Microbio Résumé Intra

Microbio cours 1

Définition 1. Stricte : science qui étudie les organismes microscopiques.. 2. Large : science qui se définit par les techniques qu’elle emploie.

Domaines 1. Bactériologie 2. Mycologie 3. Phycologie (algues) 4. Protozoologie [premiers animaux] (eucaryotes unicellulaires hétérotrophes). 5. Virologie

Composants principaux cellule (macromolécules) 1. Protéines 2. Acides nucléiques 3. Lipides 4. Polysaccharides

Caractéristiques des systèmes vivants 1. Métabolisme : prélèvent les nutriments dans l’environnement et les transforment, conservant une partie de l’énergie présente dans ces substances sous une forme assimilable (genre ATP) puis les déchets sont éliminés. 2. Reproduction : capacité de diriger une suite d’événements biochimiques permettant la croissance et la division, permettant de former deux cellules. 3. Différenciation : formation d’organes ou autres structures ou autres substances spécialisées (exemple des spores). 4. Communication : répondre à des signaux de l’environnement (signaux chimiques). Exemple de quorum sensing : permet d’évaluer le nombre d’organismes adjacents par petites molécules solubles (diffusibles). 5. Mouvement : propulsion autonome par flagelle 1

6. Évolution : capacité de changer leurs caractéristiques et les transmettre à leur descendances (hérédité).

Les cellules en tant que machinerie cellulaire ou dispositif de codage •

Machines : effectuent les transformations cellulaires.

•

Dispositifs de codage : analogues des ordinateurs.

Elles sont des dispositifs de codage en même temps d’être des machines. Pour la survie, une grande coordination entre ces deux fonctions est nécessaire. Toutes les cellules CONNUES sont basées sur le même système. La possibilité d’un ancêtre commun est donc valable. La cellule possède la fonction de machine pour permettre la transmission de l’information. L’information sans moyen de la transmettre ne sert à rien et l’inverse est aussi vrai.

Classification des organismes vivants Vue ancienne A- Linné (18e siècle) : •

Plantes : immobiles/ photosynthétiques

•

Animaux : mobiles /non photosynthétiques

Problèmes de la classification de Linné : 1. Algues et champignons : Non photosynthétiques donc sont classés comme plantes par les botanistes et comme animaux par les zoologies (bande de profiteurs). 2. Euglène : mobiles et photosynthétiques, plantes par les botanistes et animaux par les zoologistes. 3. Bactéries : paroi rigide (non mobiles on supposait =) : plantes B- Maeckel (19e siècle) : classification basée sur l’organisation cellulaire : 1. Unicellulaire 2. Pluricellulaire 3. Tissus spécialisés (oui ou non) 2

4. Donne les plantes, les animaux et nouvellement, les protistes : algues, champignons, bactéries...

Vue moderne C- Whittaker (1969) : Classification basée sur : 1. Type cellulaire 2. Organisation 3. Nutrition Donne les règnes : 1. Monères : Bactéries [procaryotes] 2. Protistes : Algues, Protozoaires 3. Mycètes : Champignons, levures 4. Plantes 5. Animaux  Virus : Non vivants mais considérés comme micro-organismes.  Règne des mon`res devrait être séparé en deux  En général, protistes sont unicellulaires et les mycètes sont pluricellulaires. C’est la principale différence entre les deux.  Les mycètes sont absolument hétérotrophes. D- Woese (1981) : basée sur caractères moléculaires •

Tous les organismes descendent du progénote, l’ancêtre commun.

1. Bacteria 2. Archaea : (biodiv 1) 3. Eukarya •

Mitochindries et chloroplastes proviennent de bactéries aérobiques et photosynthétiques (respectivement).

•

Atchaea est le plus proche d’Eukarya que bacteria  Organismes qui se développent dans des conditions particulières  C’est un état (proximité ) qui n’est pas évident d’un point de vue anatomique.

3

•

Le séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16s a permi de définir les 3 domaines de la vie.

Description comparative Trait

Bacteria

Archaea

Eukarya

Dimension

1-10 um

1- 10 um

Organelles

Pili

Pas de pili

Beaucoup d’organelles

ADN

Pas d’introns

Introns

Chromosomes

1 chromosome

1 chromosome

Histones

Plasmides

Plasmides

Aperçu historique •

Leeuwenhoek (1632 à 1723) : père de la microscopie, premier à décrire des micro-organismes (spermatozoïdes)

•

Pasteur (1822-1895) : Réfute la théorie de la génération spontanée •

Pasteurisation

•

Fermentation : aérobie/anaérobie

Génération spontanée Spallanzani (1729-1799) : expérience de Spallanzani

4

Pasteur : réfute la théorie de la génération spontanée et démontre que c’est l’air qui transporte les germes.

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•

Utilise des ballons à col de cygne

•

Si la poussière accumulée entrait avec le bouillon nutritif, la croissance microbienne est très rapide

Robert Koch(1843-1910) •

Méthode de culture pure

•

Isolation par striation (mène éventuellement à l’agar)

•

Démontre que les micro-organismes peuvent causer des maladies

•

Injecte des bactéries issues de cultures pures chez des animaux

•

Postulat de Koch

Hans Christian Gram (1884) •

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Coloration de Gram : Permet d’augmenter le contraste mais surtout de différencier les deux grands types de bactéries

Joseph Lister(ine) (1827-1912) •

Les méthodes antiseptiques : laver les mains, stériliser outils à la chaleur ou aux phénols.

Alexander Fleming (1881-1955) •

Découverte accidentelle de la pénicilline, il travaillait sur Staphylocoque, son voisin a contaminé son espace de travail avec le champignon Penicilium notatum.

Caractéristiques des bactéries •

Font partie du règne des monères selon Whittaker (1969)

•

S’adaptent très facilement : le rapport volume/surface est relativement petit, il y a donc un bon taux d’échange à travers la membrane. Permet une division très rapide et une bonne chance d’accumuler des mutations et permettre une adaptation marquée.

•

La paroi bactérie maintient l’osmolarité

•

Ils dominent la biosphère par leur activité métabolique  Environ 50% du carbone organique se trouve dans les bactéries  90% de l’azote organique se trouve dans les bactéries

•

Décomposent et recyclent les éléments chimiques

•

Eucaryotes ne sont pas essentiels aux procaryotes.

Morphologie bactérienne La morphologie bactérienne peut servir de critère de reconnaissance. 1. Cocci :  Diplocoque  Longue chaîne : streptocoque  Grappe de raisin : staphylocoque  Tétrades : micrococcus 7

 Cube : sarcina 2. Bacilles : forme de bâtonnets. 3. Autres formes : Hélices/spirale, filamenteuse, bourgeonnante et appendiculée...

Composition des bactéries Le nucléoïde est équivalent au chromosome.

Membrane plasmique •

Structure fine qui entoure la cellule

•

Chez Bacteria  Hopanoïdes : molécule très abondante et importante. Remplacent les stérols. Ce sont des homologues. Ils influencent la rigidité de la membrane plasmique.  Il y a beaucoup plus de protéines membranaires pour combler le manque d’organelles.  Il y a une différence de transporteurs dans la membrane  Il y a une controverse sur la présence de glycolipides.  Chimiotactisme : Orientation spatiale grâce à des récepteurs membranaires.

Systèmes membranaires internes Permet une augmentation de la surface

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•

Cyanobactéries

•

Bactéries pourpres

•

Bactéries nitritiantes

Inclusions cytoplasmiques Granules de matière organique ou inorganique. Ce sont des éléments nutritifs en excès Organiques : •

Glycogène : Carbone et énergie

•

Polyhydroxybutyrate (PHB) : Carbone et lipides

•

Vacuole gazeuses : Flottaison pour permettre d’obtenir des nutriments au fond de l’eau ou de la lumière plus en surface.

Inorganiques : Phosphate : granules de volutine ou de polyphosphate Soufre : H2S, donneur d’électrons pour les bactéries pourpres. Fer : Permet une orientation magnétique (on parle de magnétite) par magnétosome.

Nucléoïde (corps nucléaire) •

Dense et irrégulier : Contient 60% d’ADN, 30% d’ARN, 10% de protéines

•

1 chromosome qui code environ 3000 gènes

•

Plasmides  Petits ADN extra-chromosomiques 

Facultatifs au cycle de vie normal

 Porte des gènes particuliers  20 à 30 gènes maximum  Possibilité d’en avoir plusieurs •

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Repliement dans le nucléoïde : environ 500 fois, ordonné, replié comme un élastique tourné.

Ribosomes •

Sites de synthèse  Protéines

intracellulaires : Cytoplasme  Protéines extracellulaires : Membrane plasmique, utilisent un peptide signal. Il y a aussi un système d’exoenzymes pour dégrader les molécules trop grosses pour entrer la membrane. •

10000 ribosomes ou plus par cellule

•

Sous-unités 30s et 50s pour un total de 70s. Le ribosome bactérien est plus petit que celui des eucaryotes.

•

La transcription et la traduction se font simultanément.

•

Possèdent une structure très conservée par l’évolution. Permet de comprendre des liens évolutifs (genre la phylogénie par ARNr 16s)

Paroi bactérienne

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•

Rigide. Situé à l’extérieur de la membrane plasmique qui elle est molle.

•

Protège contre le milieu hypotonique en appliquant une pression et en limitant le volume maximal.

•

Ne protège pas contre le milieu hypertonique puisqu’il n’empêche pas l’eau de quitter le cytoplasme. On utilise ce principe dans la conservation par le sel ou le sucre.

Composition peptidoglycane :Unique aux bactéries (bonne cible pour les médicaments). Le peptidoglycane est composé d’un dimère de •

N-Acétylglucosamine (G)

•

Acide N-acétylmuramique (M) : Lié à un tétrapeptide de

 L-alanine  Acide mésodiaminopimélique (analogue lysine)  Acide D-Glutamique  D-alanine Il est important de réaliser que les peptides sont D. Normalement c’est le type L qui se retrouve dans les organismes vivants. Ils sont très rares. Cela fait en sorte qu’il n’y a pas de peptidases pour les dégrader et sont donc stables.

Pontage du peptidoglycane

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•

Lien au niveau d’e l’alanine qui termine (D-alanine)

•

Les Gram négative ont un pontage direct.

•

Les Gram positive ont des ponts de pentaglycine (5 glycines)

Paroi des Gram+

Caractéristiques importantes

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•

Couche importante de peptidoglycanes

•

Présence d’acides téichoïque et lipotéichoïques (liés aux phospholipides)

•

L'acide téichoïque est un acide qui permet au peptidoglycane de s'attacher à la membrane des bactéries. Il est présent sur les Gram + mais pas sur les Gram -, ce qui explique le fait que les bactéries à Gram - possèdent beaucoup moins de peptidoglycane

•

Espace périplasmique (périplasme) peu abondant

Paroi des Gram-

Caractéristiques importantes

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•

Peu de peptidoglycanes

•

Absence d’acide teichoïque et lipotéichoïques

•

Espace périplasmique (périplasme) important

•

Chez les GRAM-, le périplasme désigne l'espace situé entre la membrane cytoplasmique (ou membrane interne) et la membrane externe, il contient le peptidoglycane (ou muréine).

•

Membrane externe composée de lipopolysaccharides (feuillet externe) et phospholipides (feuillet interne) (bicouche lipidique)

•

Protéines transmembranaires : Porines (perméabilité) et lipoprotéines (points d’ancrage)

•

La membrane externe permet la résistance à certains antibiotiques

•

La membrane externe permet la rétention d’enzymes au niveau du périplasme.

Lipopolysaccharides (LPS) Seulement chez GramComposition •

Chaîne latérale O ou antigène O, polysaccharide très variable

•

Polysaccharide central chargé négativement, composé de cétodésoxyoctanes (KDO) et de sucres

•

Lipide A (enfoui dans le feuillet externe). Souvent toxique et faisant du LPS une endotoxine pour certains animaux

Espace périplasmique

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•

Protéines de liaison (transport de substances

•

Chimiorécepteurs (locomotion par chimiotactisme?)

•

Enzymes hydrolytiques permettant la dégradation de grosses molécules

•

Une des fonctions majeures de la membrane externe est de prévenir la sortie de protéines à l’extérieur du cytoplasme.

Coloration de Gram

•

Technique permettant de différencier les 2 types de parois bactériennes.

•

Mis au point par M. Hans Christian Gram

•

Dans la coloration de Gram, un complexe insoluble de violet de gentiane et d’iodure apparaît à l’extérieur de la cellule. CE complexe est extrait par l’alcool chez les bactéries Gram – mais pas chez les bactéries Gram +. Les bactéries Bram+ ont une paroi très épaisse constituée de plusieurs couches de peptidoglycane. Celles-ci sont déshydraté par l’alcool causant la fermeture des pores dans la paroi et empêchant alors la sortie des complexes de violet de gentiane et d’iodure de la bactérie.

Le lysozyme et la paroi bactérienne Cette protéine a été découverte par Alexander Fleming en 1922. Le lysozyme est une protéine globulaire formée d'acides aminés (129 chez l'être humain), que l'on rencontre dans un certain nombre de sécrétions (larmes, salive, lait maternel, mucus...) et dans le blanc d'œuf. Il s'agit d'une hydrolase acide. Elle détruit la paroi bactérienne en catalysant l'hydrolyse des peptidoglycanes la constituant. Hydrolyse (coupe) la liaison (lien glycosidique) qui unit le N-acétylmuramique (NAM) au N-acétylglucosamine (NAG).

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Pénicilline et paroi bactérienne Les pénicillines et les autres antibiotiques β-lactames agissent par inhibition de la formation des liens inter-peptidoglycanes dans la paroi cellulaire bactérienne. La moitié bêta-lactame des pénicillines se lie à l'enzyme (transpeptidase) qui devrait se lier aux molécules de peptidoglycane des bactéries et empêche ainsi la multiplication des bactéries. Les pénicillines tuent les bactéries contre lesquelles elles sont actives (les gram +,et quelques gram - par passage intrabacterien possible chez ces gram -). En inhibant la synthèse de la paroi bactérienne pendant la division cellulaire des bactéries (scissiparité) les cellules ne sont plus complètement formées à la fin de la phase de division ainsi la bacteries "s'autodétruit" pendant sa phase de division. Les pénicillines sont donc actives sur des bactéries en multiplication et non en phase de repos. Cependant, certains agents pathogènes développent une résistance à la pénicilline en dégradant le noyau β-lactame (par hydrolyse de la liaison amide) grâce à la β-lactamase, ce qui cause l'inactivation de l'antibiotique. Pour contrer cela, on utilise un inhibiteur de cette enzyme, l'acide clavulanique. En somme

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•

Empêche la formation des ponts peptidique (inhibe la transpeptidase)

•

Bactéries sont les seuls à posséder du peptidoglycane donc elles sont les seules affectées

•

Gram- sont plus résistants parce qu’une membrane externe protège le peptidoglycane.

Structures en périphérie de la paroi 1-Glycocalyx Couche visqueuse de polysaccharides et/ou polypeptides entourant la paroi bactérienne ou une colonie (agrégat multicellulaire) Il existe deux types de glycocalyx •

Capsule : Structure bien organisée qui s’enlève difficilement

•

Couche mucoïde : structure diffuse non-organisée qui s’enlève facilement

Fonction : •

Adhérence

•

Protection contre les bactériophages et le système immunitaire (phagocytose)

•

Protection contre la déshydratation

•

Réservoir d’éléments nutritifs

•

Glycocalyx is a general term referring to extracellular polymeric material (glycoprotein) produced by some bacteria, epithelia and other cells. The slime on the outside of a fish is considered a glycocalyx. The term was initially applied to the polysaccharide matrix excreted by epithelial cells forming a coating on the surface of epithelial tissue. External to the plasma membrane, all animal cells have a fuzzy coat called the glycocalyx. This coat consists of the carbohydrate moieties of membrane glycolipids and glycoproteins. Only identical twins have chemically identical glycocalices; everyone else is unique. The glycocalyx is a type of identification that the body uses to distinguish between its own healthy cells and transplanted tissues, diseased cells, and invading organisms. The glycocalyx also includes the cell-adhesion molecules that enable cells to adhere to each other and guide the movement of cells during embryonic development.[2] Studies have shown that the glycocalyx plays a role in modulating red blood cell filling in capillaries and it is also believed to be important in many other functions of the vascular system, but studies are ongoing

2-Fimbriae (~1000 /cellule) Structures filamenteuses à la surface qui ne sont visible qu’au microscope électronique. Composées de protéines disposées en forme d’hélice (environ 3 à 10 nm de diamètre et plusieurs μm de long) 17

Fonctions •

Adhérence

•

Biofilms

•

Facteurs de virulence : Les fimbriae jouent un rôle majeur pour expliquer la virulence de certaines bactéries dont E. coli, staphylocoques et streptocoques, gonocoques..) qui peuvent ainsi s'accrocher à leurs hôtes et mieux les infecter.

 Virulence : En médecine, la virulence correspond au degré de rapidité de multiplication d'un virus dans un organisme donné, donc à sa vitesse d'envahissement. Cela ne présume nullement de la gravité de l'affection (éventuellement) engendrée. •

Mobilité (fimbriae de type IV): Some pili, designated type IV pili, generate motile forces.[3] The external termini of the pili adhere to solid substrate, either the surface to which the bacteria are attached or to other bacteria, and subsequent pilus contraction pulls the bacteria forward, not unlike a grappling hook. As type IV pilus-mediated movement is typically jerky, it is called twitching motility, as distinct from other forms of bacterial motility, such as are mediated by flagella.

3-Pili sexuels (1 à 10/cellule)

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•

Structure similaire aux fimbriae, mais un peu plus épaisse (10 nm de diamètre)

•

Déteminés génétiquement par des plasmides.

•

Permet la conjugaison

•

A pilus is typically 6 to 7 nm in diameter. During bacterial conjugation, a sex pilus emerging from one bacterium ensnares the recipient bacterium, draws it in, and eventually triggers the formation of a mating bridge, which establishes direct contact, merging the cytoplasms of two bacteria via a controlled pore. This pore allows for the transfer of bacterial DNA from the bacteria with the pilus (donor) to the recipient bacteria. Through this mechanism of genetic transformation, advantageous genetic traits can be disseminated amongst a population of bacteria. Not all bacteria have the ability to create sex pili, however sex pili can form between bacteria of different species.

•

The fertility factor is required to produce sex pili. C’est un plasmide.

•

Role of F Pili in the Penetration of Bacteriophage fl: The results showed that the average number of F pili with f1 attached decreased with time as phage deoxyribonucleic acid (DNA) entered the cell. Concomitant with this loss, the remaining F pili became shorter. The rate of entry of phage DNA into the cell followed, with a short lag, the rate of loss of F pili with f1 attached. During the lag period, intact phage particles accumulated at the surface of the cell. The results from radioautographs showed that no phage DNA could be located within the F pilus. These results suggest that F pili are resorbed by the cell during infection with the bacteriophage f1. Parallel experiments with noninfected cultures further suggest that pilus resorption may be a normal cellular phenomenon.

4-Flagelles •

Appendices locomoteurs s’étendant à l’extérieur de la membrane cytoplasmique et de la paroi cellulaire

•

Ils mesurent de 15 à 20 μm de long et ont 20nm de diamètre

•

Présents chez environ 50% des procaryotes

Ultrastructure du flagelle Contient trois éléments : Filament, crochet, corps basal

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Filament : Partie la plus longue qui émane de la surface de la cellule. Cylindre creux non flexible formé de sous-unités protéiques de flagelline. Forme d’hélice pouvant se régénérer. Crochet : Segment court et courbe qui unit le filament au corps basal. Plus large que le flagelle. Corps basal : C’est le moteur fournissant l’énergie nécessaire à la rotation du flagelle. Enfoui dans la cellule (paroi et membrane). Différente selon Gram+ ou Gram-.

Mécanisme de propulsion L’essieu tourne dans la membrane, entraînant le flagelle qui propulse la bactérie Vitesse absolue de 100 μm/seconde Vitesse relative de 50 unités corporelles /seconde

Chimiotactisme bactérien

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•

Deux types : Chimiotactisme positif (la bactérie s’approche vers la substance nutritive) et chimiotactisme négatif (la bactérie s’éloigne d’une substance nocive).

•

Le chimiotactisme est la tendance des cellules et plus particulièrement des leucocytes ou des organismes mobiles à se déplacer dans une direction déterminée sous l'influence de divers stimuli (stimulations).

Ces stimuli sont émis par des substances chimiques. Le chimiotropisme appelé également profond tropisme caractérise par une simple orientation non accompagnée de mouvements, c'est-à-dire de déplacement dans l'une ou l'autre direction.

se

Endospore bactérien Définition : Organite facultatif qui se forme au sein du cytoplasme de certaines espèces bactériennes au moment de stress. L’endospore diffère de la cellule végétative par sa forme, sa structure, son équipement enzymatique et sa résistance. La sporulation est le phénomène de différenciation qui conduit de la forme végétative à l’endospore. La cellule mère restante est appelée sporange. Caractéristiques des endospores •

Résistance à la chaleur, sécheresse, U.V. et désinfectants chimiques. Les tuniques internes et externes rendent la spore imperméable et sont responsable de sa résistance aux antibiotiques.

•

Certains endospores sont restés viables pendant plus de 100 000ans.

•

Composés d’acide dipicolinique complexé au Ca2+ (15% du poids sec). Stabilise les acides nucléiques de la spore en s’intercalant entre les bases et empêchant ainsi sa dénaturation par la chaleur. Réduit la biodisponibilité de l’eau favorisant la déshydratation de la spore.

•

pH légèrement acide

•

Petites protéines acido-solubles

•

Le cortex est composé d’une structure analogue au peptidoglycane classique.

Anatomie des spores Types d’endospores

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-

Centrale (a)

-

Subterminale (b)

-

Terminale (c)

-

Sporange gonflé (d)

Structure de l’endospore Exosporium (EX) : -Enveloppe mince et délicate Tunique(SC) : Plusieurs couches protéiques assez épaisses procurant une imperméabilité aux toxines et produits chimiques. Cortex (CX): Occupe plus de la moitié du volume de la spore. Constitué de peptidoglycanes. La paroi de la spore est dans le cortex. Protoplaste : Nucléoïde(N) et ribosomes cytoplasmiques (CR). Le métabolisme est inerte. •

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La sporulation est une série d’événements complexes de différenciation cellulaire. Elle intervient lorsque la reproduction cesse par manque de nutriments. Chez Bacillus subtilis, le processus entier de sporulation dure environ 8 heures.

Sporulation

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Les 7 stades de sporulation Stade I (ou stade du filament axial) : Se caractérise par la présence d'un matériel nucléaire qui s'étend sur toute la longueur de la cellule et qui correspond à 2 génomes. Stade II : Les deux génomes se séparent et en même temps la membrane cytoplasmique s'invagine près d'un pôle de la cellule pour former un septum de sporulation qui partage la cellule en deux parties inégales. Stade III : Ce septum de sporulation va envelopper le cytoplasme (enkystement) de la plus petite partie pour former une préspore caractéristique du stade III. Formation du protoplaste.

Stade IV : Entre les deux membranes limitant la préspore se forme l’exosporium puis apparaît rapidement le cortex dont la présence est caractéristique du stade IV. Stade V : Incorporation de Ca2+, déshydratation avancée, synthèse de SASP et d’acide dipicolinique, formation des tuniques. Stade VI : Maturation, développement de la résistance à la chaleur et aux agents chimiques. Stade VII : La cellule mère se lyse et libère la spore mature.

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Germination Lorsque les conditions deviennent favorables, l’endospore peut germer et donner naissance à une cellule active. La germination est un processus habituellement rapide (de l’ordre de quelques minutes).

Chapitre III Nutrition et croissance des microorganismes

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Besoins nutritifs courants

•

Les macroéléments représentent 95% de la masse sèche

S S S

Métabolisme Désigne l’ensemble des réactions chimiques au sein d’une cellule Catabolisme : La complexité des molécules diminue (dégradation). Oxydation. Anabolisme : La complexité des molécules augmente (biosynthèse). Réduction.

Sources d’énergie •

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Phototrophie :Les mécanismes utilisent la lumière comme source d’énergie sont uniques et complexes et génèrent une force protonmotrice qui est employée pour synthétiser l’ATP par un processus appelé photophosphorylation. La plupart des phototrophes ont reecours à l’énergie de l’ATP pour assimiler du CO2 comme source de

carbone pour leurs biosynthèses; ce sont les photoautotrophes. Certains utilisent des composés organiques comme source de carbone et la lumière comme source d’énergie. Ce sont des photohétérotrophes. Il existe deux processus photosynthétiques différents mais apparentés : la photosynthèse oxygénique et la photosynthèse anoxygénique. •

Chimiolithotrophie : Utilisation de composés inorganiques à la place de composés organiques comme donneurs d’électrons (réducteurs). H2S (hydrogène sulfureux), H2 (gaz hydrogène) et NH3 sont des exemples de donneurs de réducteurs inorganiques.

•

Chimioorganotrophie : Utilisation de composés organiques comme donneurs d’électrons.

Besoins nutritifs

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•

Source de carbone : CO2 pour les autotrophes, molécules organiques préformées et réduites pour les hétérotrophes.

•

Source d’énergie : Lumière pour les phototrophes. Oxydation des composés organiques et inorganiques (H2S, NH4+, Fe2+)

•

Source d’électrons : Litotrophies ont besoin de molécules inorganiques réduites. Les organotrophes ont besoin de molécules organiques réduites.

Pour les bactéries non sulfureuses, relativement au premier groupe qui utilisent le sulfure d’hydrogène comme donneur d’électrons, eux utilisent une source de carbone organique. Le dioxyde de carbone est une source de carbone extrêmement oxydée qui fait en sorte que ce n’est pas une source d’énergie utilisable pour beaucoup d’organismes. Exigences nutritionnelles

1-Carbone Unité structurale de base de toutes molécules organiques •

Source de carbone inorganique pour les autotrophes : Les chimioautotrophes et les photoautotrophes peuvent utiliser le CO2 comme seule source de carbone pour la biosynthèse de leurs macromolécules.

•

Source de carbone organique pour les hétérotrophes

1. Substances hydrocarburées pour les organismes hétérotrophes: glucides, protides, lipides, hydrocarbures, acides organiques, polyalcools. Presque toutes les substances carbonées peuvent être dégradées. Lorsqu’aucun chimiohétérotrophe ne peut dégrader une substance, elle est considérée comme non-biodégradable.

2-Azote Essentiel pour la synthèse des acides aminés (permet protéines), bases azotées (purines et pyrimidines), certains glucides/lipides, cofacteurs enzymatiques Forme inorganique pour certains micro-organismes •

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Azote atmosphérique (N2) : Fixation de l’azote atmosphérique (besoin de nitrogénase). Certaines bactéries seulement : Rhizobium et Azotobacter.

•

Ammoniaque (NH3) : Oxydation de l’ammoniaque en nitrites (nitrosation). Exemple de Nitrosomas

•

Nitrites (NO2) : Oxydation des nitrites en nitrates (NO3) par nitration. Exemple de Nitrobacter. Nitrification= nitrosation + nitration.

•

Sels d’ammonium (NH4+) : Plusieurs espèces par exemple E. coli

Forme organique utilisée par un grand nombre de micro-organismes •

Composés azotés tels que les acides aminés, les bases azotées, les phospholipides.

3-Phosphore Élément essentiel des acides nucléiques, de nombreux coenzymes et de l’ATP. Absorbé sous forme inorganique (PO42-)

4-Soufre Élément essentiel de certains acides aminés (cystéine,méthionine) Principalement absorbé sous forme de sulfate (SO42-) ou de composés soufrés organiques (cystéine)

5-Ions inorganiques (Na+,K+, Mg2+, Fe2+, Ca2+, Co2+, Cu2+ ,Mn2+ ,Zn2+) Essentiels pour l’équilibre physicochimique de la cellule. Constituants d’enzymes et coenzymes, constituants des structures cellulaires, cofacteurs enzymatiques.

6-Facteurs de croissance Composés organiques essentiels à la croissance que la bactérie ne peut synthétiser elle-même (doivent être préformés) Trois types : Acides aminés, vitamines et bases azotées. •

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Prototrophe : micro-organisme de type sauvage du point de vue nutritionnel. Autonome, pouvant croître sur un milieu minimal. C’est relativement à la souche et non pas par rapport à tous les microorganismes (voir la définition d’auxotrophe)

Pour définir un milieu minimal, il faut déterminer les exigences nutritionnelles minimales du micro-organisme (différent d’un organisme à l’autre). •

Auxotrophe : Mutant biochimique d’un organisme dont la différence avec le type sauvage (prototrophe) porte sur une exigence nutritionnelle (facteur de croissance). Il y a perte de capacité à synthétiser certains métabolites essentiels (comparé au type sauvage). Incapable de croître sur un milieu minimal.

Exemple du mutant E. coli arg- : il nécessite un ajout d’arginine dans le milieu minimal du prototrophe pour pouvoir croître.

7-Eau Principal constituant cellulaire des micro-organismes. Indispensable comme solvant et dans les réactions biochimiques. Les états de l’eau : Eau liée : liée aux macromolécules, ions ou toute surface hydrophile Eau libre : suffisamment éloignée d’une surface chargée et libre de ses mouvements, propriétés physico-chimiques normales. Seule l’eau libre du milieu est disponible pour les micro-organismes Activité de l’eau libre : indice de la disponibilité de l’eau pour les microorganismes. Si on prend un bécher avec de l’eau pure, l’eau n’est pas liée et peut s’évaporer comme normalement. Si on ajoute des solutés, plus l’eau est liée et plus l’activité de l’eau est base. Par définition l’activité de l’eau est inférieure à 1, automatiquement inférieur à l’eau pure s’il y a formation de ponts H. Aw (Activity water) = La plupart des micro-organismes nécessitent une grande quantité d’eau libre pour leur croissance.

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L’eau n’est plus disponible pour permettre la croissance.

8-Oxygène Accepteur final d’électrons dans la chaîne respiratoire pour les organismes aérobiques. Toxique pour les bactéries anaérobiques. •

Eucaryotes : L’oxygène est presque toujours essentiel. Certaines levures peuvent croître en absence d’oxygène (fermentation).

•

Procaryotes (bactéries) : L’oxygène peut être essentiel, toléré ou encore toxique.

5 groupes de bactéries selon leur réponse à l’égard de l’oxygène. 1. Aérobies stricts : Bactéries qui exigent obligatoirement l’oxygène libre pour se multiplier. L’oxygène libre est utilisé comme accepteur final d’électrons dans la chaîne respiratoire. Exemples : Nitrobacter, Nitrosomas, la plupart des Pseudomomas. 2. Microaérophiles : Bactéries qui ne se développent qu’en présence d’une faible pression d’oxygène libre, inférieur à celle de l’atmosphère. Pression d’oxygène libre de 2 à 10% et non 21% comme l’air Exemples : Azotobacterm Hydrogenomonas, Campylobacter 3. Anaérobie strict ou obligatoire : Bactéries qui ne peuvent se multiplier qu’en absence totale d’oxygène libre. L’oxygène libre ne peut être utilisé comme accepteur final d’électrons dans la chaîne 31

respiratoire. Elles utilisent d’autres substances oxydatrices comme des nitrates, des sulfates ou des carbonates comme accepteur final d’électrons. C’est la respiration anaérobie. Exemple : Clostridium, Veillonella, Desulfovibrio, Bacteroides. Si l’accepteur final est un composé organique, on parle alors de la fermentation. Il y a alors dégradation incomplète du glocuse.

4. Anaérobie facultatif (aéro-anaérobies) : Bactéries capables de croître en présence ou en absence totale d’oxygène libre. Ces bactéries peuvent se développer à l’airde de la respiration (aérobie) ou de la fermentation (anaérobie) Exemple : la très grande majorité des espèces bactériennes. 5. Anaérobies aérotolérants : Bactéries anaérobies mais qui ne sont pas tuées par la présence d’oxygène. En présence d’oxygène, leur croissance est plus faible que celle des anaérobies facultatifs car elles n’utilisent pas l’oxygène. Exemple : Enterococcus faecalis

La respiration anaérobie : L’accepteur final d’électrons n’est pas l’oxygène mais des nitrates, sulfates, carbonates...

32

Bouillon nutritif au thioglycolate (agent réducteur)

Toxicité de l’oxigène :il est potentiellement toxique car la réduction de l’oxygène (gain d’électrons) produit une suite de radicaux libres. La réduction de l’oxygène provoque une série de radicaux libres toxiques O2

+ e-

=

O2-.

(anion superoxyde, très réactif)

O2-. + e- + 2H+

=

H2O2

(peroxyde d’hydrogène)

H2O2 + e- + H+

=

H2O + OH. (radical hydroxyle)

OH. + e- + H+

=

H2O

(eau)

Le processus est accéléré par deux enzymes : 1. Superoxyde dismutase (SOD) : Dismutation 2 O2- + 2 H+

=

H2O2 + O2

2. Catalase : transformer le peroxyde en eau et en oxygène 2 H2O2

33

=

2 H2O + O2

Il semble y avoir une corrélation directe entre la présence des enzymes et le mode de respiration.

Croissance On peut faire croître les bactéries anaérobies par 1. Bouillon thyoglycolate 2. Système GasPak : Contenant hermétique dans lequel on met le GasPak qui élimine l’oxygène dans le récipient. 3. Chambre de travail anaérobie.

34

Facteurs physiques influençant la croissance des micro-organismes Température

35

•

La température est un facteur très important dans la croissance des micro-organismes à cause de l’activité enzymatique.

•

Elle affecte directement les réactions enzymatiques (métabolisme)des micro-organismes

•

Température minimale: Température la plus basse à laquelle un microorganisme peut croître

•

Température optimale: Température idéale permettant aux microorganismes un taux de croissance maximal

•

Température maximale: Température la plus élevée à laquelle un micro-organisme peut croître

•

La température optimale de croissance des pathogènes de l’humain est très près de la température du corps humain

Le pH L'activité enzymatique des micro-organismes est directement influencée par le pH. En milieu acide ou en milieu alcalin, les enzymes sont normalement inactivées. •

pH minimal: valeur de pH la plus basse à laquelle un micro-organisme peut croître

•

pH optimal: valeur de pH idéale permettant aux micro-organismes un taux de croissance maximal

•

pH maximal: valeur de pH la plus élevée à laquelle un micro-organisme peut croître

•

Type de micro-organismes selon le pH optimal: Acidophiles : pH 0-5.5 Neutrophiles : pH 5.5-8.0 Alcalophiles: pH 8.5-11,5

36

•

Les bactéries préfèrent un milieu à pH 6-7 tandis que les mycètes préfèrent un pH à ~5-6

Pression osmotique : Les solutés et l’activité de l’eau •

La présence d’une membrane plasmique à perméabilité sélective fait en sorte que les micro-organismes sont affectés par des modifications de la concentration en solutés (concentration osmotique) de leur milieu

•

Lorsque les bactéries sont placées en milieu hypotonique, l'eau entre dans la cellule mais la paroi oppose une certaine résistance mécanique à la pression osmotique

•

Lorsqu’une bactérie est placée en milieu hypertonique, l'eau quitte la cellule au profit du milieu ambiant (déshydratation) - Plasmolyse (la membrane se rétracte de la paroi) - Faible disponibilité en eau libre

Types de micro-organismes selon leur réponse à la pression osmotique •

Osmotolérants: tolèrent une pression osmotique élevée Ex: Champignons et confitures, Staphylococcus (tolère de 5-20% NaCl)

• 37

Osmophiles: nécessitent une pression osmotique élevée pour croître (milieux hypertoniques)

•

Halophiles: nécessitent une concentration en NaCl > 2% Ex: Pseudomonas, Vibrio vulnificus (3.5% NaCl), Halobacterium, Vibrio costicolus (20-30% NaCl) (bactéries des saumures)

•

Composés osmocompatibles ou osmorégulateurs: Glycine, bétaïne, glycérol, etc. Permettent d’ajuster l’activité de l’eau du cytoplasme sans nuire aux réactions biochimiques des cellules. Petites molécules relativement inertes et faciles à synthétiser.

Milieux de culture 1. Milieux de culture liquides : Bouillon de culture 2. Milieux solides : Même composition que les bouillons sauf qu’on ajoute de l’AGAR à 1,2-1,5%  Agar : Polysaccharide extrait d’une algue rouge utilisée comme agent gélifiant (non métabolisable par les micro-organismes).  Colonie : une seule cellule qui se divise pour former une population d’individus identiques (culture pure). Aspect macroscopique des colonies Aspect macroscopique : Taille, forme, couleur, texture, relief, odeur, … sont des caractéristiques génétiques de l'espèce microbienne (critères d'identification)

38

Types de milieux de culture 1. Synthétique ou définis : Composition chimique connue. Milieux pauvres permettant la croissance de certains micro-organismes seulement. 2. Complexes (empiriques) : Composition chimique imprécise. Milieux riche permettant la croissance d’une grande variété de microorganismes. 3. Enrichis : Milieux complexes enrichis de certains additifs (sang, sérum...). Favorisent la croissance de certains micro-organismes exigeants comme les hétérotrophes fastidieux.

Milieux de culture selon l’usage •

Milieux de base ou de propagation : Permettent la croissance de la plupart des micro-organismes Ex : bouillon nutrient broth (NB) pour E. coli

•

Milieux sélectifs : Contiennent Contiennent des composés qui inhibent de façon sélective la croissance de quelques micro-organismes sans en affecter d’autres

Ex: La gélose MacConkey contient des sels biliaires et du cristal violet qui inhibent la croissance des bactéries Gram + (favorise Gram-) •

Milieux différentiels: Contiennent des agents spécifiques permettant de déterminer la présence (ou l’absence) de caractères particuliers

Ex: La gélose MacConkey contient du lactose et du rouge neutre(indicateur de pH); La fermentation du lactose change le pH du milieu et par le fait même la coloration du rouge neutre (indicateur du pH)

Culture pure •

Définition : culture composée d’une seule espèce de micro-organisme

•

L’isolement se fait toujours sur gélose et non en milieu liquide

1. Isolement par striation: A l'aide d'un manche de Koch stérile (fil de platine), les micro-organismes sont étalés progressivement par des mouvements de va-et-vient (stries) à la surface d'une gélose. L'épuisement de l'inoculum lors de ces striations produira normalement des colonies isolées dont chacune constituera une culture pure. 2. Isolement par dilution en milieu liquide: dilutions successives en milieu liquide afin d'obtenir une dilution de l'inoculum permettant la croissance de colonies isolées sur une gélose 39

Croissance des micro-organismes •

Définition : La croissance est définie par un accroissement du nombre de cellules ou de la masse cellulaire totale

•

Chez la plupart des procaryotes, la croissance d’une cellule se poursuit jusqu’à sa division en deux nouvelles cellules par fission binaire

Mesure de la croissance bactérienne Décompte total des micro-organismes •

Chambre de comptage observée au microscope  Hémocytomètre: Les levures et cellules mammifères  Cellule de Petroff-Hausser: Les bactéries

•

Avantage  facile à utiliser, rapide et peu coûteux  informations sur la taille/morphologie des microorganismes

•

Désavantages  densité microbienne élevée  décompte des cellules mortes et vivantes

*Il existe maintenant des kits commerciaux permettant de distinguer les cellules mortes et vivantes (Live/Dead BacLight Bacterial Viability) Hémocytomètre •

Dimensions: 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 1/10000 cm3

•

Cellules/ml: 10000 x cellules comptées x facteur de dilution

Cellule de Petroff-Hausser 40

•

Dimensions : 10 fois plus petit que l’hémocytomètre

•

Cellules/ml: 100000 x cellules comptées x facteur de dilution

Décompte des unités viables (capables de se reproduire) •

Méthode des dilutions en milieu liquide et d'étalement sur gélose

•

Avantages  Les colonies proviennent seulement des cellules vivantes capables de se reproduire

•

Désavantages  Amas de cellules = 1 colonie (Unités Formant des Colonies) (UFC)  Cellules Viables Non Cultivables (VNC)

•

41

Méthode des filtres de cellulose : L’échantillon est passé sur un filtre de cellulose dont la porosité retient les micro-organismes.

Méthode de mesure de la croissance des microorganismes indirectes 1. Mesure de l’activité •

En mesurant la consommation de substrats (C, N2, O2 ou un facteur spécifique de croissance), la concentration des constituants cellulaires (ATP, FAD ou FMN, ADN, gr de protéines) ou l'excrétion de certains produits (CO2 ou NH3), il est possible d'évaluer la concentration microbienne d'un échantillon

2. Mesure de la masse cellulaire •

Mesure de la masse cellulaire par le poids sec

 Récolte des micro-organismes (filtration sur membrane)  Lavage + dessiccation (100 à 110oC)  Pesée (toutes les bactéries, mortes ou vivantes sont pesées)  Valeurs exprimées en g/L  Valeurs exprimées en cellules/ml (nécessite un décompte cellulaire avant de récolter les bactéries) •

Mesure de la masse cellulaire par la turbidité par la densité optique (D.O.)  Évaluation de la concentration cellulaire à l'aide de sa densité optique [D.O.] (absorption lumineuse) à une certaine longueur d'onde (Ex 600 nm)  Dans une certaine limite (106/ml < [ ] < 108/ml), la D.O. d'une suspension microbienne est directement proportionnelle à sa concentration cellulaire

42

 Pour évaluer la concentration microbienne d'une suspension inconnue, on doit établir à l'aide d'un spectrophotomètre une courbe de référence pour des concentrations microbiennes connues

Cycle cellulaire procaryote

Courbe de croissance microbienne La courbe de croissance d'une population bactérienne se développant dans un milieu de culture liquide (système fermé) peut être représentée par le log10 de la concentration bactérienne (bact./ml) en fonction du temps d'incubation (heures).

On observe alors 4 phases de croissance

43

1) Latence •

Phase d’adaptation dans laquelle il n’y a aucune division cellulaire

•

Synthèse de nouvelles composantes cellulaires

•

Augmentation de la masse cellulaire (fin de la phase de latence)

•

La durée de la phase de latence varie en fonction  de l'âge des bactéries  de l'origine (composition et température du milieu)

2) Exponentielle (logarithmique) •

Accélération de la croissance des bactéries ainsi que de la division cellulaire (début de la phase)

•

Les micro-organismes se développent et se divisent à la vitesse maximale

•

Les constituants cellulaires sont synthétisés à des vitesses constantes les unes par rapport aux autres (croissance à l’équilibre)

•

La phase de croissance exponentielle est de courte durée

3) Stationnaire 44

•

Le nombre total de micro-organismes viables reste constant (Équilibre entre division et mort cellulaire)

•

Causes  Limitation des nutriments (système fermé)  Accumulation de conditions défavorables (déchets toxiques, acidité,…)  Niveau de densité cellulaire critique

Un milieu pauvre va faire entrer en phase stationnaire très rapidement. Dépend des nutriments. 4) Phase de mortalité : Arrêt de la division cellulaire •

Le nombre de bactéries viables ou cultivables diminue de façon constante en fonction du temps

•

Cause  Dégâts irréparables conduisant à une perte de viabilité  Réponse génétique déclenchée dans les cellules carencées en phase stationnaire  Formation de cellules viables non cultivables (VNC)  Mort cellulaire programmée

Expression mathématique de la croissance bactérienne 1. Temps de génération ou de doublement (g) : intervalle entre deux divisions cellulaires successives. G= temps/nombre de générations 2. Taux de croissance (k) : Nombre de générations par unité de temps, inverse du temps de génération. 3. Nombre de génération (n) : Nombre de génération à un moment, dépend du nombre de cellules initiales évidemment. N= (Log(nombre de cellule au temps t)-Log(nombre initial de cellule de la population))/log2

45

Chémostat Système de culture continue (ouvert)

Chapitre IV : Rôle des agents physiques et chimiques sur les bactéries •

Contribution des bactéries au bien être de l’humain :  Production de médicaments/additifs alimentaires,…  Produits alimentaires (yogourt, fromage,...)

46

 Décontamination des sols •

Cause des problèmes de santé et économiques :  Maladies, infections  Contamination et détérioration des aliments

•

Il faut des méthodes pour éliminer l’effet indésirable des microorganismes  Importance d’outils stériles lors de chirurgie  Importance de ne pas contaminer une chaîne de production

•

Historiquement  Les gens préservaient les aliments par des méthodes de salage, séchage, sucrage et cuisson.

Terminologie INANIMÉS •

Stérilisation [PARFAIT]: L’élimination complète ou la destruction de tous les micro-organismes viables (forme végétative et forme sporulée). Utilisée sur les objets inanimés.

•

Désinfection [IMPARFAIT, INANIMÉ]: Destruction ou élimination des agents pathogènes végétatifs mais pas des endospores bactériennes. Ordinairement utilisée uniquement sur les objets inanimés.

•

Décontamination [moins poussé que la désinfection, INANIMÉ]: Réduction de la population microbienne à un niveau sans danger selon les normes d’hygiène publique. Utilisée sur les objets inanimés.

VIVANTS

S S 47

•

Antisepsie :Agents chimiques appliqués sur des surfaces du corps pour détruire ou inhiber les agents pathogènes.

•

Chimiothérapie: Agents chimiques utilisés pour tuer ou inhiber la croissance de micro-organismes à l’intérieur des tissus de l’hôte, toutes les thérapies à base d’agents chimiques dont les antimicrobiens.

S S S

Antimicrobiens Deux types, statiques ou -cides (tueurs) 1. Substances qui empêchent temporairement le développement des micro-organismes sans les tuer •

EFFET RÉVERSIBLE

•

Activité ‘statique’

•

(Bactériostatique, fongistatique)

2. Substances qui tuent les micro-organismes •

EFFET IRRÉVERSIBLE

•

Activité ‘cidique ou cide’

•

(Bactéricide, fongicide, algicide, virucide)

•

Meilleur moyen de s’assurer que les bactéries sont mortes : remettre l’objet dans un milieu de croissance propice à la croissance des microorganismes et examiner s’il y a croissance microbienne.

Cinétique de la mort bactérienne Courbe de létalité

48

•

Une population microbienne n’est pas tuée instantanément lorsqu’elle est exposée à un agent létal

•

La population est réduite de la même fraction (et non du même nombre de bactéries) à intervalles constants (taux de mortalité)

•

Tout comme la courbe de croissance d’une population la courbe de létalité est logarithmique. La pente de la droite est cependant négative

•

*Courbe logarithmique à pente négative*

•

Plus le taux de mortalité est grand et plus la pente de la droite est forte

s

Pente du taux de mortalité

49

Facteurs affectent l’efficacité d’un agent antimicrobien

1-

Facteurs biologiques

•

Taille de la population  Il faut plus de temps pour détruire une grosse

population qu’une petite (préférable de nettoyer avant d’appliquer le traitement) 50

•

Composition de la population  Les endospores sont plus résistantes que les formes végétatives  Les bactéries avec une capsule (glycocalyx) sont plus résistantes  Les cellules plus jeunes plus vulnérables que les cellules matures

2-Facteurs chimiques •

Concentration de l’agent  La plupart du temps l’efficacité croît avec la concentration d’un produit chimique ou de l’intensité d’un agent physique  Courbe d’efficacité d’un agent n’est pas nécessairement linéaire  Parfois un agent est plus efficace à plus faible concentration (Ex: l’éthanol est plus efficace à 70% qu’à 95%, car l’eau augmente son efficacité)

•

Temps de contact  Plus longue est la durée d’exposition et plus nombreux sont les microorganismes tués  Temps de contact varie selon les agents chimiques/physiques  Pour réussir une stérilisation, il faut utiliser une durée d’exposition suffisante pour réduire la probabilité de survie à 10-6 ou moins. On ne retrouve presque jamais autant d’endospores donc c’est effectivement une stérilisation.

3- Facteurs environnementaux • 51

La température

 L’efficacité d’un agent croît généralement avec l’augmentation de la température  À une température élevée on peut utiliser un agent en concentration moindre (coûts moins élevés) •

Le pH  Modifie les charges électriques des macromolécules et influencent la dissociation et l’ionisation  Selon l’agent considéré le pH aura une influence positive ou négative. : La chaleur tue plus facilement à pH acide  Présence de matière organique  Les protéines ont une grande affinité pour de nombreux antiseptiques (réduit le nombre de molécules pouvant tuer les micro-organismes) Ex: Action des antiseptiques diminuée par la présence de sang, pus, …

Méthodes physiques dans le contrôle des microorganismes Basse température •

Les basses températures ne tuent pas les micro-organismes mais ralentissent leur métabolisme et par conséquent leur multiplication (effet statique)

•

La basse température est une méthode très importante en microbiologie alimentaire

1) Réfrigération • Ralentit fortement la croissance et la multiplication microbienne, mais ne l’arrête pas complètement. • On peut conserver des micro-organismes durant une longue période en les réfrigérant entre 4 et 7oC

52

2) Congélation • Une température de -20oC ou plus bas arrête la croissance des microorganismes à cause de la température basse et de l’absence d’eau liquide. (Congélateur: -18oC ; Glace sèche : -70oC ; Azote liquide : -195oC) • Certains micro-organismes seront tués par la rupture des membranes suite à la formation des cristaux de glace, mais la congélation ne détruit pas tous les germes. • Permet aussi de conserver certains micro-organismes.

• Lyophilisation: permet d’éviter la formation de cristaux de glace à l’aide de la surgélation puis une évaporation sous vide de la glace sans la faire fondre. Le principe de base est que lorsqu’on réchauffe de l’eau à l’état solide à très basse pression, l’eau se sublime, c’est-à-dire qu’elle passe directement de l’état solide à l’état gazeux. La vapeur d’eau (ou de tout autre solvant) quitte le produit et on la capture par congélation à l’aide d’un condenseur, ou piège froid. Cette technique permet de conserver à la fois le volume, l’aspect et les propriétés du produit traité.

Haute température •

Le traitement thermique est la méthode la plus employée pour contrôler le développement des micro-organismes

•

La chaleur agit en tuant les micro-organismes

•

La chaleur humide agit essentiellement en dénaturant les protéines et l’ADN alors que la chaleur sèche, par oxydation

1) Stérilisation thermique •

La stérilisation consiste à tuer tous les micro-organismes (forme végétative et forme sporulée) contenus dans une préparation (effet bactéricide, fongicide et virucide)

1-1) Stérilisation par la chaleur humide (L’autoclave (inventé par Chamberland en 1884)) Les micro-organismes (incluant les endospores) sont normalement tués (stérilisation) à l’autoclave en 15 minutes à 121oC sous 103,4 kPa (15 livres/pouce2) de pression (la chaleur humide est très pénétrante) 53

Avantages:- simple, rapide, efficace et peu dangereux 1-2) Stérilisation par la chaleur sèche (Le four Pasteur et le flambage direct) •

Stérilisation au four Pasteur pendant 2 heures à 170oC (La chaleur sèche est moins pénétrante que la chaleur humide)

•

Objets en verre ou en métal, matières grasses peu miscibles avec l’eau

•

Le flambage direct est l’une des méthodes les plus simples de stérilisation à la chaleur sèche (Ex: Anse de repiquage au laboratoire, incinérateur…)

2) Désinfection thermique: Consiste à tuer les pathogènes sans nécessairement stériliser (exclue les endospores donc croissance subséquente possible) 2-1) Ébullition

54

•

L'ébullition (100oC) pendant 10 minutes ne peut être considérée comme une méthode de stérilisation

•

Ce procédé détruit rapidement les micro-organismes non sporulants (bactéries végétatives) et la majorité des virus sans affecter les endospores

•

Par contre c’est un moyen pratique pour détruire les entérobactéries et les entérovirus

2-2) Appertisation •

Comme pour l'ébullition, ce procédé thermique ne peut être considéré comme une méthode de stérilisation

•

L'appertisation est un procédé de conservation des denrées alimentaires par l'ébullition (100oC) prolongée des aliments dans des récipients hermétiquement fermés (pas de contamination de l’air)

3-2) Tyndallisation •

Consiste à chauffer le milieu à 60oC ou 70oC durant 30 minutes ou 1 heure, trois fois consécutives, en ménageant un intervalle de 24 heures entre chaque chauffage

•

Repose sur le principe que les endospores peuvent germer entre les périodes de chauffage; les formes végétatives qui en découlent vont être détruites durant les périodes de chauffage suivantes

•

Stérilisation incertaine

4) Pasteurisation • Comme pour l'ébullition et l'appertisation, la pasteurisation ne peut être considérée comme une méthode de stérilisation • La pasteurisation est plutôt un procédé par lequel on expose un produit thermosensible (ex: produits laitiers) à une température modérée pendant une courte période • Cette pasteurisation permet l'inactivation des micro-organismes non sporulants pathogènes (ex: Mycobacterium tuberculosis) sans altérer les caractères organoleptiques et nutritifs du produit

• Pasteurisation LTH (Low Temperature Holding) : 30 min à 62,8oC

55

• Pasteurisation HTST (High Temperature Short Time) : 15 sec à 71,7oC : Lait, jus et autres liquides thermosensibles • Pasteurisation UHT (Ultra High Température) : 2 sec à 141,0oC: Lait Grand Pré qui se conserve à la température de la pièce avant ouverture, crème/lait à café

Efficacité de la destruction thermique •

Temps de réduction décimale (D ou valeur D):

•

Temps requis pour tuer 90 % des micro-organismes ou des endospores d’un échantillon à une température spécifique.

Filtration Très utile pour réduire le nombre de bactéries dans une solution thermosensible ou même la stériliser si aucun micro-organisme n’a traversé le filtre 56

Ex: produits pharmaceutiques, milieux de culture, huiles, antibiotiques, etc. Les bactéries ne sont pas détruites, elles sont simplement éliminées de la solution. Le récipient sous le filtre doit être préalablement stérilisé. Par contre, certains micro-organismes sont plus petits que le diamètre des pores ou n’ont pas de paroi (mycoplasmes, rickettsies, chlamydia, virus).

Filtration des solutions 1) Les filtres épais (très poreux) •

Constitués de matières fibreuses ou granuleuses

•

Retiennent les bactéries par piégeage dans des canaux sinueux ou en surface

•

Ex: - Filtres de Berkefield en terre de diatomées (système de traitement d’eau), filtres de porcelaine (Chamberlain)

2) Les membranes filtrantes •

Disques poreux et minces de 0,1 mm d’épaisseur.

•

Taille des pores disponible dans une grande variété, mais souvent 0,2 mm

Filtration de l’air •

Stérilisation de l’air en le faisant passer dans des filtres qui retiennent les micro-organismes

•

Ex.: Masques chirurgicaux, bouchon de ouate sur les flacons de culture, Hottes à flux laminaire avec filtres HEPA (High-Efficiency Particulate Air filters) qui retiennent 99,97% des particules de 0,3 μm de diamètre.

Radiations Les radiations ultraviolettes(UV) 57

•

Région de 260-270 nm est très létale (les protéines et l’ADN absorbent les UV) mais ces radiations ne pénètrent pas bien (ex: bloquées par le verre, la poussière,…)

•

Utilisations  Désinfecter/décontaminer les surfaces, l’air et les matériaux qui n’absorbent pas les radiations UV, l’eau,…

Les radiations ionisantes (rayons X et gamma)(60Co et

137

Cs)

•

Très énergétiques; production d’ions et autres espèces moléculaires réactives à partir des molécules auxquelles les particules de rayonnement se heurtent

•

Excellents agents de stérilisation car pénétration en profondeur dans les objets

•

Toutefois, dispendieux et dangereux. Utilisation limitée.

•

Utilisations  Stérilisation à froid d’antibiotiques, hormones, fils de suture, seringues en plastique, pansements, champs opératoires, boîtes de Pétri, aliments, etc.

Pression osmotique

58

•

L’utilisation de grande concentrations de sel (10-15%) ou de sucre (5070%) pour la des aliments repose sur les effets de la pression osmotique

•

Une concentration élevée de sel ou de sucres autour des microorganismes crée un milieu hypertonique autour des micro-organismes, ce qui provoque la sortie de l’eau de la cellule microbienne vers le milieu (plasmolyse et faible Aw).

•

Ex: Solutions salines concentrées pour saler la viande ou le poisson, solutions sucrées pour conserver les fruits (confitures)

•

Attention !!! osmophiles et halophiles = micro-organismes potentiellement résistants

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Agents chimiques

59

Métaux lourds se complexent avec les protéines et précipite ainsi les protéines.

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60

Agents alcalins sont aussi appelés agents pontant parce qu’ils provoquent la formation de liens.

61

Évaluation de l’efficacité d’un agent antimicrobien Coefficient phénol : comparer l’efficacité d’un désinfectant à celle du phénol

Calcul du coefficient : Dilution la plus élevée capable de tuer les bactéries après 10 minutes d’exposition Ex : Phénol = 1/4 versus Produit = 1/160

Conclusion : votre produit est 4 fois plus puissant que le phénol Mise en garde : L’efficacité peut varier lorsque l’agent est utilisé dans un usage normal (in vivo)... s s s s s 62

Antibiotiques •

Problématique  Il faut détruire le micro-organisme sans tuer l’hôte infecté mais encore faut-il réduire le plus possible les effets secondaires indésirables  De nombreux produits chimiques détruisent les bactéries et autres micro-organismes tout en étant également fatals pour l’organisme infecté. Ils sont bien sûr à mettre à l’index

•

Solution  Tirer profit de la diversité structurale et métabolique des microorganismes  Plus approfondies seront nos connaissances en ce domaine et plus nous pourrons fabriquer des molécules spécifiques pour cibler adéquatement l’envahisseur sans affecter l’hôte

•

Chimiothérapie  Traitement des maladies en utilisant des agents chimiques (s’emploie souvent dans le sens anti-cancéreux)

•

Antibiotique  Agent chimiothérapeutique capable de tuer ou d’inhiber la croissance de micro-organismes

Historique •

Paul Ehrlich (1854 - 1915)  Père de la chimiothérapie moderne  Découvre que le rouge Trypan affecte le trypanosome (protozoaire transmis par la mouche Tsé-tsé) responsable de la maladie du sommeil  Arséphamine (dérivé de l’arsenic) contre le spirochète causant la syphilis

•

63

Gerhard Domagk (1935)

 Découvre que le rouge Prontosil, utilisé pour colorer le cuir, tue les streptocoques et les staphylocoques pathogènes sans affecter les animaux  Prix Nobel en 1939 •

Alexander Fleming (1928)  Découvre la pénicilline. Prix Nobel 1945

•

Selman Waksman (1944)  Découvre la streptomycine isolée de l’actinomycète Streptomyces griseus (Actinomycètes: Gram + qui produisent des hyphes semblables aux mycètes)  Prix Nobel 1952

Propriétés des antibiotiques •

Toxicité sélective: Toxique pour les micro-organismes mais non toxique pour l’hôte (Tuer ou inhiber l’agent pathogène en affectant le moins possible l’hôte)

•

Dose thérapeutique: Concentration du produit requise pour le traitement clinique d’une infection

•

Dose toxique: Concentration du produit qui devient toxique pour l’hôte

•

Indice thérapeutique: C’est un indice de la toxicité sélective

Plus l’indice est élevé, meilleur est l’agent thérapeutique car plus grande est la différence entre la sensibilité de l’hôte et celle du microorganisme

•

64

Spectre d’action (champ d’activité): Quantité d’espèces attaquées par un agent

•

Spectre étroit: Affecte une variété restreinte de micro-organismes Ex: - pénicilline vs Gram +, Gentamycine vs Gram –

•

Large spectre: Affecte une grande variété de micro-organismes Ex: - Sulfamides peuvent agir contre les bactéries et certains protozoaires - Tétracycline et chloramphénicol agissent contre les Gram + et Gram –

•

Nature de l’activité antimicrobienne statique (inhibe la croissance; réversible) cide (tue le micro-organisme; irréversible)* * Peut dépendre de la concentration et de l’espèce microbienne

•

Types d’antimicrobiens - Antibactériens (bactéries) - Antifongiques (mycètes) - Antiprotozoaires (protozoaires) - Antiviraux (virus)

•

Provenance des antibiotiques Naturels: synthétisés par des micro-organismes (bactéries Gram+ et mycètes) Purement synthétiques: Synthétisés chimiquement (sulfamides, chloramphénicol,…) Semi-synthétiques: Antibiotiques naturels ayant subis une modification par l’addition d’un groupement pour les rendre moins sensibles à la dégradation par les pathogènes (Ex: ampicilline et méthicilline qui dérivent de la pénicilline)

65

Mesure de l’activité antimicrobienne 1) Concentration minimale inhibitrice (CMI) Concentration la plus faible d’un antibiotique capable d’empêcher la croissance d’un micro-organisme 2) Concentration minimale létale (CML) (CMB: CM Bactéricide) Concentration la plus faible d’un antibiotique capable de tuer un microorganisme **Mesure des concentrations d’un antimicrobien dans le sang Un agent doit atteindre au siège de l’infection une concentration supérieure à la CMI du germe pathogène pour être efficace Dans les cas de maladie grave, potentiellement mortelle, il est souvent nécessaire de contrôler la concentration des agents chimiothérapeutiques dans le sang et autres liquides corporels

Détermination de la des CMI et CML •

Méthode des dilutions en milieu liquide

1. Série de tubes contenant du bouillon de culture qui assure une bonne croissance 2. Addition d’un antibiotique à des concentrations variant de 0,1 jusqu’à 128 μg/ml 3. Inoculation des tubes avec le micro-organisme à tester 4. Incubation de 16 à 20 heures dans un environnement adéquat 5. La concentration la plus faible qui inhibe la croissance bactérienne = CMI Pour déterminer la CML 6. Un échantillon de chacun des tubes qui ne présentent pas de croissance est inoculé dans des tubes de bouillon frais sans antibiotique ou sur un agar sans antibiotique 7. La concentration d’antibiotique la plus faible à laquelle les bactéries furent soumises dans la détermination de la CMI et qui ne présente pas de croissance dans ce nouveau milieu sans antibiotique = CML. Donc les bactéries ont été tuées 66

67

Méthode de diffusion sur gélose (méthode de KirbyBauer, antibiogramme) 1. Ensemencer uniformément la surface d’une gélose avec un écouvillon stérile trempé dans une suspension bactérienne 2. Déposer sur la gélose des disques imprégnés d’antibiotique 3. L’antibiotique diffuse à partir du disque en formant un gradient de concentration (plus forte concentration près du disque) 4. Après incubation (16 à 18 h) il y a un halo autour des disques où les bactéries ne se sont pas développées. Plus le diamètre du halo est grand et plus l’espèce est sensible à l’antibiotique (pour un antibiotique donné) * En général plus la zone est grande et plus l’antibiotique est efficace * Il est difficile d’évaluer l’efficacité de deux antibiotiques différents en mesurant les diamètres d’inhibition contre une espèce bactérienne: - Les vitesses de diffusion et leur solubilité peut être différentes…

E-test : gradient de concentration d’antibiotique sur la bandelette.

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Effets secondaires •

Les agents antimicrobiens, bien que dotés d’une toxicité sélective, ne sont pas sans effet sur l’hôte.

•

Atteintes hépatiques ou rénales  Élévation du taux sanguin des pigments biliaires (jaunisse)  Les glomérulonéphrites et les tubulopathies sont les atteintes rénales les plus fréquentes

•

Allergies (hypersensibilités)  Allant de simples éruptions cutanées au choc anaphylactique (pénicilline)

•

Troubles gastro-intestinaux  Nausées, vomissements, diarrhées…

•

Surinfections  Les antibiotiques ne frappent pas suffisamment de façon sélective le micro-organisme qui cause l’infection. Les populations des bactéries commensales (intestin, vagin) peuvent être déséquilibrées au point de ne plus agit à titre de barrière pour des micro-organismes pathogènes

•

Altération de l’hémocytopoïèse (production de cellules sanguines)  Altération temporaire et bénigne  Production moindre d’érythrocytes ou fragilité accrue (hémolyse)  Immunodéficience légère et temporaire (diminution leucocytes)  Atteintes irréversibles de la moelle osseuse  diminution de la production des divers types de globules (Ex.:chloramphénicol)

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Facteurs influençant l’activité des antibiotiques Capacité d’atteindre le siège de l’infection •

Importance du mode d’administration  Orale : Résistance acidité de l’estomac, facilement absorbé par l’intestin  Cutané (topique): Directement sur la peau pour les infections cutanées  Parentérales (injections intraveineuses, intramusculaires, timbres)

•

Caillot sanguin et tissus nécrotiques peuvent empêcher l’antibiotique d’atteindre les bactéries (absorption, liquide corporel qui ne peut y diffuser)

Sensibilité de la bactérie à l’agent •

Bactérie en phase de latence sera insensible aux antibiotiques (absence de réplication, absence de synthèse de la paroi)

•

Mycoplasmes sans paroi insensibles à la pénicilline

•

Résistance

Concentration plus élevée que la CMI •

Influencée par: 1. quantité administrée 2. voie d’administration 3. vitesse d’absorption

70

4. vitesse d’élimination du corps

Substances antibactériennes Pénicillines [Inhibition de la synthèse de la paroi] •

Indice thérapeutique élevé

•

La pénicilline G (Fleming, 1929) est produite par Penicillium chrysogenum

•

Maintenant versions semi-synthétiques

•

Cycle b-lactame essentiel pour l’activité (b-lactamines), les bactéries développent une résistance en utilisant la bêta-lactamase

•

Bactéricide

•

Les moins toxiques des antibiotiques, mais 1-5% des adultes allergiques

•

Il y a de plus en plus de résistance envers les pénicillines

Céphalosporines [Inhibition de la synthèse de la paroi] 71

•

Indice thérapeutique élevé

•

Le premier découvert est produit par le mycète Cephalosporium (1948)

•

Maintenant versions semi-synthétiques

•

Spectre d’activité plus large que les pénicillines

•

Cycle β-lactame comme les pénicillines, mais plus résistant aux pénicillinases

•

Prescrits souvent aux patients souffrant d’allergie aux pénicillines

•

Bactéricides

Sulfamides [Substance antagoniste du métabolisme (antimétabolites)] •

Indice thérapeutique élevé

•

Entrent en compétition avec l’acide p-aminobenzoïque (précurseur de la biosynthèse de l’acide folique essentiel chez les bactéries)

•

Synthèse des nucléotides est inhibée, il en va de même pour l’ADN et les ARN - Bactériostatiques (besoin du système immunitaire)

•

Les humains sont incapables de synthétiser l’acide folique

•

Efficacité limité: résistance croissante + effets secondaires (allergies)

Aminoglycosides (noyau cyclohexane +sucre aminé) [Inhibent la synthèse protéique] •

Indice thérapeutique relativement élevé

•

Inhibent la synthèse protéique en se fixant sur la sous-unité 30S des ribosomes, provoquant ainsi des erreurs de lecture de l’ARNm

•

Bactéricides et plus efficaces contre les gram -

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•

La streptomycine, la kanamycine, la néomycine sont synthétisés par le genre Streptomyces. La gentamycine est synthétisé par le genre Micromonospora

•

De moins en moins utilisés (résistance et assez toxiques)

Tétracyclines [inhibent la synthèse protéique] •

Indice thérapeutique relativement élevé

•

Structure à 4 cycles, avec diverses chaînes latérales

•

Produites par Streptomyces sp, mais aussi versions semi-synthétiques

•

Fixation sur la sous-unité 30 S (empêchent la fixation des aminoacyl-ARNt sur le site A des ribosomes)

•

Effet bactériostatique et non bactéricide (besoin du système immunitaire)

•

Large spectre, mais effets secondaires importants

Chloramphénicol [inhibent la synthèse protéique] •

Indice thérapeutique relativement élevé

•

Produit au départ par Streptomyces venezuelae

•

Maintenant obtenu par synthèse chimique

•

Fixation sur l’ARN 23 S où il inhibe l’élongation de la chaîne peptidique

•

Très large spectre, mais affecte la moelle osseuse de façon temporaire ou permanente. À utiliser en dernier recours. Bactériostatique.

Macrolides [inhibent la synthèse protéique] •

Indice thérapeutique relativement élevé

•

Cycle lactone de 12 à 22 carbones associé à un ou plusieurs sucres

•

Synthétisé par Streptomyces erythraeus

•

Bactériostatique et spectre relativement large

•

Se fixe sur l’ARN 23 S de la sous-unité 50S et inhibe l’élongation de la chaîne peptidique. Ex: Érythromycine, l’azithromycine, …

•

Prescrits aux patients allergiques aux pénicillines

73

Quinolones [Inhibe la synthèse des acides nucléiques] •

Indice thérapeutique peu élevé

•

Antibiotiques synthétiques avec un noyau de 4-quinolone

•

Inhibe la topoisomérase II (gyrase) en se fixant au complexe ADN-gyrase

•

Réplication et réparation de l’ADN sont sévèrement perturbées au point de tuer la bactérie (Bactéricide)

•

Large spectre et couramment utilisées

Polymixine B [Détruit la membrane plasmique] •

Indice thérapeutique peu élevé

•

Se fixe à la membrane plasmique et en perturbe sa structure et ses propriétés de perméabilité sélective

•

Bactéricide

•

Utilisation restreinte (pommades topiques), car trop toxique…

74

75

Production et utilisation d’antibiotiques

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Résistance aux antibiotiques Origines et transmission de la résistance 1. Mutation – sélection (rare)  Mutation spontanée dans le chromosome qui rend la bactérie résistante  Si elle n’est pas détruite par le système immunitaire de l’hôte elle est sélectionnée et peut se développer plus rapidement que les bactéries non mutantes demeurées sensibles à l’antibiotique. Sélection naturelle 2. Plasmide de résistance (R) (fréquent)  Plasmide qui contient des gènes codant des enzymes qui affectent l’antibiotique  Transfert du plasmide à d’autres bactéries par conjugaison, transduction ou transformation (transfert horizontale)

Mécanismes de résistance 1. Blocage de la pénétration de l’antibiotique Membrane externe des Gram - qui empêchent le passage de la pénicilline G Perméabilité réduite des sulfamides (doivent atteindre le cytoplasme) Mycobactéries et couche lipidique complexe externe (acides mycoliques) 2. Excrétion Pompage vers l’extérieur de la cellule. Présence de pompes effluentes nonspécifiques (Multirésistance) 3. Inactivation des antibiotiques par les bactéries (modifications chimiques) Pénicillinase (β-lactamase) qui hydrolyse le noyau β-lactame des pénicillines Addition de groupes chimiques sur les antibiotiques (phosphorylation, acétylation) 4. Modification de la cible de l’antibiotique Une fois modifiée, l’enzyme ou l’organelle n’est plus sensible à l’antibiotique Ex.: Modification d’un ribosome 5. Utilisation d’une voie alternative 77

Résistance aux sulfamides en utilisant l’acide folique de leur environnement au lieu de le synthétiser

Stratégies pour réduire le risque d’émergence des résistances 1. Concentration de l’antibiotique assez élevée pour détruire les mutants spontanés 2. Combinaison d’antibiotiques: exige que la bactérie soit multirésistante 3. Réduire l’utilisation des antibiotiques à large spectre : Identification de la bactérie, détermination de sa sensibilité aux antibiotiques et utilisation de l’antibiotique à spectre étroit approprié 4. Éviter l’abus d’antibiotiques : S’assurer qu’il s’agit bien d’infections bactériennes… 5. Nouvelles approches (Ex. les virus bactériophages)

Chapitre V, génétique bactérienne Transformation Frederick Griffith (1928): Étudie le transfert de la virulence de la bactérie pathogène Streptococcus pneumonia Principe de l’expérience de Griffith A) Types morphologiques de pneumocoques 1) Pneumocoques sauvages encapsulés et virulents (forme S) Les pneumocoques entourés d'une capsule de polysaccharides (encapsulés) sont virulents (septicémie mortelle) et ils forment sur un milieu solide des colonies dont le contour est lisse (forme S: smooth ou forme L: lisse) 2) Pneumocoques mutants non capsulés et non virulents (forme R)

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Les pneumocoques mutants sans capsule ne sont pas virulents et ils forment sur un milieu solide des colonies dont le contour est dentelé (forme R : rough, rugueuse)

B) Transformation des pneumocoques de forme R en pneumocoques de forme S Des souris inoculées avec un mélange de pneumocoques S virulents tués par la chaleur (non pathogènes) et de pneumocoques R non virulents vivants (non pathogènes) meurent. De plus, des pneumocoques S virulents vivants sont isolés à nouveau de ces souris mortes. Il semble que les débris (agent transformant) des pneumocoques S chauffés (non vivants) transforment des pneumocoques R vivants en forme S. C) Agent transformant: l’ADN En 1944, Oswald Avery, C.M. Macleod et McCarthy ont démontré que l'ADN présent dans les débris des pneumocoques S tués par la chaleur est la seule classe de molécules qui transforme des colonies rugueuses (pneumocoques R vivants) en colonies lisses (pneumocoques S vivants). Les protéines et les lipides n’ont aucun pouvoir de transformation La démonstration que l'ADN est l'agent transformant constituait pour la première fois une preuve que la substance responsable de l'hérédité (gènes) était l'ADN. On croyait jusque là que c’était les protéines car elles sont plus complexes que l’ADN

Définition de la transformation bactérienne • Processus dans lequel une bactérie receuveuse absorbe de l'ADN nu libéré dans le milieu par la lyse accidentelle ou provoquée de bactéries donneuses • Ces fragments d'ADN absorbés peuvent se recombiner au chromosome de la bactérie réceptrice pour ainsi produire des transformants (recombinants bactériens) 79

Caractéristiques de la transformation bactérienne Compétence bactérienne: Aptitude de certaines bactéries à absorber des fragments d’ADN libre et de les incorporer dans son génome, au cours de la transformation. Facteurs de compétence: récepteurs, nucléases, protéines liant l’ADN simple brin Paramètres pouvant influencer la compétence: •

Espèce bactérienne

•

Phase de croissance

•

Changement rapide de température

•

Milieux de culture

B) Exemples de bactéries compétentes Bactéries Gram + : Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, … Bactéries Gram - : Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, …

80

Importance de la transformation bactérienne •

Transfert génétique horizontal ou latéral : Processus dans lequel un organisme intègre du matériel génétique d’un autre organisme sans en être le descendant.

•

Cartographie génétique à l’aide de la transformation bactérienne

 Position des gènes sur le chromosome bactérien • Génie génétique  Induction de la compétence chez E. Coli (bactérie naturellement non transformable) par traitement au chlorure de calcium [CaCl2] et d’un choc thermique.  De l’ADN de n’importe quelle origine peut être introduit dans des bactéries en l’insérant dans un plasmide avant transformation (107 à 108 transformants/mg d'ADN)

Conjugaison bactérienne Découverte de J. Lederberg et E. Tatum (1946) 81

Ils utilisèrent deux souches auxotrophes, présentant plusieurs exigences nutritionnelles différentes (poly-auxotrophes), obtenues par mutation de la souche prototrophe E. Coli K12 Souche A: Bio - Phe- Cys- Thr+ Leu+ Thi+ Souche B: Bio+ Phe+ Cys+ Thr- Leu- Thi(+ = synthèse; - = absence de synthèse) (Bio: biotine; Phe: phénylalanine ; Cys: cystéine ; Thr: thréonine; Leu: leucine; Thi: thiamine) Principe de l’expérience de Lederberg et Tatum Ils étalèrent soit environ 108 bactéries de la souche A ou de la souche B (groupes témoins), soit un mélange de bactéries des deux souches (groupe expérimental: lemélange est préalablement incubé pendant 4 à 5 heures dans un milieu riche) sur des boîtes contenant du milieu minimal (eau, sels minéraux, glucose et agar)

Résultats A) Groupes témoins Aucune colonie n’apparaît sur les milieux ensemencés avec des bactéries de la souche A ou de la souche B car milieu minimal B) Groupe expérimental Environ 10 colonies deviennent visibles (croissance) sur le milieu ensemencé avec le mélange de bactéries de la souche A et de la souche B (fréquence: 101 / 108 = 10-7 = 1/10 000 000). Ces colonies sont nécessairement prototrophes puisqu'elles sont capables de croître sur un milieu minimal sans supplément nutritionnel Conclusion Les nouvelles colonies de type prototrophe (Bio+ Phe+ Cys+ Thr+ Leu+ Thi+) obtenues sur le milieu minimal sans supplément nutritionnel (groupe expérimental) sont des bactéries recombinantes résultant probablement d'un échange de matériel génétique entre les deux souches bactériennes.

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Caractéristiques de la conjugaison bactérienne 1. Nécessite un contact physique entre les bactéries (B. Davis 1950) Un contact physique entre les deux souches est essentiel pour produire des bactéries prototrophes (recombinants) (Expérience du tube en U). Il fallait s’assurer que c’était un contact physique qui transmettait l’information génétique et donc il y avait un filtre laissant passer seulement le milieu de culture et après quelques heures, il les ensemença sur milieu minimum et n’observa pas de croissance. 2. Présence d’un facteur de fertilité (F) dans les bactéries donneuses (W. Hayes 1952) Hayes démontra que le transfert de gènes observé par Lederberg et Tatum s’effectuait dans un sens déterminé. Il émit donc l'hypothèse de la présence d'un facteur de fertilité (F) dans les bactéries donatrices A) Bactéries receveuses: F- (sans facteur de fertilité) B) Bactéries donneuses: F+ (avec un facteur de fertilité F) •

Lors d’un croissement F+ x F-, les descendants ne sont que rarement modifiés dans leur auxotrophie, mais les souches F- deviennent fréquemment F+

•

Le Facteur de fertilité F est sur un plasmide

C) Bactéries donneuses: Hfr (haute fréquence de recombinants) •

Les bactéries donneuses transferts des gènes chromosomiques avec une grande efficacité, mais ne transforment pas les bactéries receveuses en cellule F+. (croissement Hfr x F- : recombinants bactériens)

•

Le facteur de fertilité F est intégré dans le chromosome bactérien à des sites spécifiques

3. Transfert linéaire de l’ADN (plasmide ou chromosome) de la bactérie donneuse dans la bactérie receveuse F- (E. Wollman et F. Jacob 1957) Le chromosome circulaire (Hfr) ou le plasmide F de la donneuse est transféré dans la receveuse F- de façon linéaire à partir d'un point spécifique appelé origine de transfert [O] (transfert orienté et progressif). 83

Définition de la conjugaison bactérienne Mécanisme qui consiste en un transfert linéaire et unidirectionnel du chromosome bactérien (Hfr) ou du plasmide F de la cellule donneuse à la cellule receveuse (F-) à l'aide d’un contact direct entre les cellules (contact initié par le pilus sexuel)

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85

Plasmide F Structure générale du plasmide F (plasmide conjugatif) •

Le plasmide F est une petite molécule d'ADN bicaténaire circulaire de 95100 kpb, extra ou intrachomosomique (épisome), autoréplicable et autotransférable

Épisomes Plasmides libres ou intégrés au chromosome de l’hôte Éléments génétiques susceptibles de se répliquer dans l’un des deux états: 1) Intégrés au chromosome de la cellule hôte 2) Libres dans le cytoplasme Ex: Plasmide F (F+ ou Hfr)

Principaux types de plasmides •

Plasmide F: Facteur de fertilité (Escherichia, Pseudomonas, Staphylococcus,…)

•

Plasmides R: Résistance aux antibiotiques et autres inhibiteurs…

•

Plasmides Col: Production et résistance aux bactériocines (colicine)

•

Plasmides de virulence: enterotoxines, invasion, antigènes,…

•

Production d’antibiotique (Streptomycine)

•

Plasmides métaboliques: dégradation de substances inhabituelles,…

Peuvent être conjugatifs (transférables d’une bactérie à une autre durant une conjugaison promue ou non par un autre plasmide) Intégration du plasmide F Le plasmide F peut s’intégrer dans le chromosome bactérien en de nombreux sites différents au niveau de séquences d’insertion. Dans l’exemple il s’afit de IS3 localisée entre les gènes chromosomiques pro et lac. Certains gènes du plasmide sont présents.

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Lors du transfert chez Hfr, il y a une coupure à l’origine de transfert puis un transfert de l’ADN à la cellule receveuse. C’est pour cela que le plasmide F est essentiel au transfert parce que c’est là que se produit l’ouverture. Les plasmides conjugatifs sont les premiers plasmides qui ont été découverts chez la bactérie Escherichia coli dans les années 1950. On les appelle aussi facteurs de fertilité ou plasmides F. Ces plasmides confèrent à la bactérie hôte la capacité de synthèse de pili dit sexuels. Par l'intermédiaire de ces pili, la bactérie porteuse (donneuse) peut transférer une copie du plasmide F par processus de conjugaison bactérienne. Les plasmides F possèdent au minimum une origine de réplication et tous les gènes nécessaires à la synthèse des pili et du transfert du plasmide. Certains plasmides F sont des épisomes, c'est-à-dire qu'ils peuvent s'intégrer dans le génome chromosomique. Conjugaison bactérienne : Hfr x F-

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Conjugaison F’ ou sexduction Comme le plasmide F est un épisome, il peut quitter le chromosome bactérien et reprendre son statut autonome de facteur F. Au cours de ce processus, il arrive que le plasmide fasse une erreur d’excision et emporte une portion du chromosome. On l’appelle alors le plasmide F’ car in est génétiquement distinct du plasmide F. 88

Conjugaison F’ ou sexduction : Acquisition par une bactérie receveuse (F-), lors du processus de conjugaison, de gènes chromosomiques liés au plasmide F (F’)

Importance de la conjugaison bactérienne •

Transfert génétique horizontal ou latéral

• Cartographie du chromosome bactérien à l’aide de la conjugaison bactérienne 89

Cartographie par conjugaison interrompue: unité de minute Principe de la méthode 1. Croisement Hfr x F2. Échantillons prélevés à intervalles de temps réguliers 3. Agitation courte mais violente (inhibition du transfert: conjugaison interrompue) 4. Étalement sur des milieux sélectifs différents permettant de dénombrer différents types de recombinants bactériens (conjugants) * La vitesse de transfert de l'ADN étant relativement constante, le temps d'entrée des marqueurs génétiques donne une idée exacte de la distance relative (en unité de temps) qui les sépare

À l'aide de différentes souches Hfr, la carte chromosomique d' E. Coli fut divisée en 100 minutes, chaque minute correspondant à environ 20 loci. Par convention, la position 0 (zéro) se situe au locus thr de la souche HfrH (Hayes) et la direction du transfert s'effectue dans le sens horaire Loci: locus (plural loci) is the specific location of a gene or DNA sequence on a chromosome. A variant of the DNA sequence at a given locus is called an allele. The ordered list of loci known for a particular genome is called a genetic map. Gene mapping is the process of determining the locus for a particular biological trait.

90

Transduction bactérienne Bactériophages Description d’un bactériophage  Virus de bactéries constitué d'une capside protéique contenant une molécule mono ou bicaténaire d'ADN ou d'ARN et pouvant se retrouver sous deux stades: intracellulaire et extracellulaire  Les phages sont des parasites intracellulaires obligatoires Types de bactériophages

 Phages virulents: cycle lytique Les phages qui lysent (destruction) toutes les bactéries qu'ils infectent sont appelés phages virulents Ex.: phages de la série T  Phages tempérés: cycle lytique ou cycle lysogénique Le phage tempéré peut se comporter comme un phage virulent et suivre le cycle lytique ou demeurer à l'état latent dans une bactérie hôte (cycle lysogénique) Ex.: P1 tempéré, P22 tempéré, lambda tempéré  Bactéries lysogènes Bactéries qui possèdent et transmettent à leur descendance le pouvoir de produire des phages en absence d’infection (elles possèdent l’ADN du phage) Ex : E. coli (lambda), E. Coli (P1)  Prophage Forme latente du génome viral qui réside dans l’hôte sans le détruire Ex : Prophage lamda de E. coli L’ADN du phage lambda s’intègre par recombinaison dans un site spécifique du chromosome d’E. coli et y demeure dans un état passif (prophage)

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Certains bactériophages (appelés phages tempérés) peuvent demeurer dans un état quiescent en intégrant leur matériel génétique à l'ADN de la bactérie. On parle alors de provirus ou de prophage, c'est-à-dire un virus dont le matériel génétique est intégré au génome de l'hôte. Ces phages endogènes, sont copiés à chaque division cellulaire avec l'ensemble de l'ADN de la bactérie, que l'on qualifie alors de lysogène. Pendant cette phase de latence, l'expression des gènes codés par le génome du phage est en général réprimée par une protéine répresseur. Transduction bactérienne Définition Transfert génétique au cours duquel un ou plusieurs gènes bactériens sont transmis d’une bactérie donneuse à une bactérie receveuse par l’intermédiaire d’un bactériophage transducteur qui agit comme vecteur en transportant une portion du chromosome bactérien de la donneuse à la receveuse Il existe deux types de transduction: généralisée ou spécialisée **Importance de la transduction bactérienne (généralisée et spécialisée) •

Transfert génétique horizontal ou latéral

•

Cartographie du chromosome bactérien

1. Transduction généralisée Transduction dans laquelle les phages tempérés ou virulents transportent un exogénote bactérien qui peut correspondre à n'importe quel fragment du chromosome de la bactérie donneuse. Ex.: P1 / E. Coli, P22 / S. typhimurium Cinétique de la transduction généralisée (ex.: P1 / E. Coli) Comme pour la transformation et la conjugaison, la cinétique de la transduction bactérienne consiste en deux grande étapes: Transfert de marqueurs génétiques de la donneuse à la receveuse par l’entremise d’un vecteur phagique Recombinaison de ces marqueurs au génome de la bactérie receveuse

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Cinétique de la transduction généralisée 1) Infection phagique des bactéries donneuses 2) Erreur lors de l’assemblage des phages (encapsidation) Lors de l’encapsidation du génome phagique, un court fragment d’ADN peut être incorporé (encapsidé) par erreur et au hasard dans la tête phagique, soit la formation d’un phage transducteur 3) Lyse des bactéries donneuses et libération de phages normaux et transducteurs La très grande majorité (>99%) des phages produits sont normaux tandis qu’une minorité possèdent seulement de l’ADN bactérien dans leur capside (Phages) Les phages transducteurs ne contiennent pas d’ADN viral ! 4) Infections des bactéries réceptrices par les phages normaux et transducteurs L’infection d’une bactérie par un phage transducteur (incapable de lyser la bactérie) produira un transductant (après intégration de l’ADN par recombinaison dans le génome de la bactérie réceptrice)  On peut se servir de la transduction générale pour déterminer la distance entre deux gènes si on suppose que l en déterminant la fréquence de cotraduction.

Transduction spécialisée Transduction dans laquelle un phage tempéré, défectif pour une partie de son information génétique, a inséré, de manière stable dans son génome, un fragment d'ADN de la bactérie donneuse correspondant à quelques gènes bactériens spécifiques Ex.: lambda / E. Coli, φ80 / E. Coli Cinétique de la transduction spécialisée (ex.: lambda / E. Coli) 1) Libération du prophage du chromosome d’une bactérie sauvage lysogène donneuse Sous certaines conditions de culture (ex.: irradiation aux ultraviolets), le prophage devient susceptible à son excision du chromosome bactérien 2) Erreur d’excision du prophage 93

À l'aide d'enzymes phagiques spécifiques, il y a excision normale du prophage produisant ainsi un génome phagique et un génome bactérien intact Avec une fréquence très faible (10-6 à 10-7), il peut se produire une erreurd'excision suite à des clivages incorrects. Cette erreur d'excision produit des fragments hybrides d'ADN (ADN phagique + ADN bactérien) Puisque le prophage lambda s'intègre dans le chromosome bactérien entre les gènes bactériens gal et bio, certains phages transducteurs contenant gal [phage lambda défectif gal] ou bio [phage lambda défectif bio] peuvent être produits suite aux erreurs d'excision, d'où la transduction spécialisée 3) Lyse des bactéries donneuses et libération des phages normaux et des phages défectifs La majorité des phages libérés sont normaux tandis qu'une faible proportion sont transducteurs (fréquence de phages lambda défectifs: 10-6 à 10-7) 4) Infection de bactéries receveuses par des phages normaux/défectifs 5) Recombinaison homologue de l’ADN transduit au génome de la bactérie receveuse (transductant)

Résumé transduction L’ADN est transféré d’une cellule à une autre par un bactériophage. Le virion transducteur est généralement non0infectieux car les gènes bactériens ont remplacé les gènes viraux impliqués dans sa virulence (désigne le caractère pathogène, nocif et violent d'un micro-organisme). •

Transduction généralisée : Phage P22/ Salmonella et P1/E. coli. L’ADN peut théoriquement provenir de n’importe quelle partie du génome et devenir l’ADN du virion mature à la place du génome viral. Si les gènes du donneur ne subissent pas une recombinaison homologue avec le chromosome bactérien du récepteur, ils sont perdus. Ils ne peuvent se répliquer indépendamment et ne font pas partie d’un génome viral. Particule transductrice : virion qui ne porte pas d’ADN viral mais plutôt l’ADN bactérien.

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Les phages qui forment des particules transductrices peuvent être tempérés ou virulents. •

Transduction spécialisée : Phage Lambda. Implique la transduction de l’opéron galactose. Seulement chez certains phages spécialisés. L’ADN d’une région spécifique de l’hôte est directement intégré dans le génome viral remplaçant certains gènes viraux. Il peut y avoir recombinaison homologue mais l’ADN bactérien donneur constitue une partie du phage tempéré. Le gène peut donc être intégré dans le chromosome de l’hôte lors de sa lyogénisation ou bien être répliqué dans une infection lytique.

Chapitre VI relation hôtesmicro-organismes Généralité Un écosystème se définit comme un ensemble dynamique composé d’une communauté (ensemble de populations) et de facteurs abiotiques (humidité, lumière, température) avec lesquels les organismes interagissent Le corps humain peut être comparé à une multitude d’écosystèmes dans le sens où il est formé de plusieurs communautés de cellules qui vivent dans des conditions environnementales différentes En plus des cellules eucaryotes (~60 000 milliards) qui nous constituent, il faut ajouter les micro-organismes qui habitent les divers écosystèmes de notre corps. En fait nous transportons tous les jours plus de cellules procaryotes que nos propres cellules eucaryotes. En réalité nous pourrions renommer les divers systèmes qui nous composent d’écosystèmes (respiratoire, digestif, uro-génital, …) tant les conditions abiotiques et biotiques diffèrent Les micro-organismes interagissent non seulement avec leurs environnements, mais également avec d’autres organismes

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Microflore normale du corps humain Définition: Mélange de micro-organismes que l’on trouve régulièrement dans un site anatomique donné (microbiota normale; flore commensale) •

Résidants chez l’hôte

: - Micro-organismes rencontrées en permanence

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Temporaires: - Micro-organisme rencontrées de façon temporaire (jours/mois) chez l’hôte. Fixation et multiplication difficiles.

Milieu intérieur/extérieur: •

Le milieu extérieur d’un animal est le milieu dans lequel vit cet animal C’est le milieu en contact avec sa surface (peau/muqueuses) La peau et les muqueuses sont toujours en contact avec les microorganismes de l’environnement et sont rapidement colonisés par diverses espèces microbiennes

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Le milieu intérieur est liquide interstitiel qui remplit les espaces entre les cellules Cerveau, sang, liquide céphalorachidien, muscles,… Milieu très riche dans lequel tout micro-organisme aimerait baigner Normalement dépourvus de micro-organismes chez une personne en bonne santé.

Colonisation Le développement du fœtus se fait dans un milieu stérile; le liquide amniotique. À ce moment le fœtus ne possède aucune flore commensale Colonisation au moment de la naissance par la flore vaginale et l’environnement (gens, nourriture, peau de la mère, …)

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L’alimentation semble un facteur déterminant dans la colonisation bactérienne:

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L’enfant nourri au sein possède les mêmes espèces qu’un enfant nourri au lait maternisé, mais la concentration de chacune des espèces varie

Ex.: Bifidobacterium bifidus en plus grande concentration que E. Coli ou Bacteroides chez les enfants allaités en lactose/lipide/prébiotiques dans le lait diffère chez la femme et la vache. Bifidobacterium transformerait le lactose en acide lactique acidifiant ainsi le contenu intestinal et formant un effet de barrière contre les pathogènes 2 jours après la naissance la peau et les muqueuses sont colonisées, mais évolution…

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Animaux gnotobiotiques (microflore connue) et axéniques (dépourvus de microflore) Permet d’examiner les interactions entre des animaux et des microorganismes spécifiques Établissement d’une colonie axénique (ex souris) Césarienne dans des conditions aseptiques dans une chambre stérile Transfert des animaux nouveau-nés dans des incubateurs stériles (air, eau et nourriture fournis stérilement) Une fois accoutumé, reproduction pour maintenir une lignée Principales caractéristiques des animaux axéniques Plus sensibles aux pathogènes (absence de l’effet barrière des commensaux) Absence de carie/plaque dentaire Tissus lymphoïdes peu développés Parois intestinale peu épaisse et selles plus molles (absorption d’eau ralentit) Plus faible titre d’anticorps Exigent de grande quantité de vitamine K et de complexes B Débit cardiaque et taux métabolique réduit

Relations entre l’hôte et la microflore normale Généralités Quel type de relation symbiotique les micro-organismes ont-ils établi avec l’Homme ? Mutualisme : Les micro-organismes apportent un certain bénéfice (vitamines produites par les bactéries du côlon). Chez les ruminants, les micro-organismes (bactéries et protozoaires) de la panse sont indispensables car ils digèrent la cellulose Commensalisme :Certains micro-organismes tirent un avantage certain de l’hôte humain (nourriture, humidité, température) sans l’affecter 99

Parasitisme : Oui, lorsque seuls les micro-organismes en tirent profit. L’hôte est généralement lésé. Ex.: Pathogène lorsque l’hôte est affecté

Commensalisme vs parasitisme La relation entre un hôte et les micro-organismes qu’il abrite est un équilibre précaire qui peut basculer en faveur de l’un ou de l’autre Normalement les micro-organismes commensaux établissent un équilibre durable avec l’hôte. Ils profitent de l’hôte sans l’affecter. Ils peuvent même offrir une certaine protection contre l’invasion par les pathogènes (effet barrière) Par contre si par mégarde ils sont introduits dans un endroit qu’ils n’occupent pas normalement, ils peuvent se comporter comme des parasites et il peut s’en suivre une infection Ex.: E. coli et infections urinaires De même si les défenses immunitaires de l’hôte sont affaiblies l’équilibre précaire peut être rompu à la faveur du micro-organisme Ex.: les personnes infectées par le VIH **Pathogène opportuniste: micro-organisme de la flore normale qui devient pathogène dans certaines circonstances

Protections naturelles A) Les barrières mécaniques Ce sont des structures épithéliales passives qui forment un obstacle physique ou mécanique à la pénétration des micro-organismes vers l’intérieur C’est la première ligne de défense contre les micro-organismes 1) Le système tégumentaire Il comprend la peau et les annexes cutanées (poils, cheveux, ongles, glandes). C’est un épithélium stratifié, squameux kératinisé soutenu par un tissu conjonctif dense non-orienté et qui forme la surface de notre corps. Très résistant 2) Les muqueuses Structures anatomiques qui tapissent la surface interne des cavités corporelles. Constituées d’un épithélium en surface, d’un conjonctif sous100

jacent (lamina propria, chorion) et d’une couche musculaire. Ex.: muqueuses intestinale, respiratoire, vaginale, …

B) Les barrières physiologiques 1) Sécrétion ou formation de produits antibactériens par l’organisme a) Kératine de la peau: Couche de cellules mortes en surface de la peau que peu de bactéries peuvent hydrolyser. Desquamation de la peau… b) Sécrétions des glandes cutanées qui ont un pH acide ralentissent le développement des nombreuses bactéries c) Mucus et cils des voies respiratoires d) Péristaltisme, mictions,… e) Acidité de l’estomac, vagin, … f) Lysozyme, lactoferrine et lactoperoxydase dans diverses sécrétions

2) Effet de barrière (ou barrière biologique) Activité des bactéries commensales de la peau/muqueuses qui créent des conditions défavorables à l’implantation de micro-organismes indésirables Exemple de défenses non spécifiques

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Pathogénicité bactérienne

Pour induire une maladie, une bactérie pathogène doit conserver un réservoir et pouvoir être transportée vers un hôte pour y entrer 102

Origines de l’infection Exogène: - Agents infectieux proviennent de l’extérieur de l’organisme (grippe, rhume,…) - Contamination par des personnes (animaux) infectées, vecteurs, environnement 1) Transmission directe: D’un hôte à une autre personne (toux, éternuements, contact corporel (MTS)) 2) Transmission indirecte: - Agents pathogènes dispersés dans l’environnement par un hôte infecté (air, sol, eau, aliments, …) 3) Transmission par un vecteur: - Organisme différent de l’humain qui transmet les agents pathogènes d’un hôte à une autre personne 4) Transmission par des aliments: - Viande cru, conserves mal préparés, …

Endogène: - Agents infectieux proviennent de l’intérieur de l’organisme suite à un déséquilibre entre l’hôte et les micro-organismes qu’il abrite. - Suite à un affaiblissement du système immunitaire, rupture d’une barrière, infection d’une plaie,…

Adhérence cutanée ou mucosale 1) Après avoir été transmit à un hôte approprié, l’agent pathogène doit être capable de se fixer et de coloniser les cellules et les tissus de l’hôte

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Invasion 2) L’entrée dans les cellules et les tissus de l’hôte est une stratégie spécialisée assurant la survie et la multiplication de nombreuse bactéries pathogènes Mécanismes actifs •

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Sécrétion par les bactéries de substances lytiques qui altèrent le tissu de l’hôte

Ex: Collagénases, protéases, phospholipases, H2O2,… Mécanismes passifs •

Profite de fissures, lésions, ulcères dans une muqueuse

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Blessures, éraflures et brûlures à la surface de la peau

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Voies d’internalisation eucaryotes (endocytose/phagocytose)

**Une fois sous la muqueuse, le pathogène peut atteindre des tissus plus profonds et continuer à se disséminer dans le corps de l’hôte: c’est le pouvoir invasif

Colonisation et croissance 3) Pour qu’une bactérie soit efficace dans son développement et sa multiplication, elle doit trouver un environnement approprié chez l’hôte: Éléments nutritifs, acidité, température, oxygénation,… Multiplication à la porte d’entrée sous la muqueuse (foyers localisés) Ex: Staphylococcus et Furoncle Relocalisation vers d’autres sites de l’hôtes via le système lymphatique (ganglions, rate,…) et/ou la circulation sanguine **La présence de bactéries viables dans le courant sanguin est appelée bactériémie. Une maladie associée à la présence de pathogènes dans le sang est appelée septicémie. Ces infections ont toujours un point de départ tissulaire (généralement reins, intestins, poumons) avec une infection localisée qui se généralise

Virulence Niveau de pathogénicité défini par un micro-organisme Généralités - La virulence tient compte autant du potentiel d’agression du microorganisme (pouvoir pathogène) que de la susceptibilité de l’hôte 105

- Quantitatif et mesurable

Variabilité de la virulence Exaltation: Augmentation progressive de la virulence (potentiel d’agression) - Naturelle - Micro-organismes plus virulents en période d’épidémie qu’en période normale - Expérimentale 106

- Transferts successifs d’un microorganisme pathogène sur des hôtes sensibles. Mécanisme inconnu Atténuation: Perte graduelle de la virulence - Naturelle - Conditions plus favorables aux micro-organismes moins virulents - Perte de l’information génétique conduisant à la virulence - Expérimentale - Vieillissement des cultures, actions de divers agents physiques (lumière, température) ou chimiques - Repiquages successifs sur certains milieux de culture ►Importante pour la mise au point de vaccin (BCG, bacille de Calmette et Guérin, Sabin contre la polio). Pouvoir pathogène atténué n’affecte pas le pouvoir immunogène. Un organisme vivant mais atténué est généralement plus immunogène qu’un organisme mort

Facteurs de virulence Composantes bactériennes qui contribuent à la virulence ou au pouvoir pathogène A) Facteurs d’adhésion (adhésines; voir le tableau 21.3) B) Facteurs biochimiques et métaboliques 1) Sécrétion d’enzymes de dégradation (protéases, lipases, collagénases,…) favorisant la colonisation, la croissance et l’invasion des pathogènes chez l’hôte. 2) Les toxines:

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- Molécules toxiques pour l’hôte provenant du métabolisme constituants cellulaire des micro-organismes

ou pathogènes

- Une bactérie peut produire plusieurs toxines en même temps ! - Empoisonnement vs infection C) Facteurs antigéniques La défense d’un hôte repose en grande partie sur la capacité de reconnaître des antigènes bactériens par le système immunitaire. Les mutations que subissent les bactéries entraînent des modifications des antigènes qu’elles portent. Les anticorps antérieurement produits sont inefficaces

Types de toxines 1) Exotoxines: •

Protéines toxiques sécrétées lors de la croissance de certaines bactéries (Gram+ et -)

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Ces toxines diffusent, circulent et provoquent des lésions tissulaires à distance de l’infection

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Sensibles à la chaleur, formaldéhyde et iode, capables de les inactiver

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Inactivation des exotoxines = anatoxines (pouvoir antigénique et/ou immunogène conservé) Ex: Vaccins contre tétanos ou diphtérie

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Généralement un mode d’action spécifique et elles agissent à faible dose (mg/kg) avec une période de latence Ex: 100 g de toxine botulique pour anéantir l’humanité !!!

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Ce sont généralement des toxines qui se fixent sur des récepteurs cellulaire (spécificité) et qui perturbent le fonctionnement des cellules cibles par:  Inhibent la synthèse protéique, la neurotransmission

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 Perturbation du transport membranaire  Dommages membranaires A) Les toxines cytolytiques ou désorganisatrices de la membrane •

Enzymes provoquant la lyse cellulaire). Favorisent la dissémination des bactéries à l’intérieur des tissus Ex: hémolysines, phospholipases, leucocidines,…

B) Les toxines A-B (deux sous-unités) A: enzymatique et responsable de l’effet toxique B: fixatrice à un port, ouvre la cellule Ex.: toxine botulique, tétanique, cholérique, coquelucheuse, charbonneuse,… C) Les toxines superantigéniques Stimulent un grand nombre de cellules de la réponse immunitaire de l’hôte, créant une réaction inflammatoire étendue

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L’entérotoxine du choléra

2) Endotoxines - Contenues à l’intérieur des bactéries mais libérées par la lyse cellulaire (à leur mort) ou pendant la multiplication. - Proviennent principalement des Gram - Ex: - Le lipide A du LPS (lipopolysaccharide) de la paroi des Gram- Résistent à la chaleur (ne forment pas d’anatoxine) - Faiblement antigéniques (peu de réponse immunitaire) Mode d’action: - Peu spécifique en général et aucune période de latence - Pouvoir pyrogène (incitent les macrophages à libérer des pyrogènes 110

endogènes comme l’interleukine-1) rôle prééminent dans la réponse inflammatoire du corps aux infections. Elle augmente l'expression de facteurs d'adhésion sur les cellules endothéliales, afin de faciliter la transmigration des leucocytes (globules blancs) sur le ou les sites de l'infection. - Agissent à concentration beaucoup plus forte (mg/kg) que les exotoxines - Causent plus souvent qu’autrement des symptômes peu spécifiques (céphalées, fièvres, diarrhées, inflammation) Ex: Escherichia coli (avec LPS) et Bacilus subtilis (Gram+ sans LPS). LPS va causer la mort de l’organisme par endotoxine vs survie

Susceptibilité de l’hôte Facteurs de risque d’infection chez l’hôte Un certain nombre de facteurs de l’hôte le sensibilise aux maladies infectieuses A) Âge - Jeunes: - système immunitaire immature - microflore intestinale moins bien développée 111

- barrière placentaire chez le fœtus - anticorps maternels - Personnes âgées: - baisse des défenses antimicrobiennes - moins de mictions (hypertrophie de la prostate) B) Le stress (fatigue, exercice, changement climatique, …) - La cortisone produite en grande quantité en période de stress réduit la réponse inflammatoire et donc diminution de la réponse immunitaire C) État nutritionnel - La résistance aux maladies infectieuses est plus élevée chez une personne bien nourrie (protéines, vitamines, etc) que chez celle souffrant de malnutrition - Nutriments nécessaires au maintien et renouvellement des tissus Ex.: Vitamine C/scorbut; sucres/carie dentaire - Modification de la microflore intestinale D) Prédispositions génétiques - Selon les gènes hérités un individu possède un système immunitaire +/- efficace - Mutation F508del dans le gène CFTR (fibrose kystique/mucoviscidose) - Mutation delta 32 dans le gène CCR5: résistance VIH-1

E) Facteurs environnementaux - Salubrité, surpopulation, installations sanitaires, qualité de l’eau, situations géographiques, conditions climatiques, latitude F) Circonstances favorables

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- Tout événement (rupture d’une barrière naturelle, affaiblissement du système immunitaire) qui permet à un organisme pathogène de pénétrer et de se multiplier à l’intérieur d’un hôte •

Accidentelle: brûlure, traumatisme, éraflure

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Chirurgicale: incision, points de suture

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Affaiblissement du système immunitaire (immunosuppresseurs, HIV, cancers, etc.).

** De nombreuses personnes contracteront une infection à la suite de leur admission dans un établissement de santé (infection nosocomiale) Infection neusocomiale : infection suite à l’admission dans un établissement de santé, infection ironique?

Maladie infectieuse Le cycle infectieux (4 phases) 1) Incubation - Phase comprise entre l’entrée du micro-organisme dans l’hôte et l’apparition des premiers symptômes de sa présence Caractéristiques: - Silencieuse, sans symptômes - Porteur peut cependant transmettre la maladie

Durée: - Très variable selon l’agent infectieux en cause Jours: Scarlatine 4, varicelle 15, oreillons 21 Semaines: Tétanos 1 à 3 Mois: Tuberculose, rage Années:

Sida

2) Invasion - Phase marquée par l’apparition des premiers symptômes 113

Caractéristiques: - Fièvre, courbatures, malaises non spécifiques ne permettant pas de poser un diagnostic précis. 3) Période d’état - Apparition des signes spécifiques permettant de diagnostiquer la maladie

4) Guérison - Rétablissement des fonctions normales de l’organisme et réparation des dommages tissulaires le cas échéant Avec immunisation: - L’organisme devient réfractaire à l’agent infectieux Sans immunisation: - Rechute: L’organisme redevient sensible à l’agent infectieux avant la guérison complète - Récidive: L’organisme redevient sensible à l’agent infectieux après la guérison Complète

Complications infectieuses - Aggravation de l’infection qui se manifeste par l’apparition de nouveaux symptômes Ex.: infection localisée qui se généralise et devient systémique Séquelles - Lésions définitives suite au passage d’un agent infectieux Ex.: varicelle, polio,… 114

Contagiosité - Il n’y a pas de règles uniformes concernant la période et le degré de contagion - Ce phénomène varie selon les agents infectieux en cause - De façon générale la contagion est maximale au cours de la période d’état mais on peut également la retrouver à la fin de la période d’incubation et au moment de l’invasion. Dans quelques cas on peut même la retrouver en pleine convalescence ou après la guérison

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