 mi sobre la superficie bien seca de agar confirmativo KAA (v. pág. 122), contenido en placas de Petri. Incubar a 37 °C durante 24 horas. Se consideran positivas las colonias rodeadas de halos negros, por hidrólisis de la esculina. El número de Streptococcus D de Lancefield por gramo o mililitro de muestra se obtiene por lectura en la Tabla del NMP de 3 series de 3 tubos (v. pág. 19), de acuerdo con los tubos positivos en caldo KAA y que han sido confirmados en agar confirmativo (KAA). Otras pruebas confirmativas (v. pág. 125) OTRO MÉTODO PARA LA INVESTIGACIÓN DE STREPTOCOCCVS D DE LANCEFIELD Para la prueba presuntiva, se parte de la suspensión madre de la muestra (1:10). Sembrar 1 ml de esta suspensión en 10 ml de caldo de Rhote simple (v. pág. 123). Incubar a 37 °C durante 24-48 horas. En caso positivo, se produce enturbiamiento. El agente selectivo de este medio es la azida sódica. Para la prueba confirmativa, se agitan los tubos del cultivo obtenido sobre el medio de Rhote y, con asa de cultivo, se hace una siembra sobre caldo de Litsky (v. pág. 123). Incubar a 37 °C durante 24-48 horas. En caso positivo, se enturbia el medio y se forma, a veces, un depósito violeta en el fondo del tubo; en el caso de formarse el depósito violeta, el enturbiamiento del medio suele ser más ligero. En este medio son agentes selectivos la azida sódica y el violeta de etilo. El cultivo se puede confirmar sembrando en la superficie bien seca de agar Barnes trifenil terazolio (v. pág. 124). Incubar a 37 °C durante 24-48 horas. Las colonias del grupo Streptococcus D de Lancefield (estreptococos fecales) crecen en el medio de Barnes de la siguiente forma: — Str. faecalis y sus variedades: colonias con centro rojo oscuro y áureo la blanca. — Str. faecutm y Str. durans. colonias blancas o rosadas. — Str. bovis y Str. equi: colonias muy pequeñas, blancas o rojas. Otras pruebas confirmativas (v. pág. 125)
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Investigación y recuento de Vibrio parahaemolyticus
El Vibrio parahaemolyticus es un germen halofílico marino ampliamente distribuido en el agua de las costas, sedimento y plancton, que produce una gastroenteritis aguda al ingerir pescados o mariscos crudos, insuficientemente cocidos o contaminados después de su preparación culinaria. Es únicamente patógeno para el hombre. No se encuentra en heces de individuos sanos, pero es abundante en las de enfermos afectados de esta gastroenteritis. Se encuentra en aguas costeras y de estuarios cuando su temperatura es superior a los 15 °C, razón por la cual se aisla, preferentemente, del agua en verano. Como consecuencia de su presencia en el agua, esta especie bacteriana se encuentra en peces, crustáceos y moluscos de costas y estuarios. El V. parahaemolyticus pertenece a la familia Vibrionaceae. Esta especie está integrada por formas bacilares con tendencia al pleomorfismo, sin esporos ni cápsulas. Son formas móviles, por un flagelo polar único. Gramnegativas. Anaerobias facultativas, necesitan para su desarrollo tasas de sal del 3 por 100. Su crecimiento es más activo entre valores de pH 7,5 a 8,5. Crecen entre 15-43 °C, con temperatura óptima a 37 °C. Se multiplican con tasas de cloruro sódico del 6 y 8 por 100, pero no con 10 por 100. No se multiplican en ausencia de cloruro sódico. Decarboxilan la lisina y la ornitina. Fermentan el manitol y la arabinosa no fermentan la sacarosa ni la lactosa. No forman acetil-metil-carbinol (prueba de Voges Proskauer negativa). El desarrollo de esta bacteria es muy rápido: tiene un tiempo generacional de 10-15 minutos, lo que hace que la presencia de un pequeño número, en pescado recién capturado, se transforme en una cifra elevada al cabo de algunas horas, si la temperatura es favorable. El V. parahaemolyticus deja de desarrollarse entre 5 y 8 °C. Se desarrolla, muy lentamente, a 10 °C. La congelación, además de evitar su desarrollo, logra su decrecimiento; el calor destruye a este microorganismo a 60 °C, aplicado durante 15 minutos. La enfermedad gastroentérica producida por esta especie bacteriana se origina, principalmente, por la ingestión de pescado y marisco crudos, poco cocidos o contaminados después de su preparación culinaria con productos crudos o material contaminado. 127
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
El V. parahaemolyticus se localiza, habitualmente, en la superficie de la piel, agallas e intestino de los alimentos del mar y en aguas costeras durante los meses calurosos. MATERIAL — — — — — — —
Matraces Erlenmeyer. Asa de cultivo. Tubos de 16 x 160 mm. Gradillas. Placas de Petri de 90 mm. Estufa de cultivo regulada a 37 °C. Estufa de cultivo regulada a 42 °C.
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Solución salina al 3 por 100 Composición: Cloruro sódico Agua destilada
30 g 1.000 ml
Disolver. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Caldo glucosa sal con Teepol (Glucosa Salt Teepol Broth: GSTB), simple Composición: Extracto de carne Triptona Cloruro sódico Glucosa Violeta de metilo Teepol 610 Agua destilada
30 g 10 g 30 g 5g 0,002 g 4 ml 1.000 ml
Disolver en agua caliente. Ajustar el pH a 8,4. Distribuir en tubos a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Caldo glucosa sal con Teepol (Glucosa Salt Teepol Broth: GSTB), doble fuerza Composición: Extracto de carne Triptona Cloruro sódico
6g 20 g 60 g
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
Glucosa Violeta de metilo Teepolólo Agua destilada
129
10 g 0,004 g 8 ml 1.000 ml
Disolver en agua caliente. Ajusfar el pH a 8,4. Distribuir en matraces de 500 ml a razón de 100 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Caldo sal colistina (Salt Colistine Broth: SCB), simple Composición: Extracto de levadura Triptona Cloruro sódico Agua destilada
3g 10 g 20 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en agua caliente. Ajusfar el pH a 7,4. Añadir, asépticamente, 0,5 g de metansulfonato de colistina o 0,25 g de polimixina B y disolver. ESTE MEDIO NO SE DEBE CALENTAR. Distribuir, asépticamente, a razón de 10 ml en tubos de ensayo estériles. Caldo sal colistina (Salt Colistine Brolh: SCB), doble fuerza Composición: Extracto de levadura Triptona Cloruro sódico Agua destilada
6g 20 g 40 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en agua caliente. Ajustar el pH a 7,4. Añadir, asépticamente, 1 g de metansulfonato de colistina o 0,5 g de polimixina B y disolver. ESTE MEDIO NO SE DEBE CALENTAR. Distribuir, asépticamente, en matraces de 500 ml estériles, a razón de 100 ml. Caldo de enriquecimiento selectivo sal polimixina (CSP), simple Composición: Extracto de levadura Peptona Cloruro sódico Polimixina B Agua destilada
6g 20 g 40 g 250 U/ml 1.000 ml
Disolver los ingredientes en agua por calentamiento. Ajustar el pH a 8,6. Distribuir asépticamente en tubos estériles a razón de 10 ml. NO SE ESTERILIZA EN AUTOCLAVE.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Caldo de enriquecimiento selectivo sal polimixina (CSP), doble fuerza Tiene la misma composición que el medio simple (v. pág. 129), con el doble de cada uno de los ingredientes para el mismo volumen de agua destilada. Agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose: TCBS) Composición: Peptona de caseína Peptona de carne Extracto de levadura Citrato sódico Tiosulfato sódico Bilis de buey desecada Colato sódico Sacarosa Cloruro sódico Citrato de hierro Azul de timol Azul de bromotimol Agar Agua destilada
5g 5g 5g 10 g 10 g 5g 3g 20 g 10 g 1g 0,04 g 0,04 g 14 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 8,6. ESTE MEDIO NO NECESITA AUTOCLAVE. Distribuir, asépticamente, en placas de Petri estériles de 90 mm, a razón de 15 ml. Agua de triptona (Tryptone Water: TW) con 3 por 100 de cloruro sódico Composición: Triptona Cloruro sódico Agua destilada
10 g 30 g 1.000 ml
Disolver. Ajustar el pH a 7,5. Distribuir en tubos de ensayo a razón de 10 mililitros. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Agar nutritivo con 3 por 100 de cloruro sódico Composición: Triptona Extracto de levadura Glucosa
5g 2,50 g 1g
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
Cloruro sódico Agar Agua destilada
131
30 g 12 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7,5. Distribuir en tubos o matraces. Esterilizaren autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Agar hierro triple azúcar (Triple Sugar Iron: TSI) con 3 por 100 de cloruro sódico Composición: Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Cloruro sódico Lactosa Sacarosa Glucosa Citrato férrico Tiosulfato sódico Rojo fenol Agua destilada
3g 3g 20 g 30 g 10 g 10 g 1g 0,30 g 0,30 g 0,024 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7.4. Distribuir en tubos. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Dejar solidificar en posición inclinada para obtener una columna en el fondo de 3 centímetros de altura y una superficie inclinada de 5 cm. Agar semisólido para la prueba de Voges Proskauer Composición: Extracto de levadura Tripticasa Peptona de soja Glucosa Cloruro sódico Agar Agua destilada
1g 7g 5g 10 g 10 g 3g 1.000 ml
Disolver a corriente de vapor. Ajustar el pH a 7,5. Distribuir en tubos a razón de 3 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Reactivo para la prueba de Voges Proskauer Solución A Solución alcohólica del alfa-naftol al 5 por 100. Conservar en frasco topacio, en lugar fresco.
132
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Solución B Hidróxido potásico Creatina Agua destilada
40 g 0,30 g 100 ml
Caldo lisina decarboxilasa con 3 por 100 de cloruro sódico Composición: Extracto de levadura Glucosa L-Lisina Púrpura de bromocresol Cloruro sódico Agua destilada
3g 1g 5g 0,016 g 30 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes por calentamiento. Ajustar el pH a 7,5. Distribuir en tubos con tapón a rosca a razón de 5 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Agar triptona soja tetrazolio (Triptone Soya Agar Tetrazolio) Composición: Agar triptona soja (TSA) Sacarosa Cloruro sódico Sales biliares Cloruro trifenil tetrazolio 1 por 100 Agua destilada
40 g 20 g 25 g 0,50 g 3g 1.000 ml
Disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7,5. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Enfriar a 47 °C y distribuir en placas de Petri a razón de 15 ml. El medio se conserva durante 15 días. Agar Wagatsuma Composición: Extracto de levadura Tripticasa Cloruro sódico Manitol Cristal violeta Agar Agua destilada
5g 10 g 70 g 5g 0,001 g 15 g 1.000 ml
Calentar suavemente hasta ebullición. Enfriar a 50 °C Por cada 100 ml de medio, añadir 10 ml de una suspensión de hematíes humanos al 20 por 100 lavados. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Distribuir en placas de Petri estériles.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
133
Medio para comprobar la tolerancia a la sal Composición: Peptona Cloruro sódico Agua destilada
10 g 0 g; 80 g ó 100 g 1.000 ml
Disolver. Distribuir en tubos a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Reactivo de Kovacs Composición: Paradimetilaminobenzaldehído Alcohol amílico Acido clorhídrico puro
5g 75 ml 25 ml
Se disuelve el aldehído en el alcohol, calentando a 60 °C en baño Maria. Dejar enfriar y añadir, gota a gota, el ácido, con lo que se obtiene un líquido color amarillo-dorado. Conservar en frigorífico en frasco topacio y al abrigo de la luz. Discos de compuesto vibriostático 0/129 (2,4 diamino 6,7 diisopropilpteridina) El producto está comercializado. Agar Mueller-Hinton Composición: Infusión de carne de bóvido Hidrolizado de caseína Almidón Agar Agua destilada
300 ml 17,50 g 1,50 g 10 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7,4. Distribuir en matraces o tubos a razón de 25 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. TÉCNICA Se describen dos técnicas: — Recuento por el Número Más Probable (NMP). — Presencia-Ausencia.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Técnica del Número Más Probable (NMP) Preparar la serie de diluciones decimales, utilizando como diluyente solución salina al 3 por 100 (v. pág. 128). En tres series de 5 tubos cada una, que contengan como medios de enriquecimiento selectivo: — Caldo glucosa sal con Teepol (GSTB), simple (v. pág. 128). — O caldo sal colistina (SCB), simple (v. pág. 129). — O bien caldo sal polimixina B (CSP), simple (v. pág. 129). Se siembra 1 mi de la dilución del alimento al 1:10 en cada uno de 5 tubos de la primera serie; 1 mi de la dilución del alimento al 1:100 en cada uno de los 5 tubos de la segunda serie y, finalmente, 1 mi de la dilución del alimento al 1:1.000 en cada uno de los 5 tubos de la tercera serie. Mezclar bien, agitando la gradilla, e incubar a 37 °C durante 18-20 horas. Pasado el tiempo de incubación, tomar una porción de la superficie de cada tubo que muestre enturbiamiento en el caldo de enriquecimiento elegido y sembrar, sobre la superficie bien seca del medio de aislamiento agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS) (v. pág. 130). Incubar a 37 °C durante 18-20 horas. Las colonias típicas de V. parahaemolyticus sobre el medio de cultivo de aislamiento son: redondas, grandes (2-3 mm de diámetro), con centro verde o azul (no hay viraje al amarillo porque el germen no fermenta la sacarosa). No crecen sobre el medio TCBS las Enterobacteriaceae ni las bacterias grampositivas, o aparecen como colonias diminutas. Las colonias con aspecto típico de V. parahaemolyticus serán sometidas a confirmación. Pruebas confirmativas Seleccionar un minino de 3 colonias típicas crecidas sobre el agar de aislamiento selectivo TCBS para ser cultivadas en agua de triptona (TW) con 3 por 100 de cloruro sódico (v. pág. 130). Incubar durante 2-4 horas, tiempo suficiente para que aparezca enturbiamiento. Del cultivo así obtenido, sembrar una gota sobre cada uno de los siguientes medios: — Caldo Usina decarboxilasa con 3 por 100 de cloruro sódico (v. pág. 132). — Agar semisólido para la investigación de acetil-metil-carbinol (prueba de Voges Proskauer; v. pág. 131). — Medio para comprobar la tolerancia a la sal (v. pág. 133), adicionado de: • • • •
0 por l00 de CINa. 6 por l00 de CINa. 8 por 100 de CINa. 10 por l00 de CINa.
— Agua de triptona con 3 por 100 de cloruro sódico (v. pág. 130). — Agar nutritivo con 3 por 100 de cloruro sódico (v. pág. 130), para investigación de citocromo-oxidasa. — Agar hierro triple azúcar (TSI) con 3 por 100 de cloruro sódico (v. pág. 131).
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
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El tubo que contiene caldo usina decarboxilasa, una vez sembrado, se cubre con una capa de parafina estéril. Incubar a 37 °C durante 18-20 horas. Si se decarboxila la lisina, el medio vira a rojo púrpura (alcalinización). El tubo que contiene agar semisolido para investigación de acetil-metilcarbinol, una vez sembrado, se incuba a 37 °C durante 18-20 horas. Mezclar 2 partes de solución A (v. pág. 131) y 1 parte de solución B (v. pág. 132). Añadir 0,5 ml de la mezcla al cultivo obtenido sobre agar semisolido y dejar a temperatura ambiente. La reacción positiva se manifiesta por la aparición de un color rojo. Los tubos que contienen medio con distintas tasas de cloruro sódico, una vez sembrados, se incuban a 37 °C durante 18-20 horas, preferentemente en baño María con agitación. Son positivos los tubos que presentan enturbiamiento. El tubo que contiene agua de triptona (TW) con 3 por 100 de cloruro sódico, una vez sembrado, se incuba a 42 °C durante 18-20 horas. La aparición de enturbiamiento es signo de crecimiento del germen a temperatura de 42 °C. El tubo que contiene agar nutritivo con 3 por 100 de cloruro sódico, una vez sembrado, se incuba a 37 °C durante 18-20 horas. Tomar con el asa una porción del crecimiento obtenido y hacer una extensión sobre una tira impregnada con el reactivo para la investigación de citocromooxidasa. La reacción es positiva cuando aparece una coloración violeta oscuro al poco tiempo. El tubo que contiene agar-hierro-triple azúcar (TSI), una vez sembrado abundantemente en la superficie y por picadura en el fondo, se incuba a 37 °C durante 18-20 horas. Las reacciones de V. parahaemolyticus en este medio son: Fondo del medio, amarillo (fermentación sin gas de la glucosa). Pendiente del medio, roja, sin cambio (no hay fermentación de sacarosa ni lactosa). Ennegrecimiento, no se produce, al no formar SH2. El tubo que contiene agua de triptona (TW) y 3 por 100 de cloruro sódico, una vez sembrado, se incuba a 37 °C durante 18-20 horas. Para investigar la producción de indol, añadir 1 mi del reactivo de Kovacs (v. pág. 133). En caso positivo, se forma un anillo rojo en la superficie. En una placa de Petri con una capa espesa de agar Mueller Hinton solidificada (v. pág. 133), sembrar, por inundación, un cultivo del germen en estudio obtenido sobre agua de triptona (TW) con 3 por 100 de cloruro sódico. Incubar a 37 °C durante 18-20 horas. Colocar con una pinza sobre el agar un disco del agente vibriostático 0/129 e incubar a 30 °C durante 18 horas. Cuando el germen es sensible al compuesto vibriostático 0/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropil-pteridina), aparece un halo de 15 mm o mayor, alrededor del disco.
Caracteres bioquímicos de Vibrio parahaemolyticus Medio
Prueba
TW 3% CINa TSI TSI TSI
Indol SH2 Fermentación glucosa Fermentación sacarosa
Reacción + + -
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Caracteres bioquímicos de Vibrio parahaemolyticus (Continuación) Medio
Prueba
TSI Lisina Agar VP Medio 0% CINa Medio 6% CINa Medio 5% CINa Medio 10% CINa TW 3% CINa 42 °C Agar nutritivo 3% CINa Agente vibriostático 0/129
Fermentación lactosa Decarboxilación Acetil-metil-carbinol Crecimiento Crecimiento Crecimiento Crecimiento Crecimiento Citocromooxidasa Inhibición
Reacción + + + + + +
Realizar la lectura de los tubos positivos confirmados en la Tabla del NMP de tres series de 5 tubos (v. pág. 38). Técnica de enriquecimiento para investigar Presencia-Ausencia A partir de la suspensión madre de la muestra (1:10) en solución salina al 3 por 100 (v. pág. 128), se mezcla 100 mi de esta suspensión con 100 mi de caldo de enriquecimiento glucosa sal con Teepol (GSTB), doble fuerza (v. pág. 128) o con caldo sal colistina (SCB), doble fuerza (v. pág. 129), o bien con caldo sal polimixina B (CSP), doble fuerza (v. pág. 130). Incubar a 37 °C durante 18-20 horas. De la superficie del cultivo obtenido en el caldo de enriquecimiento elegido, sembrar una porción sobre la superficie bien seca del medio de aislamiento selectivo agar citrato sales biliares sacarosa (TCBS) (v. pág. 130). Incubar a 37 °C durante 18-24 horas. Pasado el tiempo de incubación, observar el aspecto de las colonias. El V. parahaemolyticus, sobre el medio TCBS, da lugar a colonias redondas, grandes (2-3 mm) y con centro verde o azulado. Someter las colonias características a pruebas confirmativas (v. pág. 134).
DIFERENCIACIÓN ENTRE VIBRIO PARAHAEMOL YTICUS Y VIBRIO ALGINOL YTICUS En ocasiones conviene diferenciar estas dos especies bacterianas, que se pueden confundir fácilmente. A partir de un cultivo reciente del germen en estudio, se hace una siembra sobre la superficie bien seca del medio agar triptona soja tetrazolio (v. pág. 132). Incubar a 37 °C durante 18-20 horas. Las colonias de V. parahaemolyticus son de color rojo brillante; las de V. alginolyticus, blancas y más pequeñas. Ocasionalmente, pueden presentar unos centros minúsculos de color rojo.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
137
REACCIÓN DE KANAGAWA Esta reacción tiene por finalidad la detección de una hemolisis específica sobre un medio especial: agar Wagatsuma. La reacción positiva se relaciona con la patogenicidad de la cepa de V. parahaemolyticus aislada. Las cepas aisladas en casos de toxiinfección por esta bacteria son siempre Kanagawa-positivas; las procedentes de alimentos del mar son Kanagawa-negativas. A partir de un cultivo reciente sobre agua de triptona (TW) con 3 por 100 de cloruro sódico, hacer una picadura en uno o varios puntos de la superficie de agar Wagatsuma (v. pág. 132). Incubar a 37 °C durante 18-20 horas. La reacción es positiva cuando aparece una zona de hemolisis de 5 mm de diámetro alrededor de los puntos de siembra. PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS La identificación rápida de V. parahaemolyticus se puede lograr con un método reciente basado en una prueba fluorogénica ideada por Miwamoto en 1990 ). Las muestras se someten previamente a una fase de enriquecimiento en un medio a base de gluconato arabinosa durante 6-8 horas a 37 °C. El centrifugado de la muestra enriquecida se prueba usando el sustrato fluorogénico benzoil-arginina- 7aminometil-cumarina. Esta prueba detecta 10 células bacterianas en el transcurso de 10 horas. Con el procedimiento miniaturizado API 20E se estudian pruebas bioquímicas útiles para la identificación del germen y para conocer el efecto de la concentración de cloruro sódico sobre las reacciones bioquímicas de las cepas de V. parahaemolyticus. Los procedimientos más sensibles para la identificación de cepas de este microorganismo son los basados en DNA. Para la detección de la hemolisina propia de las cepas virulentas Kanagawa positivas, se han propuesto métodos inmunológicos: Enzyme Lynked Immuno Assay (ELISA) y Reversed Passive Hemagglutination (RPH). Estas pruebas son específicas, sensibles y capaces de detectar cantidades en nanogramos por mililitro de hemolisina termoestable. Para detectar la virulencia del germen se utiliza la reacción de Kanagawa. PREVENCIÓN Y CONTROL DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS Como ya se ha referido, V. parahaemolyticus es un microorganismo halófilo facultativo moderado (hasta 8 por 100 de CINa) que se aisla de aguas templadas del litoral marino y de alimentos del mar. La virulencia del germen está en estrecha relación con la prueba Kanagawa, tanto, que algunos investigadores sugieren que dicha prueba se utilice habitualmente en el laboratorio para distinguir cepas virulentas de las que no lo son. Los cultivos Kanagawa positivos dilatan el asa ileal ligada del conejo, mientras que los Kanagawa negativos no lo consiguen. Los V. parahaemolyticus Kanagawa positivos causan gastroenteritis aguda por consumo de alimentos contaminados durante los meses calurosos. El periodo de
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MICROBIOLOGÍA AUMENTARÍA
incubación es de 9-24 horas, aunque existen referencias de la aparición de síntomas a las 2 horas de la ingestión del producto contaminado y, por el contrario, mucho más tarde, a las 96 horas. La diarrea profusa es el síntoma predominante y se acompaña, normalmente, con dolor abdominal y nauseas. Otros síntomas como vómitos, dolor de cabeza, fiebre y escalofríos, son infrecuentes. La enfermedad remite a las 72 horas. La tasa de mortalidad es muy baja. La rápida aparición de los síntomas (12 horas por término medio) y sus signos característicos sugieren que en el proceso está implicada una enterotoxina, sugerencia que se apoya en la dilatación del asa ileal ligada del conejo en las cepas Kanagawa positivas. Se podría hacer referencia a ella como enterotoxina citotóxica. Esta enterotoxina es similar a la producida por V. cholerae. Para producir la enfermedad se necesitan, por lo general, 1O5-1O7 gérmenes aunque, a veces, se requiere un número menor de bacterias Kanagawa positivas. V. parahaemolyticus está muy distribuido en la naturaleza. Se encuentra en el litoral de aguas marinas y estuarios de países tropicales o templados, pero no en mar abierto, asociado con moluscos, crustáceos y peces. Como el crecimiento de este germen en el agua está en relación con la temperatura, no se aisla en ella cuando ésta es inferior a 15 °C. Entre 20-35 °C, una población moderada de V. parahaemolyticus (102-103/g), adquiere en 2-3 horas una tasa superior a 105 germenes/g. Muere a temperatura entre 0-5 °C. Es moderadamente sensible a la congelación, donde puede persistir largos periodos de tiempo. Respecto al calor, comienza a morir lentamente a 47 °C y, con rapidez, a partir de 60 °C, temperatura a la que sucumbe en 15 minutos. En cuanto al pH, se desarrolla entre valores 5.0-11.0, con óptima de 7.5-8.5. La cantidad mínima y máxima de CINa que requiere para su crecimiento está entre 0.5-8 por 100. La cifra óptima es 3 por 100. Como es un microorganismo mesófilo, se aisla normalmente en verano en regiones templadas; en zonas de agua caliente persiste todo el año. Se encuentra, generalmente, en alimentos que proceden del mar y. esporádicamente, en otros alimentos caracterizados por encontrarse en un ambiente salino, como vegetales conservados en salmuera. En Norteamérica y Europa, la mayoría de los brotes se deben al consumo de moluscos crudos (ostras y almejas) o a crustáceos cocidos recontaminados. En este último caso se refleja, además, poca higiene en la manipulación. Esta especie bacteriana, como V. cholerae, se caracteriza porque la susceptibilidad a padecer la enfermedad es mucho más alta en individuos con acidez estomacal disminuida. Actúa sin preferencias de edad o sexo. Además de portadores enfermos existen también portadores sanos. Los brotes de gastroenteritis por V. parahaemolyticus, en casi todos los casos, han sido el resultado del consumo de alimentos: — Mal refrigerados. — Sometidos a cocción insuficiente. — Recontaminados después de su cocción. En Oriente la fuente principal de infección por V. parahaemolyticus es el consumo de alimentos precocinados congelados pero, sobre todo, alimentos del mar consumidos crudos, preferentemente los importados de zonas del Caribe por la alta temperatura de sus aguas. El control de los signos de enfermedad producidos por V. parahaemolyticus irá dirigido a utilizar procedimientos que re-
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
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duzcan al máximo o eliminen el riesgo para el consumidor de ingerir dosis infectantes. Las mejores medidas de prevención son: — Controlar la multiplicación del germen inmediatamente después de ser capturados los productos del mar (moluscos, crustáceos, peces), manteniéndolos a temperatura inferior a 5 °C, en refrigeración. — La cocción interna de los alimentos deberá alcanzar los 65 °C en su masa para destruir al germen. — Importar alimentos microbiológicamente sanos. — Evitar la contaminación cruzada de alimentos crudos y cocidos, separando de forma estricta las formas correspondientes a cada uno de ellos. — Almacenamiento adecuado de alimentos crudos y cocinados a temperatura de refrigeración. — Los alimentos se deben consumir en el transcurso de las 2 horas posteriores a su preparación, o bien, enfriados inmediatamente por debajo de 5 °C y mantenidos en refrigeración hasta su consumo.
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Hongos Joaquín Berenguer Soler
Pretender definir los hongos en términos sencillos no resulta fácil, debido a que en este término general se incluyen, a menudo, tanto hongos típicos como diversos organismos fúngicos inusuales. En general, se los conceptúa como vegetales pertenecientes al grupo de los talofitas y, por consiguiente, carentes de cormo, con una estructura que puede ser unicelular o pluricelular, y caracterizados por la falta absoluta de clorofila y por ser típicamente filamentosos. Un elemento estructural que define a los hongos lo constituyen, precisamente, esos filamentos individuales formados por células alineadas en una sola serie, denominados hifas. Las células fúngicas están rodeadas por una pared que, a menudo aunque no siempre, contiene quitina como componente mayoritario. La hifa crece únicamente por su ápice (los hongos tienen crecimiento apical) y se ramifica periódicamente por detrás del ápice, dando como resultado una maraña de hifas que se denomina micelio. Existen excepciones a estos caracteres generales, y hay hongos que carecen de micelio o de seudomicelio (formado por células menos regulares, menos homogéneas, y no relacionadas de modo definido como en los verdaderos micelios), y se presentan formando colonias constituidas por la reunión no definida de células fúngicas que se reproducen a menudo agámicamente, por gemación. Todos los hongos son heterotrofos y requieren materiales orgánicos preformados que utilizan como fuente de energía y como esqueletos carbonatados para la síntesis celular. A causa de su pared celular rígida, no pueden englobar alimento y, por lo general, absorben nutrientes solubles simples que pueden obtener a partir de polímeras complejos por liberación de enzimas extracelulares (depolimerasas) al medio ambiente. Son eucarióticos en contraste con las procarióticas bacterias, es decir, presentan membrana nuclear. Sus ribosomas son del tipo 80s, a diferencia de los ribosomas bacterianos, del tipo 70s. Su reproducción puede ser sexual y/o asexual. Puede resumirse lo dicho hasta ahora definiendo a los hongos como organismos eucarióticos, característicamente miceliares, heterotrofos con nutrición por absorción, con el riesgo que supone tratar de definir de forma simplificada un grupo de organismos tan complejo. 141
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
En cuanto a su clasificación taxonómica, la posición relativa de los hongos hacia otros organismos está sujeta a debate. Será suficiente decir que los hongos se han llegado a considerar tradicionalmente incluso como un subreino del Reino vegetal, si bien diversos autores aportan argumentos para incluirlos en un reino aparte, equivalente a las Plantas y a los Animales (Whittaker, 1969; Von Arx, 1981). MOHOS Y LEVADURAS En el campo de la micología industrial, se estudia tanto la acción nociva de los hongos microscópicos, que pudren y malogran materias primas y productos manufacturados (incluidos los distintos alimentos), como el empleo de estos organismos en fermentaciones industriales y en el campo de la biotecnología. Se trata de organismos fúngicos que muestran diferencias considerables en su estructura. Pertenecen a grupos taxonómicos muy diversos y, si bien se pueden observar a simple vista, no obstante producen estructuras diminutas, reproductoras y vegetativas, que no es posible estudiar sin la ayuda del microscopio. Comúnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares filamentosos, dotados de un micelio verdadero, microscópicos, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta concepción, es inseguro establecer el límite entre los mohos y ciertos microorganismos encuadrados en las especies esporógenas y productoras de micelio de las levaduras. Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de células independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargadas o casi cilíndricas En algunos casos, forman cadenas de células alargadas, adheridas de modo suelto, semejantes a un micelio, por lo que se las denomina seudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de verdadero micelio, con frecuencia ramificado. De acuerdo con lo expuesto, y según se ha comentado ya, no existe un limite de separación definido entre levaduras y otros hongos que forman un micelio típico. Las levaduras, cuando crecen sobre medios sólidos, forman colonias de aspecto característico que recuerdan a las colonias bacterianas. En casi todas las especies de interés industrial, el modo habitual de reproducción vegetativa es por gemación. Muchas de ellas presentan reproducción sexual por medio de ascosporas y, a diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse solamente por sus caracteres morfológicos; se precisa la ayuda de pruebas bioquímicas para la identificación específica SIGNIFICADO DE LA CONTAMINACIÓN FUNGICA DE LOS ALIMENTOS De la amplia dispersión de los hongos en todos los estratos bióticos e inertes se desprende su fácil y frecuente aparición como contaminantes en productos alimentarios, ya que éstos, constituidos por sustancias inorgánicas y orgánicas más o menos complejas, constituyen excelentes medios para la sustentación y repro-
HONGOS
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ducción de gran número de especies fúngicas. Además, como sucede con las bacterias, diversos factores (pH, Eh, aw, Hr, temperatura, elementos nutritivos, estructuras biológicas, etc.) influyen en la proliferación fúngica sobre los alimentos. El significado de la contaminación fúngica de los alimentos, especialmente por mohos, viene no sólo del potencial de los hongos para deteriorarlos, sino también del potencial de muchos de ellos para producir una gran variedad de micotoxinas a las que el hombre tiene susceptibilidad, así como su capacidad para provocar infecciones e, incluso, reacciones alérgicas en personas hipersensibles a los antígenos fúngicos. En esquema, la contaminación fúngica de los alimentos puede considerarse desde un doble aspecto: 1.
Actuación sobre los alimentos: bioconversores
— Defectos de aspecto. — Modificaciones químicas. • Del valor nutricional. • Del carácter organoléptico. • Dificultades de conservación. 2.
Actuación sobre hombre y animales
— Patógena (micosis). — Alergena (alergias). — Tóxica (micotoxicosis). En cuanto a su significado para la salud del consumidor, la acción de las levaduras es meramente infectiva (Candida albicans Cryptococcus neoformans, etc.), mientras que el mayor problema originado por los mohos se refiere a su gran capacidad de elaboración de micotoxinas (Aspergillus spp, Penicillium spp, Fusarium spp, etc.). No obstante, ciertos mohos pueden ser tanto agentes de micosis como responsables de intoxicaciones (p. ej., Aspergillus fumigatus). Se denominan micotoxinas las toxinas zootóxicas extracelulares elaboradas por hongos en alimentos consumidos por el hombre y los animales. Se ha comprobado que diferentes mohos pueden producir la misma toxina, y que ciertos mohos son capaces de producir varias micotoxinas. El número de micotoxinas conocidas en la actualidad es elevado; son destacables por su interés como contaminantes de diversos alimentos: aflatocinas, esterigmatocistina, ocratoxinas, citrinina, patulina, zearalenona, tricothecenos, tremórgenos, ácido ciclopiazónico, ácido penicílico, etc. Su determinación analítica en el laboratorio se lleva a cabo fundamentalmente por medio de técnicas químicas (cromatografía en capa fina, cromatografía liquida de alta eficacia) e inmunológicas (enzimoinmunoensayo: ELISA). RECUENTO TOTAL DE MOHOS Y LEVADURAS De todo lo expuesto anteriormente se deduce que existe un riesgo potencial en la contaminación fúngica de los alimentos y, por ello, para conocer la calidad mi-
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
crobiológica de diversos productos, se procede a la evaluación de su tasa de contaminación por mohos y levaduras. Para averiguar la carga micológico de un alimento, se emplea la técnica usual del recuento en placa de agar a partir de la «serie de diluciones decimales» del producto. Material — — — — — —
Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Gradillas. Pipetas graduadas estériles de 1 y 10 ml. Estufa de cultivo. Matraces Erlenmeyer de 250 ml. Probetas de 100 ml.
Medios de cultivo Caldo de triptona soja (Tryptone Soy Broth. TSB) (v. pág. 34) Agua de triptona (Tryptone Water. TW) (v. pág. 11) Solución de Ringer 114 (v. pág. 118) Solución de Tween 80 al 0,01 por 100 Composición: Tween 80: Agua destilada:
0,1 ml 1.000 ml
Disolver. Distribuir en tubos a razón de 9 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Agar extracto de levadura-glucosa-o.xitetraciclina (Oxytetracycline Glucose Yeast Extract Agar. OGYE) Composición: Extracto de levadura Dextrosa Bilis de buey desecada Agar Oxitetraciclina Agua destilada
5g 20 g 5g 15 g 100 ml 1.000 ml
Disolver los ingredientes por calentamiento y agitación hasta ebullición, salvo la oxitetraciclina. Ajustar el pH a 6,5 ± 0,2. Distribuir en matraces a razón de 200
HONGOS
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mi. Esterilizar en autoclave a 115 °C durante 10 minutos. Atemperar el medio a unos 45 °C y añadir 20 ml de solución de oxitetraciclina por cada 200 ml de medio. En la Sección de Micología del Centro Nacional de Alimentación, se utiliza oxitetraciclina de Pfizer, que contiene 250 mg de este antibiótico en 3 ml de solución. Se disuelve la ampolla en un matraz con 250 ml de agua destilada estéril. De esta mezcla, se utilizan 20 ml por cada 200 ml de medio OGYE (medidos con probeta). Así se obtiene la proporción requerida de 100 mg de oxitetraciclina por cada litro de medio. Técnica La mezcla se suspende en la proporción 1/9 en caldo de triptona soja (TSB) (v. pág. 34). Tras mantener la dilución inicial de la muestra (1:10) durante 2 horas a temperatura ambiente, partiendo de esta dilución, se realizan diluciones decimales seriadas (1:100, 1:1.000, 1:10.000, etc.), en agua de triptona (v. pág. 11), solución de Tween 80 al 0,01 por 100 (v. pág. 144) 0 solución de Ringer (v. pág. 118). La siembra de las placas de recuento se lleva a cabo en masa, depositante 1 mi de cada una de las diluciones decimales en placas de Petri estériles que midan 90 mm de diámetro, adicionar seguidamente el medio de recuento (OGYE) (v. pág. 144), atemperado a 45 °C, en cantidad aproximada de 20 mi por placa. Es importante dispersar homogéneamente la muestra en el medio de recuento para obtener valores correctos. Dejar solidificar en una superficie horizontal a temperatura ambiente. Incubar en estufa de cultivo a 25 °C durante 5-7 días. Pasado este tiempo, se procede al recuento de las colonias crecidas, si bien la lectura se comienza al tercer día para observar la formación de micelios aéreos invasores. El recuento se establece a partir del número de colonias aparecidas en una sola dilución, concretamente la dilución que proporcione un valor medio de colonias fúngicas entre 0 y 30 (0 a 50). El número de colonias contadas se multiplica por el factor de dilución de la placa y se obtiene así el recuento total de unidades formadoras de colonias de mohos y/o levaduras por gramo o mililitro de alimento. Diversos autores han señalado que, a diferencia de lo que ocurre con los recuentos bacterianos en placa, los recuentos fúngicos a partir de los valores de unidades formadoras de colonias de una sola dilución no varían en la misma razón que las diluciones correspondientes y pueden dar valores inferiores a los reales. A pesar de ello, otros autores señalan que es el método más adecuado para llevar a cabo cualquier trabajo comparativo. De cualquier forma, algunos de sus inconvenientes pueden evitarse observando las siguientes medidas: a) Empleando un medio de cultivo de revivificación. El caldo triptona soja (TSB) es un medio liquido idóneo para la revivificación de propágulos, posiblemente estresados por las condiciones de los productos analizados. Este paso de revivificación antes del recuento es necesario, según Mossel (1982), para que todas las unidades formadoras de colonias existentes en el alimento se encuentren en condiciones de originar una colonia de crecimiento, y así conseguir un recuento fiable.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
b) Utilizando medios de recuento que permitan el amplio desarrollo de la mayoría de especies fúngicas y, en caso necesario, simultanear el recuento con medios idóneos para especies determinadas. En este sentido, el medio de recuento OGYE se recomienda para la selección y enumeración de mohos y levaduras en alimentos (Mossel y otros, 1970 y 1973; el ex tracto de levadura tiene por finalidad aportar vitaminas para el crecimiento de muchos hongos; la oxitetraciclina actúa como agente selectivo, impidiendo el crecimiento bacteriano, que es más rápido que el fúngico; la bilis de buey actúa como factor limitante del crecimiento en diámetro de las colonias de hongos invasores de crecimiento rápido, principal mente Zygomycetos (Rhizopus, Mucor, Absidia, etc.), que podrían cubrir por completo la superficie del agar y dificultar, alterar o impedir, incluso, el recuento. c) Al efectuar las diluciones decimales previas al recuento, es aconsejable el uso de agentes tensioactivos, como el Tween 80, para favorecer la dispersión homogénea de los propágulos fúngicos, que son, habirualmente, ricos en sustancias lipídicas, especialmente en sus membranas celulares. Con el mismo fin, se precisa una agitación mecánica adecuada en el momento de la preparación de las diluciones decimales seriadas poco antes de su siembra en las placas de recuento, evitando demoras en los sucesivos pasos. ESTUDIO DE LA MICOFLORA: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN Después del recuento, se procede al aislamiento de todos los tipos morfológicos distintos de colonias fúngicas que aparezcan en la placa. Generalmente, el aislamiento se lleva a cabo mediante la resiembra directa, con asa de cultivo, de cada uno de los tipos morfológicos, en tubos o placas de agar, aunque en algún caso es preciso acudir a realizar cultivos de dilución previos al aislamiento final, con objeto de obtener colonias separadas que permitan conseguir subcultivos puros. Uno de los medios de cultivo utilizados habitualmente para la resiembra y aislamiento de cultivos puros es el agar extracto de multa-glucosa-peptona: Composición: Extracto de malta Dextrosa Peptona Agar Agua destilada
20 g 20 g 1g 20 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes por calentamiento y agitación hasta ebullición. No se ajusta el pH. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Una vez aisladas las cepas puras, se procede a la identificación de cada cepa aislada. La metodología utilizada en la clasificación de hongos microscópicos sigue caminos distintos para la identificación de mohos y levaduras.
HONGOS
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Las técnicas para la identificación de mohos se encaminan, casi exclusivamente, al estudio de la morfología, tanto macroscópica como microscópica. Para ello, se realiza una resiembra sobre un medio de identificación adecuado y, después de su incubación en estufa de cultivo, se procede a la observación macro y microscópica de diversos parámetros: grado de crecimiento y aspecto de las colonias (forma, textura superficial, color), características de las hifas, formación y tipo de exudado, emisión de pigmento, olor, órganos de fructificación maduros (grado de desarrollo, características, tipos, tamaño, disposición), esporas (tipo, forma, tamaño, color, tabicación, marcas superficiales, disposición), etc. Una técnica de cultivo, empleada habitualmente, es la siembra del moho que se estudia en tres puntos equidistantes (triángulo equilátero) en placa de agar, con el fin de facilitar así la observación in vivo de las estructuras (sobre todo las de fructificación) sin necesidad de manipulación alguna, lo que evita su destrucción. Los medios de identificación para mohos son muy diversos; entre los más empleados puede citarse: medio de agar-solución de Czapek; medio de agarsolución de Czapek-extracto de levadura; medio de agar-solución de Czapek 20 por 100 sacarosa; agar-extracto de malta-glucosa-peptona (Rapar y Fennell, 1977; Ramírez, 1982; Pitt, 1979, 1980), agar-patata-dextrosa (Americen Public Health Association, 1966); agar-extracto de malta 5 por 100-glucosa-peptona (Joly, 1964); agarglucosa (De Vries, 1967); agar-extracto de malta Rifai 1969). Para el examen microscópico, se suele utilizar como liquido de montaje agua con Tween 80 al 0,01 por 100, aunque en ciertos casos se emplean otros líquidos (lactofenol, sobre todo) y la tinción de diversas estructuras para su observación. A veces se emplea la técnica del microcultivo sobre portaobjetos para visualizar estructuras delicadas, sin manipulación que las pudiera alterar. Estos microcultivos se preparan extendiendo una capa fina del medio de agar adecuado, asépticamente, sobre un portaobjetos estéril, e inoculándolo en su punto central, cuando se ha solidificado, con una suspensión de esporas del hongo en estudio. A continuación, se incuba asépticamente (en el interior de una placa de Petri estéril) en condiciones idóneas para cada caso. A partir de todos los datos obtenidas, se procede a la clasificación del moho. Se pueden emplear multitud de claves, si bien una de las de mayor interés es la publicada por Von Arx (1981), para clasificación hasta el nivel de género. Para llegar al nivel de especie, suele ser necesario el empleo de monografías concretas. En cuanto a la identificación de levaduras, se sustenta inicialmente en la observación de una serie de características morfológicas esenciales: sin embargo, la identificación específica de una cepa precisa del concurso de pruebas fisiológicas y bioquímicas, por lo que la metodología en este punto se aproxima, en cierta medida, a los sistemas clásicos de identificación bacteriana. Brevemente, entre las características que hay que estudiar, se encuentran: 1. Morfología. — Características de las células vegetativas y de su cultivo, tanto en medio líquido como en medio sólido (forma, tamaño, formación de velo, de anillo, de sedimento, textura, color, formación de pseudomicelio y/o micelio verdadero, etc.).
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— Características de la multiplicación vegetativa. — Características de la reproducción sexual: morfología de las esporas sexuales. 2. Fisiología. — Utilización(fermentativa/oxidativa) de compuestos carbonados. — Utilización de compuestos nitrogenados. — Osmotolerancia, crecimiento a diversas temperaturas, reacciones de hidrólisis, resistencia a antibióticos, etc. Los medios de cultivo y las técnicas que se pueden emplear son variados; existen monografías completas al respecto. Entre las más útiles, se pueden citar la editada por Lodder (1974), junto a la de Barnett (1983) y la editada por Kreger van Rij (1984).
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Investigación de toxina botulínica
El Clostridium botulinum es una especie bacteriana ampliamente distribuida en la naturaleza; sus esporos están presentes en polvo, suelo, vegetación, sedimento de ríos, lagos, etc. Si los esporos logran germinar en algunos alimentos, se multiplican las formas vegetativas y elaboran una poderosa neurotoxina. Al ser ingerida la toxina con los alimentos, es absorbida a través del intestino y pasa a la circulación, para localizarse en las terminaciones nerviosas, ocasionando la enfermedad conocida como botulismo. Dado que su acción es tóxica al intervenir una toxina preformada en el alimento, la alteración que ocasiona es una intoxicación. Sin embargo, esporos de CL botulinum pueden germinar y multiplicarse en el intestino de lactantes, produciendo suficiente toxina para dar lugar al botulismo denominado infantil, causa frecuente de fallecimiento de niños en edad comprendida entre 1 mes y 1 año. En este caso se trataría de una infección. Los primeros síntomas de la intoxicación botulínica se desarrollan entre las 12 y 36 horas que siguen a la ingestión del alimento tóxico: náuseas, estreñimiento, debilidad y sequedad de garganta, principalmente. A continuación se presentan trastornos neurológicos como: dilatación pupilar y visión borrosa, dificultad para deglutir, debilidad general y, finalmente, parálisis respiratoria y muerte. Los síntomas del botulismo infeccioso de los niños son idénticos. La sintomatología descrita es consecuencia del efecto neuropatológico de la toxina botulínica, al actuar ésta a nivel de las sinapsis de los nervios motores somáticos en la unión neuromuscular, con lo que se bloquea la estimulación de la contracción muscular al inhibirse la liberación de acetilcolina; de aquí que se produzca una parálisis flaccida. Aunque el Cl. botulinum produce, al menos, siete toxinas distintas, que difieren en sus caracteres inmunológicos y en los animales a los que afectan normalmente, farmacológicamente son similares. Los tipos de Cl. botulinum y las especies animales a las que afectan, son los siguientes:
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Tipo A B Cα Cß D E F G
Especie animal Hombre Hombre, équidos Pájaros, tortugas Bovinos, ovinos, équidos Bovinos, ovinos Hombre, pájaros Hombre No se conocen brotes
El tipo C contiene, al menos, dos componentes: Cα y Cß, que están relacionados serologicamente con la toxina tipo D. Son numerosos los alimentos involucrados en brotes de botulismo, en general: — Productos cárnicos curados: jamón. — Conservas de pH superior a 4,5. — Semiconservas. MATERIAL — — — — — — — — — — — — — — —
Triturador homogeneizador. Centrífuga refrigerada. Tubos de centrífuga. Tubos de ensayo. Pipetas estériles. Gradillas. Tijeras. Bisturíes. Abrelatas. Pinzas. Baño María. Jeringas y agujas. Guantes de goma. Alcohol yodado. Ratones blancos de 18-20 g.
TAMPON GEL FOSFATO Y SUEROS ANTITOXINAS Tampón gel fosfato (pH 6,5) Composición: Fosfato disódico Bacto-gelatina Agua destilada
1g 1g 1.000 ml
INVESTIGACIÓN DE TOXINA BOTUÜNICA
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Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 6,5. Distribuir y esterilizar en autoclave a 115 °C durante 20 minutos. Solución de tripsina Composición: Tripsina Tampón gel fosfato (v. pág. 150)
2g 1.000 ml
Antitoxinas botulínicas para toxinotipia Están comercializadas por el Instituto Pasteur. TÉCNICA Por ser la toxina botulínica una sustancia extremadamente tóxica, se debe poner un cuidado especial en todas las manipulaciones de la técnica. El material de laboratorio y los animales de experimentación utilizados se desecharán con un tratamiento especial para evitar riesgos: incineración, por ejemplo. Preparación de la muestra de alimento Apertura del envase en conservas En el caso de envases de hojalata, desinfectar las bases con cualquier desinfectante y desechar el exceso. Secar bien el área desinfectada con papel de filtro. Verter, sobre la superficie de la base que se va a abrir, alcohol yodado y dejar actuar durante algunos minutos. Quitar el exceso con papel de filtro estéril. Abrir el envase con abrelatas estéril, tomando precauciones y con una protección especial para el manipulador de la muestra. Una vez abierto el envase, proceder al examen organoléptico del producto: aspecto, presencia o no de burbujas, teniendo en cuenta que no se debe probar nunca el alimento. Se anotarán todos los detalles observados. Tratamiento de la muestra Mezclar, a partes iguales, el alimento con tampón gel-fosfato (pH 6,5) (v. pág. 150). Triturar y homogeneizar, evitando el posible calentamiento de la muestra. Centrifugar la mezcla dentro de centrifuga refrigerada a 3.500 rpm durante 30 minutos. Recoger el sobrenadante para la investigación de toxina botulínica. Lo que sobre del sobrenadante se conservará a -15 °C por si fuera necesario repetir la prueba.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Detección de toxina botulínica Dividir en tres partes alícuotas el sobrenadante que constituye la muestra: — Calentar una de las partes a 100 °C durante 5 minutos para destruir la toxina. Diluir la fracción calentada al 1:5 con tampón gel fosfato (pH 6,5) (v. pág. 150). — Diluir una segunda parte, sin calentar, al 1:5 en tampón gel fosfato (pH 6,5) (v. pág. 150). — Mezclar la tercera parte alícuota con un volumen igual de solución de tripsina al 1 por 100 (v. pág. 151) en tampón gel fosfato (pH 6,5) (v. pág. 150). Incubar a 37 °C durante 1 hora. La tripsina activa las toxinas de los tipos no proteolíticos. — Preparar lotes de 2 ratones blancos de 18-20 g de peso. Inocular a los dos ratones que constituyen el lote con 0,5 mi de cada una de las partes alícuotas, previamente preparadas, por vía intraperitoneal. — Observar a los ratones inoculados durante 72 horas y anotar síntomas y muerte. Los síntomas suelen aparecer dentro de las 24 horas posteriores a la inoculación. Sin embargo, y en función de ciertos factores como la cantidad de toxina presente en el alimento, los síntomas pueden aparecer, incluso, después de las 72 horas. La sintomatología en el ratón se presenta con: erizamiento del pelo, respiración laboriosa, retracción del abdomen, debilidad en las extremidades parálisis progresiva, disnea y muerte. Tipificación de ¡a toxina Método 1. Diluir al 1:5 en solución fisiológica estéril (CINa al 0,85 por 100) la antitoxina botulínica polivalente o cada una de las toxinas monovalentes. Mezclar 0,5 ml de la muestra tóxica con otros 0,5 ml de la antitoxina diluida al 1:5 y dejar a temperatura ambiente durante 1 hora. Con 0,5 mi de la mezcla anterior, inocular a 2 ratones blancos por vía intraperitoneal. Inocular a otros 2 ratones con 0,5 mi cada uno de una mezcla a partes iguales de mezcla tóxica y solución salina. Estos ratones servirán de control. Observar las reacciones de los ratones durante 72 horas, como minino. Se identifica la toxina al comprobar que sobreviven los ratones protegidos por una determinada antitoxina y mueren los protegidos con otras y los controles. Método 2. Inocular varios lotes de 2 ratones, por vía intraperitoneal, con 0,5 ml de cada una de las antitoxinas botulínicas monovalentes diluidas al 1:5, para que queden protegidos. Reservar dos ratones sin protección para que sirvan de testigos. Al cabo de 1 hora, inocular, por vía intraperitoneal, a cada uno de los ratones,
INVESTIGACIÓN DE TOXINA BOTULÍNICA
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protegidos o no, con 0,5 mi de la muestra tóxica diluida (muestra tóxica y tampón gel fosfato, pH 6,5, a partes iguales). Anotar las reacciones de los ratones, observándolos, como mínimo, durante 72 horas. Los ratones protegidos con una determinada antitoxina que sobrevivan habrán sido inoculados con el tipo de toxina involucrada en el brote de botulismo. Los ratones no protegidos deberán morir con la sintomatología típica del botulismo. TÉCNICAS RÁPIDAS PARA LA DETECCIÓN DE TOXINAS BOTULÍNICAS Se pueden utilizar dos tipos de técnicas: — Detección de toxinas botulínicas por la prueba de bioensayo en ratones blancos. — Identificación serológica del tipo de las toxinas. La técnica in vivo para bioensayo en ratones, ya ha sido descrita. Las técnicas in vitro son, esencialmente, de dos tipos: — Pruebas serológicas. — Pruebas de cultivos celulares. La mayoría de las pruebas serológicas no son satisfactorias respecto a sensibilidad y especificidad. Se han utilizado: — — — — —
Electroinmunodifusión. Inmunoelectroforesis contracorriente. Radioinmunoensayo (RÍA). Reversed Passive Haemagglutination (RPH). Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
El método ELISA se ha mostrado prometedor en la investigación de toxina tipo G; para el resto de toxinas se muestra poco sensible. Recientemente se ha probado esta técnica utilizando anticuerpos monoclonales para investigar la toxina tipo A (Shone, 1985) (Doellgast, 1994). A pesar de los grandes esfuerzos realizados para desarrollar un método alternativo al bioensayo al ratón blanco, ninguno de los utilizados se ha mostrado tan sensible y específico como la prueba en ratón. Los métodos de cultivos celulares no están suficientemente estudiados.
PREVENCIÓN Y CONTROL DEL BOTULISMO La prevención del botulismo se basa en la utilización de una tecnología alimentaria correcta, mediante una limpieza cuidadosa de los productos (pelado, lavado) y que éstos sean frescos. En la elaboración de conservas caseras se pondrá especial cuidado en:
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— Esterilizar el producto preparado para su conservación en recipientes tipo autoclave. — Mantener en refrigeración las semiconservas (productos no esterilizados pero bacteriológicamente aceptables). Las conservas de preparación industrial requieren: — Baremos de esterilización estudiados para cada producto. — Cantidades adecuadas de sal y otros aditivos para asegurar la salubridad del producto, evitando el crecimiento de Cl. botulinum. El botulismo en alimentos sometidos a un proceso de conservación se previene totalmente tomando unas medidas básicas: — Estudiar y establecer baremos adecuados del proceso térmico en productos en los que se puede desarrollar Cl. botulinum. — Controlar la integridad de los envases utilizados, muy especialmente sus costuras. — Asegurar un ambiente con una higiene meticulosa durante las fases de enfriamiento, distribución y transporte de las conservas. El control de los brotes de botulismo que se originan por el consumo de productos cárnicos curados, se basa en el uso de cantidades adecuadas de sales de curado: cloruro sódico y nitrito sódico combinadas, a veces, con un proceso térmico moderado. Los brotes de botulismo tipo B suelen ser consecuencia del consumo de jamón crudo curado, sobre todo de elaboración casera, Se deben, casi por completo, al uso inadecuado de las sales de curado si son utilizadas en cantidad inferior a la necesaria o, con frecuencia, a la falta de adición de nitrito sódico. Un tipo de botulismo, el infantil, se produce como consecuencia de la ingestión de esporos de Cl. botulinum con ciertos alimentos infantiles. Los esporos ingeridos colonizan en el intestino donde elaboran toxina botulínica, causa de la enfermedad. Las fuentes de esporos de Cl. botulinum en el botulismo infantil suelen proceder del suelo y de ciertos tipos de miel que, de una forma u otra se les administra en su alimentación.
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Investigación de Aeromonas hydrophila
Es una especie bacteriana perteneciente al género Aeromonas y familia Vibrionaceae. Esta familia está integrada por los géneros: — Vibrio. — Aeromonas. — Plesiomonas. Más recientemente, y considerando que existe alguna falta de relación con los Vibrio, se ha propuesto una nueva familia para integrar a los géneros Aeromonas y Plesiomonas, la familia Aeromonadaceae (Colwell, 1986). Dentro de los géneros Aeromonas y Plesiomonas se han reconocido especies causantes de enteritis alimentaria: Aeromonas hydrophila y Plesiomonas shigelloides. El género Aeromonas, con respecto a movilidad, se divide en dos grupos de especies: Aeromonas inmóviles
A. salmonicida A. hydrophila
Aeromonas móviles
A. caviae A. sobria
A. salmonicida es una especie patógena para los peces, pero no para el hombre. Produce forunculosis en salmón y trucha. A. hydrophila es un germen móvil, junto con otras especies, A. caviae y A. sobria, que tienen características y DNA similares. Es normal incluir a todas las especies móviles del género Aeromonas bajo el término general de A. hydrophila. Más recientemente también se han relacionado con trastornos gastroenténcos: A.veronii y A. schubertii ( Hickman- Brenner, 1988). A. hydrophila, cuyo habitat natural es el agua, está integrada por gérmenes de forma bacilar, aunque su morfología puede ser variable, desde cocoide a filamentosa, pasando por formas curvadas que se distinguen fácilmente de los Vibrio. 155
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Generalmente son bacilos rectos con extremos redondeados que aparecen solos, en parejas o cadenas cortas. Gramnegativos. No esporulados. Móviles por un flagelo polar único (monotricos). Miden de 1.0-4.4 µ de largo por 0.4-1.0 µ de ancho. La longitud del flagelo alcanza 1.7 µ . Se trata de gérmenes mesófilos, con temperatura óptima a 30 °C y límites de temperatura de crecimiento entre 5°-42 °C. Producen oxidasa y fermentan la glucosa con producción de gas y algunos otros azúcares, como la salicina. Bioquímicamente las Aeromonas móviles son similares a algunos miembros de las Enterobacreriaceae, especialmente E. coli y Klebsiella spp. Diferenciación entre especies de Aeromonas móviles A. hydrophila Movilidad Oxidasa Glucosa Sacarosa Inositol Acido salicina Cree. 42 °C SH2 Indol
+ +
AG
+ + + +
A. caviae
A. sobria
+ + A + + + +
+ + AG + + + -
Las Aeromonas móviles son, principalmente, microorganismos acuáticos que se encuentran en aguas frescas, estuarios y océanos, así como en heces de algunas personas sanas y en las de animales domésticos. La densidad de estos gérmenes es más alta en aguas corrientes que en aguas tranquilas y mayor en agua salada que en agua fresca. Su presencia se incrementa en verano. El agua tratada con cloro y el agua embotellada pueden ser reservorios del germen. Como gran parte de las cepas de A. hydrophila son psicrotróficas, el almacenamiento del agua o los alimentos a temperatura de refrigeración no es un medio para prevenir la enfermedad ocasionada por este germen. Desde 1968 están consideradas como gérmenes «oportunistas», afectando a personas con defensas bajas en las que se puede producir septicemia, meningitis, endocarditis, etc. Aeromonas y Plesiomonas se han relacionado cada vez con más frecuencia como enteropatógenos humanos. P. shigelloides tiene que ver, principalmente, con alimentos procedentes del mar, mientras que las Aeromonas se han encontrado también en cerdos, aves, leche, huevos y vegetales. Las Aeromonas tienen capacidad para multiplicarse rápidamente a 4 °C, lo que supone un riesgo respecto al almacenamiento en frío de los alimentos. Además de los productos citados en los que se han aislado Aeromonas, se recuperan igualmente del agua e, incluso, muchas de las cepas aisladas son resistentes al cloro. Recientemente se ha comprobado que las Aeromonas móviles son causa de gastroenteritis en personas sanas, principalmente niños entre 6 meses y 2 años y
INVESTIGACIÓN DE AEROMONAS HYDROPHILA
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ancianos de más de 60 años. Aunque se transmiten por el agua de bebida, también se pueden propagar a través de alimentos que hayan estado en contacto con agua contaminada por estos microorganismos al ser ingeridos, lo que ha sido puesto de manifiesto por algunos autores (Toddy, 1992) respecto a. A. hydrophila. A. hydrophila se ha encontrado en: pescado, marisco, carnes rojas, aves, leche cruda, huevo líquido y alimentos envasados al vacío. Estos alimentos, consumidos crudos, pueden ser causa de gastroenteritis, especialmente el marisco, por lo que el mejor método para evitar la enfermedad es una cocción perfecta. No se conoce bien el periodo de incubación de la enfermedad ni su dosis infectante. Los síntomas de la gastroenteritis ocasionada por la ingestión de alimentos contaminados con especies móviles del género Aeromonas son de dos tipos: 1. 2.
Casos parecidos al cólera, con heces acuosas, fiebre ligera o ausente, dolor abdominal y calambres. Casos parecidos a la disentería, con heces mucosas, sanguinolentas y dolor abdominal.
El proceso gastroentérico producido por Aeromonas móviles se ha atribuido a las especies: A. hydrophila y A. sobria. La mayoría de las veces la enfermedad es leve y afecta, sobre todo, a niños y ancianos. Los síntomas duran entre 1-7 días. No obstante, se conocen casos graves producidos por las dos especies citadas. Más que brotes, se producen casos esporádicos de gastroenteritis. MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE ESPECIES DE AEROMONAS MÓVILES DEL GRUPO AEROMONAS HYDROPHILA Dado que estos microorganismos se han asociado con enteritis por ingestión de agua y alimentos contaminados, se ha hecho necesario poner en práctica métodos para su detección. El aislamiento de este grupo de gérmenes se puede hacer: — por recuento directo en placas, sembrando en un medio selectivo; — previo enriquecimiento en medio líquido seguido de siembra en medio sólido selectivo. Recuento directo en placas Material — — — — — — —
Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Asa de vidrio de Drigalski Asa de cultivo Placas de Petri estériles de 90 mm de diámetro Estufa de cultivo Hilo recto de siembra en nicrom de 1 mm de diámetro Baño de agua
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Medios de cultivo y reactivos Agua de triptona (T.W.: Tryptone water) Composición: Triptona Cloruro sódico Agua destilada
10 g 5g 1.000 ml
Mezclar y disolver los ingredientes en el agua. Ajustar el pH a 7.2 ± 0.1. Distribuir en tubos de ensayo de 16 x 160 mm, a razón de 9 ml. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Agar ampieilina dextrina (AD) Composición: Triptona Dextrina Extracto de levadura en polvo Cloruro sódico Cloruro potásico Sulfato magnésico 7H,O Cloruro férrico Desoxicolato sódico Agar Agua destilada
2.5 g 5.0 g 1.0 g 1.5 g 0g 0.1 g 0.05 g 0.005 g 7.5 g 500 ml
Mezclar los ingredientes con el agua y llevar a ebullición para disolverlos por completo, removiendo frecuentemente. A los 500 mi de medio se le añaden 4.5 mi de una solución de azul de bromotimol (1 g de azul de bromotimol y 1 mi de NaOH 5N en 99 mi de agua destilada). Ajustar el pH a 8.0 ± 0.1. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Atemperar a 47 °C en agua del grifo. Para los 500 ml del medio preparado, se añaden 5 mi de una solución de 100 mg de ampicilina en 100 ml de agua destilada, esterilizada por filtración. Mezclar bien y distribuir, asépticamente, en placas de Petri estériles a razón de 15 ml. Dejar secar. Solución de yodo-yoduro potásico Composición: Yodo Yoduro potásico Agua destilada Disolver.
1g 2g 300 ml
INVESTIGACIÓN DE AEROMONAS HYDROPHILA
159
Agar ampicilina de Ryan (AAR) Como en el agar ampicilina dextrina (AD), la ampicilina es selectiva para Aeromonas hydrophila Composición: Peptona Extracto de levadura Clorhidrato L Arginina Clorhidrato L Lisina Lactosa Inositol Xilosa Tiosulfato sódico Sales biliares Cloruro sódico Citrato férrico amónico Azul de bromotimol Azul de timol Agar Agua destilada
5g 3g 2g 3.5 g 1.5 g 2.5 g 3.75 g 10.65 g 3g 5g 0.8 g 0.04 g 0.04 g 12.5 g 1.000 ml
Mezclar los ingredientes en el agua y calentar suavemente hasta ebullición. Ajustar el pH a 8.0 ± 0.1. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. A 500 ml del medio se le somete a un enfriamiento de 50 °C y se añaden, asépticamente, 5 ml de una solución de 100 mg de ampicilina en 100 ml de agua destilada, esterilizando la mezcla por filtración. Mezclar bien y repartir, asépticamente, en placas de Petri estériles, a razón de 15 ml por placa. Este medio se puede mantener útil durante 5 días a temperatura de refrigeración. Medio GN en tubos (para diagnóstico de bacterias Gramnegativas) Consta de tres capas superpuestas dentro de un tubo de cultivo estéril. Capa inferior: agar büiado rojo violeta glucosa (VRBG) Composición: Extracto de levadura Peptona Cloruro sódico Sales biliares Glucosa Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada
3g 7g 5g 1,5 g 10 g 0,03 g 0,002 g 15 g 1.000 ml
160
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Mezclar los ingredientes con el agua. Ajustar el pH a 7.3 + 0.1 y calentar hasta ebullición para una disolución perfecta. Enfriar inmediatamente al grifo hasta los 50 °C y mantener en baño de agua a 47 °C. El medio es sensible al calor y NO NECESITA ESTERILIZACIÓN EN AUTOCLAVE Capa media: agar agua Composición: Agar Agua destilada
20 g 1.000 ml
Capa superior: agar sulfuro-indol-movilidad (SIM) Composición: Triptona Peptona de soja Sulfato ferroso de amonio Tiosulfato de sodio Cloruro sódico Agar Agua destilada
20 g 6g 0,2 g 0,2 g 5g 3,5 g 1.000 ml
Mezclar los ingredientes con el agua. Ajustar el pH a 7.3 ± 0.1 y disolver cuidadosamente por calentamiento. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Enfriar y mantener a 47 °C. Preparación del medio GN En tubos de cultivo estériles, y asépticamente, poner una capa de 2 cm de agar VRBG, mantenido a 47 °C, en el fondo del tubo y llevarlos a refrigeración para que se solidifique el medio. Encima de esta capa superponer, asépticamente, 2 cm de agar agua, mantenido a 47 °C, y dejar solidificar en refrigeración. Finalmente, sobre la última capa colocar, asépticamente, 2 cm de agar SIM, mantenido a 47 °C, y llevar a refrigeración para que se solidifique. NOTA: No conservar los tubos de GN más de 5 días almacenados en refrigeración. Agar salicina Composición: Triptona Extracto de levadura en polvo Cloruro sódico Fosfato dipotásico Azul de bromotimol Agar Agua destilada
2g 1g 5g 0,3 g 80 mg 15 g 950 ml
INVESTIGACIÓN DE AEROMONAS HYDROPHILA
161
Mezclar los ingredientes con el agua. Ajustar el pH a 7.1 ± 0 . 1 . Calentar para disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Enfriar a 50 °C y añadir 100 ml de una solución de salicina al 10 por 100 esterilizada por filtración. Mezclar bien y distribuir en tubos de ensayo estériles a razón de 10 ml, dejando solidificar el medio en posición vertical. Reactivo para la prueba de citocromo-oxidasa: CO Composición: Clorhidrato de N-dimetil-parafenilendiamina Agua destilada
100 g 1.000 ml
Esta solución no se debe conservar más de 1 semana, y siempre en frasco oscuro y en refrigeración. En el comercio existen discos, tiras y varillas para realizar esta prueba. Agar inositol-bilis-verde brillante (IBB: Inositol Bile Brilliant Green) Composición: Peptona Bilis de buey Verde brillante Rojo fenol Inositol Agar Agua destilada
5g 10 g 7,5 mg 40,0 mg 5g 7,5 g 490 ml
Mezclar los ingredientes con el agua. Llevar la mezcla a ebullición para disolver dichos ingredientes, removiendo de vez en cuando. Ajustar el pH a 7.2 ± 0.1. Enfriar rápidamente en agua del grifo hasta los 50 °C y mantener el medio en baño de agua regulado a 47 °C. Por su sensibilidad al calor, este medio NO SE ESTERILIZA EN AUTOCLAVE. Repartir el medio en placas de Petri estériles a razón de 15 ml. Técnica de recuento directo en placas A partir de una «serie de diluciones decimales» del producto a analizar, se transfiere, por duplicado, 0.1 ml de cada una de las diluciones a la superficie bien seca de agar ampicilina dextrina (AD). Diseminar por todo el medio con asa de vidrio de Drigalski. Incubar en estufa a 30 °C durante 24-48 horas. Las placas donde aparece crecimiento se inundan con una solución de yodoyoduro potásico. Se cuentan las colonias que presenten un halo claro sobre fondo rojo púrpura, preferentemente en las placas que contengan entre 20 y 200 colonias típicas. En este medio se detectan colonias dextrina positivas. Esta misma técnica se puede seguir utilizando agar ampicilina de Ryan (AAR).
162
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Con asa de cultivo, sembrar una suspensión del alimento sobre la superficie bien seca del medio AAR contenido en placas. Incubar en estufa a 30 °C durante 24-48 horas. Pasada la incubación, las colonias de Aeromonas hydrophila se muestran opacas, de color verde oscuro y con el centro aún más oscuro. Las colonias típicas se someten a pruebas de confirmación. Confirmación de las colonias Para la confirmación de las colonias se utilizan tres medios: — Medio GN ( Gramnegativos) — Agar salicina — Agar inositol-bilis-verde brillante ( IBB) Técnica de confirmación de las colonias Se toma una colonia dextrina positiva crecida sobre agar ampicilina dextrina (AD) y se siembra en el fondo y a lo largo de un tubo conteniendo medio GN, por picadura, mediante un asa recta de nicrom de 1 mm de diámetro. Incubar a 30 °C durante 24 horas. Sembrar, de igual forma, en tubos conteniendo agar salicina e incubar a 30 °C durante 24 horas. Con asa de vidrio de Drigalski, diseminar una colonia dextrina positiva aislada en agar ampicilina dextrina (AD), sobre la superficie bien seca de agar inositolbilis-verde brillante (I.B.B.). Incubar a 30 °C durante 24 horas. La confirmación de las colonias crecidas sobre agar AD es positiva y se consideran pertenecientes a Aeromonas móviles, cuando: — en agar GN se observa la fermentación de la glucosa al virar el color del medio VRBG de la capa inferior. También hay producción de gas; — para investigar la producción de oxidasa, se frota el crecimiento obtenido en el medio GN, con papel de filtro ( u otro sistema) humedecido en una solución acuosa de clorhidrato de N-dimetil-parafenilendiamina. En el caso de que aparezca en el papel de filtro un color púrpura intenso, la reacción de oxidasa es positiva. A. hydrophila es oxidasa positiva; — las especies móviles se manifiestan por un crecimiento difuso a lo largo de la línea de siembra o con una turbidez más intensa. A. hydrophila es una especie móvil. NOTA: aunque A. hydrophila es SH, e indol positiva, estas características no se manifiestan en el medio GN. Con respecto a las siembras sobre agar salicina y agar I.B.B., A. hydrophila se comporta de la siguiente forma: — En el fondo del tubo conteniendo agar salicina se produce un viraje al amarillo, con formación de gas, debido a la fermentación de la salicina. A. hydrophila fermenta la salicina con producción de gas. — En las placas de agar I.B.B. no aparece color amarillo alrededor de las colonias crecidas, ya que A. hydrophila no fermenta el inositol.
INVESTIGACIÓN DE AEROMONAS HYDROPHILA
163
Para calcular el número de gérmenes por gramo o mililitro del producto analizado, se multiplican las colonias contadas y confirmadas en la placa elegida, por 10 veces el factor de dilución de la misma, ya que se ha partido de un inoculo de 0.1 mi para sembrar las placas de agar AD. Prueba de Presencia-Ausencia (P-A), previo enriquecimiento en medio líquido selectivo Material — — — — — — — —
Tubos de ensayo de 16 x 160 mm Asa de vidrio de Drigalski Asa de cultivo Placas de Petri de 90 m Estufa de cultivo Hilo recto de siembra de nicrom de 1 mm de diámetro Matraces de 50 m Baño de agua
Medio de cultivo Caldo de enriquecimiento EE de Mossel, doble fuerza Composición: Peptona Glucosa Fosfato bisódico Fosfato monopotásico Bilis de buey Verde brillante Agua destilada
10 g 10 g 20 g 4g 40 g 0.027 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua. Ajustar el pH a 7.2 ± 0.1. Mezclar bien y distribuir en tubos de ensayo de 16 x 160 mm a razón de 10 ml y calentar en baño de agua a 100 °C durante 30 minutos. Enfriar enseguida en agua corriente del grifo. El medio es sensible al calor y NO DEBE SER ESTERILIZADO EN AUTOCLAVE. Técnica para investigar la Presencia-Ausencia (P-A) de A. hydrophila, previo enriquecimiento Preenriquecimiento de los gérmenes Sembrar, por duplicado, 1 mi de cada tubo de una «serie de diluciones decimales» del producto a analizar, en matraces de 50 mi conteniendo 9 mi de agua de triptona (T.W.). Mezclar bien. Para el preenriquecimiento de los gérmenes, man-
164
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
tener los matraces durante 6 horas a temperatura de laboratorio, agitándolos manualmente cada hora. Enriquecimiento Después de 6 horas de preenriquecimiento, añadir a los matraces 10 ml de caldo EE de Mossel, doble fuerza. Mezclar bien e incubar a 30° ± 1 °C durante 18-24 horas. Pasado este tiempo, agitar los matraces y sembrar, con asa de cultivo, desde el caldo de enriquecimiento a la superficie bien seca de agar I.B.B. contenido en placas de Petri. Incubar a 30 ± 1 °C durante 18-24 horas. La fermentación del inositol, sustancia que integra este medio, se detecta por la presencia de un halo color amarillo alrededor de las colonias. A. hydrophila no fermenta el inositol. Confirmación Se emplea la misma sistemática que para el recuento directo en placas. Prueba rápida Se puede utilizar el API 20 NE, para identificación de bacterias Gramnegativas, no Enterobacteriaceae.
19
Investigación de Plesiomonas shigelloides
Se trata de una especie bacteriana perteneciente al género Plesiomonas y familia Vibrionaceae. Esta familia está integrada por los géneros: — Vibrio — Aeromonas — Plesiomonas En los géneros Aeromonas y Plesiomonas se han reconocido especies que son causa de enteritis alimentaria: Aeromonas hydrophila y Plesiomonas shigelloides. Dentro del género Plesiomonas, P. shigelloides es la única especie. P. shigelloides es un bacilo anaerobio facultativo, asporógeno y gramnegativo. Mide 2-3 u de largo por 1 u de grueso. Es móvil, mediante flagelos polares lofotricos. Se trata de bacilos rectos y extremos redondeados aunque, a veces, presenta forma filamentosa. A pesar de que la mayoría son móviles por flagelos polares, en cultivos jóvenes, pueden aparecer flagelos laterales. Se han encontrado, incluso, cepas sin flagelos inmóviles. P. shigelloides es una especie catalasa y oxidasa positiva, fermenta la glucosa sin producción de gas, fermenta el inositol y da reacción positiva con la lisina, ornitina y arginina. No fermenta la sacarosa, manitol, dulcitol, adonitol ni xilosa. El IMViC para Plesiomonas se corresponde con + +- -. Esta especie bacteriana fue descubierta en 1947 por Ferguson y Henderson (Ferguson, Henderson, 1947) y denominada C27. Posteriormente se describió como una especie móvil de la familia Enterobacteriaceae. En 1960, por sus muchas similitudes con el género Aeromonas, se denominó Aeromonas shigelloides. En 1962, Habs y Schubert (Habs, Schubert, 1962) integran a este microorganismo en un nuevo género, Plesiomonas, con una sola especie: Plesiomonas shigelloides, incluyéndose dentro de la familia Vibrionaceae (Schubert, 1984) junto con los géneros Vibrio y Aeromonas. El género Plesiomonas se diferencia, esencialmente, de los otros dos géneros de la familia Vibrionaceae porque fermenta el inositol. P. shigelloides está ampliamente distribuida en la naturaleza. Se considera germen patógeno de origen acuático, encontrándose normalmente en la superficie de aguas frescas, estuarios y en agua de mar durante épocas calurosas. El agua es, probablemente, la fuente más importante en las infecciones humanas. También se 165
166
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
ha aislado en el intestino de diversos animales: peces, crustáceos, aves, reptiles, animales domésticos (perro, gato) y salvajes. Su aislamiento es más fácil durante los meses calurosos, al encontrarse en mayor número. P. shigelloides no es habitante normal del intestino humano, pero se aísla de las heces de pacientes diarreicos. Este microorganismo puede ser causa de colitis aguda. La infección diarreica del hombre es, probablemente, transportada de forma directa por el agua o por contaminación de los alimentos. Las infecciones extraintestinales ocasionadas por este germen son, principalmente, meningitis, septicemia y osteomielitis. Los síntomas asociados con la enfermedad gastrointestinal producida por P. shigelloides incluyen: diarrea, con heces acuosas, no sanguinolentas, dolor abdominal, náusea, vómitos, escalofríos, dolor de cabeza y fiebre. El periodo de incubación de la enfermedad está entre 24-48 horas y los síntomas pueden durar de 1-9 días. La fuente más común de la infección es el consumo de agua contaminada, y hay constancia de varios brotes con cientos de enfermos. Otra vía de contaminación es el consumo de alimentos contaminados crudos, como es el caso de las ostras. La infecciones extraintestinales son más raras, afectando a personas con defensas bajas: niños, ancianos e inmunodefícientes. Se considera un germen «oportunista». La temperatura mínima de crecimiento para P. shigelloides es de 8 °C. El crecimiento óptimo se sitúa entre 30°-38° C y la temperatura máxima a 40°-45 °C. No es resistente al calor y se destruye a 60 °C en 30 minutos. La tolerancia de P. shigelloides a valores de pH bajos es mayor que la de muchas bacterias gramnegativas. Puede iniciar su crecimiento a pH 4.0 y crecer en condiciones óptimas a pH 4.5. Su pH máximo de crecimiento es 9.0. No crece por debajo de pH 4.0. La concentración de cloruro sódico que permite el crecimiento de P. shigelloides depende de la riqueza nutricional del medio donde se desarrolle. En caldo triptona puede crecer con un 3 por 100 de sal, pero no con 4 por 100; en caldo triptona soja, más nutritivo, todas las cepas crecen con 4 por 100 de cloruro sódico y, casi el 70 por 100, con 5 por 100. (Miller, Kobrungen, 1986). Límites de crecimiento de P. shigelloides Mínimo Crecimiento °C PH CINa%
o
8 4,0 -
Óptimo
Máximo
30° 7,0 -
45° 9,0 5
El control de P. shigelloides en alimentos consiste en asegurar su destrucción utilizando temperaturas de calentamiento adecuadas, teniendo en cuenta que se destruye con una temperatura de 60 °C aplicada durante 30 minutos. El mayor pe-
INVESTIGACIÓN DE PLESIOMONAS SHIGELLOIDES
167
ligro está en la ingestión de agua contaminada y consumo de alimentos contaminados consumidos crudos, como las ostras, almejas etc. Como ya se ha señalado, P. shigelloides, dentro del género Plesiomonas, se considera una especie única y sus principales características son: Características de Plesiomonas shigelloides Movilidad
+
Catalasa Oxidasa Fermentación glucosa Gas de glucosa Fermentación inositol Arginina dihidrolasa Ornitina decarboxilasa Lisina decarboxilasa Indol
+ + + + + + + +
MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE PLESIOMONAS SHIGELLOIDES Puesto que este microorganismo se ha relacionado con casos de enteritis en el hombre por ingestión de agua y alimentos contaminados, ha sido necesario poner en práctica métodos para su detección. Algunas técnicas de aislamiento se reducen a la siembra directa en placas que contienen un medio de cultivo específico para el crecimiento del germen. Este método se utiliza, sobre todo, en el análisis de muestras clínicas (heces diarreicas). En éstas aparece P. shigelloides de forma predominante cuando la enteritis ha sido producida por esta especie bacteriana. Para su detección en alimentos, se aconseja una fase de enriquecimiento, particularmente si se supone que el germen está estresado. El alimento de P. shigelloides se puede hacer: — por recuento directo en placas, sembrando en un medio selectivo; — previo enriquecimiento en un medio líquido adecuado seguido de siembra en medio sólido selectivo. Recuento directo en placas Material — — — —
Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Asa de vidrio de Drigalski. Asa de cultivo. Placas de Petri estériles de 90 mm de diámetro.
168
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— Estufa de cultivo. — Hilo recto de siembra en nicrom de 1 mm de diámetro. — Baño de agua. Medios de cultivo Agua de triptona (TW: Tryptone water) Composición: Triptona Cloruro sódico Agua destilada
10 g 5g 1.000 ml
Mezclar y disolver los ingredientes en el agua. Ajustar el pH a 7.2 ±0.1. Distribuir en tubos de ensayo de 16 x 160 mm., a razón de 9 mi. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Agar inositol-bilis-verde brillante (IBB: Inositol Bile Brilliant Green) Composición: Peptona Bilis de buey Verde brillante Rojo fenol Inositol Agar Agua destilada
5g 10 g 7,5 g 40,0 g 5g 7,5 g 950 ml
Mezclar los ingredientes con el agua. Llevar la mezcla a ebullición para disolver dichos ingredientes, removiendo de vez en cuando. Ajustar el pH a 7.2 ± 0.1. Enfriar rápidamente en agua del grifo hasta los 50 °C y mantener el medio en baño de agua regulado a 47 °C. Por su sensibilidad al calor, NO SE ESTERILIZA EN AUTOCLAVE. Repartir el medio en placas de Petri de 90 mm, estériles, a razón de 15 ml. Medio GN en tubos (para diagnóstico de bacterias gramnegativas) (consúltese el capítulo 18 para investigación de Aeronionas hydrophila). Agar salicina (consúltese el capítulo 18 para investigación de Aeronionas hydrophila). Técnica de recuento directo en placas A partir de una «serie de diluciones decimales» del producto a analizar, se transfiere, por duplicado, 0.1 mi de cada una de las diluciones a la superficie bien seca del medio agar inositol-bilis-verde brillante (IBB) y se disemina con asa de
INVESTIGACIÓN DE PLESIOMONAS SHIGELLOIDES
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Drigalski. Incubar a 30 °C durante 24-48 horas. Contar las colonias rodeadas de un halo amarillo sobre fondo rojo en la placa elegida, preferentemente en las que contengan entre 20 y 200 colonias. El crecimiento típico de P. shigelloides en el medio se debe a la producción de ácido por fermentación del inositol, característica de este microorganismo. Confirmación de las colonias La confirmación de las colonias típicas de P. shigelloides crecidas sobre agar IBB, se hace en dos medios: — Medio GN (gramnegativos) — Agar salicina Técnica de confirmación de las colonias Se toma una colonia inositol positiva, bien aislada, crecida sobre agar IBB y se siembra en el fondo y a lo largo de un tubo de medio GN por picadura, mediante un hilo recto de nicrom de 1 mm de diámetro. Incubar a 30 °C durante 24-48 horas. Los resultados se consideran positivos cuando en el medio GN fermenta la glucosa (viraje del medio VRBG en la capa inferior del tubo), pero sin producción de gas. P. shigelloides es oxidasa positiva. Para detectar la oxidasa se frota una porción del crecimiento obtenido en el medio GN en un papel de filtro humedecido en una solución acuosa de clorhidrato de N dimetil parafenilendiamina. En el caso de que aparezca en el filtro un color púrpura intenso, la reacción de oxidasa es positiva. En el medio GN las especies móviles se desarrollan formando un crecimiento difuso a lo largo de la línea de siembra o una turbidez más intensa. P. shigelloides es un germen móvil. NOTA: aunque P. shigelloides es SH, e indol positiva, estas características no se manifiestan en el medio GN. Para la confirmación de P. shigelloides en agar salicina, se toma una colonia inositol positiva, bien aislada, crecida sobre agar IBB y se siembra, por picadura, en agar salicina. Incubar a 30 °C durante 24-48 horas. Después de la incubación no se produce viraje al amarillo en el medio porque P. shigelloides no fermenta la salicina. Para calcular el número de gérmenes por gramo o mililitro del producto analizado, se multiplican las colonias, contadas y confirmadas en la placa elegida, por 10 veces el factor de dilución de la misma, ya que se ha partido de un inoculo de 0.1 mi para sembrar las placas de agar IBB. Prueba de Presencia-Ausencia (P-A), previo enriquecimiento en medio líquido selectivo Material — Tubos de ensayo de 16 x 160 mm — Asa de vidrio de Drigalski
170
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— — — — — —
Asa de cultivo Placas de Petri de 90 mm Estufa de cultivo Baño de agua Hilo recto de siembra de nicrom de 1 mm de diámetro Matraces de 50 ml
Medio de cultivo Caldo de enriquecimiento EE de Mossel, doble fuerza (consúltese capítulo 18) Técnica para investigar la Presencia-Ausencia (P-A), previo enriquecimiento. Preennquecimiento de los gérmenes Sembrar, por duplicado, 1 mi de cada tubo de una «serie de diluciones decimales» del producto a analizar en matraces de 50 mi conteniendo 9 mi de agua de triptona (TW). Mezclar bien. Para el preennquecimiento de los gérmenes, mantener los matraces durante 6 horas a temperatura de laboratorio, agitándolos manualmente cada hora. Enriquecimiento Después de 6 horas de preenriquecimiento, añadir a los matraces 10 ml de caldo EE de Mossel, doble fuerza. Agitar bien e incubar a 30° ± 1 °C durante 18-24 horas. Pasado este tiempo, agitar los matraces y sembrar, con asa de cultivo, desde el caldo de enriquecimiento a la superficie bien seca de agar IBB contenido en placas de Petri. Incubar a 30 °C durante 18-24 horas. La fermentación del inositol, sustancia que integra el agar IBB, se detecta por la presencia de un halo color amarillo alrededor de las colonias. P. shigelloides fermenta el inositol. Confirmación Se emplea la misma sistemática que para el recuento directo en placas. Prueba rápida Se puede utilizar el API 20 NE, para identificación de bacterias gramnegativas, no Enterobacteriaceae.
20
Investigación de Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes, por su interés para la salud pública y su impacto económico, es uno de los gérmenes de origen alimentario más importantes en los últimos 20 años. En 1926, Murray aísla este germen en conejos de laboratorio y, posteriormente, otros investigadores lo encontraron en: — — — — — — — — —
Ovejas y bóvidos (1928). Hombre (1929). Moscas (1933). Ratas (1942). Cabras (1943). Équidos (1944). Aves (1944). Perro (1944). Cerdo (1950).
Hoy en día se sabe que este microorganismo está distribuido ampliamente en la naturaleza. Desde su aislamiento se ha denominado de diversas formas: Bacterium monocytogenes, por ser la monocitosis uno de los síntomas de la enfermedad. Listeria hepatolytica, en honor a Lister y por su asociación con una alteración del hígado del conejo. Listeria monocytogenes, denominación que ha prevalecido y que fue propuesta por Pirie en 1940. En principio, el género Listeria estaba incluido dentro de la familia Corynebacteriaceae. Actualmente, el Manual de Bergey integra al género Listeria en el denominado «Grupo de bacilos no esporulados grampositivos» junto con otros géneros: — Listeria. — Lactobacillus. 171
172
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— — — —
Brochothrix. Renibacterium. Kwthia. Cariophanon.
Dentro del género histeria se incluyen las especies: — — — — — — — —
L. monocytogenes. L. innocua. L. welshimeri. L. seeligeri. L. ivanovii. L. grayi. L. murrayi. L. denitrificans.
Las tres últimas especies han sido sometidas a reclasificación. Actualmente, L. denitrificans se conoce como Jonesia denitrificans. La única especie de Listeria patógena para el hombre es Listeria monocytogenes. L. monocytogenes es un germen de forma bacilar, no esporulado, móvil, grampositivo, anaerobio facultativo, catalasa positivo y que crece bien a temperatura de refrigeración. Es un bacilo corto y con extremos redondeados. Mide entre 0,5-2 u de largo por 0,2-0,5 u de grueso; a veces adopta forma de cocobacilo. Se presenta aislado, en parejas, cadenas cortas o agrupado en V. La movilidad se debe a flagelos peritricos y se manifiesta mejor entre 20o25 °C; a 37 °C llega a ser imperceptible o nula, reduciéndose el número de flagelos a uno o dos situados en la región polar. Se mueve de forma característica, mediante un lanzamiento rápido combinado con saltos y rotación. La movilidad es óptima entre 20°-22 °C. Respecto a la temperatura de crecimiento, sus límites están entre l°-45 °C, con una óptima de 30°-37 °C. Es un germen psicrotrófico, aunque a 4°-5 °C su crecimiento es más lento. Para que se destruya L. monocytogenes son necesarios 70 °C, aplicados durante 2-3 minutos siempre que esta temperatura/tiempo, alcance el centro del producto. L. monocytogenes se puede desarrollar entre valores de pH comprendidos entre 5,0-9,0. Pasados estos límites se inhibe su crecimiento, pero sobrevive. Su pH óptimo es 7,5. Produce hemolisina beta, característica relacionada con su patogenicidad. Características generales de Listeria monocytogenes Forma y tamaño Bacilos 0,5-2µ x 0,2-0,5 µ
Gram
Movilidad
pH
+
+
5-9
Agrupación Solos, cadenas cortas o V
INVESTIGACIÓN DE USTERIA MONOCYTOGENES
173
Dentro del «Grupo de bacilos no esporulados grampositivos», donde, en el Manual de Bergey se incluye el género histeria, se puede confundir con otros géneros: — — — —
Brochothrix. Erysipelothrix. Lactobacillus. Kurthia.
En el cuadro siguiente se muestran las diferencias entre ellos. Diferenciación entre algunos géneros del «Grupo de bacilos no esporulados grampositivos» respecto al género histeria Género listeria Brochothrix* Erysipelothrix hactobacillus Kurthia
1
2
3
4
+ + -** +****
Anaer. facult. id. id. id. Aerobio
+ + + +
+ + -**** + 1. 2. 3. 4. 5.
* Brochothrix thermosphacta es psicrotrófica como Listeria pero no crece a 35 °C ** Hay una cepa móvil. *** No todas las cepas son móviles. **** Hay alguna cepa catalasa positiva.
5 + + + + -
Movilidad Necesidad de CO, Crecimiento a 35 °C Catalasa Acido de glucosa
En este otro cuadro se expone la diferenciación entre las especies del género histeria: Pruebas diferenciales entre especies del género histeria Prueba
1
2
3
4
5
6
7
8
Fermentación sin gas de: — Glucosa — Esculina — Maltosa — Ramnosa — Xilosa — Manitol Hemolisis Prueba CAMP (St.aureus) Prueba CAMP (Rh equi)
+ + + + + + -
+ + +
+ + +
+ + + + + + -
+ + + V + -
+ + + + + -
+ + + V + + -
+ + + + + -
V
-
-
+ -
-
+
-
+
1
Listeria monocytogenes
5
Listeria welshimeri
2 3 4
Listeria innocua Listeria ivanovii Listeria seeligeri
6 7 8
Listeria grayi Listeria murrayi Listeria denitrificans
174
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Listeria monocytogenes posee constitución antigénica, mediante antígenos O y H identificados, que se usan para subdividir a este microorganismo en varios serovars: Serotipos de especies de Listeria L. monocytogenes
l/2a, l/2b, l/2c
L. ivanovii L. innocua L. welshimeri L. seeligeri
3a, 3b, 3c 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7 5 6a, 6b, 6c 6a, 6b l/2a, 4c, 4d, 6b
Respecto a fagos, están presentes en casi todas las especies conocidas y ascienden a unos 31. No se han aislado en L. grayi ni en L. murrayi. En los siguientes cuadros se exponen los límites de distintos factores entre los cuales puede crecer L. monocytogenes y la supervivencia de este microorganismo en distintos ambientes:
Límites de algunos factores entre los cuales es posible el crecimiento de Listeria monocytogenes Factor
Máximo
Temperatura pH Cloruro sódico
44 °C 9,5 2%
Mínimo 2,5 °C 4,5
Supervivencia de L. monocytogenes en distintos ambientes Aitihipiite
Leche past. (71,7 °C) Forraje Paja Heces Suelo fértil Suelo arcilloso Suelo húmedo
Supervivencia positiva
negativa
nivel alto 3 meses 6 meses 1 mes 9 meses 2 meses 2 años
nivel bajo
INVESTIGACIÓN DE USTERIA MONOCYTOGENES
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PODER PATÓGENO DE LISTERIA MONOCYTOGENES PARA EL HOMBRE Respecto a su poder patógeno para el hombre, L. monocytogenes es un microorganismo de carácter ubicuitario que actúa como patógeno cuando las condiciones del huésped son favorables para su desarrollo. La enfermedad que produce se denomina listeriosis y, en el caso de los alimentos, el germen actúa por vía digestiva. Por su ubicuidad se encuentra en zonas sucias y zonas húmedas. En la industria se encuentra en suelos, desagües, aire acondicionado, proximidades de pasteurizadores y enfriadores de leche, gotas de condensación, etc. así como piensos de mala calidad microbiológica, pájaros, vacas, mataderos, industrias de la carne y lugares similares. En la industria, por estas circunstancias, L. monocytogenes tiene fácil acceso a los productos alimenticios en las distintas fases de su elaboración. Es un germen «oportunista» que se aprovecha de la debilidad de las víctimas a las que ataca: niños, ancianos y personas debilitadas. Antes de 1980, L. monocytogenes se consideraba sólo como causa de enfermedad en animales, sobre todo rumiantes, ocasionando, principalmente, abortos y encefalitis. Con posterioridad, fue reconocida como vehículo en los alimentos y causa de infecciones en el hombre. En veterinarios se dan casos de Hsteriosis cutánea por manipulaciones obstétricas; también pueden aparecer afecciones en ojos y piel por malas manipulaciones de laboratorio. En Alemania, entre 1949-51 se produjo un gran brote por consumo de leche contaminada, pero no es hasta 1980 cuando se estudian diversos brotes en Estados Unidos y Europa en los que estuvieron implicados diversos alimentos. Los brotes son infrecuentes, apareciendo generalmente de forma esporádica. La enfermedad se está incrementando en algunos países. Existe un estado de portador asintomático. En España se han hecho estudios de portadores, obteniendo una frecuencia global del 3,8 por 100 con una incidencia del 18 por 100 en varones adultos y un 31 por 100 en mujeres embarazadas. La listeriosis es una enfermedad peculiar con una alta tasa de mortalidad. Los rasgos clínicos van desde una gripe benigna a meningitis o meningoencefalitis. Es más frecuente en mujeres embarazadas, niños, ancianos o inmunodeprimidos. El periodo de incubación varía entre 1-70 días. En mujeres embarazadas, sobre todo en el 2° trimestre de gestación, la presencia de L. monocytogenes se puede corresponder con los síntomas de una gripe leve; la meningitis en este caso es muy rara. L. monocytogenes puede dar paso al feto a través de la madre por vía placentaria y dar lugar a: aborto, muerte durante el nacimiento o a una listeriosis neonatal. En este último caso la enfermedad puede ser de comienzo precoz (a los 2-3 días del nacimiento) después de la infección en el útero, o de comienzo tardío (más de 85 días después del nacimiento) al ser infectado el recién nacido durante el parto o, posteriormente, en el periodo neonatal. En el caso de la listeriosis neonatal de comienzo precoz, los síntomas suelen ser: neumonía, septicemia y abscesos diseminados, con una tasa de mortalidad del 40-50 por 100. En la listeriosis neonatal de comienzo tardío, el principal rasgo de enfermedad es la meningitis; en este caso la mortalidad es, aproximadamente, de un 25 por 100.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
En personas mayores o inmunodeprimidas predominan la meningitis y la septicemia; en ocasiones, meningoencefalitis, encefalitis, adenitis, endocarditis etc. En los inmunodeprimidos, la listeriosis afecta a individuos con enfermedades subyacentes: transplantados renales, cancerosos, con hepatopatías, enfermos de SIDA, etc. En la industria ocurre que, por su ubicuidad, L. monocytogenes tiene un acceso fácil a los productos alimenticios en las diversas fases de su elaboración, partiendo de las granjas, principalmente.
Esquema 1
A partir de 1980 se han producido varios brotes importantes de listeriosis humana, claramente identificados, entre los que se ecuentran los siguientes: — En Alemania (1966), con 337 personas afectadas y 108 muertes. No se identificó la procedencia de L. monocytogenes. — En Francia (1975-1976), con 167 personas afectadas. — En Estados Unidos (Nueva Escocia) y Canadá (1981), con 34 personas afectadas y 18 defunciones. El alimento involucrado fue ensala de col. — En Estados Unidos (Massachusetts) (1983), con 49 personas afectadas y 29 muertes. El alimento causante del brote fue leche pasteurizada. — En Estados Unidos (California) (1985), con 142 personas afectadas y 31 defunciones. El alimento involucrado fue queso tipo mejicano elaborado en California. — En Suiza (1987), con 30 personas afectadas y 10 muertes. El origen del brote fue atribuido a queso de pasta blanda. — Francia (1992), se detectan 244 casos con 51 muertes.
INVESTIGACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES
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La contaminación de la leche se produce — Del suelo al ensilado: Listeria puede sobrevivir en el suelo seco más de 2 años. De aquí pasa a contaminar el forraje y, posteriormente, el ensilado. En el ensilado se multiplica hasta que la acidificación no baje de pH 5, aunque puede sobrevivir en estas condiciones durante más de un año. — Del ensilado a las heces: El animal ingiere las Listeria con el ensilado, que se multiplican en el aparato digestivo o transitan por él, pasando a las heces. En éstas persisten entre tres meses y un año. — De las heces a la leche: Con el estiércol de los corrales se ensucian los pezones y L. monocytogenes pasa a la leche. Son reservorios de Listeria monocytogenes: — — — — — — — — — — — — — — — — —
Hombre. Animales domésticos. Animales salvajes. Aves. Roedores. Artrópodos. Peces. Crustáceos. Larvas de insectos. Batracios. Ambiente. Aguas superficiales. Aguas estanques. Aguas de río. Aguas de alcantarillado. Vegetales y plantas. Suelo, etc.
Su extensa distribución en la naturaleza se explica porque crece o sobrevive entre temperaturas amplias (4°-65 °C). Los alimentos donde se ha aislado Listeria monocytogenes son numerosos, entre ellos: — Leche y productos lácteos. En la leche cruda de vaca se encuentran en mayor o menor cantidad todas las bacterias patógenas procedentes de las heces del animal, incluidas especies del género Listeria, por lo que este producto y sus derivados pueden ser causa de listeriosis humana. — Carne y productos cárnicos. En estos productos, el 30 por 100 de las muestras analizadas son positivas a L. monocytogenes. — Canales de aves. La contaminación de las canales de aves por L. monocytogenes es elevada, siendo el 50 por 100 de las muestras positivo. — Alimentos vegetales. En los vegetales la contaminación es menor, limitándose a 5-8 gérmenes por gramo. — Pescados. Los pescados capturados en alta mar están exentos de este mi-
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
croorganismo. La contaminación por L. monocytogenes suele ser de un 10 por 100 de las muestras analizadas de pescados, puestos a la venta. — Mariscos. La contaminación en los mariscos es algo superior a la de los pescados, entre 12-15 por 100 de las muestras analizadas. No se conoce bien la incidencia de la listeriosis humana, ya que no en todos los países es enfermedad de declaración obligatoria. En otros, es voluntaria. La dosis mínima necesaria de L. monocytogenes para contraer la listeriosis no se conoce bien. En el sector lácteo hay una norma microbiológica comunitaria para este germen: Ausencia/25 g. Este texto comunitario no existe para carne y productos cárnicos. INVESTIGACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN ALIMENTOS Dado que L. monocytogenes está muy difundida en el medio ambiente, su presencia en los alimentos es inevitable. La asociación de la listeriosis con los alimentos ha sido algo nuevo e insospechado hasta la aparición de varios brotes de esta enfermedad en Estados Unidos que se relacionaron con el consumo de distintos alimentos. A partir de los citados brotes, se han probado numerosos métodos para detectar en los alimentos al microorganismo causante de esta enfermedad en el hombre, histeria monocytogenes. Como suele ser habitual en la detección de gérmenes en alimentos, se necesita una fase de enriquecimiento previa al aislamiento en medios sólidos selectivos. Por lo general, salvo excepciones, la concentración de esta bacteria en algunos alimentos suele ser baja, normalmente inferior a 102/g, por lo que el éxito de su detección en los mismos depende del enriquecimiento. Para el enriquecimiento de L. monocytogenes se han usado distintos procedimientos, principalmente: — enriquecimiento en frío, aprovechando su característica de germen psicrotrófico; — enriquecimiento en medios selectivos. Gray, en 1948, aprovechando la capacidad de L. monocytogenes para crecer a temperatura de refrigeración, usó como medio de enriquecimiento el frío, logrando así suprimir gran parte de la flora competitiva, incapaz de desarrollarse a baja temperatura. El procedimiento tiene la desventaja de requerir periodos de incubación prolongados, incluso de semanas o meses, ya que el tiempo generacional de esta especie bacteriana es de 1,5 días El enriquecimiento en caldos selectivos es en la actualidad el método más utilizado para la investigación de L. monocytogenes en alimentos. En las distintas fórmulas de los caldos de enriquecimiento se integran sustancias que, como los antibióticos, suprimen o inhiben el crecimiento de la mayor parte de la flora competitiva permitiendo, no obstante, el desarrollo de Listeria. Entre las sustancias que integran los distintos medios, figuran: feniletanol (inhibe el crecimiento de la flora gramnegativa); cloruro de litio (suprime la fio-
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ra gramnegativa y grampositiva distinta de L. monocytogenes); glicina (actúa de la misma forma que el cloruro de litio). En cuanto a los antibióticos (moxalactam, ácido nalidixico, bacitracina y otros) son selectivos para Listeria y suprimen la mayoría de los géneros de origen alimentario. De esta forma se reducen a días las semanas o meses necesarios para el enriquecimiento en frío. Para leche y productos lácteos se puede seguir la técnica de LOVETT, conocida también como método de FDA.
INVESTIGACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS Material — — — — — — — — — — — — — — — — —
Balanza. Triturador homogeneizador Stomacher. Estufas de cultivo reguladas a 30 °C y 37 °C. Centrífuga. Lupa. Microscopio de contraste de fase. Matraces Erlenmeyer de 500 mi y 250 mi. Pipetas de 10 ml y 1 ml. Tubos de ensayo de 16 x 125 mm con tapón a rosca. Placas de Petri de 90 mm. Placas microtiter de fondo en U. Portaobjetos y cubreobjetos. Jeringuillas y agujas. Asa de cultivo. Aguja de siembra. Hisopos estériles. Micropipeta.
Medios de cultivo y reactivos Caldo de triptona soja-extracto de levadura (TSB-YE) Composición: Caldo de triptona soja (TSB) Extracto de levadura Agua destilada
30 g 6g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua y calentar hasta ebullición. Ajustar el pH a 7,3 ± 0,1. Distribuir en matraces de 500 ml a razón de 225 ml y en tubos de ensayo de 16 x 125 mm con tapón a rosca a razón de 10 ml. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Caldo de enriquecimiento selectivo (EB: Enrichment Broth) Composición: Caldo TSB-YE estéril Solución de acriflavina Solución de cicloheximida Solución de ácido nalidíxico
500 ml 5 ml 5 ml 5 ml
Solución de acriflavina Acriflavina Cl Agua destilada
15 mg 10 ml
Solución de cicloheximida Cicloheximida Etanol Agua destilada
50 mg 4 ml 6 ml
Solución de ácido nalidíxico Acido nalidíxico Hidróxido sódico 0,05 N
40 mg 10 ml
Medio completo A 500 ml de caldo triptona soja-extracto de levadura (TSB-YE) estéril se añaden, asépticamente, 5 ml de cada una de las soluciones que integran el medio (solución de acriflavina, solución de cicloheximida y solución de ácido nalidíxico). El caldo de enriquecimiento así preparado (EB), se distribuye en matraces Erlenmeyer de 250 ml, estériles, a razón de 100 ml y en tubos de ensayo de 16 x 125 mm con tapón a rosca, también estériles, a razón de 10 ml por tubo. Solución de hidróxido potásico Composición: Hidróxido potásico Cloruro sódico Agua destilada
2,5 g 20 g 1.000 ml
Disolver. Distribuir a razón de 4,5 ml en tubos con tapón a rosca de 16 x 125 mm. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 10 minutos. El pH debe estar por encima de valor 12. Mantener a temperatura ambiente. NOTA: el hidróxido potásico absorbe el CO, de la atmósfera. Si el pH alcanza 12,3 es necesario desechar el reactivo.
INVESTIGACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES
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Agar selectivo MacBride modificado Agar base Composición: Agar feniletanol Glicina anhidra Cloruro de litio Agua destilada
35,5 g 10 g 0,5 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento. Ajustar el pH a 7,3 ± 0,1. Distribuir en matraces Erlenmeyer de capacidad adecuada, a razón de 100 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Suplemento Cicloheximida Etanol Agua destilada
200 mg 4 ml 6 ml
Disolver la cicloheximida en el etanol/agua. Medio completo Agar base Suplemento
100 ml 1 ml
El agar base licuado en corriente de vapor o baño mana hirviendo se enfría a 47°-50 °C, añadiendo a continuación, asépticamente, 1 ml del suplemento mezclando cuidadosamente. El medio completo se distribuye en placas de Petri estériles de 90 mm de diámetro, a razón de 10-12 ml, para obtener una capa de medio poco espesa. Las placas así preparadas se pueden mantener durante una semana en refrigeración. Medio de Oxford Agarbase Composición: Agar base Columbia Esculina Citrato férrico amónico Cloruro de litio Agua destilada
19,5 g 0,5 g 0,25 g 7,5 g 500 ml
Disolver los ingredientes en el agua. Ajustar el pH a 7,0 ±0,1. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Suplemento Composición: Cicloheximida Sulfato de colistina Acriflavina Cefotetan Fosfomicina Mezcla etanol agua 4/6
200 mg 10 mg 2,5 mg 1 mg 5 mg 5 ml
Medio completo Agar base Suplemento
500 ml 5 ml
El suplemento se añade, asépticamente, al agar base atemperado. Peróxido de hidrógeno Solución de peróxido de hidrógeno el 3 por 100. Agar triptona soja-extracto de levadura (TSA-YE) Composición: Caldo triptona soja (TSB) Extracto de levadura Agar Agua destilada
30 g 6g 15 g 1.000 ml
Mezclar los ingredientes en el agua y disolverlos por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7,3 ±0,1. Distribuir en matraces Erlenmeyer, de capacidad adecuada, a razón de 100 ml y en tubos de ensayo a razón de 6 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Distribuir 15 ml en placas de Petri y dejar solidificar. Los tubos se solidificarán en posición inclinada. Equipo de tinción de Gram Caldo cerebro corazón (BHl) Composición: Brain infusión Heart infusión Proteosa peptona D (+) glucosa Cloruro sódico
12,5 g 5g 10 g 2g 5g
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Hidrógeno fosfato disódico Agua destilada
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2,5 g 1.000 ml
Mezclar los ingredientes en el agua y disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,4 ± 0,1. Distribuir en tubos de ensayo a razón de 10 ml por tubo. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Tampón salino Composición: Fosfato disódico Fosfato monosódico Cloruro sódico Hidrógeno fosfato disódico Agua destilada
8,98 g 2,71 g 8,5 g 2,5 g 1.000 ml
Mezclar y disolver los ingredientes en el agua. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. El pH de la solución debe ser 7,2 ± 0,1 medido a 25 °C. Suspensión de hematíes Composición: Sangre de oveja desfibrinada y estéril Tampón salino Se centrifuga la sangre a 3.000 rpm durante 15 minutos. Desechar el sobrenadante y homogeneizar el sedimento cuidadosamente con tampón salino para ser centrifugado de nuevo. Este lavado de hematíes se repite tres veces. Después del último lavado, se diluye 1
[email protected] del sedimento en 500 ml de tampón salino, lo que constituye la suspensión de hematíes, que es estable durante una semana a 4 °C. Agar sangre de ovino Composición: Agar sangre base n.° 2 Agua destilada Sangre de ovino desfibrinada
40 g 1.000 ml 70 ml
Disolver el agar base en el agua por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7,0 ± 0,1. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Atemperar el medio a 45°-50 °C y añadir, asépticamente, 7 ml de sangre de ovino por cada 100 ml de agar base. Mezclar uniformemente y distribuir en placas de Petri de 90 mm estériles, a razón de 20 ml y dejar solidificar. Sobre la placa, externamente, se marca un enrejado formando 20-25 cuadriculas.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Medio de agar con capa de sangre de caballo Agarbase Composición: Agar sangre base Columbia CNA Agua destilada
44 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Verter en placas de Petri de 90 mm de diámetro, estériles, a razón de 10 ml. Dejar solidificar y, cuando aún está templado el agar, cubrir con la capa superior de agar sangre. Agar sangre (capa superior) Al agar base Columbia CNA atemperado a 46 °C después de su esterilización o licuación, se le añade 4 por 100 de sangre de caballo y se mezcla perfectamente. Poner 5 ml de la mezcla sobre el agar base contenido en placas de Petri, cuando aún esta ligeramente templado, y extender la capa uniformemente. Conservar las placas preparadas en refrigeración, desechándose las que se decoloren. Son necesarias capas finas para facilitar la visión de beta hemolisis de las listeria. Agar sangre ovina para prueba CAMP Composición: Agar triptona soja (TSA) Sangre de ovino desfibrinada
1.000 ml 50 ml
La sangre se añade al medio estéril licuado y atemperado a 45°-50 °C, previamente esterilizado en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Mezclar bien y distribuir en placas de Petri de 90 mm de diámetro, estériles, a razón de 8 ml. Las placas con el medio se conservan en refrigeración, desechándose las que se decoloran. Agar urea de Christensen inclinado Composición: Peptona D (+) glucosa Cloruro sódico Dihidrógeno fosfato de calcio Rojo fenol Agar Agua destilada
1g 1g 5g 2g 0,012 g 12 g 1.000 ml
INVESTIGACIÓN DE USTERIA MONOCYTOGENES
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Mezclar y disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 6,8 ± 0,1 Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Atemperar a 45°-50 °C e incorporar, asépticamente, 50 ml de solución de urea al 40 por 100, esterilizada por filtración. Se mezcla bien y se distribuye en tubos estériles a razón de 6 ml. dejando que se solidifique en posición inclinada. Agar S1M para movilidad Composición: Triptona Peptona de carne Sulfato ferroso de amonio Tiosulfato de sodio Agar Agua destilada
20 g 6,1 g 0,2 g 0,2 g 3,5 g 1.000 ml
Mezclar y disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,3 ± 0,2 y repartir en tubos de 16 x 125 mm con tapón a rosca a razón de 6 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Caldo MR-VP Composición: Peptona de carne D (+) glucosa Hidrógeno ortofosfato dipotásico Agua destilada
7g 5g 5g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua. Ajustar el pH a 6,9 + 0,1. Mezclar bien y distribuir en tubos a razón de 3 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Solución indicadora de rojo de metilo Composición: Rojo de metilo Etanol absoluto
0,04 g 60 ml
Mezclar. Ajustar el pH a 5,0. La solución debe presentar color anaranjado. Reactivos para la investigación de acetil metil carbinol (prueba de Voges-Proskauer: VP) Composición: Solución A etanólica de alfa naftol Alfa naftol 6g Alcohol absoluto 100 ml Se conservará en oscuridad y frasco topacio.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Solución B de hidróxido potásico Hidróxido potásico Agua destilada
16 g 100 ml
Disolver y almacenar en refrigeración y frasco topacio. Solución de creatinina Composición: Monohidrato de creatinina Agua destilada
0,5 g 100 ml
Disolver y almacenar en frasco topacio. Agar hierro triple azúcar (TSI) Composición: Peptona decaseína Peptona de carne Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro sódico Lactosa Sacarosa D (+) glucosa . Citrato férrico Tiosulfato de sodio Rojo fenol Agar Agua destilada
15 g 5g 3g 3g 5g 10 g 10 g 1g 0,3 g 0,3 g 0,024 g 12 g 1.000 ml
Mezclar y disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7,4 ± 0,1. Distribuir en tubos de 17-18 mm de diámetro, a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 10 minutos. Dejar solidificar en posición inclinada para formar en el fondo una columna de unos 3 cm de altura y una superficie inclinada de 5 cm, aproximadamente. Caldo para fermentación de carbohidratos Caldo base Composición: Proteosa peptona Extracto de carne Cloruro sódico Púrpura de bromocresol Agua destilada
10 g 1g 5g 0,02 g 1.000 ml
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Mezclar y disolver los ingredientes en el agua por calentamiento hasta ebullición. Distribuir en tubos con campana Durham a razón de 9 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos Solución de carbohidratos Composición: Ramnosa o xilosa Agua destilada
5g 100 ml
Disolver separadamente cada azúcar en el agua destilada. Esterilizar por filtración. Medio completo Composición: Caldo base Solución de azúcar
9 ml 1 ml
A cada tubo que contiene caldo base se le añade, asépticamente, 1 mi de la solución de carbohidrato esterilizado por filtración. Cuando el carbohidrato que se vaya a utilizar es la esculina, se puede añadir al medio base, antes de ser esterilizado en autoclave, en cantidad suficiente para obtener una solución al 0,5 por 100. No se esteriliza por filtración. Medio y reactivos para la reducción de nitratos Medio para reducción de nitratos Composición: Caldo nutritivo KNO3 Agua destilada
13 g 1g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento hasta ebullición. Distribuir en tubos a razón de 5 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Reactivos para investigar la reducción de nitratos Reactivo A Ácido sulfanílico Ácido acético 5 N
0,8 g 100 ml
Disolver el ácido sulfanílico en el ácido acético por calentamiento suave.
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Reactivo B Alfa naftilamina Acido acético 5 N
0,5 g 100 ml
Disolver el primer ingrediente en el ácido acético por calentamiento suave. Polvo de zinc (reductor de nitratos) Sueros comerciales anti Listeria monocytogenes — Antisuero Listeria polivalente — Antisueros Listeria tipos 1 y 4 Comercializados por distintos laboratorios (Oxoid, Difco y otros) Caldo base de enriquecimiento selectivo (formulación UVM: Uníversity of Veri Mont) (Listeria Enrichment Broth: LEB 1) Composición: Proteosa peptona Triptona Lab Lemco en polvo Extracto de levadura Cloruro sódico Fosfato disódico Fosfato monopotásico Esculina Agua destilada
5g 5g 5g 5g 20 g 12 g 1.35 g 1g 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua. Ajustar el pH a 7,4 ±0,1. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Suplemento 1 Composición: Ácido nalidíxico Acriflavina Agua destilada
10 mg 6 mg 2 ml
Suplemento 2 Composición: Ácido nalidíxico Acriflavina Agua destilada
10 mg 12,5 mg 2 ml
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NOTA: la diferencia entre los suplementos 1 y 2 está en que el suplemento 2 lleva en su composición mayor cantidad de acriflavina. Caldo de enriquecimiento selectivo LEB1 (o UVM 1) Composición: Caldo base Suplemento 1
500 ml 2 ml
El suplemento se añade, asépticamente, al caldo base atemperado a 50 °C justo antes del uso. Mezclar y distribuir de forma aséptica a razón de 225 ml en matraces de 500 ml. Caldo de enriquecimiento selectivo LEB 2 (o UVM 2) Composición: Caldo base Suplemento 2
500 ml 2 ml
El suplemento se añade, asépticamente, al caldo base atemperado a 50 °C justo antes del uso. Mezclar y distribuir de forma aséptica a razón de 10 ml en tubos de 16 x 125 mm, estériles. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS Se describe a continuación el método de LOVETT, conocido también como método de la FDA. Preparación de la muestra Leche líquida Agitar vigorosamente el envase para la distribución homogénea de los microorganismos. Leche, suero y mantequilla en polvo, lactosa y caseína Mezclar perfectamente el contenido del envase en condiciones asépticas. Mantequilla Derretir al baño María y recipiente estéril a 45 °C. El análisis del producto será inmediato.
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Queso Se toma asépticamente la porción necesaria del producto, incluyendo la corteza. Helados Se deshace el producto a 37 °C, sin sobrepasar esta temperatura. Leches fermentadas, yogures, postres, flanes Se agita vigorosamente el envase cerrado para lograr una mezcla perfecta del producto. También se puede hacer una mezcla aséptica con el envase abierto. P re enriquecimiento (o enriquecimiento primario) El preenriquecimiento no es selectivo. Sirve para reparar las bacterias lesionadas. Se mezclan y homogeneizan 25 g de la muestra con 225 ml de caldo triptona soja-extracto de levadura (TSB-YE). Incubar a 30 °C durante 24 horas. Enriquecimiento selectivo o secundario Las sustancias inhibidoras que forman parte de la fórmula del caldo, suprimen o detienen el crecimiento de la posible flora acompañante. Se transfieren 10 ml del cultivo obtenido en el caldo de preenriquecimiento (TSB-YE), a un matraz que contenga 100 ml de caldo de enriquecimiento selectivo (Enrichment Broth: EB). Incubar a 30 °C durante 24 horas. Subenriquecimiento Para una mayor selección de Listeria, es aconsejable un subenriquecimiento del cultivo de enriquecimiento. Del cultivo de 24 horas obtenido en la fase de enriquecimiento, se siembra 0,1 mi en un tubo que contenga 10 ml de caldo EB. Incubar a 30 °C durante 24 horas. Aislamiento selectivo En esta etapa se obtienen colonias aisladas sobre medios de cultivo selectivos. Los medios de aislamiento deben favorecer el crecimiento de Listeria e impedir que se desenrollen gérmenes de la flora competitiva. Del cultivo obtenido sobre caldo EB en la fase de enriquecimiento, se siembra, con asa de cultivo, sobre los medios de aislamiento: — Agar MacBride modificado (MMA). — Medio de Oxford.
INVESTIGACIÓN DE USTERIA MONOCYTOGENES
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Incubar a 37 °C durante 48 horas. Del cultivo obtenido sobre caldo EB en la fase de enriquecimiento, diluido al 1/10 en KOH al 0,5 por 100 (1 ml del cultivo en 9 ml de la solución de KOH), se siembra sobre los medios de aislamiento: — Agar MacBride modificado (MMA). — Medio de Oxford. En este caso se mezcla 1 mi del cultivo de enriquecimiento con 9 ml de la solución de KOH. Agitar durante 2 segundos e, inmediatamente, con un hisopo estéril, se extiende la mezcla en la mitad de la placa de cada uno de los medios de aislamiento. Luego, con asa de cultivo, extender, a partir de la parte sembrada con el hisopo y dos veces, formando un ángulo de 90°.
Dibujo A.—Modelo de siembra en LEB 2.
Incubar a 37 °C durante 48 horas Del cultivo obtenido en la fase de subenriquecimiento, se siembra sobre los medios de aislamiento: — Agar MacBride modificado (MMA). — Medio de Oxford. Incubar a 37 °C durante 48 horas. Transcurrida la incubación de las placas sembradas, se procede a la confirmación de las colonias aisladas. El aspecto de las colonias se observará a las 24 y a las 48 horas por transiluminación. En el agar MacBride modificado, las colonias de histeria monocytogenes son pequeñas, inferiores a 1 mm y, con luz incidente oblicua, exhiben una superficie azulada y aspecto granular. Para su observación se emplea el método de iluminación de Henry, utilizando un microscopio estereoscópico con platina de vidrio transparente o un microscopio invertido, según el dibujo B y C:
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Dibujos B y C.—Transiluminación.
Es recomendable la lupa marca WILD, sencilla y fácil de manejar. En el medio de Oxford, las colonias de listeria monocytogenes muestran halos negros a su alrededor, debido a la capacidad de esta bacteria para hidrolizar la esculina, que con el citrato férrico amónico, ambos integrantes de la fórmula del medio, da lugar a la formación de compuestos fenólicos de hierro, de color negro.
Esquema 2.—Investigación de Listeria monocytogenes en productos lácteos.
INVESTIGACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES
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INVESTIGACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN CARNE Y PRODUCTOS CÁRNICOS Para la carne y productos cárnicos exponemos la técnica basada en el método de Lee y MacClain (USDA-FSIS) Enriquecimiento primario En esta primera fase de enriquecimiento se repara la subletabilidad de las bacterias lesionadas Se mezclan 25 g de la muestra con 225 ml de caldo LEB 1 (o UVM 1). De esta mezcla se ponen, asépticamente, 10 mi en un tubo estéril que se incuba a 30 °C durante 24 horas. Enriquecimiento secundario En esta técnica se utiliza un caldo de enriquecimiento que sus autores denominan UVM (iniciales de University of Vert Mont) o caldo LEB. Se emplean dos etapas de enriquecimiento (primario y secundario), utilizando el mismo caldo pero con distinta concentración de acriflavina, derivando así los medios LEB 1 (UVMl) y LEB2(UVM2). Se siembra 0,1 ml del cultivo obtenido sobre LEB 1, en 10 ml de caldo LEB 2. Incubar a 30 °C durante 24 horas. Aislamiento selectivo Del cultivo obtenido sobre el caldo de enriquecimiento secundario (LEB 2) se siembra sobre los medios de aislamiento: — Agar MacBride modificado (MMA) — Medio Oxford Incubar a 37 °C durante 48 horas. NOTA: Lee y MacClain utilizan en su método como medio de aislamiento selectivo el agar LPM, basado en la fórmula de MacBride, sustituyendo la cicloheximida por el antibiótico moxalactam. Durante mi investigación en el Servicio de Microbiología del Centro Nacional de Alimentación (Área Biológica), encontré mayores ventajas con el medio Oxford. Confirmación de las colonias aisladas En cualquiera de las dos técnicas descritas, bien sea para lácteos o para cárnicos, la confirmación de las colonias aisladas en los medios selectivos es idéntica, y los pasos posteriores son comunes. Para su confirmación se eligen, como mínimo, dos colonias con aspecto característico en cada medio de aislamiento. Cada colonia, individualmente, se siembra sobre agar triptona soja-extracto de levadura (TSA-YE ) contenido en pía-
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Esquema 6.—Investigación de Listeria monocytogenes en carnes y productos canucos.
cas de Petri. Incubar a 37 °C durante 24 horas. A partir de este cultivo se llevan a cabo las pruebas siguientes: Observación de las colonias Las colonias crecidas sobre agar triptona soja-extracto de levadura (TSAYE) se observan con lupa y luz incidente. Las Listeria muestran de esta forma colonias con tonalidad azul o gris azulada. Catalasa Sobre una de las colonias crecidas sobre TSA-YE, se deposita una gota de solución de agua oxigenada al 10 por 100. La formación de burbujas por desprendimiento de oxígeno, indica actividad catalásica positiva. Las Listeria son catalasa positivas. Coloración de Gram De colonias crecidas sobre TSA-YE, se hace una extensión sobre portaobjetos que se colorea por el método de tinción de Gram. Las Listeria se muestran como pequeños bacilos grampositivos.
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Hemolisis Las colonias integradas por bacilos pequeños, Gram positivos y catalasa positivos, se siembran en un tubo conteniendo 10 ml de caldo cerebro corazón. Incubar a 37 °C durante 24 horas. En una placa microtiter con pocilios en U, se ponen 100 ul de una suspensión de hematíes y 100 ul del cultivo obtenido sobre caldo cerebro corazón (BHI) bien homogeneizado, mezclando cuidadosamente con micropipeta. Se pondrán en la misma microplaca controles de cultivos positivos (L. monocytogenes) y negativos (L. innocua). Incubar a 37 °C durante 45 minutos y, posteriormente, 2 horas a temperatura de 4 °C. El resultado se lee en el fondo de los pocilios; un líquido rojo homogéneo indica reacción positiva (hemolisis). L. monocytogenes es una especie hemolítica dentro del género Listeria.
Dibujo D.—Hemolisis.
Realizadas estas pruebas, las colonias azuladas o azul grisáceas cuando se observan con la lupa, que están integradas por bacilos pequeños grampositivos, catalasa positivas y hemolíticas, se consideran Listeria.
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Incubación 37 °C 24 h ACTIVIDAD HEMOLÍTICA Esquema 3.—Confirmación
de colonias.
Pruebas complementarias de confirmación Para llegar a especie, es necesario efectuar otras pruebas complementarias para la confirmación. Colonias aisladas en TSA-YE se siembran en caldo triptona soja-extracto de levadura (TSB-YE ). Incubar a 37 °C durante 24 horas. El cultivo sirve como inoculo para efectuar pruebas bioquímicas y de fermentación de azúcares. El cultivo se puede utilizar durante varios días si se mantiene en refrigeración. Movilidad en fresco A partir de un cultivo obtenido sobre caldo TSB-YE incubado a 22 °C, se hace una preparación en gota pendiente que se observa al microscopio por contraste de fase y objetivo de inmersión. El movimiento de las listeria es característico: rotación y volteo. Movilidad en agar SIM A partir de un cultivo obtenido sobre caldo TSB-YE incubado a 22 °C, se siembra, por picadura, en agar SIM contenido en tubos de ensayo. Incubar a 25 °C durante 7 días. Las listeria crecen en forma de sombrilla.
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Movilidad en sombrilla
Dibujo E.—Movilidad en sombrilla.
Investigación de Rojo de metilo y Voges-Proskauer (MR-VP) A partir del cultivo sobre caldo TSB-YE incubado a 37 °C, se siembra un tubo conteniendo medio MR-VP. Incubar a 37 °C durante 48 horas. De este cultivo se pone 1 ml en un tubo limpio y se añaden 0,8 ml de solución A (alfa naftol) y 0,2 ml de la solución B (sol. de KOH al 40 por 100). Agitar y examinar. La reacción de Voges Proskauer es positiva (presencia de acetil-metil-carbinol) si aparece un fuerte color rojo. El resto del cultivo se incuba durante 2 días más, al cabo de los cuales se vierten sobre el mismo varias gotas de solución indicadora de rojo de metilo. La reacción es positiva cuando se produce un viraje del reactivo de anaranjado a rojo. Listeria monocytogenes es rojo de metilo y Voges-Proskauer positiva. Reacción sobre agar hierro triple azúcar (TSI) A partir del cultivo sobre caldo TSB-YE incubado a 37 °C, se siembra en la superficie y se pica en el fondo del medio agar hierro triple azúcar (TSI). Incubar a 37 °C durante 5 días. Las listeria acidifican la superficie y el fondo del medio (viraje a amarillo). No producen SH2 (ausencia de ennegrecimiento). Fermentación de ramnosalxilosa A partir del cultivo obtenido sobre caldo TSB-YE incubado a 37 °C, se siembra en tubos con caldo púrpura de bromocresol-ramnosa y caldo púrpura de bromocresol-xilosa. Incubar a 37 °C durante 7 días. h. monocytogenes fermenta la ramnosa sin producción de gas y no fermenta la xilosa. Agar urea inclinado A partir del cultivo obtenido sobre caldo TSB-YE incubado a 37 °C, se siembra en la superficie de agar urea inclinado. Incubar a 37 °C durante 5 días. Se observará diariamente. El enrojecimiento del medio indica que la reacción es positiva debido a la presencia de ureasa por parte del germen en estudio, h. monocytogenes, al no poseer ureasa, da reacción negativa.
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Reducción de nitratos a nitritos Del cultivo obtenido sobre caldo TSB-YE, se siembra en el medio para investigar la reducción de nitratos. Incubar a 35 °C durante 5 días. Añadir 0,2 ml del reactivo A e, inmediatamente, 0,2 ml del reactivo B. La aparición de un color rojo indica la presencia de nitritos, es decir, los nitratos han sido reducidos. Si no se ha desarrollado el color, añadir polvo de zinc y dejarlo actuar 1 hora. El desarrollo de un color rojo al añadir el zinc (sustancia reductora) indica que está presente el nitrato por no haber sido reducido previamente por los gérmenes. Sólo L. denitrificans y L. murrayi reducen nitratos a nitritos. Patogenicidad para el ratón Se toman 10 ml de un cultivo de 24 horas obtenido sobre caldo TSB-YE incubado a 37 °C y se centrifugan a 1.600 rpm durante 30 minutos. Después de desechar el sobrenadante, se resuspende el sedimento en 1 ml de solución salina fisiológica. Esta suspensión contiene, aproximadamente, 10 gérmenes por mililitro. Inocular, por vía intraperitoneal, 5 ratones Swiss White de 16-18 g de peso, con 0,1 ml de la suspensión concentrada. Se procede así con cada cultivo. Los ratones se observarán en el transcurso de 7 días para ver si mueren o sobreviven. Las cepas patógenas matan al ratón en este periodo de tiempo. Los ratones inoculados con cepas no patógenas permanecerán vivos. La prueba debe controlarse con cepas patógenas (L. monocytogenes) y no patógenas (L. innocua). Hemolisis En la confirmación de las colonias, citada con anterioridad, se ha descrito una prueba para comprobar la actividad hemolítica de las cepas aisladas. En el presente apartado se describe cómo se investiga, además, el tipo de hemolisis de dichas cepas: — Hemolisis en agar sangre ovina A partir del cultivo sobre caldo TSB-YE incubado a 37 °C, se siembra por picadura, abundantemente, en un cuadrado de los 20-25 que constituyen un enrejado hecho sobre la placa de Petri que contiene agar sangre de ovino. Al mismo tiempo se siembran cultivos testigo positivos y negativos. Incubar a 37 °C durante 48 horas. Para observar bien la hemolisis se utiliza luz brillante, pudiéndose ayudar como figura en el dibujo F de la página siguiente. L. monocytogenes y L. seeligeri producen beta hemolisis, con un ligero aclaramiento alrededor de la picadura. L. innocua no produce ningún aclaramiento, por no ser hemolítica. L. ivanovii muestra una zona de aclaramiento, perfectamente definida, alrededor de la picadura. — Hemolisis en agar sangre equina A partir del cultivo obtenido sobre caldo TSB-YE incubado a 37 °C, se siembra sobre medio de agar con capa de sangre de caballo. Incubar a 37 °C durante 48 horas:
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Dibujo F.—Observación de hemolisis.
Listeria monocytogenes muestra una zona estrecha de hemolisis alrededor de las colonias que puede ser difícil de detectar. Listeria seeligeri muestra una hemolisis semejante a la de L. monocytogenes. Listeria innocua no produce hemolisis Listeria ivanovii presenta una amplia zona de hemolisis alrededor de las colonias. La visualización de las colonias se facilita como se muestra en el dibujo G.
Dibujo G.—Ángulo de observación para placas sangre de caballo.
Prueba CAMP Se trata de otra prueba para la investigación de hemolisis dentro de la identificación de especies del género Listeria. La prueba CAMP (Christie, Atkins, Munch, Peterson), aprovecha la capacidad hemolítica de las distintas especies de Listeria para su confirmación. Se utiliza una placa de agar sangre ovina en la que se siembra en paralelo, y diametralmente opuestas, una cepa de Staphylococcus aureus beta hemolítico (ATCC 25178) y otra de Rhodococcus equi (ATCC 6939). Transversalmente a es-
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tas siembras, sin tocarlas y formando ángulo recto con ellas, se siembran los cultivos en estudio. Incubar a 37 °C durante 24-48 horas. L. monocytogenes y L. seeligeri producen su hemolisis en la zona de influencia de St. aureus. L. ivanovii lo hace en la zona de influencia de Rh. equi.
Dibujo H.—Prueba CAMP.
Como L. monocytogenes y L.seeligeri reaccionan de la misma forma en la prueba de CAMP, se deben diferenciar en la fermentación de los azúcares ramnosa y xilosa y en su patogenicidad o no para el ratón. Diferenciación de Listeria monocytogenes v listeria seelieeri
L. monocytogenes L. seeligeri
Ramnosa
Xilosa
Pat. ratón
+ -
+
+ -
Esquema 4.—Pruebas confirmativas complementarias.
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Esquema 5.—Pruebas diferenciales entre especies del género Listeria.
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Serología Las cepas aisladas e identificadas por pruebas confirmativas, se pueden serotipar utilizando sueros comerciales. La mayoría de las cepas de L. monocytogenes aisladas en los alimentos, enfermos y ambiente pertenecen a los serotipos 4b l/2a. En España predomina el tipo 4b (92 por 100) sobre el l/2a (8 por 100). La serotipificación por si sola no es suficiente para la identificación de L. monocytogenes sino un complemento en la caracterización del microorganismo aislado. Pruebas rápidas El protocolo de los métodos de aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes es largo y complicado. En el momento actual existen técnicas más simples, con resultados aceptables, basadas en reacciones inmunoenzimáticas. Se usan cuando es necesario intervenir de forma rápida, pero siempre son suplementarias al método convencional. La identificación por estos procedimientos se logra a nivel de género y son útiles como métodos de screening cuando hay que analizar muchas muestras: — ELISA (kit comercial, Organon Teknika, que utiliza anticuerpos monoclonales). — DNA (kit de hibridación para probar DNA por sonda: Genetrak). — API (kit). — Kit VICAM, MA, USA. — Método flow cytometric (para detección de L. monocytogenes en leche). Estas técnicas requieren un enriquecimiento previo de la muestra en caldos selectivos. MÉTODO NGFIS (NETHERLAND FOOD INSPECTION SERVICE) PARA AISLAMIENTO DE LISTERIA MONOCYTOGENES En este método se usa PALCAMY como caldo de enriquecimiento y PALCAM como agar selectivo en placas. El aislamiento de esta especie bacteriana, según la técnica, se puede hacer: — por recuento de L. monocytogenes en placas — por la prueba de Presencia-Ausencia (P-A), previo enriquecimiento en medio liquido selectivo Recuento de L. monocytogenes en placas Material — Autoclave. — Asa de vidrio de Drigalski.
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— — — —
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Hilo de siembra. Placas de Petri de 90 mm de diámetro. Estufa de cultivo. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm.
Medios de cultivo Medio polimixina-acriflavina-cloruro de litio-ceftacidina-esculina-manitol (PAL CAM. polimyxin acriflavin litium chloridre ceftazidime aesculin mannitol), según van Netten Composición: Caseína pancreática 5g Peptona 5g Peptona de soja 5g Extracto de levadura 5g Digestión tríptica de corazón, en polvo 3g Almidón 1g Cloruro sódico 5g Glucosa 0,5 g Manitol 10 g Esculina 0,75 g Citrato fénico amónico 0,5 g Cloruro de litio 15 g Rojo fenol 80 mg Agar 15 g Agua destilada 950 ml Mezclar. Ajustar el pH a 7,2 ± 0,1 y llevar a ebullición para disolver bien los ingredientes. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Enfriar al grifo a 48 °C y añadir, de forma aséptica: Acriflavina Sulfato de polimixina B Ceftacidína
5 mg 105 UI 25 mg
Mezclar bien y verter en placas de Petri a razón de 15 ml. aproximadamente. Cuando sea necesario utilizar un método que requiera una fase de preenriquecimiento para revivificar los gérmenes, mantener el medio en baño de agua a 48 °C. Agar sangre Composición: Caseína pancreática Peptona
5g 5g
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Peptona de soja 5g Extracto de levadura 5g Digestión tríptica de corazón, en polvo 3g Almidón 1g Cloruro sódico 5g Agar 15 g Agua destilada 950 ml Mezclar. Ajustar el pH a 7,2 ± 0,1 y llevar a ebullición para disolver bien los ingredientes. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Atemperar rápidamente a 48 °C y añadir 50 ml de sangre ovina desfibrinada, en condiciones asépticas. Mezclar y verter en placas de Petri a razón de 15 ml. aproximadamente. Agar xilosa Composición: Triptona Extracto de levadura Cloruro sódico Fosfato dipotásico Azul de bromotimol Agar Agua desfilada
2g 1g 5g 0,3 g 80 mg 15 g 900 ml
Mezclar. Ajustar el pH a 7,1 ±0,1 y llevar a ebullición para disolver bien los ingredientes. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Atemperar a 50 °C. Añadir, en condiciones asépticas, 100 ml de una solución de xilosa al 10 por 100 esterilizada por filtración. Mezclar bien y distribuir en tubos estériles de 16 x 160 mm a razón de 10 ml. dejándolos solidificar en posición vertical. Agar ramnosa Composición: Triptona Extracto de levadura Cloruro sódico Fosfato dipotásico Azul de bromotimol Agar Agua destilada
2g 1g 5g 0,3 g 80 mg 15 g 900 ml
Mezclar. Ajustar el pH a 7,1 +0,1 y llevar a ebullición para disolver bien los ingredientes. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Atemperar a 50 °C. Añadir, en condiciones asépticas, 100 ml de una solución de ramnosa al 10 por 100 esterilizada por filtración. Mezclar bien y distribuir en tubos estériles de 16 x 160 mm a razón de 10 ml dejándolos solidificar en posición vertical.
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TÉCNICA A partir de una «serie de diluciones decimales» del producto a analizar, se transfiere, por duplicado, 0,1 mi de cada una de las diluciones a la superficie bien seca de agar PALCAM y se disemina con asa de Drigalski. Incubar a 30 °C durante 24-48 horas. Contar las colonias planas que presenten color verde grisáceo, rodeadas de un halo marrón-negro sobre fondo rojo en la placa elegida, preferentemente aquella que contenga entre 20 y 200 colonias. Este medio es selectivo debido a las sustancias inhibidoras que contiene en su fórmula (acriflavina, cloruro de litio, polimixina y ceftacidina). L. monocytogenes hidroliza la escofina dando lugar a glucosa y esculetina. Ésta última forma con el hierro un color verdinegro típico de sus colonias. Confirmación de las colonias Se toma una colonia típica crecida en agar PALCAM y se purifica sembrándola en un medio de cultivo no selectivo, como el agar triptona soja (TSA). Colonias crecidas sobre TSA se colorean por el método de Gram. L. monocytogenes es un germen grampositivo integrado por bacilos cortos. Del mismo crecimiento obtenido en TSA se efectúa la prueba de la catalasa, que consiste en depositar sobre portaobjetos 1 gota de agua oxigenada de 10 volúmenes y emulsionar en ella un poco del cultivo. En caso positivo se desprenden burbujas porque la catalasa existente descompone el agua oxigenada con desprendimiento de oxígeno. L. monocytogenes es catalasa positiva. Confirmadas las colonias como bacilos cortos, grampositivos y catalasa positivos, se siembran: — por diseminación, en placas de agar sangre, incubando en microaerobiosis a 37 °C durante 18-48 horas; — por siembra en picadura, en tubos de agar xilosa, incubando en microaerobiosis a 37 °C durante 72 horas; — por siembra en picadura, en tubos de agar ramnosa, incubando en microaerobiosis a 37 °C durante 72 horas. Se trata de L. monocytogenes cuando: Se aislan bacilos móviles, grampositivos y catalasa positivos. Dan ligera hemolisis en agar sangre. No fermentan la xilosa (no aparece color amarillo en los tubos sembrados e incubados). Fermentan la ramnosa (aparece un color amarillo alrededor de la picadura de siembra) sin producción de gas. Se calcula el número de gérmenes por gramo o mililitro multiplicando la cantidad de colonias contadas y confirmadas, por 10 veces el factor de dilución del tubo elegido, ya que se ha partido de un inoculo de 0,1 ml para sembrar las placas de agar PALCAM.
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Prueba de Presencia-Ausencia (P-A), previo enriquecimiento en medio líquido selectivo Material — — — — — —
Autoclave Matraces de 500 ml estériles Estufa de cultivo Asa de cultivo Asa de vidrio de Drigalski Tubos de ensayo de 16 x 160 mm estériles
Medios de cultivo Medio infusión cerebro corazón (BHl: Brain Heart Infusión) Composición: Infusión de cerebro de ternera desecado Infusión de corazón de vaca desecado Triptona Cloruro sódico Fosfato sódico Agua destilada
12,5 g 5g 10 g 5g 2,5 g 1.000 ml
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH a 7,4 ± 0,2 y distribuir en matraces a razón de 225 ml. Esterilizar en autoclave 121 °C durante 20 minutos. Caldo de enriquecimiento PALCAMY (Polymyxin-Acriflavin-Lithium chloride-Ceftazidime- Aesculin-Manitol-Egg Yolk), doble fuerza. Composición: Caseína pancreática Peptona Peptona de soja Extracto de levadura Digestión tríptica de corazón, en polvo Almidón Cloruro sódico Glucosa Manitol Esculina Citrato férrica amónico Cloruro de litio Rojo fenol Agua destilada
10 g 10 g 10 g 10 g 6g 2g 10 g 1g 20 g 1,5 g 1g 30 g 160 mg 950 ml
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Mezclar los ingredientes en el agua. Ajustar el pH a 7,2 ± 0,1. Llevar a ebullición para disolver bien los ingredientes. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Atemperar rápidamente a 48 °C y añadir: Acriflavina Sulfato de polimixina B Ceftacidina Emulsión de yema de huevo al 20 por 100, estéril
5 mg 105 UI 25 mg 50 ml
Mezclar y distribuir en matraces estériles de 500 ml a razón de 225 ml en condiciones asépticas. Técnica para investigar la Presencia-Ausencia (P-A), previo enriquecimiento P re enriquecimiento Se homogeneiza la muestra y se incorporan 25 g o ml del homogeneizado a matraces que contengan 225 ml de caldo BHI. Mezclar bien por agitación y dejar a temperatura ambiente, en atmósfera microaeróbica, durante 6 horas. Enriquecimiento Después de las 6 horas de preenriquecimiento, añadir un volumen igual de caldo PALCAMY, mezclar bien e incubar a 30 °C durante 48 horas. Pasado este tiempo, agitar el medio y, con asa de cultivo, sembrar sobre la superficie bien seca de agar PALCAM, contenido en placas. Incubar a 30 °C durante 48 horas. Se considera un resultado positivo cuando aparecen colonias planas, de color verde grisáceo, rodeadas de un halo marrón negro sobre fondo rojo. Técnica de confirmación Se emplea la misma sistemática que para el recuento directo en placas. Medidas de control frente a listeria monocytogenes Para establecer medidas de control frente a L. monocytogenes, se deben tener en cuenta ciertas características del germen: — Su abundante distribución en la naturaleza. — Su crecimiento entre límites de temperatura muy amplios, incluyendo la refrigeración. — Su capacidad para crecer a una actividad de agua (aw) baja, inadecuada para otras bacterias. — Su supervivencia durante largos periodos de tiempo en ambiente seco. — Su resistencia al calor comparada con la de otras bacterias.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
De acuerdo con estas características, las medidas de control deben comenzar en el origen de los alimentos, pasando por los puntos intermedios hasta llegar al producto terminado. Estas medidas podrían ser, principalmente: — — — — — — — — —
Utilizar materia prima mínimamente contaminada. Obtener los productos de granja en las mejores condiciones higiénicas. No emplear aguas contaminadas para el riego. Evitar el empleo de abonos animales. Mantener una higiene perfecta en granjas, establos y animales. Utilizar piensos de buena calidad bacteriológica. Controlar las mastitis animales. Transportar higiénicamente los productos. Planificar correctamente las plantas de procesado: • con separación entre zonas destinadas a productos crudos y productos terminados; • teniendo en cuenta que se debe evitar la entrada de animales domésticos, pájaros, insectos, roedores, polvo, etc.
— Instaurar programas de control de calidad en las fases de procesamiento y ambiente, así como del personal. — Investigar la posible presencia de L. monocytogenes en el ambiente y en el producto terminado. — Vigilar y controlar los acondicionadores de aire. — Controlar y limpiar la maquinaria (válvulas, placas, etc.), desmontándola para la comprobación de sus condiciones físicas y limpieza. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), el problema de las Listeria no está en impedir su presencia, sino en controlar su supervivencia y crecimiento, con el fin de reducir las cantidades en que se encuentran en los alimentos.
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Investigación de residuos de antibióticos por métodos microbiológicos
INTRODUCCIÓN Los antibióticos se vienen utilizando desde hace tiempo de forma muy extensa en los animales destinados al consumo humano, tanto para el tratamiento y prevención de enfermedades infecciosas, como para la estimulación de su crecimiento. Después de su utilización debe respetarse un tiempo de espera o periodo de supresión antes del sacrificio o de emplear los alimentos procedentes del animal con el fin de evitar que permanezcan residuos que causen efectos indeseables en el consumidor. La utilización de antibióticos en animales preocupa como posible fuente de resistencias bacterianas. Estas resistencias podrían extenderse, no sólo a la flora bacteriana de otros animales, sino afectar también a la población humana. Por otra parte, los residuos de antibióticos en los alimentos pueden resultar tóxicos para el consumidor, siendo el caso más frecuente el de las reacciones alérgicas. Desde el punto de vista de la producción de alimentos, la presencia de residuos de antibióticos tiene importantes repercusiones para la industria alimentaria, ya que puede interferir en la producción de alimentos en los que intervienen cultivos bacterianos (yogur, queso o embutidos). Como resultado de la preocupación por estos problemas, y debido a la necesidad de asegurar controles homogéneos entre lo distintos países que impidan el establecimiento de barreras comerciales, se ha desarrollado una legislación sobre distintos aspectos del problema tales como la utilización de los antibióticos en animales destinados al consumo humano (Real Decreto 109/1995, Directiva 70/524/CEE), el establecimiento de límites máximos de residuos (Reglamento CEE N.° 2377) o la regulación de los Planes Nacionales de Residuos (Directiva 96/23/CE). (Real Decreto 1749/1998). El control de los residuos de antibióticos se realiza en tres fases: cribado, postcribado y confirmación. En las dos primeras se pueden utilizar técnicas microbiológicas, mientras que la confirmación se realiza mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
TÉCNICAS DE CRIBADO DE RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS El gran número de muestras y de antibióticos a determinar hace inviable la utilización desde el principio de técnicas de alta especificidad debido a su alto coste y laboriosidad. Es necesario utilizar una técnica de cribado que seleccione aquellas muestras que, en principio, pueden contener algún residuo de antibiótico. Una técnica de cribado de residuos de antibióticos debe tener una serie de características: Económica y sencilla, ya que se aplica a un número elevado de muestras. Rápida, porque en ocasiones se retiene la canal o deben proseguir otros análisis de post-cribado, confirmación, contradictorios o dirimentes. Multiresiduo, capaz de detectar un gran número de compuestos, dado que lo que se busca al principio es un grupo de inhibidores y no un antibiótico concreto. Con un Límite de detección ajustado al Límite Máximo de Residuos. No sólo se debe alcanzar el Límite Máximo establecido para evitar falsos resultados negativos sino que conviene que ambos límites estén cercanos para evitar falsos resultados positivos que llevan a confirmar muestras que, en realidad, no deberían pasar la fase del cribado. Las técnicas microbiológicas juegan un importante papel en el cribado de los residuos de antibióticos en alimentos ya que la única característica común a todos los antibióticos es su actividad antibacteriana. Por tanto estas técnicas, al estar basadas en esa única característica común, cubren un número muy amplio de residuos de antibióticos con un solo análisis. El grupo de residuos de antibióticos determinados mediante técnicas microbiológicas se suele denominar como inhibidores del crecimiento bacteriano. Otros antibióticos se identifican y analizan de forma individual ya que no son detectados adecuadamente por estas técnicas (sulfamidas) o requieren unos límites de detección muy bajos por tratarse de compuestos prohibidos (cloranfenicol, nitrofuranos). Técnica de cribado de residuos de antibióticos de las cuatro placas La técnica de cribado de las cuatro placas (Bogaerts y Wolf, 1980) es la más extendida en la Unión Europea y, pese a que existen versiones o técnicas distintas se admite como técnica común. Se basa en la difusión del antimicrobiano contenido en la muestra en el medio de cultivo de varias placas que contienen Bacillus subtilis BGA o Micrococcus luteus ATCC 9341. Las sustancias antibacterianas presentes en las muestras difunden alrededor de éstas provocando la aparición de zonas de inhibición del crecimiento del microorganismo. La utilización de medios de cultivo de distinto pH facilita la detección de distintos grupos de antibióticos. Esta técnica se aplica habitualmente a muestras de tejido (músculo o riñon) pero también se puede utilizar para el análisis de otras muestras (huevo, leche, miel, pienso, productos de acuicultura, queso o productos zoosanitarios). Material — Baño de agua termostatizado (apto para alcanzar 50 y 70 °C). — Bisturíes y cuchillas estériles.
INVESTIGACIÓN DE RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS POR MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
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— Bolsas de plástico de 10 x 15 cm para homogeneizador de palas tipo Stomacher. — Congelador. — Discos control de antibiótico de 6 mm de diámetro: bencilpenicilina 0,01 Ul/disco, sulfadimidina 0,5 ug/disco, estreptomicina 0,5 ug/disco. — Discos de papel de 12,7 mm de diámetro (Schleicher & Schuell 321262). — Equipo de lectura de halos de inhibición. — Estufa de cultivo a 30 °C. — Estufa de cultivo a 37 °C. — Guantes desechables. — Guantes metálicos de protección. — Homogeneizador de palas tipo Stomacher (Colworth, modelo 400 o equivalente). — Matraces aforados de 10 ml. — Matraces Erlenmeyer. — Membrana de celulosa 300 PNR (UCB-La Cellophane). — Micropipetas de 10-100 ul y de 100-1000 ul con puntas estériles. — Pinzas estériles. — Pipetas de vidrio estériles de 10 y 25 ml. — Placas de Petri estériles de 90 o 140 mm de diámetro o de 243 x 243 mm. — Probetas de vidrio estériles. — Refrigerador. — Sacabocados estériles de acero inoxidable de 8 mm de diámetro interno. — Tampón fosfato 0,1 M pH 7. — Trimetoprima 5 mg/ml (Sigma T 7883, disuelta en ácido acético 5 por 100). — Tubos de 50 ml estériles. — Varillas estériles para extracción de cilindros de tejido. Suspensiones de microorganimos — Bacillus subtilis BGA suspensión de 107 esporos/ml (Merck N.° 10649). — Micrococcus luteus CECT 281 (equivalente a ATCC 9341). Medios de cultivo: Agar de ensayo de pH 6 para sustancias inhibidoras (Merck N.° 10663): Peptona de caseína Peptona de carne NaCl Agar Agua destilada
3,45 g 3,45 g 5,10 g 13 g 1.000 ml
pH 6 + 0,1. Esterilización en autoclave: 15 minutos, 121 °C Agar de ensayo de pH 7,2 para sustancias inhibidoras (Merck N.° 15787): Peptona NaCl Agar
7g 5,10 g 13 g
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Fosfato trisódico Agua destilada
0,8 g 1000 ml
pH 7,2 ±0,1. Esterilización en autoclave: 15 minutos, 121 °C Agar de ensayo de pH 8 para sustancias inhibidoras (Merck N.° 10664): Peptona de caseína Peptona de carne NaCl Agar Fosfato trisódico Agua destilada
3,45 g 3,45 g 5,10 g 13 g 2,4 g 1000 ml
pH 8 ± 0,1. Esterilización en autoclave: 15 minutos, 121 °C Preparación de placas de ensayo de B. subtilis BGA Se inocula el microorganismo en los medios de cultivo de pH 6, pH 7,2 y pH 8 de manera que se obtenga una concentración final de lx 104 esporos por mililitro de medio de cultivo. La temperatura del medio de cultivo no debe superar los 50 °C. En el medio de pH 7,2 se añade también una solución de trimetoprima con el fin de alcanzar una concentración final de 0,05 ¡ig por mi de medio de cultivo: por ejemplo 1 mi de una solución 5 wg/ml de trimetoprima por cada 100 ml de medio de cultivo. Se distribuye el medio inoculado en las placas de manera que se obtenga una capa de, aproximadamente, 2 mm de espesor: 10 ml en placas de 90 mm de diámetro. 25 ml en placas de 140 mm de diámetro. 80 ml en placas de 243x 243 mm. Se deja solidificar sobre una superficie plana perfectamente horizontal. Las placas se pueden conservar en refrigeración durante, aproximadamente, una semana. Preparación de placas de M. lúteas CECT 281 (ATCC 9341) Se inocula el microorganismo en el medio de cultivo de pH 8 de manera que se obtenga una concentración final de 1 x 104 u. f. c. por mililitro de medio de cultivo. La temperatura del medio de cultivo no debe superar los 50 °C. El medio inoculado se distribuye en placas de la misma manera que se hizo con B. subtilis. Para preparar la suspensión de M. luteus, se incuba el microorganismo a 37 ±1 °C durante 18-24 horas en un medio nutritivo líquido como la infusión de cerebro y corazón y se hace un recuento de la suspensión para conocer el número de ufc/ml. También se pueden utilizar suspensiones congeladas de concentración conocida. (Diez et al.. 1994).
INVESTIGACIÓN DE RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS POR MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
213
Procedimiento Con un sacabocados estéril de 8 mm de diámetro interno se extraen cilindros de la muestra cuya congelación facilita su manipulación. Conviene retirar antes la capa superficial para eliminar la zona más contaminada. Lo cilindros de muestra se cortan en discos de, aproximadamente, 2 mm de anchura con un bisturí estéril. El pienso se puede mezclar con agua destilada estéril hasta obtener una masa con la que rellenar pocilios de 8 mm de diámetro excavados en las placas. En el caso de muestras de huevo es necesario reducir la capacidad inhibitoria natural mediante el calentamiento de la muestra (calentar en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos). Después se rellenan pocilios excavados en el agar. La miel también presenta una cierta inhibición natural que se puede reducir por mezcla con un tampón fosfato 0,1 M pH 7 en proporción 1:1 antes de aplicarla impregnando discos de papel de 12,7 mm de diámetro que se sitúan sobre las placas
(Rothetal., 1986).
Las muestras (discos de muestra, de papel o pocilios excavados) se colocan por duplicado en posiciones opuestas en cada una de las cuatro placas. Así se pueden colocar 3 muestras en placas de 90 mm y 6 en placas de 140 mm de diámetro. Si la muestra es de riñon de cerdo congelado se colocará una porción de membrana de celulosa 300 PNR entre el medio de cultivo y la muestra con el fin de evitar la acción de los inhibidores naturales del tejido (Calderón,1992). La mitad de la muestra quedará situada sobre el medio y la otra mitad sobre la membrana. Como control de calidad en la preparación de series sucesivas de placas se utilizan discos de papel de 6 mm de diámetro que contienen distintos antibacterianos. En el centro de la placa de pH 6 se sitúa un disco de bencilpenicilina 0,01 U/disco, en la de pH 7,2 el disco de sulfadimidina 0,5 ug/disco y en la de pH 8 y M. luteus el disco de estreptomicina 0,5 ug/disco. Generalmente estos discos se preparan el el laboratorio al ser de concentracionas más bajas de las disponibles para uso en antibiogramas. Las placas se incuban durante 18-24 horas a 30 °C (B. subtilis) y 37 °C (M. luteus). Después de incubar se comprueba la aparición de zonas de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor de las muestras. Se considera que el resultado es positivo cuando la zona de inhibición (desde el borde de la muestra hasta el borde del halo de inhibición) tenga, al menos, 2 mm de anchura. Los discos control deben dar lugar a zonas de inhibición de 6 mm de anchura en placas de B. subtilis y de 4 mm en placas de M. luteus. Un resultado positivo indica únicamente la presencia en la muestra de inhibidores del crecimiento bacteriano cuya identidad y concentración debe establecerse mediante otras técnicas. Técnicas de cribado de residuos de antibióticos en leche La industria láctea ha precisado del control de residuos de antibióticos para proteger su producción de queso o yogur. Por ello se han desarrollado desde hace tiempo diversos métodos de detección rápida cuyo principal objetivo es la
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
penicilina, uno de los residuos más frecuente en leche. Las técnicas basadas en la inhibición de B. stearothermophilus son pruebas rápidas y presentan buena sensibilidad frente a residuos de antibióticos betalactámicos. Existen varias pruebas comerciales basadas en la inhibición de B. stearothermophilus (Test BR, Delvotest). En general se basan en el cambio de color de un vial que contiene el medio de cultivo, el organismo y un indicador del crecimiento bacteriano. Si el crecimiento del microorganismo es inhibido por un residuo el indicador permanece del color inicial y se considera que el resultado es positivo. Al tratarse de pruebas comerciales tipo kit, se remite a la instrucciones de cada producto. La Decisión 91I180ICEE de la Unión Europea describe una técnica de determinación de residuos de antibióticos en leche utilizando viales y placas. Técnica de inhibición de B. stearothermophilus en placa Material — — — — — — — — — — — — — — — — — —
Baño de agua termostatizado (apto para alcanzar 50 y 80 °C). Bencilpenicilina 0,0067 Ul/ml leche. Congelador. Discos control de antibiótico de 6 mm de diámetro. Discos de papel de 12.7 mm de diámetro (Schleicher & Schuell 321262). Equipo de lectura: de halos de inhibición. Estufa de cultivo a 64 °C. Guantes desechables. Matraces aforados de 10 ml. Matraces Erlenmeyer. Micropipetas de 10-100 ul y de 100-1.000 ul con puntas estériles. Pinzas estériles. Pipetas de vidrio estériles de 10 y 25 ml. Placas de Petri estériles de 90 o 140 mm de diámetro o de 243 x 243 mm. Probetas de vidrio estériles. Refrigerador. Leche exenta de inhibidores (por análisis previo). Matraces Erlenmeyer estériles de 100 ml y de 250 ml.
Suspensión de microorganismo y medio de cultivo — Bacillus stearothermophilus ATCC 10149 (suspensión de 108 esporos/ml (DifcoN.0 1801-52-6) Medio de cultivo Medio nutritivo como el Bacto PM Indicator Agar (Difco 1800-15-3) o el medio para antibióticos N.° 4 (Difco 0244-17-7).
INVESTIGACIÓN DE RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS POR MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
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Preparación de placas de B. stearothermophilus Se inocula el microorganismo en el medio de cultivo (atemperado a 50 °C) de manera que se obtenga una concentración final de 1 x 106 esporos por mililitro de medio. Se distribuye el medio inoculado en las placas: 6 mi en placas de 90 mm de diámetro o 15 ml en placas de 140 mm de diámetro y se deja solidificar sobre una superficie plana perfectamente horizontal. Las placas se pueden conservar en refrigeración durante, aproximadamente, cuatro días. Procedimiento Para eliminar el posible efecto inhibidor de compuestos naturales de la leche cruda, puede realizarse un tratamiento térmico introduciendo la muestra en un baño de agua a 80 °C durante 10 minutos. La muestra se impregna en discos de papel de 12,7 mm de diámetro eliminando el exceso de leche tocando con el disco en la pared del recipiente que la contiene. Los discos se colocan sobre la superficie del medio de cultivo por duplicado y en posiciones opuestas. En cada serie de placas se ensayará, además, un disco impregnado en el control positivo (bencilpenicilina 0,0067 Ul/ml). Las placas se incuban a 64 °C durante, aproximadamente 3 horas. Después de incubar se comprueba la aparición de zonas de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor de las muestras. Se considera que el resultado es positivo cuando la zona de inhibición (desde el borde del disco hasta el borde del halo de inhibición) tenga, al menos, 2 mm de anchura. Asimismo los discos control deben dar lugar a zonas de inhibición de 2 mm de anchura. Un resultado positivo indica únicamente la presencia en la muestra de inhibidores del crecimiento bacteriano cuya identidad y concentración debe establecerse mediante otras técnicas. La inactivación del antibiótico por la adición de penicilinasa a la muestra o a la placa de ensayo permite la identificación de residuos de antibióticos betalactámicos. TÉCNICAS DE POST-CRIBADO DE RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS Para identificar y cuantificar un residuo de antibiótico es necesario conocer antes el grupo de antibióticos al que pertenece el residuo. La técnica de post-cribado enlaza el cribado con la confirmación definitiva al informar sobre la identidad del grupo de antibióticos. Como técnicas de post-cribado pueden utilizarse métodos microbiológicos, inmunológicos, radiológicos y electroforesis o cromatografía en capa fina con bioautografía. Las técnicas microbiológicas de post-cribado cuentan con varias ventajas por su sencillez, bajo coste y capacidad de detección. La técnica microbiológica de post-cribado por bioensayo múltiple se utiliza desde hace tiempo en los Estados Unidos (FSIS-USDA, 1974-1992). Mediante la combinación de distintos microorganismos, medios de cultivo y reactivos se prepara una serie de placas que permiten identificar varios grupos de antibióticos. Se trabaja con pares de placas, en una de ellas se introducen los factores que favore-
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
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cen la detección de un grupo concreto y en otra se introduce un factor que impide la actividad de ese grupo y sirve de contraste. Grupo
Microorganismo sensible
Medio
Extracción Tampón
Microorganismo resistente o reactivo de contraste
Tetraciclinas
Bacillus cereus ATCC 11778
Antibiótico N.°8
0,1 MpH4,5
B. cereus K 250
ß-lactámicos
Micrococcus luteus ATCC 9341a
Antibiótico N.°2
1 % pH 6
Betalactamasa
0,2 M pH 8
Heparina
0
Bacillus stearothermophilus ATCC 10149 Aminoglucósidos Bacillus Antibiótico tipo subtilis N.°5 estreptomicina ATCC 6633 Aminoglucósidos tipo neomicina
Staphvlococcus epidermidis ATCC 12228
Antibiótico N.° 11
0,2 M pH 8
Heparina
Macrolidos
Micrococcus luteus ATCC 934la
Antibiótico N.° 11
0,2 M pH 8
M. luteus ATCC 15957
Quinolonas
Escherichia coli ATCC 11303
Agar para inhibidores pH7,2
0,2 M pH 8
No afectada por heparina
Las muestras de tejido se extraen (5 gramos + 10 ml) con tres tampones de distinto pH y los extractos se aplican en pocilios de acero (6 mm de diámetro interno, 8 mm de diámetro externo y 10 mm de altura) sobre la superficie de las placas (ver tabla). Las placas se incuban durante 18-20 horas a 30 °C (excepto las placas de 5. epidermidis a 37 °C y las de B. stearothermophilus a 64 °C). Después de incubar se comprueba la aparición de zonas de inhibición del crecimiento del microorganismo en cada placa. Si una muestra provoca inhibición en la placa de detección de uno de los grupos y no en la de contraste cabe suponer que el residuo pertenece a ese grupo de antibióticos. La comparación con los perfiles de actividad de patrones de antibióticos en todas las placas (Calderón, 1996) también se emplea en la identificación del grupo de antibióticos al que pertenece el residuo. La identidad dentro del grupo y su concentración debe establecerse mediante técnicas de alta especificidad como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
SEGUNDA PARTE
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Carnes
(«Carnes y derivados». Capítulo X del Código Alimentario Español)
La carne de los animales constituye la base de la alimentación humana, y su industria es una de las más importantes en el ámbito de la alimentación. Se trata de un alimento excelente por su alto valor nutritivo, debido a la riqueza proteica de su constitución. En un sentido distinto, la carne es uno de los alimentos más perecederos. Debido a sus características de composición, pH y actividad de agua (aw), constituye un medio muy favorable para la mayor parte de las contaminaciones microbianas. La profundidad del músculo de un animal recién sacrificado contiene una flora muy escasa, del orden de un germen por gramo. Esta microflora procede, generalmente, del intestino y es transportada al músculo por la sangre. La parte superficial de la carne, especialmente en la canal, está mucho más contaminada por una flora muy diversa, que depende de las condiciones higiénicas de manipulación, así como del ambiente del matadero. La contaminación de la carne comienza durante el sacrificio de la res, continúa en otras dependencias del matadero y lugares de venta para terminar en el hogar del consumidor. En el momento del sacrificio, algunos gérmenes pueden atravesar la barrera intestinal (por falta de un ayuno previo a la matanza, en el caso de animales fatigados o cuando se trata de animales enfermos, etc.), para llegar a los músculos por vía sanguínea. Durante el desuello, evisceración y despiece, resulta fácil la contaminación de las canales con gérmenes procedentes del intestino, suelo, ambiente o personas que manipulan las canales o las piezas de carne. La canal preparada adecuadamente también está sujeta a nuevas contaminaciones por los instrumentos utilizados en el despiece y otras manipulaciones. La contaminación en el frigorífico es muy importante, al entrar en contacto unas carnes con otras. En el caso de largos períodos de almacenamiento en frío, puede proliferar una contaminación psicrófila debida a cierta llora que, incluso, se puede desarrollar a temperaturas cercanas a los 0 °C. Prosigue la contaminación durante el transporte de las canales o piezas de carne a los lugares de venta, donde puede seguir contaminándose durante su almacenamiento si las condiciones higiénicas son desfavorables. 219
220
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
VÍAS DE CONTAMINACIÓN Matadero — Mala salud de los manipuladores. — Falta de higiene de los manipuladores. — Insectos y roedores. Animal — Piel (Micrococcus, Pseudomonas y otros gramnegativos, Staphylococcus, Lactobacillus). — Contenido intestinal (coliformes, E. coli, Clostridium, Streptococcus y, a veces, Salmonella). Otras fuentes En almacenamiento y manipulación posterior hay gérmenes del suelo, aire, manipuladores, agua (Pseudomonas, B. cereus, Cl. perfringens y, a veces, Cl. botulinum, Enterobacteriaceae, E. coli, Salmonella, Staphylococcus, Cladosporinm, Sporotrichum, Geotrichum, Mucor, Penicillium, Alternaría, Monilia, levaduras, etc.). La carne puede contener parásitos helmintos (cestodos y nematodos), protozoarios y bacterias patógenas: Cestodos — Tenía solium, parásito del cerdo. El hombre se infesta por ingestión de carne con cisticercos (Cysticercus cellulosae). La forma adulta se fija en el intestino del hombre. — Tenía saginata, parásito de los bóvidos. El hombre se infesta por ingestión de carne con cisticercos (Cysticercus bovis) y la forma adulta se implanta en el intestino del hombre. — Echinococcus granulosas, responsable de la equinococosis, que se manifiesta por un quiste hidatídico. La infestación directa en el hombre por la carne es rara. Nematodos Dentro de los nematodos (gusanos redondos), el género Trichinella incluye una sola especie: Trichinella spiralis. Las larvas de este parásito se desarrollan en los músculos estriados del huésped (suido) hasta su estado infestante. Dichas larvas se sitúan entre las miofibrillas del músculo longitudinalmente, luego se enrollan y encapsulan en quistes calcificados. Las infestaciones humanas se producen por la ingestión de cerdo, jabalí, etc., poco cocinado o crudo.
CARNES
221
Protozoarios Los protozoarios que pueden infestar la carne son: — Toxoplasma gondii, transmitido por la carne de cerdo. — Sarcocystis, agente de la sarcosporidiosis, que se transmite por carnes de cerdo y ovino. Bacterias Hay varias enfermedades humanas que se pueden transmitir por la carne: salmonelosis (Salmonella), brucelosis (Brucella), mal rojo (Erysipelothrix rhusiopathine), carbunco (Bacillus anthracis), tularemia (Pasteurella tularensis). Puesto que la carne es un producto fácilmente alterable, resulta necesario que todas las manipulaciones posteriores al sacrificio se realicen en un ambiente refrigerado. La cadena del frío debe ser ininterrumpida. Para la conservación de la carne se utilizan dos sistemas: — Refrigeración. — Congelación. Con la refrigeración se inhibe el desarrollo de la flora microbiana en general, excepto la psicrófila y algunos mohos y levaduras. La congelación puede destruir algunas bacterias o inhibir el crecimiento de otras. Durante la descongelación del producto, si es lenta, puede proliferar abundantemente la flora psicrófila que se ha mantenido inhibida cuando el alimento estaba congelado. Algunos patógenos, como especies del género Salmonella, son inhibidos a temperatura de congelación, pero sobreviven y se hacen, incluso, más resistentes. Dentro de las distintas formas de comercialización de la carne, la picada es la que está expuesta a una alteración más fácil, debido a su amplia superficie de contaminación, al estar finamente triturada, y a su mayor manipulación. Las especies microbianas que habitualmente acompañan a la carne pertenecen a los géneros: Pseudomonas, Achromobacter, Streptococcus, Micrococcus, Sarcina, Leuconostoc, Flavobacterium, Proteus, Escherichia, Bacillus, Clostridium, Chromobacterium, Streptomyces, levaduras (Saccharomyces, Rhodotonda, Candida), mohos (Sporotricum, Cladosporium, Mucor, Geotricum, Penicillium, Alternaria, Monilia, Aspergillus, Thamnidium). En el proceso de maduración de la carne se pueden producir alteraciones como consecuencia de su degradación, según sus caracteres fisicoquímicos, que son originadas por microorganismos: — Degradación por microorganismos aerobios • Viscosidad. Se manifiesta por la aparición de una capa viscosa, acompañada de un olor desagradable, cuando la tasa de gérmenes que causan la alteración sobrepasa la cifra de 107 gérmenes por centímetro cuadrado. Esta alteración es producida, habitualmente, por microorganismos pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Achromobacter, Leuconos-
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
• • • • •
•
•
•
toe, Bacillus, Micrococcus, Lactobaeillus, levaduras y mohos que, al ser entre ellos gérmenes aerobios, psicrotróficos e hidrófilos, ven favorecido su crecimiento en ambiente frío y húmedo. Decoloración. Se debe a fenómenos de oxidación originados por levaduras y especies bacterianas de los géneros Lactobaeillus y Leuconostoc. Pigmentación. Alteración originada por Pseudomonas, Flavohacteriam, Micrococcus, Serrana, levaduras (Rhodotorula) y mohos (Cludosporium herbarum, Sporotrichum carnis, Penicillium) Enranciamiento: Alteración de la grasa producida por Pseudomonas. Levaduras y mohos. Enmohe cimiento. Se debe a la presencia de flora micótica variada (Mucor, Rhizopus. Thamnidum, etc.). Decoloración verde. Frecuente en carnes almacenadas a temperatura de refrigeración comprendida entre 1 y 2 °C y baja tensión de oxígeno. En estas condiciones, la decoloración tiene lugar al transformarse la mioglobina en sulfomioglobina, en presencia del SH2 preformada por P. mephitica cuando se multiplica sobre la carne. Lipolisis. Producida por el desarrollo de gérmenes lipolíticos pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Achromobacter, levaduras (Tricosporum y Candida) y mohos. La hidrólisis de las grasas da lugar a la formación de compuestos químicos que producen olores particulares, por ejemplo, a ácido butírico. Fosforescencia. Se debe al crecimiento de microorganismos fosfores centes, como Photobacterium. Se suele observar en carnes conservadas a baja temperatura. En esta alteración tiene lugar un proceso oxidativo de la luciferina. Olores v sabores anormales. a) b) c) d)
Olor y sabor agrio, por la producción de ácidos volátiles, al crecer bacterias y levaduras acidificantes. Sabor a rancio, por crecimiento de actinomicetos. Sabor a tierra, por crecimiento de actinomicetos. Sabor a humedad, por crecimiento de mohos.
— Degradación por microorganismos anaerobios Las alteraciones de degradación por microorganismos anaerobios se producen siempre que haya condiciones anaerobias. • Agriado. Se debe a la presencia de ácidos volátiles y no volátiles, como consecuencia de: a) La acción enzimática de la carne durante su maceración. b) Procesos de fermentación microbiana con formación de ácidos grasos y ácido láctico. c) Proteolisis microbiana cuyo origen no es la putrefacción. Intervienen en esta alteración: bacterias lácticas, Enterobacteriaceae, Staphylococcus, Bacillus y Clostridium, principalmente. • Putrefacción. Alteración que indica descomposición anaeróbica de las proteínas con formación de compuestos de olor nauseabundo (amoniaco.
CARNES
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ácido sulfhídrico, indol, escatol, mercaptano, etc.). Las carnes que presentan esta alteración están repletas de gas, tienen un color gris-verdoso y despiden un olor desagradable. La alteración se presenta en carnes no refrigeradas o mal refrigeradas, puesto que las bacterias que la originan se inhiben a temperaturas inferiores a los 20 °C. Las carnes de pH superior a 6,2 son las más afectadas. Las especies bacterianas que intervienen principalmente en este proceso son: Proteus vulgaris, Proteus mirabilis y algunas otras especies de la familia Enterobacteriaceae, Clostridium bifermentans, Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes. • Hueso hediondo. Alteración que se caracteriza por la producción de un olor pútrido en las partes profundas de la carne, sobre todo cerca del hueso. La alteración se presenta por la mala refrigeración de carnes con pH elevado. Suelen intervenir en la alteración: Clostridium putrefaciens, Clostridium hystoliticum, Clostridium putrificum. En la carne, además de los microorganismos propios de su alteración, se pueden encontrar gérmenes perjudiciales para la salud del hombre, procedentes de animales enfermos o de malas manipulaciones durante su preparación: Salmonella, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejunilcoli, histeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum. DEFINICIONES Carne Es la parte muscular comestible de los animales de abasto, sacrificados y faenados en condiciones higiénicas. Se incluyen en este concepto las porciones de grasa, hueso, cartílago, piel, tendones, aponeurosis, nervios y vasos linfáticos y sanguíneos que normalmente acompañan al tejido muscular y que no se separan de éste en los procesos de manipulación, preparación y transformación de la carne. Carne fresca Se denomina carne fresca a la que sólo ha sufrido las manipulaciones propias del faenado y oreo refrigerado, previos a su distribución y en la que su temperatura de conservación, durante este periodo, ha oscilado entre 1 y + 7 °C. Carne congelada Se denomina carne congelada a la que, además de las manipulaciones propias de la carne fresca, ha sido sometida a la acción del frío industrial hasta conseguir en el centro de la masa muscular una temperatura de -18 °C, como mínimo, según la especie, la técnica y el tiempo de conservación previsible.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LA CARNE Los recuentos e investigaciones, en un control analítico normal, comprenden: — — — — — —
Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C). Escherichia coli. Salmonella. Staphylococcus aureus. Recuento de Clostridium sulfito-reductores. Recuento de Clostridium perfringens.
Preparación de la muestra para su análisis Las muestras de carne (fresca, troceada, picada, etc.) permanecerán en refrigeración a temperatura comprendida entre 0 y 5 °C, hasta el comienzo del análisis. Este deberá iniciarse lo más pronto posible una vez recibido en el laboratorio y nunca más de 24 horas después del muestreo. Las muestras congeladas permanecerán en estado de congelación, a temperatura inferior a -15 °C, hasta el momento de su análisis. La descongelación se realiza en ambiente de refrigeración, entre 2 y 5 °C, durante 18 horas, según el tamaño de la muestra, sin exceder nunca las 24 horas, para proceder a su análisis inmediatamente.
ANÁLISIS Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Investigación y recuento de Escherichia coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella (v. cap. 7) Recuento de Clostridium sulfito-reductores (v. cap. 9) Investigación y recuento de Staphylococcus aureus (v. cap. 10) Investigación y recuento de Clostridium perfringes (v. cap. 12) Real Decreto 1916 / 1997 de 19 de diciembre (B.O.E. 13-1-98) sobre producción y comercialización de carne picada. Definición. (Capítulo I, Artículo 2) Carne picada: se entiende por carne picada la que ha sido sometida a una operación de picado en fragmentos o al paso por una máquina picadora continua.
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CARNES
DETECCIÓN DE TRIQUINA Como ha habido legislación posterior a la Orden 22-9- 89 (B.O.E. 4-10-89), remitimos al lector a la Orden del 17 de enero de 1996 sobre detección de triquinas en las carnes frescas procedentes de animales domésticos de las especies porcina y equina. En esta Orden se exponen los distintos métodos para la investigación de triquina a los que remitimos al lector; se mencionan únicamente sus enunciados: I. II. III. IV.
Examen triquinoscópico. Método de la digestión artificial. Método de la digestión artificial de muestras colectivas. Método de la digestión artificial de muestras colectivas con asistencia mecánico/técnica de la sedimentación. V. Método de la digestión artificial de muestras colectivas con asistencia mecánico/técnica del aislamiento por filtración. VI. Método de la digestión de muestras colectivas con utilización de un agitador magnético. VII. Métodos de digestión automática de muestras colectivas de hasta 35 gramos.
NORMA MICROBIOLOGICA PARA CARNES PICADAS El Real Decreto 1916/1997 de 19 de diciembre B.O.E. 13-1-98) anula la Norma Microbiológica aplicable a las carnes picadas (Orden 14-1-86; B.O.E. 21-1-86) y la sustituye por los siguientes criterios microbiológicos: M(a)
m(b)
Gérmenes aerobios mesófilos n (c) = 5; c (d) = 2
5 x 106 / g
5x105 / g
Eschericia coli n = 5:c = 2
5x 102 / g
50/g
Salmonella n = 5: c = 0
Ausencia en 10 g
Staphylococcus aureus n = 5;e = 2
1 03 /g
102/g
(a) M = límite de aceptabilidad por encima del cual los resultados dejan de considerarse satisfactorios. M es igual a «1 0 x m» cuando el recuento se efectúa en un medio líquido. (b) m = límite por debajo del cual todos los resultados se consideran satisfactorios. (c) n = número de unidades que componen la muestra. (d) c = número de unidades de la muestra que manifiestan valores situados entre m y M.
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Derivados cárnicos
(«Carnes y derivados». Capítulo X del Código Alimentario Español)
Los derivados cárnicos son productos alimenticios preparados total o parcialmente con carnes, despojos, grasas y subproductos comestibles, procedentes de los animales de abasto u otras especies y, en su caso, ingredientes de origen vegetal o animal, así como condimentos, especias y aditivos, siempre que estén autorizados, y se ajusten a las normas especificas de calidad (Real Decreto 379/1984, de 25 de enero; B.O.E. 27-2-84). Los derivados cárnicos se clasifican en: — — — — — —
Productos cárnicos crudos adobados. Embutidos crudos curados. Productos cárnicos tratados por el calor. Salazones cárnicas. Platos preparados cárnicos. Otros derivados cárnicos.
PRODUCTOS CÁRNICOS CRUDOS ADOBADOS Definiciones Productos crudos adobados Productos cárnicos crudos adobados son los elaborados con piezas cárnicas enteras o en trozos, identificables según la clasificación comercial oficial de carnicería, o por trozos de carne que no reúnan dichos requisitos de identificación, pertenecientes a las especies de abasto, aves y caza autorizadas. Dicho producto será sometido a la acción de la sal, especias y condimentos que le confieran un aspecto y sabor característicos, recubierto o no de pimentón y posteriormente protegido por un envolvente autorizado (Orden 5 de noviembre de 1981; B.O.E. 9-11-81). 227
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Lomo adobado de cerdo Lomo adobado de cerdo es el producto elaborado con la pieza del paquete muscular que tiene como base el músculo longissimus dorsii del cerdo, o con un solo trozo de dicha pieza, libre de tendones, sometido a la acción de la sal, adicionada o no de especias y condimentos que le confieran aspecto y sabor característicos, posteriormente protegido por un envolvente autorizado. (Orden de 5 de noviembre de 1981; B.O.E. 9-11-81.)
Protocolo de análisis microbiológico de los productos cárnicos crudos adobados Las determinaciones microbiológicas, en un control analítico normal, comprenden: — — — — —
Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± °C). Investigación y recuento de Escherichia coli. Investigación de Salmonella. Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores. Investigación y recuento de Staphylococcus aureus enterotoxigénico.
Preparación de la muestra para su análisis Estos productos permanecerán en refrigeración a temperatura comprendida entre 0 y 5 °C hasta el comienzo del análisis. Este deberá iniciarse lo más pronto posible una vez recibido en el laboratorio y nunca más de 24 horas después del muestreo.
ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Investigación y recuento de Escherichia coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella (v. cap. 7) Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores (v. cap. 9) Investigación y recuento de Staphylococcus aureus enterotoxigénico (v. cap. 10)
DERIVADOS CÁRNICOS
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Criterio microbiológico para productos cárnicos crudos adobados Con un fin exclusivamente orientativo para el técnico, se sugiere el siguiente criterio microbiológico para productos cárnicos crudos adobados: Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C): Escherichia col i: Salmonella-Shigella: Clostridium sulfito-reductores: Staphylococcus aureus enterotoxigénico:
1 x l05/g 1 x 102/g Ausencia/25 g 1 x 102/g 1 x 102/g
EMBUTIDOS CRUDOS CURADOS Son productos cárnicos, troceados o no, adicionados de sal y otras sustancias, que sufren un proceso de maduración-desecación apropiado. Definiciones Chorizo Se entiende por chorizo la mezcla de carnes picadas o troceadas de cerdo o de cerdo y vacuno y tocino y/o grasa de cerdo, con adición de sal, pimentón y otras especias, condimentos y aditivos autorizados, amasada y embutida en tripas naturales, o artificiales, en su caso, que ha sufrido un proceso de maduración-desecación, con o sin ahumado, que se caracteriza por su coloración roja (con excepción de los denominados chorizos blancos) y por su olor y sabor característicos. (Orden de 27 de febrero de 1980; B.O.E. 21-3-80.) Chorizo de Pamplona Se entiende por chorizo de Pamplona la mezcla de carnes de cerdo o de cerdo y vacuno, picadas o troceadas y tocino finamente picado, en pequeños granos perfectamente definidos de diámetro medio de 3 mm ± 0,5 mm, con adición de sal, pimentón y otras especias, condimentos y aditivos autorizados, amasada y embutida en tripas naturales o artificiales, que ha sufrido un proceso de maduracióndesecación, con ahumado, en forma de vela más o menos regular, con calibre minino de 40 mm de diámetro en producto curado, cuyo aspecto externo será ligeramente granulado y su presentación al corte ofrecerá el tocino en forma de grano de arroz, color rojizo y diferenciación neta entre carnes y tocino, de olor y sabor característicos. (Orden de 7 de febrero de 1980; B.O.E. 21-3-80.) Chis torra Se entiende por chistorra la mezcla de carnes picadas de cerdo o de cerdo y vacuno y tocino y/o grasa de cerdo, con adición de sal, pimentón, ajo y aditivos au-
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torizados, amasada y embutida en tripas naturales o artificiales, que han sufrido un corto proceso de maduración-desecación, con ahumado o sin él, de un calibre máximo de 25 mm en producto curado, que se caracteriza por su coloración roja y por su olor y sabor característicos. (Orden de 7 de febrero de 1980; B.O.E. 21-3-80). Chorizo de cerdo ibérico Se entiende por chorizo de cerdo ibérico la mezcla de carnes picadas o troceadas y tocino y/o grasa, procedentes todos ellos exclusivamente de cerdo ibérico, con adición de sal, pimentón y otras especias, condimentos y aditivos autorizados, amasada y embutida en tripas naturales o artificiales en su caso, que ha sufrido un proceso de maduración-desecación, con o sin ahumado, que se caracteriza por su coloración roja y por su olor y sabor característicos. (Orden de 7 de febrero de 1980; B.O.E. 21-3-80.) Salchichón Se entiende por salchichón la mezcla de carnes picadas de cerdo, vacuno o de cerdo y vacuno y aditivos, amasada y embutida en tripas naturales o artificiales, en su caso, que ha sufrido un proceso de maduración-desecación que le asegura una buena estabilidad, así como un olor y sabor característicos. (Orden de 7 de febrero de 1980; B.O.E. 21-3-80.) Salchichón Málaga Se entiende por salchichón Málaga la mezcla de carnes picadas o troceadas de cerdo o de cerdo y vacuno y tocino y/o grasa de cerdo, adicionada de sal, especias y aditivos autorizados, amasada, y que tras un proceso biológico de fermentación es embutida en tripas naturales procedentes de animales de abasto o en tripas de material biológico procedentes de aquéllos, de calibre superior a 30 cm, de forma más o menos curvada, que ha sufrido un corto proceso de maduración-secado que asegura su estabilidad y proporciona sus características peculiares en cuanto a textura, sabor y aroma. (Orden 6 de abril de 1987; B.O.E. 8-4-87.) Salami Se entiende por salami la mezcla de carnes de cerdo, de vacuno o de cerdo y vacuno, tocino y/o grasa de cerdo finamente picada, salpicada de manchitas rojas y blancas, éstas inferiores a 3 mm, embutida, curada y ahumada, en forma de vela más o menos regular, u ovalada, cuyo aspecto externo será más o menos liso y su presentación al corte ofrecerá diferenciación neta entre carne y tocino, de olor y sabor característicos. (Orden 7 de febrero de 1980; B.O.E. 21-3-80.) Lomo embuchado Lomo embuchado es el producto elaborado con el músculo ileoespinal del cerdo (prácticamente libre de grasa externa), aponeurosis y tendones, salado,
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adobado y embutido en tripas naturales o artificiales permeables y que ha sufrido un proceso de maduración apropiado. (Orden de 7 de febrero de 1980; B.O.E. 21-3-80.) Protocolo de análisis microbiológico de embutidos crudos curados Los recuentos e investigaciones, en un control analítico normal, comprenden: — — — —
Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de E. coli. Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores. Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico.
Preparación de la muestra para su análisis Para el control de fabricación, es necesario un muestreo al azar, teniendo en cuenta siempre el tamaño de las piezas. En el laboratorio, para preparar la muestra analítica, se limpia la superficie del embutido para quitar posibles mohos y levaduras; luego, asépticamente, se desprende la cubierta. Desaparecida ésta, se toman porciones de distintas zonas, en condiciones asépticas, para ser trituradas. ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores (v. cap. 9) Investigación y recuento de St. aureus (v. cap. 10) Criterio microbiológico para embutidos crudos curados Existe Norma Microbiológica aplicable a chorizo, salchichón y lomo embuchado (Orden del 21 de junio de 1977; B.O.E. 12-6-77): Salmonella: St. aureus: Escherichia coli: Clostridium sulfito-reductores:
Ausencia/25 g Menos de 100/g Menos de 100/g Menos de 100/g
No obstante, la Orden de 7 de febrero de 1980 (B.O.E. 21-3-80), que hace referencia a la flora microbiana, dice: «Las especificaciones microbiológicas que de-
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ben cumplir los embutidos crudos-curados, se aprobarán por resolución del Ministerio de Sanidad y Seguridad Social». PRODUCTOS CÁRNICOS TRATADOS POR EL CALOR Se denominan «productos cárnicos tratados por el calor» todos los productos preparados esencialmente con carnes y/o despojos comestibles de una o varias de las especies animales de abasto, aves y caza autorizadas, que se han sometido en su fabricación a la acción del calor y han alcanzado en su punto crítico una temperatura suficiente para lograr la coagulación total o parcial de sus proteínas cárnicas y, opcionalmente, a ahumado y/o maduración (Orden de 5 de noviembre de 1981; B.O.E. 9-11-81). Clasificación Estos productos, según sus características, se han dividido en varios grupos: El primer grupo lo integran los productos preparados con piezas de carne identificables, correspondientes al despiece normal de carnicería (jamón, contra, babilla, etc.). Se denominan por el nombre de la pieza, seguido de la palabra «cocido»; si se les adicionan féculas o proteínas extrañas, se denominan «fiambre de». El segundo grupo lo integran los productos preparados con trozos de carne no identificables. La denominación de los productos de este grupo será «magro de cerdo» o «carne de vacuno»; si se les adicionan féculas o proteínas extrañas, la denominación será «fiambre de». El tercer grupo lo integran los productos preparados con piezas esencialmente grasas, como las pancetas y otras partes comestibles. El cuarto grupo lo integran los productos cárnicos tratados por el calor y picados, fabricados con carne y grasa, embutidos en tripa natural o artificial (la tripa puede quitarse después de la cocción) y con un calibre máximo de 45 mm de diámetro. El quinto grupo está integrado por productos cárnicos fabricados con carne o con carne y grasa picados o troceados: mortadela, lunch, chopped, rouladas, patés de carne, etc. El sexto grupo lo integran los embutidos crudos curados que se someten a la cocción. Se denominan con el nombre que corresponda al embutido crudo curado seguido de la palabra «cocido». El séptimo grupo lo integran los productos cárnicos fabricados con hígado como ingrediente caracterizante, picado más o menos finamente En este grupo se engloban las pastas de hígado patés, etc. La denominación de estos productos será «pasta» o «patés de hígado», seguido del nombre de la especie animal de que procede. El octavo grupo lo integran los productos cárnicos tratados por el calor, fabricados con sangre como ingrediente caracterizante, procedente de animales de abasto. A este grupo corresponden las morcillas, butifarra, etc. El noveno grupo lo integran los productos cárnicos tratados por el calor, fabricados con visceras, patas, morros, caretas y otras partes comestibles, como in-
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gredientes caracterizantes, procedentes de animales de abasto. A este grupo corresponden los callos, cabeza de jabalí, etc. Jamón cocido y fiambre de jamón, paleta cocida y fiambre de paleta, magro de cerdo cocido y fiambre de magro de cerdo Jamón cocido y fiambre de jamón Pertenecen al primer grupo de la clasificación de productos cárnicos tratados por el calor. Se diferencian en que el fiambre de jamón lleva fécula. Protocolo de análisis microbiológico del jamón cocido y fiambre de jamón Los recuentos e investigaciones para su control analítico comprenden: — — — —
Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales. Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de Clostridium sulfíto-reductores. Investigación y recuento de St. áureas enterotoxigénico.
Preparación de la muestra para su análisis La muestra se tomará asépticamente, extrayendo distintas porciones del producto en zonas diversas y siguiendo la metodología general. ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae (v. cap. 6) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores (v. cap. 9) Investigación y recuento de St. aureus (v. cap. 10) Criterio microbiológico para jamón cocido y fiambre de jamón Existe Norma Microbiológica aplicable & jamón cocido y fiambre de jamón (Resolución de 26 de diciembre de 1983; B.O.E. 3-1 -84): Enterobacteriaceae totales: Salmonella-Shigella. Sulfito-reductores anaerobios esporulados: St. aureus enterotoxigénico:
1 x 102 colonias/g Ausencia/25 g 1 x 102 colonias/g 1 x 102 colonias/g
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Paleta cocida y fiambre de paleta Pertenecen al primer grupo de la clasificación de productos cárnicos tratados por el calor. Se diferencian en que el fiambre de paleta lleva fécula. Protocolo de análisis microbiológico de paleta cocida y fiambre de paleta (v. pág. 233 jamón cocido y fiambre de jamón) Preparación de la muestra para su análisis (v. pág. 233) Análisis (v. pág. 233) Criterio microbiológico para paleta cocida y fiambre de paleta (v. pág. 233) Magro de cerdo cocido y fiambre de magro de cerdo Pertenecen al segundo grupo de la clasificación de productos cárnicos tratados por el calor. Se diferencian en que el fiambre de magro de cerdo lleva fécula. Protocolo de análisis microbiológico del magro de cerdo cocido y fiambre de magro de cerdo (v. pág. 233 jamón cocido y fiambre de jamón) Preparación de la muestra para su análisis (v. pág. 233) Análisis (v. pág. 233) Criterio microbiológico para magro de cerdo cocido y fiambre de magro de cerdo (v. pág. 233) Fiambre de lomo Pertenece al segundo grupo de la clasificación de productos cárnicos tratados por el calor. Definición Fiambre de lomo es el producto elaborado con el paquete muscular o parte del paquete muscular que tiene como base el músculo longissimus dorsii del cerdo en una sola pieza, libre de tendones, salado, adobado o no, con o sin pimentón, y sometido a un tratamiento térmico, terminado mediante el empleo de envolventes autorizados y etiquetado. (Orden de 5 de noviembre de 1981; B.O.E. 9-11-81.) Protocolo de análisis microbiológico del fiambre de lomo (v. pág. 233 jamón cocido y fiambre de jamón) Preparación de la muestra (v. pág. 233)
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Análisis (v. pág. 233) Criterio microbiológico para fiambre de lomo (v. pág. 233) GELATINAS COMESTIBLES Definición Se entiende por gelatina comestible el producto obtenido por hidrólisis parcial del colágeno que proviene de la piel, tejido conjuntivo y huesos de los animales de abasto. Protocolo de análisis microbiológico de las gelatinas comestibles — — — —
Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± °C). Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales. Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de Clostridium perfringens.
Preparación de la muestra para su análisis La muestra se prepara tomando porciones representativas del producto que hay que analizar, en condiciones asépticas y con material estéril, según metodología habitual. ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae (v. cap. 6) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de Clostridium perfringens (v. cap. 12) Criterio microbiológico para gelatinas comestibles Existe Norma Microbiológica aplicada a gelatinas comestibles (Orden de 12 de marzo de 1984; B.O.E. 17-3-84): Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± C) Máximo 5 x 103/g Enterobacteriaceae Salmonella-Shigella Clostridium perfringens
Ausencia/g Ausencia/25 g Ausencia/g
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CALDOS Y SOPAS DESHIDRATADOS Definiciones Extracto de carne Se denomina extracto de carne a los derivados cárnicos concentrados y/o deshidratados obtenidas por procedimientos tecnológicos adecuados a partir de los tejidos que constituyan la denominada carne de los animales de abasto. Estos extractos podrán contener también los correspondientes a los condimentos, especias y hortalizas que se hayan incorporado en la preparación de la carne inicial. (Decreto 2180/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-775.) Extractos de vegetales Se entiende por extractos de vegetales los derivados de estos productos obtenidas por procedimientos tecnológicos adecuados, que pueden contener además los condimentos y especias de su previa preparación culinaria. (Decreto 2180/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-7-75.) Hidrolizado de proteínas Se entiende por hidrolizado de proteínas al producto obtenido por procedimientos tecnológicos adecuados a partir de proteínas animales, vegetales o microbianas autorizadas para la alimentación humana. (Decreto 2180/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-7-75.) Preparados alimenticios deshidratados para caldos Se considerarán preparados alimenticios deshidratados para sopas los productos sólidos, pastosos o más o menos líquidos, constituidos por algunos de los siguientes ingredientes: cloruro sódico, grasas comestibles, extractos de carne y/o vegetales, hidrolizados proteicas, vegetales deshidratados, condimentos, especias, aromas y aditivos autorizados, que son destinados al consumo previa dilución y/o ebullición. Preparados alimenticios deshidratados para sopas Se considerarán preparados alimenticios deshidratados para sopas los productos sólidos, pastosos o más o menos líquidos, constituidos por los mismos ingredientes que los preparados para caldos, pero que pueden llevar además incorporados pastas alimenticias, harinas, sémolas, otros productos amiláceas y proporciones de productos animales y/o vegetales comestibles. Estos preparados serán consumidos previa dilución y/o ebullición. Protocolo de análisis microbiológico de caldos y sopas deshidratados — — — —
Investigación y recuento de Escherichia coli. Investigación de Salmonella. Investigación y recuento de Staphylococcus aureus. Investigación y recuento de Cl. perfringens.
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Si se trata de sopas envasadas esterilizadas, su control se llevará a cabo con las pautas señaladas para las conservas (cap. 39). Preparación de la muestra para su análisis En el caso de caldos y sopas deshidratados solubles, después de incorporado el diluyente, la muestra se mantendrá durante unos 30 minutos a temperatura ambiente, agitando de vez en cuando para su perfecta solubilización; si el alimento deshidratado contiene una parte insoluble, se someterá a trituración-homogeneización, una vez mezclado el diluyente. ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella (v. cap. 7) Investigación y recuento de St. aureus (v. cap. 10) Investigación y recuento de Cl. perfringens (v. cap. 12) Criterio microbiológico para caldos y sopas deshidratados Existe Norma Microbiológica para caldos y sopas deshidratados. (Decreto 2180/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Esta Norma es modificada por Decreto (B.O.E. 28-7-76) y queda en la siguiente forma: Caldos y sopas instantáneos: Escherichia coli:
Salmonella: St. aureus: Clostridium perfringens:
Máximo 1 x 1 0 col/g
Ausencia/25 g Máximo 1 x 102 col/g Máximo 1 x 10 col/g
Caldos y sapas que deben heñirse para su consumo: Salmonella: St. aureus: Clostridium perfringens:
Ausencia/25 g Máximo 1 x 102 col/g Máximo 1 x 10 col/g
Nota: Se indica al lector que, como exigencia de la adhesión de España a las Comunidades Europeas, por Real Decreto 1473/1989 de 1 de diciembre (B.O.E. 12-12-89) se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria que regula las condiciones exigibles para el comercio intracomunitario de productos cárnicos destinados al consumo humano, así como las que deben reunir las industrias cárnicas autorizadas para dicho comercio.
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Aves y caza («Aves y caza». Capítulo XI del Código Alimentario Español)
Dada su mayor importancia, se va a hacer referencia principalmente a las aves. La composición química de la carne de ave Influye notablemente en el crecimiento de toda clase de bacterias y, muy especialmente, de las productoras de alteración. Es una buena fuente de proteínas (21-24 por 100), vitaminas (tiamina, niacina, riboflavina) y sales minerales, lo que, unido a que posee una actividad de agua (aw) de 0,98-0,99 y un pH comprendido entre 6,2-6,4, hace que sea un medio inmejorable para el crecimiento microbiano. Por su riqueza en proteínas, la flora de alteración de esta carne es, sobre todo, proteolítica; los gérmenes obtienen el carbono y el nitrógeno de las proteínas presentes en el sustrato. Esta llora, aunque puede degradar o sintetizar grasas, no las necesita para su desarrollo. El glucógeno del músculo se convierte en ácido láctico después del sacrificio, por lo que desciende el pH a 6,2-6,4, valor que permite un buen crecimiento de la flora microbiana. Dicho esto, se deduce que es muy importante controlar la temperatura y la higiene durante la preparación de este producto, mediante la utilización de buenas prácticas de higiene y de conservación. La calidad bacteriológica de la carne de ave depende de distintos factores, ligados al sacrificio del animal y a su comercialización, sin olvidar su crianza en vida. En las distintas etapas del procesado de las aves, se producen incrementos o disminuciones de la microflora existente en las canales. Las aves vivas albergan gran número de microorganismos de diferentes tipos, principalmente en plumas, patas, contenido intestinal y exudado nasal. Esquemáticamente, se exponen las etapas principales del procesado de las aves: Recepción
Sacrificio
Enfriado en agua
Sangrado
Lavado
Escaldado
Eviscerado
Enfriado con aire 239
Desplumado
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
El escaldado tiene como finalidad facilitar el desplumado de las aves. Se hace por inmersión durante unos 30 segundos en un tanque de agua caliente. En esta fase tiene lugar una reducción del número de gérmenes por efecto del lavado y la destrucción de bacterias termosensibles. El desplumado aumenta la carga bacteriana sobre la piel de las aves y ocasiona problemas de contaminación cruzada y formación de aerosoles. La evisceración también aumenta la carga bacteriana, extendiendo la flora fecal a la piel, al mismo tiempo que se produce la contaminación de unas canales con otras por contacto. Se puede decir que en esta fase la contaminación alcanza el más alto grado. Con el lavado que sigue a la evisceración, la contaminación anterior se reduce un 20 por 100 en cada canal. En el enfriado en agua, si se utiliza agua clorada fría que fluya continuamente, la reducción de la flora puede ser del 90 por 100. El enfriado final se hace con aire frío (0 °C), que tiende a secar la piel, retardando con ello el crecimiento de la flora psicrotrófica e impidiendo el desarrollo de la no psicrotrófica. Inmediatamente después del enfriado con aire, los recuentos de gérmenes en piel suelen variar entre 5 x 103 a 1 x 105/cm2, y en la cavidad abdominal 1 x 104 a 1 x 105/cm2. La estructura de la piel hace que muchos gérmenes se adhieren a ella por medio de flagelos 0 fimbrias, por lo que son difíciles de desprender. Según pasa el tiempo, la flora se incrementa; así, al cabo de 10 días puede haber sobre la piel 109 - 10" gérmenes/cm2. Este incremento va acompañado de olores anormales (1 x 107 gérmenes/cm2) y una capa pegajosa de limo (1 x 10x gérmenes/cm2). Por su parte, el valor del pH se eleva a 7,5. La flora es muy variada y está asociada a la de las plumas, patas, excreciones, etc. Sin duda, los recuentos más bajos se dan cuando las condiciones de cría y procesado han sido higiénicas. Como son carnes enfriadas, predomina la flora psicrotrófica, sobre todo del género Pseudomonas (fluorescentes o no). En fases avanzadas de alteración por Pseudomonas, a veces se puede observar fluorescencia en las canales cuando se iluminan con luz ultravioleta. Dentro de la flora contaminante de alteración, las Pseudomonas representan un 70-80 por 100 y el resto son principalmente, Acinetobacter, Alteromonas, Achromobacter y Alcaligenes. En canales de aves congeladas no suelen existir problemas de alteración, a no ser por crecimiento de mohos y levaduras que resisten la acción del frío: Sporotrichum carnis (manchas blancas) y Cladosporium herbarum (manchas negras), por ejemplo. Cuando el ave en canal se trata con tetraciclinas por inmersión, los principales agentes de alteración son los mohos y levaduras. Con carga microbiana inicial de 103 gérmenes por gramo, el alimento dura unos 12 días sin mostrar alteración; si la carga inicial es de 105 gérmenes por gramo, el alimento comienza a mostrar alteración a los 6 días aproximadamente. Si el producto se mantiene en refrigeración, una canal con baja carga inicial, a 0 °C se mantiene inalterada 14-16 días; a 5 °C se altera a los 6-7 días ya 10 °C se observa mal olor y limo sobre la superficie a los 3 días. En cuanto a flora patógena, es evidente que la carne de pollo es una de las mayores fuentes de toxiinfección en el hombre. Los principales agentes causales
AVES Y CAZA
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son: Salmonella, Clostridium perfringens y St. aureus enterotoxigénico, sin olvidar algunas enfermedades entéricas provocadas por otros microorganismos, especialmente E. coli enteropatógeno, Yersinia enterocolítica y Campylobacter jejunilcoli. La Salmonella, a través de la carne de pollo, es en algunos países la causa predominante entre las toxiinfecciones alimentarias. Estas Salmonella no parecen ser parte de la flora intestinal normal de las aves, sino que la adquieren en el ambiente en que viven (insectos, roedores, aves salvajes, hombre), así como a través de los piensos y por sus condiciones de vida cuando se crían de forma intensiva. En la actualidad, la Salmonella constituye un problema de salud pública. Los esfuerzos realizados en cuanto a higiene en todos los puntos de la cadena de producción disminuyen el nivel de contaminación de esta bacteria. Datos aportados por distintos países señalan que el 50-90 por 100 de las canales de pollo están contaminadas con Salmonella. Con respecto a Clostridium perfringens, hay que tener en cuenta que es una especie bacteriana muy extendida en la naturaleza, abundante en el ambiente y que se encuentra en la flora intestinal de mamíferos y aves. En éstas, su tasa es elevada (1 x l05 /g), aun en animales sanos, y tiende a incrementarse con la edad. En la piel de los animales se suele encontrar en cantidad inferior a 10 gérmenes por centímetro cuadrado de piel. La intoxicación por St. aureus enterotoxigénico, producida por el consumo de carne de ave, es inferior a las toxiinfecciones por Salmonella y Cl. perfringens. Los Staphylococcus se introducen en el matadero a través de las aves vivas, que llevan el germen en sus plumas, patas, fosas nasales, etc., y que persisten en el material utilizado para el faenado y, particularmente, en los dedos de los desplumadores. La tasa de St. aureus disminuye de forma ostensible utilizando medios apropiados de limpieza y desinfección. Hay que tener presente la existencia de una bacteria, Listeria monocytogenes, que es de carácter ubicuitario y que actúa como patógena cuando las condiciones del huésped son favorables para su desarrollo. La enfermedad que produce se denomina listeriosis y, en el hombre, puede ser de origen alimentario. En estudios realizados por el Servicio de Microbiología (Área Biológica) del Centro Nacional de Alimentación (Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda) en los últimos años, sobre canales de aves de distinta procedencia, en el 90-95 por 100 se ha detectado L. monocytogenes. Los productos congelados pueden contener flora patógena que, al descongelar el producto, podría ocasionar idénticos problemas que la de canales frescas refrigeradas. El agua de descongelación constituye una fuente abundante de microorganismos, patógenos y no patógenos, procedentes de toda la canal. DEFINICIONES Aves de abasto Se entienden por aves de abasto: la gallina, el pavo, el pato, la oca, la pintada, la paloma, la perdiz, la codorniz, el faisán y demás especies domésticas. (Real Decreto 179/1985 de 6 de febrero; B.O.E. 15-2-85.)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Canal Se denomina canal el cuerpo entero de un ave de abasto después de sangrada, desplumada y eviscerada. (Real Decreto 179/1985 de 6 de febrero; B.O.E. 15-2-85.) Partes de la canal (cuartos) Son las partes anteriores (craneal) y posteriores (caudal), resultantes de la subdivisión de la canal en cuatro partes. (Real Decreto 179/1985 de 6 de febrero; B.O.E. 15-2-85.) Despojos Son las partes comestibles que se obtienen de las aves de abasto y que no están comprendidas en el término canal. (Real Decreto 179/1985 de 6 de febrero; B.O.E. 15-2-85.) Subproductos Son las materias que se obtienen de las aves y que no están comprendidas en los conceptos de canal o despojo. (Real Decreto 179/1985 de 6 de febrero; B.O.E. 15- 2-85.) Carne Es la parte comestible de las aves sacrificadas, sangradas y faenadas en condiciones higiénicas. Se incluyen en este concepto las porciones de grasa, hueso, cartílago, piel, tendones, aponeurosis, nervios y vasos linfáticos y sanguíneos, que normalmente acompañan al tejido muscular y que no se separan de éste en los procesos de manipulación, preparación y transformación de la carne. (Real Decreto 179/1985 de 6 de febrero; B.O.E. 15-2-85.) Canal fresca refrigerada Son las canales que, sometidas a la acción del frío, alcanzan una temperatura entre cero grados centígrados (0 °C) y siete grados centígrados (7 °C) en el interior de la masa muscular profunda en un tiempo inferior a 24 horas. (Real Decreto 179/1985 de 6 de febrero; B.O.E. 15-2-85.) Canal congelada Son las canales que, por el mismo tratamiento, obtuvieron también en su masa muscular profunda la temperatura de menos dieciocho grados centígrados (-18 °C), en un tiempo inferior a 24 horas. (Real Decreto 179/1985 de 6 de febrero; B.O.E. 15-2-85.)
AVES Y CAZA
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Pieza de caza Cualquier ave o mamífero salvaje, excluidos los marinos, pertenecientes a una especie aprobada por la autoridad de inspección para la producción de carne de caza y que, por haber sido abatida en aquel estado, no ha podido someterse a inspección ante mortem. (Real Decreto 2815/1983 de 13 de octubre; B.O.E. 11-11-83.) Canal de caza Pieza de caza, después de efectuada la eliminación del tracto digestivo. Comprende los órganos que han de retenerse con la misma a efectos de inspección o con fines comerciales. (Real Decreto 2815/1983 de 13 de octubre; B.O.E. 11-11-83.) Carne de caza Cualquier parte comestible, incluidos los despojos, de una pieza de caza autorizada como apta para el consumo humano. (Real Decreto 2815/1983 de 13 de octubre; B.O.E. 11-11-83.) PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE CANALES Y CARNE DE AVES Para orientación del analista en un control normal de estos productos, los recuentos e investigaciones comprenden: — — — — — —
Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 + 1°C). Recuento de colonias psicrotrófícas (17 °C). Investigación y recuento de Escherichia coli. Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de Clostridium perfringens. Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA La toma de muestras para el análisis se puede hacer por distintos procedimientos. Los gérmenes en las canales están distribuidos irregularmente. Se encuentran en mayor número en la piel del cuello y en escaso número en la piel de la pechuga. En el tejido muscular, el número de microorganismos es muy pequeño y, si el tejido muscular es profundo, está exento de bacterias normalmente. Es evidente, por lo tanto, que habrá una clara diferencia entre los recuentos de zonas que lleven piel exclusivamente y los que estén integrados por piel y carne o sólo por carne. Ocurre que la piel además de estar más expuesta a todo tipo de contaminaciones, por su estructura rugosa, facilita la adherencia de flagelos y fim-
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brias, lo que hace difícil el desprendimiento de los gérmenes durante las distintas etapas de preparación de las canales. Placas de Rodac Son unas pequeñas placas de Petri de plástico que llevan marcada una cuadricula para facilitar el recuento de las colonias. Estas placas estériles se llenan asépticamente con agar nutritivo hasta el mismo borde, de tal forma que, al solidificarse, se forme una superficie convexa. Para su uso se hace que tome contacto toda la superficie del agar con la zona elegido para tomar la muestra. La placa sembrada se somete a incubación a 31 ± 1 °C durante 24 horas. Al cabo de este tiempo, se hace el recuento de las colonias crecidas. Hisopo Los hisopos suelen ser de algodón o alginato estériles. El método consiste en frotar una superficie medida de la piel de la canal con el hisopo impregnado con tampón estéril. Se rompe por el extremo opuesto y se introduce en un tubo que contenga diluyente estéril. A partir del diluyeme inoculado, se hacen siembras totales o para investigar flora específica (Salmonella, Cl. perfringens, St. aureus, Listeria monocytogenes. Campxlobactcr, Yersinia, etcétera). Lavado de la canal En bolsa de polietileno estéril, de tamaño adecuado al de la canal, se introduce ésta y se vierten a continuación unos 1.000 ml de diluyente o caldo de enriquecimiento. Agitar para que el líquido bañe completamente toda la canal y se desprendan los microorganismos adheridos a la piel. El líquido de lavado constituye la muestra que hay que analizar. Exudado o goteo Se puede utilizar cuando se trata de canales envasadas en bolsas de plástico, refrigeradas o congeladas. En este último caso, se deja descongelar la canal, previamente, a temperatura de refrigeración durante 18-24 horas, como máximo. Luego se presiona la bolsa externamente con la mano para lograr abundante líquido de goteo. Se desinfecta la bolsa con alcohol de 70° en la zona donde se haya acumulado el líquido, que se extraerá, asépticamente, con jeringa estéril. Este líquido constituye la muestra y, si tomamos 10 mi en un tubo, será la suspensión madre, o primera dilución a partir de la cual se podrá preparar la «serie de diluciones decimales». Piel Se toma asépticamente una zona de piel de la canal y se homogeneiza con diluyente tamponado (agua de peptona tamponada) en la proporción 1/9, dejando
AVES Y CAZA
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macerar la mezcla unos minutos. Si el macerado se lleva a Stomacher, se logra una mayor recuperación de gérmenes. Músculo La muestra de músculo se recoge cauterizando la piel y desprendiéndola asépticamente para luego tomar zonas de los músculos subyacentes. Esta muestra, con el diluyente, será sometida a trituración-homogeneización. ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C (v. cap. 3) Recuento de colonias psicrotróficas (17 °C 5 días) (v. cap. 13) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de Cl. perfringens (v. cap. 12) Investigación y recuento de St. aureus (v. cap. 10) CRITERIO MICROBIOLÓGICO PARA CANALES Y CARNE DE AVE Actualmente, no existe norma microbiológica en la legislación española. Se sugiere, para poder conocer el estado higiénico-sanitario de estos productos, tener en cuenta las siguientes determinaciones y las cifras que se señalan, únicamente como orientación para el técnico: Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C: Recuento de psicrotrófcas (17 °C 5 dios): Investigación y recuento de E.coli: Investigación de Salmonella-Shigella: Investigación y recuento de Cl. perfringens: Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico:
1 x 106/g 1 x 105/g 1 x 107g Ausencia/25 g 5 x 10/g 1 x 102/g
Este criterio podría ser orientativo para canales de conejo de matadero.
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Pescado y derivados («Pescado y derivados». Capítulo XII del Código Alimentario Español)
La carne de pescado contiene proteínas (20-25 por 100) de alto valor biológico. Lleva vitaminas (tiamina, vitamina B|2, riboflavina, ácido pantoténico, ácido fólico, niacina y piridoxina; los pescados grasos contienen, además, vitaminas A y D, y minerales (yodo, sodio, potasio, fósforo, calcio, magnesio, hierro, flúor, manganeso, cloro, azufre, zinc, etc.)- El contenido graso varía con la especie (4-8 por 100) y está constituido por triglicéridos y fosfolípidos. Es pobre en hidratos de carbono. Se trata de un alimento eminentemente proteico y, en algunos países, como Japón, el pescado es la principal fuente de proteínas en su alimentación. El descenso del pH después de la muerte es escaso y depende de las condiciones de la captura, ya que las reservas de glucógeno disminuyen en mayor o menor grado como consecuencia, por ejemplo, de la resistencia que pone el pez al ser capturado. Por lo general, el pH del pescado, inmediatamente después de su captura, es 7; luego desciende a 6,2-6,5, para volver a subir a 6,6-6,7. Esto contribuye a la inestabilidad del pescado después de la muerte, ya que en estos valores de pH no se inhibe el desarrollo microbiano. Como consecuencia de su composición química y de la reacción poco acida de su carne, el pescado constituye un alimento altamente perecedero, debido a que sufre procesos autolíticos de degradación rápida y un acelerado crecimiento microbiano. El pescado, lo mismo que la carne, se puede deteriorar por la acción de enzimas autolíticas endógenas y el desarrollo de una flora de contaminación variada. La flora contaminante asienta, básicamente, sobre la piel y el intestino; se extiende y se multiplica en otros tejidos donde existen sustancias nutritivas adecuadas (sustratos de débil peso molecular: ácidos aminados, aminas) y un pH relativamente elevado que favorece el desarrollo de dicha flora. Como consecuencia de este crecimiento, aparecen compuestos volátiles que confieren mal olor al pescado, principalmente: trimetilamina, amoníaco, SH, mercaptanos, sulfuro de dimetilo, ácidos grasos, aldehídos, indol, etc., que son característicos del proceso de putrefacción; la trimetilamina es el producto más típico que se origina en la descomposición de los peces. Además, las proteasas hísticas y las bacterianas provocan un reblandecimiento rápido del músculo. Por su parte, los lípidos se oxidan y las hemoproteínas modifican el color de la carne. 247
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La refrigeración retarda un poco la aparición de estas transformaciones, pero no las suprime, ya que la flora contaminante es psicrotrófica (Pseudomonas) y continúa desarrollándose incluso a -5 °C; por otra parte, las lipasas que intervienen en la oxidación de los lípidos permanecen activas aun a temperaturas de congelación. La alteración del pescado depende de distintos factores: — Especie: Se alteran más rápidamente los peces planos que los redondos. — Condiciones del pescado en el momento de su captura. Una larga agonía provoca mayor consumo de glucógeno, cuya falta acelera la aparición de fenómenos de alteración. — Tipo de flora contaminante: Si la contaminación corporal e intestinal del pescado es alta y la que se instaura después de su captura también es elevada, la alteración será mayor y más rápida. La microflora del pescado vivo depende de la del ambiente natural en que vive; las especies microbianas aisladas en el intestino son las mismas que se han aislado en el agua donde se ha capturado. Las zonas de litoral son las más contaminadas, por contener desechos humanos y animales, contaminantes industriales y agrícolas, con el riesgo de que puedan contener flora patógena, principalmente de transmisión fecal (Salmonella virus, parásitos). La contaminación posterior a la captura del pescado se produce en las distintas fases que preceden a su venta y durante ella: a bordo del barco, por utilización de cajas y otros materiales sucios, por empleo de hielo de mala calidad bacteriológica, por lavado con aguas contaminadas, etc. Las faenas de transformación del pescado también suponen un riesgo de contaminación si las manipulaciones y el material utilizado son inadecuados. La carne y los órganos internos del pescado sano recién capturado son, generalmente, estériles, pero existe flora contaminante en piel, agallas o intestino, según el ambiente en que han vivido los peces y su alimentación. La superficie corporal y las branquias han estado constantemente en contacto con el ambiente acuático, por lo que resultan siempre más o menos contaminadas. Por su parte, el intestino lleva una carga microbiana que depende del hábitat y la alimentación. Durante los meses calurosos, la carga microbiana de la superficie del agua es elevada y desciende a medida que se baja hacia el fondo, donde, de nuevo, aumenta. En los meses fríos, al disminuir la temperatura ambiental, el agua de la superficie tiende a equilibrar su temperatura con la profunda y se establece un movimiento continuo que hace que la carga microbiana sea más uniforme que en la época de calor. A la contaminación natural del agua se une, en zonas del litoral, la contaminación con residuos urbanos y de otro tipo que pueden aportar flora patógena. Esta flora, en función de las corrientes marinas, puede ser vehiculada, incluso, a grandes distancias y si, como es normal, estos residuos llevan abundante materia orgánica, el crecimiento microbiano se favorece. La flora contaminante habitual del pescado pertenece a varios géneros, sobre todo psicrotróficos: Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Micrococcus, Alteromonas, Moraxella, Escherichia, Proteus, Serrana, Sarcina, Bacillus, Corynebacterium, Vibrio, Clostridium, mohos y levaduras. Dentro de estos géneros, el
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más abundante es Pseudomonas (60 por 100). En aguas más calurosas (costas de Australia, India, Sudáfrica), la proporción de mesófilos es mayor; predominan los Micrococcus (50 por 100) y Corynebacterium y descienden las Pseudomonas (18 por 100). Entre las especies bacterianas de interés sanitario que pueden formar parte de la microflora normal del pescado, se encuentran: Clostridium botulinum tipo E y Vibrio parahaemolyticus; existe otra flora que, aunque no es normal en el pescado, se puede transmitir al hombre por pescado contaminado: Salmonella, Shigella y Vibrio cholerae. En cuanto a parásitos, el pescado alberga numerosos parásitos que, en su mayoría, no suelen afectar al hombre. Entre los más importantes se encuentran los Anisakis (nematodos), que se transmiten al hombre a través del pescado. Se encuentran en la musculatura de los peces y se ingieren con el pescado crudo, deficientemente cocinado, adobado o ahumado en frío. Sobreviven a la congelación y se destruyen con el cocinado en caliente. El mecanismo de penetración de la flora microbiana en el músculo es distinto para peces planos y redondos. En los primeros se realiza a través de la piel y se favorece por las heridas que se pueden producir durante la captura; en los segundos, el acceso al músculo se produce a través del intestino. El paso desde el intestino está favorecido por la bacteriemia que se produce en los peces al ser capturados, debido a la fatiga y asfixia que sufren. Las branquias también sirven como puerta de entrada de los gérmenes al músculo. Como la autodepuración del agua del mar no es, a veces, todo lo rápida que sería de esperar, da tiempo a las bacterias patógenas, contenidas en las aguas residuales y/o fecales que desembocan en el litoral, a sobrevivir y poder ser ingeridas por los peces, que de esta forma se contaminan. A pesar de ello, si éstos se encuentran en agua pura, eliminan rápidamente las bacterias patógenas adquiridas del exterior. Entre las bacterias patógenas que se pueden encontrar en el pescado está Clostridium botulinum tipo E, especie que se asocia con el medio marino, aunque sus esporos se han encontrado también en ambiente terrestre. Está comprobado que los esporos de Cl. botulinum tipo E son de origen terrestre y de aquí son arrastrados al mar, ríos, lagos, etc. Se trata de una bacteria esporulada y toxinógena que se localiza en pequeño número en el intestino y, a veces, en la piel del pescado del hemisferio Norte y cuya presencia es inocua para estos animales. Sus esporos son menos resistentes que los de los otros tipos de Cl. botulinum, pero pueden crecer y elaborar toxina a 3 °C Los esporos persisten durante las manipulaciones del pescado v pueden germinar y elaborar toxina. Las arenas y sedimentos del mar, ríos, lagos, etc., contienen cifras altas de Clostridium y, en ciertas zonas, es muy frecuente Cl. botulinum tipo E, sobre todo en el hemisferio Norte, según estudios realizados en Japón, Estados Unidos (Grandes Lagos), Rusia, Groenlandia y otros países. La posibilidad de la presencia de este Clostridium en el pescado capturado en zonas contaminadas ha sido comprobada por numerosos investigadores; de hecho, la intoxicación por Cl. botulinum tipo E es frecuente en países donde se consume abundante pescado o sus subproductos. Es una especie halofílica, que soporta concentraciones de cloruro sódico al 3,5 por 100, y psicrotrófica, ya que sus esporos pueden germinar a 4 °C Sin embargo, es poco resistente al calor. El crecimiento del germen en el pescado está favorecido al encontrar en el músculo
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nutrientes y pH adecuados para su multiplicación y elaboración de toxina. Ha sido causa de brotes de botulismo en alimentos como: pescado crudo, pescado ahumado, pescado fermentado y pescado en conserva, principalmente. No obstante, CI. botulinum tipo E posee algunas características positivas para la preparación de conservas y marinadas de pescado: — Sus esporos se destruyen a 80 °C en 20 minutos, mientras que los tipos A, B, C y D exigen 100 °C, aplicados entre 30 minutos y 5 horas. — A pH inferior a 5,3 se inhibe su multiplicación y su toxinogénesis. El Vibrio parahaemolyticus es un germen halofílico marino, ampliamente distribuido en el agua de las costas, sedimento marino y plancton y que es patógeno para el hombre al ingerir pescado o marisco crudo o deficientemente cocinado. Como gérmenes de origen no marino y que pueden contaminar el pescado, se encuentran: — — — —
St. aureus enterotoxigénico. Salmonella. Shigella. Vibrio cholerae.
En la calidad microbiológica del pescado y derivados hay que considerar dos aspectos importantes: el sanitario y el económico. En el aspecto sanitario, los pescados presentan riesgos de distinta consideración para el consumidor, de acuerdo con su naturaleza, hábitat y transformaciones que sufren posteriormente a su captura. Es evidente que el hombre debe estar protegido de estos riesgos mediante el control de la presencia de microorganismos patógenos o sus toxinas. En el aspecto económico, es claro que los pescados son productos perecederos que se alteran fácilmente. Su alteración se debe a la presencia de una flora saprofita que no presenta riesgos desde el punto de vista sanitario, pero que es responsable de pérdidas económicas. DEFINICIONES Productos de la pesca Se entiende por productos de la pesca todas y cada una de las especies comestibles de pescado, mariscos y cefalópodos, marinos o de agua dulce, enteros, fraccionados o cualquier parte de los mismos. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto: B.O.E. 22-8-84.) Pescados Animales comestibles, marinos o de agua dulce, cuyos nombres vernaculares uficiales y científicos se especifican en el Capítulo Xll del Código Alimentario Español. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto: B.O.E. 22-8-84.)
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Peces Animales vertebrados de sangre fría: peces elasmobranquios y ciclóstomos. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos de la pesca y acuicultura frescos Son aquellos que no han sido sometidos desde su captura a ningún proceso de conservación. No se considera proceso conservador al desangrado, descabezado, eviscerado ni la adición preventiva del hielo, con o sin sal, o al mantenimiento en refrigeración. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos de la pesca congelados Son aquellos que, en estado fresco, han sido sometidos a la acción del frío hasta conseguir un descenso de la temperatura en el centro del producto, una vez conseguida la estabilización térmica: — — — —
Pescados magros, semigrasos y grasos: -18 °C. Crustáceos y moluscos: -16 °C Cefalópodos:-15 °C Túnidos en congelación por salmuera: -9 C.
Dentro de este producto se define como «ultracongelado» aquel que, procedente de la clase «extra» (los de la pesca artesanal, marisqueo cultivos marinos, vivos o muertos, que alcanzan tradicionalmente el primer punto de venta sin necesidad de empleo de hielo, sal u otros medios conservadores), pase rápidamente la zona de cristalización máxima, de modo que se logre en un periodo de tiempo inferior a dos horas, que en el centro del producto la temperatura baje de 0 a 5 °C. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos verdes o salpresados y salados Son los sometidos a la acción de la sal común, en forma sólida o en salmuera. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos en salazón Son los sometidos a la acción prolongada de la sal común, en forma sólida o en salmuera, acompañada o no de otros condimentos y especias. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos ahumados Son aquellos que. previamente salados o no, son sometidos a la acción del humo de madera u otros procedimientos autorizados. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.)
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Productos desecados Son aquellos sometidos a la acción del aire seco o a cualquier otro procedimiento autorizado hasta conseguir un grado de humedad inferior al 15 por 100. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos seco-salados Son los sometidos a la acción de la sal común y del aire seco hasta conseguir un grado de humedad no superior al 50 por 100. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos cocidos Son los que han sido convenientemente sometidos a la acción del vapor de agua o del agua en ebullición o cualquier otro sistema autorizado, sola o con adición de sal común, condimentos, especias y aditivos alimentarios autorizados. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos en semiconserva Aunque en sentido general puedan considerarse semiconservas los productos definidos anteriormente, excepto los pescados frescos y congelados, se establece que son aquellos que, con o sin adición de otras sustancias alimenticias autorizadas, se han estabilizado mediante un tratamiento apropiado para un tiempo limitado y se mantienen en recipientes impermeables al agua a presión normal. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos en conserva Son los que, con o sin adición de otras sustancias alimenticias autorizadas, se han introducido en envases cerrados herméticamente y han sido tratados después por procedimientos físicos apropiados, de tal forma que se asegure su conservación como producto no perecedero. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos despiezados Son los que han sido sometidos a la operación de despiece, que consiste en la separación de diversas partes del producto considerado, siguiendo criterios anatómicos, con el fin de obtener productos comerciales. Los productos obtenidos tendrán siempre una forma anatómica típica. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.)
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Productos troceados Son los que han sido sometidos a la operación de troceado, que consiste en la obtención de piezas a partir del producto considerado o de sus despieces, siguiendo criterios convencionales. En todo caso, las piezas tendrán una estructura anatómica identificable. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos picados Son los que han sido sometidos a la operación de picado, que consiste en la obtención de pequeños trozos a partir del producto considerado o de sus despieces o trozos mayores. En todo caso, estos pequeños trozos tendrán una estructura tisular típica. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos en pasta Son los que han sido sometidos a una operación de trituración de una o varias especies de productos de la pesca o de sus despieces o trozos. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Productos deshidratados o liofílizados Son aquellos productos enteros o fraccionados a los que se ha reducido su contenido de agua hasta el 5 por 100 como máximo por la acción de métodos autorizados; deben ser envasados al vacío o con gas inerte. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Embutido de productos de la pesca Es el embutido elaborado a partir del pescado sin piel, conservando la estructura tisular del mismo. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22- 8-84.) Bloque de productos de la pesca prensado Es el elaborado a partir de filetes o migas de pescado sin piel, prensado de tal manera que no presente grietas ni huecos intersticiales; las superficies serán homogéneas y lisas; las aristas bien marcadas. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE PESCADOS Y DERIVADOS En el pescado fresco no suele haber justificación para un análisis microbiológico, a no ser en casos muy concretos y por razones determinadas y específicas, debido a que:
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— Tienen un plazo de comercialización muy corto, dada su fácil alteración; este plazo sería más breve que el tiempo necesario para efectuar el análisis. — El pescado capturado en el mar, cuando se vende fresco, no suele estar contaminado con los microorganismos que, habitualmente, reflejan el estado higiénico sanitario de los alimentos. De aquí que los criterios microbiológicos utilizados en Microbiología Alimentaria no se adapten al pescado fresco. Por el contrario, es de la mayor utilidad valorar el estado de frescura de estos productos, mediante la inspección de los caracteres organolépticos: aspecto, olor, rigidez, piel, escamas, ojo, branquias, ano, visceras y carne. Es distinta la manera de proceder con el pescado transformado: troceado, picado, fileteados, etc., que por las manipulaciones que sufre, puede ser contaminado con microorganismos que, en este caso, reflejaría su estado higiénico-sanitario, por lo que requiere una vigilancia mediante el uso de criterios sanitarios. De igual modo, se controlará el pescado fresco destinado a la congelación. En estos casos, los recuentos y determinaciones microbiológicos serían: — — — — —
Recuento de colonias psicrotróficas (17 °C ± 3 °C). Investigación y recuento de Escherichia coli. Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de Clostridium perfringens. Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Piel Se elige la zona media del cuerpo, en un lateral, midiendo la superficie que se vaya a tomar. En condiciones asépticas, se extrae la piel con un mínimo de carne. La muestra se introduce en un tubo con tapón de rosca que contenga 10 mi de solución de Ringer (v. pág. 118) y un poco de arena estéril. Llevar al Stomacher durante 2 minutos. Hacer diluciones decimales. Carne Se toma, asépticamente, un trozo de tejido muscular del que se ha desprendido previamente la piel, para evitar contaminaciones. Diez gramos de carne se maceran en 90 mi de solución de Ringer (v. pág. 118) durante 5 minutos. Llevar al Stomacher durante 1 minuto. Hacer diluciones decimales. Branquias Con material estéril, se toma un trozo de branquia y se opera como en el caso de la piel. Hacer diluciones decimales.
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Contenido intestinal Se abre la cavidad abdominal asépticamente. Se liga el intestino en sus extremos con pinzas para extraer en condiciones asépticas todo el contenido intestinal del asa. Las heces extraídas se depositan en un tubo con tapón de rosca y con 10 mi de solución de Ringer (v. pág. 118). Homogeneizar en Stomacher durante 1-2 minutos. Hacer diluciones decimales. Agua de mar Se toma la muestra necesaria, en condiciones asépticas, y se analiza como un agua normal. El diluyente lleva una tasa de sal más elevada (8,5 g/1.000). Hielo Se dejan descongelar trozos de hielo en frigorífico y se analizan como el apara. ANÁLISIS El análisis microbiológico del pescado y derivados irá dirigido a dos clases de flora: — Normal, no peligrosa para la salud pública. — La que, contaminando el pescado, puede producir enfermedad. Con el análisis microbiológico se descubre el origen de las contaminaciones en la medida en que sea posible. Los microorganismos peligrosos para la salud suelen proceder de aguas contaminadas donde ha permanecido el pescado v, por tanto, se encontrarán en su intestino y/o en sus branquias. También pueden ser aportados por las malas manipulaciones efectuadas después de la muerte del pescado. Se encontrarán preferentemente en sus superficies externas. De acuerdo con estos conceptos, se deben examinar, separadamente: — — — —
Piel. Contenido intestinal en su totalidad. Branquias. Músculo.
A veces, interesa analizar el agua de mar y el hielo. Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias psicrotrófícas La incubación a (17° ± 3 °C 5 días) (v. cap. 13).
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Recuento de microorganismos halotolerantes La proporción de sal del agar de recuento será de 50 g/1.000. La incubación en estufa a 17° ± 3 °C durante 5 días. Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico (v. cap. 10) Investigación y recuento de Cl. perfringens (v. cap. 12) Investigación de toxina botulínica (v. cap. 17) CRITERIO MICROBIOLÓGICO PARA PESCADOS Y DERIVADOS Se sugieren los siguientes criterios como orientación para el técnico: Recuento de colonias Aerobias psicrotrófcas Escherichia coli Salmonella-Shigella St. aureus enterotoxigénico Cl. perfringens
1
2
3
1 x 105 g 10g Ausencia 25 g 1 x 102 g 10 g
lx 10 4 g Ausencia g Ausencia 25 g 1 x 102 g Ausencia g
1 x 106 g 1 x 102 g Ausencia 25 g 1 x 102g 10 g
1 = Pescado en filetes, trozos, etc., frescos o refrigerados. 2 = Pescado en filetes, trozos, etc., congelados o ultracongelados. 3 = Carne de pescado picada.
En el pescado en conserva se comprobarán su estabilidad y esterilidad, según metología del capítulo de Conservas (v. cap. 39), así como la posible presencia de toxina botulínica en determinadas ocasiones. MÉTODO DE LA DIGESTIÓN PARA LA LOCALIZACION DE NEMATODOS EN LOS MÚSCULOS DEL PESCADO Material — — — — — — —
Bisturí. Tijeras. Baño María Estufa de cultivo. Vaso de precipitado. Filtro tamiz de, aproximadamente, 2 mm de luz de malla. Microscopio.
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Solución digestiva Composición: Pepsina en polvo (potencia 1:2.500) Acido clorhídrico al 1 %
10 g 1.000 ml
Mezclar en vaso de precipitado. Técnica — Eviscerar el pez y retirar la cabeza. — Lavar para recoger cualquier parásito suelto en la cavidad abdominal o en la superficie externa. — Abrir el pez longitudinalmente, retirar la columna vertebral y colocar la carne en el vaso de precipitado que contiene la solución digestiva. — Dejar la mezcla a 52 °C, en baño María o estufa de cultivo. Agitar de vez en cuando durante 40 minutos. — Filtrar el contenido del vaso de precipitado donde se ha producido la digestión, a través del tamiz. — Poner el tamiz a chorro de agua para lavar todo el tejido muscular digerido y poder contar, sobre fondo oscuro, cualquier gusano. — Estudiar taxonómicamente el parásito, utilizando microscopio estereoscópico o microscopio óptico. El género Anisakis, de la familia Heterocheilidae, está constituido por especies de nematodos que son parásitos normales de mamíferos marinos y aves. Los adultos de este parásito viven habitualmente en el estómago de mamíferos marinos que se alimentan de peces (delfines, focas, ballenas, marsopas). Estos animales expulsan huevos que producen larvas, y en su segundo estado larvario se desarrollan en crustáceos hasta su tercer estado larvario. El tercer estado larvario se localiza en peces marinos, de los cuales pasa al huésped definitivo, cuando éste se alimenta de peces. En los últimos años ha adquirido gran importancia este parásito al conocerse que sus larvas, ingeridas con el pescado crudo o poco cocinado, horadan la pared estomacal y pueden originar granulomas gástricos en el hombre e, incluso, la muerte. Generalmente, las larvas del nematodo se encuentran en la pared intestinal y en el hígado de numerosos peces, por lo que una evisceración rápida después de su captura hace que se eliminen gran número de parásitos. Sin embargo, si el pescado se mantiene en refrigeración o en estado de congelación deficiente hasta su llegada a puerto para su comercialización, el retraso en la evisceración provoca que las larvas accedan a zonas profundas de la musculatura del pez. Las larvas de Anisakis están muy distribuidas entre los cefalópodos y peces marinos (calamar, arenque, sardina, jurel, caballa, salmón, bacalao, merluza, pescadilla, lubina, etc.).
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Mariscos (Crustáceos y moluscos) {«Mariscos y derivados». Capítulo XIII del Código Alimentario Español)
Los mariscos son animales invertebrados comestibles, marinos o continentales (crustáceos y moluscos), frescos o conservados por distintos procedimientos:
La carne de los crustáceos posee enzimas proteolíticas y una pequeña cantidad de glúcidos (0,5 por 100). Como consecuencia de ello, estos animales, una vez muertos, se alteran muy rápidamente y se produce una elevación del pH y la producción de compuestos nitrogenados volátiles. Como consecuencia de la oxidación de pigmentos, aparecen reacciones como el ennegrecimiento de la cabeza (melanosis), debidas a la acción de enzimas del propio cuerpo del animal (gamba, cigala, etc.) pero no de las bacterias que lo puedan acompañar. Entre la microflora de los crustáceos predominan: Pseudomonas Achromobacter, Micrococcus y Corynebacterium. En cuanto a patógenos, como estos productos pueden ser capturados cerca de las costas y, por tanto, estar expuestos a contaminaciones terrestres que contengan flora patógena para el hombre, es fácil que sean portadores de gérmenes con riesgo sanitario. De crustáceos se conocen importantes brotes de toxiinfección por Vibrio parahaemolyticuss en Estados Unidos, por el consumo de estos productos cocidos y recontaminados después de la cocción. Los moluscos de valva son más ricos en glúcidos (3-6 por 100), glucógeno, principalmente. De acuerdo con su composición, la alteración que sufren es fer259
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mentativa, con un descenso progresivo de pH, por lo que las Pseudomonas que acompañan al principio a estos moluscos son sustituidas por especies bacterianas acidificantes: Lactobacillus, Streptococcus e, incluso, levaduras. La medida del pH puede servir, a veces, para valorar la calidad microbiológica de los moluscos bivalvos. Las ostras frescas, por ejemplo, tienen un pH entre 6,2-6,5 que desciende a pH 5,8 o inferior cuando se alteran. En los moluscos vivos predominan los géneros: Pseudomonas, Vibrio. Achromabacter, Flavobacterium, Cytophaga y escasos gérmenes grampositivos. En los moluscos alterados aumenta considerablemente el recuento total microbiano y predominan las bacterias gramnegativas proteolíticas: Pseudomonas y Vibrio y sacarolíticas (Lactobacillus). La alteración por las primeras se traduce en la formación de aminas y amoníaco. Por la acción de las bacterias sacarolíticas desciende el pH, por fermentación del glucógeno de los tejidos. En cuanto a flora patógena, su presencia en los moluscos bivalvos tiene que ver con el lugar de desarrollo de estos animales y su forma de alimentarse, ya que. al filtrar al día muchos litros de agua, la concentración de microorganismos en su cuerpo es notable, con el peligro de que entre ellos existan especies que supongan un riesgo sanitario para el hombre, sobre todo si los moluscos se consumen crudos. Entre los microorganismos más peligrosos están los de origen entérico: Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Escherichia coli y virus. También se han aislado otras especies de patógenos, como Cl. botulinum, Cl. perfringens. St aureus enterotoxigénico, etc. El Vibrio parahaemolyticus aparece en moluscos que viven en aguas templadas durante los meses de verano, y durante todo el año en los que viven en aguas cálidas. Son frecuentes los casos de fiebres tíficas, paratíficas y hepatitis víricas por consumo de ostras. Los mejillones crudos, mal cocinados o recontaminados pueden ser la causa de fiebres tíficas y salmonelosis. Los moluscos bivalvos son portadores en ocasiones de biotoxinas marinas. Las biotoxinas marinas producen distintos trastornos para la salud después de consumir determinadas sustancias tóxicas. Varias especies de dinoflagelados producen sustancias tóxicas (biotoxinas), entre ellas Gonyaulax caterella, Gonyaulax tamarensis y Pyrodinum phoneus. Dentro de las especies toxigénicas, el género Gonyaulax es el que aporta mayor número. Se pueden distinguir dos grupos de biotoxinas claramente diferenciadas: — Neurotoxinas. — Enterotoxinas. Al grupo de las neurotoxinas pertenecen, principalmente: — — — —
Saxitoxina. Neosaxitoxina. Saxitoxinas crípticas Gonyautoxinas.
producidas por especies de los géneros Gonyaulax y Gymnodinium. Dentro del grupo de las neurotoxinas, se encuentra otro subgrupo, el de la toxina de Gymnodinium breve, que produce NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning).
MARISCOS (CRUSTÁCEOS Y MOLUSCOS)
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Respecto a las enterotoxinas, producidas fundamentalmente por los géneros Dinophysis y Prorocentrum, hasta el momento se han identificado: — Dinofisistoxina, — Peptenotoxina. — Yessotoxina. Las intoxicaciones producidas al ingerir productos del mar se conocen hace mucho tiempo, y suelen estar relacionadas con la aparición de un fenómeno natural denominado «marea roja». Los organismos productores de biotoxina, los dinoflagelados, son elementos constituyentes del plancton. Aunque viven habitualmente a gran profundidad, ascienden a la superficie y se multiplican muy activamente si concurren ciertos factores respecto a salinidad, temperatura, luz solar, etc. Cuando estos factores son óptimos, los dinoflagelados se reproducen de manera extraordinaria hasta dar lugar a lo que parece una verdadera floración con la aparición de distintos colores en el mar, siendo el más común el rojo, de aquí la denominación de «marea roja» o «purga de mar». Los moluscos, y especialmente los mejillones, filtran grandes cantidades de agua de mar para retener el plancton que les sirve de alimento. En esta operación, se fijan las toxinas en el hepatopáncreas de los mejillones y en el sifón de las almejas. El hombre, al consumirlos, presenta diversos cuadros de intoxicación, según las especies de dinoflagelados acumulados. Los dinoflagelados productores de neurotoxinas en los moluscos originan la intoxicación paralítica (Paralytic Shellfish Poisoning: PSP). Los dinoflagelados productores de enterotoxinas en los moluscos originan la intoxicación diarreica (Diarrhetic Shellfish Poisoning: DSP). Los síntomas de la intoxicación paralítica (PSP) aparecen entre los 15 minutos y las 3 horas después de la ingestión de moluscos tóxicos, y son: hormigueo en labios, carrillos, lengua, cara y cuello, que pasa luego a brazos, piernas y dedos de pies y manos. Posteriormente, hay entumecimiento corporal y dificultad de movimientos, salivación, sed, disfagia, anuria, dolores musculares, vértigo, malestar general y dolor de cabeza. También pueden producirse síntomas gastrointestinales secundarios. Al final, aparecen convulsiones y muerte por parálisis respiratoria. Los síntomas duran de 3 a 7 días. La cocción de los alimentos disminuye la cantidad de toxina, debido a que se diluye en el agua, pero no porque se vea afectada por el calor. La sintomatalogía de la intoxicación diarreica por moluscos (DSP) se caracteriza por trastornos gastrointestinales: náuseas, vómitos y dolor abdominal. La aparición de los síntomas se produce entre los 30 minutos y varias horas después de la ingestión del molusco tóxico, pero no más de 12 horas. Los afectados se recuperan en 2-3 días. Los síntomas observados en la intoxicación con toxina de Gymnodinium breve constituyen el denominado síndrome de NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning), y se manifiestan con: pinchazos en las extremidades, escalofríos, pulso bajo, pupila dilatada, diarrea leve. La recuperación es rápida. Hasta el momento, no se han descrito en Europa mareas rojas por este dinoflagelado. De las distintas toxinas, la más importante es la PSP (Paralytic Shellfish Poisoning). Se trata de una toxina soluble en el agua, resistente al calor y esta-
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ble en condiciones acidas. Es uno de los venenos no proteínicos más potentes. La dosis tóxica para el hombre está por encima de las 40.000 a 60.000 unidades-ratón. En España se siguen, para su control, las recomendaciones establecidas por la FDA (Food and Drug Administration) avaladas por la OMS (Organización Mundial de la Salud), que consideran no aptos para el consumo humano moluscos con cantidades de 80 /Yg de saxitoxina por 100 gramos de vianda.
DEFINICIONES Mariscos Animales invertebrados comestibles, marinos o de agua dulce (crustáceos, moluscos no cefalópodos y equinodermos), cuyos nombres figuran en el Capítulo XIII del Código Alimentario Español. (Real Decreto 1521/1984 de 1 de agosto; B.O.E. 22-8-84.) Molusco bivalvo depurado Se entiende por molusco bivalvo depurado el producto obtenido, por su mantenimiento en tanques de depuración bajo condiciones aprobadas y controladas, del que se ha eliminado en cantidad suficiente la flora patógena en las condiciones que se determinan en la norma de calidad para los moluscos bivalvos depurados y es apto en vivo para consumo humano. (Orden de 31 de julio de 1985: B.O.E. 8-6-85.) Mejillón cocido y congelado Se entiende por mejillón cocido y congelado el producto obtenido a partir, exclusivamente, de la especie de mejillón Mytilus edulis y Mytilus gallo provincialis, que ha sufrido tratamiento térmico (vapor, agua caliente, calor seco o cualquier otro sistema autorizado), antes de la apertura de la concha, para facilitar la separación de la carne y posterior congelación. (Orden de 15 de octubre de 1985; B.O.E. 22-10-85.) Mejillón, almeja y berberecho en conserva Se entiende por mejillones, almejas y berberechos en conserva los productos obtenidos a partir del molusco de las especies cuyo nombre científico se señala en el articulo 2.° de esta norma, envasados con los medios de cobertura adecuados, en recipientes herméticos y esterilizados convenientemente por tratamiento térmico.
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Nombre vulgar oficial de la especie Mejillón Mejillón Almeja fina Almeja babosa Almeja rubia Almeja margarita Almeja chilena Berberecho
Denominación científica de la especie
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Denominación normalizada de los productos conservados
Mytilus edulis Mytilus gallo provincialis Venerupis (Tapes) decussatus Venerupis ((Tapes) pullastru Venerupis (Tape) rhomboides Venerupis (Tapes) aureus (gmi) Protothaca thaca (Mol) Amenoghinonya antigua (King) Carastoderma (Cardium) edule
Mejillón Mejillón Almeja Almeja Almeja Almeja rubia Almeja chilena Berberecho
Orden de 15 de octubre de 1985 por la que se aprueba la Norma de Calidad para el mejillón, almeja y berberecho en conserva (B.O E. 22-10-85). NOTA: Se remite al lector al Real Decreto 263/1985 de 20 de febrero (B.O.E. 7-3-85), articulo 2o. sobre los moluscos bivalvos que son de depuración obligatoria: ostra, ostión, almeja fina, almeja babosa, mejillón y berberecho.
PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO Y BIOLÓGICO DE MARISCOS Y DERIVADOS Para el control normal de estos productos, se requieren los siguientes recuentos e investigaciones: — — — — — — — — —
Recuento de colonias aerobias revivifícables. Investigación y recuento de E. coli. Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales. Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico. Investigación y recuento de Streptococcus D. de Lancefíeld. Investigación de Vibrio parahaemolyticus. Investigación de biotoxinas marinas hidrosolubles. Investigación de biotoxinas marinas liposolubles.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Crustáceos con caparazón Se desinfecta la superficie de caparazón con alcohol de 70° para quitarlo luego, asépticamente, con ayuda de material estéril. Crustáceos sin caparazón Se manipula la carne asépticamente con material estéril.
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Moluscos Tomar el suficiente número de individuos para que el volumen de carne más líquido intervalvar no sea inferior a 30 ml e introducirlos en un cristalizador con agua clorada (0,2 ppm de cloro libre). Limpiar los moluscos 0.5 uno a uno bajo el grifo de agua corriente con un cepillo para quitar algas, tierra y otras sustancias. Después de un cuidadoso lavado de manos, abrir las valvas, previo llameado rápido, con un cuchillo abridor de ostras esterilizado. Seccionar el pie del molusco y recoger el cuerpo y el líquido intervalvar en una probeta graduada estéril. Añadir el diluyente (solución de Ringer 1/4) o agua de triptona (TW) para obtener la dilución 1:10 (el líquido intervalvar sirve como parte del líquido de dilución). Triturar-homogeneizar para obtener la suspensión madre de la muestra. ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias revivificables (v. cap. 3) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae (v. cap. 6) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico (v. cap. 10) Investigación y recuento Streptococcus D. de Lancefield (v. cap. 14) Investigación de V. parahaemolyticus (v. cap. 15) Investigación de biotoxinas marinas hidrosolubles (PSP) (v. cap. 26) Investigación de biotoxinas marinas liposolubles (DSP) (v. cap. 26) Investigación de toxinas botulínicas (v. cap. 17) CRITERIO MICROBIOLOGICO PARA MARISCOS (CRUSTÁCEOS Y MOLUSCOS) Y DERIVADOS Crustáceos y moluscos pueden ser capturados en zonas cercanas a las costas, por lo que están expuestos a contaminaciones de origen terrestre, de aquí que el análisis microbiológico deba estar dirigido a la investigación de flora de origen fecal. Para productos muy manipulados, principalmente crustáceos desprovistos de caparazón, se completa el control con la investigación de St. aureus, organismo que puede haber sido aportado por el hombre a través de manipulaciones poco cuidadosas.
MARISCOS (CRUSTÁCEOS Y MOLUSCOS)
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En los productos crudos interesa investigar cierta flora patógena como, por ejemplo, Vibrio parahaemolyticus. También interesa el control de biotoxinas marinas (PSP y DSP), productos tóxicos para el hombre si se ingieren con los moluscos. Como orientación para el técnico, se sugiere el siguiente criterio microbiológico: 1 Recuento total de colonias revivificables Escherichia coli Salmonella-Shigella Clostridium sulfíto-reductores St. aureus enterotoxigénico
1 x 105g 2g Ausencia 25 g 2g —
2
3
1 xl03Vg 2g Ausencia 25 g 2g —
1 x 105Vg 1 x l0g Ausencia 25 g 1 x l0g 1 x 10 2g
1 = Crustáceos enteros, cocidos y refrigerados. 2 = Crustáceos cocidos o crudos, congelados o ultracongelados. 3 = Gambas, langostinos, etc.. pelados, refrigerados, congelados o ultracongelados.
Existen Normas Microbiológícas de obligado cumplimiento en la siguiente Legislación: Por Orden de 31 de julio de 1985 (B.O.E. 8-6-85), se aprueba la «Norma de Calidad para moluscos bivalvos depurados». En el artículo 10 de dicha Orden se dictan Normas Microbiolóeicas y Biológicas: Recuento total de microorganismos aerobios revivificables (20 °C cinco dios) Escherichia coli Salmonella Streptococcus D de Lancefield Vibrio parahaemolyticus Biotoxinas hidrosolubles Biotoxinas liposolubles
Máximo 1 x l05Vg Máximo 5 x 102/g Ausencia 25 g Máximo 1 x 102/g Máximo 1 x 102/g 80,µg/100/g producto Ausencia/100/g producto
Por Orden del 15 de octubre de 1985 (B.O.E. 22-10-85) se aprueba la «Norma de Calidad para mejillones cocidos y congelados». En el artículo 11 de dicha Orden, se dictan Normas Microbiológicas y Biológicas. Recuento de colonias aerobias mesófilas Enterobacteriaceae totales Escherichia coli Salmonella-Shigella St. aureus enterotoxigénico Biotoxinas hidrosolubles Biotoxinas liposolubles
Máximo 1 x 104/g Máximo 1 x l01/g Ausencia/g Ausencia 25 g Máximo 1 x 102/g 80 g/100/g producto Ausencia/100/g producto
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Por Orden de 15 de octubre de 1985 (B.O.E. 22-10-85) se aprueba la «Norma de Calidad para el mejillón, almeja y berberecho en conserva». En el artículo 11 de dicha Orden se dicta la Norma Microbiológica para estos productos: — Ausencia de gérmenes patógenos. — Ausencia de microorganismos que crezcan y se multipliquen, previas las pruebas de preincubación durante 28 días a 31 °C ± 1 °C y 10 días a 44 °C. — Flora esporulada: máximo 10 esporos de Bacillaceae termoestables, no patógenos, no toxigénicos e incapaces de alterar la conserva. — Ausencia de toxina botulínica en todo el contenido del envase.
Por Real Decreto 38/1989 de 13 de enero (B.O.E. 20-1-89), se aprueba la «Norma de Calidad exigida a las aguas para la cría de moluscos». Dentro de los parámetros bacteriológicos, se señala el análisis trimestral de coliformes fecales/100 ml. MÉTODO ANALÍTICO BIOLÓGICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA TOXINA PARALIZANTE DEL MARISCO (PARALYTIC SHELLFISH POISONING: PSP) Para la detección de toxinas marinas existen métodos biológicos, inmunológicos y químicos. En el momento presente, el «bioensayo en ratón» es el método oficial para la determinación de biotoxinas PSP en España, y resulta el mejor método disponible hasta ahora. Se discute actualmente en el seno del Comité Veterinario de la CEE la conveniencia de mantener este método o sustituirlo por otros: fluorométrico o HPLC, fundamentalmente. Material — — — — — — —
Guantes de goma. Abridor de ostras. Balanza. Tamiz. Vidrio de reloj. Triturador-homogeneizador. Jeringuillas.
— Solución estándar de toxina paralizante de marisco 100//g mi (suministra: División of Microbiology, Food and Drug Administration, 1090 Tusculum Ave., Cincinnati, OH 45226, como una solución acida estándar al 20 por 100 estable indefinidamente en frigorífico). — Solución de trabajo estándar de toxina paralizante de marisco; cantidad: 1 ug/ml. Se diluye 1 ml de la solución estándar de toxina paralizante de marisco con agua destilada hasta 100 ml. Esta solución es estable durante varias semanas en refrigeración a 3-4 °C.
MARISCOS (CRUSTÁCEOS Y MOLUSCOS)
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— Ratones blancos sanos, de 19 a 21 g de peso, procedentes de una colonia stock controlada. Si el peso es inferior a 19 g o superior a 21 g, se aplicará el factor de corrección para obtener el tiempo de muerte verdadero (ver Tabla en página siguiente). No usar ratones de peso superior a 23 g ni que hayan sido utilizados anteriormente. Técnica Preparación de la muestra Almejas, ostras y mejillones: Limpiar la parte externa del molusco con agua del grifo. Abrir las valvas cortando los músculos abductores. Lavar el interior con agua corriente para extraer sustancias extrañas. Separar la carne de la concha. Recoger 100-150 g de carne del molusco en un vidrio de reloj. Pasar las carnes a un tamiz del n.° 10 y después separar el líquido durante 5 minutos. Triturar-homogenizar la carne. Veneras: Separar la porción comestible cortando el músculo abductor, y utilizarla como muestra filtrándola y triturándola como en el caso anterior. Molusco en conseja: Colocar en un mezclador todo el contenido del envase, incluido el liquido de gobierno, y triturar tres veces. Para envases grandes, drenar la carne sobre un tamiz del n.° 8-12 y recoger el líquido. Determinar el peso de la carne y el volumen del líquido. Mezclar porciones de ambos proporcionalmente y triturar-homogeneizar. Extracción En un vaso de precipitación tarado, se pesan 100 g del homogeneizado de la muestra. Añadir 100 mi de ácido clorhídrico 0,1 N. Agitar perfectamente y comprobar el pH (el pH deberá ser inferior a 4, preferentemente 3). Calentar el homogeneizado, hervir suavemente durante 5 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente. Ajustar el pH del homogeneizado enfriado a 2-4, pero nunca a un valor superior a 4,5. Si es necesario bajar el pH, añadir ácido clorhídrico 5 N, gota a gota, agitando; si es necesario elevar el pH, añadir hidróxido sódico 0,1 N, gota a gota, con agitación continuada para prevenir la alcalinización local y la destrucción de la toxina. Transferir el homogeneizado a una probeta graduada y diluir hasta 200 mi. Pasar este último homogeneizado a un vaso de precipitado, agitar para homogeneizar de nuevo la mezcla y dejar en reposo hasta que el sobrenadante sea traslúcido. Si fuera necesario, centrifugar a 3.000 rpm durante 5 minutos o filtrar a través del papel de filtro. Test del ratón Inocular 2-3 ratones, por vía intraperitoneal, con 1 mi del extracto ácido (v. pág. 267). Anotar el momento de la inoculación y observar cuidadosamente el tiempo de muerte, que viene indicado por el último suspiro. Registrar el tiempo de
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muerte con cronómetro. Si el tiempo de muerte medio de varios ratones es inferior a 5 minutos, hacer diluciones para obtener tiempos de muerte entre 5 y 7 minutos. Si el tiempo de muerte de 1 ó 2 ratones inyectados con la muestra no diluida es superior a 7 minutos, deberán ser inoculados 3 o más ratones para establecer la toxicidad de la muestra. Si fueran necesarias diluciones mayores, ajustar el pH de las diluciones añadiendo, gota a gota, ácido clorhídrico 0,1 N ó 0,01 N hasta pH 2-4 (nunca superior a 4,5). Inocular a tres ratones con la dilución que dé un tiempo de muerte entre 5 y 7 minutos. Cálculo de toxicidad Determinar el tiempo de muerte medio, incluyendo el de los ratones supervivientes y, a partir de la Tabla de Sommer, determinar el número de unidades-ratón correspondiente. Si el peso de los animales de experimentación es inferior a 19 g o superior a 21 g, hacer la corrección para cada ratón multiplicando las unidades ratón correspondientes al tiempo de muerte de ese ratón por el factor de corrección de peso para ese ratón, hallado en la Tabla de Sommer; después determinar la unidad-ratón media por grupo. Convertir las unidades-ratón a µg de toxina/ml, multiplicando por el factor de conversión. Tabla de Sommer. Relaciones tiempo de muerte/unidades-ratón para Veneno Paralizante de Marisco (ácido) * Tiempo de muerte
Unidades ratón
1:00 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
100 66.2 38.3 26.4 20.7 16.5 13.9 11.9 10.4 9.33 8.42
2:00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50
7.67 7.04 6.52 6.06 5.66 5.32 5:00 4.73 4.48 4.26 4.06
* Tiempo de muerte
Unidades-ratón
5:00 05 10 15 20 30 40 45 50
1.92 1.89 1.86 1.83 1.80 1.74 1.69 1.67 1.64
6:00 15 30 45
1.60 1.54 1.48 1.43
7:00 15 30 45
1.39 1.35 1.31 1.28
8:00 15 30
1.25 1.22 1.20
MARISCOS (CRUSTÁCEOS Y MOLUSCOS)
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Tabla de Sommer. Relaciones tiempo de muerte/unidades-ratón para Veneno Paralizante de Marisco (ácido) (Continuación) * Tiempo de muerte
Unidades ratón
55 3:00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
3.88 3.70 3.57 3.43 3.31 3.19 3.08 2.98 2.88 2.79 2.71 2.63 2.56
4:00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
2.50 2.44 2.38 2.32 2.26 2.21 2.16 2.12 2.08 2.04 2.00 1.96
* Tiempo de muerte
Unidades-ratón
45 9:00 30 10:00 30
1.18 1.16 1.13 1.11 1.09
11:00 30
1.075 1.06
12:00
1.05
13 13 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 30 40 60
1.03 1.03 1.000 0.99 0.98 0.972 0.965 0.96 0.954 0.948 0.942 0.937 0.934 0.917 0.898 0.875
* Minutos:Segundos
Tabla de corrección para peso de ratón Peso del ratón (g) 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5
Unidades/ratón 0.50 0.53 0.56 0.59 0.62 0.65 0.675 0.70
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Tabla de corrección para peso de ratón (Continuación) Peso del ratón (g) 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20 20.5 21 21.5 22 22.5 23
Unidades/ratón 0.73 0.76 0.785 0.81 0.84 0.86 0.88 0.905 0.93 0.95 0.97 0.985 1.000 1.015 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07
MÉTODO ANALÍTICO BIOLÓGICO PARA LA DETERMINACIÓN DE ENTEROTOXINA (DIARRHETIC SHELLFISH POISONING: DSP) EN MOLUSCOS (YASUMOTO 1978) Para la determinación del DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) se utilizan métodos biológicos (bioensayo en ratón) o químicos (HPLC). Material — — — — — — — — —
Guantes. Balanza. Abridor de moluscos. Bisturí. Tamiz. Triturador-homogeneizador. Matraz Kitasato. Bomba de vacio. Baño María.
Preparación de la muestra Lavar los moluscos al grifo del agua corriente y abrirlos lavando también el contenido de las conchas.
MARISCOS (CRUSTÁCEOS Y MOLUSCOS)
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Aislar perfectamente el hepatopáncreas y colocarlo sobre papel de filtro para su perfecta desecación, durante unos 5 minutos. Tomar 30 g de hepatopáncreas y triturarlos hasta obtener una pasta fina. Extracción de la toxina Lavar el triturador tres veces consecutivas con 50 mi de acetona, agitando en los intervalos durante 2 minutos cada vez. Filtrar. Los 150 mi de filtrado se pasan a un Kitasato de 250 mi éste se conecta a una bomba de vacío y se introduce en un baño María regulado a 45-50 °C. Agitar de vez en cuando hasta que no se produzcan burbujas. El residuo se suspende en una solución de Tween 60 al 1 por 100 en agua destilada. Test del ratón Inyectar intraperitonealmente a ratones blancos, que pesen entre 17 y 20 gramos, 1 ml del extracto. Se pueden inocular diluciones seriadas a varios ratones si se sospecha que pueda existir gran cantidad de enterotoxina. Observar el ratón durante 48 horas, con intervalos a las 18 y 24 horas. En caso positivo, sobreviene la muerte entre las 24 y 48 horas, con síntomas y lesiones gastroentéricas. Durante el periodo de observación, mantener al ratón en condiciones óptimas de temperatura y ventilación, y suministrar alimento y agua.
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Huevos y derivados («Huevos y derivados». Capítulo XIV del Código Alimentario Español)
El huevo, como alimento, puede ser considerado como la proteína más perfecta. Para la alimentación humana se utilizan, generalmente, huevos de gallina. En el siguiente cuadro se dan cifras de la composición del huevo de gallina: Agua % Huevo entero Yema Clara
73,7 51,1 87,6
Proteínas %
Grasas %
Hidratos de Carbono %
Cenizas * %
1 2,9 16,0 10,9
11,5 30,6 indicios
0,9 0,6 0,8
1,0 1,7 0,7
* Minerales: hierro calcio, fósforo, sodio y potasio Vitaminas: del complejo B
El valor del pH del huevo de gallina recién puesto es de 7,6 a 7,9. El pH de la clara puede alcanzar un valor máximo de 9,7. La yema tiene un pH cercano a 6 que se eleva durante el almacenamiento del huevo y alcanza valores entre 6,4 y 6,9. Los huevos poseen un sistema defensivo que obstaculiza notablemente su contaminación interna. El huevo de gallina sana, en el momento de la puesta es, normalmente, estéril, y su estructura y composición ofrecen una protección eficaz frente a las contaminaciones microbianas. La yema por su composición y otras propiedades, constituye un excelente medio de cultivo para los microorganismos y está rodeada de unas barreras de protección que evitan su contacto con el exterior. Las barreras que protegen a la yema o vitelo son: — Cutícula: Revestimiento mucilaginoso impermeable de la cáscara, de naturaleza proteica y que actúa como barrera mecánica cuando está intacta. Esta sustancia obstruye los poros de la cáscara. Cuando está seca, impide el acceso de los gérmenes al huevo. Desaparece con la humedad. 273
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— Cáscara calcárea: Constituye un obstáculo mecánico a la penetración de microorganismos al interior del huevo; es de naturaleza calcárea y está compuesta por carbonato calcico (93,7 por 100), carbonato magnésico (1,39 por 100), P,O. (0,76 por 100) y materia orgánica (4,15 por 100). Forma una red fibrilar y su superficie es porosa. Los numerosos poros de la cáscara miden entre 20 y 45 //m de diámetro y están obturados por tapones de cutícula. La humedad y otras circunstancias (higrometría elevada, condensación de vapor de agua en el huevo, acción de ciertas enzimas, etc.), permeabilizan estos tapones y permiten la entrada de gérmenes móviles con cierta actividad proteolítica (Enterobacteriaceae, Pseudomonas) y micelios de mohos a través de la cáscara. — Membranas de la cáscara: Son dos, externa e interna. La membrana externa es una prolongación de la red fibrilar de la cáscara y forma fibras entrelazadas con estructura laxa. La membrana interna forma una red fibrilar compacta y actúa como un filtro, frenando la progresión de numerosos microorganismos. Ambas membranas, sobre todo la interna, retardan la invasión de las bacterias desde el exterior, pero no de las hifas de los mohos, que pueden aposentarse en las membranas y reproducirse. — Albúmina (clara de huevo): Se trata de una barrera muy importante contra la invasión microbiana por su acción bacteriostática y bactericida para ciertas especies. Contiene sustancias antimicrobianas que restringen o inhiben totalmente el crecimiento de flora invasora. Su acción protectora se debe a su elevado pH inicial (en las proximidades de 9), y a la presencia de sustancias inhibidoras: • Lisozima: Enzima que lisa las paredes de las bacterias grampositivas. • Avidina: Sustancia que, al combinarse con la biotina, bloquea su acción, que es indispensable para el crecimiento de muchos gérmenes. • Conalbúmina: Sustancia que bloquea la acción de algunos metales (hierro, cobre y zinc) indispensables para el crecimiento de muchos gérmenes. Actúa frente a grampositivos y gramnegativos. • Riboflavina: Vitamina del complejo B que limita el crecimiento de algunos gérmenes. • Proteína B: Sustancia que inhibe la proteasa fúngica, limitando el crecimiento de hongos. La yema, fuente rica en nutrientes, no contiene agentes inhibidores, por lo que, si se contamina, los gérmenes crecen muy rápidamente. El huevo de gallina se considera estéril en el momento de la puesta, a no ser que se haya infectado de forma congénita, principalmente con ciertas Salmonella. La contaminación del huevo se produce habitualmente después de la puesta, cuando los microorganismos presentes en la superficie externa de la cáscara intentan vencer las barreras defensivas naturales del huevo para penetrar en su interior y, si lo logran, se producen fenómenos de alteración. También puede ocurrir que el huevo se contamine en el ovario o en el oviducto durante su formación. Esto ocurre, principalmente, con gérmenes patógenos, como Salmonella. Hay muchas referencias sobre el aislamiento de Salmonella en huevos procedentes de gallinas infectadas o de gallinas portadoras sanas con lo-
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calización ovárica. En aves portadoras sanas no hay que excluir el paso de Salmonella desde la cloaca al oviducto, donde se encuentra el óvulo sin la protección de la albúmina, en el momento del acoplamiento. Esta forma de contaminación es más frecuente en patas, cuyo acoplamiento y forma de vida se realiza, con frecuencia, en aguas polucionadas. La contaminación externa del huevo ya comienza en el momento de la puesta, por el contacto con materias fecales a su paso por la cloaca y, después, en el nido, por contacto con el ambiente exterior; es evidente que la superficie del huevo está siempre más o menos contaminada y que, en un tiempo que depende de muchos factores, los gérmenes contaminantes pueden atravesar sus barreras protectoras y llegar a la yema. Después de la puesta, el huevo va sufriendo modificaciones que minimizan la acción de sus barreras naturales de protección. Así, la cutícula superficial que reviste la cáscara tiende a desaparecer. Al cabo de 2-3 semanas disminuye la acción bactericida y bacteriostática de la lisozima. El pH de la albúmina desciende con el tiempo y se va acercando a la neutralidad, circunstancia favorable al crecimiento microbiano. Según va envejeciendo, el huevo pierde gas carbónico y agua espontáneamente por sus poros. Con la pérdida de gas carbónico, se produce una alcalinización de la clara, que tiende a homogeneizarse y hacerse más fluida. La evaporación del agua da lugar a un aumento de la cámara de aire en el extremo ancho del huevo. Aproximadamente 10 días después de la puesta, la yema, debido a su poca densidad por su riqueza en materia grasa, tiende a elevarse de tal forma que, si el huevo está en posición horizontal, contactará directamente con las membranas de la cáscara y su contaminación será inmediata, al no existir protección de la clara; por el contrario, los huevos que se conservan con el extremo estrecho hacia abajo tienen la yema protegida por la cámara de aire, que la mantiene alejada de la cáscara. Los microorganismos del huevo son variados. En la cáscara se encuentran numerosos gérmenes procedentes de la cloaca o del medio exterior. La incidencia de Salmonella es alta, ya que son muy frecuentes las aves portadoras sanas. En las granjas son portadoras sanas el 5-30 por 100 de las gallinas. En cuanto a serotipos, las Salmonella pullorum-gallinarum tienen una importancia mínima en higiene alimentaria, ya que poseen débil poder patógeno para el hombre y actúan únicamente a dosis altísimas. Hace años que han aparecido nuevos serotipos a través de aves portadoras y que suponen un riesgo para la salud humana: S. typhimurium, S. enteritidis, S. bareilly, S. virchow, S. thomson, principalmente. En los huevos de gallina, la contaminación por Salmonella es, sobre todo, a partir de la cáscara, sin rechazar en absoluto la posibilidad de la vía ovárica. En los huevos de pata, la vía ovárica es corriente, ya que la Salmonella se encuentra con frecuencia en el lodo de las charcas y se introduce en los animales por la cloaca para remontar el oviducto y contaminar directamente la yema. El 2,5 por 100 de las yemas de huevo de pata están contaminadas con Salmonella. La flora predominante en la cáscara es, al principio, grampositiva, aunque en las alteraciones del huevo la flora es gramnegativa. La flora del huevo es bastante constante y sus principales representantes pertenecen a los géneros: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Citrobacter y Aeromonas. Entre los mohos: Mucor, Cladosporium, Penicillium, Alternaría.
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Thamnidium y Sporotrichum. En huevos rotos predominan: Pseudomonas, Proteus, Escherichia y Alcaligenes. Las alteraciones bacterianas de los huevos se denominan, habitualmente, putrefacciones: — Putrefacción verde: Producida por Pseudomonas fluorescens. La clara adquiere color verde y la yema se disgrega y se mezcla con la clara. Con luz ultravioleta, el huevo emite fluorescencia. Olor a fruta. — Putrefacción incolora: Producida por Pseudomonas spp., Achromobactei; coliformes, etc. Se rompe la pared de la yema y se mezcla con la clara, que es acuosa. El olor depende del germen que haya intervenido en la alteración. A veces, es repelente. — Putrefacción negra: Producida por Proteus y ciertas Pseudomonas y Aeromonas. Es una alteración típica de huevos mantenidos a temperaturas elevadas. La clara se muestra acuosa y de color marrón; la yema está disgregada y ennegrecida. Puede haber fluorescencia verde si actúan Pseudomonas. Fuerte olor a ácido sulfhídrico. — Putrefacción roja: Producida por Serratia marcescens. Color rojo del interior del huevo. Sin olor. Las alteraciones de los huevos producidas por mohos son: — Manchas: Superficiales en el interior de la cáscara, debido a la entrada de micelios por los poros y su asentamiento entre cáscara y membranas. Amarillas, azules o verdes (Penicillium): negras o marrones Cladosporium); rosas (Sporotrichum). — Putrefacción: Clara gelatinosa que muestra el color típico de la especie responsable: La membrana de la yema se rompe y se mezcla con la clara. — Olores: Variados, por ejemplo, a tierra (Streptomyces). Respecto a ovoproductos, aunque el contenido de los huevos frescos recién puestos suele ser estéril, los productos comercializados a base de huevos (líquidos, congelados o en polvo) están microbiológicamente muy contaminados. Existe la evidencia de que, por utilizarse huevos que no se venden en el comercio (de pequeño tamaño, rotos, con manchas, sucios, malformados, etc.), los huevos líquidos están contaminados frecuentemente con Salmonella de aquí la necesidad de pasteurizar estos productos. Dada la posibilidad de infección por muy variados serotipos de Salmonella en los huevos líquidos completos, se requiere que este producto sea calentado, al menos durante 3 minutos, a 60 °C. En un sentido amplio, para disminuir la contaminación de los ovoproductos es necesario mejorar extraordinariamente la higiene de la producción y las manipulaciones. Es una buena práctica el lavado desinfectante de los huevos antes de ser cascados. En cuanto a huevos congelados, la congelación mata algunas bacterias que han podido sobrevivir a la pasteurización. La flora más frecuente está integrada por especies del género Bacillus, Alcaligenes y Proteus. En el huevo en polvo, aunque no hay flora termosensible y la población total se ha reducido considerablemente, persiste, sobre todo, flora esporulada o sus esporos (Bacillus).
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DEFINICIONES Huevos Con la denominación genérica de huevos se entiende, única y exclusivamente, el procedente de gallina (Gallus domesticus). Los huevos de otras aves se designarán indicando, además, la especie de la que proceden. (Decreto 408/1975, de 7 de marzo; B.O.E. 12-3-75.) Huevos frescos Se consideran huevos frescos los que se presentan en su estado natural, sin haber sido limpiados por ningún procedimiento ni haber sufrido tratamientos de conservación o refrigeración. (Decreto 408/1975, de 7 de marzo; B.O.E. 12-3- 75.) Huevos refrigerados Se denominan así los huevos con cáscara, frescos, que se han sometido a un proceso de refrigeración en cámaras frigoríficas o en locales con temperaturas controladas que oscilan de 0 a 2 °C, durante un periodo máximo de 30 días. (Decreto 408/1975, de 7 de marzo; B.O.E. 12-3-75.) Huevos conservados Se denominan así los huevos en cáscara sometidos a un proceso tecnológico de conservación por un periodo superior a 30 días: — Conservación por el frío: Son los huevos refrigerados mantenidos a las temperaturas ya citadas, por periodos superiores a los 30 días e inferiores a 6 meses. — Consecución por otros procedimientos: Son los huevos sometidos a otros procedimientos de conservación, distintos del frío que se autoricen. (Decreto 408/1975, de 7 de marzo; B.O.E. 12-3-75.) Ovoproductos Son los productos constituidos, esencialmente, por huevos o partes de los mismos desprovistos de cáscara y destinados a servir de materia prima para la elaboración de otros productos alimenticios. Se clasifican en: Líquidos: Constituidos por el contenido entero del huevo o por la clara separada de la yema, o por ésta aislada. Secos: Son los productos derivados de los huevos obtenidos por deshidratación o desecación de un derivado líquido. Compuestos: Son los obtenidos a partir de un derivado líquido o seco, mezclado con otras sustancias nutritivas para obtener un producto final cuyo contenido
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mínimo en huevo sea del 50 por 100. (Decreto 408/1975 de 7 de marzo; B.O.E. 12-3-75.) PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE HUEVOS Y DERIVADOS Para el control normal de estos productos, desde el punto de vista microbiológico, se requieren los siguientes recuentos e investigaciones: — — — — —
Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C). Recuento de mohos y levaduras. Investigación y recuento de coliformes. Investigación y recuento de Escherichia coli. Investigación de Salmonella.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Las muestras de productos frescos sin cáscara se deben analizar muy rápidamente. Si el transporte al laboratorio excede de 20 minutos, es aconsejable congelar la muestra. Huevos con cáscara Provistos de guantes, lavar y cepillar suavemente los huevos con agua jabonosa. Aclarar con agua limpia y sumergirlos en baño de alcohol de 70 °C durante 10 minutos. Con guantes estériles, sacar los huevos del alcohol y secarlos con papel de filtro estéril. Extraer el huevo rompiendo la cáscara con material estéril. Si es necesario separar clara y yema, usar un separador o cuchara estériles. Huevo líquido Después de agitar bien la muestra, se homogeneiza y se toma la cantidad necesaria para el análisis, asépticamente y con material estéril. Huevo congelado Se deja descongelar la muestra en refrigeración durante no más de 18 horas y se toma la cantidad necesaria para el análisis, asépticamente y con material estéril. Huevo en polvo Homogeneizar la muestra asépticamente y tomar la cantidad necesaria para el análisis, asépticamente y con material estéril.
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ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Recuento de mohos y levaduras (v. cap. 16) Investigación y recuento de coliformes (v. cap. 4) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella (v. cap. 7)
CRITERIOS MICROBIOLOGICOS PARA HUEVOS Y DERIVADOS Existen Normas Microbiológicas aplicadas a ovoproductos (Decreto 408/1975, de 7 de marzo; B.O.E. 12-3-75.) Ovoproducto constituido por huevo entero pasteurizado, refrigerado o congelado Recuento total de aerobios Recuento total de mohos y levaduras Coliformes E. coli Salmonella Otros patógenos
Menos de 1 x 105Vg Menos de 1,5 x 103g Máximo 1 x 10/g Ausencia/g Ausencia/25 g Ausencia
Ovoproducto constituido por yema pasteurizada, refrigerada o congelada Recuento total de aerobios Recuento total de mohos y levaduras Coliformes £. coli Salmonella Otros patógenos
Menos de 1 x 105/g Menos de 1,5 x l03g Máximo 1 x 10/g Ausencia/g Ausencia/25 g Ausencia
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Ovoproducto constituido por clara pasteurizada, refrigerada o congelada Menos de 1 x l05g Menos de 1,5 x l03g Máximo 1 x 10/g Ausencia/g Ausencia/25 g Ausencia
Recuento total de aerobios Recuento total de mohos y levaduras Coliformes E. coli Salmonella Otros patógenos
Ovoproductos secos 1 Recuento total aerobios Recuento mohos y levaduras Coliformes E. coli Salmonella Otros patógenos 1 = Huevo entero desecado. 2 = Yema desecada. 3 = Clara desecada.
1 x 105/g 1 x 10/g 1 x 10/g Aus./g Aus./25 g Ausencia
2
3 5
1 x 10 /g 3xl0 2 /g 1 x 10/g Aus./g Aus./25 g Ausencia
1 x 105g 1 x 10/g 1 x 10/g Aus./g Aus./25 g Ausencia
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Leche y derivados («Leche y derivados». Capítulo XV del Código Alimentario Español)
La leche es una secreción natural de la glándula mamaria de los animales mamíferos. Se trata de un alimento completo procedente del ordeño de los animales domésticos. La denominación de leche, sin indicación de la especie, se refiere a la leche de vaca. Cuando se trata de leche perteneciente a otras especies domésticas, se exige el nombre de la especie (leche de oveja, leche de cabra). Se define a la leche como: «El producto integro, no alterado ni adulterado y sin calostros del ordeño higiénico, regular, completo e ininterrumpido de vacas sanas y bien alimentadas». Por su composición es un alimento de elección. La composición media de la leche de vaca es la siguiente: Agua: Proteínas: Lípidos: Glúcidos: Sales minerales: Vitaminas hidrosolubles: Vitaminas liposolubles:
87 por 100 3,5 por 100 (caseína 2,7 por 100) 3,5-4,0 por 100 5,1 por 100 (lactosa 4,9 por 100) 0,7 por 100 (sodio, potasio, calcio, hierro, magnesio, fósforo, cloruros, ácido cítrico) (Vitaminas C, B1, B2 B6, B12 niacina, ácido pantoténico, ácido fólico, biotina, colina, inositol) (Vitaminas A, D, E y K)
Contiene también enzimas: lactenina, lactoperoxidasa, catalasa, reductasa, lipasa, fosfatasa, proteasa, amilasa y lisozima. La lactenina, lactoperoxidasa y lisozima tienen actividad inhibidora. Su pH está comprendido entre 6,5 y 6,7. La composición de la leche varia de acuerdo con distintos factores como: alimentación, raza, estación del año, etc. Precisamente por su composición, la leche es un medio excelente para el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos; composición y pH permiten el desarrollo de bacterias, mohos y levaduras. El desarrollo microbiano en la leche origina una serie de modificaciones químicas que pueden dar lugar a: 281
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— Procesos alterativos. — Procesos útiles para la elaboración de otros productos (queso, yogur). La leche constituye un producto altamente perecedero que, además, puede ser vehículo de bacterias patógenas para el hombre (Mycobacterium tuberculosis, Brucella, Salmonella, Escherichia coli enteropatógeno, Listeria monocytogenes y otras). Con el fin de destruir esta flora, la leche se somete a un tratamiento térmico de pasteurización (62 °C durante 30 minutos: pasteurización baja; 72 °C durante 15 segundos: pasteurización alta). También pueden estar presentes en la leche micotoxinas, procedentes de vacas que han consumido alimentos contaminados (aflatoxina M, segregada por Aspergillus flavus) o del desarrollo directo de mohos (Penicillium cyclopium viridicatum o stoloniferum) en la leche en polvo. La leche, aunque proceda de vacas sanas y se haya obtenido en las mejores condiciones de higiene, resulta siempre contaminada en mayor o menor grado, considerando como carga mínima de un ordeño completo la tasa de 100 a 500 gérmenes por mililitro. En general, las primeras porciones extraídas son siempre las más contaminadas por su proximidad al pezón y pueden superar 103 gérmenes por mililitro; las últimas porciones pueden resultar, incluso, estériles. Se trata, normalmente, de gérmenes saprofitos del pezón y de los canales galactóforos. También puede haber otros microorganismos de animales enfermos, patógenos y peligrosos desde el punto de vista sanitario. Los procedentes del pezón, aunque no representan un riesgo, se pueden desarrollar abundantemente en la leche; los patógenos pueden ser causa de enfermedad o de toxiinfección alimentaria. Después del ordeño, la leche se contamina, más o menos, por distintas causas, de las que forman parte: — El animal (escamas de la piel, pelos, suciedad, pezón, rabo, etc.). — El ambiente (contaminación del aire, polvo, suelo, lecho). — El sistema de ordeño (manos del ordeñador, ordeño mecánico poco higiénico). — Los recipientes de recogida (material sucio o mal lavado). — Los vectores (insectos, particularmente). Posteriormente al ordeño, y durante la conservación, el contenido microbiano de la leche sufre ciertas variaciones: — En la primera hora que sigue al ordeño, se produce una disminución de la flora, debido a la acción de las sustancias inhibidoras de la leche (lactenina, lactoperoxidasa y lisozima), en especial una reducción de bacterias lácticas. — En una siguiente fase, se produce un incremento de microorganismos, según la temperatura de conservación de la leche. Si no se frena este crecimiento, se producen una serie de modificaciones fisicoquímicas en el producto. — Se inicia a continuación una fase de acidificación, consecuencia de la fermentación de la lactosa para formar ácido láctico; el pH desciende a 4,5-4. La acidificación es más o menos rápida, según la especie microbiana que la origina y de las condiciones ambientales, principalmente la temperatura. El
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ácido láctico se combina con el calcio presente en la molécula de caseína y tiene lugar la coagulación. El aumento de acidez inactiva la acción de los fermentos lácticos, circunstancia que aprovechan los mohos (Geotricum, Penicillium, etc.) y otros gérmenes acidófilos para su desarrollo, pudiendo crecer entonces otras especies microbianas, aerobias y anaerobios, determinando un proceso de putrefacción que transforma la leche y hace variar sus caracteres organolépticos (olor, color, sabor). La flora que logra desarrollarse abundantemente da lugar a modificaciones en la leche: — Agriado y acidificación con coagulo: Ya se ha mencionado el proceso de acidificación y coagulación de la leche. Los gérmenes responsables son de tipo homo y heteroláctico. Entre los 10-37 °C, los gérmenes que intervienen son: Streptococcus lactis asociado, a veces, con coliformes, enterococos, micrococos y lactobacilos. Por encima de 37 °C intervienen Streptococcus thermophilus, Streptococcus faecalis y Lactobacillus bulgaricus. En la leche pasteurizada intervienen gérmenes termófilos que han resistido la acción del calor o gérmenes esporulados (Bacillus, Clostridium). Si intervienen heterofermentativos, hay desprendimiento de gas. — Proteolisis: Esta alteración está favorecida por el almacenamiento prolongado de la leche a baja temperatura. La proteolisis se manifiesta por su olor y una ligera alcalinización. La flora incriminada pertenece a los géneros: Micrococcus, Alcaligenes, Pseudomonas, Bacillus y Clostridium. Se puede producir una acidificación del coágulo y su digestión. — Leche filante: Esta alteración también se puede producir por causas no bacterianas (exceso de crema, coagulación de la lactoalbúmina por calentamiento), por acción microbiana indirecta (paso de leucocitos y fibrina a la leche como consecuencia de una mastitis) y por acción microbiana directa. Se manifiesta por aumento de viscosidad que hace a la leche filante. La originan, en el caso de acción microbiana directa: Alcaligenes viscosas, Micrococcus freudenreichii, Micrococcus mucofaciens, algunas cepas de Aerohacter aerogenes, Streptococcus lactis, Lactobacillus spp., Leuconostoc spp. — Coloraciones: • Amarilla (Pseudomonas synxanta. Flavobacterium spp. y Xantomonas). • Azulada (Pseudomonas syncyanea, Pseudomonas aeruginosa). • Roja (Serrana marcescens, Brevibacterium erythrogcnes, Pseudomonas spp.). • Violeta (Chromobacterium violaceum). — Modificaciones del sabor o el olor: En parte se deben al tipo de alimenta ción del animal y, en parte, a la contaminación de la leche: • Olor a fruta (Pseudomonas fragi, Flavobacterium lactis, Bacillus estenificans da olor a pina).
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• Olor a rancio: Crecimiento de gérmenes lipolíticos {Pseudomonas, Bacillus cereus). • Olor y sabor a pescado: Debido a la formación de trimetilamina en la leche {Pseudomonas, Torulopsis amara). • Olor y sabor a caseína (Micrococcus caseolyticus). • Sabor amargo {Bacillus liquefacíais Iactis amari, Micrococcus caseiamar i, Torulopsis amara). • Olor a urea y amoniaco {Pseudomonas flúorescens, Alcaligenes faecalis). • Sabor a caramelo {Streptococcus Iactis var. maltigenes). • Sabor a jabón {Bacillus Iactis saponacei, Pseudomonas putida). DEFINICIONES Leche natural Se entiende por leche natural el producto integro, no alterado ni adulterado y sin calostros del ordeño higiénico, regular, completo e ininterrumpido de vacas sanas y bien alimentadas. (Decreto 2478/1966, de 6 de octubre; B.O.E. 7-10-66.) Leche certificada Es la procedente de ganaderías diplomadas y/o de sanidad comprobada, registradas en el Ministerio de Agricultura, en las que los procesos de producción, obtención, envasado y distribución están sometidos a un riguroso control sanitario uficial, que garantiza la inocuidad y valor nutritivo. (Decreto 2478/1966, de 6 de octubre; B.O.E. 7-10-66.) Leche pasteurizada Se entiende por leche pasteurizada la leche natural, entera, desnatada o semidesnatada, sometida a un proceso tecnológico adecuado que asegure la destrucción de los gérmenes patógenos y la casi totalidad de la flora banal, sin modificación sensible de su naturaleza físico-química, características biológicas y cualidades nutritivas. (Orden de 11 de febrero de 1987; B.O.E. 20-287.) Leche concentrada Se entiende por leche concentrada la leche natural, entera, desnatada o semidesnatada, pasteurizada y privada de parte de su agua de constitución. (Orden de 11 de febrero de 1987; B.O.E. 20-2-87.) Leche esterilizada Se entiende por leche esterilizada la leche natural, entera, desnatada o semidesnatada, sometida después de su envasado a un proceso de calentamiento en
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condiciones tales de temperatura y tiempo que aseguren la destrucción de los microorganismos y la inactividad de sus formas de resistencia. (Orden de 11 de febrero de 1987; B.O.E. 20-2-87.) Leche UHT Se entiende por leche UHT la leche natural, entera, desnatada o semidesnatada, sometida a un proceso de calentamiento en condiciones tales de temperatura y tiempo que aseguren la destrucción de los microorganismos y la inactividad de sus formas de resistencia, y envasada posteriormente en condiciones asépticas. (Orden de 11 de febrero de 1987; B.O.E. 20-2-87.) Leche evaporada Se entiende por leche evaporada la sometida, en el mismo envase en que se suministra al consumidor, a tratamiento térmico que asegure la destrucción de los gérmenes y la inactividad de sus formas de resistencia. (Orden de 7 de octubre de 1983; B.O.E. 31-10-83.) Leche en polvo Se entiende por leche en polvo el producto seco y pulverulento que se obtiene mediante la deshidratación de la leche natural, entera o total o parcialmente desnatada, sometida a un tratamiento térmico equivalente, al menos, a la pasteurización, y realizado en estado líquido antes o durante el proceso de fabricación. (Orden de 11 de febrero de 1987; B.O.E. 20-2-87.) Yogur Se entiende por «yogur» o «yoghourt», el producto de leche coagulada obtenido por fermentación láctica mediante la acción de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus, a partir de leche pasteurizada, leche concentrada pasteurizada, leche total o parcialmente desnatada pasteurizada, leche concentrada total o parcialmente desnatada, con o sin adición de nata pasteurizada, leche en polvo entera, semidesnatada o desnatada, suero en polvo, proteínas de leche y/u otros productos procedentes del fraccionamiento de la leche. Los microorganismos productores de la fermentación láctica deben ser viables y estar presentes en el producto terminado en cantidad minina de 1 x 107 colonias por gramo o mililitro. Todos los yogures deben tener un pH igual o inferior a 4,6. (Real Decreto 874/1987, de 30 de abril de 1987; B.O.E. 3-7-87.) Nata Se entiende por nata, en general, al producto lácteo rico en materia grasa separado de la leche, que toma la forma de una emulsión del tipo grasa en agua. (Orden 12 de julio de 1983; B.O.E. 20-7-83.)
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Nata en polvo Se entiende por nata en polvo el producto seco y pulverulento que se obtiene mediante la deshidratación de la nata, pasteurizada en estado líquido, antes o durante el proceso de fabricación. (Orden de 12 de julio de 1983; B.O.E. 20-7-83.) Mantequilla Es el producto graso obtenido exclusivamente de leche o nata de vaca, higienizadas. (Orden de 7 de enero de 1975; B.O.E. 5-3-75.) Mantequilla de suero Es el producto graso obtenido del suero higienizado que no contenga ninguna otra grasa más que la leche de vaca. (Orden de 7 de enero de 1975; B.O.E. 5-3-75.) Queso Se entiende por queso el producto fresco o maduro, sólido o semisólido, obtenido por separación del suero después de la coagulación de la leche natural, de la desnatada total o parcialmente, de la nata, del suero de mantequilla o de una mezcla de algunos o de todos estos productos por la acción del cuajo u otros coagulantes apropiados, con o sin hidrólisis previa de la lactosa. Asimismo, se entiende por queso el conseguido mediante técnicas de elaboración que comprendan la coagulación de la leche y/o de materias obtenidas de la leche y que den un producto final que posea las mismas características del producto definido en el párrafo anterior y siempre que la relación entre la caseína y las proteínas séricas sea igual o superior a la de la leche. (Orden de 29 de noviembre de 1985; B.O.E. 6-12-85.) Queso curado o madurado Es el que, tras el proceso de fabricación, requiere mantenerse durante cierto tiempo a una temperatura y en condiciones tales que se produzcan los cambios físicos y/o químicos necesarios y característicos del mismo. (Orden de 29 de noviembre de 1985; B.O.E. 6-12-85.) Queso curado o madurado con mohos Es aquel en el que el curado se ha producido principalmente como consecuencia del desarrollo característico de mohos en su interior y/o sobre la superficie del mismo. (Orden de 29 de noviembre de 1985; B.O.E. 6-12-85.)
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Queso fresco Es el que está dispuesto para el consumo al finalizar el proceso de fabricación. (Orden de 29 de noviembre de 1985; B.O.E. 6-12-85.) Queso blando pasteurizado Es aquel queso fresco en el que el coágulo obtenido se somete a un proceso de pasteurización de 72 °C durante 16 segundos u otras combinaciones de temperatura y tiempo de efecto equivalente, quedando dispuesto para el consumo al finalizar el proceso de fabricación. (Orden de 29 de noviembre de 1985; B.O.E. 6-12-85.) Queso fundido Se entiende por queso fundido el producto obtenido por molturación y/o mezcla, fusión y emulsión con tratamiento térmico de una o más variedades de queso con o sin adición de agentes emulgentes, de leche y productos lácteos y otros productos alimenticios. (Orden de 29 de noviembre de 1985 B.O.E. 6-12- 85.) Cuajada Se entiende por cuajada el producto semisólido obtenido de la leche sometida a tratamiento térmico adecuado para conseguir las características bacteriológicas que se fijan posteriormente, entera o desnatada total o parcialmente, coagulada por la acción del cuajo y otras enzimas coagulantes autorizadas, sin adición de fermentos lácticos y sin proceso de desuerado. (Orden de 14 de junio de 1983; B.O.E. 28-6-83.) Enzimas coagulantes Enzimas coagulantes de leche son las de origen animal, vegetal o microbiano y sus mezclas capaces de provocar el desdoblamiento de la molécula de caseína, bajo las condiciones tecnológicas habituales en el proceso al que van destinadas. Se clasifican en: Cuajo Es el producto líquido, pastoso o sólido, cuyo componente activo está constituido por la mezcla de las enzimas obtenidas por extracción de los cuajares de rumiantes exclusivamente. Coagulante de leche Es el producto líquido, pastoso o sólido, cuyo componente activo está constituido por otra(s) enzima(s) diferente(s) de las incluidas en el apartado anterior. (Orden de 14 de enero de 1988; B.O.E. 20-1-88.)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE Y DERIVADOS En los distintos productos se hacen los siguientes recuentos o investigaciones: — Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± °C). — Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes). — Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales. — Investigación y recuento de Escherichia coli. — Investigación de Salmonella-Shigella. — Investigación y recuento de St. áureas enterotoxigénico. — Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores. — Recuento de mohos y levaduras. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Leche natural, leche certificada y leche pasteurizada Agitar la muestra en su envase durante unos 20 segundos. En todos los casos, abrir asépticamente y tomar la muestra asimismo con material estéril. Leche concentrada, leche esterilizada, leche UHT y leche evaporada Homogeneizar el contenido del envase invirtiéndolo varias veces. Limpiar y desinfectar la superficie con alcohol de 70 °C. Repetir la operación dos veces, cambiando de algodón. Si el envase es metálico, depositar, además, unas gotas de alcohol de 70 °C y flamear con cuidado, esperando a que se evapore. Abrir el envase asépticamente y con material estéril. Tomar la muestra y depositarla en matraz Erlenmeyer estéril. Leche condensada El examen microbiológico se practica sobre una dilución al 1/3 de leche condensada. La muestra se toma de la misma forma que en el apartado anterior. Leche en polvo y nata en polvo En un matraz Erlenmeyer estéril y tarado, se introducen 10 g de muestra tomada asépticamente. Añadir 90 mi de diluyente (agua de triptona o solución Ringer 1/4) estéril y precalentado a 47 °C. Homogeneizar. Colocar en baño María regulado a 47 °C, durante 5 minutos. Agitar moderadamente en agitador electromagnético unos 5 minutos. Volver a poner en baño María unos minutos y analizar.
LECHE Y DERIVADOS
289
Yogur y cuajada Antes del análisis, se fluidifica la muestra por agitación. Tomar la muestra en condiciones asépticas y utilizar como diluyente agua de triptona o solución de Ringer 1/4 atemperada a 40 °C. Nata Homogeneizar el contenido del envase por agitación. Abrir asépticamente. Tomar la muestra y diluirla al 1:10 con una solución estéril al 2 por 100 de fosfato dipotásico precalentado a 45-46 °C. Homogeneizar y poner en baño María regulado a 45-46 °C durante 5 minutos. Homogeneizar de nuevo y analizar. Fosfato dipotásico al 2 por 100 Composición: Fosfato dipotásico Agua destilada
20 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento suave. Ajustar el pH a 7,4 ± 0,2. Distribuir en matraces Erlenmeyer de 125 ml a razón de 90 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Mantequilla Con ayuda de una sonda estéril, cuchillo o cualquier otro material similar estéril, colocar trozos de mantequilla en un tubo de centrífuga estéril, habiendo eliminado aproximadamente 1 cm de la parte externa. Colocar la muestra en baño María regulado a 45 °C. Cuando la mantequilla esté fundida, centrifugar la muestra a 1.200-2.000 rpm. Desechar la materia grasa y aprovechar la fase acuosa para el análisis. Queso Operar sobre la totalidad del queso, sin quitar la corteza. Con sonda o cuchillo estériles, tomar porciones del queso e introducirlas en el triturador homogeneizador. Añadir el diluyente (fosfato dipotásico al 2 por 100) (v. pág. 289) precalentado a 45-46 °C. Triturar-homogeneizar. Cuajo y coagulante de la leche Tomar la muestra asépticamente con material estéril. Usar como diluyente agua de triptona o solución de Ringer 1/4.
290
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
A efectos del Real Decreto 1679/1994 de 22 de julio (B.O.E. 24-9-94) dentro de las definiciones, se entenderá por: Leche cruda, a la producida por la secreción de la glándula mamaria de vacas, ovejas, cabras y búfalas que no haya sido calentada a una temperatura superior a 40 °C ni sometida a un tratamiento de efecto equivalente, Leche destinada a la elaboración de productos lácteos, a la leche cruda destinada a transformación, la leche líquida o congelada, obtenida a partir de leche cruda, que haya sufrido o no algún tratamiento físico autorizado (como, por ejemplo, un tratamiento térmico o una termización) y cuya composición haya sido modificada o no, siempre y cuando las modificaciones se limiten a la adición y/o a la sustración de componentes naturales de la leche. Leche de consumo tratada térmicamente, a la leche de consumo destinada a la venta al consumidor final y a las colectividades, obtenida mediante tratamiento térmico y que se presente en las formas de leche pasteurizada, leche pasteurizada sometida a «alta pasteurización», leche esterilizada y leche UHT, o bien, la leche pasteurizada para su venta a granel a petición del consumidor individual. Productos lácteos, a los productos a base de leche, es decir, los derivados exclusivamente de la leche, teniendo en cuenta que se pueden añadir sustancias necesarias para su elaboración, siempre y cuando estas sustancias no se utilicen para sustituir, total o parcialmente, alguno de los componentes de la leche y los productos compuestos de leche, en los que la leche o un producto lácteo es la parte esencial, ya sea por su cantidad o por el efecto que caracteriza a dichos productos y en los que ningún elemento sustituye ni tiende a sustituir a ningún componente de la leche. Tratamiento térmico: cualquier tratamiento por calentamiento que, inmediatamente después de su aplicación, tenga como consecuencia una reacción negativa a la prueba de la fosfatasa. Termización: el calentamiento de la leche cruda durante 15 segundos como mínimo, a una temperatura comprendida entre 57 °C y 68 °C, de forma que la leche, después de dicho tratamiento, reaccione positivamente a la prueba de la fosfatasa. ANÁLISIS Las determinaciones siguientes son aplicables a los distintos productos que integran la leche y sus derivados. Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C (v. cap. 3) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) ( v. cap. 4) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales (v. cap. 6) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5)
291
LECHE Y DERIVADOS
Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores (v. cap. 9) Investigación y recuento de St. aureus enterotexigénico (v. cap. 10) Investigación y recuento de mohos y levaduras (v. cap. 16) Investigación de Listeria monocytogenes (v. cap. 20) CRITERIOS MICROBIOLOGICOS PARA PRODUCTOS LÁCTEOS Y LECHE DE CONSUMO Según Real Decreto 1679 / 1994 de 22 de julio (B.O.E. 24-9-94) se deben aplicar los siguientes criterios microbiológicos a los productos lácteos y a la leche de consumo. 1 A.
Criterios obligatorios: gérmenes patógenos. Productos lácteos al salir del establecimiento de transformación
Tipo de gérmenes
Productos
Listeria monocytogenes Quesos distintos de los de pasta dura Otros productos (a) Salmonella spp.
Todos, salvo la leche en polvo Leche en polvo
(a) (b)
Norma (ml,g) Ausencia 25 g(b) n = 5: c = 0 Ausencia en 1 g Ausencia 25 g (b) n = 5; c = 0 Ausencia 25 g (b) n= 10;c = 0
La búsqueda no será obligatoria para la leche conservada y los productos lácteos tratados térmica mente después y durante el envasado y el embalado. Los 25 gramos se obtendrán mediante 5 tomas de 5 gramos en la misma muestra y en puntos distintos.
Por otra parte, no contendrán ningún microorganismo patógeno ni sus toxinas en una cantidad que afecte a la salud de los consumidores. 2
Criterios analíticos: gérmenes testigos de falta de higiene
Tipo de gérmenes
Productos
Staphylococcus aureus Queso a base de leche cruda y a base de leche termizada.
Norma (ml, g) m= 1.000: M= 10.000 n =5 c =2
292
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
(Continuación) Tipo de gérmenes
Escherichia coli
Productos
Norma (ml, g)
Queso de pasta blanda (a base de leche tratada térmicamente).
m= 100 M= 1.000 n=5 c=2
Queso fresco.
m= 10
Leche en polvo Productos lácteos helados (incluidos los helados y las natas heladas)
M= 100 n=5 c=2
Queso a base de leche
m= 10.000
cruda y a base de leche termizada
M= 100.000 n=5 c=2
Queso de pasta blanda
m= 100
(a base de leche tratada térmicamente)
M= 1.000 n=5 c=2
La detección de cepas St. aureus enterotoxigénico o de cepas de E. coli patógenos, implicará la retirada del mercado de todos los lotes de que se trate. 3.
Gérmenes indicadores: líneas directrices
Tipo de gérmenes
Productos
Norma (mi, g)
Coliformes 30 °C
Productos lácteos líquidos
m=0 M=5 n=5 c=2
Mantequilla a base de leche
m=0
o nata pasteurizadas.
M= 10* n=5 c=2
Queso de pasta blanda a base de leche tratada térmicamente.
m = 10.000 M= 100.000 n=5 c=2
LECHE Y DERIVADOS
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(Continuación) Tipo de gérmenes
Contenido de gérmenes
Productos
Norma (mi, g)
Productos lácteos en polvo
m=0 M= 10 n=5 c=2
Productos lácteos helados
m= 10
(incluidos los helados y las natas heladas)
M= 100 n=5 c=2
Productos lácteos líquidos,
m = 50.000
tratados térmicamente y no fermentados (a)
M = 100.000 n=5 c=2
Productos lácteos helados (incluidos los helados y las natas heladas) (b)
m = 100.000 * M = 500.000 n=5 c=2
(a) Después de incubación a 6 °C durante 5 días (contenido de gérmenes a 21 °C) (b) Contenido de gérmenes a 30 °C * Cifras modificadas en Real Decreto 402 / 1996 (B.O.E. 8-4-96), que rectifican las establecidas en el Real Decreto 1679 /1994 (B.O.E. 24-9-94).
4.
Los productos lácteos esterilizados cumplirán, después de ser incubados a 30 °C durante 15 días, las siguientes normas: a) b)
B.
Contenido de gérmenes a 30 °C (por 0.1 ml): aproximadamente 10. Control organoléptico normal.
Criterios microbiológicos para la leche de consumo
1. La leche cruda de vaca destinada al consumo directo cumplirá, después de su envasado, las siguientes normas: a) b) c) (a)
Contenido de gérmenes a 30 °C (por ml): aproximadamente 50.000 (a) Staphylococcus aureus (por ml): m = 100; M = 500; n = 5; c = 2 Salmonella: ausencia en 25 ml. n = 5; c = 0 Media geométrica observada durante un periodo de 2 meses con dos muestras, por lo menos, al mes.
294
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
No estarán presentes microorganismos patógenos y sus toxinas en cantidades que afecten a la salud de los consumidores 2.
La leche pasteurizada cumplirá también, en los controles aleatorios realiza dos en el establecimiento de tratamiento, las normas microbiológicas si guientes: Gérmenes patógenos: ausencia en 25 g. m = 0; M = 0; n = 5, c = 0 Conformes (por mi): m = 0 ; M = 5 ; n = 5 ; c = l Después de incubación a 6 °C durante 5 días: Contenido de gérmenes a 21 °C (por mi): m = 5x 10 4 ;M = 5x 105; n = 5; c = 1 Se entenderá por:
n = número de unidades de que se compone la muestra; m = valor de umbral del número de bacterias; el resultado se considera satisfactorio si todas las unidades de que se compone la muestra tienen un número de bacterias igual o menos que m; M = valor límite del número de bacterias; el resultado se considerará no satisfactorio si una o varias unidades de las que componen la muestra tienen un número de bacterias igual o mayor que M; c = número de unidades de la muestra cuya cifra de bacterias podrá situarse entre m y M; la muestra seguirá considerándose aceptable si las demás unidades de que se compone tienen un número de bacterias menor o igual a m. 3.
La leche esterilizada y la leche UHT cumplirán en el momento de los con troles aleatorios efectuados en el establecimiento de tratamiento, las normas siguientes, después de incubación a 30 °C durante 15 días: a) Contenido de gérmenes a 30 °C (por 0.1 ml), aproximadamente 10. b) Control organoléptico normal.
Para aplicar la Norma se necesitan, para cada análisis, tres muestras (envases) del mismo lote. Muestra núm. 1. Sin incubar. — — — —
Estabilidad al alcohol (68 por 100 v/v en agua). Acidez titulable expresada en ácido láctico. Examen microscópico directo, previa coloración. Examen organoléptico (color, olor, aspecto).
Si la prueba de estabilidad al alcohol es satisfactoria (no se forman grumos), se realizan las otras pruebas. Muestra núm. 2. Incubación a 31 ± 1 °C durante 14 días. — Estabilidad al alcohol (68 por 100 v/v en agua). — Acidez titulable expresada en ácido láctico.
LECHE Y DERIVADOS
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— Recuento total de gérmenes viables. — Examen organoléptico (color, olor, aspecto). Muestra núm. 3. Incubación a 55 ± 1 °C durante 7 días. — — — —
Estabilidad al alcohol (68 por 100 v/v en agua). Acidez titulable expresada en ácido láctico. Recuento total de gérmenes viables. Examen organoléptico (color, olor, aspecto).
Exigencias: — Estabilidad al alcohol: satisfactoria en las tres muestras. — La diferencia entre la acidez titulable de la muestra no incubada (núm. 1) y cada una de las muestras incubadas (núm. 2 y núm. 3) no será superior a 0,02, expresada en gramos de ácido láctico por 100 mi de leche. — Los recuentos totales de gérmenes viables en cada una de las muestras incubadas (núm. 2 y núm. 3) no serán superiores a 1 x 102/ml. — Los caracteres organolépticos de todas las muestras serán normales sin que exista coagulación ni proteólisis. En las muestras incubadas, el olor y sabor serán característicos de una leche esterilizada sometida a un largo periodo de incubación. Leche evaporada Existe Norma Microbiologica aplicable a la leche evaporada, por Orden de 7 de octubre de 1983 (B.O.E. 11-10-83), donde se aprueba la Norma General de Calidad para la Leche Evaporada destinada al mercado interior. — Ausencia de microorganismos que crezcan y se multipliquen, previas las pruebas de preincubación durante 28 días a 30 + 1 °C y 10 días a 44 °C, por mililitro de producto reconstituido. — Flora esporulada antes de incubación: máximo 10 esporos de Bacillaceae termoestables, no patógenos e incapaces de producir alteración por mililitro de producto reconstituido. Leche condensada Existe Norma Microbiológica aplicable a la leche condensada, por Orden de 11 de febrero de 1987 (B.O.E. 20-2-87), por la que se modifica la Norma General de Calidad de la Leche Condensada. Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 + 1 °C) Enterobacteriaceae totales St. aureus enterotoxigénico Fosfatasa
1 x 104g Ausencia/g Ausencia/g Negativa
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Leche en polvo Existe Norma Microbiológica aplicable a la leche en polvo, por Orden de 11 de febrero de 1987 (B.O.E. 20-2-87), por la que se modifica la Norma General de Calidad para la Leche en Polvo. Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 + 1 °C) Enterobacteriaceae lactosa positivas (coliformes) Salmonella-Shigella St. aureus enterotoxigénico Fosfatasa
Máximo 1 x 107g Máximo 1 x 1 0 col./g Ausencia/25 g Máximo 1 x 1 0 col./g Negativa
Yogur Existe Norma Microbiológica aplicable al yogur por Real Decreto 874/1987 de 30 de abril (B.O.E. 3-7-87), por el que se deroga el Real Decreto 705/1976 de 5 de marzo y se aprueba la Norma de Yogur, Yogur azucarado, Yogur edulcorado, Yogur con frutas, con zumos o con otros productos naturales y Yogur aromatizado. Como norma general, se tomarán 5 unidades del mismo lote por muestra. Cada unidad estará constituida por un envase original e íntegro. Excepcionalmente, en el supuesto de que no fuese posible tomar el número de muestras indicado en el párrafo anterior por falta de cantidad suficiente de un mismo lote, se tomará una unidad. El transporte y conservación de las muestras se hará a temperatura inferior a 10 °C. El análisis deberá ser iniciado antes de la fecha de caducidad. La porción de muestra que se tome para el análisis deberá ser representativa del conjunto de su respectiva unidad. Tolerancias microbiológicas para yogur natural, yogur azucarado, yogur edulcorado y yogur aromatizado
Enterobacteriaceae lactosa positivas colonias/g Escherichia coli colonias/g Salmonella-Shigella en 25 g
n
c
5 5 5
2 2 0
m
M 1
1 x 10
1 xl02 1 1x 101
Tolerancias microbiológicas para yogur con fruta, zumos y/u otros productos naturales n Enterobacteriaceae lactosa positivas colonias/g Escherichia coli colonias/g SalmonellaShigella en 25 g
5 5 5
c 2 2 0
m 5x 10 5 0
M 1
5xl0 2 5x101 -
LECHE Y DERIVADOS
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n: Número de unidades de muestra de un lote que se analiza según el programa de muestreo establecido. c: Numero de muestras que pueden rebasar el limite m, sin ser superior al limite M m: Limite microbiológico que únicamente c de las n muestras pueden sobrepasar; se admite para este nivel una variabilidad de 3 m para medio sólido y 10 m para medio líquido. M: Nivel limite de aceptabilidad. Los valores superiores a M no son satisfactorios. Los valores M se fijan: M = 10 m para medios sólidos. M = 30 m para medios líquidos.
Cuando se toma una sola muestra por falta de cantidad suficiente del mismo lote o por otra causa relacionada siempre con falta de otras unidades las tolerancias son las siguientes: Yogur sin fruta Yogur con fruta, etc. Entewhacteriaceae lactosa positivas colonias/g Escherichia coli colonias/g Salmonella-Shigella en 25 g
1 x 102 1 x 101 0
5x 102 5x 101 0
Estos valores son válidos para determinaciones en medios sólidos. Debido a la variabilidad de los resultados en medios líquidos, las tolerancias serán tres veces superiores.
Nata y nata en polvo Existe Norma Microbiológica aplicable a la nata y a la nata en polvo por Orden de 12 de julio de 1983 (B.O.E. 20-7-83), por la que se aprueban las Normas Generales de Calidad para la Nata y Nata en Polvo con destino al mercado interior. La Norma Microbiológica es la misma para ambos productos: Recuento de colonias aerobias Enterobacteriaceae totales mesófilas (31 ± 1 °C) Escherichia coli Salmonella-Shigella St. aureus enterotoxigénico Otros patógenos Fosfatasa
Máximo 1 x 105/g Máximo 1 x l01/g Ausencia/g Ausencia/25 g Máximo 1 x l01/g Ausencia Negativa
Mantequilla Existe Norma Microbiológica para la mantequilla, de la que es necesaria nueva revisión, por Orden de 7 de enero de 1975 (B.O.E. 5-3-75), por la que se aprueba la Norma para la Mantequilla destinada al mercado nacional.
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
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— Ausencia total de gérmenes patógenos. — Ausencia de gérmenes coliformes en 0,1 g. — Ausencia de E. coli en 0.1 g. — Recuento de mohos: Máximo 10/g. — Recuento de levaduras: Máximo 100/g. — Microorganismos lipolíticos: Máximo 10/g. — Fosfatasa: Negativa.
Quesos frescos y blancos pasteurizados Existe Norma Microbiológica para quesos frescos y blancos pasteurizados, por Orden de 29 de noviembre de 1985 (B.O.E. 6-12-85), por la que se aprueban las Normas de Calidad para Quesos y Quesos fundidos destinados al mercado interior. Como norma general, se tomarán 5 unidades del mismo lote. Cada unidad estará constituida por un envase original e integro cuando su contenido sea inferior a un kilogramo, y por porciones de 300 g aproximadamente, recogidas con utensilios estériles, en recipientes asimismo estériles, para piezas con un contenido neto igual o superior a un kilogramo. Excepcionalmente, en el supuesto de que no fuese posible tomar el número de muestras indicado en el párrafo anterior, por falta de cantidad suficiente del mismo lote, se tomará una unidad como muestra. El análisis deberá estar iniciado antes de la fecha de caducidad del producto o, en su caso, de la de consumo preferente del mismo. La porción de la muestra que se tome para el análisis deberá ser representativa del conjunto de su respectiva unidad. Las tolerancias para quesos frescos y blancos pasteurizados son: n Enterobacteriaceae totales/g Escherichia colilg Salmonella-Shigella en 25 g St. aureus enterotoxigénico/g
5 5 5 5
c 2 2 0 1
m
M 1
1 x 10 1 x 102 0 1 x 102
1 x 104 1 x 103 0 1x103
n: Número de unidades de muestra de un lote que se analizan según el programa de muestreo establecido. c: Número de muestras que pueden rebasar el limite DI sin ser superior al limite M m: Límite microbiológico que únicamente c de las n muestras puede sobrepasar Se admite para este nivel una variabilidad: M: Nivel limite de aceptabilidad Los valores superiores a M no son aceptables. Los valores de M se fijan en: M = 10 m para medios sólidos. M = 30 m para medios líquidos.
299
LECHE Y DERIVADOS
Para las muestras de las que sólo existe una unidad, las tolerancias son: 1 x 104 1 x 103 Ausencia 1 x 103
Enterobacteriaceae totales/g E colilg Salmonella-Shigellal25g St. aureus enterotoxigénico/g
Quesos fundidos Como norma general, se tomarán 5 unidades del mismo lote. Cada unidad estará constituida por un envase original e integro. Excepcionalmente, en el supuesto de que no fuera posible tomar el número de muestras indicado en el párrafo anterior, por falta de cantidad suficiente de un mismo lote, se tomará una unidad como muestra. El análisis deberá estar iniciado antes de su fecha de consumo preferente. La porción de la muestra que se tome para la práctica del análisis deberá ser representativa del conjunto de su respectiva unidad. Las tolerancias para quesos fundidos son: n Entewhacteriaceae totales/g E. coli/g Sulmonella-Shigella/25 g St. aitreus enterotoxigénico/g
5 5 5 5
c 2 1 0 2
m
M 2
1 x 10 1 0 1
1 x 103 1 x 101 _
1 x 101
La Norma Microbiológica para quesos fundidos rallados, quesos fundidos en polvo y quesos fundidos con los ingredientes sacarosa, dextrosa y glucosa: n Enterobacteriaceae totales/g E. coli/g Salmonella-Shigella/25 g St. aureus enterotoxigénico/g
5 5 5 5
c 2 2 0 1
m
M 2
1 x 10 1 x 103 1 1 x 10 1 x 102 _ 0 3 1 x 10 1 x 103
n: Número de unidades de muestra de un lote que se analiza según el programa de muestreo establecido. c: Número de muestras que pueden rebasar el limite m sin ser superior al limite M. m: Límite microbiológico que únicamente c de las n muestras puede sobrepasar Se admite para este nivel una variabilidad: 3 m para medio sólido. 10 m para medio líquido. M: Nivel limite de aceptabilidad. Los valores superiores a M no son aceptables. Los valores de M se fijan en: M = 10 m para medios sólidos. M = 30 m para medios líquidos.
300
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Cuando existe una sola muestra para el análisis, las tolerancias son las siguientes: Enterobacteriaceae totales/g E. coli/g Salmonella-Shigellal25 g St. aureus enterotoxigénico/g
1
2
1 x 103 1 x 101 Ausencia 1 x 101
1 x 103 1 x 102 Ausencia 1 x 103
1 = Queso fundido. 2 = Quesos fundidos rallados, quesos fundidos en polvo, etc.
Clorhidrato de lisozima Existe Norma Microbiológica para el clorhidrato de lisozima, por Orden de 3 de mayo de 1988 (B.O.E. 13-5-88), por la que se modifican las listas positivas de aditivos autorizados en Quesos y Quesos fundidos, añadiendo este producto a la citada lista. Recuento de gérmenes totales Salmonella Coliformes St. aureus Ps. aeruginosa Clostridium sulfito-reductores
Máximo 5 x 104 col./g Ausencia/25 g Máximo 30 col./g Ausencia/g Ausencia/g Ausencia/g
Cuajada Existe Norma Microbiológica para la cuajada, por Orden de 14 de junio de 1983, por la que se aprueba la Norma de Calidad para la Cuajada en el mercado interior. Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 + 1 °C) Enterobacteriaceae E. coli Salmonella St. aureus
1 x 105 col./g Máximo 1 x 102 col./g Máximo 1 x 1 0 1 col./g Ausencia/25 g 1 x 102 col./g
Cuajo y enzimas coagulantes Existe Norma Microbiológica para el cuajo y enzimas coagulantes, por Orden de 14 de enero de 1988 (B.O.E. 20-1-88), por la que se aprueba la Norma General de identidad y pureza para el cuajo y otras enzimas coagulantes de leche destinados al mercado interior.
LECHE Y DERIVADOS
Recuento total de aerobios mesófilos (31 ± 1 °C) E. coli Salmonella-Shigella St. aureus enterotoxigénico Clostridium sulfito-reductores Mohos y levaduras
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Máximo 10/g o ml Máximo 1/g o ml Ausencia en 25/g o ml Ausencia en 1/g o ml Máximo 1/g o ml Máximo 10/g o ml
DETERMINACIÓN DE LA FLORA ESPECIFICA DEL YOGUR: LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS Puesto que el yogur es un producto obtenido como consecuencia de la actividad de dos fermentos lácticos asociados: Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus, y estos microorganismos deben mantenerse viables en el producto en una tasa mínima de 107 gérmenes por gramo, es imprescindible investigar su presencia y número en el producto, ya que cuando ambos son adecuados, resultan incompatibles con la flora contaminante y patógena, al conferir al producto un pH bajo que supone una garantía sanitaria. Material — Pipetas estériles de 1 ml. — Placas de Petri estériles de 90 mm. Estufa de cultivo. — Cuentacolonias. Medio de cultivo diferencial para Lactobacillus bulgaricus-Streptococcus thermophilus (L-S Differential Médium) Medio basal Composición: Triptona Lab Lemco en polvo Peptona de soja Extrato de levadura Dextrosa Cloruro sódico Clorhidrato de L-Cisteína Agar Agua destilada
10 g 5g 5g 5g 20 g 5g 0,30 g 13 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 6,1 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
302
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Medio completo Al medio base (v. apartado anterior), atemperado a 50 °C, añadir, asépticamente, en el momento en que se vaya a utilizar al medio: — 100 ml de solución acuosa al 10 por 100 de leche desnatada en polvo libre de antibióticos, esterilizada en autoclave a 121 °C durante 5 minutos. — 10 ml de solución acuosa al 2 por 100 de cloruro-trifenil-tetrazolio esterilizada por filtración. Ambas soluciones se calentarán a 50 °C antes de ser añadidas al medio base. Mezclar bien. Este medio permite el crecimiento de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus; diferenciándose en: — La morfología de las colonias. — La reducción del cloruro de trifenil- tetrazolio. — La reacción de la caseína. Técnica — Preparar la «serie de diluciones decimales» (v. pág. 11), en la que se utilizará como diluyente agua de triptona (TW) (v. pág. 11). — Verter, por duplicado, 1 mi de cada una de las diluciones decimales (hasta la dilución -8, por ejemplo) en otras tantas placas de Petri estériles. — Añadir unos 15 mi de medio de cultivo diferencial (L-S) (v. pág. 301) licuado y atemperado a 45-47 °C. Mezclar bien medio e inoculo. Dejar solidificar e incubar en estufa a 43 °C durante 48 horas. Aspecto de las colonias Lactobacillus bulgaricus. Colonias de forma irregular, de 1 a 1,5 mm de diámetro, rojas, en forma rizoide, rodeadas de una zona blanca y opaca. Streptococcus thermophilus. Colonias redondas u ovales, de 0,2 a 0,5 mm, rojas, rodeadas de una pequeña zona clara. El número total de colonias típicas en cada caso, multiplicado por el factor de dilución de la placa elegido para el recuento, da el número de colonias por gramo o mililitro. Para que la calidad del yogur sea correcta, el número de colonias de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus, individualmente, no debe ser inferior a 107 colonias por gramo o mililitro. INVESTIGACIÓN DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA Pseudomonas aeruginosa es una especie bacteriana perteneciente a la familia Pseudomonadaceae. Está integrada por formas bacilares finas, sin esporos ni
LECHE Y DERIVADOS
303
cápsula, pero extraordinariamente móviles por ciliatura polar monótrica generalmente. Microorganismo gramnegativo, posee, a veces, en su interior granulaciones coloreadas. Material — — — — — — — — —
Pipetas estériles de 1 ml. Asas de vidrio estériles. Estufa de cultivo. Equipo de coloración de Gram. Microscopio óptico. Portaobjetos. Pipetas Pasteur. Asa de cultivo. Hilo de cultivo.
Medios de cultivo y reactivos Caldo selenito cistina Composición: Peptona L-Cistina Lactosa Fosfato disódico, anhidro Selenito disódico Agua destilada
5g 0,01 g 4g 2g 4 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento suave, sin exceder los 70 °C. Ajustar el pH a 7 ± 0,2. Repartir estérilmente en tubos, a razón de 10 ml. Caldo nitrofurantoína Caldo base Composición: Gelysate peptona Triptona Cloruro sódico Agua destilada
7,50 g 7,50 g 5g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7 ± 0,2. Distribuir a razón de 100 ml en matraces de 250 ml. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Por cada 100 ml del medio así preparado, se añaden 5 mi de una solución de nitrofurantoína (v. apartado siguiente).
304
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Solución de nitwfurantoína Composición: Nitrofurantoína Polietilenglicol
0,2 g 100 ml
Disolver en baño María a 100 °C. La solución se conserva durante 6 meses a 4 °C en frasco topacio. Agar cetrimida Composición: Peptona Cloruro magnésico Sulfato potásico Bromuro N-cetil N,N,N,-trimetil-amonio Agar Agua destilada
20 g 1,40 g 10 g 0,50 g 14 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Añadir 10 ml de glicerol y volver a calentar hasta ebullición. Ajustar el pH a 7 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Preparar placas de Petri. Reactivo para citocromo-oxidasa (v. pág. 35) Medio de Hugh Leifson Composición: Peptona Estracto de levadura Cloruro sódico Glucosa Púrpura de bromocresol Agar Agua destilada
2g 0,5 g 5g 10 g 0,015 g 3g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7,4 ± 0,2. Distribuir en tubos de 160 x 16 mm a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Agar movilidad (v. pág. 97) Medio de King A Composición: Peptona Glicerol
20 g 10 ml
LECHE Y DERIVADOS
Sulfato potásico anhidro Cloruro mercúrico anhidro Agar Agua destilada
305
10 g 1,4 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar a pH 7,2 ± 0,2. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Preparar placas de Petri. Medio de King B Composición: Peptona Glicerol Fosfato potásico anhidro Sulfato magnésico Agar Agua destilada
20 g 10 g 1,50 g 1,50 g 15 g 1.000 ml
Añadir al agua todos los ingredientes excepto el sulfato magnésico. Disolver por calentamiento y agitación. Añadir lentamente el sulfato magnésico y mezclar. Ajustar el pH a 7,2 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Preparar placas de Petri. Medio de Moller Composición: Peptona de carne Extracto de levadura D-Glucosa Púrpura de bromocresol Agua destilada
5g 3g 1g 0,016 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 6 ± 0,2. Añadir 5 g de monoclorhidrato de L-arginina. Comprobar de nuevo el pH, que en esta fase debe alcanzar un valor de 6,7. Distribuir en tubos a razón de 3 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Técnica A partir de la suspensión madre (1:10) se siembra, por duplicado, en uno o en los dos caldos de enriquecimiento (caldo selenito cistina: página 303; caldo nitrofurantoína: página 303). Incubar a 42 °C durante 24 horas. Del cultivo obtenido, sembrar 0,1 ml sobre la superficie bien seca de agar cetrimida (v. pág. 304), por diseminación con asa de vidrio estéril. Incubar a 42 °C durante 30 horas.
306
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
El agar cetrimida es selectivo para Pseudomonas, debido a que la cetrimida, derivado del amonio cuaternario, es un agente que selecciona a este microorganismo. La temperatura de 42 °C favorece el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa e inhibe el crecimiento de otras Pseudomonas. Las colonias de Pseudomonas aeruginosa producen un pigmento verde azulado (piocianina) y son fluorescentes cuando se observan con luz ultravioleta. Con las colonias aisladas se hace el siguiente estudio: — Morfología y tinción: Con el crecimiento del germen se hace un frotis que se colorea por el método de Gram. Ps. aeruginosa es un bacilo fino, de 0,3 x 3 /mi sin cápsula ni esporos, gramnegativo. — Citocromooxidasa (v. pág. 35): Ps. aeruginosa es citocromo-oxidasa positivo. — Degradación oxidativa de la glucosa: Se hace una siembra en el medio Hugh Leifson (v. pág. 304), por picadura hasta el fondo, en dos tubos con el mismo medio. Uno de lo tubos se cubre con una capa de parafína esté ril para evitar el contacto con el oxigeno; el otro se deja sin cubrir. Incubar a 42 °C entre 2 a 8 días. • Si no aparece ninguna modificación en los tubos, el germen es «inerte», o sea, inactivo sobre el azúcar. • Si hay un viraje al amarillo en la superficie del tubo que no se ha cubierto con parafína, significa oxidación de la glucosa. • Si hay un viraje al amarillo en ambos tubos, con o sin parafína, significa que hay fermentación de la glucosa. — Ps. aeruginosa es un microorganismo que oxida la glucosa. — Movilidad (v. pág. 97): Ps. aeruginosa es móvil. — Comprobación de pigmentos: Sembrar en estria sobre los medios King A y King B (v. pág. 304-305). Incubar a 42 °C durante 48-72 horas. En estos medios se exalta la pigmentación de las Pseudomonas. En el medio King A se manifiesta la piocianina y en el medio King B la pioverdina — Arginina dihidroíasa: Sembrar a partir de un cultivo de la cepa obtenido en agar nutritivo, sobre el medio de Móller (v. pág. 305). Cubrir con una capa de parafína estéril e incubar a 42 °C durante 4 días, observando cada día. En las primeras 8 horas a partir de la siembra, el medio va adquiriendo coloración amarilla cada vez más intensa por acidificación de la glucosa y viraje del indicador. Los microorganismos dihidrolasa-positivos hacen que se vuelva a elevar el pH, con lo que vuelve a virar el indicador y el medio adquiere entonces color violeta. Ps. aeruginosa es un germen arginina dihidrolasa-positivo. DETERMINACIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN LECHE. Consúltese cap. 21
29
Grasas comestibles
(«Grasas y comestibles». Capítulo XVI del Código Alimentario Español)
Las grasas alimentarias, distintas de la mantequilla, son: — — — —
Aceites y grasas vegetales. Grasas animales. Margarinas. Otros preparados grasos.
Los aceites y grasas vegetales, extraídos de granos oleaginosos y de frutos, se utilizan principalmente para el consumo humano como aceites de mesa y de fritura, así como para la preparación de margarinas. Las grasas animales se extraen, principalmente, de los tejidos adiposos de reserva. El tejido adiposo del cerdo (tocino) da por fusión la manteca de cerdo, utilizada para la alimentación humana. La margarina es una materia grasa, en gran parte de origen vegetal, que se prepara por fusión o emulsión y que tiene aspecto de mantequilla. Contiene, aproximadamente, un 16 por 100 de agua y, al menos, un 80 por 100 de materia grasa. La flora microbiana, concretamente de la margarina, es reflejo de la que contengan las materias primas que la integran y del ambiente que rodea su proceso de elaboración. Si en su composición interviene la leche, existirán inicialmente gérmenes lácticos; si la leche es pasteurizada, sólo aportará un escaso número de bacterias esporuladas termorresistentes. La alteración más frecuente de la margarina se debe a la presencia de mohos y levaduras, aunque dicha alteración está controlada por el uso correcto de sal, por un pH adecuado en la fase acuosa y por la presencia de conservantes autorizados. Cladosporium butyri produce, por ejemplo, ranciedad cetónica y Candida lipolytica provoca hidrólisis de la grasa. También está controlada, por los mismos medios, la posible presencia de cierta flora patógena, como Salmonella y St. aureus enterotoxigénico. Las grasas se alteran escasamente por microorganismos y sufren sobre todo daños fisicoquímicos ajenos a la flora microbiana. Sin embargo, los gérmenes lipolíticos pueden dar lugar a hidrólisis y oxidaciones. 307
308
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
El análisis microbiológico de aceites y grasas, a no ser las margarinas, es excepcional, ya que las bacterias no pueden mutiplicarse en un producto si no contiene agua; de aquí que los aceites, generalmente, no supongan un problema de orden sanitario. En otros cuerpos grasos comestibles, se deben analizar los posibles gérmenes que se encuentren en la fase acuosa. DEFINICIONES Grasas comestibles Se entiende por grasas comestibles los productos de origen animal, vegetal o sus mezclas que reúnan las características y especificaciones exigidas por esta Reglamentación y cuyos componentes principales sean glicéridos de los ácidos grasos, si bien pueden contener otros componentes menores. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1-6-81.) Grasas animales Son las obtenidas por distintos procedimientos, a partir de diversos depósitos adiposos de determinados animales en adecuado estado sanitario. Entre ellas se pueden distinguir las siguientes: Manteca de cerdo Se entiende por manteca de cerdo la grasa obtenido de los tejidos grasos, limpios y sanos del cerdo (Sus seroja), en buenas condiciones sanitarias, en el momento de su sacrificio, y apta para el consumo humano. Los tejidos grasos no contendrán huesos, piel desprendida, piel de la cabeza, orejas, rabos, órganos, tráquea, vasos sanguíneos grandes, desperdicios de grasa, recortes, sedimentos, residuos de prensado y similares y estarán exentos de tejido muscular y de sangre. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1 1-6-81.) Grasa de cerdo fundida Se entiende por grasa de cerdo fundida la obtenido por fusión procedente de los tejidos del cerdo (Sus seroja) en buenas condiciones sanitarias, en el momento de su sacrificio, y apto para el consumo humano. La grasa de cerdo fundida podrá contener grasa de los huesos (convenientemente limpios), grasa de pieles desprendidas, de la cabeza, de las orejas, de los rabos y de otros tejidos. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1-6-81.) Primeros jugos Se entiende por primeros jugos el producto que se obtiene fundiendo mediante suave calentamiento, la grasa del corazón, membranas, riñones y mesenterio de
GRASAS COMESTIBLES
309
animales bovinos (Bos taurus) en buenas condiciones sanitarias en el momento de su sacrificio, y apto para el consumo humano. La materia prima no debe contener grasa de recortes. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1- 6-81.) Sebo comestible Se entiende por sebo comestible el producto obtenido por la fusión de tejidos grasos, limpios y sanos (incluyendo las grasas de recortes) y de músculos y huesos de animales bovinos (Bos taurus) y/o ovinos (Ovis aries), en buenas condiciones sanitarias, en el momento de su sacrificio, apto para el consumo humano. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 16-81.) Otras grasas animales Bajo esta denominación se recogen las grasas comestibles obtenidas de animales sanos en el momento de captura y/o sacrificio; se destacan de entre ellas las grasas de animales marinos, aves, caprinos, conejos, caza, etc. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de a abril; B.O.E. 1-6-81.) Grasas vegetales Son las obtenidas, por distintos procedimientos, de frutos o semillas sanos y limpios. Entre ellas podemos distinguir, fundamentalmente, las siguientes. Manteca de coco Es la grasa procedente del fruto del cocotero (Coco nucífera L), adecuadamente refinada. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1-6-81.) Grasa de palmiste Es la grasa obtenido de la semilla del fruto de la palmera (Elaeis guineen.sis-L), adecuadamente refinada. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1-6-81.) Manteca de palma Es la grasa obtenido de la pulpa del fruto de la palmera (Elaeis guineensis-L), adecuadamente refinada. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 11-6-81.) Manteca de cacao Es la grasa obtenida de las semillas del cacao o de otros productos semidesgrasados derivados de la semilla del cacao. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1-6-81.)
310
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Otras grasas vegetales Son aquellas obtenidas de otros frutos o semillas cuyo uso para fines comestibles haya sido autorizado. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1-6-81.) Grasas anhidras Se entiende por grasa anhidra la constituida por aceites y/o grasas comestibles y sus mezclas, de aspecto homogéneo y con una humedad no superior a 0,5 por 100. Estas grasas se destinan a la alimentación a través de industrias alimentarias o para uso doméstico en preparaciones culinarias. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1-6-81.) Margarina Es el alimento extensible, en forma de emulsión líquida o plástica, usualmente del tipo agua-aceite, obtenido principalmente a partir de grasas y aceites comestibles que no procedan fundamentalmente de la leche. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1-6-81.) Minarina Es el alimento en forma de emulsión líquida o plástica, principalmente del tipo agua en aceite, a partir de grasas y aceites comestibles que no procedan fundamentalmente de la leche. Se caracterizan por su bajo contenido graso. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 1-6-81.) Preparados grasos Son los productos de aspecto graso elaborados con grasas y/o aceites comestibles, con agua o sin ella, y otros ingredientes alimenticios o alimentarios, siempre que el ingrediente fundamental sea el graso. (Real Decreto 1011/1981 de 10 de abril; B.O.E. 11-6-81.) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE GRASAS COMESTIBLES — Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 °C ± 1 °C). — Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes). — Investigación y recuento de Escherichia coli. — Investigación de Salmonella-Shigella. — Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico. — Investigación y recuento de mohos y levaduras.
GRASAS COMESTIBLES
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PREPARACIÓN DE LA MUESTRA La muestra de margarina se toma, asépticamente, de la misma forma que la mantequilla (v. pág. 289). Otras materias grasas, según el caso, se toman con sonda, cuchara o pipeta, asépticamente. La margarina se conservará en frío a 5 °C; los otros productos se pueden mantener a temperatura ambiente. El análisis se efectuará dentro de las 24 horas. Para preparar la muestra de margarina, fragmentar en trozos, asépticamente, y colocar 25 gramos en un matraz con 20 mi de solución Ringer 1/4. Colocar el matraz en baño María a 45 °C hasta su fusión. Homogeneizar por agitación y volver a llevar al baño María hasta la separación de las dos fases: grasa y acuosa. Tomar con una pipeta la fase acuosa y utilizarla para el análisis. ANÁLISIS El análisis microbiológico de grasas comestibles, excepto el de margarinas, es raro. En caso de necesidad se adaptará la técnica descrita para margarinas: Diluciones decimales (v. pág. 11) utilizando como diluyente solución de Ringer 1/4 (v. pág. 118) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± °C (v. cap. 3) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) (v. cap. 4) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico (v. cap. 10) Investigación y recuento de mohos y levaduras (v. cap. 16) CRITERIO MICROBIOLÓGICO PARA GRASAS COMESTIBLES Existe Norma Microbiológica para grasas, margarinas y minarinas por Real Decreto 3141/1982 (B.O.E. 24-11-82): Salmonella y Arizona Mohos Levaduras
Ausencia/50 g 1 x 102g 1 x 10 2g
Dado que los aceites y otras grasas no son muy adecuados para el desarrollo de microorganismos debido a su escasa humedad, únicamente interesa tener un
312
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
criterio microbiológico para calificar la calidad higiénicosanitaria de margarinas y productos similares que posean cierta cantidad de agua en su composición. En general, estos productos tienen una calidad microbiológica satisfactoria, aunque es aconsejable investigar la eventual presencia de la flora que hayan podido aportar las materias primas que integran el producto. Como orientación, se le sugiere al técnico que tenga en cuenta la presencia y recuento de la siguiente flora: 1 x 104 col/g 1 x 101 col/g Ausencia/25 g Ausencia/g Máximo 1 x l01/g
Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 °C ± 1 °C) Enterobacteriaceae lactosa positivas (coliformes) Salmonella-Shigella St. aureus enterotoxigénico Mohos y levaduras
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE FLORA LIPOLITICA Los gérmenes llamados ¡¡políticos poseen lipasas que, al hidrolizar la materia grasa, dan lugar a ácidos grasos. Esta transformación conduce a la alteración de los productos grasos de forma rápida, originando la aparición de gustos anormales, como consecuencia de transformar los ácidos grasos liberados en metilcetonas. La acción lipolítica se puede investigar de distintas formas, según el medio de cultivo utilizado; la acción de la lipasa se percibe por hidrólisis de los triglicéridos. Material — — — —
Pipetas de 1 ml estériles. Placas de Preti estériles, de 90 mm de diámetro. Estufa de cultivo. Cuentacolonias
Diluyente y medio de cultivo Solución de Rmger 1/4 (v. pág. 118) Agar tributirina Composición: Peptona Extracto de levadura Tributirina Agar Agua destilada
5g 3g 10 g 15 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,3 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
GRASAS COMESTIBLES
313
Técnica A partir de la «serie de diluciones decimales», utilizando como diluyeme solución de Ringer 1/4 (v. pág. 118), por duplicado, transferir 1 mi de cada dilución a otras tantas placas de Petri estériles. Añadir 10 mi del medio agar tributirina (v. pág. 312) atemperado a 45-47 °C. Mezclar bien e incubar a 30 °C durante 72 horas. Las colonias lipolíticas aparecen rodeadas de una zona clara sobre un medio opaco. El recuento total de microorganismos lipolíticos se obtiene multiplicando el número de colonias típicas contado en la placa elegido por el factor de dilución de dicha placa. Así se obtiene el recuento total por gramo o mililitro de muestra analizada.
30
Cereales
(«Cereales». Capítulo XVI del Código Alimentario Español)
Los granos de cereales son el fruto de ciertas gramíneas e incluyen; trigo, cebada, avena, centeno, arroz, mijo, alforfón, maíz, panizo, sorgo. A excepción del arroz, todos ellos los consume el hombre previamente transformados. El grano del cereal es pobre en agua (11-13 por 100 y tiene la siguiente composición: — — — —
Proteínas (12-14 por 100). Grasa (1,5-2,2 por 100). Hidratos de carbono (69-78 por 100). Fibra (0,9-2,3 por 100).
También contiene sales minerales y vitaminas D, E y del grupo B. Su composición química es favorable para el crecimiento de microorganismos, pero su escasa humedad, sobre todo si se trata de cereales secos, hace que las bacterias sean incapaces de multiplicarse y que los mohos lo hagan de forma limitada. La flora de los granos de cereales está compuesta de gérmenes saprofitos, generalmente; es abundante y se sitúa en la superficie. Procede de la que existe en el aire, suelo, sobre animales y sobre plantas. El tipo y número de organismos integrantes de esta ñora dependen de diversos factores: — — — — — —
Clima donde se han producido. Suelo en el que han crecido. Ambiente con el que han estado en contacto (insectos, roedores, pájaros). Métodos de recolección utilizados. Condiciones climáticas durante la recolección. Tiempo y forma de almacenamiento.
La diversidad de factores conduce a una gran variedad de microorganismos en los cereales. En general, se encuentran especies de familia Pseudomonadaceae, del grupo «coliformes», bacterias esporuladas, levaduras y esporas fúngicas. Al315
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
gunos granos están contaminados, habitualmente, con mohos Cladosporium y, otros, por Aspergillus de diversos tipos. Claviceps purpurea, parásito del centeno, tiene interés desde el punto de vista sanitario porque sus esclerotes contienen un alcaloide tóxico que produce una micotoxicosis en el hombre, el ergotismo. Por su parte, el desarrollo de otros mohos toxinógenos pertenecientes a los géneros Aspergillus, Penicillium, Fusarium y otros, puede ocasionar problemas sanitarios graves. Se puede citar también una micotoxicosis humana, la islanditoxicosis, provocada por arroz contaminado con Penicillium islandicum, moho que produce una sustancia tóxica: la luteoskirina. Esta especie fúngica produce también otras sustancias tóxicas, como la ciclorotina (afecta primariamente al hígado, causando fibrosis y cirrosis) y la eritroskirina (alteraciones en hígado y sistema linfático). En los consumidores de arroz polucionado con Penicillium islandicum (Extremo Oriente), se observa un aumento anormal en la frecuencia de cánceres primitivos de hígado. En los cereales también puede asentarse una flora procedente del exterior que aportan, sobre todo, pájaros, roedores y hombre (coliformes, Escherichia coli, Salmonella). DEFINICIONES Cereales Se conocerá bajo la denominación de cereales a las plantas gramíneas y a sus frutos maduros enteros, sanos y secos. Se incluye también el alforfón o trigo sarraceno, que pertenece a la familia Poligonaceae. (Código Alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.1.) Sirven de alimentación al hombre y animales domésticos los siguientes: — Alforfón o trigo sarraceno {Fagopyrum sculentum. Moench). — Alpiste (Phalaris canariensis, L). — Arroz {Oryza sativa, L). — Avena {Avena sativa, L). — Cebada (Ordeum vulgare, L). — Centeno (Sécale cereale, L). — Maíz {Zea mays, L). — Mijo (Panicum miliaceum, L). — Panizo {Setaria itálica P.L.). — Panizo de Daimiel (Pennisetum glaucum). — Sorgo (Sorghum vulgare. Pers). — Trigo (Triticum, L). Alforfón Es el fruto de Fagopyrum sculentum. (Código alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.19.)
CEREALES
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Alpiste Se considerará como alpiste (Phalaris canariensis) la planta y los frutos procedentes de la mencionada especie. (Código Alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.11.) Arroz Arroz cáscara Es el fruto procedente de la especie Oryza saliva, revestido por las glumas. (Código Alimentario Español. Capítulo XVI, apartado 3.17.12.) Arroz descascarillado o cargo Es aquel cuyos granos, procedentes del «arroz cáscara» maduro, están desprovistos solamente de su cubierta exterior (glumas y glumillas), pero conservan el pericarpio, al que deben su color característico. (Orden de 12 de noviembre de 1980;B.O.E. 19-11-80.) Arroz blanco Es aquel cuyos granos, maduros, están desprovistos total o parcialmente de las cutículas del pericarpio y que presentan un color más o menos blanco, pero siempre uniforme. (Orden de 12 de noviembre de 1980; B.O.E. 19-11-80.) Arroz sancochado o parboiled Es aquel cuyos granos, procedentes del arroz cáscara o cargo, está sometido a un tratamiento hidrotérmico seguido de secado, y que es susceptible de posterior elaboración, con lo que adquiere una coloración característica. (Orden de 12 de noviembre de 1980; B.O.E. 19-11-80.) Arroz tratado Es aquel cuyo granos, procedentes del arroz blanco, están sometidos a procesos especiales de elaboración: arroz glaseado, arroz matizado o camolino, arroz enriquecido. (Orden de 12 de noviembre de 1980; B.O.E. 19-11-80.) Avena Son los frutos procedentes de la especie Avena saliva. (Código Alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.13.) Cebada Son los frutos sanos y secos procedentes de distintas especies de Ordeum. (Código Alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.14.)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Centeno Es el fruto procedente de la especie Sécale cereale. (Código Alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.15.) Maíz
Es el fruto procedente de la especie Zea mays. (Código Alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.16.) Mijo, panizo y panizo de Daimiel Se entenderá por mijo los frutos procedentes de Panicum miliaceum; por panizo los procedentes de Setaria itálica y por panizo de Daimiel los procedentes de Pennisetum glaucas. (Código Alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.17.) Trigo Es el fruto procedente de las diferentes especies del género Triticum. (Código Alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.18.) Sorgo Es el fruto procedente de Sorghum vulgare. (Código Alimentario Español. Capítulo XVII, apartado 3.17.20.) Cereales en copos o expandidos Se entiende por cereales en copos o expandidos, los productos alimenticios elaborados a base de granos de cereales sanos, limpios y de buena calidad, enteros o sus partes o molidos, preparados según técnicas que se indican en el articulo 7.° de la presente Reglamentación, aptos para ser consumidos directamente o previa cocción. (Real Decreto 1094/1987 de 26 de junio; B.O.E. 8-9-87.) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE CEREALES — Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 °C ± 1 °C). — Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes). — Investigación y recuento de Escherichia coli. — Investigación de Salmonella. — Investigación y recuento de mohos y levaduras. — Investigación y recuento de Bacillus cereus.
CEREALES
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PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Se tomarán, asépticamente, porciones de muestra de varias áreas para obtener una muestra representativa. Añadir agua de triptona (TW) (v. pág. 11) estéril para obtener una dilución al 1:10 (suspensión madre). Triturar homogeneizar en condiciones asépticas durante 2 minutos. En vez de triturar, también se pueden poner los cereales y el diluyente en maceración en frigorífico durante 30 minutos. A partir de la suspensión madre, se preparan las diluciones decimales.
ANÁLISIS El análisis microbiológico de cereales es infrecuente. Para conocer su calidad higiénico-sanitaria en determinadas ocasiones, se pueden efectuar las siguientes determinaciones y recuentos. Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Investigación y recuento Enterobacteriaceae lactosa-positivas (col i formes) (v. cap. 4) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella (v. cap. 7) Investigación y recuento de mohos y levaduras (v. cap. 16) Investigación y recuento de B. cereus (v. cap. 11)
CRITERIO MICROBIOLÓGICO PARA CEREALES Por Orden 12 de noviembre de 1980 (B.O.E. 19-11-80), se establece, entre las características mínimas de calidad para el arroz envasado con destino al consumo en el mercado interior, que: El producto sea sano (esencialmente exento de mohos, podredumbres, insectos y parásitos). Como orientación para el técnico, se sugiere el siguiente criterio microbiológico para casos determinados en que interese conocer la calidad higiénico-sanitaria de los cereales. Se dan unos límites amplios, teniendo en cuenta la diversidad de estos productos:
320
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Recuento total de colonias erobias mesófilas (31 °C ± 1 °C) Enterobacteriaceae lactosa positivas (coliformes) Escherichia coli Salmonella Recuento de mohos* Recuento de levaduras
1 x 102— 1x105 /g 1 x 102 — 1x104 /g 1 x 101 —1x102 /g Ausencia 25g 1 x 102 — 1x104 /g 1 x 102 — 1x104 /g
* Cepas no toxigénicas.
Existe Norma Microbiológica para cereales en copos o expendidos, por Real Decreto 1094/1987 de 26 de junio (B.O.E. 8-9-87). Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 °C ± 1 °C) Escherichia coli Salmonella y Arizona Bacillus cereus Mohos y levaduras
Máximo 1 x 104/g Ausencia/g Ausencia/25 g Máximo 1 x 101/g Máximo 1 x 102/g
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Leguminosas («Leguminosas». Capítulo XVIII del Código Alimentario Español)
Las leguminosas constituyen una gran familia de dicotiledóneas, cuya característica común, de la que deriva su nombre, es la legumbre o vaina, típico fruto alargado o en espiral que contiene casi siempre varias semillas dispuestas en fila. Las legumbres son un grupo muy heterogéneo que procede de órganos vegetales diversos: — — — — — — —
Semillas: guisantes, judías, maíz, etc. Frutos: tomates, pimientos, etc. Hojas: lechuga, espinaca, col, etc. Flores: coliflor, alcachofa, etc. Raíces: nabo, zanahoria, remolacha, etc. Tallos: espárragos. Tubérculos: patatas.
Con la denominación genérica de «legumbres secas», se conocerán las semillas secas, limpias y sanas y separadas de la vaina, procedentes de plantas de la familia de las leguminosas, enteras o mondadas (con los cotiledones enteros, unidos o separados) destinadas al consumo humano que a continuación se mencionan: — Alubias o judías: procedentes de las especies Phaseolus vulgaris, L (judía común); Phaseolus multiflorus, Wild (judía de España o escarlata); Pha seolus lumatus, L (judía de Lima) y Vigna sinensis, L (judía carilla). — Lentejas: procedentes de la especie Leus sculenta. Moench. — Guisante, procedente de la especie Pisum sativum, L. — Garbanzos, procedentes de la especie Cicer arictinum, L. — Habas, procedentes de la especie Vicia faba, L. (Orden de 16 de noviembre de 1983; B.O.E. 17-11-83.) Las características químicas de las legumbres son muy variables. Las siguientes corresponden a las legumbres secas: 321
322
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— — — —
Proteínas (20-30 por 100). Grasas 1,2 - 3 por 100). Glúcidos solubles (60-65 por 100). Fibra (2-6 por 100).
Algunas legumbres se contaminan en el suelo que, además de la flora habitual, puede contener accidentalmente patógenos de origen animal. Otras legumbres se contaminan a través de: aire, pájaros, insectos, agua de riego, etcétera. La flora de las legumbres es muy variada; generalmente, suele estar constituida por bacilos gramnegativos de los géneros Pseudomonas, Chromobacterium y Flavobacterium. Especies de los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Micrococcus y Bacillus. La flora de las legumbres secas es más limitada y procede del ambiente; no ocasiona habitualmente, ningún problema sanitario. DEFINICIÓN Legumbres secas Se denominan legumbres secas las semillas secas y separadas de la vaina procedentes de plantas de la familia de las leguminosas, enteras o mondadas (con los cotiledones enteros, unidos o separados) destinadas al consumo humano, que a continuación se mencionan: — — — — —
Alubias o judías. Lentejas. Guisantes. Garbanzos. Habas.
(Orden de 16 de noviembre de 1983 por la que se aprueba la Norma de Calidad para determinadas legumbres secas y legumbres mondadas, envasadas, destinadas al mercado interior; B.O.E. 17-11-83.) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LEGUMBRES SECAS (v. pág. 318) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA (v. pág. 319) ANÁLISIS (v. pág. 319) CRITERIO MICROBIOLOGICO PARA LEGUMBRES SECAS Por Orden de 16 de noviembre de 1983 (B.O.E. 17-11-83) se establece, entre las características mínimas de calidad para las legumbres secas con destino al consumo en el mercado interior, que:
LEGUMINOSAS
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— Estén enteras, salvo para las presentadas mondadas. — Estén sanas y, en particular, exentas de mohos, podredumbres, insectos vivos o muertos y parásitos vivos o muertos. — Estén limpias, prácticamente exentas de trazas visibles de residuos. — Estén exentas de olores y/o sabores extraños.
Con un fin exclusivamente orientativo para el técnico, se puede tener en cuenta el mismo criterio microbiológico que para los cereales (v. pág. 319).
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Tubérculos y derivados («Tubérculos y derivados». Capítulo XIX del Código Alimentario Español)
Los tubérculos son partes subterráneas de tallos o raíces que se hacen más gruesos, acumulando gran cantidad de sustancias de reserva, principalmente almidón: patata, batata, chufa, etc. Están relativamente protegidos contra los microorganismos de contaminación gracias a la presencia de tegumentos. Las patatas son los extremos finales engrosados (tubérculos) de la planta solanácea Solanum tuberosum. Están protegidas por un peridermum de tejido acorchado que les permite un largo periodo de conservación. Por su gran riqueza en fécula (9-35 por 100) e importante contenido en vitaminas y sales minerales, las patatas tienen una gran importancia en la alimentación humana. Su composición es: Agua: 77,8 por 100 Hidratos de carbono: 19,1 por 100 Proteínas: 2 por 100 Grasas: 0,1 por 100 Cenizas: 1 por 100 Vitaminas (A, B1B6 C, H, K, ácido nicotínico, ácido pantoténico) Sales minerales (combinaciones de potasio y manganeso) Por su contenido en sustancias nutritivas y agua, permiten el crecimiento de mohos, levaduras y bacterias y pueden ser deterioradas por algunos de estos microorganismos. Aunque las patatas están protegidas por el tejido acorchado que las envuelve y por sustancias como el ácido ascórbico que contienen, sufren importantes pérdidas por enfermedades ocasionadas por bacterias y hongos. Por su contacto con el suelo, la superficie de las patatas da recuentos bacterianos altos, incluso superiores a 106. La flora contaminante es la típica del suelo (esporulados, coryneformes), así como mohos y levaduras. También pueden contener coliformes y enterococos. En cuanto a la presencia de Escherichia coli, está relacionada con el uso de aguas contaminadas para el riego. En la práctica, no son productos que, como tales, sean causa de problemas sanitarios al ser consumidos por el hombre. 325
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
DEFINICIONES Patatas Con la denominación genérica de «patatas», se conocerán los tubérculos procedentes de la planta Solanum tuberosum, L, sanos, maduros, limpios de tierra u otras impurezas y que, en su estado natural o debidamente conservados, sean aptos para el consumo humano. (Código Alimentario Español. Capítulo XIX, apartado 3.19.00.) Derivados de las patatas Son los productos obtenidos por la elaboración de patatas, aptos para la alimentación o destinados a servir de materia prima para fabricación de productos alimenticios. Los derivados de la patata se clasifican en: — — — — — —
Patatas conservadas. Patatas deshidratadas. Patatas congeladas. Patatas fritas. Harina de patata. Gránulos y copos de patata. Otros productos.
(Código Alimentario Español. Capítulo XIX, apartado 3.19.07.) Productos de aperitivo Se consideran productos de aperitivo aquellos preparados de utilización básicamente fruitiva como aperitivo y que se obtienen por la aplicación, a las materias primas reguladas en esta Reglamentación, de operaciones de secado, testación, extrusión, fritura, troquelado o procesos similares. (Real Decreto 126/1989 de 3 de febrero; B.O.E. 8-2-89.) Cortezas de cerdo fritas Son los productos obtenidos a partir de piel de cerdo deshidratada y posteriormente frita en aceite o grasa comestible. (Real Decreto 126/1989 de 3 de febrero; B.O.E. 8-2-89). Productos de aperitivo fritos («Snacks» y similares) Son los productos de forma variable, de relativa baja densidad y pequeño peso por unidad, manufacturados fundamentalmente a partir de almidón procedente de productos tales como patatas, maíz, arroz, trigo y otros vegetales, y otros ingredientes alimenticios.
TUBÉRCULOS Y DERIVADOS
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Se elaboran por extrusión, troquelado u otras operaciones y pueden freírse en aceite o grasa comestible. (Real Decreto 126/1989 de 3 de febrero; B.O.E. 8-2-89.) Productos de aperitivo secados u horneados (palitos, «prettzels», lazos y similares) Son las masas de harina, agua y otros ingredientes alimenticios que se moldean en formas características (palitos, lazos o similares) secados u horneados. (Real Decreto 126/1989 de 3 de febrero; B.O.E. 8-2-89.) Productos semielaborados Son los productos preelaborados con componentes de origen animal o vegetal, estables en su conservación y que pueden ser comercializados como tales y destinados a la obtención de alguno de los productos anteriormente descritos, mediante alguna o algunas de las operaciones propias de las industrias de aperitivo. (Real Decreto 126/1989 de 3 de febrero; B.O.E. 8-2-89.) Patatas fritas Es el producto obtenido a partir de patatas sanas, sin indicios de verdeo, peladas, debidamente lavadas, cortadas y fritas en aceite de oliva u otros aceites y grasas comestibles. (Real Decreto 126/1989 de 3 de febrero; B.O.E. 8-2-89.) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE PATATAS FRITAS Y PRODUCTOS DE APERITIVO — — — —
Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales. Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de Streptococcus D de Lancefíeld. Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Se prepara, asépticamente, una suspensión madre (1:10) de la muestra, macerándola en el diluyente (agua de triptona: TW) (v. pág. 11) en refrigeración durante 30 minutos y triturándola posteriormente. ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales (v. cap. 6)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Investigaciones de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de Streptococcus D de Lancefield (v. cap. 14) Investigación y recuento de St. aureus enterotexigénico (v. cap. 10) CRITERIO MICROBIOLOGICO PARA PATATAS FRITAS Y PRODUCTOS DE APERITIVO Por Real Decreto 126/1989 de 3 de febrero (B.O.E. 8-2-89) se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración y comercialización de patatas fritas y productos de aperitivo. En dicho Decreto se marcan los límites de la flora que expresa la Norma Microbiológica en los términos siguientes: Cuando se trata de una sola muestra, los valores máximos admisibles serán los siguientes: Enterobacteriaceae totales Salmonella-Shigella Streptococcus D de Lancefield St. aureus enterotoxigénico
Ausencia/g Ausencia/25 g 1 x lO2 /g Ausencia/g
Cuando en el programa de muestreo el número de unidades de muestra (N) es igual a 5, los valores máximos admisibles serán los siguientes:
Enterobacteriaceae totales col./g Salmonella-Shigella/25 g Streptococcus D de Lancefield col./g St. aureus enterotoxigénico/g
n
c
m
M
5 5 5 5
2 0 2 2
0 0 0 0
1 xl01 1 x 102 1x10 1
n: Número de unidades de muestra de un lote que se analizan según el programa de muestreo establecido. c: Número de muestras que pueden sobrepasar el limite m sin ser superior al limite M. m: Límite microbiológico que únicamente c de las muestras puede sobrepasar. M: Nivel limite máximo de aceptabilidad. Nota: Se incluyen las definiciones de aperitivos porque la Norma Microbiológica que se da en el Real Decreto 126/1989 de 3 de febrero (B.O.E. 8-2-89) es para patatas fritas y productos de aperitivo.
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Harinas y derivados («Harinas y derivados». Capítulo XX del Código Alimentario Español)
De forma genérica, las harinas son productos de la molienda de los cereales y de las semillas o frutos de otras plantas, especialmente el producto obtenido de la molienda del trigo, libre de sustancias extrañas e impurezas. Los granos triturados liberan almidón. En el transcurso de la molienda, la flora procedente de cereales, semillas o frutos se reparte por todo el producto. De igual forma, debido a las diversas manipulaciones a que se somete la harina para su obtención, se producen recontaminaciones por el aire y a través de la maquinaria utilizada, principalmente. Las harinas tienen, en general, una actividad de agua (aw) muy baja, circunstancia que dificulta el crecimiento microbiano. Sin embargo, ciertas condiciones de almacenamiento (locales húmedos; productos que, ante fuertes variaciones de temperatura, sufren condensaciones de humedad; contacto con otros productos que pueden ceder humedad, etc.) pueden hacer que la actividad de agua (aw) supere un valor de 0,70, lo que posibilita el enmohecimiento del producto con el riesgo de poder producir micotoxinas. La flora de la harina está constituida, esencialmente, por esporos de Bacillus, coliformes, representantes de los géneros Achromobacter, Flavobacterium, Sarcina, Micrococcus, Alcaligenes, Serrada, Pseudomonas y numerosas esporas de mohos (Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaría, Cladosporium, Mucor y Rhizopus). Las harinas con cargas microbiológicas muy elevadas (por esporos, principalmente), comprometen la estabilidad de los productos a los que se incorporan, pudiendo ocasionar problemas en la elaboración de pan, pastas y otros productos. La microflora total de las harinas oscila entre 2 x 104/g y 5 x 106/g. Sería deseable que, para evitar alteraciones, la tasa microbiana no sobrepasase 1 x 104/g. La harina es un producto estable debido a su escasez en agua; sus alteraciones evolucionan paralelamente al aumento de humedad, con la presencia de mohos en la superficie y levaduras y Bacillus en profundidad que originan fermentaciones (alcohólica, acética) y gas. Dentro de los productos derivados de la harina, el pan sufre alteraciones ligadas al aumento de la temperatura y a una humedad excesiva. Entre las alteraciones de origen microbiano del pan están: 329
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— Enmohecimiento. Debido al desarrollo de esporas fúngicas, que dan lugar a la alteración de los caracteres organolépticos del producto (colonias coloreadas, olor y sabor a moho). Los microorganismos causantes son especies y géneros de distintos mohos: Penicillium expansum, Rhizopus nigricans, Aspergillus niger, Monilia, Mucor, Geotrichum. — Pan filante. Alteración producida, sobre todo, cuando el pan se somete a un enfriamiento lento. Es producida por las variedades mesentericus y panis de las especies Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis. Se degradan el gluten y el almidón, convirtiendo el pan en una masa viscosa con olor de melón podrido. — Pan rojo o sangrante. Es más frecuente en panes de molde o troceados. Consiste en la aparición de manchas rojas por el crecimiento de bacterias (Serrana marcescens) o mohos (Monilia sitophila, Oïdium aurantreceum). Desde el punto de vista higiénico-sanitario, son las micotoxinas los productos de más riesgo en el caso de la harina. Los granos mohosos pasan a las harinas donde, por diversos tratamientos, se destruyen los mohos, pero perduran las micotoxinas elaboradas por ellos. Dentro de las bacterias patógenas, se ha aislado Salmonella en harinas de soja y otras harinas oleaginosas; no obstante, su incidencia en la harina de trigo es baja.
DEFINICIONES Harina Deberá entenderse por harina, sin otro calificativo, el producto finamente triturado obtenido de la molturacion del grano de trigo (Triticum aestiviim) o la mezcla de éste con el Triticum durum, maduro, sano y seco e industrialmente limpio. Los productos finamente triturados de otros cereales deberán llevar adicionado al nombre genérico de la harina, el del grano del cual proceden. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.) Harina integral Es el producto resultante de la molturacion del grano de trigo, maduro, sano y seco, industrialmente limpio, sin separación de ninguna parte de él, es decir, con un grado de extracción del 100 por 100. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.) Harina integral de trigo desgerminado Es el producto resultante de la molturacion del grano de trigo maduro, sano y seco, industrialmente limpio, al que se le ha eliminado sólo el germen. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.)
HARINAS Y DERIVADOS
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Mezcla de harinas Es la harina resultante de la mezcla de harinas de diferentes cereales. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.) Harina acondicionada Son las harinas cuyas características organolépticas, plásticas y/o fermentativas se modifican y complementan para mejorarlas mediante tratamientos físicos o adición de productos debidamente autorizados. En su denominación se adicionará siempre, al nombre genérico de harina, el del grano del que proceda. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.) Harinas para rebozar Son harinas acondicionadas por adición de determinadas sustancias, debidamente autorizadas, y que se utilizan en la condimentación de alimentos. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.) Harina enriquecida Es aquella a la que se ha añadido alguna sustancia que eleve su valor nutritivo con el fin de transferir esta cualidad a los productos con ella elaborados. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.) Harina de fuerza Es la harina de extracción T-45 y T-55, exclusivamente, procedente de trigos especiales. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84). Sémolas y semolinas Son los productos fundamentalmente constituidos por endospermos de estructura granulosa, procedentes de la molturación del trigo industrialmente limpio. Se clasifican según su granulosidad en: — — — —
Sémola de boca o consumo directo. Sémola industrial. Semolina de trigo duro. Semolina de trigo blando.
(Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Salvado para consumo humano Es el subproducto del proceso de molienda del trigo, procedente de las capas externas o cubiertas de la semilla del grano, que quedan después de extraer la harina. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.) Germen de trigo Es el producto constituido por el embrión del grano de trigo, separado del mismo al iniciarse el proceso de molturación. (Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo; B.O.E. 6-7-84.) Pastas alimenticias Productos obtenidos por desecación de una masa no fermentada, elaborada con sémolas, semolinas o harinas procedentes de trigo duro, semiduro, blando o sus mezclas. (Real Decreto 2181/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Productos de confitería, pastelería, bollería y repostería Productos de confitería Se consideran productos de confitería aquellos preparados cuyo ingrediente fundamental es el azúcar o azúcares comestibles, junto a otra serie de productos alimenticios o alimentarios autorizados. (Real Decreto 2419/1978 de 19 de mayo; B.O.E. 12-10-78.) Productos de bollería Se consideran productos de bollería aquellos preparados alimenticios elaborados básicamente con masa de harina comestible fermentada, cocida o frita, a la que se han añadido o no otros alimentos, complementos panarios y/o aditivos autorizados. (Real Decreto 2419/1978 de 19 de mayo; B.O.E. 12-10-78.) Productos de pastelería y repostería Son aquellos elaborados, fermentados o no, de diversa forma, tamaño y composición, integrados fundamentalmente por harinas, féculas, azúcares, grasas comestibles y otros productos alimenticios y alimentarios como sustancias complementarias. (Real Decreto 2419/1978 de 19 de mayo; B.O.E. 12-10-78.) Galletas Se entiende por galletas los productos alimenticios elaborados, fundamentalmente, por una mezcla de harina, grasas comestibles y agua, adicionada o no de
HARINAS Y DERIVADOS
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azúcares y otros productos alimenticios o alimentarios (aditivos, aromas, condimentos, especias, etc.), sometida a proceso de amasado y posterior tratamiento térmico, dando lugar a un producto de presentación muy variada, caracterizado por su bajo contenido en agua. Se clasifican en: — — — — — — — — —
Marías, tostadas y troqueladas. Cracker y de aperitivo. Barquillo, con o sin relleno. Bizcochos secos y blandos. Sandwiches. Pastas blandas y duras. Bañadas con aceite vegetal. Recubiertas de chocolate. Surtidas.
(Real Decreto 1124/1982 de 3 de abril; B.O.E. 4-6-82.) Pan y panes especiales Pan Pan, sin otro calificativo, designa el producto perecedero resultante de la cocción de una masa obtenido por la mezcla de harina de trigo, sal comestible y agua potable, fermentada por especies de microorganismos de la fermentación panaria, como Saccharomyces cerevisiae. (Real Decreto 1137/1984 de 28 de marzo; B.O.E. 19-6-84.) Pan especial Es el pan al que: — Se le ha incorporado cualquier aditivo y/o coadyuvante tecnológico de la panificación, autorizados para panes especiales, tanto a la masa panaria como a la harina. — Se ha utilizado como materia prima harina enriquecida. — Se han añadido ingredientes como leche, huevos, cacao, pasas, frutas, etcétera; no se ha añadido sal ni microorganismos propios de la fermentación. (Real Decreto 1137/1984 de 28 de marzo; B.O.E. 19-6-84.) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE HARINAS Y DERIVADOS — Recuento total de microorganismos aerobios mesófilos (31 ± 1 °C). — Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— — — — — —
Investigación y recuento de Escherichia coli. Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores. Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico. Investigación y recuento de Bacillus cereus. Investigación y recuento de mohos y levaduras.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Preparar, asépticamente, una suspensión madre (1:10) de la muestra, mezclándola con el diluyeme (agua de triptona: TW) (v. pág. 11). Homogeneizar. ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales (v. cap. 6) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores (v. cap. 9) Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico (v. cap. 10) Investigación y recuento de Bacillus cereus (v. cap. 11) Investigación y recuento de mohos y levaduras (v. cap. 16) CRITERIO MICROBIOLÓGICO PARA HARINAS Y DERIVADOS Por Real Decreto 1286/1984 de 23 de mayo (B.O.E. 6-7-84) se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración, circulación y comercio de harinas y sémolas de trigo y otros productos de su molienda, para consumo humano. En dicha Reglamentación se especifica la siguiente Norma Microbiológica: Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1°C) Escherichia coli Salmonella Recuento de mohos
Máximo 1 X 106col./g Máximo 1 X102col./g Ausencia/25 g Máximo 1 X 104col./g
HARINAS Y DERIVADOS
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Por Real Decreto 2419/1978 de 19 de mayo (B.O.E. 12-10-78) se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración, circulación y comercio de productos de confitería, pastelería, bollería y repostería. Como condiciones específicas para estos productos, dice: «Todos los productos de confitería, pastelería,bollería y repostería y elaboraciones complementarias, estarán exentos de: Staphilococcus DNsa-positivos
Ausencia en 0,1 g
Salmonella-Shigella Clostridium sulfito-reductores Mohos y levaduras
Ausencia en 30 g Máximo 1 x 103/g Máximo 5 x 102/g
Por Real Decreto 1124/1982 de 30 de abril, se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración, fabricación, circulación y comercio de galletas (B.O.E. 4-6-82). En dicha Reglamentación se especifica la siguiente Norma Microbiológica: 1 Recuento de aerobios mesófilos (31 ± 1 °C) Enterobacteriaceae totales Escherichia coli Salmonella St. aureus Bacillus cereus Mohos y levaduras
3
lx 10 col./g Ausencia/g Ausencia/g Ausencia/25 g Ausencia/g Ausencia/g Máximo 2 x 102/g
2 4
1 x 10 col./g Máximo 1 x 10/g Ausencia/g Ausencia/25 g Ausencia/g Ausencia/g Máximo 2 x 102/g
1 = Simples 2 = Rellenas o recubiertas
Por Real Decreto 1137/1984 de 28 de marzo (B.O.E. 18-6-84) se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la fabricación, circulación y comercio de Pan y Panes especiales. Entre las características de los productos terminados dice: «No presentará enmohecimientos, residuos de insectos, sus huevos o larvas, o cualquier otra materia extraña que denote su deficiente estado higiénico-sanitario.»
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Hortalizas y verduras («Hortalizas y verduras». Capítulo XXI del Código Alimentario Español)
El Código Alimentario Español considera hortaliza, de forma genérica, a cualquier planta herbácea hortícola en sazón para que se pueda utilizar como alimento, ya sea en crudo o cocinada. Las verduras son un grupo de hortalizas en las que la parte comestible está constituida por sus órganos verdes (hojas, tallos o inflorescencias). Según la parte de la planta que se utiliza como alimento, se diferencian en: — — — — —
Raíces y tubérculos (patata, zanahoria, remolacha, rábano, etc.). Bulbos (cebolla, puerro, cebolleta, etc.). Hojas v tallos tiernos (lechuga, acelga, espinaca, etc.). Coles (lombarda, repollo, coliflor, etc.). Frutos de hortalizas (pepino, tomate, pimiento, judía verde, calabaza, guisante, berenjena, etc.).
La importancia de las hortalizas y verduras en la alimentación humana no reside en su contenido en proteínas, grasas e hidratos de carbono que, salvo excepciones, es bajo, sino en las sales minerales y vitaminas, así como en la celulosa. Entre las sales minerales, abunda el hierro, especialmente en la espinaca; el cobre en todas las hojas verdes; pero, sobre todo, el calcio, elemento en el que la mayoría de alimentos, excepto la leche, son pobres. Una buena proporción de calcio la contienen los espárragos, judías verdes, cardo, apio y todas las hojas verdes de las hortalizas que se consumen crudas. Entre las funciones que las hortalizas ejercen sobre el metabolismo intestinal, está la de intervenir en el desarrollo de la flora bacteriana intestinal, responsable de las fermentaciones útiles, haciéndola predominar sobre la flora de putrefacción, procedente, casi siempre, de alimentos de origen animal. La composición química de las hortalizas y verduras responde a: — — — —
Agua (62-96 por 100). Proteínas (0,90-23 por 100). Grasas (0,1-1,7 por 100) Glúcidos (3-27 por 100). 337
338
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— Sales minerales (0,5-2,8 por 100). — Vitaminas (A, B, B, C, E y K). La flora microbiana de hortalizas y verduras reside en su superficie,, como consecuencia de su contacto con el suelo, aire, agua y animales. El pH de estos alimentos suele ser neutro, por lo que entre su microflora son más frecuentes las bacterias que las levaduras, por ejemplo. Las especies bacterianas que predominan pertenecen a los géneros: Achromobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Micrococcus y Lactobacillus. Entre los mohos, son frecuentes los géneros: Penicillium, Alternaría, Fusarium, Botiytis, etc. En las raíces y tubérculos se encuentran formas esporuladas de los géneros Bacillus y Clostridium. Cuando se riega con aguas fecales, Salmonella, E. coli y otras Enterobacteriaceae. El riego con aguas fecales puede ser, igualmente, la causa de transmisión de parásitos que suponen un peligro en el caso de hortalizas que se consumen crudas. Las verduras tienen un periodo de conservación limitado, siendo más sensibles a la acción microbiana según avanza su maduración. El resultado de la acción de los gérmenes es siempre una alteración más o menos intensa. Los distintos tipos de alteración de las hortalizas se deben, en gran parte, a la acción de especies bacterianas pertenecientes a los géneros Erwinia y Xanthomonas. En las hortalizas almacenadas, son frecuentes las especies de mohos: Sclerotina scierotiorum, Fusarium culmorum, Alternaría radicina. Alternaría brassicae, Phoma aplicóla, etc. DEFINICIONES Hortalizas Con la denominación genérica de «hortaliza», se designa a cualquier planta herbácea hortícola en sazón que se puede utilizar como alimento, ya sea en crudo o cocinada. (Código Alimentario Español. Capítulo XXI. Apartado 3.21.01.) Clasificación Según el Código Alimentario Español, se clasifican, de acuerdo con la planta a que pertenecen, en: — Frutos (berenjena, guindilla, maíz dulce, pimiento dulce, pimiento picante). — Bulbos (ajo, cebolla, puerro, cebolleta francesa, chalote). — Coles (berza, bróculi, col de Bruselas, col de Milán, coliflor, lombarda, repollo, bordes). — Hojas y tallos tiernos (acedera, acelga, achicoria, berro, borraja, cardo, endibia, escarola, espinaca, grelo, lechuga, mastuerzo). — Inflorescencia (alcachofa). — Legumbres verdes (guisante, haba, judía, tirabeque). — Pepónides (calabacín, calabaza, pepino, calabaza confitera).
HORTALIZAS Y VERDURAS
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— Raíces (achicoria, apio, colinabo, colirrábano, chirivía, escorzonera, nabo, rabanito, rábano, remolacha, salsifí, zanahoria). — Tallos jóvenes (apio, espárrago de huerta, espárrago triguero). De acuerdo con su forma de presentación al consumidor, se clasifican en: — — — — —
Hortalizas frescas. Hortalizas desecadas. Hortalizas deshidratadas. Hortalizas en juliana. Hortalizas y verduras congeladas.
(Código Alimentario Español. Capítulo XXI, apartado 3.21.02.) Verdura Grupo de hortalizas en las que la parte comestible está constituida por sus órganos verdes (hojas, tallos o inflorescencias). (Código Alimentario Español. Capítulo XXI, apartado 3.21.01.) Encurtidos Son las hortalizas y verduras que, después de haber sido curadas en salmuera o de haber sufrido una fermentación láctica, se conservan en vinagre y sal con o sin adición de azúcares o condimentos (encurtidos ácidos) o en vinagre con azúcares y condimentos (encurtidos dulces). (Código Alimentario Español. Capítulo XXI, apartado 3.21.24.) Chucrut Son las diversas variedades de hortalizas de la Brassica oleracea, L, sometida a un proceso tecnológico adecuado de maceración y fermentación láctea, con 2-3 por 100 de sal y condimentos y una acidez no inferior al 1 por 100, expresada en ácido láctico. (Código Alimentario Español. Capítulo XXI, apartado 3.21.26.) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE HORTALIZAS Y VERDURAS (v. pág. 327) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA (v. pág. 327) ANÁLISIS (v. págs. 327) CRITERIO MICROBIOLÓGICO PARA HORTALIZAS Y VERDURAS Con el fin exclusivamente orientativo para el técnico, se puede utilizar el mismo criterio que para cereales (v. pág. 319).
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Frutas y derivados («Frutas y derivados». Capítulo XXII del Código Alimentario Español)
Las frutas son alimentos vegetales producidos en árboles y arbustos, generalmente, que se consumen frescos. Los frutos carnosos tienen como características comunes: — — — —
Su riqueza en azúcar. Su acidez relativamente elevada. Su perfume. Su consumo frecuente en crudo.
Ciertos frutos (aceituna, aguacate) no se incluyen en estas características. El pH de las frutas es inferior a 4,5 debido a los ácidos orgánicos, a excepción de algunas, como el melón, plátano e higo, que tienen pH superior a 4,5. Son ricas en agua (85 por 100), celulosa, sustancias pécticas, vitaminas y azúcar (13 por 100). Están protegidas de las contaminaciones externas de forma desigual; así, algunas tienen una cubierta gruesa (plátano, melón, sandía), otras una piel fina (pera, manzana, melocotón) y otras una protección muy débil (fresa, frambuesa, mora). Las frutas maduras se alteran con facilidad. Los azúcares de las frutas son abundantes y se metabolizan fácilmente (hexosas, pentosas). Su composición química es compatible con el crecimiento de microorganismos, pero el pH aparece como un factor de selección, ya que es inferior a los valores que permiten la vida de las bacterias. Varía entre pH 3 para fresas hasta pH 5 como plátano y melón, por ejemplo. La flora original de las frutas es variada y está constituida por saprofitos relacionados estrechamente con el ambiente (aire, suelo, agua, animales). Esta flora la integran especies de los géneros: Micrococcus, Streptococcus, Staphylococcus, coliformes, bacterias esporuladas (Bacillus y Clostridium), Pseudomonas, levaduras y mohos. Dentro de la flora de contaminación, pueden existir gérmenes patógenos transmitidos por el agua de riego, el estiércol o los manipuladores. Se pueden encontrar, excepcionalmente, Enterobacteriaceae patógenas (Salmonella) y parásitos (Tenia, amebas). Por la acidez de las frutas frescas, los gérmenes causantes de su alteración suelen ser mohos: 341
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— Podredumbre blanda: Reblandecimiento y ennegrecimiento por fermentación de sustancias pécticas y desprendimiento de mal olor (Rhizopus nigricans, Sclerotina sclerotinium). — Enmone cimiento: Aparición de zonas coloreadas y degradación de la estructura subyacente (Penicillium: azul o verde; Botrytis: gris; Bremia: blanco; Alternaría, Aspergillus: negra; Trichothecium: rosa; Fusarium: rosa o roja; Sclerotina: marrón). Aparte de las peras, que pueden presentar podredumbre por Erwinia, las frutas no son sensibles a la acción de las bacterias; por el contrario, los mohos causan pérdidas económicas importantes. Igualmente, los mohos pueden producir sustancias tóxicas (micotoxinas). Ciertas especies de mohos atraviesan la piel de la fruta y elaboran micotoxinas en su interior; es el caso de lapatulina, sustancia producida por Penicillium expansum en manzanas y derivados de la manzana. El control microbiológico sobre frutas frescas es excepcional y no suelen encontrarse en ellas gérmenes de interés sanitario, habitualmente. Los zumos y néctares, por su composición química (ricos en vitaminas, sales minerales, azúcares, ácidos orgánicos, etc.), suponen un medio nutritivo excelente para los gérmenes especialmente para mohos y levaduras debido a su bajo pH, mientras que las bacterias sobreviven, pero apenas se multiplican. De acuerdo con estas características, son las levaduras las que originan mayores alteraciones en estos productos y son causantes de: enturbiamiento, sedimentos y velos, así como productos metabólicos perjudiciales. Las bacterias que producen ácido láctico, acético o butírico son también alterantes de zumos y néctares; dan lugar a la formación de velos. En cuanto a otras bacterias, se ha comprobado que las Enterobacteriaceae se pueden desarrollar en zumos de poca acidez y permanecer en los de acidez superior. Los mohos participan activamente en la alteración de zumos y néctares. Por su carácter de aerobios, viven en la superficie de estos productos formando micelios algodonosos. Dentro de los mohos hay que tener en cuenta el peligro que constituye para el consumidor la presencia de micotoxinas. Las confituras, jaleas, mermeladas, etc., de frutas se suelen conservar bien debido a su alto contenido en azúcar, escaso contenido de agua y presencia de ácidos, a lo que contribuye también la cocción a que se someten, que destruye los microorganismos contenidos en la materia prima. Las alteraciones por bacterias o levaduras sólo ocurren en productos insuficientemente calentados. Los únicos elementos alterantes suelen ser las especies fúngicas osmófilas, capaces de vivir en grandes concentraciones de azúcar. DEFINICIONES Frutas Con la denominación genérica de frutas se comprende, a efectos de este Código, el fruto, la infrutescencia, la semilla o las partes carnosas de órganos florales que hayan alcanzado un grado adecuado de madurez y sean propias para el
FRUTAS Y DERIVADOS
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consumo humano. (Código Alimentario Español. Capítulo XXII, apartado 3.22.01.) Clasificación Frutas carnosas Son aquellas cuya parte comestible posee en su composición, cuando menos, el 50 por 100 de agua (albaricoque, breva, grosella, cereza, ciruela, fresa, granada, manzana, melón, naranja, etc.). (Código Alimentario Español. Capítulo XXII, apartado 3.22.06.) Frutas secas o de cascara Son aquellas cuya parte comestible posee en su composición menos del 50 por 100 de agua (almendra, avellana, castaña, nuez, piñón). (Código Alimentario Español. Capítulo XXII, apartado 3.22.07.) Frutas y semillas oleaginosas Son aquellas empleadas para la obtención de grasas y para el consumo humano (cacahuete, coco, girasol, aceituna). (Código Alimentario Español. Capítulo XXII, apartado 3.22.08.) Fruta fresca Es la destinada al consumo inmediato, sin sufrir tratamiento alguno que afecte a su estado natural. (Código Alimentario Español. Capítulo XXII, apartado 3.22.09.) Fruta desecada Es el producto obtenido a partir de frutas frescas a las que se ha reducido la proporción de humedad por la acción natural del aire y del sol. (Código Alimentario Español. Capítulo XXII, apartado 3.22.10.) Fruta deshidratada Es el producto obtenido a partir de frutas carnosas frescas a las que se ha reducido la proporción de humedad mediante procesos apropiados y autorizados. (Código Alimentario Español. Capítulo XXII, apartado 3.22.12.) ' Derivados de frutas Zumos Son los líquidos (jugos) obtenidas mecánicamente a partir de frutas y vegetales sanos, limpios y maduros, clasificados o no por procedimientos mecánicos o
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
enzimáticos, fermentables, pero no fermentados, con color, aroma y sabor típicos del fruto o vegetal del que proceden. Asimismo, los obtenidos a partir de zumos concentrados, por restitución del agua y del aroma extraídos, y con características organolépticas y analíticas equivalentes a las definidas en el párrafo anterior. Su conservación se conseguirá únicamente por tratamientos físicos autorizados, con prohibición expresa de utilización de conservadores. (Real Decreto 667/1983 de 2 de marzo; B.O.E. 31-3-83.) Néctares Son los productos fermentables, pero no fermentados, obtenidos por adición de agua y azúcares a los zumos, sus mezclas, pulpas o cremogenados, concentrados o no. (Real Decreto 667/1983 de 2 de marzo; B.O.E. 31-3-83.) Aceituna de mesa Se denomina aceituna de mesa al fruto de variedades determinadas del olivo cultivado {Olea europaea sativa, Hoffg. Link) sano, cogido en el estado de madurez adecuado y de calidad tal que proporcione un producto de consumo y de buena conservación. (Real Decreto 1074/1983 de 25 de marzo; B.O.E. 65-83.) Confituras, jaleas, marmalade y mermelada de frutas Confitura extra Es la mezcla, con consistencia gelificada apropiada, de azúcares y de pulpa, bien de una sola especie de frutas bien de dos o más especies de fruta, con exclusión de manzanas, peras, ciruelas con hueso adherente, melones, sandias, uvas, calabazas, pepinos y tomates. (Real Decreto 670/1990 de 25 de mayo; B.O.E. 31-5-90.) Confitura La mezcla, con la consistencia gelificada apropiada, de azúcares, así como de pulpa y/o de puré, bien de una sola especie de frutas, bien de dos o más especies de frutas. (Real Decreto 670/1990 de 25 de mayo; B.O.E. 31-5-90.) Jalea extra La mezcla, suficientemente gelificada, de azúcares, así como de zumo y/o de extracto acuoso, bien de una sola especie de frutas, bien de dos o más especies de frutas, con exclusión de manzanas, peras, ciruelas con hueso adherente, melones, sandías, uvas, calabazas, pepinos y tomates. (Real Decreto 670/1990 de 25 de mayo; B.O.E. 31-5-90.)
FRUTAS Y DERIVADOS
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Jalea La mezcla, suficientemente gelificada, de azúcares, así como de jugo y/o de extracto acuoso, bien de una sola especie de frutas o de dos o más especies frutales. (Real Decreto 670/1990 de 25 de mayo; B.O.E. 31-5-90.) Marmalade La mezcla, con la consistencia gelificada apropiada, de azúcares y de uno o más de los productos siguientes, obtenidas a partir de agrios: pulpa, puré, zumo, extractos acuosos o pieles. (Real Decreto 670/1990 de 25 de mayo; B.O.E. 315-90.) Crema de castañas La mezcla, con la consistencia apropiada, de azúcares y de puré de castañas. (Real Decreto 670/1990 de 25 de mayo; B.O.E. 31-5-90.) Mermelada extra Es el producto preparado por cocción de frutas enteras, troceadas o trituradas, a las que se han incorporado azúcares hasta conseguir un producto semilíquido o espeso. (Real Decreto 670/1990 de 25 de mayo; B.O.E. 31-5-90.) Mermelada Es el producto preparado por cocción de frutas enteras, troceadas, trituradas, tamizadas o no, a las que se han incorporado azúcares hasta conseguir un producto semilíquido o espeso. Se diferencia de la mermelada extra en que, en aquélla, la cantidad de fruta por 1.000 g es de 500 g como mínimo y en la mermelada es de 300 g como mínimo. (Real Decreto 670/1990 de 25 de mayo; B.O.E. 31-5-90.) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE FRUTAS Y DERIVADOS (v. pág. 318) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA (v. pág. 319) ANÁLISIS (v. pág. 319) CRITERIO MICROBIOLOGICO PARA FRUTAS Y DERIVADOS Con un fin exclusivamente orientativo para el técnico, se puede aplicar el mismo criterio microbiológico que para hortalizas y verduras (v. pág. 319). En el Real Decreto 667/1983 de 2 de marzo (B.O.E. 31-3-83) (apartado 7), se especifica que los zumos de frutas y otros vegetales y sus derivados no contendrán agentes patógenos o perjudiciales para el propio producto y para el consumidor.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
En el Real Decreto 1074/1983 de 25 de marzo (B.O.E. 6-5-83) (apartado 4.1), se especifica que las aceitunas de mesa estarán exentas de gérmenes patógenos y de sus toxinas o de cualquier otra fuente contaminante. En el Real Decreto 670/1990 de 25 de mayo (B.O.E. 31-5-90) (apartado 11), se especifica que las confituras, jaleas, mermeladas, etc., no podrán contener sustancias en tal cantidad que representen un peligro para la salud humana.
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Edulcorantes naturales y derivados («Edulcorantes naturales y derivados». Capítulo XXIII del Código Alimentario Español)
DEFINICIONES Caramelos y chicles Caramelos Se entiende por caramelos las pastas de azúcares comestibles concentradas al calor, endurecidas al enfriarse, quebradizas y, generalmente, aromatizadas y coloreadas. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Confites Productos obtenidos al recubrir distintos núcleos de productos alimenticios y preparados de confitería, con azúcares, chocolate, harinas y almidones, fundamentalmente, pudiendo ser de formas y tamaños variados. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Peladillas
Se consideran peladillas los confites obtenidas al recubrir almendras enteras, hasta que queden recubiertas con una capa continua de azúcares, a la que se han añadido o no sustancias alimenticias y otros productos autorizados. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Garrapiñados Se denominan garrapiñados los confites formados por núcleos de frutos secos, revestidos de una capa de azúcar caramelizada de aspecto grumoso. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Anises Se denominan anises los confites formados por núcleos de semillas de anís o cominos, granos de azúcar o de pastas alimenticias, revestidos de una capa continua 347
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
de azúcares, coloreados o no, y siempre con agentes aromáticos que recuerden el sabor del anís. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Grageas Se consideran grageas los confites formados por distintos núcleos de diferentes formas y tamaños, recubiertos con una capa de azúcares y féculas, coloreados o no. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Pastillas de goma y gelatinas Son preparados de confitería elaborados, fundamentalmente, con todos o algunos de los siguientes productos: gomas naturales, gelatinas alimenticias, azúcares, pulpas y zumos de frutas, espesantes, con o sin colorantes y agentes aromáticos. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Comprimidos Son productos de confitería elaborados por simple mezcla, sin cocción y en frío, con azúcares, otros productos alimenticios, aromas y aditivos autorizados, cuya forma y tamaño se obtiene por compresión en máquinas apropiadas. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Artículos de regaliz Son los productos elaborados con extracto de regaliz, al que se incorporan azúcares, féculas, harinas y dextrinas comestibles, aromatizados y coloreados o no. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Goma de mascar o chicle Es el preparado elaborado con una base masticatoria plástica, natural o sintética, azúcares, agentes aromáticos y aditivos autorizados. (Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre; B.O.E. 13-9-75.) Turrones y mazapanes Turrón Se entiende por turrón la masa obtenida por cocción de miel y azúcares, con o sin clara de huevo o albúmina, con incorporación posterior y amasado de almendras tostadas, peladas o con piel. La miel podrá ser sustituida, total o parcialmente, por azúcares en sus distintas clases o derivados. (Real Decreto 1787/1982 de 14 de mayo; B.O.E. 2-8-82.) Mazapán Se entiende por mazapán la masa obtenida por amasado, con o sin cocción, de una mezcla de almendras crudas, peladas y molidas, con azúcares en sus distintas clases y derivados. (Real Decreto 1787/1982 de 14 de mayo; B.O.E. 2-8-82.)
EDULCORANTES NATURALES Y DERIVADOS
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Jarabes Son líquidos viscosos constituidos por solución de azúcares en agua, en zumos de frutas, en emulsiones de disgregados de frutas, en infusiones o decocciones vegetales o bien por mezcla de éstas con agentes aromáticos y aditivos autorizados con una graduación de 62° BRIX, como mínimo. (Decreto 380/1984 de 25 de enero; B.O.E. 27-2-84.) Jarabe simple Es la disolución de azúcares en agua potable con una graduación mínima de 62° BRIX. (Real Decreto 380/1984 de 25 de enero; B.O.E. 27-2-84.) Jarabe de zumo y/o de disgregados de frutos y tubérculos La denominación de jarabe de zumo y/o disgregados de frutos y tubérculos, acompañada de la indicación de la especie o especies que entren en su fabricación, se aplicará a los jarabes que contengan tales zumos o disgregados, ya sean naturales, conservados, concentrados, y los definidos en la legislación vigente en las proporciones mínimas señaladas para cada caso y con los aditivos autorizados para esta clase de productos. (Real Decreto 380/ 1984 de 25 de enero; B.O.E. 27-2-84.) Jarabe de esencia o de aroma Es el jarabe simple al que se le añaden esencias o aromas naturales y aditivos autorizados, aunque lleven añadido zumo, si no llega éste a la proporción exigida. (Real Decreto 380/1984 de 25 de enero; B.O.E. 27-2-84.) Jarabe de fantasía o imitación Es el jarabe simple elaborado con agentes aromáticos artificiales y aditivos autorizados. (Real Decreto 380/1984 de 25 de enero; B.O.E. 27-2-84.) Miel Se entiende por miel el producto alimenticio producido por las abejas melíferas a partir del néctar de las flores o de las secreciones procedentes de partes vivas de las plantas o que se encuentren sobre ellas, que las abejas liban, transforman, combinan con sustancias específicas propias y almacenan y dejan madurar en los panales de la colmena. Se clasifica en: — Miel de flores. — Miel de mielada. — Miel en panales. — Miel con trozos de panal. — Miel decantada, escurrida o de gota. — Miel centrifugada. — Miel prensada. — Miel cremosa. (Orden de 5 de agosto de 1983; B.O.E. 13-8-83.)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE EDULCORANTES NATURALES Y DERIVADOS — Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C). — Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales. — Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes). — Investigación y recuento de Escherichia coli. — Investigación de Salmonella-Shigella. — Investigación y recuento de mohos y levaduras. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Caramelos y chicles Preparar, en condiciones asépticas, la suspensión madre (1:10), triturando la muestra con el diluyente (agua de triptona: TW) (v. pág. 11). Turrones y mazapanes (ver chicles) Jarabes Preparar, en condiciones asépticas, la suspensión madre (1:10), mezclando y homogeneizando la muestra con el diluyente (agua de triptona: TW) (v. pág. 11). Miel (ver Jarabes) ANÁLISIS Caramelos y chicles Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 + 1 °C) (v. cap. 3) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa-positiva (coliformes) (v. cap. 4) Investigación de mohos y levaduras (v. cap. 16) Turrones y mazapanes Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3)
EDULCORANTES NATURALES Y DERIVADOS
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Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales (v. cap. 4) Investigación de Salmonella (v. cap. 7) Jarabes Diluciones decimales (v. pág. 11) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales (v. cap. 6) Investigación de Salmonella (v. cap. 7) Investigación y recuento de mohos (v. cap. 16) Miel Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales (v. cap. 6) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de mohos y levaduras (v. cap. 16) CRITERIO MICROBIOLOGICO PARA EDULCORANTES NATURALES Y DERIVADOS Caramelos y chicles En el Decreto 2179/1975 de 12 de septiembre (B.O.E. 13-9-75), por el que se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración, circulación y comercio de caramelos y chicles, se especifica como Norma: Recuento total de aerobios mesófilos Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) Recuento de mohos y levaduras
Máximo 5 x 102 col./g Ausencia/g Máximo 5 x 1 0 col./g
Turrones y mazapanes En el Real Decreto 1787/1982 de 14 de mayo (B.O.E. 2-8-82), por el que se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración y venta de tu-
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
rrones y mazapanes, se especifica que estos productos estarán exentos de gérmenes de contaminación fecal y/o patógenos. Jarabes En el Real Decreto 380/1984 de 25 de enero (B.O.E. 27-2-84), por el que se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración y venta de jarabes, se especifica como Norma: Recuento de colonias aerobias mesófüas (31 + 1 °C)
Máximo 1 x 104 col./ml
Enterobacteriaceae totales Salmonella Mohos
Ausencia/ml Ausencia/25 ml Máximo 1 x 10/ml
Miel En la Orden de 5 de agosto de 1983 (B.O.E. 13-8-83) por la que se aprueba la Norma de Calidad para la miel destinada al mercado interior, se especifica como Norma Microbiológica: Gérmenes patógenos o toxinas Recuento de aerobios mesófilos (31 + 1 °C) Enterobacteriaceae totales Escherichia coli Salmonella-Shigella Mohos
Ausencia Máximo 1 x 104 col./g Ausencia/g Ausencia/g Ausencia/g Máximo 1 x 102 col./g
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Condimentos y especias («Condimentos y especias». Capítulo XXIV del Código Alimentario Español)
Por sus características especiales, se señalan a continuación algunas generalidades de las especias. Según la International Standard Organization (ISO), las especias son «productos naturales o sus mezclas, sin materias extrañas, que se utilizan para dar sabor, aroma y sazón a los alimentos; la denominación se aplica a la vez al producto entero y al producto en polvo». La Comisión Legisladora de Alimentos alemana dice de las especias que son «partes de ciertas plantas (raíces, rizomas, bulbos, cortezas, hojas, tallos, flores, frutos y semillas) en estado natural, desecadas o elaboradas mecánicamente que, por su sabor o aroma característicos, sazonan y dan sabor a los alimentos para consumo humano». Para la Comisión de Especialistas en Agricultura de Alemania son «productos de origen vegetal, tanto en forma entera como tras su reducción a polvo, que se añaden a los alimentos para comunicarles su sabor y aroma característicos». La Asociación Americana para el Comercio de Especias las considera «plantas tropicales cuyas distintas partes se usan para sazonar alimentos. Botánicamente son raíces, cortezas, brotes, semillas o frutos de plantas aromáticas que, normalmente, crecen en los trópicos». En la Reglamentación española se da la definición de Especias por Real Decreto 2242/1984 de 26 de septiembre (B.O.E. 22-12-84). Las especias se conocen desde la antigüedad; se utilizaron, por ejemplo, en Egipto, como conservantes hace 3.000 años. Posteriormente, durante siglos, fueron los árabes los que monopolizaron el mercado de especias. Hoy día se sabe que las características antibacterianas que poseen algunas especias se encuentran en sus aceites esenciales: — — — — — —
Eugenol (cinamomo y clavo). Aldehído cinámico (cinamomo). Acido gárlico (cinamomo y clavo). Alil-isocianato (rábano y mostaza). Curcumina (cúrcuma). Derivados sulfurados (cebolla y ajo). 353
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Está comprobado que son escasas las especias con poder germicida; son más bien bacteriostáticas cuando se usan en cantidad apreciable. Algunos investigadores han señalado que la nuez moscada y el cinamomo inhiben el crecimiento de especies bacterianas pertenecientes a los géneros Salmonella y Shigella, debido a los extractos de ácido gárlico y aldehído cinámico que contienen. La dosis de especias utilizadas por la industria y en la preparación de alimentos caseros, al ser pequeña, hace que la acción bacteriostática sea escasa. También es cierto que su incorporación a los alimentos refuerza la acción de otros productos empleados como conservadores. En todos los casos, los aceites esenciales de las especias son más inhibidores que las especias molidas. Los microorganismos más sensibles a la acción germicida de las especias son, por orden: mohos, levaduras y bacterias. Las especias han intervenido durante siglos en la Historia del Mundo y ha dependido de ellas una serie de hechos, como el establecimiento de rutas comerciales para su adquisición, saqueos de barcos y el descubrimiento de América, todo ello como consecuencia de la predilección del hombre por sus sabores y aromas. Los pueblos salvajes las han usado preferentemente para estimular los sentidos del gusto y el olfato. Estos productos suelen dar recuentos microbianos altos, por lo que, cuando se usan como ingredientes de alimentos, pueden contribuir a su alteración. En parte, su contaminación se debe a que se suelen recolectar en países donde las prácticas de higiene no son muy escrupulosas. Predomina una flora perteneciente a especies del género Bacillus (B. licheniformis, B. subtilis, B. megaterium), Clostridium (Cl. perfringens), a veces, especies de la familia Enterobacteriaceae, especies de los géneros Micrococcus, Streptococcus, Sarcina, Pseudomonas, Achrobacter, Flaxobacterium, bacterias acidilácticas, mohos y sus esporas y levaduras. Entre la flora perjudicial productora de toxiinfecciones alimentarias, se han aislado: Salmonella, Shigella, Bacillus cereus y Clostridium perfringens, así como mohos productores de micotoxinas pertenecientes a los géneros Aspergillus y Penicillium. A este respecto se señalan las ochratoxinas, metabolitos tóxicos elaborados por varias cepas de las especies Aspergillus ochraceus y Penicillium viridicatum. Los recuentos microbianos totales oscilan entre 103 y 108 colonias por gramo de producto. Las especias que dan recuentos más altos son: pimienta (blanca y negra), paprika, mejorana y otras. El grado de contaminación varia, evidentemente, de acuerdo con las prácticas de higiene empleadas en el país de origen para su recogida, envasado y transporte. La presencia de E. coli indica contaminación de origen fecal. Son frecuentes los esporos de Cl. perfringens y su nivel varía de 10 a varios cientos por gramo de producto. La existencia de esporos termófilos supone un peligro si se incorporan a conservas y semiconservas, ya que, al sobrevivir al tratamiento de estos productos, pueden desarrollarse y constituir un riesgo para la salud o ser causa de alteración del alimento.
CONDIMENTOS Y ESPECIAS
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DEFINICIONES Sal y salmueras comestibles Sal Es el producto cristalino constituido fundamentalmente por cloruro sódico en condiciones que lo hacen apto para usos alimenticios y que se conoce con el nombre de «sal comestible» o, simplemente, «sal». (Real Decreto 1424/1983 de 27 de abril; B.O.E. 1-6-83.) Salmueras para alimentación Son las disoluciones en agua potable de sal comestible, adicionadas o no de azúcar, vinagre, otros condimentos, especias y demás sustancias autorizadas. (Real Decreto 1424/1983 de 27 de abril; B.O.E. 1-6-83.) Salsas de mesa Se entiende por salsas, a efectos de esta Reglamentación, los preparados alimenticios que resultan de la mezcla de distintos ingredientes comestibles y que, sometidos a tratamiento culinario conveniente, se utilizan para acompañar a la comida o a los preparados alimenticios. Se clasifican en: — — — — —
Tomate frito. Ketchup, catsup o catchup. Mayonesa o mahonesa y salsa fina. Mostaza. Otros tipos de salsas.
(Real Decreto 858/1984 de 28 de marzo; B.O.E. 10-5-84.) Tomate frito Es el producto formulado a partir del tomate en cualquiera de sus formas de utilización (tomate natural, zumo de tomate, puré, pasta o concentrado de tomate), tal como se definen en el Código Alimentario Español, y sometido a una proceso de cocción con aceite vegetal comestible, con la adición facultativa de ingredientes autorizados, envasados en recipientes convenientemente cerrados y adecuadamente conservados. (Real Decreto 858/1984 de 28 de marzo; B.O.E. 10-5-84.) Ketchup, catsup o catchup Es el producto preparado a partir de tomate en cualquiera de sus formas de utilización (tomate natural, zumo de tomate, puré, pasta o concentrado de tomate), tal como se definen en el Código Alimentario Español, sazonado con sal, vinagre, azúcares y especias y con la adición facultativa de otros ingredientes autorizados,
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
envasados en recipientes cerrados y adecuadamente conservados. (Real Decreto 858/1984 de 28 de marzo; B.O.E. 10-5-84.) Mayonesa o mahonesa y salsa fina Son los productos en forma de emulsión constituidos, básicamente, por aceites vegetales comestibles, huevos o yemas de huevo, vinagre y zumo de limón, con la adición facultativa de otros ingredientes autorizados, envasados en recipientes cerrados y adecuadamente conservados. (Real Decreto 858/1984 de 28 de marzo; B.O.E. 10-5-84.) Mostaza Es el producto preparado a partir de la semilla de mostaza en cualquiera de sus formas de utilización (grano entero, grano machacado o harina de mostaza) sazonado con vinagre, con la adición facultativa de otros ingredientes, envasado en recipientes convenientemente cerrados y adecuadamente conservados. (Real Decreto 858/1984 de 28 de marzo; B.O.E. 10-5-84.) Otros tipos de salsas Son aquellas que, respondiendo al concepto general de salsas, no se ajustan a las características de los tipos definidos anteriormente. Su denominación deberá ser el nombre consagrado por el uso o, en su defecto, una denominación de fantasía en cuyo caso deberá ir acompañada de una inscripción del producto alimenticio lo suficientemente precisa para permitir al comprador conocer su naturaleza real y distinguirla de aquellos otros con los que pueda confundirse. Condimentos y especias Especia o condimento aromático A efectos de esta Reglamentación, se designa con el nombre de especia o condimento aromático a las plantas o partes de las mismas, frescas o desecadas, enteras, troceadas o molidas que, por su color, aroma o sabor característicos, se destinan a la preparación de alimentos y bebidas, con el fin de incorporarles estas características, haciéndolos más apetecibles y sabrosos y, en consecuencia, consiguiendo su mejor aprovechamiento. (Real Decreto 2242/1942 de 26 de septiembre; B.O.E. 22-12-84.) Condimentos preparados o sazonadores Producto obtenido por la simple mezcla de varias especias o condimentos entre sí, y/o con otras sustancias alimenticias autorizadas.
CONDIMENTOS Y ESPECIAS
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Serán «aditivos» y no «condimentos preparados» todas las mezclas de especias a las que se les incorporen aditivos cuya acción va a desarrollarse en la elaboración de un preparado alimenticio determinado y cuya presencia en la mezcla está explicada por su mayor facilidad de dosificación y homogeneización de las materias primas a las que se va a incorporar. (Real Decreto 2242/1984 de 26 de septiembre; B.O.E. 22-12-84.) Sucedáneos de especias Son los productos elaborados con ingredientes distintos de la especia que marca su denominación, de propiedades parecidas, que adoptan la misma presentación y aspecto físico y usos que la especia genuina y están destinados a reemplazarla. (Real Decreto 2242/1984 de 26 de septiembre; B.O.E. 22-12-84.) Clasificación Arilos (macis: arilo desecado de la nuez moscada) Bulbos (ajo, cebolla) Corteza (canela) Flores y partes florales (alcaparra, azafrán clavo) Frutos (alcaravea, anis, apio, badiana, cardamomo, cilantro, comino, enebro, hinojo, pimentón, pimienta blanca, pimienta de Cayena, pimienta de Jamaica, pimienta negra, vainilla) Hojas y sumidades (ajedrea, artemisa, espliego, estragón, hierbabuena, laurel, mejorana, menta, orégano, perejil, poleo, romero, salvia, tomillo) Rizomas y raíces (cálamo, cúrcuma, galanga, jengibre) Semillas (ajonjolí o sésamo, mostaza, nuez moscada) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE CONDIMENTOS Y ESPECIAS — — — — — —
Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C). Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales. Investigación y recuento de Escherichia coli. Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de Bacillus cereus. Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores esporulados anaerobios.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Sal y salmueras comestibles Preparar, asépticamente, una suspensión madre del producto (1:10), utilizando como diluyente agua de triptona (TW) (v. pág. 11). Salsas de mesa Preparar, asépticamente, una suspensión madre del producto (1:10) por mezcla y homogeneización en el diluyente agua de triptona (TW) (v. pág. 11). Condimentos y especias En las especias la preparación de la muestra es distinta, según el tipo que se analice: — Especias en grano, nuez o trozos, siempre que su dureza impida la tritura ción (granos de pimienta, nuez moscada, coriandro, cúrcuma, etc.). En este caso se pesan las especias en un matraz estéril con perlas de vidrio y se añade el diluyente (agua de triptona: TW) (v. pág. 11) en cantidad suficiente para obtener una dilución al 1:10. Muestra y diluyente se mantienen en contacto durante 45 minutos para revivificar la flora. Al final de este tiempo, agitar durante 15 minutos, a intervalos, para homogeneizar. Con el liquido de la maceración se prepara la «serie de diluciones decimales». — Especias troceadas pero triturables (canela vainilla y todas las de forma de hoja). El producto se pesa, asépticamente, de forma directa en el homogeneizador, en un matraz estéril, con perlas de vidrio o en bolsas de plástico estériles, si se utiliza el Stomacher. — Especias en polvo. Se pesa el producto, asépticamente, en el homogeneizador o en bolsa de plástico. En los dos últimos casos, el producto se mezcla con el diluyente (agua de triptona: TW) (v. pág. 11) para obtener una dilución 1:10, dejándolos en contacto durante 25 minutos para que se revivifiquen los gérmenes y se sedimente el liquido o llevando a cabo una trituración con sedimentación posterior. La revivificación tendrá lugar a temperatura comprendida entre 20-25 °C. ANÁLISIS Sal y salmueras Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Investigación de Salmonella (v. cap. 7)
CONDIMENTOS Y ESPECIAS
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Salsas de mesa Tomate frito — Diluciones decimales (v. pág. 11). — Investigación y recuento de Bacillus cereus (v. cap. 11). — Investigación y Salmonella- Shigella (v. caps. 7 y 8). Ketchup, catsup o catchup — — — —
Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales (v. cap. 6) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8)
Mayonesa o mahonesa y salsa fina (analizar como ketchup). Mostaza (analizar como ketchup). Otras salsas (analizar como ketchup). Condimentos y especias Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores esporulados anaerobios (v. cap. 9) Investigación de Salmonella (v. cap. 7) CRITERIO MICROBIOLOGICO PARA CONDIMENTOS Y ESPECIAS En la legislación española existen las siguientes Normas Microbiológicas para Condimentos y Especias. Sal y salmueras comestibles En el Real Decreto 1424/1983 de 27 de abril (B.O.E. 1-6-83) se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la obtención, circulación y venta de la sal y salmueras comestibles, especificándose que la sal, envasada y dispuesta para el consumo, no contendrá más de 20.000 gérmenes banales por gramo y estará exenta de gérmenes patógenos. Para la salmuera, señala que la flora bacteriana estará exenta de bacterias patógenas.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Salsas de mesa El Real Decreto 858/1984 de 28 de marzo (B.O.E. 10-5-84) aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración, circulación y comercio de salsas de mesa, especificándose: Tomate frito Salmonella-Shigella Bacillus cereus
Ausencia/25 g Máximo 1 x l0col./g
Ketchup, mayonesa y mostaza Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) Enterobacteriaceae totales Salmonella-Shigella
Máximo 1 X 104/g Máximo 1 x l0col./g Ausencia/25 g
Otras salsas Enterobacteriaceae totales Salmonella-Shigella
Máximo 1 x 10/g Ausencia/25 g
Condimientos y especias En el Real Decreto 2242/1984 de 26 de septiembre (B.O.E. 22-12-84) se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración, circulación y comercio de condimentos y especias, especificándose: Las especias y condimentos estarán libres de parásitos en cualquiera de sus formas. No contendrán microorganismos patógenos o sus toxinas, y se tolerarán los siguientes límites máximos: Escherichia coli Salmonella Clostridium sulfito-reductores esporulados anaerobios
1 x 1 0 col./g Ausencia/25 g 1 x 103 col./g
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Alimentos estimulantes y derivados («Alimentos estimulantes y derivados». Capítulo XXV del Código Alimentario Español)
DEFINICIONES Café Son las semillas sanas y limpias procedentes de las diversas especies del género botánico Coffea. (Real Decreto 664/1983 de 2 de marzo; B.O.E. 30-3-83.) Denominaciones — — — — — — —
Café de tueste natural. Café torrefacto. Café de tueste natural y café torrefacto. Café molido de tueste natural. Café molido torrefacto. Café molido. Café soluble o instantáneo.
(Real Decreto 664/1983 de 2 de marzo; B.O.E. 30-3-83.) Café descafeinado Es aquel desprovisto de la mayor parte de la cafeína. (Real Decreto 664/1983 de 2 de marzo; B.O.E. 30-3-83.) Sucedáneos de café Son los productos de origen vegetal, tostados, destinados a efectuar preparaciones que reemplacen a la infusión de café como bebida fruitiva. (Real Decreto 2323/1985 de 1 de diciembre; B.O.E. 14-12-85.): 361
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
— Achicoria tostada. — Malta de cebada tostada. — Cebada tostada. Té Son las hojas jóvenes y las yemas, sanas y limpias, de las distintas especies del género botánico Thea, en buen estado de conservación, convenientemente preparadas para el consumo humano que posean el aroma y gusto característicos de su variedad y zona de producción: — — — — — —
Té verde. Té negro o té. Té semifermentado o té colong. Té descafeinado. Extracto soluble de té. Té aromatizado.
(Real Decreto 2362/1985 de 4 de diciembre; B.O.E. 21-12-85.) Especies vegetales para infusiones de uso en alimentación Son aquellas especies vegetales, o sus partes, que, debido al aroma y sabor característicos de la especie a que pertenecen, se utilizan en alimentación por su acción fisiológica. (Real Decreto 3176/1983 de 16 de noviembre; B.O.E. 28-12- 83.) Denominaciones — — — — — — — — — — — — — — — — — —
Anis estrellado. Anis verde. Azahar. Escaramujo. Eucalipto. Hibisco. Hierba luisa. Hinojo. Malva. Manzanilla. Manzanilla amarga. Manzanilla de Mahón. Mejorana. Melisa. Menta. Menta poleo. Romero. Salvia.
AUMENTOS ESTIMULANTES Y DERIVADOS
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Saúco. Tila. Tomillo. Verbena. Zarzaparrilla
(Real Decreto 3176/1983 de 16 de noviembre; B.O.E. 28-12- 83.) Infusión Es el producto líquido obtenido por la acción del agua, a temperatura de ebullición, sobre la especie vegetal, con el objeto de extraer sus sustancias solubles. (Real Decreto 3176/1983 de 16 de noviembre; B.O.E. 28-12-83.) Extracto soluble Es el producto soluble en agua, obtenido por parcial o total evaporación de la infusión de la especie vegetal correspondiente. (Real Decreto 3176/1983 de 16 de noviembre; B.O.E. 28-12-83.) Granos de cacao Son las semillas del cacao (Theobroma cacao. L.), fermentadas y secadas. (Real Decreto 822/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.) Cacao en grano Son los granos de cacao, tostados o no, cuando han sido limpiados, descascarillados y desgerminados. (Real Decreto 822/1990 de 22 de junio; B.O.E. 286-90.) Finos de cacao Elementos de granos de cacao que se presentan en forma de pequeñas partículas, recogidas separadamente en el momento del descascarillado y del desgerminado. (Real Decreto 822/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.) Cacao en pasta El cacao en grano, reducido a pasta por medio de un procedimiento mecánico y que no ha sido privado de ninguna parte de su materia grasa natural. (Real Decreto 822/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Torta de cacao El cacao en grano o en pasta, transformado en torta por un procedimiento mecánico. (Real Decreto 822/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.) Cacao en polvo La torta de cacao, obtenida por presión hidráulica, transformada en polvo por un procedimiento mecánico. (Real Decreto 822/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.) Manteca de cacao La materia grasa obtenida a partir de granos de cacao o de parte de granos de cacao. (Real Decreto 822/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.) Chocolate El producto obtenido a partir de cacao en grano, de cacao en pasta, de cacao en polvo o de cacao magro en polvo y de sacarosa con o sin adición de manteca de cacao: chocolate a la taza, chocolate familiar, chocolate familiar a la taza, chocolate con frutos secos, chocolate con leche, chocolate blanco, chocolate relleno, bombón de chocolate, etc. (Real Decreto 822/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.) Derivados de cacao, de chocolate y sucedáneos de chocolate Son los productos destinados a la alimentación humana que se definen a continuación: Cacao azucarado en polvo con harina, cacao azucarado con harina El producto destinado a su consumo, previa cocción, obtenido mediante la mezcla de cacao en polvo, de sacarosa y harina o fécula de trigo, arroz o maíz. (Real Decreto 823/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.) Cacao familiar azucarado en polvo con harina, cacao familiar azucarado con harina El producto destinado a su consumo, previa cocción, obtenido mediante la mezcla de cacao en polvo, sacarosa y harina o fécula de trigo, arroz o maíz. (Real Decreto 823/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.)
ALIMENTOS ESTIMULANTES Y DERIVADOS
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Cacao magro azucarado en polvo con harina, cacao magro azucarado con harina, cacao desgrasado azucarado en polvo con harina, cacao desgrasado azucarado con harina El producto destinado a su consumo, previa cocción, obtenido mediante la mezcla de cacao magro en polvo, sacarosa y harina o fécula de trigo, arroz o maíz. (Real Decreto 823/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.) Cacao magro familiar azucarado en polvo con harina, cacao magro familiar azucarado con harina, cacao desgrasado familiar azucarado con harina El producto destinado a su consumo, previa cocción, obtenido mediante la mezcla de cacao desgrasado en polvo, sacarosa y harina o fécula de trigo, arroz o maíz. (Real Decreto 823/1990 de 22 de junio; B.O.E. 28-6-90.) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS ESTIMULANTES Y DERIVADOS — — — — —
Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C). Investigación y recuento de Escherichia coli. Investigación de Salmonella-Shigella. Investigación y recuento de Bacillus cereus. Investigación y recuento de mohos.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Preparar, asépticamente, una suspensión madre (1:10), utilizando como diluyente agua de triptona (TW) (v. pág. 11), mediante la mezcla, trituración y/u homogeneización de producto y diluyente. ANÁLISIS Diluciones decimales (v. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Investigación y recuento de Escherichia coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella-Shigella (v. caps. 7 y 8) Investigación y recuento de Bacillus cereus (v. cap. 11) Investigación y recuento de mohos (v. cap. 16)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
CRITERIO MICROBIOLOGICO PARA ESTIMULANTES Y DERIVADOS Existe Norma Microbiologica aplicable al Té. (Real Decreto 1534/1483 de 27 de abril; B.O.E. 27-5-83.) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) Escherichia coli Salmonella-Shigella Bacillus cereus Recuento de mohos
Máximo 1 x 106 col./g Máximo 1 x 104 col./g Ausencia/25 g Máximo 1 x 102/g Máximo 1 x 104/g
La Norma Microbiológica del Té puede ser aplicada a otras infusiones vegetales. En ambos productos no deberán existir parásitos ni sus huevos.
Para cacao, chocolate, derivados de cacao y chocolate y sucedáneos de chocolate, los Reales Decretos 822/1990 y 823/1990 de 22 de junio (B.O.E. 28-6-90) especifican que: no contendrán cuerpos extraños ni gérmenes patógenos o perjudiciales para el consumidor o para el propio producto. Se aconseja al técnico la observación de la posible presencia de parásitos o sus huevos.
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Conservas animales y vegetales («Conservas animales y vegetales. Capítulo XXVII del Código Alimentario Español)
Los productos en conserva forman parte de uno de los tres grandes grupos en que, habitualmente, se dividen los alimentos: — Crudos. — Estabilizados. — Conservados. Las características principales exigibles en una conserva son: — Inocuidad para el consumidor. — Mantenimiento inalterable de sus caracteres organolépticos durante largos periodos de tiempo. Para lograr la inocuidad de una conserva, sería suficiente con utilizar un tratamiento térmico elevado, lo que, por otra parte, daría lugar a que los caracteres organolépticos del producto envasado sufrieran una modificación sensible. Por esta causa, se suelen tener en cuenta dos conceptos respecto a la esterilidad de las conservas: — Esterilidad biológica. — Esterilidad comercial. En la esterilidad biológica existe una ausencia total de microorganismos y sus toxinas, así como la inactivación absoluta de enzimas celulares y microbianas. En la esterilidad comercial no deben existir formas vegetativas, esporos de bacterias patógenas o toxígenas ni microorganismos capaces de alterar el producto. Las enzimas celulares y microbianas deberán estar inactivadas. En las conservas de esterilidad comercial se toleran esporos pertenecientes a la familia Bacillaceae no patógenos, no toxígenos e inertes, es decir, incapaces de germinar. DEFINICIONES En un sentido amplio, con la denominación de conservas se incluyen aquellos productos que, generalmente esterilizados, permanecen sin contaminar a 367
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
temperatura ambiente durante largos periodos de tiempo. Según el tipo de alimento, las conservas tienen una vida útil que puede variar entre 6 meses y varios años. La esterilidad comercial se puede definir como aquella condición de un alimento que es consecuencia de un tratamiento, generalmente térmico, aplicado para lograr que esté libre de gérmenes patógenos o que sean incapaces de multiplicarse en él en condiciones de temperatura ambiente durante su almacenamiento y distribución. Otra definición de conservas las considera como «productos alimenticios preparados en recipientes metálicos, de vidrio o de plástico, que tienen cierre hermético y han sido sometidos a un tratamiento que debe garantizar la destrucción de todas las formas bacterianas vegetativas o esporuladas y de cualquier enzima». En Francia (Decreto 10-2-55), las conservas se definen como «productos alimentarios de origen vegetal o animal, perecederos, cuya conservación está asegurada por el empleo combinado de las dos técnicas siguientes: — Acondicionamiento en recipientes impermeables a los líquidos, gases y microorganismos a temperatura inferior a 55 °C. — Tratamiento por el calor u otro procedimiento autorizado. Este tratamiento tendrá por finalidad destruir o inhibir totalmente, por una parte, las enzimas y, por otra, los microorganismos y sus toxinas, cuya proliferación o presencia podrían alterar el producto considerado o hacerlo impropio para la alimentación humana». CLASIFICACIÓN Teniendo en cuenta su tecnología, y con fines de control, las conservas se suelen clasificar: — Según el pH. — Según el envase. Clasificación según el pH De acuerdo con el valor del pH del producto envasado, las conservas se clasifican en: — Conservas no acidas, de pH superior a 4,5. — Conservas acidas, de pH inferior a 4,5. Las conservas de pH superior a 4,5 exigen un tratamiento térmico elevado, de acuerdo con un baremo de esterilización adecuado previamente estudiado. Las conservas de pH inferior a 4,5 se someten, generalmente, a un tratamiento térmico que gira alrededor de los 100 °C, temperatura suficiente para destruir la flora acidófila (bacterias, levaduras y mohos). Basándose igualmente en el pH del contenido, las conservas se pueden clasificar en:
CONSERVAS ANIMALES Y VEGETALES
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Poco acidas, con pH superior a 5,3: carne, pescado, etc. De acidez media, con pH entre 5,3 y 4,5: legumbres, verduras, etc. Acidas, con pH entre 4,3 y 3,7. Muy acidas, con pH inferior a 3,7: choucroute y similares.
Clasificación según el envase Teniendo en cuenta el envase que las contiene, las conservas se pueden clasificar en: — Conservas en envases metálicos herméticamente cerrados. — Conservas en envases de vidrio, cerrados con cápsulas metálicas o de plástico, al vacío. — Conservas en envases de plástico flexible o duro cerradas por termosellado o cápsula. — Conservas en envases de cartón parafinado o de plástico, estériles, donde se introduce asépticamente el producto previamente esterilizado. El envase se cierra mediante cápsula o termosellado. CARACTERÍSTICAS DE LAS CONSERVAS DE PH INFERIOR Y SUPERIOR A 4,5 En las conservas de pH inferior a 4,5 (acidas o muy acidas), no se puede desarrollar la especie bacteriana Clostridium botulinum ni algunas otras especies del género Clostridium. Por esta razón, la tecnología utilizada para la elaboración de este tipo de conservas exige unos haremos de esterilización que aseguren la destrucción de las formas vegetativas de los gérmenes patógenos que puedan sobrevivir en los alimentos ácidos, así como de la flora acidófila: levaduras, mohos (Byssochlamis), Lactobacillus y Leuconostoc, especies de Clostridium del grupo butírico y otras del género Bacillus (Bacillus macerans), ya que todos ellos, al desarrollarse en las conservas, pueden dar lugar a fenómenos de alteración. En conservas acidas, son capaces de persistir, sin germinar, esporos del género Bacillus. Las conservas de pH superior a 4,5 (poco acidas y de acidez media) son más peligrosas, puesto que el pH ya no es una barrera que inhiba la multiplicación de los gérmenes o la germinación de los esporos. En estas conservas se necesitan baremos de esterilización altos, muy estudiados y comprobados, para lograr: — La destrucción de formas vegetativas y esporos de Cl. botulinum, así como de otros Clostridium toxinógenos. — La destrucción de bacterias patógenas (Salmonella, St. aureus enterotoxigénico, Vibrio parahaemolyticus, etc.) — La ausencia de toxinas, botulínicas y estafilocócicas, particularmente. El comportamiento de estas dos toxinas en las conservas es distinto: • La toxina botulínica, al ser termolábil, se destruye fácilmente durante el proceso de esterilización en el caso de que se hubiera preformado previamente en el alimento antes del comienzo de dicho proceso.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Si el calor utilizado durante la operación de esterilización en autoclave ha sido insuficiente para destruir posibles esporos de Clostridium botulinum inertes, éstos, favorecidos por el ambiente anaerobio y el aporte nutricional del producto envasado, germinan y dan lugar a nuevas formas vegetativas que, al multiplicarse, producen toxina botulínica. En este caso, la aparición de la toxina tiene lugar posteriormente a la esterilización de la conserva. Para evitar la formación de toxinas botulínicas, es imprescindible calcular un baremo de esterilización que asegure la destrucción de los esporos de Cl. botulinum, mediante la utilización de bacterias testigo esporuladas, aerobias y anaerobias, cuya resistencia térmica sea similar o superior a la de los esporos de este microorganismo. • La enterotoxina estafilocócica se puede preformar en el alimento antes de su esterilización, como consecuencia de una multiplicación activa de St. aureus enteroxigénico. Cuando la materia prima está muy contaminada con éste, cabe el peligro de que su multiplicación excesiva produzca una cantidad suficiente de toxina capaz de constituir un riesgo para la salud del consumidor. La enterotoxina estafilocócica es termoestable y, debido a que a veces la acción de la temperatura es variable, la conducta a seguir por la industria conservera debe ir encaminada a evitar la multiplicación del germen antes de la esterilización del producto. — La inactivación de enzimas orgánicas o microbianas. — Respecto a esporos no pertenecientes a Clostridium botulinum o a otros Clostridium toxinógenos, se puede admitir en una conserva comercial la presencia de un pequeño número de esporos inertes de la familia Bacilla ceae, incapaces de germinar y multiplicarse en el producto conservado.
ALTERACIONES DE ORIGEN MICROBIANO: PROCEDENCIA DE LA FLORA ALTERANTE Las conservas pueden contener, anormalmente, microorganismos revivificables debido a causas diversas, principalmente: — Por tratamiento térmico insuficiente. — Por microfugas en los envases. En el caso de un tratamiento térmico insuficiente, pudiera ocurrir que: — El baremo de esterilización aplicado fuera correcto pero, si se ha partido de materias primas excesivamente contaminadas, se encuentren en la conserva esporos de Bacillaceae termorresistentes, como ciertas especies de los géneros Bacillus y Clostridium. — El baremo de esterilización fuera insuficiente, por lo que se podrían encontrar Bacillaceae termorresistentes y otros gérmenes de naturaleza variada, termosensibles. El mayor riesgo está en el primer caso, puesto que existe la posibilidad de persistencia de esporos pertenecientes a la especie Cl. botulinum.
CONSERVAS ANIMALES Y VEGETALES
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El crecimiento microbiano en el segundo caso se descubre más fácilmente puesto que se manifiesta por el abombamiento del envase. Las alteraciones ocasionadas por esterilización insuficiente se deben, generalmente, a los siguientes microorganismos:
Cuando se trata de microfugas, se considera que la conserva ha sido esterilizada correctamente, pero determinados defectos del envase facilitan la penetración de microorganismos desde el exterior, especialmente si se utilizan aguas contaminadas para el enfriamiento de las conservas una vez esterilizadas.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Los tipos de alteración en este último caso son variados, según el germen contaminante. De acuerdo con la posibilidad de desarrollo de determinados gérmenes en el interior de la conserva, se pueden producir distintos tipos de alteración. Alteración por bacterias esporuladas termófilas Cuando en una conserva se hace posible el crecimiento de algunas especies de bacterias esporuladas termófilas, se puede producir: Acidificación Denominada también fíat sour por los anglosajones. Esta alteración se presenta, sobre todo, en conservas de legumbres. Está provocada por el desarrollo de Bacillus termófilos y, a veces mesófílos, cuyos esporos han resistido el tratamiento térmico aplicado al producto. El agente causal en las legumbres suele ser Bacillus stearothermophilus. En las conservas acidas intervienen, preferentemente, B. thermoacidurans y B. thermoaceticum. Ambas especies están integradas por bacilos esporulados termófilos, con metabolismo muy activo por lo que, si logran multiplicarse en la conserva, la alteran rápidamente. Si las bacterias esporuladas termófilas se desarrollan muy activamente en la conserva, sufren el fenómeno de «autoesterilización», frecuente en los microorganismos termófilos. En conservas alteradas con fíat sour se observa que no existen células bacterianas viables cuando se siembra el alimento en medios de cultivo mientras que, por examen bacterioscópico, se hacen visibles abundantes cadáveres bacterianos «autoesterilizados». La alteración que nos ocupa se caracteriza porque, al ser inspeccionado el envase, no presenta anormalidad aparente, sus bases están planas. El contenido es ácido, por la producción de ácido láctico, pero no gasógeno. Abombamiento El abombamiento de una conserva, sin tener en cuenta su origen, consiste en una sobrepresión interna del envase como consecuencia de la producción de gas que puede, incluso, originar su explosión. Él abombamiento propiamente dicho resiste a la presión manual del envase. Existe otra clase de abombamiento en el cual la alteración es más fácilmente depresible (flochage de los franceses). El abombamiento de origen bacteriano es consecuencia del crecimiento y multiplicación de una determinada bacteria que produce gas a expensas de los constituyentes del alimento envasado. El abombamiento por crecimiento de bacterias esporuladas termófilas se encuentra, sobre todo, en conservas poco acidas o de acidez media. El agente responsable suele ser Clostridium thermosaccharolyticum, bacilo esporulado termófilo anaerobio estricto. En esta alteración se produce un hinchamiento de las paredes del envase y, sobre todo, de las bases del recipiente metálico o de las cápsulas del envase de vidrio, que es consecuencia de una excesiva presión interna,
CONSERVAS ANIMALES Y VEGETALES
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por producción de gas. En el caso concreto de abombamiento por Cl. thermosaccharolyticum, el contenido es ácido y el olor a ácido butírico. Ennegrecimiento Alteración muy corriente debida al crecimiento de Clostridium nigrificans, esporulado anaerobio termófilo productor de SH, Se suele encontrar en algunas conservas poco acidas, sobre todo guisantes. En esta alteración, el envase se muestra más o menos abombado y el contenido presenta color negro y desprende olor pútrido. Alteración por bacterias esporuladas mesófílas Estas bacterias originan varios tipos de alteración, como consecuencia de un tratamiento térmico defectuoso. Acidificación Es una alteración similar a la descrita para bacterias esporuladas Termóphilas, pero más frecuente. Es provocada, sobre todo, por Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis y Bacillus pumilus. Además de la acidificación, se produce un reblandecimiento (pectinolisis) en consejas poco acidas. Abombamiento Esta alteración es originada por varios gérmenes esporulados mesófilos. Se conocen diversos tipos: — Abombamiento con fermentación butírica, producido al desarrollarse algunas bacterias esporuladas anaerobios mesófílas sacarolíticas (Cl. butyricum, Cl. pasteurianum y, a veces, Cl. perfringens). Se produce una fermentación del alimento, con acidificación y desprendimiento de gran cantidad de gas (H2 y CO2), que causa el abombamiento del envase, incluso con su estallido. Esta alteración es propia de productos de pH inferior a 4,5 y de conservas de tipo familiar que han sufrido un tratamiento térmico bajo. — Abombamiento con putrefacción. Producido al desarrollarse algunas bacterias esporuladas anaerobias mesófílas pútridas (Cl. sporogenes, Cl. putrefaciens, Clostridium perfringens, Cl. bifermentans, Cl. carnofoetidum, Cl. carnis, Cl. aerofoetidum, Cl. hystoliticum). Como consecuencia del crecimiento de estos gérmenes sobre el alimento, se produce la descomposición de las proteínas con liberación de compuestos de la putrefacción: indol, amoniaco, escatol, aminas, sulfhídrico, mercaptanos, etc. En este tipo de abombamiento tiene lugar también una digestión parcial del contenido de la conserva con desprendimiento de olor pútrido desagradable.
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La alteración se encuentra en conservas de carne y pescado que han sufrido un tratamiento térmico insuficiente. El Clostridium botulinum puede formar parte de esta alteración puesto que sus esporos son termorresistentes. Si la proliferación de este germen es débil, no se manifiesta el abombamiento del envase ni la alteración del producto, pero constituye, sin embargo, un alto riesgo dada la gran toxicidad de sus toxinas. — Abombamiento por desprendimiento de nitrógeno, ocasionado por desarrollo de bacilos denitrificantes al transformar los nitratos en nitritos, como por ejemplo, Bacillus circulans. — Abombamiento por la multiplicación de bacterias gasógenas (Bacillus polimyxa y Bacillus macerans) en conservas poco acidas o de acidez media. Alteración por bacterias no esporuladas La presencia de este tipo de bacterias se debe a que han podido sobrevivir en la conserva por distintas causas: — Esterilización insuficiente por fallo en el tratamiento térmico. Algunas especies bacterianas no esporuladas son termodúricas, por lo que resisten el tratamiento a temperaturas relativamente altas aunque no las necesiten para su desarrollo habitualmente. Por esta circunstancia, si sobreviven en la conserva, pueden ser causa de su alteración. — Penetración de este tipo de bacterias desde el exterior a través de microfisuras del envase (sertidos defectuosos, porosidades, desperfectos originados por choques, mala calidad del material del envase, etc.) En el caso de esterilización insuficiente, se considera que las bacterias no esporuladas más resistentes son: Streptococcus thermophilus y algunas especies de Micrococcus, Lactobacillus y Microbacterium. Estos microorganismos pueden crecer en alimentos ácidos como consecuencia de haber sufrido la conserva un tratamiento térmico bajo. La alteración se manifiesta por el agriado del producto, con o sin producción de gas. Debido a que los mohos y las levaduras se destruyen fácilmente por el calor, su presencia en las conservas indica esterilización insuficiente. No obstante, hay mohos cuyas esporas tienen una termorresistencia elevada. Se desarrollan, sobre todo, en conservas acidas. Las levaduras suelen provocar fermentación alcohólica, con desprendimiento de CO2 y, por consiguiente, abombamiento del envase. Cuando se trata de microfisuras, puede producirse la penetración accidental de gérmenes desde el exterior, sobre todo a partir del agua de enfriamiento. La alteración que se produzca depende del germen o gérmenes contaminantes que hayan logrado introducirse en la conseja. Alteración de la calidad higiénico-sanitaria Con respecto a la calidad higiénico-sanitaria de las conservas, por lo general, sólo existe riesgo de toxiinfección alimentaria en aquellas de pH superior a 4,5
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(no acidas). Las de pH inferior a 4,5 (acidas) sólo excepcionalmente permiten el crecimiento de bacterias patógenas o toxinógenas. El crecimiento de gérmenes patógenos en una conserva altera, habitualmente, sus caracteres organolépticos, por lo que el propio consumidor la rechaza. Esto no siempre es así, puesto que a veces, aunque el producto no esté alterado aparentemente, contiene flora patógena, circunstancia que supone un enorme riesgo. Es el caso, por ejemplo, de la presencia de Cl. botulinum tipos A, B y E, capaces de multiplicarse y elaborar toxinas, así como de St. aureus enterotoxigénico que, igualmente, podría producir enterotoxina estafilocócica al tener oportunidad de multiplicarse en el producto. Respecto a Clostridium botulinum, concretamente, si el microorganismo logra multiplicarse abundantemente en una conserva que reúna las condiciones óptimas para ello, se produce la alteración de los caracteres organolépticos del producto envasado, modificándose su consistencia por desintegración de las proteínas, dando lugar a olor pútrido y desprendimiento de gas que ocasiona el abombamiento del envase. Si, por el contrario, el crecimiento de Cl. botulinum es moderado, puede ocurrir que los caracteres organolépticos del contenido sean aparentemente normales, a pesar de que la cantidad de toxina botulínica elaborada sea suficiente para producir intoxicación. Esto puede darse en cualquier tipo de conserva de pH superior a 4,5 y es interesante señalar que, en conservas de pescado causantes de brotes de botulismo, la mayoría de las veces no existe alteración del envase ni del producto envasado. Para el desarrollo y multiplicación de Cl. botulinum en las conservas influyen decisivamente algunas condiciones: — Capacidad del alimento para que se pueda desarrollar en él esta especie bacteriana, de acuerdo con: • La calidad nutritiva del sustrato. • El valor del pH. • Características del material de envasado; existen datos sobre la influencia favorable del lacado de la superficie interna del envase para la elaboración de toxina botulínica. — Características toxigénicas de la cepa de Cl. botulinum. Unas toxinas ejercen su efecto a diluciones más altas que otras. — Cantidad de inoculo presente en la conserva. — Posibilidad de asociación microbiana acompañante que, al crecer, modifique el pH del sustrato haciendo posible el crecimiento de Cl. botulinum inhibido por el pH primitivo. — Inhibición por causas ajenas al pH: baja actividad de agua (aw), tasa de cloruro sódico y nitritos incompatibles con el crecimiento de Cl. botulinum, concentración elevada de azúcar, etc. Dentro de los distintos tipos de Clostridium botulinum, el tipo E tiene algunas características especiales, como su facultad de microorganismo psicrotrófico, capaz de multiplicarse y elaborar toxina a 3,3 °C. Por otra parte, Clostridium botulinum tipo E, al ser preferentemente de origen pisciario, produce botulismo por la ingestión de conservas de pescado, dándose con más frecuencia en pescados
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grasos (sardina, aguja, arenque, bacalao, salmón, etc.), debido a que los ácidos grasos de estos peces favorecen la multiplicación del germen y la elaboración de toxina. La presencia de toxina botulínica en consejas se debe, generalmente, a deficiencias en la esterilización. En lo que se refiere a St. aureus enterotoxigénico, no hay constancia de casos de intoxicación estafilocócica por consumo de consejas, aunque cabe la posibilidad de crecimiento en estos productos en determinadas ocasiones. La presencia de enterotoxina estafilocócica seria posible en alimentos conservados cuya materia prima estuviese muy contaminada con St. aureus enterotoxigénico antes del proceso de esterilización. La presencia de St. aureus enterotoxigénico revivificable en una conserva se debe a fisuras o microfugas en el envase. Hay que señalar que, respecto a otras bacterias, existen datos en cuanto a la presencia de Salmonella en productos conservados que han sido causa de brotes de toxiinfección alimentaria, a veces por Salmonella typhi presente en el agua de enfriado y que penetró en la conserva a través de microfisuras.
CONTROL MICROBIOLOGICO DE LAS CONSERVAS Este control se establece a dos niveles: — Control de rutina para comprobar que las conservas no han sufrido modificaciones después de haber sido sometidas a una incubación previa: control de estabilidad. — Control completo realizado generalmente cuando existan problemas de alteración o si se desea poner a punto un baremo de esterilización: control de esterilidad. El control de estabilidad se puede realizar en fábrica, mientras que el control de esterilidad requiere un examen delicado y minucioso por parte de laboratorios especializados. Control de estabilidad Se trata de un control simplificado con el que se logra analizar un considerable número de muestras. Consiste en someter a incubación parte de las muestras del mismo lote que se va a controlar, con el fin de comprobar posteriormente si se han producido modificaciones sensibles cuando se comparan con una muestra del mismo lote no incubada y que sirve como testigo. Pasado el tiempo de incubación, se procede a: — Estudiar el aspecto del envase incubado, comparado con el envase normal no incubado (testigo). — Comprobar si existe variación de pH entre el producto incubado y el no incubado (testigo).
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— Realizar un examen bacterioscópico del alimento con recuento de gérmenes, comparando la flora microbiana del contenido del envase incubado con la del envase no incubado (testigo). Control de esterilidad Constituye un análisis completo reservado, habitualmente, a laboratorios especializados. Está indicado cuando, después del control de estabilidad, se ha manifestado una alteración positiva o dudosa, o cuando se trate de conservas alteradas espontáneamente. Este control consiste en comprobar si el alimento conservado alberga microorganismos revivificables y, en caso positivo, determinar su naturaleza para poder explicar la falta de estabilidad. En el examen se comprueba: — La morfología de la flora microbiana revivificable. — La termorresistencia de esta misma flora. — La temperatura óptima de crecimiento. ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LAS CONSERVAS Exige varias etapas. Muestreo Consiste en la separación de cierto número de unidades pertenecientes a un lote (lote: cantidad de alimento producida y manipulada en condiciones idénticas). Como es imposible someter todo un lote de alimentos al análisis microbiológico, se necesita recurrir a la utilización de una muestra representativa constituida por un conjunto de unidades cuyo análisis pueda reflejar con la máxima fiabilidad el estado del lote del que procede. El problema del muestreo es controvertido y difícil, por lo que se aconseja seguir en cada caso las conclusiones de la ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods). Lavado de los envases Antes de proceder al análisis microbiológico de las conservas, es buena práctica lavar cada uno de los envases con agua jabonosa y aclarar después con agua potable para, al día siguiente, dar comienzo al análisis. Examen macroscópico preliminar de los envases Consiste en comprobar el estado de las conservas para descubrir posibles defectos o alteraciones tales como:
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— — — —
Abombamiento. Oxidación. Microfugas. Deformaciones.
Incubación Una vez realizado el examen externo de los envases, se someten a incubación (solamente los no alterados) para controlar la estabilidad del producto envasado. La incubación tiene por objeto: — Permitir la germinación de los esporos aletargados. — Conseguir el crecimiento de microorganismos mesófilos, utilizando tiempos de incubación prolongados, a temperatura adecuada. — Conseguir el crecimiento de microorganismos termófilos, utilizando tiempos de incubación limitados, a temperatura adecuada (55 °C durante 10 días, como máximo), para evitar el fenómeno de la autoesterilización de la conserva. Previamente, se hacen tres grupos con las unidades de muestra del mismo lote que se va a analizar: — Grupo al que se aplica temperatura de mesófilos para posibilitar su crecimiento. — Grupo al que se aplica temperatura de termófilos para posibilitar su crecimiento. — Grupo que permanece a temperatura ambiente y sirve de testigo. Para que puedan crecer posibles gérmenes mesófilos en el interior de la conserva, se colocan los envases en estufa regulada a 31 °C ± 1 °C durante 28 días. Para los termófilos se utiliza una temperatura de 55 °C durante un máximo de 10 días. La temperatura de 55 °C para termófilos no es ideal a veces, ya que algunas cepas bacterianas de este grupo se desarrollan mejor a 45 °C. Mossel aconseja una pauta de incubación que se podría resumir de la forma siguiente: — Conservas de pH inferior a 4,5 (7 días a 31 °C ± 1 °C). — Conservas de pH superior a 4,5: • Mitad lote (28 días a 31 °C ± 1 °C). • Mitad lote (10 días a 45 °C; 10 días a 55 °C). — Conservas almacenadas más de 1 año (14 días a 31 ± 1 °C). — Conservas sin incubar (testigos). Microbiólogos franceses estiman que es necesaria una incubación de 31 °C ± 1 °C durante 21 días para conservas acidas (pH inferior a 4,5), teniendo en cuenta que los gérmenes que se desarrollan habitualmente en las mismas no son termófilos. Para conservas no acidas (pH superior a 4,5), señalan una incubación de 31 °C ± 1 °C durante 21 días para mesófilos y de 55 °C durante 7 días para termófilos. Se mantiene un envase a temperatura ambiente como testigo.
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En Francia, para conservas de origen animal, se establece el Decreto 21-12-79, en el que se exige, para conservas de pH superior a 4,5 una incubación a 37 °C durante 7 días o de 35 °C durante 10 días. El desarrollo microbiano producido durante la fase de incubación puede dar lugar a la aparición de unos signos no observados en el examen macroscópico preliminar (abombamiento, rezumamiento, flat sour; etc.) y que revelan falta de estabilidad de la conserva. Si la deficiencia de estabilidad es poco manifiesta por escasa alteración del envase, se puede confirmar por la modificación del pH al final de la incubación. Los envases destinados a ser incubados se colocan dentro del incubador, a la temperatura adecuada, sobre hojas de papel de filtro blanco para descubrir con más facilidad las microfugas, que se manifestarán por el rezumado del contenido en forma de manchas en el papel. Las conservas mantenidas en incubación deberán ser observadas diariamente para comprobar si se producen alteraciones y evitar, en caso de abombamiento, que puedan explotar. Examen externo del envase después de la incubación Transcurrido el tiempo de incubación, es necesario que las conservas se estabilicen a temperatura ambiente durante un periodo variable, comprendido entre 1 y 4 horas, antes de ser examinadas. No es necesario utilizar más tiempo en la permanencia de los envases a temperatura ambiente, excepto cuando es inevitable por razones de coordinación del trabajo. A continuación se examina la conserva para comprobar posibles alteraciones: — Abombamiento (de origen físico, químico o biológico). — Oxidación. — Deformación. Abombamiento: según su resistencia a la presión, la hinchazón del envase puede ser reductible (flochage de los franceses) o no reductible. El abombamiento de origen físico se debe a diversas causas, como puede ser un exceso de llenado o la deformación del envase como consecuencia de golpes. En este tipo de abombamiento, el producto es estéril y sus caracteres organolépticos normales. El abombamiento de origen químico deriva de la reacción química entre envase y contenido, con desprendimiento de R, y corrosión del metal. El contenido puede ser normal o estar ligeramente alterado. El abombamiento biológico de origen microbiano se produce como consecuencia del crecimiento de determinados gérmenes en el interior de la conserva. En este tipo de abombamiento se alteran envase y contenido. En cuanto a la oxidación, es una alteración propia de conservas mantenidas en lugares húmedos. Se debe, principalmente, a la acción de la humedad aunque, en ocasiones, sea consecuencia del desprendimiento de la capa protectora del envase metálico. No implica necesariamente el deterioro del alimento envasado pero, como puede ser causa de la rotura del envase, existe peligro de contaminación por parte de gérmenes procedentes del exterior.
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La deformación es una alteración causada generalmente por golpes. Es posible encontrar microfugas en un envase deformado, que facilitarían la entrada de flora del exterior. No deben existir diferencias en el aspecto del envase cuando se comparan las conservas incubadas y la testigo normal. El examen macroscópico de envases realizado después de la incubación se completa con el examen del contenido, comparando el de una conserva testigo no incubada y las conservas sometidas a incubación: — Estudio de caracteres organolépticos. — Medida del pH. — Examen microscópico directo. Apertura del envase y toma de muestra para el análisis Estas operaciones deben ser extremadamente cuidadosas, con el fin de evitar contaminaciones externas que podrían falsear los resultados. En el interior de la conserva existe un vacío que, al abrir el envase, da lugar a una aspiración del aire exterior por lo que, para impedir poluciones, el aire circulante debe ser estéril y resulta aconsejable el uso de cámaras de flujo laminar. — La tapa de la conserva que se va a abrir se lava enérgicamente con algodón empapado en alcohol de 70°. Se vierte una pequeña cantidad de alcohol que debe actuar durante unos minutos y desecharse después definitiva mente. La película de alcohol que permanece se flamea de forma rápida. Este flameado se omite, evidentemente, en envases abombados. — La persona que realiza las operaciones se lavará las manos cuidadosamente con agua y jabón, secándose con toallas de un solo uso. Adicionalmente, se aplicará alcohol etílico. La operación se puede hacer con guantes, guardando las mismas precauciones. Evitará tocar el alimento con las manos, estar en corrientes de aire que harían posible la dispersión de gérmenes y conversar durante el trabajo. — Cuando se trata de envases abombados, como su apertura puede suponer un peligro para el manipulador, se tomarán ciertas precauciones para protegerse de la salida violenta del contenido. Un procedimiento clásico es el uso del embudo de vidrio colocado de forma invertida sobre la conserva que, a su vez, estará colocada en una bandeja metálica. La tapa de la conserva se perfora con un punzón metálico estéril, a través del vastago del embudo. Los gases que salen por el orificio de apertura se recogen en un tubo de ensayo o en una probeta colocados en posición invertida sobre el vastago del embudo. Para detectar la presencia de H2, se aplica una pequeña llama a la boca del tubo donde se han recogido los gases; en caso positivo, se producirá una pequeña explosión. La presencia de CO, se detecta añadiendo 3 ml de hidróxido potásico al tubo que contiene los gases y agitando, previa obturación del tubo con el dedo. Cuando se crea un vacío que succiona el dedo, la prueba es positiva.
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Fig.l En el mismo tubo se puede comprobar la presencia de 5//, que se manifiesta por el ennegrecimiento de una tira de acetato de plomo aplicada a dicho tubo. — Los recipientes se abren cortando la tapa, previamente esterilizada, con una cizalla flameada, evitando tocar con la mano la zona desinfectada. La apertura se hace a cierta distancia de la línea de inserción de la tapa para evitar contaminaciones, ya que el borde es difícil de desinfectar. Recién abierto el envase, se comprueba visualmente el aspecto del producto, tomando nota de las posibles alteraciones.
Fig.2
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En la toma de muestras para el análisis, una primera operación consiste en flamear la superficie del producto envasado cuando se va a tomar la muestra analítica. Se utilizan para la toma pipetas estériles para productos líquidos y arpón, bisturí y pinzas, igualmente estériles, para sólidos. En este último caso, la toma para siembra en medios de cultivo se efectúa asépticamente, escogiendo siempre parte de la zona central que es, lógicamente, la más alejada del tratamiento térmico, y porciones de zonas localizadas en distintos puntos, haciendo con todo ello una muestra común. El ideal es, en caso de que hubiera posibilidad, hacer una toma de toda la conserva, dado que los posibles gérmenes no suelen estar repartidos de forma homogénea. Medida del pH Separada la muestra para el análisis bacteriológico, se mide el pH del producto restante, utilizando un pH metro con electrodo de vidrio. La medida se hace directamente sobre el producto si es homogéneo, y sobre un triturado cuando dicho producto es heterogéneo, utilizando como diluyeme un tampón cuyo pH se aproxime al del alimento. Examen del contenido de la conserva Consiste en observar la posible modificación de los caracteres organolépticos del producto conservado, comparando conservas incubadas con testigos sin incubar. — Olor: Putrefacto (propio, generalmente, de gérmenes esporulados anaerobios mesófilos: Cl. sporogenes, Cl. perfringens, Cl. putrefaciens, Cl. nigrificans). — Olor: Fecal (por coliformes procedentes del exterior: indican fisuras en el envase). — Olor: A ácido sulfhídrico (suele ir acompañado de ennegrecimiento: Cl. nigrificans). — Olor: A queso (por algunas especies de Clostridium). — Olor: A ácido butírico (por algunas especies de Clostridium. Cl. thermosaccharoyticum, Cl. butyricum, Cl. perfringens, Cl. pasteurianum). — Aspecto: Textura blanda, dura, digerida, etc. — Aspecto: Consistencia líquida, viscosa, filante, etc. — Aspecto: Elementos extraños. — Sabor: No se debe comprobar nunca esta característica. Examen interno del envase Se extrae el producto para hacer un examen minucioso de la parte interna del envase, con el fin de descubrir posibles alteraciones del color de las paredes debidas, generalmente, a reacciones químicas, así como lesiones de oxidación y desprendimiento del esmalte protector.
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Examen bacterioscópico Consiste en examinar microscópicamente el contenido de las muestras incubadas y la testigo no incubada. Con este examen se pone de manifiesto la calidad bacteriológica del producto antes de su esterilización. En las conservas, los gérmenes se pueden concentrar de tres formas: — Vegetativa. — Esporulada. — Muertos. Al tratarse de productos sometidos a esterilización, la forma común es la de gérmenes muertos o esporos inertes. La cifra de estos microorganismos se pone en evidencia mediante el examen microscópico directo. Si esta cifra es alta (superior a 107) significa que la materia prima, a partir de la cual ha sido elaborada la conserva, era bacteriológicamente deficiente. En general, una buena conserva no debe contener más de 2-3 bacterias muertas por campo microscópico, excepto en alimentos cuya elaboración es consecuencia de una fermentación biológica. El examen microscópico directo es, en ocasiones, el único medio de detectar el fíat sour, ya que los Bacillus termófilos causantes de esta alteración, al multiplicarse en la conserva, dan lugar al fenómeno de «autoesterilización» por lo que no se produce el crecimiento de colonias de microorganismos revivificables sobre los medios de cultivo y, en cambio, aparecen multitud de gérmenes muertos por examen bacterioscópico. La presencia de formas microbianas variadas (cocos, bacilos, levaduras, etc.) indican microfugas o deficiencia en la esterilización. Bacilos con esporangios, con esporos o sin ellos indican igualmente microfugas o esterilización deficiente. Si se observan bacilos con esporos subterminales o esporos libres, acompañados de olor pútrido, procede hacer pruebas de bioensayo en ratones blancos para la investigación de la posible presencia de toxina botulínica. Cuando predominan cocos grampositivos, se puede sospechar de la presencia de enterotoxina estafilocócica. La técnica para el examen microscópico consiste en hacer una extensión fina del alimento que se va a examinar sobre un porta de vidrio bien limpio, coloreada por tinción simple o método de Gram, para ser examinada al microscopio con objetivo de inmersión: — Se parte de una suspensión del alimento en agua destilada al 1:10. Esta suspensión se deja sedimentar 3-5 minutos. — Del sobrenadante se efectúa una extensión de 0,01 ml sobre un área de 1 cm2 marcada sobre un portaobjetos. — Fijación por el calor a la llama de un mechero. — En caso necesario, desengrasado con xilol. — Coloración por el método de Gram u otra tinción especial, si se requiere. — Se examinan 10-20 campos distintos elegidos al azar, utilizando objetivo de inmersión y un aumento total de x 1.000. Se cuentan las agrupaciones microbianas encontradas: parejas, racimos, cadenas, gérmenes aislados, grampositivas y/o gramnegativas.
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El número de gérmenes por gramo o mililitro de alimento se obtiene por la formula: N= 1,5 x 106x n N = Número por gramo o mililitro. n - Número de agrupaciones contadas en 10-20 campos del microscopio. Esta fórmula deriva de la siguiente: N=f x K x 106 + r n N = Número por gramo o mililitro. f= Factor distinto: — Productos secos, 1,5. — Productos alta aw, 2. — Productos no diluidos, 0,5. k = Número total de agrupaciones contadas en 10 campos. n - Número de campos contados. r = Logaritmo de 10 de la dilución del alimento. En la observación al microscopio se cuentan como un solo germen las agrupaciones microbianas encontradas, así como cada célula aislada que esté separada del grupo a una distancia superior al eje mayor de dicha bacteria. Interpretación del control de estabilidad De acuerdo con los exámenes efectuados, para que la estabilidad de una conserva sea correcta, debe ocurrir: — Que después de la fase de incubación no existan modificaciones del envase. — Que después de la incubación no se observen modificaciones en el contenido. — Que la variación del pH entre la conserva incubada y la no incubada (testigo) sea igual o inferior a 0,5 unidades. — Que la variación del número y naturaleza de los elementos microbianos observados al microscopio en la conserva incubada con respecto a los de la conserva no incubada (testigo), sea inferior a 100. Control de esterilidad A veces, una conserva no estéril es aparentemente estable. En este caso, la falta de esterilidad se comprueba sobre medios de cultivo donde aparecen, en número más o menos elevado, formas vegetativas revivificables.
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Examen bacteriológico Este examen es delicado y exige conocimientos especiales. Mediante él se comprueba la existencia o no de microorganismos revivificables en la conserva y, en caso positivo, se llega a definir su naturaleza. Se utiliza este examen en el caso de conservas alteradas espontáneamente o cuando el control de estabilidad ha dado resultados de alteración manifiesta o dudosa. Siembra del contenido de la conserva Una vez tomada la muestra (v. pág. 380), se procede a su siembra en medios de cultivo. Los medios utilizados para el examen bacteriológico de las conservas deben ser muy nutritivos para que resulte posible el crecimiento del mayor número de gérmenes. El pH de estos medios se ajustará al del producto que se analiza. Se emplean medios líquidos y medios sólidos, incluyendo: — Medios para el crecimiento de aerobios que favorezcan, además, la germinación de esporos del género Bacillus. — Medios para crecimiento de anaerobios que favorezcan, además, la germinación de esporos del género Clostridium. — Medios específicos que faciliten la identificación de gérmenes de la familia Bacillaceae. — Medios específicos que favorezcan el crecimiento de mohos y levaduras, sobre todo en conservas de frutas y otros productos ácidos. — Medios específicos que favorezcan el crecimiento de Lactobacillus, sobre todo en conservas de frutas y otros productos ácidos. Medios de cultivo líquidos — — — — — —
Caldo triptosa-almidón soluble. Medio Rosenow-almidón soluble. Medio de Crossley modificado. Caldo Schaedler. Caldo extracto de levadura y extracto de malta (YMB). Caldo MRS.
Caldo triptosa-almidón soluble Este medio se utiliza para el crecimiento de gérmenes aerobios y anaerobios facultativos. Favorece, además, la germinación de esporos del género Bacillus. Composición: Triptosa Glucosa Extracto de levadura
10 g 1g 3g
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Almidón soluble Hidrógeno fosfato potásico Cloruro sódico Agua destilada
2g 1g 5g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua por calentamiento suave. El pH se ajusta a 7. El medio se reparte a razón de 15 ml en tubos de 200 x 20 milímetros. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Medio de Rosenow-almidón soluble Este medio es favorable al crecimiento de bacterias anaerobias facultativas y estrictas. Composición: Peptona Extracto de carne Glucosa Cloruro sódico: Indicador de Andrade (fuchina acida 5 por 100) Mármol blanco Cerebro Almidón soluble Agua destilada
10 g 3g 5g 5g 10 ml 1 trozo 1 trozo 10 g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua por calentamiento suave. El pH se ajusta a 7,2. El medio se reparte a razón de 12 ml tubos de 160 x 16 milímetros. Esterilización a 115 °C durante 30 minutos. Nota: A los medios con triptosa y a los destinados al crecimiento de anaerobios les favorece la incorporación de almidón soluble que, además, disminuye el periodo de latencia de los esporos de la familia Bacillaceae.
Medio de Crossley modificado Utilizado para la investigación de flora anaerobia en conservas alimenticias. Composición: Leche en polvo desnatada Peptona Púrpura de bromocresol Clorhidrato de cisteína Agua destilada
100 g 10 g 0,1 g 0,8 g 1.000 ml
Mezclar todos los ingredientes y disolverlos poco a poco por calentamiento suave. El pH se ajusta a 6,8-7. El medio se reparte a razón de 10 ml en tubos de 160 x 16 rara. Esterilización en autoclave 121 °C durante 15 minutos.
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Caldo Schaedler Este medio favorece el crecimiento de bacterias anaerobias. Composición: Caldo TSB Peptona Extracto de levadura Dextrosa Clorhidrato de cisteína Hemina BufferTris Agua destilada
10 g 5g 5g 5g 0,4 g 0,01 g 0,75 g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua por calentamiento suave. El pH se ajusta a 7,2, El medio se reparte a razón de 10 ml en tubos de 160 x 16 milímetros. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Caldo extracto de levadura y extracto de malta (YMB) Este medio favorece el crecimiento de levaduras y mohos. Composición: Extracto de levadura Extracto de malta Peptona Glucosa Agua destilada
3g 3g 5g 10 g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua por calentamiento suave. No se ajusta el pH. El medio se reparte a razón de 15 mililitros en tubos de 200 x 20 mm. Esterilización en autoclave a 115 °C durante 15 minutos. Caldo MRS Medio selectivo para cultivo de Lactobacülus. Composición: Peptona Extracto de carne Extracto de levadura Acetato sódico Fosfato bipotásico Citrato amónico Sulfato de magnesio Sulfato de manganeso Glucosa
10 g 8g 1g 5g 2g 2g 0,2 g 0,05 g 20 g
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Tween 80 Agua destilada
1 ml 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en agua templada. El pH se ajusta a 6,2. El medio se reparte a razón de 10 ml en tubos de 160 x 16 rara. Esterilización a 121 °C durante 15 minutos. Medios de cultivo sólidos — — — — — —
Agar triptosa-almidón soluble. Agar VL-almidón soluble. Agar Schaedler. Agar extracto de levadura y extracto de malta. AgarMRS. Agar jugo de tomate.
Agar triptosa-almidón soluble Composición: Triptosa Glucosa Extracto de levadura Almidón soluble Hidrógeno fosfato potásico Cloruro sódico Agar Agua destilada
10 g 1g 3g 2g 1g 5g 15 g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua por calentamiento suave. El pH se ajusta a 7. Con el medio se preparan placas de Petri. Agar VL-almidón soluble Composición: Peptona Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro sódico Clorhidrato de cisterna Glucosa Almidón soluble Agar Agua destilada
10 g 3g 6g 5g 0,3 g 2g 2g 18 g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua, calentando hasta ebullición, para lograr una perfecta disolución. El pH se ajusta a 7,4. El medio se reparte a razón de 15 ml en tubos de 180 x 18 mm. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. El agar se deja solidificar manteniendo los tubos en posición vertical.
CONSERVAS ANIMALES Y VEGETALES
389
Agar Schaedler Este medio de cultivo puede reemplazar al VL. Composición: Caldo TSB Peptona Extracto de levadura Dextrosa Clorhidrato de cisteína Hemina Buffer Tris Agar Agua destilada
10 g 5g 5g 5g 0,4 g 0,01 g 0,75 g 15 g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua por calentamiento suave. El pH se ajusta a 7,2. El medio se reparte a razón de 10 ml en tubos de 160 x 16 milímetros. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Se preparan tubos (inclinados y verticales) o placas de Petri (recuentos). Agar extracto de levadura y extracto de malta (YMA) Composición: Extracto de levadura Extracto de malta Peptona Glucosa Agar Agua destilada
3g 3g 5g 10 g 20 g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua por calentamiento suave. No se ajusta el pH. Esterilización en autoclave a 115 °C durante 15 minutos. Con el medio se preparan placas de Petri. Agar MRS Composición Peptona: Extracto de carne Extracto de levadura Acetato sódico Fosfato bipotásico Citrato amónico Sulfato de magnesio Sulfato de manganeso Glucosa Tween 80
10 g 8g 4g 5g 2g 2g 0,2 g 0,05 g 20 g 1 ml
390
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Agar Agua destilada
20 g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en agua templada. El pH se ajusta a 6,2 Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Con el medio se preparan placas de Petri. Agar jugo de tomate Composición: Jugo de tomate Peptona Leche peptonizada Agar Agua destilada
20 g 10 g 10 g 12 g 1.000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua, calentando hasta ebullición, para lograr una perfecta disolución. El pH se ajusta a 6.1. Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Con el medio se preparan placas de Petri. Incubación de los medios de cultivo Los medios líquidos o sólidos sembrados con las conservas que deben ser incubadas a temperatura para mesófilos (31°C ± 1°C) se mantienen en estufa a esta temperatura durante 3-4 días. Los medios líquidos o sólidos sembrados con las conservas que deben ser incubadas a temperatura para termófilos (55 °C), se mantienen en estufa a esta temperatura durante 3-4 días. En ambos casos, para evitar la desecación que se produce durante su permanencia en la estufa, se toman precauciones: — Cubriendo los tapones de los tubos con papel de aluminio o parafinado. — Obturando los bordes de las placas con película de parafina o envolviéndolas en papel de aluminio. Todos los medios sembrados se examinarán diariamente, hasta que se cumpla el periodo de incubación. Lectura de resultados La lectura de los resultados se hace sobre medios sólidos y líquidos: — En los medios sólidos se comprueba la presencia o no de colonias, comparando con testigos del medio no sembrado pero incubado. — En los medios líquidos es más difícil la interpretación, por lo que, con frecuencia, es necesario hacer subcultivos en medios sólidos. — Algunos medios líquidos viran de color y sufren ciertas modificaciones cuando se produce crecimiento bacteriano, al llevar incorporado un indicador.
CONSERVAS ANIMALES Y VEGETALES
391
Interpretación de resultados según el crecimiento obtenido en los distintos medios de cultivo Caldo triptosa-almidón soluble (v. pág. 385) — Siembra: Abundante en el medio. — Incubación: Varios tubos a 31 °C ± 1 °C y otros tantos a 55 °C, durante 34 días, con lectura diaria. — Resultados: Enturbiamiento, sedimentación, formación de velo, etc., según el germen desarrollado. Como el inoculo debe ser abundante, a veces es difícil descubrir el enturbamiento producido por el crecimiento microbiano. Por esta razón, se impone un subcultivo a partir del cultivo líquido sobre agar triptosa-almidón soluble (v. pág. 388), incubando de nuevo a 31 ± 1 °C y 55 °C durante 3-4 días para comprobar la presencia o ausencia de colonias. Medio de Rosenow-almidón soluble (v. pág. 386) Se utiliza para el crecimiento de anaerobios estrictos y facultativos. — Siembra: Abundante y en la profundidad del medio (v. pág. 386). Cubrir la superficie del medio con parafina estéril. — Incubación: 37 °C durante 1-3 días. — Resultados: En el cultivo se puede observar: • La producción de gas, que se manifiesta cuando el disco de parafina es rechazado hacia arriba, de forma más o menos pronunciada. Cuando llega hasta el tapón obturante del tubo, se anota la producción de gas como: + + + +; a media altura entre la superficie del medio y el tapón: + + +; cuando se desplaza ligeramente: + Es necesario comprobar la posibilidad de que el gas haya podido escapar entre el tapón de parafina y la pared del tubo. • La fermentación de la glucosa se manifiesta por un viraje del indicador de Andrade del rosa al rojo. Este viraje se suele producir en la zona circundante al cerebro, lugar donde las bacterias comienzan a multiplicarse. • El poder reductor se manifiesta por la decoloración del medio. Hay viraje a verde en el caso de gérmenes reductores proteolíticos y alcalinizantes, pero poco o nada glucidolíticos. • Para comprobar la movilidad, se toma una porción del cultivo perforan do para tal fin la capa de parafina con un hilo metálico caliente. A través del orificio, con pipeta Pasteur estéril, se elige una zona de cultivo cercana al trozo de cerebro y se observará en fresco para ver si hay movilidad. • La licuación de la gelatina se comprueba mediante la introducción de un disco chargel en el cultivo, con precauciones asépticas. La licuación se manifiesta por la sedimentación de partículas del disco que, incluso, llega a desintegrarse y convertirse en una nube visible.
392
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Medio de Crossley (v. pág. 386) Medio utilizado para investigación de bacterias anaerobias en conservas. — Siembra: Abundante en el medio (v. pág. 386). Parte de los tubos sembrados se cubren con parafina estéril. — Incubación: A 37 °C durante 3-4 días. — Resultados: Se obtienen distintas reacciones en el medio, según la naturaleza de la flora desarrollada: • Medio color púrpura (pH neutro o alcalino); producción de gas; coágulo blando con digestión posterior de la caseína; sedimento negro; olor fétido: crecimiento que se puede relacionar con Clostridium putrificum, Clostridium sporogenes, Clostridium oedematiens, Clostridium hystoliticum. • Medio sin cambio de pH; producción de gas ligera, coágulo reblandecido en 2-3 días con posterior digestión completa de la caseína; sin olor: Clostridium centrosporogenes. • Medio amarillo pálido (pH ligeramente bajo); ligera formación de gas; formación de coágulo blando y suero: Clostridium sphenoides. • Medio amarillo manifiesto; producción de gas; formación de un coágulo firme: Clostridium butyricum. • Medio ácido; formación de gas; coágulo tormentoso: Clostridium perfringens. • pH muy alcalino; peptonización del medio; sin gas; sin ennegrecimiento: Bacillus subtilis, Bacillus vulgatus. • pH ácido; sin gas; con coágulos; a veces peptonización: Bacillus cereus, Bacillus coa gula ns. Caldo de Schaedler (v. pág. 387) Utilizado para crecimiento de bacterias anaerobias. — Siembra: Abundante en el medio (v. pág. 387). La superficie se cubre con 1-2 cm de parafina estéril. — Incubación: Varios tubos a 31 °C ± 1 °C y otros tantos a 55 °C durante 34 días, con lectura diaria. — Resultados: Enturbiamiento. Es necesario subcultivar sobre agar Schaedler inclinado, incubando de nuevo a 31°C ± 1 °C o a 55 °C durante 3-4 días, con lectura diaria para observar si hay crecimiento o no. Para el recuento de anaerobios se parte de una «serie de diluciones decimales» del alimento. Un mililitro de cada dilución se siembra en masa utilizando placas de Petri estériles y agar Schaedler atemperado a 47 °C. Por otro procedimiento, se siembra 0,1 mi de cada dilución sobre la superficie bien seca de agar Schaedler contenido en placas de Petri. Las placas se incubarán en anaerobiosis. En el primer caso, las colonias contadas, multiplicadas por el factor de dilución de la placa, dan el número de colonias de anaerobios por gramo o mililitro de alimento. En el segundo caso, la cifra de recuento obtenido se multiplicará por 10, por haber partido de un inoculo 0,1 mi para obtener colonias por gramo o mililitro de alimento.
CONSERVAS ANIMALES Y VEGETALES
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Caldo extracto de levadura y extracto de malta (YMB) (v. pág. 387) Este medio favorece la multiplicación de mohos y levaduras. — Siembra: Abundante en el medio (v. pág. 387). — Incubación: A 25 °C durante 5 días. — Resultados: Enturbiamiento. Se seguirá el estudio por siembra en medio sólido. Caldo MRS (v. pág. 387) Se utiliza para cultivo o enriquecimiento de todas las especies de Lactobactillus. — Siembra: Abundante en el medio (v. pág. 387). — Incubación: A 37 °C durante 72 horas o a 31 °C ± 1 °C durante 5 días en atmósfera de CO7 al 5 por 100 — Resultado: Enturbiamiento. Se seguirá el estudio por siembra en agar MRS. Agar triptosa-almidón soluble (v. pág. 388) Para completar el estudio del crecimiento en caldo triptosa-almidón soluble. — Siembra: A partir del crecimiento obtenido sobre caldo triptosa- almidón soluble (v. pág. 385) incubado a 31 ± 1°C y 55° C, se siembra sobre la superficie bien seca de agar triptosa-almidón soluble (v. pág. 388). — Incubación: Varias placas a 31 °C ± 1 °C y otras a 55° C durante 3-4 días. — Resultados: Observación del crecimiento bacteriano. Agar VL almidón soluble (v. pág. 388) Se utiliza para el aislamiento de gérmenes anaerobios en superficie. — Siembra: A partir del cultivo obtenido sobre medio Rosenow. — Incubación: A 37 °C durante 24 horas en anaerobiosis. — Resultados: Crecimiento de colonias que se someterán a estudio e identificación. Agar jugo de tomate (v. pág. 390) Medio selectivo para el aislamiento y recuento de Lactobacillus. — Siembra: A partir de una «serie de diluciones decimales» del alimento en agua de triptona, se siembra 0,1 mi de cada dilución sobre la superficie bien seca de agar jugo de tomate (v. pág. 390), contenido en placas de Petri. — Incubación: 31 °C ± 1 °C durante 48 horas.
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
394
— Resultados: Crecimiento de colonias. El número de colonias contadas en la placa elegida, multiplicado por su factor de dilución y por 10, da como resultado el recuento de gérmenes por gramo o mililitro del alimento analizado. Las colonias crecidas serán identificadas por distintas pruebas. Características de crecimiento de Clostridium sobre medio de Rosenow Clostridium
Rosenow Gas
Grupo I
Cl. butyricum Cl. acetobutyricum Cl.beijerinkii Cl. saccharobytiricum Cl. multifermentans Cl. pasteurianum Cl. tyrobutyricum Cl.fallax
++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + +++
Cl. perfringens Grupo
II Grupo III
Grupo IV
1
Cl. oedematiens Cl. septicum
Color1 RD RD RD RD RD RD RD RD
+ + + + + + + +
RD +++ +++
V V
+ +
Cl. bifermentans carnofoetidum
++
V
+
Cl. aerofoetidum Cl. sporogenes Cl. hystoliticum
++ +
V V V
+ + +
CL tetani
+
V
+
CL tetanomorphum CL putrificum Cl. capitovale Cl. sphenoides Cl. clochearium CL carnis Cl. tertium
+
V V RD RD RD V RD
+ + + + + + +
RD = Rosa y luego decoloración.
V = Verdoso.
Movilidad
+ + + +++
Platos preparados
40
(«Conservas animales y vegetales. Platos preparados. Productos dietéticos y de régimen». Capítulo XXVI del Código Alimentario Español)
Los platos preparados son alimentos que se elaboran partiendo de muy diversos productos que poseen, individualmente, una flora específica. Por otra parte, están sometidos a numerosas manipulaciones para su preparación y conservación (cocción, refrigeración) que influyen notablemente sobre la naturaleza de dicha flora. La cocción puede ser un factor de selección de la flora esporulada que, cuando se produce un enfriamiento lento, origina una proliferación considerable. A la inversa, el paso del almacenamiento en frío, a la exposición a temperatura ambiente, puede dar lugar a una multiplicación excesiva de los contaminantes microbianos. Se trata de preparaciones culinarias, cocinadas o precocinadas, elaboradas a partir de muy diversos productos: carnes de abasto, carne de aves, caza, pescados, moluscos, crustáceos, huevos, etc., acompañados de salsas, productos lácteos, verduras, legumbres, rellenos y otros. Los platos preparados son cada día más numerosos y variados. Para que estos productos alcancen una buena calidad microbiológica, es necesario: — Que las materias primas no estén contaminadas o lo estén mínimamente. — Que durante su elaboración se eviten nuevos aportes microbianos y la proliferación de la flora presente. — Que se conserven adecuadamente después de su elaboración. Dada la gran diversidad de materias primas utilizadas en la elaboración de platos preparados, es posible el aporte de flora indeseable muy variada razón por la que se impone el control de cada una de ellas, así como de otros agentes que, como las especias, son frecuentes vectores de contaminación. Es evidente que no se deben mezclar materias primas de calidades microbianas distintas y no correctas. Durante la elaboración del producto hay que evitar la proliferación de los gérmenes presentes, procurando que no existan oportunidades que faciliten el crecimiento microbiano. Es importante, después de la cocción, someter al alimento a un enfriamiento rápido previo a su conservación en frigorífico. Dicho enfriamiento no debe superar las dos horas. 395
396
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Conseguido el enfriamiento, la conservación en frío se logra: — En refrigeración, a temperatura inferior a 3 °C. — En congelación, a temperatura de -18 °C o inferior. En la fase de preparación del plato, además de evitar la proliferación de la flora procedente de la materia prima, es necesario no aportar nuevos gérmenes mediante manipulaciones poco higiénicas o por utilización de material contaminado en un ambiente sucio. En el aspecto sanitario, los platos preparados pueden constituir un riesgo para el consumidor si están mal elaborados o conservados, ya que casi todas las bacterias productoras de toxiinfecciones alimentarias se pueden encontrar en ellos, conociéndose numerosos casos de enfermedades gastrointestinales de origen alimentario causadas por platos preparados donde se han aislado Salmonella, St. aureus enterotoxigénico, Clostridium perfringens, Bacillus cereus y otros. Los platos preparados, además de inofensivos para la salud, deben mostrar un buen aspecto que los haga apetecibles y no rechazables. Para conseguirlo, los que no sean de consumo inmediato se conservarán en refrigeración a temperatura inferior a 3 °C o en congelación o ultracongelación, a temperaturas de -10 o -18 °C, respectivamente. La alteración de estos productos se manifiesta por cambios en sus caracteres organolépticos (aspecto, gusto, olor) debido, principalmente, a la acción de bacterias psicrotróficas (Pseudomonas, Achromobacter, etc.), levaduras y mohos. Los platos preparados destinados a ser conservados en caliente antes de su consumo, se mantendrán, inmediatamente después de su preparación, a una temperatura minina de 65 °C en su parte profunda hasta el momento de su consumo, que tendrá lugar en el transcurso del mismo día. Estos alimentos, por sus características especiales, exigen un control microbiológico muy estricto y constante de la materia prima, distintas fases de elaboración y como producto terminado. DEFINICIONES Platos preparados Son los productos obtenidos por mezcla y condimentación de alimentos de origen animal y/o vegetal, con o sin adición de otras sustancias autorizadas, contenidos en envases apropiados, herméticamente cerrados o no, según el procedimiento de conservación utilizado, y dispuestos para ser consumidos, ya directamente o previo simple calentamiento o tras un tratamiento doméstico adicional. (Real Decreto 512/1977 de 8 de febrero; B.O.E. 2-4-77.) Plato precocinado Es el resultado de una preparación culinaria completa, envasado y sometido a un procedimiento de conservación de los citados en esta Reglamentación. Este plato necesita, por tanto, tratamiento doméstico adicional. (Real Decreto 512/1977 de 8 de febrero; B.O.E. 2-4-77.)
PLATOS PREPARADOS
397
Plato cocinado Es el resultado de una preparación culinaria completa, envasado y sometido a un proceso de conservación de los citados en esta Reglamentación. Este plato se encuentra dispuesto para el consumo con calentamiento previo o sin él. Pueden expenderse platos cocinados en recipientes tapados y mantenidos, inmediatamente después de la preparación, a temperaturas iguales o superiores a 65 °C, medidos en la zona central del producto. Estos platos deben consumirse el mismo día de su preparación y reciben el nombre de «Platos cocinados de consumo inmediato». (Real Decreto 512/1977 de 8 de febrero; B.O.E. 2-4-77.) Definiciones complementarias Los procedimientos de conservación que se utilizan en la elaboración de platos preparados (precocinados y cocinados) pueden ser: Conservación por el frío Refrigeración Consiste en someter a los alimentos a la acción de bajas temperaturas, sin alcanzar las de congelación. La temperatura de refrigeración deberá mantenerse uniforme y sin cambios bruscos durante el periodo de conservación y ser la apropiada para cada tipo de producto. (Real Decreto 512/1977 de 8 de febrero; B.O.E. 2-4-77.) Congelación Consiste en someter a los alimentos a un procedimiento industrial de frío que haga bajar la temperatura, en el centro geométrico, como máximo a 10 °C bajo cero. No se fijan los tiempos o velocidades para alcanzar la congelación, ya que son específicos de cada plato preparado. (Real Decreto 512/1977 de 8 de febrero; B.O.E. 2-4-77.) Ultracongelación Consiste en someter a los alimentos a un proceso realizado en instalaciones convenientes y específicas de modo que, partiendo de unas temperaturas muy bajas, se rebase rápidamente la zona de temperatura de máxima cristalización, no considerándose alcanzada hasta el momento en que, tras la estabilización técnica, la temperatura en el centro geométrico del producto sea, como mínimo, de 18 °C bajo cero. No se fijan los tiempos o velocidades para alcanzar la ultracongelación, ya que son específicos de cada plato preparado (Real Decreto 512/1977).
398
MICROBIOLOGÍA AUMENTARÍA
Conservación por el calor Esterilización industrial Es el proceso por el que se destruyen o inactivan en los alimentos, a temperaturas adecuadas aplicadas de una vez o por tindalización, todas las formas de vida de microorganismos patógenos o de aquellos otros que puedan alterar los alimentos. (Real Decreto 512/1977 de 8 de febrero; B.O.E. 2-4-77) Pasteurización Es el proceso por el que se destruyen en los alimentos las formas vegetativas de los microorganismos patógenos y se disminuyen los de naturaleza banal, sometiendo aquéllos a temperaturas variables, en función del producto y del periodo de tratamiento, de forma que los alimentos no sufran modificaciones esenciales en su conservación durante un periodo de tiempo no superior a 72 horas. (Real Decreto 512/1977 de 8 de febrero; B.O.E. 2-4-77.) Cocción Es el proceso por el que se someten los alimentos a temperatura de ebullición en periodos de tiempo variables, de acuerdo con las exigencias de cada producto. (Real Decreto 512/1977 de 8 de febrero; B.O.E. 2-4-77.) Preparados alimenticios para regímenes dietéticos y/o especiales Son alimentos elaborados según fórmulas autorizadas de composición y/o características especiales y que satisfacen necesidades fisiológicas, bien de las personas sanas o de aquellas otras cuyos procesos de asimilación o metabolismo se encuentran alterados. (Real Decreto 2685/1976 de 16 de octubre; B.O.E. 26-11-76.) Tipos de preparados alimenticios para regímenes dietéticos y/o especiales Alimentos que satisfacen las exigencias fisiológicas especiales de nutrición de las personas sanas Alimentos para niños lactantes, postlactantes y de corta edad 1.
Alimentos a base de leche, productos lácteos y componentes de la leche.
a) Para lactantes. Son alimentos presentados en forma sólida o liquida, destinados a reemplazar o complementar la leche de la madre y a satisfacer las necesidades nutricionales de dichos niños. (Real Decreto 2685/1976 de 16 de octubre; B.O.E. 26-11-76.)
PLATOS PREPARADOS
399
b) Para postlactantes. Son alimentos sólidos o líquidos que se utilizan normalmente para los niños a partir del destete y durante el periodo de adaptación a los alimentos ordinarios. Entre éstos se encuentran las harinas lacteadas, instantáneas o no, simples o compuestas, con o sin frutas y/u hortalizas añadidas. (Real Decreto 2685/1976 de 16 de octubre; B.O.E. 26-11-76.) 2. Alimentos a base de cereales o hidratos de carbono. Son alimentos destinados a completar, principalmente, las necesidades de los niños postlactantes y de corta edad. (Real Decreto 2685/1976 de 16 de octubre; B.O.E. 26-11-76.) a) Harinas no lácteas, instantáneas o no, simples o compuestas con o sin frutas y/u hortalizas. b) Algunos tipos de galletas o bizcochos especiales. 3. Alimentos a base de hortalizas, frutas, carnes, pescados o mezclas de los mismos, cuya finalidad sea exclusivamente establecer un régimen alimenticio infantil. 4. Alimentos compuestos de mezclas de las anteriores y de otras fórmulas específicas, cuya finalidad sea exclusivamente establecer un régimen alimenticio infantil. Alimentos complementarios o para situaciones de esfuerzo y desgaste 1. Alimentos para mujeres embarazadas y en periodo de lactación. 2. Alimentos que proporcionan nutrientes complementarios. En este grupo se incluyen los alimentos destinados a aquellas personas que realizan esfuerzos físicos extraordinarios o que viven en condiciones especiales del medio ambiente. 3. Alimentos para personas de avanzada edad. Alimentos para regímenes nutricionales específicos Alimentos sin gluten Alimentos con reducido contenido en ciertos aminoácidos o sin ellos Alimentos con reducido contenido en calorías Alimentos ricos en calorías Alimentos con variaciones cualicuantitativas en grasas, carbohidratos, proteínas, sales o iones Alimentos hipoalérgicos Alimentos para diabéticos
400
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Alimentos especiales considerados tradicionalmente como específicos para regímenes dietéticos Levaduras Germen de trigo Polen, jalea real Alimentos no refinados (cereales y harinas integrales, azúcar moreno, etc). Aceites y grasas con alto contenido en ácidos grasos esenciales Alimentos especiales administrados por medio de sonda Alimentos para regímenes dietéticos y/o especiales enriquecidos Son los alimentos definidos en el apartado anterior, en los que la proporción de vitaminas, sustancias minerales, aminoácidos o ácidos grasos esenciales es superior a la del contenido natural medio de sus ingredientes, por haber sido suplementados significativamente sin finalidad terapéutica. (Real Decreto 2685/1976 de 16 de octubre; B.O.E. 26-11-76.) PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE PLATOS PREPARADOS Y PRODUCTOS DIETÉTICOS Y DE RÉGIMEN Protocolo para el análisis microbiológico de platos preparados — — — — — —
Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C). Investigación y recuento de Enterobacteriaceae. Investigación y recuento de Escherichia coli. Investigación de Salmonella. Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores. Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico.
Protocolo para el análisis microbiológico de productos dietéticos y de régimen — Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C). — Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes). — Investigación y recuento de Escherichia coli. — Investigación de Salmonella. — Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico. — Investigación y recuento de mohos y levaduras.
PLATOS PREPARADOS
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PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Preparación de muestras de platos preparados Es muy importante que la muestra sea representativa de todo el plato, sobre todo cuando éste es muy heterogéneo. Las muestras se enviarán al laboratorio dentro de las 24 horas del día y en recipiente refrigerado a 4 °C. Es desaconsejable la congelación de las muestras para su envió al laboratorio, ya que esta práctica actúa negativamente sobre la flora microbiana del producto; sólo se puede utilizar en casos muy especiales y de absoluta necesidad. Se tomarán porciones de los distintos componentes del plato, incluidas salsas, y en la misma proporción en que forman parte de aquél. Tomada la muestra, se prepara la suspensión madre (1:10), sometiéndola previamente a trituración por los procedimientos habituales y utilizando como diluyente agua de triptona (TW) (v. pág. 11). Preparación de muestras de alimentos dietéticos y de régimen Preparar, asépticamente, una suspensión madre (1:10) del alimento, utilizando como diluyente agua de triptona (TW) (v. pág. 11). ANÁLISIS Análisis microbiológico de platos preparados Diluciones decimales (v. pág. 11 ) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3) Investigación y recuento de Enterobacteriaceae (v. cap. 6) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella (v. cap. 7) Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores (v. cap. 9) Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico (v. cap. 10) Análisis microbiológico de productos dietéticos y de régimen Diluciones decimales (y. pág. 11) Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) (v. cap. 3)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Investigación y recuento de Enterohacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) (v. cap. 4) Investigación y recuento de E. coli (v. cap. 5) Investigación de Salmonella (v. cap. 7) Investigación y recuento de St. aureus enterotoxigénico (v. cap. 10) Investigación y recuento de mohos y levaduras (v. cap. 16) CRITERIO MICROBIOLÓGICO PARA PLATOS PREPARADOS Y PRODUCTOS DIETÉTICOS Y DE RÉGIMEN Criterio microbiológico para platos preparados En el Real Decreto 512/1977 de 8 de febrero (B.O.E. 2-4-77) se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración, circulación y comercio de platos preparados (precocinados y cocinados). En el artículo 10, sobre condiciones específicas, dice que estos alimentos estarán exentos de gérmenes patógenos. Como orientación para el técnico, se sugieren las siguientes determinaciones y cifras máximas para calificar las condiciones higiénico-sanitarias de estos productos: Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °C) Enterobacteriaceae totales Escherichia coli Salmonella Clostridium sulfíto-reductores St. aureus enterotoxigénico
Máximo 1 x 10s/g Máximo 1 x 103/g Máximo 1 x 10/g Ausencia/25 g Máximo 3 x 10/g Máximo 1 x 102
Criterio microbiológico para productos dietéticos y de régimen En el Real Decreto 2685/1976 de 16 de octubre (B.O.E.26-11-76) se aprueba la Reglamentación Técnico-Sanitaria para la elaboración, circulación y comercio de preparados alimenticios para regímenes dietéticos y/o especiales, y se dicta la Norma Microbiológica para estos productos: A Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 ± 1 °)* Coliformes Escherichia coli Sulmonella/30 g St. aureus enterotoxigénico Mohos y levaduras
Max. 5 x 104/g Aus. 0,01/g Aus./g Ausencia Aus./0,l g Max. 3 xl02 /g
B 2x 10 5 /g Aus. 0,001/g Aus./0,l g Ausencia Aus./0,01 g Max. 1 x 103/g
D 1 x 104/g Aus. 0,1/g Aus./g Ausencia Aus./0,l g 3 x 102/g
PLATOS PREPARADOS
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Grupo C: Productos sometidos a esterilización 1.
2.
Prueba de esterilidad. Las muestras serán sometidas a pruebas de incubación. La mitad del lote de muestras a 30 °C durante 4 semanas y la otra mitad a 44 °C durante 10 días. En este último caso, de no haber abombamiento, se someten las muestras de nuevo a 55 °C durante 10 días. Las muestras, después de incubadas y enfriadas, no presentarán modificaciones en su sabor y olor característicos. Estos productos habrán sufrido un tratamiento que garantice la inactivación de esporos de Cl. botulinum.
* No aplicable para alimentos obtenidas, en cualquier fase de su proceso, por bacterias que forman ácido láctico. A = Productos que han de consumirse después de añadir un liquido. B = Productos que deben cocerse antes de su consumo (calentar a temperatura de 100 °C o superior durante un minino de 3 minutos). C = Productos sometidos a esterilización técnica, industrial o comercial y comercializados en envases herméticos. D = Productos listos para su consumo, no comprendidos en A, B o C.
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Aguas y hielo («Aguas y hielo». Capítulo XXVII del Código Alimentario Español)
El agua constituye un alimento esencial, puesto que es indispensable para la vida. Interviene en nuestra alimentación y en la preparación de alimentos y puede ser, además, un vector de gérmenes peligrosos. El agua potable posee cualidades físico-químicas, microbiológicas y organolépticas que la hacen apta para el consumo humano. Las aguas minerales son aguas con propiedades terapéuticas reconocidas por la ley, pero cuya apelación no significa que, obligatoriamente, posean una gran cantidad de minerales. De forma general, se puede incluir el agua en dos grandes grupos:
Las aguas de distribución pública corresponden a lo que son aguas potables. Proceden de la captación de aguas superficiales, de vetas de agua o de aguas subterráneas. Antes de su distribución son sometidas a tratamientos depuradores: — Filtración. — Decantación. — Floculación (desinfección por ozonización o cloración por cloro gaseoso o por un derivado del cloro). 405
406
MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Las aguas de captación individual proceden de fuentes o yacimientos subterráneos (pozos), y se suelen utilizar en zonas rurales para abastecer casas de campo o industrias que no reciben agua de distribución pública. Deben ser tratadas para su utilización. Las aguas envasadas proceden de yacimientos subterráneos protegidos de contaminación y no sometidas a tratamiento desinfectante, envasándose en condiciones higiénicas para su consumo. Las aguas de consumo público se pueden envasar en situaciones de emergencia, previa autorización de la autoridad sanitaria competente. Además de para el consumo público, el agua es un elemento esencial en la industria alimentaria y se utiliza con distintos fines: — — — — — —
Lavado y tratamiento de alimentos. Preparación de hielo para conservación de alimentos. Lavado de material. Esterilización de productos o material. Para enfriamiento de conservas y otros alimentos. Aguas utilizadas en acuicultura (agua de mar o agua dulce).
En todos los casos, las industrias que utilizan estas aguas tienen la responsabilidad de que posean una calidad bacteriológica satisfactoria. Tanto el agua destinada a la alimentación como agua de bebida, como la utilizada en el tratamiento de los alimentos o en la industria alimentaria, deben presentar una gran pureza microbiológica, que depende mucho de su procedencia. Las aguas subterráneas (fuentes, pozos), si proceden de capas profundas, están mejor protegidas que las aguas superficiales (ríos, lagos, etcétera). Las contaminaciones son más difíciles y la filtración a través de las capas sedimentarias limita el número de microorganismos. Tanto el agua de alimentación como la destinada a usos industriales deben estar controladas y sometidas a tratamientos antimicrobianos autorizados. La flora del agua es muy variada, encontrándose: — Gérmenes habituales del agua. — Gérmenes de origen telúrico. — Gérmenes de origen humano o animal. Los gérmenes típicamente acuáticos son, principalmente, algas microscópicas y bacterias pertenecientes a los géneros: Vibrio, Pseudomonas, Chromobacterium, Achromobacter, Corynebacterium y otros de menor interés. Los gérmenes de origen telúrico encontrados en el agua son, habitualmente, bacterias esporuladas (Bacillus, Clostridiun), otras pertenecientes al género Streptomyces y, a veces, esporas fúngicas. Los gérmenes de origen humano o animal son, con frecuencia, patógenos y, esencialmente, enterobacterias de origen intestinal (Escherichia coli, coliformes fecales, Salmonella, Shigella), Streptococcus fecales, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae, etc. En climas tropicales se pueden encontrar en el agua protozoarios y otros parásitos animales. El agua puede ser también transmisora de virus (poliomielitis, hepatitis vírica).
AGUAS Y HIELO
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DEFINICIONES Aguas de bebida envasadas Son las distintas aguas presentadas como minero-medicinales, minerales naturales, de manantial y potables preparadas, que se comercializan envasadas, así como aquellas de consumo público que, por circunstancias accidentales, excepcionalmente, se distribuyen envasadas. (Real Decreto 2119/1981 de 24 de julio; B.O.E. 21-9-81.) Aguas minero-medicinales envasadas Son aguas minero-medicinales aquellas que emergen espontáneamente en la superficie de la tierra o se captan mediante labores practicadas al efecto, habiéndose obtenido para ellas la declaración de utilidad pública, de acuerdo con lo estipulado en el Decreto-Ley de 25 de abril de 1928. Estas aguas deben ser aptas para tratamientos terapéuticos en el área de emergencia o balneario, disponer de estudios clínicos sobre evolución de procesos específicos y conservar, una vez envasadas, efectos útiles sobre los mismos. (Real Decreto 2119/1981 de 24 de julio; B.O.E. 21-9-81.) Aguas minerales naturales envasadas Son las que poseen los mismos requisitos legales que las mineromedicinales envasadas. Estas aguas han de tener una acción favorable complementaria de las funciones fisiológicas, sin llegar a poseer propiedades terapéuticas fuera del área de emergencia o balneario. (Real Decreto 2119/1981 de 24 de julio; B.O.E. 21-9-81.) Aguas de manantial envasadas Son las potables que emergen espontáneamente en la superficie de la tierra con un caudal continuo o se captan mediante labores practicadas al efecto; se obtienen para ellas las autorizaciones administrativas expresadas en el Decreto 3069/1972 de 26 de octubre (artículos 9, 10 y 11). (Real Decreto 2119/1981 de 24 de julio; B.O.E. 21-9-81.) Aguas potables preparadas envasadas Son las que, previa autorización de la autoridad sanitaria competente, han sido sometidas a los tratamientos necesarios para que reúnan las características establecidas en el artículo 18 de esta Reglamentación. (Real Decreto 2119/1981 de 24 de julio; B.O.E. 21-9-81.)
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Aguas de consumo público envasadas Son las aguas potables de consumo público, envasadas coyunturalmente para distribución domiciliaria gratuita, previa autorización de la autoridad sanitaria competente, con el único objeto de suplir ausencias o insuficiencias accidentales de las aguas de consumo público distribuidas por la red general. Deberán reunir las características señaladas en el artículo 19 de esta Reglamentación. (Real Decreto 2119/1981 de24dejulio;B.O.E. 21-9-81.) Aguas potables de consumo público Son las utilizadas para este fin, cualquiera que sea su origen, bien en su estado natural o después de un tratamiento adecuado, ya sean aguas destinadas directamente al consumo o aguas utilizadas en la industria alimentaria, de forma que pueda afectar a la salubridad del producto final. (Real Decreto 1423/1982 de 18 de junio; B.O.E. 29-6-82.) Agua potable Es el agua que reúne las características físico-químicas y microbiológicas que se indican en el articulo 3.° de esta Reglamentación. (Real Decreto 1423/1982 de 18 de junio; B.O.E. 29-6-82.) Agua sanitariamente permisible Es aquella que no posee las características indicadas en el artículo 4.1 y que, por reunir las características que se indican en el artículo 4.2 de esta Reglamentación, puede ser utilizada, excepcionalmente, para el consumo humano. (Real Decreto 1423/1982 de 18 de junio; B.O.E. 29-6-82.) Agua no potable Es aquella cuyas condiciones físico-químicas y/o caracteres microbiológicos o de radiactividad impiden su inclusión en alguna de las clases anteriores. (Real Decreto 1423/1982 de 18 de junio; B.O.E. 29-6-82.) Agua tratada Es aquella que, habiendo sido sometida a un tratamiento adecuado, reúne las características propias de las aguas potables o sanitariamente permisibles. (Real Decreto 1423/1982 de 18 de junio; B.O.E. 29-6-82.) Aguas de baño Son las de carácter continental, corrientes, estancadas o embalsadas, y las de carácter marítimo, que el baño esté expresamente autorizado o, sin estar prohibí-
AGUAS Y HIELO
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do, se practica habitualmente por un número importante de personas. (Real Decreto 734/1988 de 1 de julio; B.O.E. 13-7-88.) Hielo natural Es el que se obtiene por procedimientos no mecánicos, aprovechando los agentes atmosféricos de la naturaleza o las condiciones climatológicas propias de los períodos invernales que producen la congelación del agua procedente de lluvias, torrentes, estanques, etc. (Orden de 16 de agosto de 1964 (B.O.E. 25-8- 64.) Hielo artificial Es el que se obtiene congelando agua mediante un procedimiento físico mecánico. (Orden de 16 de agosto de 1964; B.O.E. 25-8-64.) Hielo alimenticio Es, únicamente, el artificial fabricado a partir de agua potable, que ofrezca los siguientes caracteres: — Ser inodoro, incoloro e insípido y estar exento de impurezas visibles. — Dar por fusión un liquido que satisfaga las condiciones de pureza y potabilidad exigidas para las aguas. PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS Y HIELO — — — — — — — — —
Recuento de colonias a 37 °C. Recuento de colonias a 20-22 °C. Investigación y recuento de coliformes. Identificación de Escherichia coli. Investigación de salmonella. Investigación y recuento de Streptococcus D de Lancefield. Investigación y recuento de esporos de Clostridium sulfito-reductores. Investigación de Pseudomonas aeruginosa. Investigación y recuento de mohos.
PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS Aguas potables de consumo público Por Orden de 27 de julio de 1983 (B.O.E. 13-8-83), se establecen métodos oficiales de análisis microbiológico de aguas potables de consumo público.
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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Aguas de bebida envasadas Por Orden de 18 de mayo de 1987 (B.O.E. 13-5-87), se aprueban los métodos oficiales de análisis microbiológico para la elaboración, circulación y comercio de aguas de bebida envasadas. CRITERIO MICROBIOLÓGICO PARA AGUAS Y HIELO Criterio microbiológico para el agua potable 1.
Caracteres orientadores de calidad
. Contenido de bacterias aerobias totales a 37 °C . Contenido de bacterias aerobias totales a 20-22 °C . Microorganismos parásitos y/o patógenos 2. . . . . .
10/ml 100/ml Ausencia
Caracteres tolerables Contenido de bacterias aerobias totales a 37 °C, máximo Coliformes Streptococcus D de Lancefold Esporos de Clostridium sulfito reductores Microorganismos parásitos y/o patógenos
200/ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/20 ml Ausencia
(Real Decreto 1423/1982 de 18 de junio; B.O.E. 29-6-82.)
Criterio microbiológico para aguas sanitariamente permisibles Coliformes totales Coliformes fecales Streptococcus fecales Microorganismos parásitos y/o patógenos
Máximo 10/100 ml Ausencia/100 ml Máximo 10/100 ml Ausencia
(Real Decreto 1423/1982 de 18 de junio; B.O.E. 29-6-82.)
Criterio microbiológico para aguas de bebida envasadas Aguas minero-medicinales En el punto de emergencia: Enterobacteriaceae Escherichia coli Salmonella Streptococcus D de Lancefield Esporos de Clostridium sulfito reductoresParásitos y microorganismos patógenos (Real Decreto 2119/1981 de 24 de julio; B.O.E. 21-9-81.)
Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia
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En envase dispuesto para el consumo Enterobacteríaceae Escherichia coli Salmonella Strepiococcus D de Lancefíeld Esporos de Clostridium sulfitoreductores Pseudomonas (¡eruginosa Staphylococcus aureus Parásitos y microorganismos patógenos (Real Decreto 2119/1981 de 24 de julio; B.O.E. 21-9-81.)
Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia
Aguas minerales naturales El mismo criterio que el apartado anterior. Aguas de manantial El mismo criterio que los dos apartados anteriores. Aguas potables preparadas Agua de partida en el punto de captación: Recuento de colonias aerobias Coliformes Escherichia coli Salmonella Streptococcus D de Lancefíeld Esporos de Clostridium sulfíto-reductores Parásitos y patógenos
Máximo 1 x 102 col./ml Máximo 2/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Máximo 2/100 ml Máximo 2/100 ml Ausencia/100 ml
(Real Decreto 2119/1982 de 24 de julio; B.O.E. 21-9-81.)
En envase dispuesto para el consumo El mismo criterio microbiológico que el ya expuesto arriba. Aguas de consumo público envasadas: Recuento de colonias aerobias Enterobacteríaceae Escherichia coli Salmonella Streptococcus D de Lancebeld Pseudomonas aeruginosa Staphilococcus aureus Parásitos y microorganismos patógenos (Real Decreto 2119/1982 de 24 de julio; B.O.E. 21-9-81.)
Ausencia/ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia/100 ml Ausencia
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Control de calidad de las aguas potables de consumo público Corresponde al Ministro de Sanidad y Consumo, previos informes, en su caso, de los distintos Departamentos ministeriales competentes, determinar los niveles, condiciones y requisitos sanitarios que deban exigirse a efectos de lo establecido en la presente Reglamentación. (Real Decreto 1138/1990 de 14 de septiembre; B.O.E. 20-9-90.) Anexo E Caracteres microbiológicos Parámetros Coliformes totales Coliformes fecales Estreptococos fecales Clostridium sulfitoreductores
Volumen muestra
Concentración máxima admisible
100 100 100 20
NMP
