Micro Biolog i e

MICROBIOLOGIE

1

Introducere Există organisme şi microorganisme vii care au dimensiuni atât de mici încât nu pot fi observate decât la microscop (optic sau electronic). Între aceste microorganisme putem discuta despre alge, fungi, bacterii, virusuri şi paraziţi. Relativ de curând au intrat în discuţie şi alte structuri numite prioni. Diferitele microorganisme sunt studiate în cadrul disciplinei de microbiologie. Ca un domeniu înrudit cu microbiologia poate fi considerată şi imunologia. Se consideră că microorganismele sunt dintre cele mai vechi, numeroase şi diversificate forme de viaţă. Pot fi identificate în mediul înconjurător, au rol în descompunerea materiei organice şi menţin fertilitatea solulului. Majoritatea microorganismelor sunt utile global sau făcând parte din flora normală a diferitelor gazde; o mai mică parte sunt implicate, în diferite grade, în patologie. În acest caz, bolile infecţioase pot să afecteze o persoană, un grup de persoane sau o întreagă comunitate. Pe măsură ce bolile infecţioase au fost identificate a apărut şi disciplina de epidemiologie, născută din necesitatea studiului izbucnirilor epidemice. Datorită faptului că iniţial nu era cunoscută etiologia epidemiilor, acestea au fost considerate drept fenomene ale naturii, invazii asupra poporului (de la cuvintele grecesti epi -pe, peste, demos - popor). Există o serie de documente istorice care atestă existenţa epidemiologiei ca ştiinţă privind patologia în masă, precum tratatele lui Hipocrate (460-377 înainte de Iisus Christos), cele 7 cărţi „Despre epidemii” şi „Despre aeri, apă şi locuri”. Microbiologia a avansat continuu, de la nivelul unei ştiinţe relativ simple la un nivel care a determinat progrese însemnate în diagnosticul, prevenirea şi tratamentul bolilor. În bună parte datorită aplicaţiilor microbiologiei, speranţa de viaţă a crescut semnificativ. La începutul secolului, se înregistrau frecvent decese datorită unor cauze infecţioase (difterie, oreion, pestă, poliomielită, rubeolă, rujeolă, tifos exantematic, tuberculoză, sifilis, varicelă, variolă, etc). În acest moment variola este eradicată. Pentru poliomielită a fost stabilită ţinta eradicării, iniţial pentru anul 2000, ulterior pentru 2012. Izbucnirea epidemică din 2010 ”a împins” această ţintă peste alţi ani (unica boală infecțioasă eradicată rămâne variola). Pentru alte maladii sunt propuse alte ţinte de prevenire şi control iar evoluţia gravă, letală, survine numai în anumite situaţii (forme clinice avansate, atipice, neglijate). Datorită cunoştinţelor în domeniul microbiologiei s-au îmbunătăţit condiţiile sanitare, s-au descoperit şi aplicat noi metode de conservare a hranei etc. Dezvoltarea „tehnologiei ADN” (în special după anul 1973), bazată pe cunoştinţele acumulate pe parcursul ultimelor trei-patru decade de studiu şi practică privind genetica microbiană, are o însemnătate deosebită. Există de un număr de ani posibilitatea inserării de material genetic provenit de la oricare organism viu în bacterii selecţionate şi adaptate astfel încât să poată realiza „sarcini” speciale, normale la celula donatoare, ajungându-se până la posibilitatea ca tulpini deEscherichia coli modificate genetic să sintetizeze structuri de tipul anticorpilor. Studiul bacteriologic a trecut de la un nivel morfologic, celular la unul biochimic, molecular. 2

Microbiologia ca ştiinţă este strict necesară pentru sănătate, pentru menţinerea sănătăţii şi prevenirea îmbolnăvirilor. Cunoaşterea modului de transmitere a diferitelor microorganisme reduce numărul cazurilor de toxoplasmoză, tuberculoză sau gripă. Cunoaşterea noţiunilor privind sterilizarea-antisepsiadezinfecţia poate permite (în cazul aplicării corecte în practică a acestor noţiuni) evitarea infecţiilor de spital sau a altor infecţii produse în unităţi sanitare cu sau fără paturi. Cunoaşterea imunologiei şi imunopatologiei permite înţelegerea legăturilor şi interrelaţiilor microorganism-gazdă, precum şi importanţa procedeelor de imunizare şi supravegherea aplicării acestora. Măsurile generale aplicate pentru evitarea apariției bolilor infecțioase sau a transmiterii ulterioare trebuie bazate pe un nivel avansat de cunoștințe microbiologice. Studiul microbiologiei nu este dificil în cazul în care se înţelege faptul că microbiologia este o ştiinţă foarte logică (cele mai multe principii pot fi învăţate prin simpla înţelegere a acestora). Pe de altă parte, pe măsură ce reuşeşti să îi descifrezi o parte dintre taine poţi realiza că este una dintre cele mai fascinante ştiinţe. Microorganismele au fost descoperite relativ târziu, în 1680, cu toate că primul instrument de mărire asemănător cu dispozitivele actuale a fost realizat în 1590 de către Zacharias Janssen. În 1665 Robert Hooke a observat pentru prima oară celulele, el a studiat o secţiune dintr-un dop de plută şi a descoperit că structura plutei era formată din nişte „cutii” micuţe. Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), dorind să examineze ţesătura hainelor fine (deşi era la bază un vânzător de mărunţişuri), se pare că a fost prima persoană care a văzut şi a descris diferite microorganisme. Microscopul realizat de van Leeuwenhoek, instrument pe care l-a construit singur, a constat dintr-o lentilă biconvexă într-un cadru metalic, cu o mărire de până la 270 de ori. Cu acest microscop a examinat iniţial diferite ţesături, însă manifestând o curiozitate deosebită a dorit să studieze ulterior apa din bălţi, tartrul dentar, materiile fecale provenite de la un pacient cu „dizenterie”, etc. A fost mirat să observe în toate aceste substanţe, mici organisme sferice, altele în formă de „bastonaş”, spirale, unele aflate în mişcare rapidă, pe care le-a numit „animalicule”. Desenele pe care le-a făcut probează că a observat cu adevărat bacterii, protozoare şi alte microorganisme. Pornind de la condiţia sa iniţială, pe parcursul a circa 4 decade, Antony van Leeuwenhoek a redactat 125 de scrisori traduse în engleză şi predate Societăţii Regale din Londra. în plus, 27 dintre lucrările sale au fost publicate în Memoriile Academiei Franceze de ştiinţe. Se pare că unul dintre microscoapele originale ale lui van Leeuwenhoek se află în muzeul Universităţii din Utrecht. În urma descoperirilor lui Leeuwenhoek s-a pus întrebarea „de unde au apărut aceste organisme?”. Până la mijlocul secolului al nouăsprezecelea cea mai acceptată teorie a fost „teoria generaţiei spontane”. Învăţaţii epocii credeau că bacteriile apăreau spontan din materie anorganică. În 1858 Rudolf Virchof a introdus termenul de „biogeneză”. Această teorie susținea faptul că un organism viu poate să apară numai din alt organism viu. Controversele între cele două teorii s-au păstrat până în 1861 când Pasteur a infirmat ”teoria generaţiei spontane”. Geniul lui Pasteur a demonstrat că aerul contaminat cu microorganisme poate cotamina o soluţie sterilă, în schimb aerul steril nu poate să determine apariția unor bacterii. Cu mult înainte de a se fi cunoscut faptul că microorganismele sunt cauza bolilor infecţioase au fost imaginate o serie de metode de prevenire a bolilor. Spre exemplu, Edward Jenner (1796) a arătat că variola ar putea fi prevenită prin vaccinare. Semmelweis a avut contribuţii importante privind prevenirea răspândirii bolilor în maternităţi şi spitale utilizând substanţe chimice „dezinfectante”. Regulile principale (unele valabile şi astăzi) precum şi metodele ştiinţei microbiologice inclusiv principiile imunizării, utilizarea microbiologiei în medicina preventivă, prevenirea şi controlul bolilor infecţioase se bazează pe activitatea a doi cercetători înzestraţi atât cu geniu cât şi cu tenacitate, probabil având şi şansa de a fi trăit 3

în „perioada marilor descoperiri”, Louis Pasteur (1822-1895) şi Robert Koch (1843-1910). Pe bună dreptate, perioada 1857-1914 e considerată drept ”epoca de aur a microbiologiei”. Louis Pasteur a fost un chimist francez devenit faimos prin descoperirea polarimetriei. Tot el a demonstrat că fermentaţia şi putrefacţia sunt cauzate de organisme vii şi a notat o asemănare între aceste procese şi bolile infecţioase luând în discuţie degradarea vinurilor şi berii ca şi „boli” ale acestor produse. Pasteur a fost cel care a realizat un experiment prin care a arătat că, atât cât era cunoscut pe baza datelor disponibile, organismele vii au luat naştere numai din organisme vii, şi nu din materie moartă. În 1861 a descoperit fenomenul de anaerobioză şi fermentarea butirică (produsă de Vibrion butyrique, numit ulteriorClostridium butyricum). După elaborarea procedeului numit „pasteurizare”, a expus în 1877 teoria pasteuriană cu privire la germeni desfiinţând (așa cum am mai menționat) „teoria generaţiei spontanee”. Utilizând substanţe simple, de origine naturală şi gaze, vapori şi arcuri electrice sub temperatură şi presiune crescută, microbiologii şi biochimiştii pot sintetiza o serie de compuşi organici care au fost descoperiţi iniţial doar în celulele vii. După studiul fermentării vinului, Pasteur a investigat o boală transmisibilă la viermii de mătase şi ca rezultat a formulat teoria legată de implicarea germenilor în producerea unor boli. În ceea ce priveşte maladiile umane, a insistat ca bandajele să fie curăţate şi instrumentele din spital să fie fierte. Louis Pasteur a demonstrat în anul 1857, la aproape o jumătate de secol după lucrările redactate despre vaccinare de către Edward Jenner, legătura dintre infecţii şi microorganismele susceptibile a fi cultivate şi studiate. în diferite experimente ingenioase, Pasteur a protejat de antrax diferite ierbivore prin vaccinarea cu un preparat extras din Bacillus anthracis. „Tratamentul profilactic” al rabiei a fost dezvoltat prin injectarea de material uscat obţinut din măduva spinării de la animalele care au murit de rabie. Joseph Meister, un băiat muşcat de un câine turbat, a fost primul om a cărui viaţă a fost salvată prin această metodă fiind protejat de injecţiile făcute de Louis Pasteur. Tot Pasteur a descoperit bacteriile anaerobe şi a studiat septicemia şi gangrena. Ca atare, a devenit posibilă punerea la punct a tehnicilor de distrugere şi de control al diferiţilor germeni (stafilococi, streptococi, pneumococi etc). În 1880, Louis Pasteur a demonstrat că putem fi protejaţi contra bolilor infecţioase prin injectarea unor germeni atenuaţi. Primul medic care a observat transmiterea infecţiilor în instituții sanitare a fost Ignaz Semmelweis. Femeile ce nășteau acasă sufereau mai puține infecții comparativ cu cele ce nășteau la spital. A impus spălarea riguroasă şi ”dezinfectarea” cu clor a mâinilor personalului înainte de a aplica intra în sala de naștere sau de a consulta o femeie însărcinată. Chirurgul englez Joseph Lister (1827-1912) a aplicat descoperirile lui Pasteur în chirurgie chiar înainte ca bacteriile care determină infecţiiile chirurgicale (nosocomiale) să fi fost descoperite. Lucrările lui Lister reprezintă baza tehnicii chirurgicale aseptice din ziua de astăzi. Ferdinand Cohn (1828-1898) a fost unul dintre cei mai renumiţi microbiologi germani. El a extins cercetările lui Pasteur lucrând cu bacterii, alge şi fungi. Fiind foarte interesat de bacteriologie, a scris una dintre primele cărţi referitoare la bacterii, realizând una dintre primele clasificări bacteriene în genuri şi specii. Cohn a reprezentat un mare sprijin pentru Robert Koch, încurajându-l să îşi publice lucrările cu privire la antrax. Cu două secole înainte de apariţia bacteriologiei, Robert Boyle a sugerat că anumite boli sunt provocate de organisme vii. Anatomistul Henle a sugerat că bolile infecţioase ar putea fi determinate direct de către microorganisme. Robert Koch i-a fost student lui Henle; a asigurat toate datele necesare pentru a demonstra „teoria microbiană a bolii”. Dezvoltarea metodelor pentru izolarea bacteriilor în cultura pură a fost printre cele 4

mai importante descoperiri ale tehnicilor microbiologice şi a fost în mare parte opera lui Robert Koch. O cultură pură de microorganisme se dezvoltă atunci când pornim de la un singur tip de microorganism care se dezvoltă în eprubetele test sau în plăcile cu mediu de cultură (în colonii izolate).în condiţii naturale, mai multe microorganisme din specii diferite pot coexista în acelaşi mediu. Spre exemplu, în materiile fecale ale unui pacient cu febră tifoidă, Salmonella typhi se află „amestecată” cu un număr extrem de mare de celule din alte specii bacteriene (aerobe şi anaerobe) sau chiar şi alte forme de microorganisme. În cadrul diagnosticului medical microbiologic este importantă izolarea în cultură pură a germenilor patogeni. În exemplul menţionat, pentru diagnostic este necesară folosirea metodelor care permit izolarea S. typhi în cultură pură, singura care permite identificarea şi stabilirea sensibilităţii / rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice. în 1876 Koch a izolat în „cultură pură” bacteria care determină antraxul. Pornind de la splina recoltată de la vite infectate şi procesată pentru a permite obţinerea unui produs patologic; a fost capabil să infecteze şoareci de laborator utilizând această cultură. Implicat în cercetarea etiologiei exacte a bolilor infecţioase, Robert Koch a rezumat ceea ce a considerat că reprezintă datele esenţiale pentru a demonstra că un anume germen este cauza unei infecţii. Aceste date sunt cuprinse în patru postulate, denumite Postulatele lui Koch, respectiv: 1. Microorganismele care determină boala trebuie să poată fi identificate în toate cazurile de boală, în relaţie patogenică directă cu simptomele şi leziunile pe care le determină; 2. Microorganismul trebuie să poată fi izolat de la victimele bolii, în cultură pură, pentru studiul în laborator; 3. Când cultura este inoculată la un animal susceptibil, trebuie să reproducă boala (sau, cum s-a stabilit ulterior, să inducă apariţia anticorpilor specifici la noua gazdă); 4. Microorganismul trebuie să poată fi izolat din nou în cultura pură din infecţia produsă experimental. Utilizând aceste reguli precum şi diferitele tehnici microbiologice, Koch a descoperit bacilul tuberculos (bacilul Koch), bacilul holeric, etc., precum şi modul de transmitere pentru numeroase alte boli infecţioase (Babessia, Trypanosoma, Plasmodiumetc.). Descoperirile menţionate au reprezentat debutul bacteriologiei, micologiei, virusologiei, parazitologiei şi imunologiei ca ştiinţe. în doar aproximativ 15 ani (după 1880) au fost descoperite şi izolate în cultură pură microorganisme implicate în multe dintre bolile infecţioase importante. Aceste descoperiri au făcut posibilă stabilirea ca entităţi bine definite a medicinei preventive şi respectiv a terapiei specifice (etiologice). Ilia Mecinikov a evidenţiat modul natural de apărare a organismului faţă de agenţii infecţioşi prin anumite celule care au proprietăţi fagocitare şi a scris în 1901 primul tratat de imunologie. În şcoala germană apar o serie de nume celebre, cum ar fi Behring, care a studiat toxinele bacteriene, imunitatea umorală şi seroterapia precum şi Paul Ehrlich (1854-1915). Cercetările lui Ehrlich stau la baza chimioterapiei antimicrobiene. Prin utilizarea derivaţilor arsenicali în tratamentul sifilisului ipotezele sale au fost confirmate. Mai mult decât atât, în anul 1878 Ehrlich realizează că există diferenţe de afinitate tinctorială faţă de coloranţii pe bază de anilină. Această descoperire îl ajută să studieze efectul diferitelor substanţe chimice, dar stă şi la baza apariţiei coloraţiilor în microbiologie. Ehrlich arată că mycobacteriile au proprietatea de acido-rezistenţă iar doi ani mai târziu (1884), cercetătorul danez Christian Gram pune bazele coloraţiei care îi poartă numele şi care are o remarcabilă utilitate după aproape 125 ani de la această descoperire. Deşi asistenţa medicală într-o anumită formă a existat încă de la debutul vieţii umane pe pământ, începuturile nursing-ului profesional au fost realizate de către Florence Nightingale (1820-1910), care a început munca sa cu mai bine de 140 de ani în urmă, în cursul războiului din Crimeea (1854-1856). Descoperirile 5

ulterioare, privind relaţia dintre microorganisme şi boală, au necesitat dezvoltarea unor proceduri de nursing mai complexe şi mai rafinate decât cele utilizate de „îngerii din Crimeea”. Descoperirea măsurilor profilactice precum administrarea de vaccin variolic (1796), de toxoizi şi antitoxine (în difterie şi tetanos), a serurilor imune (von Behring, Fränkel şi Kitasato, 1890), a vaccinurilor polio şi rujeolos (Enders, Weller şi Robins 1949; Salk 1954; Sabin şi alţii, 1954-1967), precum şi utilizarea de gama globuline pentru prevenirea pojarului, rabiei, tusei convulsive etc., au făcut necesară dezvoltarea de noi concepte şi educaţie în prepararea şi administrarea acestor substanţe. Identificarea căilor de transmitere a infecţiilor a condus la dezvoltarea de metode eficace de prevenire a răspândirii bolilor.în 1895, sir Ronald Ross (1857-1932), medic militar în India, a demonstrat transmiterea agentului etiologic al malariei prin intermediul ţânţarilor. Parazitul a fost vizualizat în eritrocitele umane în 1881 de către Laveran, chirurg al armatei franceze în Algeria. în 1900 a fost demonstrată transmiterea virusului febrei galbene de către o specie particulară de ţânţari (Aedes aegypti), în Cuba. Descoperirea unor teste de diagnostic în domeniul microbiologiei a necesitat o pregătire microbiologică mai avansată a medicilor, asistentelor şi a altor profesionişti ai sănătăţii în metode pentru colectarea produselor şi raportarea specifică de laborator, astfel încât terapia să demareze cât mai precoce. Descoperirea de substanţe chimice specifice (de exemplu sulfonamidele, Domagk 1935) şi substanţe antibiotice (de exemplu penicilina, streptomicina, tetraciclina şi cloramfenicolul) a contribuit la îmbunătăţirea modului de abordare medicală a problematicii bolilor infecţioase. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit în anul 1944 (streptomicina - Scharty, Bugie, Waksman). Procedurile chirurgicale moderne ar fi imposibile fără dezinfecţie şi sterilizare. Industria laptelui, a conservelor, a hranei ambalate şi congelate sunt dependente de microbiologie. Sanitaţia sistemelor de apă şi tratarea apelor poluate sunt posibile numai datorită cunoştinţelor acumulate prin microbiologie în cursul ultimului secol. în multe moduri profesiunea medicală şi fiecare latură a ei este dependentă de cunoaşterea, înţelegerea şi utilizarea informaţiilor din microbiologie. La şcoala română de microbiologie înfiinţată de profesorii Victor Babeş (1854-1926) şi Ion Cantacuzino (1863-1934) s-au pregătit multe generaţii de microbiologi, viitori cercetători şi profesori, care au contribuit la dezvoltarea microbiologiei din ţara noastră. Victor Babeş s-a născut la Viena în anul 1854, a studiat la Facultatea de medicină din Budapesta, apoi în Viena unde a fost numit preparator la catedra de Anatomie condusă de profesorul Lauder. Ulterior este recomandat pentru a deveni asistent la catedra de Anatomie patologică la Facultatea de medicină din Budapesta. A fost în acelaşi timp anatomopatolog şi microbiolog. A fost atât elevul lui Robert Koch, cât şi al lui Louis Pasteur. A fost numit docent şi profesor la Facultatea de medicină din Budapesta la o vârstă foarte tânără (27 ani). Cu patru ani mai târziu, în anul 1885, publică împreună cu A.V. Cornil primul tratat de bacteriologie medicală din lume (în 1891 apare a treia ediţie a tratatului). A doua ediţie a acestui tratat se află în Biblioteca Institutului Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie „Cantacuzino”. Victor Babeş a demonstrat importanţa introducerii tehnicilor microbiologice în anatomopatologie. Ar putea fi menţionat şi faptul că pe parcursul celor 10 ani de activitate la Facultatea din Budapesta, a dat indicaţiile necesare pentru construirea unui nou Institut de anatomie patologică iar în cadrul acestuia a unei secţii dedicate bacteriologiei. A evidenţiat proprietăţile neutralizante ale serurilor imune, a descoperit corpusculii metacromatici ai bacilului difteric (Babeş-Ernst), o nouă metodă de preparare a serului antidifteric etc. în 1886 a fost numit profesor de anatomie patologică şi bacteriologie la Facultatea de Medicină din Bucureşti. Este fondatorul Institutului de Bacteriologie pe baza căruia s-a dezvoltat actualul Institut „Victor Babeş”. În 1889 a 6

preparat vaccin antirabic,ţara noastră fiind a treia ţară din lume care a reuşit să prepare acest vaccin. A condus institutul creat până aproape de sfârşitul zilelor sale, care a fost la puţin timp după pensionarea sa. Din păcate, în ciuda monumentalității sale, ”nu a fost posibil” să fie găsit un spațiu în care să-şi poată continua cercetările şi după pensionare, lucru din păcate mult prea des întâlnit în istoria medicinei noastre. Cu privire la poziţia acestui mare cercetător precum şi la situaţii care par a fi foarte asemănătoare peste ani, în ciuda trecerii timpului şi a speranţei că evoluţia societăţii noastre este într-o direcţie pozitivă, vom prezenta în continuare un fragment din discursul profesorului Victor Babeş, ţinut la Universitatea din Cluj în anul 1919. „Astăzi lumea civilizată aşteaptă deci lucruri mari din partea noastră; nu îmbogăţirea

oligarhiei politice în afaceri, certuri politice, persecuţiuni şi denunţuri infame pentru interese egoiste şi înguste, ci păstrarea şi sporirea celor mai valoroase achiziţiuni ale omenirii: sănătatea, prosperitatea, forţa, justiţia, instrucţiunea şi ştiinţa, spre a asigura pacea şi progresul şi prin ele forţa şi fericirea poporului român, servind de exemplu popoarelor din Orient. Dar politica noastră de până acum n-a făcut decât să ne ducă în cea mai mare desorganizare, desbinare şi dezastru economic, permiţând prin egoism şi nepăsare ca ţărănimea să fie azi degenerată, analfabetă, lipsită şi îndatorată peste măsură; politicienii noştri au reuşit să oprime toate valorile, înlocuindu-le prin clientela lor politică; au adus funcţionarismul, birocratismul, nepotismul la culme; politicienii noştri în nepăsarea lor pentru interesele ţării au lăsat armata la începutul războiului aproape nepregătită în clipele cele mai periculoase prin care a trecut ţara şi din care nu ne-a scăpat decât vitejia fără pereche a soldatului român. Trebue să ne întrebăm dacă nu acest politicianism este cauza tuturor relelor şi dacă nu este o datorie patriotică să întrebuinţăm toate mijloacele necesare ca să-l nimicim şi să-l înlocuim cu o altă putere care să ne garanteze regenerarea şi progresul. În adevăr trebue să fim profund îngrijaţi şi să ne întrebăm înainte de toate cum vom putea să eşim din acest dezastru şi cum vom putea face faţă creanţei mari pe care am contractat-o faţă de lumea civilizată. Publicul care, până deunăzi, a observat la guvernanţii noştri aceleaşi viţiuri politice, aceeaşi nepăsare pentru interesele reale ale ţării, acelaşi nepotism, aceeaşi venalitate, acelaşi egoism care ne-a condus la degenerare ca şi înainte războiului,aşteaptă cu nerăbdare o schimbare radicală a moravurilor politice care să ne pună în poziţiunea de a îndeplini măreaţa noastră misiune. Faţă de aceste adevăruri ar fi trebuit să ne aşteptăm ca România nouă să pună piciorul în prag şi să rupă odată pentru totdeauna cu vechiul politicianism. Însă ce vedem spre profunda noastră descurajare; că aceeaşi principii dezastruoase, egoiste, aceeaşi fraze goale domină şi politica de astăzi şi că mergem orbi înainte spre un dezastru sigur. În loc ca întinderea şi bogăţia acestei ţări binecuvântate să ne asigure un loc de frunte şi stare economică briliantă, ne găsim astăzi în deplin faliment, expuşi ruinei şi foametei şi mai mult decât oricând sub dependenţa şi exploatarea nemiloasă a naţiunilor mari.” Ion Cantacuzino a avut o personalitate cu totul deosebită, imposibil de cuprins într-o trecere atât de sumară prin istoricul microbiologiei. A studiat la Paris Filozofia şi Literele, ştiinţele naturale şi Medicina. Pregătirea în microbiologie a desăvârşit-o pe parcursul a 9 ani, în laboratorul lui Ilia Mecinikov, la Paris. A cunoscut mai multe limbi străine, inclusiv latina şi greaca. A studiat la Paris şi a revenit în ţară pentru satisfacerea stagiului militar (genişti, Jilava). A continuat studiile în Franţa (ştiinţe naturale 1886, medicină 1887). Lucrează în Institutul Pasteur începând cu 1892, devine doctor în medicină în 1894 şi este numit profesor suplinitor de Morfologie animală la Facultatea de Ştiinţe din Iaşi (1894). A fost numit profesor la 7

Facultatea de Medicină din Bucureşti în anul 1901 şi a grupat în jurul său un mare număr de tineri medici, care au devenit la rândul lor îndrumători şi creatori de şcoală (Al. Slătineanu, C. Ionescu-Mihăieşti, M. Ciucă, Al. Ciucă, D. Danielopolu, D. Combiescu, N. Gh. Lupu, I. Bălteanu, I. Nicolau, Lidia şi I. Mesrobeanu şi mulţi alţii). În perioada 1908-1910, profesorul Cantacuzino este numit Director General al Serviciului Sanitar, face Legea de organizare a acestui serviciu, înfiinţează sanatoriile Bisericani, Bârnova, Nifon, Cărbuneşti, Filaret precum şi primele laboratoare regionale de bacteriologie şi igienă (Craiova, Galaţi, Constanţa, Iaşi, Sulina). Începe în 1912 prepararea vaccinului contra febrei tifoide şi a holerei asiatice, ulterior începe prepararea serului antidifteric. Este numit în 1917 Director al Directoratului Sănătăţii Publice civile şi militare, calitate în care coordonează combaterea epidemiilor de holeră, tifos exantematic, febră recurentă. În 1920 începe prepararea serurilor antimeningococic şi anti gangrenos (în Laboratorul de Medicină experimentală) iar în data de 4 iunie semnează în calitate de prim delegat, Tratatul de la Trianon. Un an mai târziu se înfiinţează Institutul de Seruri şi Vaccinuri, în 1926 începe vaccinarea BCG în România iar în 1928 înfiinţează „Archives Roumaines de Pathologie Expérimentale et de Microbiologie”. Din păcate, în momentul de faţă „Romanian Archives of Microbiology and Immunology” (numele actual al revistei, care a ajuns la volumul cu numărul 69) nu apare listată între publicaţiile recunoscute oficial în ţara noastră, cu toate că începând cu anul 2005 a existat un reviriment, comitetul editorial străduindu-se să refacă prestigiul revistei, ca o datorie morală faţă de înaintaşi. În perioada 1931-1932 face parte din Guvernul prezidat de Nicolae Iorga, în calitate de ministru al sănătăţii publice. Lucrează la elaborarea unei noi legi sanitare. Cu numai nouă zile înainte de a înceta din viaţă prezidează Congresul de Tuberculoză şi propune înfiinţarea Ligii contra Tuberculozei. Pe lângă şcoala pe care a format-o, una dintre cele mai mari realizări ale Profesorului Cantacuzino a fost înfiinţarea în anul1921 a Institutului de Seruri şi Vaccinuri, numit astăzi INCDMI „Cantacuzino” (Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie), centru de cercetare ştiinţifică fundamentală şi aplicativă, centru de învăţământ de specialitate, instituţie care a preparat şi prepară seruri, vaccinuri şi alte produse biologice utile în diagnosticul bolilor transmisibile. Alexandru Slătineanu (1873-1939) a organizat învăţământul universitar de microbiologie la Iaşi (cercetări în domeniul febrei tifoide, tuberculozei, tifosului exantematic, etc.). Constantin Ionescu-Mihăieşti (1883-1962) a abordat teme importante în domeniul virusologiei, bacteriologiei, parazitologiei, imunologiei, hematologiei, anatomiei patologice şi epidemiologiei. A avut contribuţii deosebite în studierea mycobacteriilor şi enterovirusurilor. A muncit intens pentru dezvoltarea Institutului „Cantacuzino” a cărui director a fost începând cu anul 1934. A continuat activitatea ştinţifică şi administrativă promovată de Ion Cantacuzino. Mihai Ciucă (1883-1969) a dezvoltat o bogată activitate ştiinţifică în domeniul bacteriologiei şi epidemiologiei, experimental, terapeutic şi clinic. A studiat împreună cu Jules Bordet fenomenul lizogeniei (1921); a avut contribuţii deosebite în domeniul malariei fiind numit secretar al Comisiei de Malarie de pe lângă Liga Naţiunilor. A fost profesor de microbiologie întâi la Iaşi şi din 1934 în Bucureşti fiind al treilea profesor de bacteriologie din Bucureşti după Victor Babeş şi Ion Cantacuzino. Alexandru Ciucă (1880-1872) a absolvit facultatea de medicină veterinară din Bucureşti. Activitatea lui s-a îndreptat mai ales spre organizarea producţiei de seruri hiperimune pentru tratamentul tetanosului, difteriei etc. A fost al treilea director al Institutului Cantacuzino. Dumitru Combiescu (1887-1961) a cercetat capitole majore ale patologiei infecţioase (febra tifoidă, febra recurentă, dizenteria, tetanosul, antraxul, gangrena gazoasă etc). A avut contribuţii deosebite în domeniul 8

rickettsiozelor şi leptospirozelor. În timpul primului război mondial a organizat măsuri de prevenire a tifosului exantematic. Matei Balş (1905-1989) a fost cea mai proeminentă personalitate a secolului XX, în România, în domeniul bolilor infecţioase. A făcut un stagiu de microbiologie la Institutul Pasteur din Paris şi ulterior a intrat între personalităţile cu formaţie „cantacuzinistă”, lucrând alături de Ion Cantacuzino, Mihai Ciucă, I. Bălteanu. Deşi era un foarte bun clinician a devenit şi întemeietorul şcolii moderne de bacteriologie clinică. Tehnicile şi metodele de diagnostic imaginate i-au adus numeroase brevete şi inovaţii care îi poartă numele atât în ţară cât şi în străinătate. Şcoala astfel întemeiată a avut o activitate cu rezultate excepţionale pentru ştiinţa românească, pentru microbiologie şi pentru sănătatea publică. După 1989, Institutul Cantacuzino a reintrat în Reţeaua Internaţională a Institutelor Pasteur şi a Institutelor Asociate ceea ce a permis obţinerea unor rezultate, importante. INCDMI „Cantacuzino” trebuie să continue tradiţia înaintaşilor şi să îşi menţină poziţia importantă în cadrul instituţiilor care se ocupă de sănătatea publică la nivel naţional şi internaţional. Eforturile de la nivel central din perioada 1997-2000 şi respectiv eforturile depuse în perioada 2005-2007 au reprezentat un sprijin important în acest sens. George Emil Palade (1912-2008) Absolvent al facultăţii de medicină din Bucureşti, a desfășurat o prodigioasă activitate ştinţifică, în Statele Unite. A fost unul dintre pionierii microscopiei electronice şi a fracționării celulelor (separarea organitelor celulare). A fost iniţial cercetător şi ulterior profesor de biologie celulară al Institutului Rockefeller din New York iar din 1973 al universităţii Yale din New Haven. Ultimul loc în care George Emil Palade a fost profesor a fost facultatea din San Diego, California. A pus bazele unor noi departamente pentru studiul celular. Cercetările lui au cuprins descrierea rolului şi structurii mai multor organite (mitocondria în detaliu cu structura membranei și a cristelor, a definit rolul reticulului endoplasmic, sistem tubular ce este prezent in orice celula animală sau vegetală). Într-un articol publicat în 1955, Palade a prezentat o fotografie de microscopie electronică ce reprezenta reticulul endoplasmic rugos şi a explicat legătura între cele 2 structuri şi rolul lor în eliberarea produşilor de secreţie). Cea mai importantă a fost descoperirea rolului corpusculilor citoplasmatici, denumiţi iniţial ”corpusculii lui Palade”. A precizat compoziția lor esențială (acizi ribonucleici) rezultând altfel denumirea de „ribozomi”. În 1974 realizările sale sunt încununate cu premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie. Datorită eforturilor depuse, incidenţa şi prevalenţa anumitor boli infecţioase a scăzut. Trebuie avută însă în vedere emergenţa şi re-emergenţa diferitelor maladii. Microbiologul, medicul clinician şi asistenta medicală trebuie să aplice cunoştinţele de microbiologie în practica de zi cu zi. Deşi anumite tehnici pot fi învăţate din rutină, persoana cu adevărat profesionistă înţelege faptele ştiinţifice precum şi principiile aflate la baza acestor tehnici. Profesionistul ştie de asemenea în ce mod ar trebui adaptate aceste tehnici în cazul anumitor tipuri de pacienţi (ex. pentru cei supuşi chirurgiei cardiace, pacienţilor care au suferit arsuri pe suprafeţe întinse), ce tehnici trebuie utilizate în sălile de operaţie, de aşteptare şi în instituţiile unde sunt îngrijiţi copii mici sau foarte mici, cum pot fi modificate acestea în condiţii de urgenţă (de exemplu în caz de război sau alte calamităţi produse de om sau calamităţi naturale) şi cum trebuie făcută informarea pacienţilor, populaţiei, de exemplu referitor la imunizări. Un membru antrenat alechipei medicale poate să diferenţieze adevărul de interpretarea greşită şi / sau dezinformarea din aşa-zisa 9

„literatură medicală” scrisă pentru publicul larg şi poate recunoaşte erorile apărute în mass media, dacă are noţiunile necesare de microbiologie. Persoanele care lucrează în domeniul sanitar dar şi orice altă persoană realmente interesată, constată sau pot constata că în aproape orice activitate cotidiană există o aplicabilitate a cunoştinţelor microbiologice.

Povestiri Adevarate 1.1.1. Girolamo Fracastoro (1478-1553) S-a născut într-o veche familie de medici. A fost coleg la Facultatea de Medicină cu Nicolaus Copernicus (astronom şi medic). S-a ocupat atât de medicină cât şi de astronomie, matematică, poezie, geografie, muzică etc. Poate fi considerat un bun diagnostician; este primul medic care a făcut diferenţa între ciumă şi tifosul exantematic (au existat 2 izbucniri epidemice de tifos, analizate de această minte luminată, în 1505 şi în 1528). Se poate spune că a descris corect din punct de vedere epidemiologic, în lumina datelor cunoscute la acea vreme, ciuma, variola, febra tifoidă şi tifosul exantematic. A scris mai multe lucrări în domeniul medical, care cuprind informaţii incredibil de corecte, dintre care unele au fost confirmate ulterior aproape în totalitate. Prima dintre aceste lucrări a fost scrisă în versuri şi se pare că a fost publicată la Veneţia [Syphilis sive morbus Gallicus(Sifilisul sau boala galică), 1530, trei volume; numele se datorează faptului că se presupune că sifilisul ar fi fost răspândit în Italia de trupe franceze asediatoare]. În primele două volume, Fracastoro descrie cu bune amănunte sifilisul; a descris şi luesul ca entitate în cadrul acestei patologii, a discutat modalităţile de debut şi chiar diferenţele între cele trei stadii ale bolii. Apar menţionate şi informaţii despre modalităţi de diagnostic şi „tratament” (vapori de mercur, mixturi din sulf, mercur şi extracte vegetale etc). În această scriere sunt discutate chiar şi metode de prevenţie. În al treilea volum, Girolamo Fracastoro prezintă date privind călătoriile lui Columb în Indiile de Vest (se pare că boala era foarte răspândită printre băştinaşi) dar şi o poveste din mitologie, povestea păstorului Syphil (numele sifilisului are, se pare, o vechime foarte mare) care a fost pedepsit de zeul Apollo, tocmai prin această boală. Lucrarea De contagione, contagionis morbis et eorum curratione („Despre contagiune, boli contagioase şi tratamentul lor”), publicată tot la Veneţia, la vârsta de 68 de ani, include toate cunoştinţele şi teoriile lui Fracastoro referitor la bolile contagioase ale acelor vremuri. În mod uimitor, cu sute de ani înainte ca aceste aspecte să fie studiate şi parţial demonstrate ştiinţific de către Louis Pasteur, într-o vreme când bolile erau considerate drept „pedeapsa zeilor”, teoria „miasmelor morbigene” a lui Hipocrate este combătută iar Fracastoro emite ipoteza conform căreia bolile contagioase sunt transmise prin intermediul unor „fiinţe invizibile” [Seminaria morborum (seminţele bolilor)]. După mai mult de 130 de ani, Antony van Leeuwenhoeck utilizează microscopul pentru a studia câteva dintre microorganisme. În plus, Girolamo Fracastoro discută căile de intrare a „seminţelor bolii” în organism: a. pe gură, b. prin respiraţie, c. prin răni, d. direct prin piele. Mai mult decât atât, clasifică „contagiul” drept fiind de trei feluri: a. prin contact direct (ex. în tuberculoză, lepră, sifilis); b. prin contact indirect, prin fomites (haine, aşternuturi, farfurii) şi c. la distanţă („seminţele morbigene” fiind purtate la distanţă de către vânt, ploaie, apa râurilor etc., ca în cazul ciumei). Cu toate că a oferit incredibil de multe explicaţii, cu toate că teoriile sale au fost în bună parte confirmate ulterior, la acea vreme 10

nu au fost acceptate iar teoria „miasmelor morbigene” a fost pentru încă mult timp considerată ca fiind valabilă. Cu toate acestea, se poate spune că Girolamo Fracastoro poate fi recunoscut în istoria medicinei ca „părintele patologiei infecţioase”. revenire sus 1.1.2. Robert Koch (1843-1910) Alături de Louis Pasteur poate fi considerat “părintele bacteriologiei”. În 1905 meritele sale au fost recunoscute, primind premiul Nobel, acordat pentru cercetările în domeniul tuberculozei. S-a născut în 1843 în Clausthal. A studiat medicina la universitatea din Gottingen şi Hanovra iar în 1866 a absolvit facultatea şi a fost numit medic de circumscripţie. A practicat medicina în mai multe localităţi germane. În 1868 s-a stabilit în Wolstein (astăzi această localitate se află în Polonia). În timpul şederii la Wolstein a studiat Bacillus anthracis într-un laborator improvizat în propria locuinţa. Aici a creat celebrele postulate. Bacillus anthracis a fost descoperit de Pollender, Reyer şi Davaine dar Robert Koch a fost cel ce a demonstrat că această bacterie e cauza îmbolnăvirilor cu antrax “cărbune” (nume dat datorită culorii închise a leziunilor din această boală). Prin studiile amănunţite a descoperit fenomenul de sporulare şi a fost primul cercetător care a folosit tehnica fotografiei în microbiologie, el fotografiind câmpurile microscopice. În 1880 a fost angajat în ministerul sănătăţii unde şi-a continuat cercetările avându-l colaborator printre alţii pe Lofler. În 1891 s-a înfiinţat Institutul pentru Studierea şi Combaterea Bolilor Infecţioase din Berlin, instituţie care la 30 de ani de la descoperirea bacilului tuberculozei a primit numele marelui savant. Infecţia cu Mycobacterium era o mare problemă în secolul 19. Unul din 7 oameni suferea de această boală, multe dintre îmbolnăviri evoluând nefast, spre deces. În 1881 Robert Koch a izolat bacilul cauzator şi a reuşit să îl cultive pe medii artificiale. În 1901 la congresul britanic despre tuberculoză, savantul a dăruit organizatorilor 5 eprubete în care se aflau colonii provenite din cultivarea succesiva de 435 de ori a bacililor pe care îi identificase cu 20 de ani în urmă (în 1891 Heinrich Gunther, un muncitor de 32 de ani, a fost internat şi după câteva zile a murit, se pare, datorită unei tuberculoze miliare; la necropsie Robert Koch a prelevat material bioptic, a inoculat iniţial pe animale de laborator bacteriile provenite din acest material, ulterior reuşind să le cultive şi în vitro; în 24 martie 1882, Robert Koch a făcut publice descoperirile sale privind izolarea şi identificarea agentului patogen al tuberculozei). Cercetările nu s-au oprit aici, Robert Koch continuând să aprofundeze studiul mycobacteriilor dar abordând şi alte microorganisme. După succesul identificării bacilului tuberculos a urmat o perioada mai puţin fastă, el încercând să folosească iniţial ”Alt-Tuberkulin” ulterior ”Neu-Tuberkulin” (un filtrat de cultură bacteriană) ca şi tratament. Insuccesul i-a adus numeroase critici dar experimentul a avut şi o parte bună, aceste încercări reprezentând momentul de pionierat pentru evidenţierea hipersensibilităţii de tip IV, tuberculinică, iar tuberculina va fi ulterior utilizată în diagnostic și studii epidemiologice. revenire sus 1.1.3. Institutul Ion Cantacuzino Institutul Cantacuzino a existat cu mulţi ani înainte de a fi primit prin legea din 1921 o confirmare pe tărâm administrativ. Încă din anul 1904, doi ani după chemarea profesorului Cantacuzino la Catedra de Medicină Experimentală de la Facultatea de Medicină, laboratorul său, destinat iniţial exclusiv învăţământului şi cercetărilor pur experimentale, instalat în câteva încăperi din institutul de Patologie şi Bacteriologie condus de 11

profesorul Victor Babeş, a fost însărcinat de către Direcţia Sanitară să studieze metodele de preparare şi valoarea practică a două ”seruri curative” de mare interes pentru medicină, serul antistreptococic şi serul antidizenteric. Primele încercări de aplicare la bolnavi s-au arătat foarte încurajatoare; ca atare s-a trecut de la faza experimentală la prepararea pe o scară mai întinsă și la utilizarea lor în practică. În perioada 1910-1913 a început experimentarea şi prepararea vaccinurilor contra febrei tifoide şi holerei asiatice. Rezultatele obținute convingeau şi pe cei mai sceptici. Consiliul sanitar a adoptat întrebuinţarea acestor metode în combaterea epidemiilor de febra tifoida şi holeră, iar Serviciul Sanitar al armatei a decis aplicarea consecventă a vaccinării antitifoidice la recruţi realizând prin aceasta dispariţia aproape completă a cazurilor de febra tifoidă din armată. Toate aceste fapte au fost realizate cu mijloace improvizate, într-un modest laborator de învăţământ, în care încăperea cea mai impunătoare - sala de lucrări practice pentru studenţi - nu putea primi deodată mai mult de 25-30 de persoane. Conducerea profesorului crea o atmosferă de munca entuziastă şi dezinteresată, o motivaţie admirabilă printre colaboratori. Personalul tehnic se întărea, numărul asistenţilor benevoli de asemenea. Prin activitatea practică, laboratorul putea pune la îndemâna studenţilor mijloace de lucru care nu puteau fi găsite într-un simplu laborator universitar. Institutul Cantacuzino, exista de fapt. Războiul din 19161918 a demonstrat imperios promovarea unei legi dedicate înființării, așa cum am menționat. De altfel, istoria ”nu se schimbă”; în ultimii 20 de ani aproape fiecare pas realizat în dezvoltarea sistemului de sănătate publică din România a ”beneficiat” de câte o problemă de sănătate care a demonstrat autorităților (cel puțin pentru o perioadă de timp) că este necesară o intervenție concretă. Mijloacele improvizate nu mai puteau fi suficiente pentru o țarăa întregităa, cu o populaţie de trei ori mai mare şi care suferise pe timpul şi din cauza ocupaţiei străine. În reorganizarea sanitară a țării, s-a impus, ca o măsură de primă necesitate, organizarea unui Institut central de seruri şi vaccinuri, echipat în aşa fel încât să corespundă nevoilor considerabil crescute ale României Mari, institut de producţie, de cercetare dar și de învăţământ. Prin Legea din 1921, grație guvernului de atunci, s-a creat o instituţie având următoarele scopuri: - să prepare toate serurile, vaccinurile, precum şi alte produse similare, necesare în profilaxia şi tratamentul specific al maladiilor infecţioase din țară; - să facă toate lucrările necesare pentru cercetarea ştiinţifică a acestor maladii şi să stabilească metodele tip pentru serologie şi de microbiologie; - să servească drept organ de control pentru toate analizele bacteriologice şi să-și dea avizul în ce priveşte introducerea în țară a serurilor şi vaccinurilor ”preparate aiurea”; - să pregătească medici specialişti în microbiologie; - să tipărească publicaţii periodice în legătură cu activitatea ştiinţifica a acestui Institut, precum şi cu activitatea medicală şi biologică din întreaga țară. Institutul prepara şi da spre întrebuinţare numai serurile şi vaccinurile care făceau dovada eficacităţii lor. În acelaşi timp, în laboratoarele institutului se cerceta şi se încercau metodele noi de diagnostic microbiologic şi serologic, sau de tratament. Una dintre remarcabilele realizări ale cercetărilor din institut a fost realizarea vaccinului BCG şi începerea vaccinării tuturor copiilor. La acea vreme vaccinul BCG se mai producea numai în cadrul Institutului Pasteur din Paris. 12

Astăzi în cadrul institutului există laboratoare naționale de referinţă (multe dintre acestea fiind certificate internațional, de către Organizația Mondială a Sănătății), inclusiv un laborator foarte performant de biologie moleculară. Producţia încă mai continuă, chiar dacă preparatele pentru uz uman includ în principal (doar) vaccinul gripal sezonier. Anul trecut, INCDMI ”Cantacuzino” a fost una dintre puținele instituții la nivel mondial care a reușit să producă în timp util vaccinul gripal pandemic. În clădirea principală se găseşte sala de curs și lucrări practice în care se predă bacteriologie, noțiuni de imunologie și micologie, pentru studenţii de anul doi ai facultății de medicină. La parter există sala de curs și seminarii pentru studenţii din anul cinci, epidemiologie. Institutul Cantacuzino rămâne cel mai important centru de cercetare din România. În ceea ce privește capacitatea de producție, existența acestuia este indispensabilă (oricărei țări). Avem speranța că în ciuda anumitor ”evenimente” din ultimii ani, nu vom vorbi niciodată despre Acest Institut la timpul trecut, ci doar la prezent și viitor.

2.STRUCTURA CELULEI BACTERIENE 2. 1. Caracteristici Bacteriile se pot clasifica după mai multe criterii, însă o variantă utilă de clasificare este clasificarea în funcţie de structură şi aspectul peretelui bacterian, bacteriile putând fi: - rigide, cu perete dens, imobile sau mobile; unele dintre aceste bacterii pot forma micelii (ex. bacterii din genurileMycobacterium, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia); dacă majoritatea bacteriilor studiate sunt cultivabile pe medii artificiale există şi bacterii care pot fi denumite ca paraziţi strict intracelulari (ex. genurile Rickettsia, Chlamydia); - flexibile, cu perete celular subţire (ex. spirochetele, Treponema spp, Leptospira spp.); - lipsite de perete celular (ex. bacteriile din genul Mycoplasma). Celula bacteriană este o celulă procariotă şi are caracteristici structurale diferite în comparaţie cu celula eucariotă Tabelul nr. 1. Caracteristici comparative (celula eucariotă / celula procariotă) Celula eucariotă Nucle ul

Celula procariotă

- prezintă - nu prezintă membrană membrană 13

- are mai - are un singur mulţi cromozom, circular cromozomi - absenţa mitozei - prezintă - nu este tipic ci aparat mitotic apare ca nucleoid - nucleul este tipic, prezintă nucleol Citopl asma

prezintă: nu prezintă: - reticul - reticul endoplasmic endoplasmic, - mitocondrii, mitocondrii - lizozomi - lizozomi prezintă ribozomi - ribozomi 70S 80S membrana citoplasmatică nu membrana conţine steroli citoplasmatică (excepţieMycoplasma) conţine steroli

Perete - absent - are structură le celular sau compus complexă, prezentând din celuloză glicopeptid, proteine, sau chitină. lipide etc. - nu prezintă glicopeptid Diviziu

mitoză

Capsul

absentă

ne

diviziune directă (binară) adesea prezentă

a

Forma 2. 2. 1. În funcţie de formă, bacteriile se pot grupa în mai multe categorii şi pot avea: a). formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea steptococilor şi stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolaţi, gonococii şi meningococii pot fi reniformi. Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultură în care se dezvoltă, de vârsta culturii bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum şi de modul în care are loc diviziunea în cursul procesului de creştere şi multiplicare (planul de diviziune). 14

Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri de bacterii, de ex.: - stafilococii sunt coci sferici dispuşi în grămezi („ciorchine”); - pneumococii sunt coci lanceolaţi dispuşi doi câte doi, eventual înconjuraţi de o capsulă comună (în diplo); - streptococii sunt coci dispuşi în lanţuri etc.; b). formă de bastonaş (bacili, „rods”), drepţi cu capetele uşor rotunjite (enterobacterii), drepţi cu capetele tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuţite (Fusobacterium nucleatum), dispuşi uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în palisade”, ca şi scândurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici); c). aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus); d). actinomicete, care în culturi tinere formează filamente lungi, ramificate (asemănător mucegaiurilor); aceste filamente se fragmentează şi rezultă aspecte bacilare (ex. Actinomyces israelli); e). forma spiralată (bacili curbi - V. cholerae, spirili şi spirochete - T. pallidum). Unele bacterii, chiar şi atunci când rezultă prin multiplicarea unei singure celule „mamă” prezintă un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.). În culturi vechi sau sub influenţa unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu antibiotice etc., pot apărea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fără experienţă sau care nu face o examinare ţinând cont de context. Dacă are loc repicarea acestora pe mediu de cultură proaspăt iar examinarea ulterioară se face la timpul potrivit (având în vedere durata optimă de multiplicare) vor rezulta forme „tipice” pentru specia respectivă.

Dimensiunile 2. 2. 2. Dimensiunile variază în funcţie de gen, specie, condiţiile de mediu, vârsta şi stadiul de dezvoltare al culturii. În general bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor, de exemplu, pentru coci 0,5-2 µm, iar pentru bacili 0,3-2/0,5-10 µm. Dintre bacteriile vizibile la microscopul optic, Francisella tularensis (discutată astăzi în legătură cu posibile atacuri teroriste) poate avea dimensiuni mici, de circa 0,3-0,6 µm / 0,2 µm. Rickettsiile, chlamydiile şi mycoplasmele nu sunt vizibile la microscopul optic datorită dimensiunilor foarte mici. Flagelii pot atinge dimensiuni de până la 10µm. Formele filamentoase rezultate după tratamentul cu antibiotice pot depăşi această dimensiune. Bacteriile din genul Proteus pot prezenta „în mod natural” forme filamentoase, de dimensiuni mari. Dacă în 1993 a fost pusă în evidenţă Epulopiscium fishelsoni (60-800 µm / 200-500 µm), cea mai mare bacterie cunoscută astăzi este Thiomargarita namibiensis, o proteobacterie Gram negativă, potenţial vizibilă cu ochiul liber (dimensiuni între 100–300 µm şi până la 750 µm). (1999) Datorită dimensiunilor mici, bacteriile pot fi vizualizate numai cu ajutorul microscopului, fie clasic, cu lumina transmisă direct, atunci când utilizând un ocular cu o mărire de 10× şi un obiectiv (de imersie) cu o mărire de 90-100 X, se realizează o amplificare a dimensiunilor bacteriene de circa 900-1.000 X, fie utilizând 15

alte tipuri de microscoape. Spre exemplu, utilizarea preparatelor colorate prin metode în care marcajul se face cu subtanţe fluorescente va creşte puterea de rezoluţie iar numărul de câmpuri investigate poate fi mai redus în comparaţie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea capitolul referitor la genul Mycobacterium). Iluminarea în câmp obscur permite examinarea preparatelor proaspete şi evidenţierea agentului etiologic al sifilisului (T. pallidum), agentul etiologic al leptospirozei (Leptospira spp.), inclusiv mobilitatea acestora. Informaţii privind preparatele microscopice, executarea şi colorarea frotiurilor, tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic sunt prezentate în anexa nr. 1.

2. 3. Componentele structurale ale celulei bacteriene Atât din punct de vedere structural cât şi funcţional, există o serie de asemănări între celula procariotă şi celula eucariotă. Bacteriile prezintă atât elemente structurale interne cât şi structuri externe care pot şi merită a fi studiate având implicaţii în relaţiile dintre celula bacteriană şi organismul gazdă. Există două tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea fiind întâlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind întâlnite numai în anumite condiţii şi doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative).

2. 3. 1. Structuri constante ale celulei bacteriene Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de: - perete, - membrană citoplasmatică, - citoplasmă (cu ribozomi şi facultativ cu incluzii, vacuole, plasmide) şi de - nucleu. 2. 3. 1. 1. Peretele bacterian Peretele bacterian înconjoară membrana citoplasmatică. Lipseşte la bacteriile din genul Mycoplasma. Are o grosime de circa 15-30 nm. Bacteriile Gram-pozitive conţin aproximativ 80-90% mureină (peptidoglican, glicopeptid parietal). Mureina este un heteropolimer al cărui schelet este format din lanţuri polizaharidice. Aceste lanţuri sunt formate prin polimerizarea, alternantă, a 2 structuri zaharidice: - acidul N-acetil-muramic (NAM) şi - N-acetil-glucozamina (NAG). Fiecare moleculă de NAM are substituit un tetrapeptid alcătuit din D şi L-aminoacizi. Se consideră că aminoacizii în formă D conferă un grad de protecţie faţă de enzimele proteolitice. Între tetrapeptidele substituite, la lanţurile polizaharidice alăturate, se stabilesc legături peptidice prin gruparea terminală COOH a unui tetrapeptid şi grupări terminale libere ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formează structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor straturi care înconjoară întreaga celulă bacteriană. 16

Bacteriile Gram-pozitive reţin violetul de metil (violet de genţiană în coloraţia „clasică”) şi au culoare violet pe frotiul colorat Gram. La unele bacterii, reţeaua de bază este acoperită de reţele suplimentare cu specificitate antigenică, alcătuite de exemplu din acid teichoic (polimer de ribitol fosfat şi glicerol fosfat), legat de regulă covalent la peptidoglican. În cazul în care structurile fosfat se găsesc în cantităţi limitate sau nu pot fi sintetizate, la nivelul peretelui bacterian putem întâlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc. În cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular în general mai subţire dar mult mai complex. Peretele este alcătuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din structura peretelui) care este acoperit de o membrană externă. Spaţiul dintre membrana citoplasmatică şi membrana externă (include peptidoglicanul) reprezintă spaţiul periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana externă este alcătuită din fosfolipide, proteine şi cantităţi variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se află la acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are în componenţă două structuri esenţiale: lipidul A şi polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decolorează cu alcool-acetonă şi se recolorează cu fucsină diluată (au culoare roşie la coloraţia Gram). Dintre bacteriile Gram-negative am putea aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc. Bacteriile acid-alcool rezistente (de exemplu, mycobacteriile sau nocardiile) conţin o cantitate substanţială de lipide la nivel parietal. Rezistă decolorării cu acid-alcool (au culoare roşie pe fond albastru la coloraţia ZiehlNeelsen); această coloraţie continuă să reprezinte o etapă esenţială în diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, indiferent de cele mai recente descoperiri privind tehnicile moderne de laborator (inclusiv utilizarea sondelor nucleotidice sau amplificarea genetică). În afară de mycobacterii (în special M. tuberculosis, dar şi numeroase mycobacterii „atipice” (non-tuberculous mycobacteria, NTM), ex. M. avium, M. intracellulare, M. kansasii), există şi alte specii bacteriene care pot apărea colorate asemănător după utilizarea metodei Ziehl-Neelsen, spre exemplu bacilul difteric (C. diphteriae). Rolurile peretelui bacterian: - prin rigiditate asigură forma caracteristică bacteriei (coci, bacili etc); - asigură rezistenţa bacteriei (de exemplu la variaţii ale presiunii osmotice şi la presiuni interioare care pot ajunge până la 20 atm.); - flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicată atât prin flexibilitatea membranei cât şi prin grosimea redusă a peptidoglicanului; - are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, în cazul bacteriilor Gramnegative etc); - prezintă receptori, de exemplu pentru bacteriofagi; - are rol în diviziunea bacteriană participând la formarea septului transversal; - la nivelul lui pot acţiona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina, D-cicloserina); - la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate în spaţiul periplasmic şi la nivelul membranei externe). Protoplastul (formă rotundă înconjurată de membrana citoplasmatică) reprezintă bacteria Gram-pozitivă după îndepărtarea completă a peretelui, de exemplu sub acţiunea lizozimului care lizează mureina. În medii hipotone protoplastul se lizează. Este o structură care nu se poate multiplica. 17

Sferoplastul reprezintă bacteria Gram-negativă după degradarea parţială a peretelui (conţine o cantitate mai mică de mureină). Lizozimul poate acţiona asupra peptidoglicanului numai după alterarea membranei externe (ex. după tratare cu EDTA). În medii hipotone sferoplastul se lizează. Spre deosebire de protoplast, se poate multiplica. Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradează peptidoglicanul, spre exemplu glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substanţe să aibă un rol în creşterea şi multiplicarea bacteriană. Formele L În 1935 s-a observat prezenţa unor germeni modificaţi structural. Au fost numite forme „L”, după numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme noi, ci variante ale unor microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizându-se lizozim sau penicilină ca agenţi inductori s-au putut obţine forme „L” de la majoritatea bacteriilor. Este posibil ca aceste forme „L” să explice, prin prezenţa lor în organism, anumite infecţii cronice (de exemplu infecţii ale aparatului urinar). 2. 3. 1. 2. Membrana citoplasmatică Între perete şi citoplasmă există membrana citoplasmatică având grosimea de 7-10nm; poate reprezenta circa o zecime din greutatea uscată a peretelui bacterian. Electronomicrografic apare formată din 2 straturi întunecoase separate de un strat mai clar. Este considerată un „mozaic fluid”, compusă dintr-un film fosfolipidic în care flotează proteine globulare cu extremităţile polare hidrofile expuse spre spaţiul intracelular, extracelular sau ambele. Aproape 10% din proteinele celulei bacteriene, peste 200 de feluri de proteine, sunt localizate la nivelul membranei citoplasmatice. Fosfolipidele, dispuse în dublu strat, au extremităţile polare, hidrofile, expuse contactului cu apa pe ambele feţe ale membranei şi extremităţile nepolare, hidrofobe, orientate spre stratul mijlociu al membranei. Nu conţine steroli (excepţie Mycoplasma spp). Rolurile membranei citoplasmatice sunt de: - filtru selectiv, datorită permeazelor (rol în permeabilitate şi transport); - barieră osmotică; - a conţine enzime ale metabolismului respirator (de exemplu citocromi); - a fi sediul majorităţii activităţilor enzimatice ale celulei bacteriene (de exemplu intervine activ în procesele de biosinteză); - excreţie a unor enzime hidrolitice; - a interveni activ în procese de biosinteză; - a contribui la formarea septului transversal (rol în diviziunea celulară); - a participa la procesul de chemotaxie prin receptorii de pe suprafaţa sa. Asupra membranei pot acţiona anumite antibiotice (de exemplu polimixinele). 2. 3. 1. 3. Mezozomii Mezozomii sunt structuri care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice de care rămân legaţi. Sunt prezenţi în special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura chimică a membranei citoplasmatice şi aceleaşi funcţii în permeabilitate şi respiraţie. Cu un capăt se pot fixa de materialul nuclear, favorizând distribuirea în mod egal a genomului între cele două celule fiice. Au rol şi în formarea septului transversal. 2. 3. 1. 4. Citoplasma La microscopul optic, pe preparatele colorate uzual, observăm numai citoplasma bacteriană, intens bazofilă. Detaliile structurale (nucleoplasmă, ribozomi, incluzii) se pot observa numai cu ajutorul microscopului 18

electronic. Are o structură mai simplă faţă de citoplasma eucariotelor. Este constituită dintr-un sistem coloidal format din proteine, enzime, lipide, pigmenţi, hidraţi de carbon, săruri minerale şi apă. Conţine în mod caracteristic 80% apă, menţine într-un sistem coloidal proteine, carbohidraţi, lipide, săruri etc, conţine o mare cantitate de ARN (ex. ARNm, ARNt). Particulele citoplasmatice studiate sunt: ribozomii, incluziile, vacuolele; în citoplasmă pot exista şi elemente facultative, plasmidele (formate din ADN extracromozomial). La celula tânără citoplasma este intens colorată, omogenă, conţine ARN în cantitate mare, este clară în timp ce la celula „bătrână” citoplasma are aspect granular. 2. 3. 1. 5. Ribozomii: structură, rol Ribozomii au formă aproximativ sferică, pot fi văzuţi la microscopul electronic. Mărimea lor (circa 10-20 nm) depinde de concentraţia ionilor Mg2+ şi K+. Unii ribozomi sunt liberi în citoplasmă, în timp ce alţii apar legaţi de faţa internă a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conţin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70 unităţi Swedberg dar sunt constituiţi din două subunităţi de câte 30S şi respectiv 50S. În subunitatea mică intră o singură moleculă de ARNr, 16S şi 21 de tipuri de proteine ribozomale. În subunitatea mare intră mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S). Între cele două subunităţi se formează canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) în cursul sintezei proteice. Se apreciază că într-o bacterie cu dimensiuni medii, aflată în faza de creştere activă, se sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens. Ribozomii au rol esenţial în procesul de biosinteză proteică. Au tendinţa de a se grupa în polisomi (poliribozomi) cu eficienţă sporită în biosinteza proteică. În aceste condiţii, la un moment dat pe aceeaşi moleculă de ARNm se află în scopul traducerii mesajului genetic mai mulţi ribozomi, care constituie un ansamblu care poartă numele de polisom. Biosinteza proteică Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor. Cu toate că secvenţa de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvenţa de baze azotate din ADN, pentru că nu există afinitate şi posibilitate de cuplare între ADN şi aminoacizi este necesar ca o altă structură să permită poziţionarea aminoacizilor în lanţul viitoarei proteine. Iniţial are loc transcrierea informaţiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta această informaţie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de ADN care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controlează sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron. ARNm care deţine informaţia genetică pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poartă numele de ARNm monocistronic. La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informaţia necesară pentru sinteza mai multor catene diferite şi în acest caz ARNm poartă numele de ARNm policistronic. Această situaţia particulară este datorată dimensiunii mici a acestor procariote precum şi metabolismului intens care are loc în cursul procesului de creştere şi multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenţial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se află deţinut de o singură moleculă de ARNm policistronic. De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriţă pentru ARNm. Transcrierea mesajului genetic este selectivă (se desfăşoară între promotor şi semnalul de terminare) şi este controlată de ARN polimeraza ADN-dependentă. 19

Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenţia la nivel ribozomal a moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi există una sau mai multe molecule de ARNt; în acelaşi timp există enzime specifice fiecărui tip de aminoacid care controlează legarea corectă a aminoacizilor activaţi pe ARNt corespunzător). La nivelul fiecărui ARNt există trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului. ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU şi în aceste condiţii ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni stop. Succesiunea specifică a nucleotidelor este transpusă într-o secvenţă specifică de aminoacizi care intră în constituţia lanţului polipeptidic din proteina în curs de formare. 2. 3. 1. 6. Incluziile Incluziile sunt formaţiuni care apar în citoplasmă la sfârşitul perioadei de creştere activă. Dimensiunea şi forma incluziilor citoplasmatice pot varia în funcţie de condiţiile externe. Pot conţine polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai genului Corynebacterium, la a căror descoperire a avut un rol important Profesorul Victor Babeş), substanţe anorganice simple, polimeri organici (rezervor energetic mai ales la germenii sporulaţi aerobi), lipide, cristale, granulaţii de sulf etc. 2. 3. 1. 7. Vacuolele Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în mai ales la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol în plutirea acestora. 2. 3. 1. 8. Nucleul Masa nucleară vine în contact direct cu citoplasma. Este localizată în partea centrală a celulei. Conţine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranţii bazici, dar pe preparatele colorate uzual este mascat de bazofilia intensă a citoplasmei bogată în ARN. Unicul cromozom bacterian este alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN dublu catenar, cu aspectul unui fir lung (1.000-2.000 µm), închis într-un inel şi replicat pe el însuşi, superspiralat. Mărimea cromozomului poate să difere în funcţie de specia bacteriană (şi respectiv numărul de perechi de baze); cea mai mică celulă bacteriană ar fi cea de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, în timp ce cromozomul de E. coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Având în vedere că dimensiunea bacteriilor este de circa 1-2 mm în cazul cocilor şi de câteva ori mai mare în cazul bacililor, pentru ca materialul genetic să poată fi conţinut în acest spaţiu redus, acesta trebuie să fie compactat într-un mod remarcabil şi astfel, rezultă nucleoidul bacterian care poate fi diferenţiat microscopic. Nucleoidul este format din molecula de ADN asociată cu proteine şi o cantitate variabilă de ARN. Relativ recent (1989) s-a descoperit că există şi bacterii care deţin cromozomi lineari (ex. Borrelia burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia deţin şi plasmide lineare. Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aşa cum am menţionat, cromozomul este unic, însă în celula care se dezvoltă rapid există posibilitatea ca înainte ca prima replicare să se fi încheiat să se iniţieze încă o replicare şi în acest caz celula bacteriană va putea fi meroploidă (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori). Dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (aşa cum se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa mai multor cromozomi. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică diferită pentru că ei sunt copii ale cromozomului iniţial (identici cu acesta). 20

Nucleul deţine informaţia genetică necesară proceselor vitale de creştere şi multiplicare. Codonul Din punct de vedere funcţional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formează un codon. Codonii deţin informaţia genetică pentru a plasa într-o anumită secvenţă un anumit aminoacid, în lanţul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor. Cistronul Cistronul reprezintă o subunitate funcţională a genei, capabilă să determine independent sinteza unui lanţ polipeptidic. Gena Gena structurală reprezintă o porţiune a genomului, respectiv o anumită secvenţă de nucleotide dispuse liniar. Genele structurale reprezintă circa 90% din ansamblul informaţiei genetice. Poartă înscrisă în structura sa informaţia genetică necesară pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau funcţionale (enzime).

2. 3. 2. Structuri facultative Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsulă, cili (flagelii), fimbrii (pili) şi spori (forme de rezistenţă). 2. 3. 2. 1. Capsula: structură, rol, evidenţiere Numeroase bacterii sintetizează polimeri organici (de obicei polizaharide) care formează în jurul celulei o matrice fibroasă, numită glicocalix. La unele bacterii glicocalixul aderă strâns de celula bacteriană şi reprezintă capsula. Există bacterii care deţin o capsulă bine definită, cu structură polizaharidică (S. pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc) sau cu structură polipeptidică (Bacillus anthracis etc). La alte bacterii, glicocalixul formează o reţea laxă de fibrile care se pierde parţial în mediu şi poate fi separată de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibilă, care nu este vizibilă la microscopul optic. Roluri: - factor de virulenţă, împiedicând fagocitarea bacteriei şi favorizând invazivitatea; - rezistenţă faţă de surfactanţi, anticorpi; - permite aderarea unor bacterii (rol de adezină); - barieră protectoare faţă de bacteriofagi, protozoare; - conţine substanţe cu specificitate antigenică (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre exemplu, în cazul S. pneumoniaeexistă peste 90 tipuri antigenice capsulare în timp ce la E. coli sau la Klebsiella pneumoniae există peste 80 tipuri antigenice capsulare. Referitor la modalităţile de evidenţiere ale structurilor capsulare, este de menţionat că prin coloraţia cu albastru de metilen sau tuş de China / India, în jurul bacteriei apare un halou necolorat. Există şi coloraţii speciale pentru capsulă, de exemplu coloraţia Hiss. Structura antigenică a capsulei permite identificarea bacteriilor, spre exemplu prin reacţia de umflare a capsulei (Neufeld) atunci când se folosesc seruri polivalente sau monovalente anti-capsulare pentru identificarea pneumococilor. 2. 3. 2. 2. Flagelii: structură, rol, localizare Cilii sau flagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evidenţiată în preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din genul Proteus este

21

observată pe orice mediu de cultură solid pe care acest microorganism foarte mobil se dezvoltă (fenomenul de „invazie”). Flagelii sunt formaţiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca două perechi pe o structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat în perete şi membrana citoplasmatică. Din punct de vedere chimic flagelul este de natură proteică (flagelina). Roluri: - în mobilitate (cu o viteză de circa 50 µm / secundă); cilul are o mişcare de rotaţie, asemănătoare unei înşurubări în mediu şi ca atare corpul bacterian este împins în direcţia opusă; „motorul” rotaţiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obţinută din ATP; - antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specific de tip); - în clasificarea bacteriilor (prin număr şi distribuţie), bacteriile putând fi - monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa; - lofotriche (cu un mănunchi de flageli dispus la o extremitate); - peritriche (cu mai mulţi flageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de exemplu E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi. 2. 3. 2. 3. Fimbriile (pilii) Sunt formaţiuni scurte, fine, nu au rol în mobilitate. De obicei pilii sunt mai subţiri decât cilii. Pot fi foarte numeroase pe suprafaţa majorităţii bacteriilor; pot fi observate numai la microscopul electronic. Există pili comuni, cu următoarele roluri: - în aderenţa bacteriană (adezine); - conţin receptori specifici pentru bacteriofagi; - antigenic (la unele bacterii), ex. N. meningitidis şi N. gonorrhoeae. Există pili „F” (sexuali), determinaţi genetic de factorul de fertilitate F (episom). Aceştia îndeplinesc rolul canalului de conjugare. 2. 3. 2. 4. Sporii: structură, compoziţie chimică, rol, localizare Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Bacillus). Pe sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi poate sute de ani. Materialul genetic este concentrat şi, împreună cu apa legată, lipide, Ca++, Mg++, este înconjurat de un strat protector (membrana sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale). „Sâmburele” sporal împreună cu membrana citoplasmatică formează protoplastul sporal. Roluri: - formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate transforma într-o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi considerată una dintre cele mai primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de reproducere celulară aşa cum se întâmplă la fungi sau paraziţi); - rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanţe chimice şi antibiotice, raze UV etc. Sporul poate fi localizat: - central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis); - central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc); - terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de „băţ de chibrit”). 22

Poate fi evidenţiat prin coloraţii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraţia Gram (locul sporului rămâne necolorat). Este sensibil la formol, propiolactonă etc. Este distrus prin autoclavare.

2. 4. Povestiri adevărate 2. 4. 1. Sporii bacterieni; Izbucnire epidemică de infecţii cu Clostridium novyi tipA în rândul utilizatorilor de droguri administrate injectabil, în Scoţia În Scoţia, în perioada aprilie-august a anului 2000, s-a raportat un număr fără precedent de îmbolnăviri în rândul utilizatorilor de droguri pe cale injectabilă. Au fost identificate 60 de cazuri (23 confirmate şi 37 probabile), la subiecţi cu vârsta medie de 30 de ani, dintre care 31 erau de sex feminin (51,66%). Toţi pacienţii erau consumatori de droguri administrate prin injecţie intramuscular şi subcutanat (în acest caz a fost vorba despre un preparat compus din heroină şi acid citric). 20 (87%) dintre cazurile confirmate au evoluat către deces. Din totalul pacienţilor, 15 au prezentat fasciită necrozantă, 22 au dezvoltatedem la locul de injectare, iar 13 au prezentat pleurezie. În 20 (54%) dintre cazurile probabile şi 14 (61%) dintre cele confirmate au existat legături familiale sau sociale între subiecţi. Semnele clinice cel mai des înregistrate au fost: durere şi edem marcat la nivelul locului de injectare; în câteva dintre cazuri, în afară de aceste semne, pacienţii au prezentat insuficienţă multiorganică. O caracteristică a sindromului de afectare multi-organică a fost reprezentată de reacţia leucemoidă, cu leucocitoză la valori foarte ridicate, cu deviere la stânga a formulei leucocitare (numeroase leucocite tinere, nesegmentate). Probe din heroina confiscată (pură şi în combinaţie cu acid citric), probe de sânge şi fragmente tisulare (recoltate antemortem şi postmortem) au fost trimise către laboratoarele de referinţă din Glasgow şi Londra, dar şi către laboratorul Centrului pentru prevenirea şi controlul bolilor (CDC, Atlanta, SUA). Supoziţia iniţială (infirmată prin testele de laborator) a fost cea de contaminare a drogurilor cu spori de Bacillus anthracis. Testele efectuate pe probele recoltate au evidenţiat contaminarea masivă cu spori de Clostridium novyi, tip A, a drogurilor injectabile recuperate (probabil datorită condiţiilor precare de obţinere, stocare şi transport ale acestora). Autorităţile au emis ipoteza că o cantitate mult mai mare de droguri se poate afla în circulaţie şi această situaţie ar putea fi considerată ca o adevărată „bombă biologică” pentru populaţia consumatoare de droguri. Microorganismul cel mai frecvent izolat din probele recoltate de la pacienţi (în condiţii de anaerobioză şi transportate corespunzător, la adăpost de oxigen) a fost Clostridium novyi.Din probele recoltate s-au izolat, de asemenea, Clostridium perfringens şi Clostridium saccharolyticum. În cazul în care autorităţile de sănătate publică nu s-ar fi gândit, în cazul diagnosticului diferenţial, şi la o ipoteză în care germenii anaerobi să fie implicaţi, izbucnirea epidemică ar fi putut să rămână fără diagnostic etiologic. Pe lângă prezenţa sporilor, demonstrată prin tehnici de laborator, a fost utilizată testarea efectului citopatic asupra culturilor monostrat de linii celulare Vero şi astfel s-a demonstrat prezenţa alfa-toxinei produsă de C. novyi,tip A, în probele recoltate. Alfa-toxina este eliberată la nivelul procesului infecţios (locul injectării drogului, unde prin realizarea condiţiilor de anaerobioză, sporii trec în formă vegetativă se multiplică şi bacteriile sintetizează exotoxina), în ţesutul subcutanat, conduce la instalarea unui răspuns inflamator local intens, cu edem marcat. Alfa-toxina are o contribuţie patogenică şi în situaţiile cu evoluţie spre insuficienţă multi-organică, asociat cu hipotensiune arterială, reacţie leucemoidă şi fasciită necrozantă. Condiţiile de anaerobioză sunt atinse deoarece soluţia de 23

heroină tamponată cu acid citric produce necroză tisulară la locul injectării (în cazul în care soluţia ar fi fost injectată intravenos, sporii ar fi fost distruşi de către mecanismele de apărare ale gazdei, la nivel sanguin). În cazul în care ipoteza unei afectări datorită sporilor proveniţi de la bacterii anaerobe ar fi fost emisă de la început şi dacă nu s-ar fi instituit (la o parte dintre cazuri) antibioterapia empirică cu antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltării probelor, procentul de infecţii cu etiologie confirmată ar fi putut să fie mai mare. S-au emis mai multe comunicate de presă pentru a pune în temă populaţia şi pentru a alerta comunitatea medicală şi pe eventualii consumatori de droguri. 2. 4. 2. Capsula bacteriană Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, răspunzător pentru izbucniri epidemice de meningită, cu urmări îngrijorătoare (decese, sechele). Infecţiile meningococice rămân încă o problemă de sănătate la nivel mondial iar înţelegerea mecanismelor prin care Neisseria meningitidis eludează mecanismele de apărare ale gazdei este foarte importantă. Meningococul determină boala prin invazivitate şi multiplicare, aderând la celulele umane şi invadându-le însă după această etapă procesul rămâne, în mare parte, un mister. Unul din atributele de patogenitate ale meningococului este reprezentat de capsula polizaharidică, cu un rol clar demonstrat în supravieţuirea bacteriană în fluidele extracelulare. Studii recente au arătat că aceeaşi structură contribuie şi la supravieţuirea intracelulară. Sistemul complement este unul dintre factorii de apărare foarte importanţi în protecţia subiecţilor faţă de infecţia cu N. meningitidis; totuşi acest microorganism s-a adaptat şi a dezvoltat mecanisme proprii de protecţie anti-complement. Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum şi cele care „imită” structurile proprii (self) ale gazdei sau leagă molecule proprii organismului salvează germenul de la liză celulară şi fagocitoză. Se pare că Neisseria meningitidis îşi foloseşte eficient proprietăţile, atât extra- cât şi intracelular. Prin inocularea de tulpini capsulate şi necapsulate marcate izotopic în culturi celulare de celule fagocitare şi nefagocitare umane s-a încercat monitorizarea invazivităţii şi multiplicării intracelulare. Rezultatele au fost surprinzătoare deoarece capsula, care diminuează capacitatea de aderare la membrana celulară şi de intrare a germenului în celulă, este esenţială pentru supravieţuirea intracelulară a microorganismului. Un posibil mecanism prin care se produce această supravieţuire ar fi cel al rezistenţei capsulare la peptidele cationice antimicrobiene (CAMPs – cationic antimicrobial peptides), componente ale sistemului imun înnăscut. Degradarea intracelulară a bacteriilor internalizate poate fi legată de o multitudine de mecanisme, printre care acţiunea pH-ului, stresul oxidativ sau acţiunea enzimelor litice şi a peptidelor antimicrobiene. Teoretic prezenţa capsulei ar putea interfera, direct sau indirect, cu oricare din aceste mecanisme. În particular s-a evidenţiat deja medierea rezistenţei pentru Klebsiella pneumoniae la CAMPs de către capsula sa, polizaharidică. În ceea ce priveşte capsula N. meningitidis, studii preliminare au arătat deja că tulpinile necapsulate sunt mai susceptibile acţiunii defensinelor, protegrinelor şi polimixinei B, asemănătoare CAMPs. Polimixina B, un peptid ciclic de origine microbiană, a fost folosită ca model al CAMPs datorită proprietăţilor ei de permeabilizare a membranei externe a germenilor Gram-negativi. Experimental s-a măsurat rata de supravieţuire a meningococilor timp de 45 de minute în diferite concentraţii de polimixină B. Rezultatele au confirmat că absenţa capsulei scade viabilitatea microbiană în prezenţa polimixinei B. Acest model pe culturi celulare susţine ipoteza conform căreia capsula N. meningitidis reprezintă un mecanism major pentru supravieţuirea intracelulară a bacteriei din cursul infecţiei. 2. 4. 3. Importanţa examenului microscopic 24

Examenul bacteriologic direct are o mare importanţă pentru diagnosticul de etapă, dar şi pentru cel definitiv; poate schimba radical indicaţia de tratament precum şi prognosticul pentru respectivul pacient. În cadrul examenului bacteriologic direct, examenul preparatului proaspăt între lamă şi lamelă a rămas „ruda săracă”, fiind mai rar folosit (prea rar); informaţiile obţinute pot fi însă foarte utile. La un pacient seropozitiv stadiul C3, cu diaree trenantă şi severă, examenul citobacteriologic a arătat prezenţa unor formaţiuni rotund ovalare interpretate ca levuri, probabil candidozice. În ciuda tratamentului antifungic pentru levuri diareea a rămas la fel de severă şi starea gravă. La o nouă examinare a materiilor fecale, de data aceasta şi a preparatului proaspăt între lamă şi lamelă, colorat cu albastru de metil, s-au văzut (datorită colorantului) aceleaşi formaţiuni rotunde dar cu capsulă, ridicându-se suspiciunea unei infecţii cu criptococ, care ulterior sau identificat după culturi şi repicări repetate pe medii specifice. Dar ce este de subliniat este că schimbarea imediată a tratamentului a condus la remiterea simptomatologiei şi îmbunătăţirea stării pacientului.

2. 5. Evaluarea cunoştinţelor 1. Alegeţi afirmaţia falsă: a. Bacilii au formă rotundă şi se adună în grămezi b. Haemophilus influenzae este un cocobacil c. Dimensiunile bacteriene sunt de ordinul micrometrilor şi din acest motiv bacteriile se pot examina la microscopul optic d. Aspectul “in diplo” este caracteristic pneumococilor e. Există bacterii cu dimensiuni foarte mici (ex.: Chlamydia spp. şi Mycoplasma spp.) care nu pot fi vizualizate la microscopul optic 2. Despre componentele structurale ale celulei bacteriene este adevărată următoarea afirmaţie: a. Peretele bacteriilor Gram-negative nu conţine mureină b. Membrana celulară este o structură facultativă c. Nucleul bacterian este învelit de membrană nucleară şi conţine numeroşi nucleoli d. Capsula bacteriană reprezintă un factor de virulenţă şi favorizează invazivitatea e. Bacteriile cu flageli sunt imobile 3. Peretele bacterian: a. Este o componentă constantă a bacteriilor din toate genurile b. Este degradat cu uşurinţă sub acţiunea lizozimului (muramidazei) c. Are aceeaşi grosime atât la bacteriile Gram-negative, cât şi la cele Gram-pozitive d. Nu este sediu de acţiune pentru nici un tip de antibiotic e. Conţine antigene capsulare 4. Care dintre enunţuri este corect în ceea ce priveşte structurile facultative bacteriene: a. Sporii bacterieni au rol în replicarea ADN-ului b. Mobilitatea bacteriilor este dată de fimbrii c. Sporul este o formă de rezistenţă bacteriană 25

d. Capsula este ubicuitară la toate genurile bacteriene e. O bacterie nu poate avea mai mult de un singur flagel 5. Sporii bacterieni: a. Nu se distrug prin autoclavare b. Sunt forme de rezistenţă ale bacteriilor şi se pot transforma în forme vegetative c. Nu se vizualizează microscopic d. Pentru orice tip bacterian, sunt localizaţi în acelaşi loc şi anume central e. Sunt caracteristici tuturor speciilor bacteriene

3. Fiziologia bacteriană 3. 1. Constituţia chimică a bacteriilor 3. 1. 1. Apa: procent, rol Apa reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă (mediu de dispersie) şi apă legată fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puţină apă, în special apă legată. Bacteriile sunt fiinţe „acvatice” prin excelenţă. Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în special la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol în plutirea acestora. Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că apa reprezintă un mediu de dispersie, este reactiv în reacţiile metabolice, reprezintă etapa finală a unor reacţii oxidative etc. Prin deshidratare (desicare) este posibilă prezervarea culturilor bacteriene timp îndelungat. O metodă des utilizată datorită eficienţei sale este liofilizarea (criodesicarea). Studiile ştiinţifice au arătat că, în general, germenii Gram-negativi rezistă mai puţin timp liofilizării decât cei Gram-pozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subţire de peptidoglican. (1) 3. 1. 2. Substanţele minerale Substanţele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei şi variază în funcţie de specie, vârsta culturii, compoziţia chimică a mediului. Unele elemente intră în compoziţia diferitelor structuri (exemplu sulful intră în structura aminoacizilor, fosforul în structura fosfolipidelor etc). Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti următoarele: · favorizează schimburile cu mediul, · participă la reglarea presiunii osmotice, · pot stimula creşterea şi funcţia bacteriei (de exemplu fierul în cazul bacilului difteric, care condiţionează şi producerea de toxine), · activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului şi a potenţialului de oxidoreducere. Aşa cum am menţionat anterior, la nivel ribozomal se găsesc Mg++ şi K+. 3. 1. 3. Glucidele

26

În structura bacteriană se pot găsi glucide simple cu rol în metabolismul intermediar glucidic, precum şi glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urmă au o serie de roluri, spre ex. participă la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor bacterii etc. Există teste biochimice în care se urmăreşte utilizarea sau imposibilitatea utilizării unui anumit zahar de către o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (în special în cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testările biochimice sunt de mare utilitate şi în studiul fungilor (auxanogramă, zimogramă). 3. 1. 4. Proteinele Există proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic) şi proteine complexe, cum ar fi: · mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din structuri de tip capsular), · cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi), · nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici). Este de remarcat prezenţa în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic, precum şi a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare biochimică a bacteriilor faţă de acţiunea nocivă a enzimelor proteolitice). 3. 1. 5. Lipidele Reprezintă mai puţin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor şi variază cantitativ în funcţie de specie, vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un semn de degenerescenţă) şi compoziţia mediului. La mycobacterii, sunt în cantitate mai mare (circa 20-40%), în special la nivel parietal şi determină o serie de proprietăţi specifice, inclusiv afinitatea tinctorială. Lipidele se pot găsi libere în vacuole, combinate sau făcând parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membrană, mezozomi). Dintre lipidele bacteriene putem aminti: · acizii graşi speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii), · cerurile (acizi graşi plus alcooli monovalenţi superiori), care se găsesc în cantitate mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. în peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre acestea, ceara D pare a fi implicată în inducerea hipersensibilităţii întârziate (de tip IV). · fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum (agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gram-negative, cu activitate toxică. 3. 1. 6. Pigmenţii Pigmentogeneza este caracteristică bacteriilor cromogene şi este dependentă de condiţiile de cultivare. Producerea de pigmenţi poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. în cazul tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sau în cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie să reţinem încă de la început faptul că în cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ şi nu vom clasifica drept „patogenă” o tulpină de stafilococ în funcţie de „culoarea” coloniei. Stafilococii sunt condiţionat patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat în mod obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la pacienţi. După localizarea pigmentului, bacteriile pot fi: · cromofore (pigmentul este legat în citoplasmă);

27

paracromofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul mucos, de exemplu la S. aureus sau laStaphylococcus epidermidis); · cromopare (pigmentul este difuzibil în mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa). În afară de faptul că datorită producerii de pigmenţi (albastru, galben-verde, maro etc. în cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb în cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de laborator se poate orienta în alegerea testelor de identificare într-un anumit context clinic şi microbiologic. Putem aminti și faptul că pigmenţii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecţie faţă de radiaţiile UV (pigmenţi carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborată de P. aeruginosa faţă de B. anthracis) şi rol enzimatic. 3. 1. 7. Enzimele În cazul bacteriilor se poate aprecia că metabolismul este foarte intens. Capacitatea de a elabora anumite enzime este determinată genetic (există peste 2000 de determinanţi genetici diferiţi), precum şi prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic în funcţie de necesităţi. După locul de acţiune, enzimele bacteriene se pot împărţi în: · enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele; · enzime ectocelulare (în membrana citoplasmatică, reglând permeabilitatea selectivă), de exemplu permeazele; · enzime intracelulare. În raport cu reacţia catalizată, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze, liaze, izomeraze etc. După modul de apariţie, enzimele pot fi: · constitutive (există totdeauna în celulă, indiferent de natura mediului); · inductibile (sunt sintetizate de către bacterie numai ca răspuns la anumiţi compuşi apăruţi în mediu). Studierea comportamentului enzimatic este foarte utilă în taxonomie. Fiecare unitate taxonomică bacteriană (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatică propriu; studierea acestuia poate avea o deosebită importanţă în identificarea bacteriilor. 3. 1. 8. Substanţe cu acţiune antibiotică: · plasmidul „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect asupra altor bacterii receptive înrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli); · unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B. licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizează gramicidina, iar B. polymyxa sintetizează polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astăzi, din alte genuri, vezi capitolul nr. 48). 3. 1. 9. Vitaminele bacteriene Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretată de exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizată de E. coli, riboflavina sintetizată de B. subtilis, vitaminele B2 şi B12 sintetizate de B. megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B şi K, care pot fi sintetizate sub influenţa florei bacteriene intestinale umane. 3. 1. 10. Factorii de creştere Factorii de creştere sunt metaboliţii esenţiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza substanţelor care se găsesc în mediul extern. Factorii de creştere trebuie neapărat incluşi în mediul de cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul respectiv, numit „microorganism pretenţios” (ex. factorii X şi V trebuie incluşi în mediul de izolare pentru Haemophilus influenzae). ·

28

Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptându-se la viaţa parazitară, devin dependente de o serie de astfel de factori de creştere (unele sunt atât de dependente încât nu pot fi cultivate „in vitro”, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae).

3. 2. Metabolismul bacterian 3. 2. 1. Nutriţia bacteriană Nutriţia bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale convertibile în energie şi în diferite componente celulare. Nutrienţii sunt substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenaţi în reacţiile metabolice care asigură creşterea şi multiplicarea celulară. În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în: · bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii) şi · bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic şi trăiesc la întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante). În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază: · bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie anorganică şi · bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici. Nutriţia principalelor bacterii studiate Majoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferenţiază în funcţie de tipul respirator. Există şi bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia şi Chlamydia, care depind nutriţional de o gazdă vie). Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma: proteine, acizi nucleici, polizaharide şi lipide. Aceste substanţe se obţin fie din mediul de cultură, fie sunt sintetizate de către celulele în creştere (sunt necesare diferite coenzime şi legături macroergice de tipul celor din ATP). Substanţele necesare şi coenzimele implicate se pot obţine dintr-un număr relativ redus de precursori metabolici. Dacă o celulă bacteriană primeşte substanţele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este determinată fie după un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidraţi şi lipide. După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor şi activitatea căilor metabolice sunt foarte bine reglate (există o permanentă balanţă a biosintezei). Microorganismele reprezintă un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de căi metabolice; de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus simplu, benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi reglată de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru căile metabolice este acela al organizării unui număr relativ mic de tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine specifică. Multe dintre căile biosintetice se pot deduce având în vedere structura chimică de la care se porneşte, produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi intermediari. Principiul determinant al reglării metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate” în joc numai când activitatea lor este necesară. Activitatea unei enzime poate fi modificată variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acţionează. 29

În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori specifici (metaboliţi care modulează activitatea enzimatică). De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este (poate fi) inhibată de produsul final al căii respective. O astfel de inhibiţie nu poate depinde de competiţia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiţia depinde de faptul că enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzimă are atât un situs catalitic de legare cu substratul, cât şi unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul său duce la o modificare conformaţională a enzimei, astfel încât afinitatea situsului catalitic scade (inhibiţie allosterică) sau creşte (activare allosterică). Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună, rezultând o deplasare liniară. La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se dau peste cap”). Acest comportament face posibilă chemotaxia: o celulă care se îndepărtează de sursa atractantului chimic îşi schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent în comparaţie cu una care se apropie de atractant şi ca o însumare, bacteria se va deplasa înspre atractant. Spre exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui aminoacid este sesizată de receptori specifici localizaţi pe membrana celulară (de multe ori acelaşi receptor participă şi la transportul membranar al acelei substanţe). Celula bacteriană este prea mică pentru a fi capabilă să detecteze existenţa unui gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat experimental că detectează gradienţii în timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe scade în timp ce bacteria se îndepărtează de sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie de sursă). Anumiţi compuşi acţionează ca respingători (R), iar alţii ca atractanţi (A). Un mecanism care ar explica răspunsul celulei faţă de A/R ar implica metilarea şi respectiv demetilarea unei proteine specifice din membrană, care depinde de GMPc. Atractanţii produc o inhibiţie tranzitorie a demetilării acestei proteine. Respingătorii stimulează demetilarea. Mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca răspuns la o modificare de mediu poartă numele de transducţie senzorială. Aceasta pare să fie responsabilă de: · chemotaxie; · aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O2); · fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină); · deplasarea spre acceptorul de electroni etc. 3. 2. 2. Respiraţia bacteriană Respiraţia reprezintă suma reacţiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de energie. Mecanismul de bază este reprezentat de oxido-reducerea biologică (pierderea ionilor de hidrogen sau a electronilor) de către o substanţă chimică (donor) şi transportul lor pe molecula unei alte substanţe numită acceptor (prima se oxidează, a doua se reduce: AH2 + B A + BH2). În funcţie de natura acceptorului final, respiraţia poate fi: aerobă sau anaerobă. Respiraţia aerobă (oxibiotică) În respiraţia aerobă, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraţia aerobă necesită existenţa membranei celulare. Electronii sunt pasaţi de la un reducător la un oxidant prin membrană cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reducător frecvent utilizat este NADPH-ul. Enzimele catenei respiratorii sunt: - nicotinice (cu coenzima NAD şi NADP); 30

- flavinice (cu gruparea proteică FMN sau FAD); - ferice (grupul prostetic conţine Fe sub formă de derivaţi ai protohemului, spre exemplu citocromi, citocromoxidază, peroxidază etc).

NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid). Pentru sinteza ATP-ului se utilizează fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată cu partea terminală a lanţului respirator. Respiraţia anaerobă (anoxibiotică) În respiraţia anaerobă acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substanţă anorganică diferită de oxigen sau de orice substanţă organică (fermentaţia); fosforilarea se face la nivelul substratului. Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezultă prin fermentaţia zaharidelor şi reprezintă un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere taxonomic şi biochimic. Etapele fermentaţiei sunt mai reduse, câştigul energetic fiind mai mic. De exemplu în cazul genului Clostridium, prin fermentaţie acetică se obţine 1 mol ATP, iar prin fermentaţie butirică se obţin 0,5 moli ATP. Fermentaţia butirică a fost descoperită de Louis Pasteur în anul 1861 (produsă deVibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Rolul biologic al fermentaţiei este reprezentat de producerea energiei şi nu de obţinerea unor produşi finali. Sinteza ATP-ului Sinteza ATP-ului se realizează prin cuplarea reacţiilor de oxidoreducere cu reacţiile de fosforilare. În respiraţia aerobă se utilizează mai ales fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată cu partea terminală a lanţului respirator. În respiraţia anaerobă fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii şi acceptorii fiind metaboliţi anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaţia). Energetica respiraţiei bacteriene Prin fosforilarea oxidativă se pot obţine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoză. Prin fosforilarea substratului se pot obţine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoză. Energia este folosită apoi în procese metabolice de asimilaţie. Tipul respirator În raport cu utilizarea proceselor pentru obţinerea energiei şi de relaţia cu oxigenul din mediu, bacteriile se pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale (vezi și Tabelul nr. 1): - strict aerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă numai în prezenţa unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic. Aceste bacterii posedă catalază, peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula bacteriană; vezi Figura nr. 1) şi utilizează numai procese de respiraţie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta în medii lipsite de oxigen, dacă în mediu sunt prezenţi nitratul sau nitritul; - strict anaerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai în absenţa O2. Nu pot supravieţui în prezenţa O2, care nefiind redus are o acţiune bactericidă. Nu au catalază, peroxidază (care acţionează asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc pentru obţinerea energiei numai procese de fermentaţie. Pentru cultivarea lor este necesară utilizarea unui mediu cu potenţial redox foarte scăzut. 31

- aerob facultativ anaerob, atunci când bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvoltă mai bine în mediile cu oxigen, prin procese de respiraţie, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, în funcţie de potenţialul redox. Majoritatea au catalază sau citocromoxidază, dar nu au peroxidaze flavoproteice. În acest tip se încadrează majoritatea bacteriilor studiate. - anaerob microaerofil, atunci când bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează mici cantităţi de O2.

3. 3. Căi metabolice Metabolismul glucidic Polizaharidele utilizabile de către bacterii nu pot pătrunde ca atare în celulă. Ele sunt degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindează unităţile monozaharidice din extremităţile lanţurilor polizaharidice) şi endohidrolaze (care hidrolizează unităţile interne). Polizaharidele existente în celulă ca materiale de rezervă au o degradare diferită, prin fosforoliză, rezultând hexozo-monofosfaţi. Principalele căi metabolice (de catabolism) sunt: a). calea hexozo-difosfaţilor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care în final pentru 1 mol de glucoză se obţin 1 mol de acid piruvic şi 2 moli ATP; b). calea pentozo-monofosfaţilor; c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas). Metabolismul lipidic Multe bacterii degradează trigliceridele prin lipaze exocelulare în glicerol şi acizi graşi liberi. Activitatea lipazică poate fi cercetată pe medii care conţin glicerol-tributirat. Pentru degradarea lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posedă enzime specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana hematiilor, fosfolipaza C conferă bacteriilor proprietatea de hemoliză. Acizii graşi sunt degradaţi preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii graşi reprezintă surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic generează 129 moli de ATP). Bacteriile saprofite au proprietăţi lipolitice intense, participând la biodegradarea grăsimilor şi uleiurilor (mai ales în mediul marin). Metabolismul proteic În lumea bacteriană mai răspândiţi sunt D-aminoacizii. Aceştia pot forma diferite polipeptide cu activitate antibiotică (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu capsula bacilului anthraxului. Participă de asemenea şi la formarea peretelui celular (de exemplu D-Ala). Căile de degradare sunt reprezentate mai ales de: a). transaminarea şi dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au căi proprii de catabolism, utile în identificare); b). decarboxilarea aminoacizilor.

3. 4. Căi biosintetice particulare 3. 4. 1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat etc. se realizează utilizând inclusiv structuri chimice care în lumea vie sunt utilizate numai de către bacterii, de exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic. 3. 4. 2. Sinteza peptidoglicanului 32

Sinteza peptidoglicanului se desfăşoară pe parcursul mai multor etape (vezi Figura nr. 3). Începe prin sinteza în citoplasmă a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Această structură se ataşează de bactoprenol (un lipid din membrana celulară), după care urmează un lanţ de reacţii biochimice. Legarea încrucişată finală se realizează printr-o reacţie de transpeptidare în care terminaţiile amino libere ale pentaglicinei înlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de la peptidul învecinat. Reacţia este catalizată de transpeptidaze, un set de enzime numite şi PBPs (penicillin binding proteins) care au atât activitate de transpeptidaze şi carboxipeptidaze, dar controlează şi gradul de legare a peptidoglicanului (aspect foarte important în diviziunea celulară). La nivelul lor se pot lega penicilinele şi alte medicamente beta-lactamice (Figura nr. 4). Această cale de biosinteză are o importanţă particulară în medicină, oferind şi baza acţiunii selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracină, vancomicină, cicloserină etc). Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele organismului. În interiorul lor presiunea osmotică este foarte mare şi viabilitatea lor depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice compus care inhibă o etapă în biosinteza peptidoglicanului la o bacterie în creştere va putea produce liza bacteriană (efect bactericid). 3. 4. 3. Sinteza LPZ Sinteza este asemănătoare cu cea a peptidoglicanului; în ambele situaţii, o serie de subunităţi se asamblează pe un lipid transportor la nivelul membranei şi apoi sunt transferate în „fabrica” polimerului în creştere pentru realizarea peretelui celular. Toate componentele LPZ sunt sintetizate şi ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice. 3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare Capsula se sintetizează enzimatic din subunităţi activate. În sinteza capsulei extracelulare (poate avea structură polizaharidică sau peptidică) nu sunt implicate lipide transportoare de provenienţă membranară. Prezenţa capsulei este adesea determinată de condiţiile de mediu. De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroză şi acest lucru se va realiza doar dacă există sucroză în mediu. 3. 4. 5. Sinteza substanţelor de rezervă Când nutrienţii sunt în exces, bacteria poate converti o parte din ei în granule de rezervă (vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutină, care diferă de la o bacterie la alta.

3. 5. Cultivarea bacteriilor 3. 5. 1. Definiţii utile Populaţia reprezintă o multitudine de indivizi ai unei specii care convieţuiesc într-un anumit biotop. Clona este populaţia care rezultă dintr-o singură celulă prin înmulţire vegetativă (diviziune binară). Tulpina reprezintă populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure izolări în cultură pură. Temperatura de dezvoltare În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: - mezofile, cu temperatura optimă de 30-37ºC; - psichrofile, cu temperatura optimă în jur de 20ºC (unele acceptând temperaturi apropiate de 0ºC; Listeria spp. poate supravieţui sau se poate chiar şi multiplica la temperatura din frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numărul mare de acizi graşi nesaturaţi conţinuţi de membrana plasmatică. Gradul de nesaturare al unui acid gras se corelează cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziţie termică 33

(temperatura la care se topeşte sau se solidifică lipidul). Acizii graşi nesaturaţi rămân în fază lichidă la temperaturi joase, dar sunt denaturaţi la temperaturi moderate. Fie că acizii graşi din membrană se află în fază lichidă sau solidă, ei afectează fluiditatea membranei, care afectează în mod direct capacitatea de a funcţiona. - termofile, cu temperatura optimă de 50-60ºC (unele putând să se multiplice şi la temperaturi apropiate de 95ºC, ca de ex.Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate să reziste la temperaturi de peste 60°C printr-o varietate de modalități. Acizii graşi din membrana bacteriilor termofile sunt acizi grași saturaţi, permiţând membranelor să rămână stabile şi funcţionale la temperaturi ridicate. - extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare şi o temperatură de dezvoltare maximă de 115°C. (2) Nu sunt patogene. Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile. 3. 5. 2. Noţiuni de creştere şi multiplicare bacteriană Creşterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creşterea volumului celular raportată la creşterea suprafeţei este mai mare, în cursul creşterii se ajunge la un punct critic. Multiplicarea celulară este o consecinţă a creşterii. Se restabileşte raportul optim dintre volumul şi suprafaţa celulei. Multiplicarea majorităţii bacteriilor se face prin diviziune simplă (binară). Sporii nu reprezintă forme de multiplicare (aşa cum se întâmplă în cazul fungilor sau paraziţilor). 3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior să îi putem studia diferitele caractere în vederea identificării. Metodele de cultivare a bacteriilor urmăresc mai multe obiective: · obţinerea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile propuse, · prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin şi · izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în culturi monomicrobiene denumite „culturi pure”. Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii. Termenul „însămânţare” defineşte operaţia de introducere a unei cantitaţi de germeni într-un mediu de cultură artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă embrionate şi mai ales animale de experienţă folosim termenul „inoculare”. Cultivarea se realizează prin însămânţarea bacteriilor pe medii de cultură. Mediile solide sau lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene se numesc medii de cultură. Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă numele de cultură bacteriană. Mediile de cultură Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii şi pe medii artificiale. Există anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate decât pe gazde vii, aşa cum se întâmplă în cazul virusurilor, respectiv: animale de laborator, ouă de găină embrionate sau culturi de celule. Majoritatea bacteriilor, fungii şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii artificiale. Mediile de cultură artificiale trebuie să fie nutritive (să conţină factorii de creştere necesari), să fie sterile, să aibă un anumit pH (de obicei între 7,2-7,6), să aibă o anumită presiune osmotică, să aibă umiditatea favorabilă multiplicării germenilor etc. 34

Factorii de creştere reprezintă substanţe esenţiale pe care microorganismele nu sunt capabile să le sintetizeze din nutrienţii de care pot să dispună. Ei sunt necesari în cantitaţi mici. Îndeplinesc anumite roluri în biosinteză. Factorii de creştere pot fi grupați în: 1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN şi ARN); 2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor; 3. Vitamine: necesare în calitate de coenzime şi grupări funcţionale pentru enzime. Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesită factori de creştere. Aceste bacterii pot sintetiza purinele esenţiale, pirimidinele, aminoacizii şi vitaminele pornind de la o sursă de carbon. Alte bacterii necesită purine, pirimidine, vitamine şi anumiţi aminoacizi pentru a creşte. Aceşti compuşi trebuie adăugaţi în prealabil în mediile de cultură. Factorii de creştere nu sunt metabolizaţi direct ci sunt asimilaţi de către bacterii pentru a-și îndeplini rolul în metabolism. Tulpinile mutante care necesită anumiţi factori de creştere ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numiteauxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E. coli care necesită triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-triptofan şi va fi desemnată E. coli trp- (2). Clasificarea mediilor de cultură artificiale Aceste medii se pot clasifica după starea de agregare, după natura ingredientelor, după complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), după scopul urmărit (de transport, de izolare, de identificare etc.), după conţinutul în apă, etc. Există medii de cultură simple (agar, apă peptonată, bulion simplu etc) şi medii de cultură mai complexe (agar-sânge, bulion glucozat, agar Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2) Medii speciale Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura nr. 5). Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea altor bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă) (Figura nr. 6) Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca mediu selectiv şi ca mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de îmbogăţire utilizate pentru izolarea Salmonella typhi). Mediul diferenţial conţine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu metabolizat, determinând modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de bromtimol lactozat (AABTL) care diferenţiază bacteriile lactoză-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactozănegative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU (mobilitate indol uree). (Figurile nr. 7-10). Colonia izolată Pe medii solide, germenii însămânţaţi în suprafaţă produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clonă bacteriană. Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin dispersie (cu ansa bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei porţiuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizează ansa; se verifică temperatura, prin atingerea mediului într-o zonă neînsămânţată, cât mai periferic; cu ansa sterilă se trasează a doua latură a poligonului; se 35

resterizează ansa şi se repetă procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge prima latură. În acest mod, pe ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după trecerea timpului necesar multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1) Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia unei culturi în circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare (asigurată în termostat) pentru că timpul de generaţie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaţie de 12-27 ore şi în acest caz cultura devine pozitivă în 2-8 săptămâni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care s-au adăugat ingrediente cu activitate reducătoare sau în anaerostat); dorim să subliniem că dacă transportul nu se face în condiţii de anaerobioză, nu vom mai obţine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate (Figura nr. 11). Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi Culturile bacteriene sunt discontinue când se realizează în volum limitat de mediu, care nu este reînnoit şi continueatunci când mediul de cultură este continuu reînnoit. O populaţie bacteriană poate fi menţinută indefinit în faza de multiplicare exponenţială dacă se adaugă continuu mediu de cultură proaspăt, cu omogenizare prin curent de aer steril şi evacuare a unei cantităţi corespunzătoare de cultură (de exemplu în dispozitivul numit chemostat sau turbidostat). Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienţi, aflat în concentraţie mai redusă decât ceilalţi, funcţionează ca factor limitant al creşterii. Mediul de cultură proaspăt este admis în vasul de cultură în ritmul în care este consumat factorul limitant, iar cultura este evacuată cu acelaşi ritm. Cultura este menţinută astfel la o valoare constantă şi submaximală ratei de creştere, reglată prin factorul limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obţinerea de tulpini mutante pentru că după ce rata de multiplicare a fost determinată şansa de selectare a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12). În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue. Timpul de generaţie Populaţia care rezultă prin diviziunea unei bacterii creşte în progresie geometrică cu raţia 2. Timpul necesar pentru dublarea populaţiei se numeşte timp de dublare sau timp de generaţie. Timpul de generaţie în faza exponenţială şi în condiţii optime de cultivare este determinat genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca şi pentru majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaţie poate avea o valoare între 12-27 ore. Fazele dezvoltării unei culturi bacteriene Teoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial. Dinamica reală a populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie caracterizată printr-o curbă la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmică; faza staţionară şi faza de declin (Figura nr. 13). Faza de lag Numărul bacteriilor însămânţate rămâne staţionar sau scade; germenii se adaptează la condiţiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, îşi consumă până la dispariţie incluziile, cresc mult în dimensiuni, sintetizează enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag durează aproximativ 2 ore. Această fază este aparent dependentă de o varietate de factori incluzând dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-şi reveni din şocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor esenţiale sau a factorilor de diviziune şi timpul necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent în mediu. (2) 36

Faza de multiplicare logaritmică (exponenţială) Celulele bacteriene prezintă caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt însă ceva mai mari), citoplasma este intens bazofilă şi omogenă, lipsită de incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la antibiotice. Această fază este adecvată pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor în vederea preparării de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenţială durează aproximativ 2-3 ore. Faza staţionară Multiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor care sunt distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de creştere devine nulă. Germenii au morfologia caracteristică speciei; în această fază realizăm identificarea germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene începe formarea sporilor. Faza staţionară durează aproximativ 23 zile. Faza de declin Substratul nutritiv sărăceşte, apar metaboliţi toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc şi enzime autolitice, rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxi butiric sau glicogenul) se consumă, pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. În acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare şi se exprimă o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durată limitată de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogeneză devine foarte intens. Aspectul culturilor pe medii solide Condiţiile de cultivare şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea bacteriilor. Aspectul coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferenţieri definitive de specie (dar au utilitate în contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene şi în contextul general al diagnosticului de laborator, care la rândul său trebuie să aibă loc într-un context în care punem în balanţă şi alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea între medicii de diferite specialităţi este esenţială). Se examinează: · dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm şi mici, sub 1 mm), · conturul (circular, lobat, zimţat), · relieful (plat, bombat, acuminat, papilat), · suprafaţa (lucioasă, granulară, rugoasă), · culoarea (pigmentate, nepigmentate), · opacitatea (transparente, opace), · consistenţa, · aderenţa la mediu, · prezenţa sau absenţa hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge). (Figura nr. 14) Colonia S (smooth) are suprafaţă bombată şi netedă, margini circulare şi adesea aspect strălucitor. Germenii păstrează structura antigenică şi nu aglutinează spontan cu soluţie salină fiziologică. Germenii capsulaţi îşi păstrează capsula. Virulenţa este conservată. Majoritatea bacteriilor studiate formează colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli etc). (Figura nr. 15) Colonia R (rough) este plată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile sunt crenelate. Structura antigenică nu este caracteristică. Nu păstrează capsula. Virulenţa nu este conservată (excepţii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis,Corynebacterium diphteriae). O bacterie care în mod caracteristic duce la apariţia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), în cazul în care testele de identificare prin reacţii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lamă, folosind anticorpi cunoscuţi) nu se efectuează la timpul potrivit ci mai 37

târziu, prin „înbătrânire” va suferi anumite modificări, coloniile vor deveni de tip R iar identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibilă. (Figura nr. 16) Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, mucoasă. Este dată de exemplu de bacteriile care prezintă capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17) Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot fi şi de tip S şi de tip M. În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obişnuite nu vom putea obţine colonii izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”). (Figura nr. 18) Cultura se întinde pe toată suprafaţa plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de „invazie” poate fi inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri biliare, tiosulfat de sodiu etc. Aspectul culturilor pe medii lichide Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându-l. Bacteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa mediului. Ca un aspect particular, în apa peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta şi formează un „văl” la suprafaţa mediului. În acest caz, pH-ul mediului este 9-9,5. Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen mediul (majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19) Variantele R realizează o tulburare mai puţin omogenă. Pot lăsa mediul limpede, formând flocoane care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos). (Figura nr. 20) Alte informaţii privind mediile de cultură, diferitele tehnici de cultivare, examinarea culturilor bacteriene şi diferitele tehnici de identificare fenotipice utile în diagnosticul microbiologic sunt prezentate în anexa nr. 2.

3. 6. Povestiri adevărate 3.6.1. Penicilina, o mare descoperire ... născută dintr-o mică neglijenţă Era prin anul 1928 când Alexander Fleming, investigând caracteristicile stafilococilor, a descoperit în mod accidental penicilina printr-o „eroare de cultivare”. Fleming era deja cunoscut drept un cercetător de excepţie prin activitatea deja desfăşurată, de ex. datorită descoperirii lizozimului (1922); pe de altă parte, omul de ştiinţă demonstra un grad de neglijenţă în activitatea de laborator. Întors din concediu în septembrie 1928, a găsit câteva dintre plăcile cultivate anterior, contaminate cu un fung din genulPenicillium şi a decis să le arunce într-o soluţie de dezinfectat. Puţin mai târziu, vrând să arate unui coleg câteva dintre rezultatele activităţii sale, a găsit câteva plăci care nu fuseseră încă „dezinfectate” iar de această dată a observat o mică zonă, la contactul dintre cultura fungică şi cultura bacteriană, zonă în care bacteriile nu s-au dezvoltat. Pornind de la această observaţie, Fleming a obţinut un extract din cultura fungică, cu proprietăţi bactericide. Pentru că fungul făcea parte din genul Penicillium a denumit acest extras penicilină. A publicat rezultatele acestei descoperiri în anul 1929. Au mai trecut aproape 16 ani, timp în care s-a reuşit izolarea şi stabilizarea acestui extract, şi în anul 1945 s-a înregistrat producerea antibioticului revoluţionar numit penicilină. Pentru descoperirea sa, Fleming împreună cu biochimistul Ernst Chain şi farmacologul Howard Florey au fost laureaţi cu Premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină în anul 1945. 3.6.2. O fostă rickettsie rescrie vechile clasificări 38

În 2009, o echipă de cercetători i-a oferit Coxiellei burnetii mijloacele de a „evada” din mediul intracelular. Până la această dată, agentul etiologic al febrei Q era unul dintre exemplele stereotipe de bacterie strict parazită, imposibil de cultivat pe medii artificiale. Nu a fost una dintre acele descoperiri rapide, neaşteptate, ci a încununat o muncă minuţioasă de studiere a necesităților metabolice ale acestor bacterii. Cercetările au evoluat progresiv: într-o primă etapă, a fost obţinut un mediu de cultură artificial, care reproducea condiţiile de pH acid din interiorul vacuolelor asemănătoare lizozomilor, în care Coxiella spp. se multiplică în celulele gazdei. Pe acest mediu, denumit ulterior Complex Coxiella Medium (CCM), Coxiella burnetii şi-a putut desfăşura activitatea metabolică timp de aproximativ 24 de ore. Într-o a doua etapă, cercetătorii au reuşit să dovedească faptul că bacteria este microaerofilă. Au adaptat mediul în consecinţă şi l-au numit ACCM (Acidified Citrate Cysteine Medium). Cultivarea Coxiella burnetii pe medii de cultură artificiale ar putea permite studierea factorilor de patogenitate, studierea structurii genetice și poate și realizarea unui model de abordare pentru alţi germeni strict intracelulari. (3-4)

3. 7. Evaluarea cunoştinţelor La următoarele întrebări alegeți un singur răspuns corect: 1. Care dintre următoarele bacterii este cromopară? A. Staphylococcus aureus B. Staphylococcus epidermidis C. Pseudomonas aeruginosa D. Escherichia coli E. Bacillus anthracis 2. Unul dintre următoarele este un microorganism strict aerob: A. Clostridium tetani B. Clostridium botulinum C. Bordetella pertussis D. Escherichia coli E. Staphylococcus aureus 3. Penicilina se leagă la nivelul: A. hidrolazelor B. oxidoreductazelor C. izomerazelor D. permeazelor E. transpeptidazelor 4. Se cultivă numai pe gazde vii: A. Staphylococcus aureus B. Chlamydia trachomatis 39

C. Streptococcus pyogenes D. Streptococcus pneumoniae E. Haemophilus influenzae 5. Pe ce mediu se produce modificarea culorii sau aspectului culturii datorită prezenţei unui substrat? A. Mediu electiv B. Mediu selectiv C. Mediu diferenţial D. Mediu Lőffler E. Mediu de îmbogăţire

4. Acţiunea factorilor fizici, chimici şi biologici asupra bacteriilor 4. 1. Definiţii de bază Septic înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei plăgi). 40

Aseptic înseamnă lipsit de microbi, indiferent dacă microbii sunt patogeni sau nepatogeni. Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menţine „sterilitatea” ţesuturilor, mediilor de cultură, medicamentelor injectabile etc. Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice, netoxice pentru tegument (ex. alcool etilic 70°, tinctură de iod 5%, KMnO40,1%, detergenți cationici etc). Contaminare, este un termen utilizat în instituţiile sanitare (deosebit de contaminarea radioactivă) care se referă, în general, la contactul cu microorganisme condiţionat patogene sau patogene (capabile să producă infecţii sauboli infecțioase ). Decontaminarea reprezintă utilizarea agenţilor fizici / chimici pentru a îndepărta, a inactiva sau a distruge unele sau toate microorganismele condiţionat patogene sau patogene de pe suprafeţe sau obiecte, astfel încât acestea să nu mai poată reprezenta o sursă de infecţie sau de transmitere a infecției, iar obiectele sau suprafeţele să poată fi manipulate şi / sau utilizate în siguranţă. Sanitizarea reprezintă totalitatea măsurilor pentru asigurarea sănătăţii publice. Prezervarea presupune prevenirea multiplicării unor microorganisme în produse farmaceutice, vaccinuri, alimente etc. Curăţarea reprezintă utilizarea agenţilor fizici şi / sau chimici pentru a îndepărta murdăria (materie organică şi anorganică) de pe suprafeţe (inclusiv tegument) sau obiecte, prin procedee mecanice sau manuale, pregătind astfel suprafeţele sau obiectele pentru utilizare în siguranţă sau, pentru trecerea la o altă etapă de decontaminare. Detergentul este un produs sintetic pentru curăţare. Detergenţii pot fi anionici, cationici, amfoterici şi neionici. Nu prezintă acţiune antimicrobiană. Detergentul enzimatic este un produs sintetic pentru curăţare care conţine o enzimă. Echipamentul de protecţie este un echipament special (îmbrăcăminte, mănuşi, ochelari etc) purtat de personalul care manipulează produse dezinfectante şi realizează dezinfecţia. Enzima este o proteină care descompune murdăria într-o formă care poate fi uşor îndepărtată de produsul de curăţare. Are rol de catalizator pentru reacţie, mărind puterea de curăţare a produsului. De exemplu: amilaza acţionează asupra urmelor de amidon; lipaza acţionează asupra urmelor de grăsimi şi uleiuri; proteaza acţionează asupra materiei proteice. Produsul de curăţare este un agent chimic care îndepărtează murdăria (materie organică şi/sau anorganică) de pe suprafeţe sau obiecte, dar nu prezintă activitate antimicrobiană (bactericidă, virucidă, fungicidă sau sporicidă) şi care nu reduce nivelul de contaminare microbiană. Spălarea mâinilor este procedura prin care se elimină murdăria şi se reduce flora tranzitorie prin acţiune mecanică, utilizând apă şi săpun (Figura nr. 1, Film nr. 1). Factori care influenţează eficacitatea metodelor de control: - mărimea populaţiei bacteriene; - timpul de expunere la agentul decontaminant (creşterea timpului de expunere creşte rata distrugerii); - efectul concentraţiei, a temperaturii și a pH-ului (o concentraţie mai mare creşte rata distrugerii); - stabilitatea agentului; - structura microorganismului etc. 41

Dezinfecţia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor) din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor agenţi fizici sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative asupra ţesuturilor gazdei). Împiedică răspândirea bolilor infecţioase. Dezinfecţia igienică a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acţiune directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fără a acţiona asupra florei rezidente. Dezinfecţia chirurgicală a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acţiune directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia şi cu acţiune asupra florei rezidente. Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel scăzut” este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate şi virusurile mari necapsulate. Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel intermediar” este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate şi mycobacteriile. Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel înalt” este un agent chimic care, în condiţii bine definite de timp şi temperatură, distruge microorganismele, are acţiune sporicidă şi reprezintă un potenţial sterilizant chimic (Figura nr. 2). Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu în formă gazoasă), utilizat pentru sterilizarea dispozitivelor medicale „critice”, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un sterilizant chimic distruge toate categoriile şi formele viabile de microorganisme, nivelul de supravieţuire al acestora fiind mai mic sau egal cu 106 (probabilitatea prezenţei unui singur microorganism viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egală sau mai mică cu 1/1.000.000). Termenul de valabilitate reprezintă perioada de timp în care un produs dezinfectant este eficient, din punct de vedere al concentraţiei substanţei active şi eficacităţii antimicrobiene. Timpul de contact (timp de acţiune) reprezintă perioada de timp în care produsul dezinfectant este în contact direct cu suprafaţa sau obiectul care trebuie dezinfectat. Perioada de timp în care produsul antiseptic este în contact direct cu ţesuturile vii. Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafaţă sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie să fie sterile înainte de utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel încât şi metodele de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează: - Metode de sterilizare prin căldură (căldura uscată sau căldura umedă); - Metode de sterilizare prin filtrare; - Metode de sterilizare utilizând radiaţiile, dar şi - Metode chimice de sterilizare. Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul de microbiologie. Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să fie sterilizat, respectiv: spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor curate, necontaminate) urmat de autoclavare, spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor contaminate refolosibile). Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc. trebuie curăţateperfect, de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta. Sticlăria de laborator este colectată în recipiente speciale şi se sterilizează prin autoclavare; pipetele vor fi menţinute în 42

amestec dezinfectant până a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile şi acele (deşi este necesară utilizarea pe scară largă a seringilor şi acelor de unică întrebuinţare) contaminate se vor introduce în baie de amoniac 12% timp de 15-30 minute, se vor peria în soluţie de 1-2% detergent cationic şi se vor spăla cu jet de apă pentru îndepărtarea substanţelor chimice (Figura nr. 3). Instrumentele de unică utilizare sunt, în general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi izolate (aparate de sutură mecanică toracică, abdominală, vasculară etc) sau pot fi furnizate în seturi de instrumente de unică utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se face industrial prin iradiere cu raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de unică utilizare (”disposable”) conferă un plus de siguranță, în pofida unui preţ relativ ridicat. Există o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării, prin indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacităţii sterilizării cu ajutorul radiaţiilor, pot fi utilizaţi spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) (Figura nr. 4).

4. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici 4. 2. 1. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici Cuprins: 4. 2. 1. 1. Influenţa temperaturii ridicate 4. 2. 1. 2. Influenţa temperaturii scazute 4. 2. 1. 3. Filtrarea 4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) 4. 2. 1. 5. Ultrasunetele 4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică 4. 2. 1. 1. Influenţa temperaturii ridicate asupra microorganismelor În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: · mezofile (temperatură optimă 30-37ºC), · psichrofile (temperatură optimă în jur de 20ºC) şi · termofile (temperatură optimă 50-60ºC). Prin acţiunea căldurii procesele chimice şi fizice sunt mult accelerate; distrugerea se produce după atingerea temperaturii de 50-60ºC prin ruperea legăturilor intramoleculare, mai ales a punţilor de hidrogen care menţin proteinele şi alte macromolecule în stare nativă. Ca urmare protoplasma se denaturează. Celulele bogate în apă sunt mult mai sensibile la acţiunea căldurii decât microorganismele care conţin puţină apă sau sunt liofilizate. Apa din compoziţia microorganismelor absoarbe căldura proporţional cu volumul său. Sterilizarea prin căldura are loc în două variante principale: prin căldură uscată și umedă. 43

Sterilizarea prin căldură: a). Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene. Amintim câteva dintre variantele tehnice: a1. Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă („la roşu”) reprezintă introducerea şi menţinerea în flacăra becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care urmează a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau pentru spatulă (Figura nr. 5, Film nr. 2). Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient de sticlă (tub, eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur şi nu reprezintă sterilizare. a2. Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr. 6). Etuva este o cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie (Schema nr. 1). Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă trebuie să atingă 180ºC, pentru o durată de 1 oră sau 160°C pentru o durată de 2 ore. Pot exista și alte variante, de exemplu în funcție de dimensiunea obiectelor de sterilizat. Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan, pulberi inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menţionat faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oţelului) etc. Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vată, bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator. a3. Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă (Figura nr. 7). Există anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. În cazul spitalelor, în România au existat astfel de incineratoare în structura unităţii sanitare respective. Odată cu procesul de aderare la Uniunea Europeană şi respectiv necesitatea aplicării unor reguli impuse pentru toate ţările membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost închise. Modul în care s-a realizat în perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activităţii acestor incineratoare nu a ţinut cont de situaţia reală din ţara noastră. În lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitară trebuie să încheie un contract de prestări servicii cu o firmă de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerării materiale de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experienţă etc. b). Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca mecanism coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor), instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultură, aparate de filtrat etc. b1. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi pentru unităţile sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă realizează · la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC, · la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC şi respectiv · 134ºC la 2 atmosfere. 44

Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un capac prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării (Schema nr. 2). Există mai multe tipuri de autoclave: - autoclave cu perete simplu · verticale · orizontale - autoclave cu manta de aburi · verticale · orizontale. În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de sterilizare de jos în sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru. Pentru punerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul superior (robinetul de aer şi vapori, care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite evacuarea vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă. În momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă fierbinţi aflaţi sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului până când presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un spaţiu în care se află sursa de căldură. În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă de metal perforată (Figura nr. 9). Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa este perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei. În vederea sterilizării se procedează astfel: · verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până la o distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează (recomandabil se va utiliza apă distilată); · aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător; · închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat autoclavul pe care îl avem la dispoziţie; · conectăm sursa de căldură; · deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în cazanul cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori, vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ; · închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori; · presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul manometrului; atunci când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în aşa fel încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30 minute) ; · după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să se răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice; · deschidem lent robinetul de vapori; 45

· deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului; · lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis; · atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele sterilizate. b2. Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă care evită depăşirea unei temperaturi de 100ºC. Substanţele de sterilizat se menţin la 56-100ºC timp de 30-60 minute, 3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care permit germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor. În ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat în prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu se va depăşi în interior temperatura de 100ºC), băi de apă sau băi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc. b3-4. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în anumite situaţii. Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii în conservarea pentru scurtă durată a unor alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65ºC), o pasteurizare medie (15 minute la 65-75ºC) şi o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-90ºC). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii. Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar mecanismul de acţiune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100oC, distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar nu şi sporii bacterieni. Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă. Eficienţa acestei metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%. ^inapoi sus 4. 2. 1. 2. Influenţa temperaturii scăzute asupra microorganismelor Temperaturile joase (în jur de 0-4ºC) au în general un efect bacteriostatic. La temperaturi scăzute, reacţiile biochimice încetinesc, multiplicarea poate fi stopată. Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (menţinând viabilitatea germenilor şi încetinind în acelaşi timp multiplicarea acestora) la o temperatură de circa 4ºC. O serie de culturi pot fi de asemenea menţinute la temperatura frigiderului pentru o durată limitată de timp în vederea prezervării şi posibilităţii de a repeta anumite teste de identificare etc. În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene. a). Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3ºC are efecte bactericide prin formarea de cristale de gheaţă şi prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor; b). Congelarea bruscă la -70ºC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea în masă a apei fără apariţia cristalelor de gheaţă; c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicaţia (deshidratarea în vid). O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi păstrată în fiole închise timp îndelungat (de exemplu vaccinul BCG). ^inapoi sus 4. 2. 1. 3. Filtrarea Microorganismele pot fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru. Trecerea unui lichid printr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul respectiv poartă numele de sterilizare prin filtrare. 46

De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă, azbest impregnat cu caolin, pământ de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din ce în ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloză cu porozităţi între 8 şi 0,025 mm (Figura nr. 11). În vederea filtrării sunt necesare o serie de piese precum: un recipient în care se introduce lichidul care urmează a fi filtrat, un recipient în care se va colecta lichidul sterilizat, o pâlnie care se montează etanş între cele 2 recipiente, o pompă de vid care va aspira lichidul din primul în al doilea recipient, prin membrana filtrantă. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare înainte de începerea filtrării. Există şi alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat filtrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa II şi clasa III), filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12). Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultură (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse în cazul sterilizării prin căldură etc. ^inapoi sus 4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin ruperea legăturilor de hidrogen, oxidarea legăturilor duble etc. Radiaţiile UV sunt utile în sterilizarea suprafeţelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultură, alte manevre aseptice etc) în cazul în care nu există cabinete de siguranţă biologică cu flux laminar dar şi atunci când avem la dispoziţie astfel de cabinete de siguranţă biologică şi dorim să sterilizăm incinta în care am prelucrat spre ex. produse în care există Mycobacterium tuberculosis. Lămpile cu UV sunt numite lămpi germicide. Astfel de lămpi sunt plasate de ex. şi în instituţiile sanitare în care sunt internaţi pacienţi cu tuberculoză (Figura nr. 13). Radiaţiile ionizante se pot utiliza în sterilizări industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unică întrebuinţare etc). ^inapoi sus 4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin acţiune mecanică, mişcare activă a conţinutului celular, formare în mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se mişcă energic şi se izbesc de membrană (fenomenul de cavitaţie) şi creşterea temperaturii la 50-80ºC. Sporii rezistă acestor efecte. ^inapoi sus 4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) în medii hipertone are efecte letale asupra unor bacterii. În medii hipotone are loc acumularea de apă în celula bacteriană; aceasta devine turgescentă şi peretele bacterian cedează.

4. 2. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor chimici Există o serie de substanţe chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene. Alte substanţe chimice (antibioticele şi chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic selectiv. Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană neselectivă, alterândstructuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare. Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase. Dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii. 47

O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aşa cum am menţionat anterior, trebuie să existe o etapă de pregătire a materialelor în vederea sterilizării. Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc, trebuie curăţate perfect, de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta. Substanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifica în funcţie de mecanismul de acţiune, după cum urmează: a). Substanţe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii şi derivaţii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70º, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). b). Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu, KMnO71‰, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2, soluţie 3% în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) şi derivaţii lor (hipocloriţi, cloramine, soluţii iodurate etc. Există și diferite clase de compuşi halogenaţi cu potență mai mare, cum ar fi cei care au în componenţa lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substanța folosită este necesară realizarea concentraţiei corespunzătoare. c). Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), sărurile de argint, compuşi de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], grupările alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc. d). Substanţe care lezează membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizări limitate datorită proprietăţilor caustice şi toxicităţii sale; este etalonul faţă de care se măsoară activitatea antimicrobiană a antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc], detergenţii [anionici (săpunuri, perlan etc), cationici (săruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substanţe care alterează acizii nucleici: coloranţii bazici (violet de genţiană, albastru de metilen, fucsină bazică etc), derivaţii de acridină, de exemplu rivanolul. Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70º, diferiţi derivaţi halogenaţi, hipermanganatul de potasiu 1‰, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substanţe antiseptice. Dorim să menţionăm şi să subliniem că atât în cazul antisepticelor cât şi în cazul dezinfectantelor este important ca substanţa utilizată să aibă concentraţia corespunzătoare, să fie aplicată pentru o durată de timp corespunzătoare, să se afle în termenul de garanţie. Aceeaşi substanţă chimică (de ex. cloramina) poate intra în categoria antisepticelor sau în categoria dezinfectantelor, în funcţie de concentraţie (concentraţia este mai mare în al doilea caz). În continuare vom prezenta pe scurt câteva exemple de substanţe dezinfectante. Dorim să menţionăm faptul că, până în prezent, nu există nici un dezinfectant ideal. Există numeroase substanţe şi numeroşi producători de antiseptice şi dezinfectante. Hipocloriţii: 

soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore),

concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. 2.500 ppm clor activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate); 

au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, sporilor bacterieni, fungilor (100 ppm în o oră), virusurilor (200 ppm în 10 minute); 

efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special proteine), maselor plastice, detergenţilor. 

48

Derivaţii fenolici: din cauza toxicităţii, potenţialului carcinogenetic şi corozivităţii, fenolii nu se folosesc ca atare, ci sub forma derivaţilor fenolici;  

soluţiile fenolice se prepară periodic (după cel mult 24 ore);



concentraţia poate fi diferită în funcţie de scopul urmărit (de obicei este de 2-5%);

au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungilor, unor virusuri (ex. HIV este inactivat de soluţia 0,5%);  

efectul este diminuat pe suprafeţele de cauciuc, lemn sau material plastic. Glutaraldehida:



cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2%, la un pH alcalin;

are efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă (în cazul mycobacteriilor este necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor; 

datorită faptului că nu corodează metalele (aşa cum se întâmplă în cazul substanţelor prezentate mai sus) se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice; 

nu poate fi folosită pentru suprafeţe, datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de expunere; ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de timp în containere menţinute închise. 

Iodoforii: 

sunt substanţe care complexează iodul pe care îl eliberează în soluţii apoase;

au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni, fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu înveliş lipidic);  

sunt inactivaţi de substanţe organice (în special proteice), mase plastice, detergenţi;



pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate. Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O):

exercită activităţi bactericide prin alkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH);  

sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi;

acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt supuse acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc.); 

· fiind o substanţă explozivă, etilenoxidul este utilizat în camere speciale în care se menţine o presiune negativă, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi combinat cu această substanţă în încăperi de oţel speciale; o altă variantă de protecție ar fi combinarea cu hidrocarburi fluorinate. 

indiferent de varianta folosită trebuie respectate toate recomandările producătorului;

există o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (pot să apară efecte carcinogenetice și afectarea sistemului nervos etc., dar e posibilă afectarea întregului organism); sterilizarea este în principiu influenţată de: concentraţia etilenoxidului, temperatură, umiditatea relativă şi timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraţiei va reduce la jumătate timpul necesar pentru sterilizare). 

49

4. 2. 3. Produsele biocide Directiva 98/8/CE defineşte produsele biocide după cum urmează: „Substanţe active şi preparatele conţinând una sau mai multe substanţe active, condiţionate într-o formă în care sunt furnizate utilizatorului, având scopul să distrugă, să împiedice, să facă inofensivă şi să prevină acţiunea, sau să exercite un alt efect de control asupra oricărui organism dăunător, prin mijloace chimice sau biologice” (vezi directiva CE). Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curăţenie, detergenţii sub formă de pulbere sau lichidă şi alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect biocid. Produsele biocide includ: produsele utilizate pentru dezinfecţia suprafeţelor mari inerte, a aerului, a echipamentului medical, a mobilierului, sau pentru dezinfecţia şi curăţarea acestora;  

produsele pentru dezinfecţia / sterilizarea instrumentarului, endoscoapelor, ş.a., prin imersie;

produsele dezinfectante / antiseptice pentru tegumente, săpunurile dezinfectante, săpunurile antiseptice, săpunurile antibacteriene / antimicrobiene, gelurile de curăţare antibacteriene / antimicrobiene, soluţiile de curăţare antibacteriene / antimicrobiene (după cum sunt denumite de producător); 



produsele dezinfectante/antiseptice pentru mucoase, ex. pentru igiena orală, ş.a.;



şerveţele umede dezinfectante,

detergenţii şi produsele de curăţare care au activitate biocidă dovedită (distrug sau inhibă multiplicarea bacteriilor, fungilor sau a altor microorganisme). 

În această categorie ar putea intra şi substanţele sintetizate de Bacillus thuringiensis din genul Bacillus, cu efect biopesticid.

4. 2. 4. Efectele antimicrobiene ale factorilor biologici 4. 2. 4. 1. Interrelaţiile microbiene în cadrul nişelor ecologice proprii În natură microorganismele nu se dezvoltă izolat. Relaţiile pot fi de comensualism, simbioză sau antagonism, noţiuni care vor fi prezentate ulterior. În cadrul relaţiilor de antagonism, acesta se poate datora vitalităţii mai mari a speciilor antagoniste sau elaborării de către specia antagonistă a unor substanţe nocive pentru speciile concurente. Aceste substanţe pot avea (ex. antibioticele şi bacteriocinele) sau nu (ex. acidifierea mediului) acţiune selectivă. 4. 2. 4. 2. Bacteriofagul Bacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu specificitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperiţi în 1915. Prof. Mihai Ciucă obţine în anul 1921 primele tulpini lizogene. În 1949 se înfiinţează în România un Centru naţional pentru bacteriofagi. Fagii au o structură mai complexă decât cea a virusurilor obişnuite. Se descriu (Figura nr. 14): 1. capul fagului are formă de prismă hexagonală bipiramidală. Conţine ADN dublu catenar helicoidal sau ARN înconjurat de capsida formată din capsomere (înveliş proteic); fagii ARN pot avea un număr mic de gene (ex. 3) în timp ce fagii ADN pot avea până la 150 gene; 2. coada fagului are structură proteică, simetrie helicoidală; are rol de adsorbţie, ajutând fagul să penetreze bacteria. Se descriu următoarele formaţiuni: 50

- cilindrul axial; - teaca cozii; - placa bazală (cu croşetele de fixare); - fibrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii). Toate proteinele fagice pot conduce la apariţia de anticorpi, descoperire utilizată în studierea înrudirii dintre diferiţi bacteriofagi. Relaţii bacteriofag-bacterie Între bacteriofag şi bacteria gazdă se pot stabili două tipuri de relaţii: - de tip litic sau productiv (Figura nr. 15); - de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16). Relaţiile sunt strict specifice şi sunt mediate de receptori. Ciclul litic are mai multe etape şi anume: 1. Adsorbţia: Ataşarea este specifică. Există receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniţial reversibilă (prin fibrele cozii), apoi ireversibilă (prin croşetele plăcii bazale). Adsorbţia fagică modifică permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene. 2. Penetrarea: Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele bacterian. Teaca cozii se contractă şi antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian, ducând apoi la injectarea ADN-ului fagic în citoplasma bacteriană; 3. Multiplicarea: După aproximativ 4-5 minute, funcţia ADN-ului bacterian este blocată şi preluată de ADNul fagic ce coordonează sinteza componentelor proprii. Se sintetizează un număr însemnat de proteine virale. 4. Maturarea (ansamblarea) fagului 5. Liza bacteriei (ex. datorită sintezei unor enzime asemănătoare lizozimului) şi eliberarea bacteriofagului matur, virulent. Bacteriile lizosensibile permit adsorbţia, penetrarea şi multiplicarea fagilor virulenţi până la realizarea lizei celulei bacteriene. Evidenţierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene · în mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunzător duce după câteva zeci de minute (uneori chiar şi câteva zile) la limpezirea mediului; · pe mediu solid, însămânţat uniform, inocularea fagului litic duce la apariţia unei zone de liză, clară, bine circumscrisă (spotul de bacteriofagie), metodă utilizată în lizotipie; · dacă se amestecă o suspensie de fagi cu o picătură de cultură (pură) bacteriană, iar tulpina respectivă are receptori potriviţi bacteriofagilor și această suspensie se amestecă cu geloză încălzită putem transfera suspensia într-o placă Petri; · bacteriofagii infectează bacteriile; după circa 30 minute bacteriile sunt lizate şi eliberează fagii; aceştia difuzează prin geloză şi infectează bacteriile situate în apropiere şi ciclul se reia; · o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potriviţi) nu sunt infectate şi în timp se multiplică iar cultura bacteriană opacizează mediul; după circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacteriană (bacterii nelizate), aceste arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii virulenţi sunt clare, în comparaţie cu plajele mai puţin clare produse de bacteriofagii temperaţi (fagii virulenţi sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua decât în ciclul litic) Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleaşi etape, iniţial. 51

După adsorbţie şi penetrare, ADN-ul fagic: · fie se integrează liniar în cromozomul bacteriei gazdă şi se replică sincron cu aceasta, · fie se circularizează şi ataşat de membrana citoplasmatică se replică sincron cu diviziunea bacteriei. Bacteria a devenit lizogenă, se reproduce şi transmite descendenţilor fagul latent (profag, fag temperat). În anumite condiţii profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12). Proprietăţile bacteriei lizogene: 1. este imună faţă de un fag omolog profagului; 2. pot apărea fenomene importante din punct de vedere genetic: · transducţia; · conversia genetică (cu producerea de exotoxine de către unele bacterii lizogenizate, cum ar fi toxina difterică, toxina scarlatinoasă, toxina botulinică de tip C etc); · recombinarea genetică (atunci când o bacterie parazitată de doi fagi diferiţi, dar înrudiţi, eliberează la sfârşitul ciclului litic pe lângă tipurile parentale şi tipuri de fagi care însumează unele din proprietăţile celor doi fagi parentali) etc.; · inducţia fagică (sub influenţa unor agenţi inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul îşi recâştigă virulenţa, devine fag virulent, şi produce liza bacteriei respective). Bacteriile lizorezistente nu permit infecţia cu un fag fie datorită lipsei receptorilor specifici, fie datorită unei stări de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii virulenţi omologi profagului găzduit. Fagul defectiv reprezintă profagul care persistă indefinit în stare latentă (nu se reactivează). Aplicaţii practice ale fenomenului de bacteriofagie: · fagii virulenţi sunt un element de echilibru ecologic în mediul natural de viaţă al bacteriilor (în nişa ecologică respectivă); · fagii temperaţi pot avea un rol deosebit în reasortarea materialului genetic al bacteriilor, întrucât atunci când se detaşează (inducţie) de cromozomul bacterian pot antrena porţiuni din ADN-ul bacterian; · fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorită specificităţii relaţiei fagbacterie); · anumite mutante ale fagilor se folosesc în ingineria genetică drept vectori ai ADN recombinant (ex. fagii Charon Lambda); · fagii reprezintă un model pentru studii teoretice şi practice privind virusurile şi oncogeneza, precum şi alte aspecte ale biologiei moleculare; · s-au evidenţiat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic şi antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilităţii la un anumit tip fagic) este una dintre cele mai fine metode de diagnostic bacteriologic şi epidemiologic, pentru identificarea lanţurilor de transmisie a germenilor şi pentru determinarea originii unei epidemii.

4. 3. Povestiri adevărate 4. 3. 1. Epidemia de holeră din Peru - Legendă urbană În 1991, în Peru, a izbucnit o epidemie de holeră. Boala nu este foarte frecventă pe continentul american, motiv pentru care iniţial a fost dificilă stabilirea cauzelor.

52

Situaţia a apărut oarecum în paralel cu o dezbatere publică ce avea loc în SUA cu privire la raportul risc / beneficii adus declorinarea apei. Dintre „istoriile adevărate” aceasta ca şi istoria epidemiei de difterie în fostele state sovietice arată cât de mult poate fi influenţată sănătatea publică de către dezbateri, de către mass-media etc (de multe ori în mod negativ). Este cunoscut faptul că prin clorinarea apei, pe lângă efectul de distrugere a unor microorganisme ar putea să apară şi fenomene nedorite, datorită apariţiei unor produşi de tipul trihalometanului. În USA se discută foarte mult despre efectul cancerigen al acestei substanţe. Diverşi oficiali americani, având se pare relaţii în industria chimică, şi care doreau ca metoda clorinării să rămână cea mai importantă metodă de antiseptizare a apei, au folosit multă vreme exemplul acestei epidemii pentru a demonstra ce se poate petrece dacă clorinarea apei va fi stopată. Pornind de la date reale (epidemia de holeră) dezbaterile au ajuns să prezinte o situaţie foarte diferită (numeric) ajungându-se să se discute de 1,3 milioane de cazuri de holeră soldate cu peste 11.000 de decese. În aceste dezbateri s-a afirmat că pentru a preveni apariţia unui număr foarte mic de cancere (ipotetice) s-a precipitat apariţia unui număr extrem de mare de cazuri de holeră şi respectiv a unui enorm număr de decese datorate infecţiei cu Vibrio cholerae. A fost criticată şi aşa-zisa „Teorie a precauţiei”, principial corectă, bazată pe următoarele idei generice: a. stabileşte un ţel în cadrul unui proces decizional deschis, care să se adreseze tuturor celor implicaţi; b. analizează toate modalităţile de a realiza ceea ce îţi propui şi alege varianta care va conduce la cele mai puţine efecte nedorite; c. dacă nu eşti sigur de calea pe care vrei să o urmezi, asigură-te că o alegi pe aceea care creează cele mai mici probleme mediului, sănătăţii publice, comunităţii în general; d. monitorizează rezultatele şi asigură-te că iei măsuri rapide de remediere, în cazul în care ar apărea o problemă şi e. consultă-te în permanenţă cu cei asupra cărora vor avea un efect măsurile pe care le-ai stabilit. Totuşi, nu aplicarea greşită a teoriei a fost cea care a provocat epidemia de holeră. În final, reprezentanţi oficiali din Peru au afirmat că au decis să aplice clorinarea intermitent şi nu continuu din motive economice (preţ prea mare pentru clorinarea continuă) şi nu au fost influenţaţi de „teoria precauţiei”; nu au luat în calcul riscul apariţiei cancerului. Investigaţia epidemiologică realizată împreună cu colegii de la CDC a demonstrat că epidemia de holeră a avut o cauzalitate multiplă, factorii cei mai importanţi fiind reprezentaţi de: a. clorinarea intermitentă a apei; b. diferite branşamente ilegale sau amatoristic făcute la linia de aprovizionare cu apă a oraşului; c. conectarea instalaţiilor ilegale de irigaţie la liniile de aprovizionare cu apă potabilă; d. perioade lungi în care apa a avut o presiune scăzută sau nu a existat presiune deloc, situaţii în care colonizarea şi multiplicarea bacteriană este favorizată; e. depozitarea apei potabile în butoaie, în condiţii neigienice sau „la limită” şi f. lipsa unor canalizări construite corespunzător, care au permis refularea apei din zonele poluate în reţeaua de apă potabilă etc. Cu toate că la baza acestei epidemii au stat mai mulţi factori, cel mai important dintre aceştia a fost lipsa clorinării (antiseptizării) corespunzătoare a apei potabile. Datele reale cu privire la această epidemie sunt prezentate succint la punctul 44. 8. 2. 4. 3. 2. Epidemia de holeră din Dhaka - bacteriofagii Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de apă contaminată cu tulpini de Vibrio cholerae, în special în zonele cu educaţie sanitară precară. Datele epidemiologice şi de mediu obţinute în urma unei izbucnirii epidemice („outbreak”) de holeră în Bangladesh, au sugerat rolul bacteriofagului litic specific pentru V. cholerae, care ar putea limita gradul de severitate al epidemiei prin efectul de distrugere a bacteriilor prezente în sursele de apă contaminată, sau chiar şi în cazul unor persoane infectate. 53

Au fost emise două ipoteze privind rolul potenţial al bacteriofagilor specifici: a. în cadrul relaţiei bacteriebacteriofag, bacteriofagii lizează un număr mare de bacterii, ulterior densitatea bacteriofagilor scade şi la un moment dat bacteriile se pot multiplica exponenţial şi densitatea bacteriană atinge nivelul la care pot determina o izbucnire epidemică (severitatea izbucnirii epidemice va fi cu atât mai mare cu cât densitatea bacteriofagilor rămaşi în sursele de apă contaminate este mai mică); b. dacă izbucnirea epidemică este datorată multiplicării bacteriene, necorelat cu diminuarea densităţii fagice, introducerea bacteriofagilor în sursele de apă ar putea reduce amploarea izbucnirii epidemice şi ar putea duce chiar şi la declinul acesteia. În ambele situaţii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balanţa care se stabileşte între rata de multiplicare a vibrionilor şi de rata de distrugere a fagilor. În timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantificate: a. incidenţa infecţiilor, b. densităţile tulpinilor deV. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la streptomicină) şi c. concentraţiile bacteriofagilor litici specifici pentru această tulpină (JSF4), atât în scaunul pacienţilor spitalizaţi cât şi în rezervoarele de apă potabilă. Studiul a fost posibil pentru că implica o singură tulpină, a cărei densitate a putut fi uşor monitorizată prin susceptibilitatea/rezistenţa la streptomicină. Pe baza observaţiilor în dinamică, studiul a sugerat că infecţiile sunt cauzate de consumul de apă dintr-un rezervor comun, în care bacteria şi fagul se reproduc şi interacţionează independent de populaţia umană. Iniţial, schimbările temporare climaterice au creat condiţiile unei descreşteri a concentraţiei fagice, cu o multiplicare exponenţială a vibrionilor în sursele de apă. Populaţia a început să se infecteze consumând apa respectivă, s-a creat un cerc vicios de multiplicare bacteriană în rezervor prin recontaminarea rezervorului datorită igienei precare şi astfel epidemia s-a amplificat. După un timp producţia de fagi a început să crească, datorită concentraţiei mari de vibrioni din rezervor şi în persoanele infectate. Amplificarea densităţii fagice a dus la un declin al densităţii bacteriene şi respectiv la scăderea numărului de persoane infectate, până la dispariţia cazurilor. Studiul (a fost realizat şi un model matematic foarte interesant) a sugerat şi posibilitatea ca fagul să se dezvolte iniţial în gazdele infectate cu V. cholerae, şi abia apoi să ajungă în rezervor (datorită lipsei de igienă). Această amplificare (numerică şi funcţională) a bacteriofagilor ar putea reprezenta o importantă componentă în prevenirea / controlul epidemiilor de holeră.

5. Genetica bacteriană 5. 1. Suportul eredităţii Genetica bacteriană studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii. Suportul material al eredităţii este reprezentat de ADN (acidul dezoxiribonucleic). Molecula de ADN conţine codificată informaţia ereditară, care se exprimă prin sinteza unor proteine şi se transmite prin replicare şi diviziune la descendenţi. Gena reprezintă unitatea funcţională a eredităţii iar noţiunea de genă este cunoscută încă din anul 1909. Dacă nu au loc modificări genetice, toţi descendenţii unei bacterii vor fi identici cu bacteria „mamă” şi identici între ei. O celulă bacteriană inoculată pe un mediu de cultură (având la dispoziţie nutrienţii necesari) 54

va produce prin multiplicare în condiţii prielnice (de pH, temperatură, umiditate etc.) o colonie bacteriană, o clonă. Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui fragment de material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetică), fie prin apariția spontană sau indusă a unei mutaţii care poate consta în adăugarea, pierderea, substituirea sau inversarea ordinii unor baze în secvenţa ADN-ului. Structura acidului dezoxiribonucleic ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide. Unitatea structurală este formată dintr-o bază azotată purinică (adenina, A; guanina, G) sau pirimidinică (timina, T; citozina, C), o pentoză (dezoxiriboza) şi acid fosforic. Legături fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboză cu carbonul 3 al moleculei adiacente, formând o catenă lungă polinucleotidică. Prin analiza compoziţiei în baze azotate a ADNului (provenit din surse diferite) s-a demonstrat că există o anumită compoziţie care diferă la diversele specii. Compoziţia de nucleotide a ADN-ului este surprinzător de variabilă. Suma procentuală a citozinei şi guaninei variază la bacterii de la 22% până la 74%, în timp ce la organismele eucariote intervalul este ceva mai restrâns (28 - 58%). La om variază între 39-40% în funcţie de tipul de ţesut (timus 39%; ficat 39,4%). Acest fapt se explică prin evoluţia în decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor în general şi a omului în particular. Comparaţiile conţinutului de C+G ale diferitelor organisme și microorganisme au fost folosite drept fundament în vederea stabilirii relaţionării/legăturii genetice. Timina fiind susceptibilă la alterări fotochimice (lumină UV), bacteriile cu un conţinut bogat de C+G este posibil să fi evoluat în medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor temperaturi înalte, iar cele cu conţinut redus de C+G s-ar fi dezvoltat în locuri mai protejate. Așadar, compoziţia în baze azotate, numită şi procentul de C+G, este diferită în funcţie de specie, dar se păstrează constantă în cadrul unei anumite specii. Procentul de C+G se calculează după formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest raport diferă la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris,51,7% la Escherichia coli, 53% la Proteus morgani şi67% la Pseudomonas aeruginosa. Aşa cum a fost precizat de către diverși autori, compoziţia de baze azotate este un index taxonomic. (1) La celulele procariote ADN-ul este inelar, împachetat în nucleoidul din citoplasmă. La bacteria intestinală E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alcătuiesc o macromoleculă de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lăţime. Aceasta conţine 4.400 de gene deja secvenţiate. În ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este extrem de bine înfăşurat în nucleoid, în aproximativ jumătate din diametrul celular. ADN-ul apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele şi complementare răsucite în dublu helix. Cele două catene sunt unite prin punţi de hidrogen formate între bazele azotate opuse (A=T şi G≡C). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de către Watson şi Crick în anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai importantă proprietate a acizilor nucleici şi condiţionează toate proprietăţile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare şi cea de transfer al informaţiei genetice. Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experienţe succesive, iniţial prin cercetările lui W. Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacteriană, ulterior prin experienţe care au confirmat rezultatele 55

obţinute de Griffith, dar abia în 1944 Avery, MacLeod şi Mc Carthy demonstrează faptul că ADN-ul este substratul chimic al eredităţii şi reprezintă materialul genetic al oricărei celule (funcţie îndeplinită așa cum știm astăzi de ARN, la ribovirusuri). La temperatura camerei ADN-ul este o structură stabilă în condiţii fiziologice normale, datorită legăturilor intercatenare (2 între A şi T şi 3 între C şi G). Dacă temperatura depăşeşte 65ºC, stabilitatea punţilor de hidrogen începe să cedeze, dublul helix începe să se desfacă şi rezultă două catene complementare (proces numit denaturare termică). Denaturarea devine completă la temperaturi care depăşesc valoarea de 90ºC. Renaturarea („reannealing”) reprezintă refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar prin acest proces se poate stabili relaţia filogenetică între două specii (în funcţie de procentul de renaturare). De exemplu dacă se utilizează ADN denaturat provenit de la E. coli şi ADN denaturat provenit de la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelaşi izotop (ex. C14), fracţiunea de ADN marcată şi evaluată prin diferite tehnici va fi fracţiunea din ADN care este complementară pentru cele două specii (aceste experienţe au stat la baza brevetării tehnicilor de hibridare moleculară). Renaturarea este un proces mai lent decât denaturarea. Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie în tehnologia ADNului recombinant, fie în studierea relaţiilor filogenetice între diferite specii. Cu cât speciile sunt mai înrudite, cu atât secvenţele de baze azotate au un mai mare grad de similitudine (lanţurile lor monocatenare renaturează mai rapid).

Genom. Genotip. Fenotip Genomul reprezintă suma genelor unui organism. Totalitatea informaţiei genetice a unui organism se numeşte genotip. Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip în interacţiune cu mediul ambiant se numeşte fenotip. Funcţiile ADN-ului ca material genetic sunt: - conservarea informaţiei genetice; - replicarea; - transcrierea şi traducerea materialului genetic; - protejarea materialului genetic propriu („self”); - reglarea şi controlul activităţii celulare. Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantităţii de material genetic urmată de diviziune. Replicarea ADN constă în sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula parentală şi identice între ele, pe bază de complementaritate (replicare semiconservativă). După ruperea legăturilor de hidrogen şi separarea celor 2 catene, fiecare catenă serveşte drept matriţă pentru sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este una dintre cele mai importante reacţii din lumea vie. Watson şi Crick au fost primii care au propus modelul semiconservativ de replicare a ADN. În celula care se dezvoltă rapid, există posibilitatea ca înainte de terminarea primei replicări să se iniţieze încă o replicare. În acest caz celula bacteriană va putea fi merodiploidă (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori decât în mod normal) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori decît în mod normal). 56

În general, dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (aşa cum se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa cromozomilor supranumerari. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică diferită, pentru că ei reprezintă copii ale cromozomului iniţial (deci sunt identici cu acesta). Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin) In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite într-o unitate de replicare independentă numită replicon. Indiferent dacă celula are mai mulţi cromozomi (celula eucariotă este diploidă) sau un singur cromozom (celula procariotă), tot genomul trebuie să fie replicat. Repliconul bacterian este bicatenar şi circular, caracterizat prin: - o secvenţă nucleotidică specifică marcând începerea replicării; - gene care codifică sinteza unor proteine specifice numite iniţiatori; - o secvenţă nucleotidică semnal pentru terminarea replicării. Exemple de repliconi: - cromozomul şi plasmidele bacteriene; - genomul bacteriofagilor. Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O genă structurală din cromozom are toată informaţia necesară sintezei iniţiatorului replicării (o proteină complexă). După ce replicarea a început, nu mai poate fi oprită până în momentul când se ajunge la dedublarea cromozomului. Cromozomul bacterian funcţionează ca un replicon, fapt dovedit de experienţa în care fragmentele de ADN introduse într-o celulă bacteriană (de ex. prin conjugare) nu se pot replica dacă rămân „libere” în citoplasmă, dar vor putea fi replicate odată cu întregul cromozom în cazul în care sunt integrate în cromozomul bacterian. Replicarea corectă este controlată de un mecanism foarte precis care „identifică” apariţia de nucleotide libere, împerecheate eronat şi în momentul apariţiei unui astfel de eveniment nucleotidul este „tăiat” iar polimerizarea se opreşte (corectitudinea citirii este realizată cu ajutorul ADN-polimerazei I).

5. 2. Hibridizarea acizilor nucleici Reacţia de hibridizare a acizilor nucleici se poate realiza datorită complementarităţii nucleotidelor (structura primară). Prin această tehnică se poate demonstra înrudirea sau eventual identitatea a două microorganisme, pe baza gradului (procentului) de omologie a secvenţelor nucleotidice. Din punct de vedere tehnic, cultivăm o bacterie de referinţă (cunoscută) în aşa fel încât să putem marca ADN-ul cromozomial (însă uneori aceste experienţe se fac prin marcarea ADN-ului plasmidic). Spre exemplu, o variantă poate fi reprezentată de cultivarea în mediu cu timidină tritiată, astfel încât rezultă marcarea radioactivă a ADN-ului cu tritiu. ADN-ul extras din fiecare microorganism este tratat pentru a obţine fragmente monocatenare. ADN-ul dublu catenar se reface, dacă fragmentele de ADN (ţintă) ale bacteriei testate au secvenţe nucleotidice complementare cu fragmentele ADN (sondă moleculară) de referinţă. Cu cât gradul de complementaritate dintre sonda moleculară şi ţintă este mai mare, cu atât structura hibridă formată va fi mai stabilă şi mai greu de disociat. Actualmente sondele moleculare sunt sintetizate chimic sau enzimatic. Utilitatea hibridizării acizilor nucleici Această tehnică se utilizează în taxonomia microbiană şi stă la baza funcţionării sondelor nucleotidice, care depistează rapid şi cu foarte mare sensibilitate microorganisme sau numai unii determinanţi genetici ai 57

acestora. Un alt aspect important este reprezentat de specificitatea sondei utilizate. Se apreciază, că pentru a elimina riscul unei hibridizări întâmplătoare, sonda nucleotidică ar trebui să aibă cel puţin 20 nucleotide.

5. 3. Amplificarea genetică conceptul amplificării cantităţii de acizi nucleici a fost introdus în 1983 de către Mullis, dar anul 1955, odată cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial. Folosind ADN-polimeraza şi două secvenţe scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus la punct un test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit „Reacţia de polimerizare în lanţ” (Polymerase Chain Reaction, PCR). ADN-polimeraza este capabilă să conducă la sinteza unui al doilea lanţ de ADN, întotdeauna orientat 5’-3’, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lanţ de ADN ca „matrice” (model) şi un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept „primer” (amorsă). Pentru un lanţ polinucleotidic, vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt complementari pentru două secvenţe specifice şi diferite ale ADN-ului ţintă. Iniţierea sintezei de ADN va putea avea loc numai după ce ADN-ul dublu catenar este denaturat (termic). Urmează o etapă de răcire, permiţând astfel ataşarea primerilor (care sunt furnizaţi în exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediată de ADN-polimerază va produce două molecule dublu catenare. Dacă procesul se repetă, vor rezulta patru molecule de ADN. ADN-ul se multiplică exponenţial (dublându-se de fiecare dată) ori de câte ori se repetă reacţia. Teoretic, PCR poate amplifica un fragment scurt de ADN pornind de la o singură moleculă la 1.000 de copii, dacă procesul se repetă de 10 ori şi la circa un milion de copii, dacă procesul se repetă de 20 de ori. Acest proces poate avea loc automat într-un aparat numit termociclor; aparatul repetă ciclul constând în denaturarea prin căldură (la 94-96ºC), ataşarea primerilor (la 40-60ºC) şi sinteza ADN-ului (la 65-75ºC), folosind ADN-polimeraza termostabilă (Taq-polimeraza) izolată de la o bacterie, care trăieşte în izvoarele termale din Yellowstone National Park, Thermus aquaticus. Aplicaţiile tehnicii de amplificare genetică PCR a început să fie aplicată în numeroase domenii ale cercetării medicale fundamentale. Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum şi de metoda de extragere şi de recuperare a ADNului. Datorită sensibilităţii extrem de mari a procesului, contaminarea datorată manipulării produselor de amplificare PCR obţinute anterior în acelaşi laborator poate reprezenta o problemă deosebit de serioasă. Contaminarea se poate realiza fie între probe, în timpul desfăşurării protocolului de lucru, fie datorită diferitelor manipulări. Prima variantă este mai uşor de evitat, astfel încât sursa majoră de contaminare în laboratorul de biologie moleculară rămâne eventuala contaminare a reactivilor. Verificarea acestei posibile erori este obligatorie pentru orice reacţie PCR, printr-o reacţie de control (control negativ) la care nu se adaugă ADN. Această problemă a contaminării nu este superpozabilă cu cea a rezultatelor fals-pozitive. O contaminare între probe este mult mai dificil de identificat. Principalele măsuri de precauţie ar fi reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru separate pentru manipularea produselor care conţin ADN şi respectiv pentru prepararea celorlalţi reactivi, folosirea micropipetelor (două seturi de micropipete, pentru produse cu şi fără ADN), utilizarea conurilor cu filtru, lucrul într-o nişă special amenajată şi dotată cu hotă cu flux laminar de aer. Recent s-a demonstrat faptul că lumina ultravioletă are capacitatea de a inactiva ADN-ul dublu catenar contaminant. Alte modalităţi de a elimina (diminua) riscurile contaminării sunt reprezentate de: includerea unei nucleotide modificate în PCR (înlocuirea deoxiuridinei-P cu deoxitimidină-3P) şi respectiv folosirea enzimelor de restricţie pentru îndepărtarea ADN-ului contaminat din RT-PCR (transcriere inversă). 58

Utilizarea PCR în diagnosticul bolilor infecţioase PCR poate fi utilă în diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare. În infecţia cu HIV, PCR şi-a dovedit utilitatea atât în diagnostic (secvenţele HIV-1 sunt detectabile în 100% din cazuri atunci când virusul este cultivabil şi în 64% din cazuri în situaţia unor culturi negative), cât şi în stabilirea prognosticului. În cazul infecţiilor cu citomegalovirus (CMV), PCR poate detecta ADN viral în sânge cu 7-10 zile mai devreme decât sunt identificate antigenemia sau viremia. În mod asemănător, PCR este utilă în identificarea altor agenţi etiologici (în contextul general epidemiologic, clinic şi paraclinic) precum virusurile hepatitei B şi C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor sau a unor enterovirusuri. Diagnosticul infecţiilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare prin amplificare genică. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile identificării agenţilor etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei (Legionella pneumophila), pneumoniei atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis), proceselor inflamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis), gonoreei (Neisseria gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum), meningitei (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis), gastritelor şi ulcerului (Helicobacter pylori), febrei tifoide (Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae), septicemiei cu E. coli (enterotoxigen), bolii Lyme (Borrelia burgdorferi), leprei (Mycobacterium leprae) etc. Dacă în cazul majorităţii bolilor enumerate există alternative bacteriologice sau imunologice clasice decisive, atunci când sunt implicate microorganismele aparţinând genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae) se ridică anumite probleme. În tuberculoză, agentul etiologic se izolează relativ dificil din produsele patologice, se multiplică lent, coloniile vizibile apărând pe mediile de cultură după 2-8 săptămâni, iar testele necesare identificării fenotipice clasice necesită 2-6 săptămâni suplimentare şi nu au relevanţă în 100% din cazuri. Pe de altă parte,Mycobacterium leprae nu se multiplică pe nici un tip de mediu de cultură. Cu alte cuvinte, aplicarea unor metode sensibile şi specifice este foarte necesară. Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile în scopul diagnosticării infecţiilor grave produse de Candida albicans, pneumoniei la pacienţi imunodeprimaţi (Pneumocystis carinii), meningitei cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecţii cuCoccidioides immitis (ex. la persoane infectate cu HIV), pentru a enumera câteva din aplicaţiile biologiei moleculare în domeniul afecţiunilor produse de fungi. În domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de diagnosticul dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de origine parazitară (de exemplu, cele produse de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum) sau diagnosticul toxoplasmozei (Toxoplasma gondii). Actualmente s-au pus la punct şi alte metode de amplificare genetică utile în diagnosticul sau în identificarea agenţilor etiologici ai maladiilor transmisibile. În mod suplimentar dorim să menţionăm faptul că dacă iniţial tehnicile de bază ale biologiei moleculare (hibridizarea moleculară, utilizarea sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau neradioactiv, amplificarea genică) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de lucru actuale cuprind combinaţii de tehnici, din ce în ce mai complexe şi mai subtile. Pe de o parte, există şi o întregă serie de variante tehnice ale reacţiei de amplificare genică, de ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei regiuni la care nu este cunoscută secvenţa, dar zonele învecinate au secvenţe cunoscute); LCR (ligase chain reaction) în care este necesar să cunoaştem integral secvenţa ADN-ului ţintă; RT-PCR (PCR înainte de care are loc o revers-transcriere, pornind de ex. de la ARNm şi obţinând ADNc); Nested PCR (în care are loc o amplificare dublă a acidului nucleic folosind 2 perechi de primeri diferiţi) etc. Pe de altă parte, tehnica PCR este utilizată din ce în ce mai frecvent ca o completare esenţială a unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction 59

fragment length polymorphism; SSCP-PCR; DRE-PCR, double repetitive element PCR; DRV-PCR, direct variable repeat-PCR; UP-PCR, single universal primer-PCR; spoligotyping etc).

5. 4. Organizarea genomului bacterian Plasmidele Genomul bacterian este alcătuit din două categorii de determinanţi genetici: 1. genele esenţiale, localizate în structura cromozomului bacterian şi 2. genele accesorii extracromozomale prezente în structura: - plasmidelor şi - elementelor genetice transpozabile. Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fizic independentă de cromozom (replicon), dar depinzând de factori codificaţi de nucleul bacterian. Conţin informaţie genetică neesenţială pentru viaţa celulei bacteriene. Sunt transmise stabil de-a lungul generaţiilor. Dimensiunea plasmidelor variază între 1kb şi circa 200 kb. Majoritatea sunt alcătuite din molecule de ADN circular, dar există şi plasmide liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar, dar există şi plasmide de ADN monocatenar (se consideră că plasmidele de ADN monocatenar reprezintă de fapt o situaţie intermediară în cursul procesului de replicare; au fost detectate de ex. la Staphylococcus aureus). Unele plasmide (numite şi epizomi) pot exista alternativ în stare autonomă (libere în citoplasmă) sau integrate în cromozomul celulei gazdă (de exemplu factorul F, bacteriofagul temperat etc). Celelalte plasmide persistă indefinit numai în stare autonomă (de exemplu plasmida R, Col, F etc). Clasificarea plasmidelor În raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica în: 1. plasmide care codifică rezistenţa la agenţi antibacterieni: - factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpină de Shigella dysenteriae); - plasmidele de rezistenţă la UV etc. 2. plasmide care codifică sinteza unor agenţi antimicrobieni: - factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotică) etc. 3. plasmide de patogenitate care codifică sinteza de: - hemolizine; - factori de colonizare; - enterotoxine sau alte exotoxine etc. 4. plasmide care codifică enzime ale unor căi metabolice particulare: - în anumite condiţii, unele bacterii pot utiliza ca sursă de C diferite substanţe cu potenţial toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieţuirea şi dezvoltarea în aceste condiţii se numesc plasmide degradative; 5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celulă care deţine respectivul plasmid (F) la alta, putând fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F; 6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate. Plasmidele R 60

Plasmidele R (de rezistenţă la antibiotice) conferă celulei purtătoare rezistenţa la unul sau la mai multe antibiotice. Plasmidele R au o structură genetică complexă, fiind alcătuite din: - gene care asigură proprietatea de rezistenţă la antibiotice; - gene care formează „factorul de transfer al rezistenţei” (RTF). Asigură capacitatea de replicare autonomă şi de transfer prin conjugare (cele două tipuri de elemente pot exista independent sau se pot asocia). Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacteriană sau prin transducţia mediată de bacteriofagi. Plasmidele „Col” Plasmidele „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora substanţe antibiotice de tip special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc). Plasmidele „Col” sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare genetică, transducţie fagică sau prin conjugare. Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (faţă de specia omologă), iar biosinteza lor nu are efect letal pentru specia producătoare. Factorul F (factorul de „sex”, factorul de „fertilitate”) Factorul F controlează capacitatea unor bacterii de a acţiona ca donoare de material genetic în procesul de conjugare. Factorul F codifică structurile (de exemplu pilul „F”) şi enzimele necesare transferului de ADN. În funcţie de prezenţa plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian şi de modul în care facilitează transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa în patru categorii distincte: bacterii F-; bacterii F+; bacterii Hfr; bacterii F’. Bacteriile FBacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule „femele” care se comportă ca receptoare de material genetic. Bacteriile F+ Bacteriile F+ deţin factorul F autonom în citoplasmă. Sunt echivalente unor celule „masculine”, donoare de material genetic, capabile să transmită factorul F. Bacteriile Hfr (High frequency of recombination) Bacteriile Hfr (cu mare frecvenţă de recombinare) deţin factorul F integrat în cromozomul bacterian. Se comportă ca donoare de material genetic, au o mare frecvenţă de conjugare şi recombinare. De obicei prezenţa factorului F integrat determină transferul unui număr variabil de gene cromozomale şi mai rar, chiar transferul factorului F. Bacteriile F’ Bacteriile F’ deţin o structură plasmidică de tip special (factor de fertilitate recombinant) care a fost anterior integrată în structura unui cromozom şi s-a desprins din acesta, încorporând în structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de „mascul” şi se comportă ca donoare de material genetic (factorul F’). Elemente genetice transpozabile O anumită secvenţă specifică de ADN constituie un element genetic transpozabil dacă îşi menţine integritatea fizică, structurală şi genetică, funcţională în cursul translocaţiei de la o poziţie la alta în acelaşi genom, replicon (intramolecular) sau în genomuri diferite (intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziţie 61

poate avea loc la nivelul oricărui replicon, la „întâmplare”, dar există şi situaţii în care un transpozon „are” anumite zone specifice unde se va insera (zone „calde”). Pe baza complexităţii lor, elementele care îndeplinesc această condiţie se pot grupa în trei categorii: - secvenţe de inserţie (IS); - transpozoni (Tn); - bacteriofagi. Secvenţele de inserţie (IS) Secvenţele de inserţie nu conţin nici o genă şi nu au nici o altă funcţie (cunoscută) în afară de cea de inserţie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. După inserţia lor pot apărea modificări în expresia unor gene sau modificări în rata incidenţei deleţiilor în regiunile adiacente situsului lor de inserţie. Există anumite secvenţe de inserţie care au intrat în istoria practică medicală datorită importanţei în diagnosticul anumitor afecţiuni. De ex. IS6110 se întâlneşte în una sau mai multe copii în genomul Mycobacterium tuberculosis şi poate fi pus în evidenţă prin reacţia PCR pornind fie de la cultură, fie chiar şi de la produsul patologic, permiţând un diagnostic mai rapid. Transpozonii (Tn) Transpozonii diferă de secvenţele de inserţie prin complexitate şi prin faptul că poartă gene care conferă bacteriilor funcţii noi, detectabile, de exemplu: - rezistenţa la antibiotice; - capacitatea de sinteză a unor enzime; - producerea de enterotoxine; - sinteza antigenelor bacteriene de suprafaţă (de exemplu K88 la E. coli); - sinteza unor factori de colonizare intestinală etc. Există transpozoni compuşi, care pe lângă funcţia de transpoziţie includ şi o serie de determinanţi genetici şi transpozoni complecşi. Dintre aceştia din urmă, transpozonul Tn3 a fost identificat la o tulpină de E. coli. El codifică 3 elemente: tnpA- cu activitate de transpozază, rezolvaza tnpR şi beta-lactamaza (produsul genic notat „bla”) cu activitate beta-lactamazică. Bacteriofagii Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezultă prin prescurtarea „mutator”, pentru că a fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb şi o structură lineară. După infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inseră în cromozom la „întâmplare” şi ulterior în diferite poziţii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului nucleic Mu. Atunci când structura genetică Mu va părăsi genomul bacterian va prelua o parte din structura genetică bacteriană (circa 100-150 pb)

5. 5. Mecanismele de variabilitate bacteriană Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepţiile prezentate anterior), au un singur cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară transferarea de material genetic de la o tulpină („donoare”) la tulpina receptor („acceptoare”). În mod clasic poate avea loc un transfer „pe orizontală” între tulpini care fie fac parte din aceeaşi specie fie fac parte din specii foarte înrudite, chiar dacă genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost demonstrată posibilitatea unor schimburi genetice între tulpini din specii 62

diferite (ex. în ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune modificarea la un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor ei şi pot exista în principiu două variante: - variabilitatea fenotipică şi - variabilitatea genotipică; Variaţiile fenotipice reprezintă modificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat. Variaţiile genotipice reprezintă modificări definitive ale materialului genetic (cromozomial sau extracromozomial) care se transmit descendenţilor. Mecanismele variaţiei genotipice sunt reprezentate de: - mutaţie; - transfer genetic urmat de recombinare genetică. Mutaţia Mutaţia reprezintă o modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene, ducând la modificări ale mesajului genetic. Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin: - substituţii; - inversii; - inserţii; - deleţii. Mutaţia spontană Mutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil se numesc mutaţii spontane. Mutaţia indusă Mutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi mutageni, se numesc mutaţii induse. Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane. Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon. Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta secvenţe mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică). Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea acestora la tipul iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară. Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a secvenţei bazelor nucleotidice persistă. Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie receptor sunt: - transformarea; - transferul mediat de bacteriofagi (transducţia); - conjugarea. Transformarea Transformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fie „competentă” în a accepta ADN-ul de la bacteria donor. 63

Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare la virulenţa pneumococilor faţă de şoarecele alb. Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a ciclului celular. Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin recombinare genetică) o secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice). Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt „natural competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară tratarea chimică a acestora, de ex. cu ioni de calciu. Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin: - transducţie; - conversie lizogenică. Transducţia reprezintă transferul unui fragment genetic (cromozomial sau extracromozomial) de la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul se numeşte transductor. Bacteria receptoare se numeşte transductant. Transducţia specializată (restrictivă) este caracteristică fagilor transductori care au proprietatea de a transfera numai un număr restrâns de gene bacteriene situate în imediata apropiere a situsului de legare a profagului în cromozomul bacterian. Transducţia generalizată (nerestrictivă) presupune că teoretic, oricare din genele cromozomului bacterian, indiferent de poziţia lor în genom, pot fi încorporate în mod accidental în particula virală matură pentru a forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii receptoare. Transducţia generalizată poate fi realizată de un mare număr de fagi neintegraţi în cromozomul bacterian atunci când aceştia intră în ciclul litic. Conversia lizogenică reprezintă apariţia unui caracter nou la bacteriile care găzduiesc un profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizată numai de către C. diphtheriae purtător al fagului temperat (profagul β care deţine gena tox) iar producerea toxinei scarlatinoase este posibilă numai în cazul în care Streptococcus pyogenes de grup A este lizogenizat. Există şi fagi care sunt integraţi în regiuni care codifică un anumit produs din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integrează într-o genă care codifică leucina). Conjugarea bacteriană reprezintă un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau extracromozomial) realizat prin intermediul unei legături intercelulare directe. Este condiţionată de prezenţa factorului F în celula donoare.

Receptorii specifici Pentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existenţa unor „receptori” de suprafaţă atât la celula donoare, cât şi la celula receptoare. Aceştia vor permite „recunoaşterea reciprocă”. Fiziologia conjugării bacteriene După un număr de alipiri întâmplătoare, bacteriile F+ formează cu bacteriile F- „perechi de recombinare” şi între celulele alăturate se formează un canal de conjugare. Prin canalul de conjugare se realizează transferul unidirecţional al materialului genetic. Fragmentul transferat poate fi apoi integrat parţial sau total în genomul celulei receptoare, ducând la apariţia unor proprietăţi noi ale acesteia, manifeste sau nu.

5. 6. Povestire adevărată 64

„Folosirea cunoştinţelor din domeniul geneticii, în munca de detectiv” Îmbinarea examinării foarte detaliate a secvenţelor genomice microbiene cu o cunoaştere aprofundată a evoluţiei bacteriilor poate fi utilă atât în obţinerea unor diagnostice de mare precizie, cât şi în aplicarea unor teste de diagnostic relevante în medicina legală. Spre exemplu, dorim să amintim situaţia creată în 2001 în urma atentatelor teroriste din SUA, când o serie de instituţii, dar şi persoane particulare, au primit plicuri având un praf alb sau maroniu, care în unele cazuri (au existat şi „alarme false”) s-a dovedit a conţine spori de Bacillus anthracis. Câteva elemente concrete cu privire la situaţia din acea perioadă vor fi prezentate în capitolul dedicat genului Bacillus. După cartografierea genomului de B. anthracis s-au evidenţiat ca fiind posibile circa 3.500 de mutaţii nucleotidice unice. În funcţie de acestea se ştie actualmente, că tulpinile cunoscute pot fi împărţite în 8 grupe, fiecare grup fiind la rândul său divizat în mai multe subgrupe. Toate aceste grupe studiate sunt foarte stabile privind o posibilă variaţie genetică (nu există „cross-link”-uri între grupe), ceea ce face ca Bacillus anthracis să reprezinte un „candidat ideal” pentru studii de biologie moleculară folosite în scopul punerii la punct a unor teste, care să identifice cu mare fineţe o anumită tulpină, inclusiv „originea” acesteia. Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu că tulpina de B. anthracis folosită în atacurile teroriste făcea parte din grupul Ames. Această încadrare a putut să fie stabilită prin evidenţierea a 6 mutaţii specifice grupului Ames (4 la nivel cromozomial, una la nivelul plasmidului pX01 şi una la nivelul plasmidului pX02). Aşadar, iată cum, pentru o bacterie stabilă din punctul de vedere al unei posibile variaţii genetice, se poate realiza o adevărată „muncă de detectiv” şi prin metode specifice de laborator se poate stabili originea şi apartenenţa sa, pornind de la caracteristicile genetice.

6. Antibiotice şi Chimioterapice 6. 1. Definiţie Antibioticele şi chimioterapicele antimicrobiene reprezintă un grup de substanţe medicamentoase capabile să distrugă sau să inhibe multiplicarea unor microorganisme implicate etiologic în bolile infecţioase. Au o acţiune selectivă asupra celulelor microorganismelor, exercitând acţiuni minime asupra celulelor organismului gazdă. Aceste substanţe pot fi: - antibacteriene, - antivirale, - antifungice, - antiparazitare. În mod clasic, în această grupă de medicamente au fost incluse şi antineoplazicele (ex. dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Există și antibiotice folosite ca: · inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini), · imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizată de Tolypocladium inflatum), 65

· · ·

hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus), insecticide, ierbicide etc (1).

6. 2. Date cu privire la descoperirea antibioticelor (Figura nr. 1) Antibioticele au revoluţionat lumea în multe aspecte. Nenumărate vieţi au fost salvate. Din nefericire însă, există şi aspecte mai puţin plăcute legate în special de apariția și dezvoltarea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice precum și de înregistrarea diferitelor reacții adverse. O bază de date recent întocmită arată prezenţa a mai mult de 20.000 de gene potenţial rezistente (2). Încă din 1820 chinina a fost folosită drept chimioterapic în tratamentul malariei, antimalaricele de sinteză fiind introduse în practică o sută de ani mai târziu, în 1926. În acelaşi an (1926) Fleming testează penicilina pentru efectul ei antimicrobian „in vitro”, pentru ca în 1946 să se demonstreze în practică utilitatea acestui antibiotic (cu ajutorul penicilinei este vindecat un pacient cu septicemie stafilococică). În 1935 sunt descoperite primele molecule de sulfonamide (Domagk) iar rezistenţa la aceste molecule a fost raportată spre sfârşitul anilor 1930. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit în anul 1944 (streptomicina, Scharty, Bugie, Waksman). În 1949 se pune în evidenţă în structura penicilinei nucleul betalactam, iar din acest moment toate substanţele antibiotice cu o astfel de particularitate structurală au primit numele de betalactamine. În 1950 sunt descrise betalactamazele, eveniment urmat începând cu 1977 de obţinerea inhibitorilor de betalactamaze (acid clavulanic, sulbactam, tazobactam). Din 1960 se folosesc deja penicilinele semisintetice antistafilococice, anul 1976 aducând cu sine utilizarea în clinică a ureidopenicilinelor cu spectru ultralarg. Sulfamidele (sulfonamidele) au fost medicamentele antimicrobiene utilizate aproape exclusiv în perioada 1946-1950 (numită din acest motiv „era sulfamidelor”). Anul 1948 impune în tratamentul antiinfecţios clasa tetraciclinelor, începînd cu clortetraciclina şi continuând cu oxitetraciclina, tetraciclina, rolitetraciclina, minotetraciclina, doxitetraciclina. Primul medicament din clasa macrolidelor, eritromicina, este obţinut în 1952. Cotrimoxazolul este introdus pe scară largă în clinică începând cu anul 1969. În 1979 este pus în evidenţă nucleul carbapenem, descoperire care duce la apariţia unei noi clase de substanţe antibiotice: tienamicinele. Printre reprezentanţii acestei clase se numără tienamicina, imipenemul, care este asociat în terapie cu cilastatina. Ulterior s-au realizat structuri chimice rezistente la acţiunea dihidropeptidazei 1 renale, respectiv biapenemul şi meropenemul. În perioada 1979-1982 sunt descoperite fluorochinolonele (norfloxacina, enoxacina, ofloxacina, pefloxacina, ciprofloxacina etc) iar în 1982 sunt produşi monobactamii, cu activitate pe germenii Gramnegativi (ex. aztreonam). La începutul secolului 21 se utilizau la nivel mondial peste 250 de molecule de antibiotice şi chimioterapice antiinfecţioase diferite. Având în vedere utilizarea mai puţin raţională a acestor medicamente, Organizaţia Mondială a Sănătăţii elaborează periodic o listă a medicamentelor esenţiale, inclusiv antibiotice şi chimioterapice. În această listă apar medicamente betalactamice (penicilină, amoxicilină, cloxacilină, piperacilină etc), medicamente antituberculoase şi antileproase (clofazimină, dapsonă, ethambutol, izoniazidă, pirazinamidă, rifampicină etc), alte medicamente antiinfecţioase (cloramfenicol, co-trimoxazol, doxiciclină, eritromicină, gentamicină, metronidazol, spectinomicină, sulfadiazină etc), medicamente „complementare” 66

(ciprofloxacină, clindamicină, acid nalidixic etc) dar nu apar pe lista principală nici cefalosporinele şi nici chinolonele ceea ce demonstrează cel puţin indirect recomandarea de reducere a utilizării în exces a medicamentelor antimicrobiene, aceasă noţiune având o legătură directă cu subiectul prezentului capitol. În acelaşi sens, este recomandată citirea unui document relativ recent („How to improve the use of medicines by consumers”, OMS, 2007), adresat atât specialiştilor în sănătate cât şi celor care utilizează diferitele medicamente, inclusiv antibiotice şi chimioterapice. Interesul pentru acest subiect este dovedit şi de faptul că editarea acelui manual a fost făcută cu asistenţă financiară de la Comunitatea Europeană.

6. 3. Clasificarea antibioticelor şi chimioterapicelor Clasificarea se poate face după: a) originea lor; b). efectul bacteriostatic sau bactericid; c). mecanismul de acţiune; d). spectrul de acţiune şi e). structura chimică (Tabelul nr. 1). 6. 3. 1. În funcţie de originea lor, agenţii antimicrobieni pot fi clasificaţi în următoarele categorii: a). Substanţe cu origine biologică elaborate de anumite microorganisme (antibioticele), de exemplu penicilina G; bacteriocinele (piocine, colicine etc) au origine biologică, dar nu pot fi utilizate în tratamentul infecţiilor umane; b). Produşi de semisinteză realizaţi pornind de la un nucleu elaborat de un microorganism, nucleu care suferă apoi prelucrări chimice (de exemplu meticilina); c). Produşi de sinteză chimică integrală (chimioterapice antiinfecţioase), de exemplu acidul nalidixic sau sulfamidele (sulfonamidele). Deoarece în momentul actual o mare parte a medicamentelor antimicrobiene sunt produse prin metode chimice, diferenţierea netă dintre antibiotice şi chimioterapice este mai rar întâlnită în limbajul medical curent, cel mai frecvent toate aceste medicamente fiind numite „antibiotice” (totuşi trebuie să cunoaştem că există această diferenţă). 6. 3. 2. în funcţie de efectul lor, medicamentele antimicrobiene pot fi bacteriostatice şi bactericide. Un antibiotic este bacteriostatic dacă efectul său se limitează la oprirea multiplicării bacteriene (ex. tetraciclinele, cloramfenicolul, eritromicina, clindamicina, sulfonamidele etc). Un antibiotic este bactericid dacă acţiunea sa duce la distrugerea bacteriilor (ex. penicilinele, cefalosporinele, polimixinele, aminoglicozidele, rifampicina, vancomicina, streptograminele etc). Trebuie cunoscute situaţiile patologice în care se poate administra un antibiotic bacteriostatic, precum şi situaţiile în care este absolut necesară administrarea unui antibiotic cu efect bactericid (spre exemplu la persoanele care prezintă imunodepresie).

6. 3. 3. Clasificarea după mecanismul de acţiune 67

a). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei peretelui celular; au efect bactericid şi sunt reprezentaţi de antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine, carbapeneme etc), glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina), bacitracina, cicloserina, fosfomicina, izoniazida etc; b). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea funcţiei membranei celulare; au efect bactericid şi sunt reprezentaţi de polimixine (polimixină B, colistin), gramicidină, tirocidină, imidazoli, nistatină, amfotericină B etc (ultimele trei fiind medicamente antifungice); c). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor; de exemplu aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele (lincomicina, clindamicina), acidul fusidic, streptograminele etc; d). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de exemplu rifampicina, chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina etc. Antibioticele beta-lactaminice inhibă selectiv sinteza peretelui celular în mod diferit la bacteriile Grampozitive faţă de cele Gram-negative (datorită diferenţelor dintre acestea în ceea ce priveşte structura peretelui). Pentru realizarea acestei acţiuni este necesară legarea de receptori celulari numiţi PBPs (penicillinbinding proteins). Beta-lactaminele inhibă de exemplu reacţia de transpeptidare (de formare a punţilor peptidice) între lanţurile adiacente de peptidoglican. Rezistenţa la beta-lactamice apare de ex. atunci când microorganismele produc enzime numite beta-lactamaze, care „desfac” inelul beta-lactamic. Alte mecanisme de rezistenţă sunt reprezentate de: alterarea porinelor din membrana externă (Gram-negativi) ceea ce afectează transportul beta-lactaminelor către sediul de acţiune, mutaţii care afectează structura PBSs şi respectiv afinitatea faţă de beta-lactamine etc. Polimixinele (polimixina B, colistinul) acţionează selectiv pe membrana germenilor Gram-negativi, printr-un mecanism asemănător cu cel al detergenţilor cationici deteriorând membrana. Se leagă şi de lipo-poli-zaharid şi acţionează asupra membranei externe a microbilor Gram-negativi. Nu se recomandă (de primă intenţie) pentru administrare pe cale generală. Rezistenţa la polimixine apare rar. Aminoglicozidele (streptomicina, kanamicina, gentamicina, spectinomicina, tobramicina etc) se ataşează iniţial de o proteină receptoare specifică aflată pe subunitatea 30S a ribozomului bacterian şi blochează ulterior activitatea normală a complexului de iniţiere necesar formării de peptide. În final determină dezintegrarea poliribozomilor şi separarea lor în ribozomi, incapabili de sinteză proteică. Rezistenţa la aminoglicozide apare în special dacă există o modificare a procesului de transport activ în interiorul celulei bacteriene. La streptococi, enterococi, germeni anaerobi etc. nu există un astfel de sistem de transport şi în aceste condiţii aceste bacterii nu sunt sensibile la aminoglicozide. În cazul bacteriilor sensibile, rezistenţa poate apărea de ex. prin producerea de enzime care adenilează sau fosforilează grupul hidroxil de pe molecula aminoglicozidului. Dintre cele mai redutabile reacții adverse putem aminti nefrotoxicitatea și ototoxicitatea. Ciclinele (ex. tetraciclina) se leagă de subunitatea 30S a ribozomilor bacterieni şi nu permit introducerea de noi aminoacizi într-un lanţ polipeptidic în curs de formare. Rezistenţa este de regulă mediată plasmidic, dar şi prin intermediul transposonilor, ducând de ex. la sinteza unei proteine membranare care mediază un aflux excesiv de tetraciclină şi astfel nu se mai pot atinge concentraţiile bacteriostatice. Ciclinele se absorb în stomac şi intestin. Sunt bacteriostatice. Acţionează pe germeni gram pozitivi și gram negativi, spirochete, mycoplasme, rickettsii, chlamydii. Printre reacţiile adverse amintim senzațiile de greaţă, voma, diareea, toxicitatea renală şi hepatică, acumularea la nivel osos şi dentar. Cloramfenicolul se leagă de subunitatea 50S a ribozomilor bacterieni şi inhibă peptidil-transferaza, interferând cu legarea de noi aminoacizi în lanţul peptidic în curs de formare. Rezistenţa poate apărea de ex. 68

prin sinteza de către bacterii a unei acetil-transferaze sau a unei nitrat-reductaze. Acţionează pe germeni aerobi şi anaerobi gram pozitivi și gram negativi. Este un medicament bacteriostatic). Are indicații în abcesul cerebral, febra tifoidă, salmoneloze sistemice, infecţii severe cu anaerobi. Printre reacţiile adverse cele mai grave la care poate să ducă enumerăm anemia aplastică cu leucopenie şi agranulocitoză. Macrolidele (eritromicina, claritromicina etc) şi lincosamidele (lincomicina și clindamicina) se leagă de subunitatea 50S a ribozomului bacterian, interferând cu formarea complexului de iniţiere pentru sinteza lanţurilor proteice. Rezistenţa poate apărea datorită unei alterări a proteinelor ribozomale sau datorită sintezei unei enzime care metilează reziduuri de adenină la nivelul ARNr. Macrolidele sunt bacteriostatice. Acționează pe cocii gram pozitivi și gram negativi, bacili gram pozitivi și unii bacili gram negativi. Pot acționa pe specii de Mycobacterium. Au efect asupra Treponema, Mycoplasma și Chlamydia. Sunt indicate în infecţiile strectococice la bolnavii cu hipersensibilitate la betalactamine dar și în difterie, tuse convulsivă, pneumonii atipice etc. Dintre reacţiile adverse amintim: greaţă, vomă, diaree, febră, rash, reacţii anafilactice. Lincosamidele (bacteriostatice) acționează pe germeni gram pozitivi aerobi şi anaerobi şi pe germeni gram negativi anaerobi. Rifampicina inhibă creşterea bacteriană prin legarea de ARN-polimeraza ADN-dependentă. Acţionează pe mycobacterii, coci gram pozitivi și gram negativi, unii bacili gram negativi, germeni anaerobi gram pozitivi și gram negativi. Dintre indicații putem menționa tratamentul tuberculozei, leprei, infecţiilor stafilococice meticilino-rezistente sensibile (testarea sensibilității tulpinilor respective este necesară). Chinolonele (de exemplu acidul nalidixic, norfloxacina, ofloxacina, ciprofloxacina) inhibă sinteza ADN-ului microbian prin blocarea ADN-girazei. Acţionează pe unii bacili gram negativi și gram pozitivi, coci gram negativi și gram pozitivi, micoplasme, chlamydii. Dintre posibilelel reacții adverse am putea aminti: fotosensibilitate, cefalee, vertij, convulsii. Sulfamidele (sulfonamidele) sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic (PABA) şi inhibă dihidropteroat-sintetaza. Se formează analogi nefuncţionali ai acidului folic, metabolismul celulei bacteriene fiind astfel inhibat. Rezistenţa apare prin alterarea dihidropteroat-sintetazei scăzând capacitatea de legare a sulfonamidelor şi este mediată plasmidic. Rezistenţa la un membru al familiei trebuie înregistrată ca rezistenţă şi faţă de celelalte substanţe cu structură similară. Trimetoprimul, omolog al acidului dihidrofolic, inhibă reductaza acestui acid. Sulfamidele şi trimetoprimul pot fi utilizate separat pentru a inhiba creşterea bacteriană. Dacă sunt însă utilizate împreună, vor produce o blocare dublă în secvenţa sintezei de ADN, rezultând o creştere marcată a activităţii lor (sinergism). O astfel de substanţă, frecvent folosită în practica medicală, este cotrimoxazolul (ex. biseptol), conţinând sulfametoxazol şi trimetoprim. Pirimetamina, la fel ca şi trimetoprimul, inhibă dihidro-folat-reductaza. Unele antibiotice, cum ar fi actinomicinele, sunt inhibitori eficienţi ai sintezei de ADN; dar realizează această inhibiţie atât la nivelul celulei bacteriene cât şi la nivelul celulei animale, nefiind suficient de selective pentru a putea fi utilizate în terapia antibacteriană. 6. 3. 4. Clasificarea antibioticelor şi chimioterapicelor după spectrul de acţiune Prin spectrul de acţiune antimicrobiană se înţelege lista grupurilor (speciilor) de bacterii asupra cărora un anume antibiotic sau chimioterapic este activ. În practică, trebuie cunoscut nu numai spectrul antimicrobian iniţial al fiecărui preparat antimicrobian, ci şi modificările ulterioare, survenite în urma apariţiei germenilor rezistenţi. 69

Spectrul antimicrobian iniţial este stabilit pentru fiecare antibiotic în parte, o dată cu introducerea sa în terapeutică. Antibiotice cu spectru „îngust” Aceste antibiotice pot fi subîmpărţite în două subgrupuri: - antibiotice cu spectru „de tip penicilinic”, active pe bacili Gram-pozitivi, coci Gram-pozitivi şi coci Gramnegativi. Din acest grup fac parte majoritatea penicilinelor, macrolidele, lincosamidele etc; - antibiotice cu spectru „de tip streptomicină”, active pe bacili Gram-negativi, coci Gram-negativi, coci Gram-pozitivi. În acest grup sunt incluse aminoglicozidele, polimixinele etc. Antibiotice cu spectru „larg” Antibioticele din acest grup sunt active pe bacili Gram-pozitivi şi negativi, coci Gram-pozitivi şi negativi. Sunt active şi pe spirochete, leptospire, rickettsii, chlamydii, mycoplasme. În acest grup au fost incluse cloramfenicolul şi tetraciclinele. La acest grup clasic de antibiotice cu spectru larg se pot adăuga alte antibiotice, cum ar fi: penicilinele cu spectru lărgit (ampicilina, amoxiciclina etc), ureidopenicilinele, tienamicinele, cefalosporinele din generaţiile IIIV, unele fluorochinolone, unele sulfamide etc. 6. 3. 5. Clasificarea antibioticelor şi chimioterapicelor antibacteriene după structura chimică 1. Antibioticele betalactaminice a). Penicilinele - penicilinele naturale (de exemplu penicilina G); -penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, nafcilina); - aminopenicilinele (de exemplu ampicilina, amoxicilina); - alte peniciline cu efect asupra enterobacteriilor (mecilinamul, pivmecilinamul, ciclacilina, epicilina); - peniciline stabile în prezenţa unor beta-lactamaze produse de enterobacterii (temocilina; în această categorie ar putea intra şi ampicilina, amoxicilina, ticarcilina şi piperacilina); - peniciline cu efect asupra Pseudomonas aeruginosa (carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, apalcilina); - alte peniciline şi inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic + amoxicilină / ticarcilină, sulbactam + ampicilină, tazobactam + piperacilină); b). Cefalosporinele - din generaţia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina); - din generaţia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima); - din generaţia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona); - din generaţia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma). Cefalosporinele se mai pot clasifica şi în: cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc); cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola etc); cefalosporine care prezintă o mai bună stabilitate în prezenţa beta-lactamazelor (cefuroxima, cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc); cefalosporine cu activitate faţă de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima, cefpiroma, cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc). c). Alte antibiotice beta-lactaminice 70

- monobactamii (de exemplu aztreonamul); - penemii (de exemplu ritipenemul); -carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina; cilastatina este un inhibitor al dehidro-peptidazei); - oxacefemii (ex. latamoxef); - carbacefemii (ex. loracarbef). d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). 2. Glicopeptidele (teicoplanina şi vancomicina); Vancomicina este utilizată în tratamentul infecţiilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se administrează intravenos deoarece nu se absoarbe în tractul gastrointestinal. Printre reacţiile adverse amintim reacţiile anafilactice, febră, eozinofilie, neutropenie, pierderea auzului. 3. Aminoglicozidele - streptomicina (care este de fapt un oligozaharid); - kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.; 4. ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc); 5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina); 6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7. Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul); 8. Antibioticele care nu se încadrează în nici una din grupele de mai sus - cloramfenicolul; - lincosamidele (lincomicina şi clindamicina); - acidul fusidic (cu o structură asemănătoare steroizilor); - streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin); - oxazolidinonele (linezolid); - mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite în special ca răspuns la apariţia tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilină etc. Chimioterapicele 1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul); 2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol) 3. Dapsona (diaminodifenilsulfona); 4. Ethambutolul; 5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida); 6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, gatifloxacina, gemifloxacina etc); 7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina); 8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.

6. 4. Lantibioticele Denumirea de „lantibiotice” a fost introdusă relativ recent, fiind vorba de un grup special de substanţe antimicrobiene cu o serie de proprietăţi datorită cărora au fost clasificate între antibiotice şi bacteriocine. Lantibioticele sunt sintetizate de bacterii Gram-pozitive (ex. din 71

genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Streptomyces) şi prezintă un spectru de activitate specific faţă de anumite bacterii Gram-pozitive. Din punct de vedere al structurii chimice lantibioticele sunt polipeptide policiclice. Masa moleculară a acestor substanţe se situează între 1.825 daltoni (mersacidina) şi 3.488 daltoni (Pep5). Pe baza structurii lor diferite, s-au descris două tipuri de lantibiotice: A şi B. Tipul A: sunt lantibiotice produse de stafilococi, lactococi şi bacili Gram-pozitivi, de ex. nisina, subtilina, epidermina, gallidermina şi Pep5. Lantibioticele îşi au originea în proteine precursoare inactive (pre-lantibiotice) sintetizate la nivel ribozomal, convertite enzimatic în polipeptide active din punct de vedere biologic. În privinţa mecanismului de acţiune se ştie de ex. că nisina şi Pep5 au activitate bactericidă depolarizând membrana citoplasmatică a celulei bacteriene, formând pori şi inducând autoliza acesteia. Datorită faptului că există o specificitate a lantibioticelor faţă de anumite bacterii se consideră că există şi alte mecanisme implicate. Genele responsabile de sinteza lantibioticelor pot fi localizate cromozomial sau plasmidic. De ex. în cazul nisinei, genele sunt localizate pe cromozonul celulei bacteriene (15) de Lactococcus lactis, iar informaţia genetică pentru biosinteza epiderminei este localizată pe plasmidul pTu 32. Utilizarea lantibioticelor în industria alimentară şi în practica medicală Dintre lantibioticele cunoscute, nisina are cea mai largă aplicabilitate practică. Nisina inhibă tulpinile din genurileStreptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria la o concentraţie ≥ 30 ml / ml, activitatea inhibitorie fiind maximă la pH < 5,5. Nisina inhibă sporularea bacteriilor din genurile Clostridium şi Bacillus; nu are efect asupra bacteriilor Gram-negative sau asupra fungilor. Nisina este folosită pe scară largă în industria alimentară drept „conservant natural” pentru vegetale, fructe, brânzeturi proaspete şi procesate, carne, peşte, cacao, băuturi alcoolice (vinuri). Nu prezintă dezavantajele nitraţilor şi nitriţilor (produc nitrozamină cu acţiune carcinogenă). În practica medicală este utilizată în unguente cosmetice. Este folosită şi ca agent terapeutic în medicina veterinară (în tratamentul local al infecţiilor bacteriene). Epidermina, produsă de Staphylococcus epidermidis, are acţiune antimicrobiană faţă de germeni care pot acţiona patogen la nivel tegumentar: Propioniibacterium acnes, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Astfel, epidermina şi gallidermina (sintetizată de Staphylococcus gallinarum) constituie alternative terapeutice pentru derivatele de vitamina A şi eritromicină, de ex. în cazurile de acnee juvenilă, eczemă, foliculite etc. Dintre lantibioticele de tip B putem exemplifica lanthiopeptina, care are acţiune antivirală faţă de virusul Herpes simplex.

6. 5. Rezistenţa microbiană la antibiotice Utilizarea cu succes a oricărui agent terapeutic poate fi compromisă de dezvoltarea rezistenţei. Rezistența poate să apară atât pentru antibioticele utilizate în tratamentul infecțiilor bacteriene cât şi pentru antifungice, antivirale, antiparazitare sau pentru medicamentele utilizate în tratamentul unor boli cronice. Trei condiţii trebuiesc îndeplinite ca un anumit antibiotic să inhibe bacteria susceptibilă: 

antibioticul trebuie să poată să ajungă la ţintă într-o concentraţie suficientă;



antibioticul nu trebuie să fie inactivat înainte să se lege de ţintă;



trebuie să existe în celula bacteriană o ţintă vitală susceptibilă la acţiunea antibioticului. Cititorul este rugat să consulte și http://ecdc.europa.eu/en/eaad/pages/video.aspx. 72

Rezistenţa microbiană la antibiotice reprezintă capacitatea unor microorganisme de a supravieţui şi de a se multiplica în prezenţa antibioticului. Fenomenul de rezistenţă la antibiotice a fost descris relativ rapid după introducerea acestora (ex. Streptococcus pyogenesrezistent la sulfonamide, Staphylococcus aureus rezistent la penicilină sau Mycobacterium tuberculosis rezistent la streptomicină) în practica medicală. Pe măsură ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecţioase afectează multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de acţiune al beta-lactaminelor) au fost descoperite şi mecanismele prin care bacteriile pot rezista faţă de acţiunea medicamentului antibacterian (ex. producerea de enzime numite beta-lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc). Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită. 6. 5. 1. Rezistenţa naturală (intrinsecă) reprezintă rezistenţa tuturor membrilor unei specii bacteriene faţă de un antibiotic şi este determinată genetic, de exemplu rezistenţa bacilului tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis) la penicilina G. 6. 5. 2. Rezistenţa dobândită este acea rezistenţă necaracteristică unei specii bacteriene, dar achiziţionată de anumite subpopulaţii din acea specie în circumstanţe date; de exemplu, antibioticul acţionează ca un presor selectiv (pacientul are o infecţie în care majoritatea populaţiei bacteriene este sensibilă la agentul antimicrobian, dar există tulpini care prezintă rezistenţă; în aceste condiţii, tulpinile sensibile vor fi inhibate sau distruse în timp ce tulpinile rezistente vor fi „selectate”; această situaţie nu poate fi detectată decât utilizând tehnicile de testare a sensibilităţii bacteriilor la antibiotice şi chimioterapice, de ex. antibiograma difuzimetrică standardizată). Rezistenţa dobândită poate fi cromozomială sau extracromozomială. Mecanisme biochimice implicate în rezistenţa la antibiotice - producerea de către bacterie a unei enzime care inactivează antibioticul, de exemplu penicilinaza stafilococului auriu (codificată plasmidic) care inactivează nucleul beta-lactamic al penicilinelor sau diferitele tipuri de beta-lactamaze produse de bacteriile Gram-negative (ex. de enterobacterii); - scăderea permeabilităţii peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotic (de exemplu formele L); - elaborarea în exces de către bacterie a unor enzime complementare, care limitează sau anulează acţiunea antibacteriană a antibioticului, exercitată la nivelul enzimei respective; - alterarea ţintei intracelulare (ex. modificarea proteinelor ribozomale); - amplificarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulându-se astfel prin „diluare” acţiunea inhibitorie a sulfamidelor etc. (Tabelul nr. 2) 6. 5. 2. 1. Rezistenţa cromozomială se poate dezvolta ca rezultat al unei mutaţii spontane, la întâmplare, la nivelul unui locus ce controlează sensibilitatea faţă de un anumit produs antimicrobian (deleţie, substituţie sau adiţie de bază). Prezenţa substanţei active antimicrobiene serveşte ca un mecanism selector, suprimând organismele sensibile şi favorizând dezvoltarea unei populaţii provenite din organismele mutante, rezistente la antibiotic. Mutaţia spontană apare cu o frecvenţă variind între 10-12-10-7. Mutaţiile cromozomiale sunt definitive, afectează numai un anumit antibiotic sau o familie de antibiotice şi se transmit vertical la toţi descendenţii suşei bacteriene devenite rezistentă. Pot fi clasificate în: · mutaţii într-un singur pas (single large step mutations) – o singură mutaţie duce la creşterea CMI pentru un anumit antibiotic. Pot duce la eşuarea tratamentului atunci când acesta este instituit cu un singur antibiotic. 73

· mutaţii în mai mulţi paşi (multistep mutations) – mutaţii secvenţiale care duc la creşterea gradată a CMI. 6. 5. 2. 2. Rezistenţa extracromozomială este mult mai frecventă decât cea cromozomială, reprezentând circa 90% din cazurile de rezistenţă. În acest caz, transmiterea materialului genetic pentru rezistenţă se poate face transversal (orizontal), la toţi membrii populaţiei bacteriene existente la un anumit moment dat, prin plasmide, material plasmidic sau transpozoni. Transferul materialului genetic se poate realiza prin: - transducţie; - transformare; - conjugare; - transpoziţie. Transducţia apare prin intervenţia unor bacteriofagi care pot transporta ADN bacterian încorporat în capsida sau genomul propriu. Dacă acest material genetic include gene pentru rezistenţa la un antibiotic (factor R sau RTF), o celulă bacteriană infectată ulterior poate deveni rezistentă la antibioticul respectiv şi este capabilă să transmită descendenţilor această rezistenţă fără a veni în contact cu antibioticul respectiv. Transformarea reprezintă un mod de transfer al informaţiei genetice care implică încorporarea de ADN liber din mediu (rezultat de exemplu în urma lizei unor bacterii care-l conţin) într-o altă bacterie. Conjugarea reprezintă pasajul genelor de la o celulă la alta prin contact direct realizat prin intermediul unui pil sexual (pil F). Acest mecanism este considerat foarte important în răspândirea rezistenţei la antibiotice. ADN-ul astfel transferat poate codifica simultan pentru germenul receptor rezistenţa faţă de mai multe antibiotice. Transpoziţia este un transfer al unor secvenţe scurte de ADN (transpozoni, elemente transpozabile) în interiorul unei celule bacteriene între două plasmide sau între o plasmidă şi o porţiune a cromozomului bacterian. 6. 5. 3. Tipuri de rezistenţă 6. 5. 3. 1. Rezistenţa faţă de un agent antimicrobian poate fi: - monovalentă (monorezistenţa), atunci când germenii rezistă la un singur antibiotic; - plurivalentă (rezistenţa multiplă, la mai multe antibiotice); 6. 5. 3. 2. Din alt punct de vedere, rezistenţa se poate manifesta: - direct (leagă o anumită bacterie de un singur anumit antibiotic); - încrucişat (rezistenţa unei bacterii faţă de mai mulţi agenţi antimicrobieni cu structură şi/sau mecanism de acţiune asemănător); de ex. rezistenţa la o sulfonamidă sau la o tetraciclină conferă rezistenţă la toate sulfonamidele sau la toate tetraciclinele în timp ce stafilococii rezistenţi la meticilină (MRSA) sunt rezistenţi la toate medicamentele beta-lactamice; 6. 5. 3. 3. După ritmul de instalare, rezistenţa poate fi: - cu ritm rapid de instalare (monostadială), „tip streptomicină”; - de ritm intermediar, „tip eritromicină”; - cu ritm lent de instalare (pluristadială), „tip penicilină”; - cu ritm foarte lent de instalare, „tip vancomicină”. 6. 5. 4. Modificări ale spectrului antimicrobian iniţial Implicaţiile clinice, terapeutice, epidemiologice şi materiale ale fenomenului de rezistenţă bacteriană la antibiotice şi chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea tulpinilor rezistente prin antibioticoterapia 74

excesivă, de multe ori abuzivă, exercitată în spitale, alte unităţi sanitare sau în ambulator (inclusiv prin fenomenul numit „automedicaţie”), duce la variate aspecte negative: infecţii cu germeni rezistenţi, apariţia şi transmiterea germenilor de spital, devalorizarea şi pierderea unor medicamente antibacteriene etc. O problemă deosebită este şi utilizarea medicamentelor antibiotice şi chimioterapice în domeniul veterinar. Se estimează că anual se consumă circa 100.000 tone de antibiotice şi chimioterapice, o bună parte în ferme de animale, piscicole etc (Levy 2002). Acest exces de utilizare produce şi un fenomen de „poluare” a mediului cu substanţe de acest tip, prin excreţia acestora de către animalele „tratate”. Atunci când vorbim de utilizarea raţională a antibioticelor şi chimioterapicelor ar trebui să avem în vedere: utilizarea acestora în beneficiul pacientului; evaluarea clinică riguroasă însoţită de teste de laborator sugestive sau care să confirme infecţia şi respectiv sensibilitatea la medicamente a tulpinilor izolate; instituirea tratamentului în cel mai scurt timp posibil în cazul pacienţilor cu infecţii severe, ameninţătoare de viaţă; tratamentul trebuie să fie „ţintit”, să fie îndreptat strict către bacteria care a produs respectiva infecţie, să se utilizeze calea de administrare cea mai potrivită, doza corespunzătoare, intervalul între doze, durata optimă a tratamentului iar pacientului să i se explice toate elementele care vor permite ca acesta să fie compliant şi să respecte indicaţiile medicale. Este strict necesară supravegherea fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice, testarea sensibilităţii germenilor, notificarea şi evaluarea statistică, publicarea periodică a datelor şi punerea lor la dispoziţia sistemului sanitar. Cu toate acestea, datele menţionate mai sus nu sunt disponibile la nivel naţional. În România, profesioniştii din sistemul sanitar se bazează fie pe experienţa proprie, fie pe datele statistice din literatura internaţională. Se vorbeşte tot mai des în zilele noastre despre „superbugs”, şi anume, bacterii rezistente la foarte multe antibiotice. Printre acestea amintim Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Enterobacterspp., Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, M. tuberculosis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae etc. Termenul de „superbug” se refer la microbi care duc la o mortalitate şi morbiditate ridicată datorită mutaţiilor multiple și respectiv rezistenței la antibiotice și chimioterapice rezultate. Variantele terapeutice devin limitate iar spitalizarea este de durată mare şi poate duce la costuri deosebit de mari. (3) NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase gene; blaNDM-1) este o genă nou descoperită. Bacteriile care dețin gena devin ”impermeabile” pentru o serie de antibiotice și inactivează carbapenemazele. Gena se găseşte la nivelul unei plasmide și din această cauză poate fi ușor transmisă. A fost prima dată identificată în India; a fost ulterior recunoscută în Pakistan, Bangladesh, UK, SUA, Canada, Australia, Belgia etc (4-7). 6. 5. 5. Date privind controlul extinderii rezistenţei la antibiotice Utilizarea oricărui antibiotic în mod potențial duce la rezistenţă. De-a lungul anilor s-au realizat și aplicat diferite strategii de către CDC, Organizația Mondială a Sănătății și mai de curând de către ECDC, pentru prevenirea şi controlul rezistenţei la antibiotice, spre exemplu: · controlul strict al folosirii acestor medicamente după o prescriere corectă (ex. nu pentru un guturai sau altă infecție insensibilă la antibiotice anti-bacteriene) · achiziţionarea antibioticelor și chimioterapicelor doar în baza prescripției medicale · controlul strict al medicamentelor utilizate la animale şi în agricultură (multe dintre moleculele de antibiotice și chimioterapice folosite în terapie la om se găsesc sub alte denumiri comerciale şi în tratamentul animalelor) 75

· prevenirea bolilor infecţioase etc. Rezistenţa la antibiotice datorată răspândirii utilizării acestora de către om şi pentru animale a devenit o problemă tot mai mare în ultimele decenii. În 2001 ”European Union Ministers of Health” a adoptat Recomandările legate de folosirea prudentă a antibioticelor în medicina umană. Prima recomandare a fost ca statele membre să întocmească şi să întărească un sistem de supraveghere pentru folosirea antibioticelor şi prevenirea rezistenţei la acestea. Din 1999, Sistemul European de Supraveghere Antimicrobiană (European Antimicrobial Surveillance System – EARSS) oferă date legate de prevalenţa şi răspândirea majorităţii bolilor cauzate de bacterii rezistente la unul sau mai multe antibiotice. În raportul anual din 2007 EARSS afirmă că „datele pe care EARSS le-a adunat de-a lungul anilor aduc un mesaj neplăcut dar important: rezistenţa la antibiotice devine o problemă tot mai mare de sănătatea publica an după an şi doar un efort cumulat poate schimba această situaţie”. (8) Copiii sunt cei care primesc cele mai multe antibiotice în UE mai ales pentru infecţii ale tractului respirator superior. Există date care arată că în acest caz apare și rezistenţa la antibiotice și chimioterapice. Tulpinile rezistente sunt răspândite printre copiii care sunt duşi la creşă sau la altă formă de educație preșcolară. La nivelul UE deşi au existat câteva iniţiative, s-a făcut mult prea puţin în ceea ce priveşte această grupă de vârstă. Ar fi totuși de menționat înfiinţarea Reţelei de Prescriere şi Rezistenţa la Antibiotice a Copiilor din UE (The Antibiotic Resistance and Prescribing in European Children network – ARPEC) care are următoarele scopuri: · să folosească metodologia şi datele oferite de celelalte sisteme de supraveghere pentru a dezvolta un sistem de supraveghere a rezistenței la antibiotice, pentru copiii din UE · să determine diferenţele legate de alegerea antibioticului, doza şi indicaţiile care apar între diferite comunităţi şi spitale · să pună la punct recomandări privind dozele de antibiotice și chimioterapice administrate zilnic copiilor · să colecteze date · să initieze referinţe legate de rata prescrierii şi rezistenţei în colaborare cu Societatea Europeană pentru Bolile Infecţioase Pediatrice (European Society for Paediatric Infectious Diseases – ESPID) · să trimită rezultatele obținute în cadrul fiecărui proiect către toate ţările membre. (9) CDC a dezvoltat la rândul său un plan de acţiune cu privire la rezistenţa la antibiotice care cuprinde patru mari puncte: · Supraveghere, · Prevenire şi Control, · Cercetare şi · Producţie. (10)

6. 6. Noţiuni legate de alegerea corectă a antibioticelor în tratamentul bolilor infecţioase Instituirea şi continuarea unei terapii cu antibiotice pe o durată optimă (nici prea scurtă şi nici prea lungă, existând recomandări specifice în funcţie de agentul etiologic şi respectiv în funcţie de patologie) trebuie să 76

urmeze întotdeauna parcurgerea unor etape minimale care să justifice această opţiune terapeutică. În acest mod s-ar putea evita principalele erori în utilizarea antibioticelor, erori extrem de frecvente în momentul actual, inclusiv la nivel mondial, erori care favorizează în principal abuzul de antibiotice / chimioterapice şi permit selectarea de microorganisme rezistente. 6. 6. 1. Etape de urmat în vederea instituirii corecte a unui tratament cu antibiotice Etapa în care se ia decizia de instituire a antibioticoterapiei Această etapă se bazează pe o serie de date concrete (însă uneori pornim doar de la ipoteze) într-un anumit contextclinic, epidemiologic, paraclinic şi de laborator. Este strict necesar să reţinem că întotdeauna există un context şi că nici una dintre informaţii luată singular nu permite luarea celei mai bune decizii. Nu există o prioritate pentru clinică sau o prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate şi integrate în contextul general. Pentru a susţine decizia încercăm să răspundem cât mai precis posibil la cel puţin două întrebări, respectiv: 1. Este în discuţie o infecţie certă sau cel puțin foarte probabilă? Argumentele principale în favoarea unei infecţii pot fi: creşterea temperaturii, prezenţa frisoanelor, identificarea unor supuraţii sau inflamaţii locale, modificarea evidentă a stării generale, icterul (colorarea în galben a tegumentelor şi mucoaselor), prezenţa unor erupţii la nivel tegumentar sau pe mucoase, modificări ale tranzitului intestinal însoţite de eliminarea de scaune mai numeroase sau de consistenţă scăzută (diaree), tusea, condensările pulmonare percepute auscultator sau prin examinare radiologică, sindromul meningian (foarte important de sesizat prin manevre clinice relativ simple), leucocitoza (atât ca număr cât şi ca procent în analiza formulei leucocitare), testele nespecifice de inflamaţie (număr de leucocite, VSH, proteină C reactivă, fibrinogen etc.), identificarea prezenţei bacteriilor la nivel tisular sau în umori în mod normal sterile prin examene simple în cadrul diagnosticului bacteriologic direct etc. Sindromul de răspuns inflamator sistemic (SIRS) sugerează de cele mai multe ori o infecţie, dar el poate fi produs şi de cauze neinfecţioase (imunologice, cancer, politraumatisme, alte agresiuni fizice etc.). În acest sindrom este evaluată prezenţa a cel puţin două din următoarele condiţii: temperatură centrală peste 38°C sau mai mică de 36°C, frecvenţă cardiacă peste 90 de bătăi pe minut, frecvenţă respiratorie peste 20 de respiraţii pe minut sau PaCO2 sub 32 mmHg, numărul leucocitelor periferice peste 12.000 pe mm3 sau sub 4.000 pe mm3 sau cu peste 10% forme imature (în bandă). Noţiunea de sepsis include prezenţa infecţiei alături de sindromul de răspuns inflamator sistemic. În prezent, este recomandată o nouă terminologie care să înlocuiască vechile denumiri de septicemie, stare septică, septicopiemie etc. Sepsisulreprezintă SIRS determinat de infecţie. Sepsisul sever se defineşte ca un sepsis asociat cu disfuncţie organică, hipoperfuzie sau hipotensiune. Şocul septic este sepsisul însoţit de hipotensiune (indiferent de aportul normal de lichide) şi de anomalii de perfuzie (cel puţin acidoză lactică, oligurie sau alterarea acută a stării mentale). Hipotensiunea este definită ca tensiune arterială (maximă) sub 90 mmHg sau reducerea tensiunii arteriale maxime cu peste 40% faţă de nivelul obişnuit. Prezenţa sau suspiciunea sepsisului, şocului septic sau a sindromului de disfuncţie multiorganică, chiar şi atunci când nu sunt clar demonstrate, constituie un argument hotărîtor pentru administrarea de antibiotice sau chimioterapice datorită gravităţii deosebite a acestor entităţi clinice. Totuşi, chiar şi în această situaţie nu există nici un argument logic de a institui antibioticoterapia înainte de a recolta produse pentru a fi examinate în cadrul diagnosticului bacteriologic direct. 2. Care este terenul pe care s-a instalat infecţia? 77

Evaluarea terenului, a situaţiei gazdei care urmează a fi tratată, are un rol important în stabilirea oportunităţii antibioticoterapiei. Infecţiile uşoare, apărute la persoane tinere anterior sănătoase, de obicei nu necesită tratament cu antibiotice sau chimioterapice. Aceleaşi infecţii apărute la pacienţii cu imunodepresie fac antibioticoterapia strict necesară (şi este indicat să utilizăm medicamente bactericide). Existenţa unor factori favorizanţi măreşte prezumţia de infecţie şi necesită instituirea terapiei cu antibiotice, chiar în contextul unor semne fizice (exemplu febră) aparent minore. Aceşti factori sunt de obicei reprezentaţi de imunodepresia la nivelul întregului organism (la pacienţi cu diabet, ciroză, cancer, SIDA, politraumatisme, operaţii extinse etc.) sau de imunodepresie locală (datorită prezenţei unor catetere, sonde, şunturi, proteze implantate etc.). La bolnavii imunodeprimaţi se va opta de obicei pentru antibiotice bactericide; în această situaţie este de obicei acceptată asocierea de antibiotice. Etapa în care se alege medicamentul antimicrobian care urmează a fi administrat Din gama largă de antibiotice disponibile la ora actuală (peste 250 de molecule diferite), selectarea celui mai indicat se face după mai multe criterii. Relativ frecvent, alegerea se bazează pe criteriul prezumţiei etiologice, cu condiţia începerii diagnosticului microbiologic direct anterior începerii terapiei (nu există nici o justificare, indiferent de eventuala gravitate a maladiei, pentru a administra întâi antibiotice şi apoi a-ţi aduce aminte că era preferabil să recoltezi produsul patologic, să îl trimiţi către laborator în vederea izolării, identificării şi stabilirii sensibilităţii/rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice a germenului implicat în respectiva patologie). Ulterior, alegerea poate fi corectată pe baza precizării definitive a etiologiei (cu condiţia ca diagnosticul microbiologic direct să fi fost „lansat”), dar şi pe baza aprecierii eficienţei clinice şi a efectelor adverse ale terapiei iniţiale. În vederea alegerii medicamentului antimicrobian pe care urmează să îl administrăm pacientului cu o boală infecţioasă este strict necesar să: a). stabilim diagnosticul etiologic, să încercăm şi să reuşim diferenţierea infecţiilor bacteriene (tratabile cu antibiotice şi chimioterapice anti-bacteriene) de infecţiile virale; elementele care ne permit orientarea spre etiologia bacteriană ar fi: un tablou clinic mai sever (există şi infecţii virale foarte grave, însoţite de modificări substanţiale ale stării generale a pacienţilor), febra mai „înaltă”, frisoanele, inflamaţia mai accentuată, prezenţa supuraţiilor, leucocitoza (numeric şi procentual în analiza formulei leucocitare). Trebuie să realizăm de asemenea o examinare clinică în detaliu a pacientului („din creştet şi până la tălpi”), examenul microbiologic (inclusiv examinarea microscopică citobacteriologică); b). testăm sensibilitatea la antibiotice a bacteriei izolate şi implicate în infecţia supusă antibioticoterapiei (de ex. antibiograma); c). realizăm sau primim informaţii privind diagnosticul anatomo-clinic al bolii; d). cunoaştem proprietăţile farmacologice ale antibioticelor propuse a fi folosite; e). avem în vedere şi criteriul economic (raportul cost-eficienţă); f). analizăm necesitatea unei eventuale asocieri de antibiotice. Trebuie de asemenea să avem în vedere şi să decidem care este calea şi modul de administrare pentru antibioticul ales în funcţie de gravitatea, localizarea infecţiei, caracterul acut sau subacut al bolii, tipul antibioticului ales, toleranţa pentru acest antibiotic a pacientului tratat. Spre exemplu, putem folosi penicilina V (de administrare orală) în infecţii de gravitate medie sau chiar şi în unele infecţii grave, în funcţie de localizare, ca alternativă pentru penicilina G sau alte preparate beta-lactamice, dacă bacteria izolată îşi păstrează sensibilitatea faţă de penicilină, dacă gazda nu prezintă hipersensibilitate de tip I faţă de penicilină şi dacă vom reţine care este procentul de absorbţie al acestui medicament şi în acest sens vom administra doze duble comparativ cu dozele utilizate pentru administrarea parenterală şi „pe stomacul gol”. În cazul în care analiza noastră a permis răspunsul la toate întrebările listate mai sus se vor stabili dozele necesare, intervalele între administrări, durata tratamentului, precum şi momentul opririi acestuia. Controlul 78

terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul administrării incluzând metode clinice (de ex. ameliorarea semnelor şi simptomelor) şi metode de laborator (examene paraclinice, dozarea antibioticelor în ser etc.).

6. 7. Erori în practica antibioticoterapiei Antibioterapia se află într-un impas constatat clinic prin diferite eşecuri terapeutice (în cadrul tuturor specialităţilor atât medicale dar mai ales chirurgicale) şi confirmat de numeroase studii de laborator (aceste studii sunt realizate în special în SUA şi Europa de Vest şi sunt mai puţine şi mai puţin semnificative în ţara noastră; constatările diferitelor eşecuri există, chiar dacă sunt prezentate de regulă „anecdotic” şi nu în publicaţii accesibile întregului sistem sanitar). În străinătate, există o tendinţă de a atrage în echipe mixte microbiologi, farmacişti etc. cu scopul de a monitoriza calitatea utilizării antibioticelor şi chimioterapicelor, mai mult, de a pregăti specialişti pentru formarea de echipe multidisciplinare cu participarea managerilor unităţilor sanitare, pentru limitarea problemelor legate de numeroasele erori comise în antibioticoterapie (Arnold 2004). Principalele cauze ale situaţiei actuale sunt un număr imens de prescrieri abuzive şi folosirea iraţională a unor antibiotice; se estimează că 60% din antibioticele şi chimioterapicele produse anual se risipesc inutil. Principalele „rezultate” sunt: apariţia de specii sau de tulpini („mutante”) bacteriene cu rezistenţă la antibiotice, înmulţirea reacţiilor adverse la antibiotice şi chimioterapice precum şi modificarea tablourilor clinice „clasice“ ale patologiei infecţioase. Cel puţin teoretic soluţia ar fi descoperirea de noi antibiotice (însă din ce în ce mai multe companii farmaceutice transferă interesul pentru descoperirea de medicamente antivirale şi antifungice şi au tendinţa de a renunţa la cercetarea fundamentală în vederea producerii de medicamente antibacteriene, Shlaes 2003) dar mult mai logic, mai corect şi mai la îndemână estefolosirea raţională a medicamentelor antimicrobiene deja existente şi evitarea erorilor făcute în practica antibioticoterapiei. Dar, care sunt cele mai frecvente erori în folosirea antibioticelor? În primul rând este incorect să începem un tratatament antibiotic fără să fi examinat clinic (complet) pacientul şi fără să utilizăm informaţiile pe care le putem obţine printr-o anamneză riguroasă. Este incorect să indicăm folosirea acestor medicamente în stări febrile în care există doar „bănuiala unei infecţii”. Este incorect să decidem antibioticoterapia „la întâmplare” sau „pe încercate” (cu o eventuală eroare suplimentară reprezentată de schimbarea succesivă a antibioticului în „raţionamentul” că „poate de data aceasta va merge” fără să încercăm să ne fundamentăm decizia pe criterii raţionale (cel puţin pe criterii de probabilitate). „Raţionamente” simpliste de tipul febră = infecţie = antibiotice şi chimioterapice (deseori întâlnite în practică, din păcate) nu pot conduce decât la eşec, la modificarea evoluţiei bolii şi la împiedicarea stabilirii ulterioare a diagnosticului („mascare” clinică şi bacteriologică) şi tratamentului corect. Cu privire la criteriile de probabilitate este adevărat că în România nu există ghiduri şi recomandări privind utilizarea corectă a antibioticelor, bazate pe studii actuale, realizate peeşantioane reprezentative statistic pentru România şi în aceste condiţii „referinţa” este reprezentată de studiile făcute în SUA sau în Europa de Vest şi de manualul domnului profesor Mircea Angelescu (1998). În al doilea rând este incorect să utilizăm antibiotice fără a solicita, fără a obţine şi fără a interpreta corect datele de laborator. Indiferent de specialitate (medicală, chirurgicală) şi indiferent de supra-specialitate este necesară cunoaşterea şi utilizarea corectă a unor noţiuni elementare de bacteriologie. Este absolut incorect să începem antibioticoterapia înainte de recoltarea produsului patologic. În funcţie de contextul clinic şi de gravitatea patologiei în cazul căreia presupunem drept etiologie o infecţie bacteriană este recomandabil 79

să solicităm şi efectuarea unor examene paraclinice de bază (leucogramă, VSH, radiografie, sumar de urină etc). Nu trebuie să uităm că atunci când suspicionăm o infecţie bacteriană, indiferent de specialitate (aceste analize pot fi efectuate chiar şi personal; ca alternativă trebuie să stabilim o foarte bună colaborare între clinică şi laborator) avem la îndemână posibilitatea şi necesitatea efectuării de preparate între lamă şi lamelă (native) şi frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, Giemsa etc.) din produsul obţinut prin recoltare de la pacientul cu o presupusă infecţie bacteriană. Realizarea şi examinarea frotiurilor poate dura chiar şi numai 5 minute, permiţând în scurt timp obţinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte important. Nu ar trebui să indicăm tratamentul cu antibiotice fără a ţine seama de sensibilitatea la antibiotice a germenului. În cazul unor infecţii grave se poate începe antibioticoterapia, după „criterii de probabilitate”. Însă, în cazul în care produsul patologic a fost recoltat anterior, a fost transmis către laborator, a fost prelucrat iar agentul etiologic a fost identificat şi s-a stabilit care este sensibilitatea la antibiotice şi chimioterapice iar evoluţia clinică şi paraclinică nu este favorabilă, demonstrând că antibioticul ales nu a fost cel mai potrivit, pentru că avem rezultate de laborator vom putea „schimba” tratamentul, de această dată pe criterii ştiinţifice evitând schimbări repetate şi „la întâmplare” sau chiar inducerea unui prognostic rezervat pacientului supus tratamentului din clinica în care ne desfăşurăm activitatea). Trebuie să nu greşim şi să luăm în considerare drept agenţi etiologici diferiţi germeni saprofiţi sau condiţionat patogeni, cultivaţi din focare sau cavităţi septice deschise, sau izolaţi din produse contaminate în cursul recoltării. O altă eroare ar fi ignorarea posibilităţii ca germenul izolat să fie doar unul dintre cei 2 sau mai mulţi germeni implicaţi. Încă din anul doi de studiu se obţin primele date cu privire la toate aspectele descrise mai sus precum şi cu privire la testarea sensibilităţii la antibiotice (de ex. antibiograma), metodă care nu trebuie interpretată mecanic, nu trebuie nici subestimată şi nici supraevaluată (mai ales atunci când este efectuată difuzimetric şi / sau nu este standardizată). Aşa cum am mai subliniat în cadrul acestui capitol, nu trebuie niciodată să absolutizăm datele clinice, datele paraclinice, datele de laborator, luate fiecare în parte şi „scoase” din contextul general. Nu există o prioritate pentru clinică sau o prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate, integrate şi utilizate în contextul clinic, paraclinic şi de laborator general. Aceasta reprezintă, după opinia noastră, un aspect esențial al medicinii pe care dorim să o practicăm la cel mai înalt nivel, în favoarea pacienţilor pe care trebuie să îi tratăm. În al treilea rând este incorect să prescriem fără justificare antibiotice şi chimioterapice, spre ex. în stări febrile neinfecţioase (maladii cu mecanism prin hipersensibilitate, maladii ale ţesutului colagen, neoplazii etc), în boli infecţioase cu agenţi patogeni care nu sunt sensibili la antibiotice (ex. este absurd să utilizăm penicilină sau orice alt antibiotic antibacterian în „tratamentul” gripei). Este de subliniat că este incorect să indicăm antibioterapia (şi să aşteptăm ca indicaţia noastră să aibă efect curativ) în cazul unor supuraţii colectate neglijând şi / sau temporizând incizia şi drenajul (antibioticul nu difuzează în focarul purulent; în plus, va fi inactivat la acest nivel). În al patrulea rând, atunci când este necesară antibioterapia, este incorect să alegem eronat un antibiotic sau o asociere de antibiotice (în cazul în care această asociere este strict necesară), prin necunoaşterea sau nerespectarea spectrului antimicrobian, prin nefolosirea antibioticului de elecţie (ex. folosirea augmentinului sau cloramfenicolului sau tetraciclinei în angina streptococică la pacientul care nu prezintă hipersensibilizare la penicilină), prin utilizarea de antibiotice nedifuzibile în focar (infecţia urinară nu se poate trata cu cloramfenicol deoarece cloramfenicolul se elimină prin bilă sau prin urină sub formă de 80

metabolit inactiv). În plus nu trebuie să uităm faptul că lucrăm cu bolnavi şi nu cu boli şi în acest sens pentru un anume pacient pot exista anumite contraindicaţii specifice (ex. hipersensibilizare faţă de antibioticul pe care dorim să îl utilizăm, cu posibilitatea apariţiei unui şoc anafilactic). Este incorect să indicăm asocierea antibioticelor antagoniste din punct de vedere al mecanismului (ex. penicilină G + tetraciclină) sau să indicăm asocierea de antibiotice cu acelaşi spectru (eroare poate fi dramatică în cazul asocierii a două aminoglicozide sau a două antibiotice cu spectru larg). Primul exemplu a fost ales pentru a atrage atenţia privind eroarea de a asocia antibiotice care pot da reacţii adverse serioase (ex. afectarea până la determinarea apariţiei surdităţii prin afectarea nervului acustico-vestibular), reacţie de notorietate în cazul aminoglicozidelor (streptomicină, kanamicină, gentamicină, amikacină etc.). În al cincilea rând, este incorect să indicăm „din start” antibiotice şi chimioterapice într-un aşa-zis scop profilactic. Spre ex. în cazul în care pacientul prezintă un panariţiu la degetul inelar singura atitudine corectă este de realiza incizia, drenajul, antiseptizarea şi pansarea locală, vindecarea urmând a se produce; nu este necesar ci este chiar contraindicat să recomandăm administrarea de antibiotice şi chimioterapice. Încă din primii ani de studenţie se poate reţine faptul că, în principiu, utilizarea antibioticelor în scop profilactic trebuie privită cu rezerve serioase. Pe de altă parte, trebuie cunoscute situaţiile în care antibioticoprofilaxia este utilă şi recomandabilă (de ex. înainte şi după efectuarea unei extrageri dentare, manevră sângerândă, la un pacient care are stenoză mitrală). În al şaselea rând, este incorect să nu studiem şi să nu acumulăm cunoştinţele necesare de microbiologie, farmacologie, fiziopatologie, semiologie medicală, medicină internă, chirurgie etc. care contribuie la evitarea erorilor în conducerea tratamentului sau / şi greşelilor în tehnica de administrare; cunoştinţele acumulate ne permit să avem în vedere posibilele reacţii adverse şi să evităm situaţii care pot deveni dramatice. Circulaţia substanţelor antimicrobiene în organism din momentul resorbţiei şi până în momentul eliminării (farmacocinetica substanţelor antimicrobiene) trebuie cunoscută atât pentru evaluarea efectului terapeutic cât şi pentru prevenirea acumulării şi apariţiei fenomenelor toxice (de ex. vom indica substanţe antimicrobiene la pacienţi cu insuficienţă renală numai în condiţiile monitorizării valorii creatinei şi creatininei sanguine, a ureei sanguine, a ratei de filtrare glomerulare, a ionogramei şi a sedimentului urinar). Există anumite caracteristici farmacocinetice pentru fiecare substanţă antimicrobiană. Datele farmacocinetice condiţionează „biodisponibilitatea” medicamentului în cazul concret al bolnavului tratat. Aceste proprietăţi caracteristice privesc absorbţia de la locul de administrare, difuziunea în organism (ţesuturi şi fluide), metabolizarea substanţei în organism, eliminarea (căi şi forme de eliminare) etc. După mecanismul patogenic reacţiile adverse la antibiotice şi chimioterapice ar putea fi reprezentate de: a. efecte toxice directe, la locul administrării (fenomene iritative, flebite etc.), sau la distanţă (hepatice, renale, hemopoietice etc.); b. reacţii de hipersensibilizare (erupţii, şoc anafilactic etc.) şi c. efecte secundare (dismicrobisme de ex. prin utilizarea antibioticelor cu spectru larg, inducerea de suprainfecţii, reacţii autoimune etc.). În al şaptelea rând, este incorect ca atunci când avem un dubiu cu privire la decizia pe care urmează să o luăm să nu ne consultăm cu alţi colegi, pentru a alege întotdeauna cea mai bună variantă posibilă. Considerăm că tăria este atunci când ne recunoaştem limitele şi nu atunci când încercăm să demonstrăm că acestea nu ar exista.

81

6. 8. Povestiri adevărate 6. 8. 1. Gentamicina administrată în aerosoli Datorită conjuncturii actuale internaţionale, s-a concluzionat că probabilitatea unui atac terorist cu arme biologice este din ce în ce mai mare. Având în vedere că prevenirea poate fi o mai bună formă de apărare, specialiştii occidentali au hotărât să pună la punct un program naţional de protecţie anti-bioterorism. În Statele Unite, acest program poartă numele de „BioShield”. Iniţial au fost identificate structurile microbiene sau tulpinile care ar putea fi utilizate în cazul unui atac biologic, cele mai importante fiind: toxina botulinică, Bacillus anthracis, virusurile febrei hemoragice, Yersinia pestis, Francisella tularensis şi virusul variolic. În afară de identificarea problemelor potenţiale a fost necesară găsirea soluţiilor de prevenire / control / combatere. În cadrul acestui capitol vom discuta numai subiectul legat de un antibiotic cunoscut, dar condiţionat într-o formă specială, prezentând astfel o serie de avantaje. Gentamicina şi respectiv mecanismul de acţiune al acesteia sunt elucidate. Condiţionarea în aşa fel încât administrarea să poate fi făcută pe care inhalatorie prezintă o serie de avantaje, spre exemplu: a. eliberare mai rapidă; b. biodisponibilitate mai bună; c. remanenţă mai bună; d. posibilitate de dozare mai bună; e. capacitatea de a ajunge mai uşor şi mai direct la nivelul organelor afectate. Atât în cazul tularemiei cât şi în cazul pestei, formele pulmonare sunt cele mai grave, cu cea mai mare mortalitate şi cu cea mai mare contagiozitate, cu alte cuvinte tratamentul acestor forme de boală reprezintă o prioritate. Având în vedere toate aceste menţiuni, gentamicina administrată pe cale inhalatorie trebuie avută în vedere atât pentru tratament cât şi pentru profilaxia post-expunere în cazul unui atac bioterorist. Aceste studii sunt foarte recente iar informaţiile au devenit disponibile în ultima parte a anului 2007. 6. 8. 2. „A da sau a nu da” aceasta este intrebarea! Când administrăm antibiotic? Mai ales că, spre exemplu, administrarea unui antibiotic adecvat la pacienţii cu sepsis diminuă mortalitatea într-un procent semnificativ cu cât se face mai precoce (de ordinul orelor). Aşadar, administrarea de urgenţă a unui antibiotic depinde de capacitatea de a recunoaşte bolnavul „critic”. „Legarea” ulterioară de etiologia infecţioasă a stării critice nu face decât să confirme decizia. Dacă va fi incriminată, ulterior, o altă etiologie a stării critice (IMA, pancreatita acută, HDS cu şoc etc) oprirea antibioticului nu afectează în sens negativ evoluţia, aşa cum ar fi fost afectată de întârzierea administrării acestuia. La vârstnici, infecţia urinară poate fi frecvent o cauză de sepsis. La un pacient vârstnic, febril, cu hipotensiune, cu imagine EKG nespecifică pentru un IMA (posibil in primele ore), aşteptăm chiar şi 4 ore fără să administrăm antibiotic, până la elucidarea modificărilor EKG, dar dacă sursa hipotensiunii era un sepsis cu punct de plecare renal, sau altul, atunci mortalitatea poate creşte de la simplu la dublu (17%-30%). La pacientul care nu e critic, se pot monitoriza semnele clinice şi se poate aştepta cu administrarea antibioticului până la determinarea posibilei etiologii infecţioase. Dar pe de altă parte nu trebuie să uităm că nimeni nu ne opreşte, indiferent de decizia care va fi luată, să recoltăm sânge pentru hemoculturi, urină pentru uroculturi sau alte produse, care pot fi trimise către laborator înainte de începerea tratamentului antibiotic. 6. 8. 3. S-a întâmplat nu demult în România ... Vă aducem la cunoştinţă cazul pacientei în vârstă de 21 de ani, care s-a prezentat la medic pentru o plagă tăiată la nivelul falangei distale a policelui mâinii stângi. Pacienta se tăiase în marginea unei conserve pe care o 82

desfăcuse de curând. Plaga era în aparenţă profundă şi secţionase coronar pulpa degetului pătrunzând şi în patul unghial. Sângerarea abundentă şi îndelungată a plăgii, dar şi durerea pulsatilă la nivelul policelui, apărută după aproximativ o oră, au fost motivele prezentării la medic. Pacienta a menţionat faptul că acasă a aplicat apă oxigenată pe plagă (a procedat corect, fiindcă apa oxigenată, prin efectul de spumare, antrenează cheagurile de sânge şi resturile anorganice de la nivelul leziunii, dar realizează şi o uşoară hemostază, oxigenând totodată plaga şi prevenind astfel dezvoltarea germenilor anaerobi). De asemenea, a aplicat local un antibiotic sub formă de pulbere (ceea ce nu este la fel de corect). La spital, din cauza durerii intense care a cuprins între timp întreaga mână până la articulaţia pumnului, medicul a evitat aplicarea unui prişnit alcoolizat, realizând hemostaza plăgii şi efectuând în continuare toaletarea marginilor şi interiorului acesteia, aplicând şi apă oxigenată. Leziunea s-a dovedit a fi minoră şi în mod cert nu necesita suturare. Totuşi, medicul curant cunoştea faptul că pacienta este studentă la facultatea de medicină şi studiind în diferite spitale, lua aproape zilnic contact cu bolnavii, cu echipamentul medical, dar şi cu celelalte cadre medicale. În mediul spitalicesc, atât pacienţii cât şi membrii personalului sanitar se pot infecta dacă există soluţii de continuitate şi dacă nu se respectă măsurile de prevenire şi control. În acest context, medicul i-a propus pacientei iniţierea unei antibioterapii cu oxacilină (menţionând că stafilococul alb şi auriu „răspund bine”), timp de cinci zile, pentru a preveni apariţia unei infecţii piogene a degetului. Un motiv de îngrijorare îl constituia durerea chinuitoare, pulsatilă la nivelul mâinii (apare de obicei ca un fenomen însoţitor pentru un panariţiu subcutanat pulpar, însă abia după 24 - 48 de ore; în cazul de faţă durerea s-a instalat la o oră de la lezarea zonei). Deşi iniţial reticentă la ideea de a lua antibiotice în scop profilactic, pacienta a acceptat, convinsă de către medic că riscul apariţiei unei infecţii era mare. A doua zi, sfătuindu-se cu un medic din universitate, pacienta a „cântărit” mai bine acest risc, ajungând la concluzia că antibioterapia pe care o urma nu era nici pe departe necesară. Medicul de la spital a tratat leziunea ca pe o plagă chirurgicală pentru care antibioterapia ar fi putut să fie instituită în scop profilactic (înainte de realizarea contaminării plăgii) sau metafilactic (în contextul unei inoculări bacteriene prezumtive). O altă eroare, de această dată a pacientei, a fost aplicarea locală de pulbere antimicrobiană imediat după lezarea zonei. Evident că riscul apariţiei unei infecţii exista, la fel ca şi în „povestea drobului de sare”. Pacienta a decis să urmeze antibioterapia timp de trei zile în loc de cele cinci recomandate; evoluţia a fost favorabilă, iar plaga s-a cicatrizat fără complicaţii. Suntem convinşi că acest lucru a fost posibil nu datorită antibioticelor administrate, ci datorită faptului că leziunea a fost minoră, precum şi datorită capacităţii de răspuns a organismului. Pacienta a decis ca pe viitor, în situaţii similare, să analizeze mai atent beneficiile şi riscurile administrării de antibiotice, acest caz constituind un elocvent contra-exemplu. În concluzie, chiar dacă fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice este bine cunoscut şi înţeles, iată că în România anului 2007 încă se mai prescriu antibiotice pentru orice „zgaibă”! 6. 8. 4. Antibiotice folosite ca biostimulante Nu doar fiinţele umane sunt supuse uzului iraţional al antibioticelor, ci şi animalele de fermă. Situaţiile de necesitate, în care acestea chiar sunt bolnave, reprezintă numai o mică parte din totalul situaţiilor în care le sunt administrate antibiotice. În majoritatea cazurilor, medicamentele antimicrobiene sunt introduse în doze mici în hrana sau apa lor pentru efectul biostimulant. Încă din anii ’40, antibioticele au început să fie folosite în fermele din toată lumea pentru capacitatea de a determina o creştere mai rapidă în greutate a animalelor. O altă consecinţă este că acestea devin adevărate rezervoare de germeni rezistenţi, care pot fi apoi transferaţi omului. Producţia de carne creşte spre beneficiul 83

câtorva producători, dar creşte concomitent şi ponderea bacteriilor rezistente la antibiotice, în dauna sănătăţii unei lumi întregi. În UE, de la 1 ianuarie 2006 a intrat în vigoare o directivă a Comisiei Europene, care interzice folosirea antibioticelor în scop biostimulant. Lista antibioticelor utilizate în alt scop decât cel terapeutic s-a micşorat treptat, de la an la an, pentru ca în 2006 responsabilii europeni, pe deplin convinşi de concluziile cercetătorilor în domeniul microbiologiei, să le interzică complet. Fenomenul rezistenţei microbiene la antibiotice are o istorie aproape la fel de lungă ca și cea a antibioticelor. În discursul rostit cu ocazia primirii Premiului Nobel, Alexander Fleming avertiza în legătură cu uşurinţa cu care pot fi produse microorganisme rezistente la invenţia sa - penicilina. Nu este nevoie de altceva decât ca acestea să fie expuse la doze mai mici decât doza bactericidă. Aceasta se întâmpla în 1945. Foarte curând temerile sale s-au adeverit, începând să apară primele tulpini rezistente. În 2009 s-a dovedit clar transmiterea de la animal la om a unui germen redutabil - stafilococul auriu rezistent la meticilină (MRSA). Aşadar, în condiţiile eforturilor pentru prevenirea apariției și răspândirii germenilor rezistenţi, sistarea abuzului de antibiotice în ferme ar trebui să se găsească în lista de priorităţi. (11) 6. 8. 5. Antibiotice fără rețetă? Tot în 2009 câţiva cercetători s-au adunat şi au avut ca scop verificarea numărului de site-uri care oferă antibiotice fără reţetă. Cu ajutorul motoarelor de căutare Google şi Yahoo au găsit 138 de astfel de site-uri. Dintre acestea, 36,2% vindeau antibiotice fără reţetă iar 63,8% ofereau o reţetă online. Penicilinele erau disponibile pe 94,2% din aceste site-uri, macrolidele pe 96,4%, fluoroquinolonele pe 61,6% iar cefalosporinele pe 56,5%. 98,6% exportau spre SUA. Rezultatele descrise în acest studiu sugerează că există o sursă mare de antibiotice în SUA care nu este afectată de iniţiativele legate de schimbarea prescrierii antibioticelor şi care poate contribui la extinderea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice. Comunitatea medicală împreună cu instituţiile de sănătate publică şi companiile farmaceutice trebuie să-şi extindă eforturile pentru a controla rezistenţa la antibiotice. În timpul anamnezei medicul poate oferi informaţii legate de antibiotice, rezistenţa la antibiotice şi posibilele interacţiuni între antibiotice. Pacienţii au nevoie să fie educaţi în acest sens! (12) 6. 8. 6. Și care să fie soluția? În SUA şi UK se estimează că un foarte mare procent din infecţiile nosocomiale cu S. aureus este produs de tulpini meticilino-rezistente (MRSA) şi o bună parte sunt MDR. O mai mică parte din aceste tulpini (şi totuşi numărul este în creştere) prezintă nivele joase de rezistenţă la vancomicină. S-au descoperit noi antibiotice care pot fi utilizate în tratamentul MRSA şi chiar şi a tulpinilor rezistente la vancomicina (ex. daptomicina) dar nu o să treacă mult timp până se va dezvolta rezistenţa şi la ele. Este o soluţie inventarea continuă de noi antibiotice? Unele tulpini de E. coli (una din cauzele comune de ITU) sunt rezistente la antibiotice din şase clase diferite incluzând cele mai nou recomandate, fluoroquinolonele. Mai mult decât atât, în sudul Asiei şi în China, 60-70% E. coli sunt rezistente la fluoroquinolone. (13) Aşa că rămâne întrebarea - ce este de făcut? Sau mai bine zis, ce va face cititorul după ce va citi aceste rânduri? Care este atitudinea pe care o va adopta medicul curant, studentul viitor medic sau omul care doreşte pur şi simplu să se informeze? 84

Am avea o propunere: în cazul în care nu va reuși să învețe sau să aplice noțiunile învățate ”secundum arte”, măcar să nu participe la ”implementarea” în practică a celor mai frecvente erori în utilizarea antibioticelor și chimioterapicelor.

6. 9. Evaluarea cunoştinţelor Alegeți răspunsul corect 1. Neutralizează acţiunea unei clase de antibiotice: A. nucleul betalactam B. nucleul carbapenem C. betalactaminele D. betalactamazele E. inhibitorii de betalactamaze 2. Au/Are efect bactericid: A. cefalosporinele B. tetraciclinele C. sulfonamidele D. cloramfenicolul E. eritromicina 3. Inhibă sinteza peretelui celular: A. macrolidele B. tetraciclinele C. cloramfenicolul D. sulfonamidele E. penicilinele 4. În cazul rezistenţei extracromozomiale, transmiterea materialului genetic NU se poate realiza prin: A. transducţie B. transformare C. mutaţie spontană D. conjugare E. transpoziţie 5. NU se obişnuieşte administrarea de antibiotice bactericide la pacienţii cu: A. cancer B. SIDA C. politraumatisme D. proteze valvulare E. gripă

85

7. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice Testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene se realizează (din punct de vedere didactic) în ultima etapă a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru majoritatea microorganismelor implicate etiologic. Testarea este necesară datorită apariţiei şi extinderii rezistenţei microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită. Rezistenţa naturală este determinată genetic. Rezistenţa dobândită este „achiziţionată” de anumite subpopulaţii dintr-o anumită specie microbiană, în circumstanţe date, ex. prin „presiunea de selecţie” exercitată de antibiotic. Noţiuni privind evaluarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni În general, o tulpină poate fi considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod eficient afectaţi de către antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obţinut cu doze şi pe căi de administrare „obişnuite”. Tulpina va fi considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt afectaţi într-o măsură mai mică, iar efectul terapeutic nu poate fi obţinut decât în condiţii speciale (ex. prescrierea unor doze mai mari decât cele „obişnuite”, calculate de exemplu pe kilogram/corp; utilizarea unor căi de administrare speciale – injectare intravenoasă, intrarahidiană etc) (Figura nr. 1, Figura nr.2). În mod absolut se consideră că o tulpină este rezistentă dacă rezultatul testării sensibilităţii in vitro este negativ. Totuşi, trebuie să avem în vedere că între rezultatele „in vitro” şi efectul „in vivo” pot exista diferenţe.

7. 1. Metode de testare a sensibilităţii bacteriilor la agenţi antimicrobieni Deoarece între rezultatele testării „in vitro” şi efectul terapeutic „in vivo” pot exista anumite diferenţe, metodele de testare a sensibilităţii pot fi diferenţiate în: a. metode de testare a sensibilităţii „in vitro”; b. metode „in vivo” (metode care ţin cont de relaţia agent terapeutic-infecţie).

7. 1. 1. Metode de testare a sensibilităţii in vitro Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită dezvoltarea optimă a microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu pe agar Mueller-Hinton). Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină bacteriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt: · Tehnicile calitative o antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri) o antibiograma difuzimetrică comparativă 86

o antibiograma difuzimetrică standardizată o antibiogramele difuzimetrice rapide · Tehnicile cantitative o metoda diluţiilor în mediu lichid o metoda diluţiilor în agar o metoda microdiluţiilor în agar o metoda „punctelor de ruptură” o testul „E” o metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc. 7. 1. 1. 1. Antibiograma difuzimetrică comună Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin „inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată. Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm). Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în termostat, la 28 sau 3537°C, în funcţie de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului testat. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă (Figura nr. 3). Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4). Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată. 7. 1. 1. 2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş) Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de referinţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram-pozitivi putem alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de referinţă are o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm. Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microorganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu termenii: „sensibil”, „intermediar”, „rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează comparativ). În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia minimă inhibitorie) a microorganismului de referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru microorganismul testat. Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie microorganismul de referinţă iar în 87

treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente. Plasăm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să interpretăm rezultatele. (Figura nr. 5) 7. 1. 1. 3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS) Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar este standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, care permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite (Film nr. 1). Elementele necesare standardizării sunt: · mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare) o există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor microorganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci când este testată sensibilitatea la aminoglicozide); o se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4); o există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor microorganisme pretenţioase; o grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm); · inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să aibă o turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108 unităţi formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor; · timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3 plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare; · concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea microcomprimatelor (6 mm diametru); · alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea; · păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de polietilenă, la +4°C); · utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate; · interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de referinţă). Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace ale antibioticului la nivelul focarului infecţios. 7. 1. 1. 4. Metoda diluţiilor în mediu lichid Acest tip de metodă oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, faţă de microorganismul testat. CMI =concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică concentraţie de agent antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o acţiune bacteriostatică asupra germenului testat. Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion MuellerHinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 16 micrograme/ml şi până la 0,125 micrograme/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără antibiotic (cantitatea finală va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul standardizat turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10 tuburi cu câte 1 ml de inocul. Agităm pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 88

ore la 35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă la temperatura frigiderului (Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir de tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă corespunzătoare. În ziua următoare citim şi interpretăm rezultatele. Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia finală de antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de 16 mg/ml, diluţia finală va fi 8 mg/ml etc.). În tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creşterea, în tubul martor menţinut la 35-37°C creşterea trebuie să fie prezentă (Figura nr. 7). În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul corespunzător datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva tulpină. În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea microorganismului corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcţie de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este £ 3mg/ml vor fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo. CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la amoxicilină în cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus, 0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentruHaemophilus influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (şi practic aceasta semnifică „rezistenţă in vivo”) pentru Bacteroides fragilis iar în cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente. 7. 1. 1. 5. Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă) Pornind de la rezultatul obţinut prin metoda diluţiilor în mediu lichid, se vor utiliza ca sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată (Figura nr. 8). Este necesară o placă Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi împărţită în sectoare, numărul de sectoare fiind corespunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană. Însămânţăm în condiţii aseptice din fiecare tub fără creştere microbiană, fiecare în sectorul de placă corespunzător (Figura nr. 9). Incubăm pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii) (Figura nr. 10). Se consideră că antibioticul va fi eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să depăşească de 4-8 ori CMB. Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea eficacităţii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infecţiilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum şi la imunodeprimaţi, efectuarea acestei metode este indispensabilă. 7. 1. 1. 6. Metoda „punctelor de ruptură” (breakpoints) Metoda este folosită în laboratoarele moderne de microbiologie şi este utilizată pentru a defini sensibilitatea şi rezistenţa la antibiotice. Depinzând de metoda de testare rezultatele sunt exprimate sub forma unei concentraţii (mg/l sau µg/ml) sau sub forma unui diametru (mm). (1) Metoda este practicată de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dacă volumul de muncă este mare sau foarte mare. Prin această metodă se pot testa mai multe microorganisme, în acelaşi timp. Antibioticele sunt incorporate în mediul de cultură, la o anumită concentraţie „limită”, în funcţie de cunoştinţele şi datele acumulate în ceea ce priveşte activitatea „in vivo” a respectivelor medicamente. Plăcile sunt inoculate simultan cu mai multe tulpini bacteriene, în „spot”, folosind un inoculator construit special, sunt incubate în condiţii corespunzătoare pentru 16-18 ore. În cazul în care tulpina sau tulpinile din diferitele specii bacteriene nu se dezvoltă la această concentraţie „limită” de antibiotic (considerată ca fiind eficace „in vivo”), bacteria 89

izolată este considerată sensibilă. În cazul în care bacteria se dezvoltă (apare cultură bacteriană), bacteria izolată este considerată rezistentă. Această concentraţie limită (breakpoint) trebuie setată în funcţie de următoarele date: distribuţia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) şi rezultatele obţinute în clinică în tratamentul pacienţilor. PD reprezintă studiul efectelor medicamentului de-a lungul timpului şi este în strânsă legătură cu PK care reprezintă modificările concentraţiilor medicamentului în timp. ”Punctele de ruptură” trebuie stabilite înainte ca un antibiotic să fie folosit în clinică şi trebuie să fie revăzute când apar cazuri de rezistenţă la antibiotice. Totuşi setarea de ”puncte de ruptură” nu este perfectă. Metoda este utilă şi în realizarea unor studii epidemiologice în ceea ce priveşte modificarea rezistenţei la antibiotice în anumite zone geografice. (1-2) 7. 1. 1. 7. Testul E; Determinarea CMI prin „E test” „E test” reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru diferite microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi. „E test” se aseamănă metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei difuzimetrice cu cele de diluţie. „E test” este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică permite determinarea valorii CMI. (3) Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o placă Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul standardizat şi langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice în gradient, de ex. la un capăt 256 mg/ml ajungând la celălalt capăt la 0,016 mg/ml (câte o langhetă pentru fiecare antibiotic, câte 15 diluţii marcate pe fiecare langhetă). Însămânţăm microorganismul care urmează a fi testat în condiţii standardizate şi depunem radiar langhetele cu antibiotice (Figura nr. 11 - Aplicarea benzii “E-test” pe suprafaţa mediului de cultură; Film nr. 2). Principiu: Asemănător metodei difuzimetrice, „E test” necesită un inocul bacterian ajustat ca turbiditate (standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză-sânge etc), în plăci Petri. Benzile „E test” conţin un gradient de agent antimicrobian şi se aplică după însămânţare. În funcţie de antibiotic, gradientul „acoperă” un şir continuu de concentraţii între 0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. După incubare (timp de 16-18 ore la 35-37°C) se formează o zonă eliptică de inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo unde creşterea bacteriană intersectează banda „E test” (Figura nr. 12 ). Materiale şi reactivi necesari: · plăci Petri cu agar Mueller-Hinton (păstrate la 2-8ºC până în momentul utilizării); · bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ şi 10-12,5 mg Mg2+/litru; se repartizează câte 5 ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează la 2-8ºC); · medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă a tulpinilor bacteriene necesare efectuării controlului de calitate ; · tulpini martor; · inocul bacterian; · soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea inoculului bacterian; · benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20ºC până în momentul utilizării (Figurile nr. 13-14. Modul de prezentare a benzilor “E-test”); au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani · tampoane sterile; · standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0; 90

· pipete Pasteur sterile; · foarfece; · plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm; · incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35ºC; incubarea în atmosferă îmbogăţită cu CO2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme; · sursă de lumină; · aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional). Tehnica de lucru (Film nr. 2): A. Benzile „E test” · scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la temperatura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai observăm nici o urmă de umezeală · înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă există perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se mai pot folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o foarfecă de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile · scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile; apoi le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat · păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru a le proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea directă la lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C) B. Inoculul bacterian: · cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură bacteriană de 1824 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm (există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore până când obţinem densitatea dorită) · ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inoculului nu garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii). C. Inocularea plăcilor: · introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat, rotim de câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii interiori ai tubului; · depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim complet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu câte o treime); · lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile „E test”. D. Aplicarea benzilor „E test”: · luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care este depus agentul antimicrobian; dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de capătul benzii notat cu E (benzile trebuie să fie complet separate una de cealaltă înainte de a le aplica pe suprafaţa mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se foloseşte aplicatorul „E test”, banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al aplicatorului); 91

· aplicăm banda „E test” pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine concentraţia cea mai mare aproape de marginea plăcii; · dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi „E test” (benzile se pun la distanţe egale, radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului benzii notată cu E trebuie să atingă marginea plăcii); · banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule de aer de sub bandă cu ajutorul unei pense începând de la marginea bulei şi mutând-o în sus pe gradient până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul testării); · banda aplicată pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu mediul de cultură, agentul antimicrobian de pe partea posterioară se eliberează imediat); dacă banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se întoarce şi se pune corect pe suprafaţa mediului; dacă banda a atins suprafaţa mesei de lucru sau un alt obiect, se poate folosi în continuare atât timp cât nu a luat contact cu o substanţă lichidă. E. Incubarea: · timpul şi temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent antimicrobian ce urmează a fi testate; · incubarea în atmosferă de CO2 modifică pH-ul mediului de cultură şi poate afecta activitatea agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorganismele supuse testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp.,Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc). Interpretarea rezultatelor: · putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape confluentă (Figura nr. 15 - Interpretare rezultate E-test pentru E. coli); · ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton); citim valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”; dacă am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-chocolate Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de lumină reflectantă şi o lupă; · pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a hemolizei; în cazul în care nu apare nicio zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca fiind mai mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test” (Figura nr. 16 Interpretare rezultate E-test pentru stafilococ); dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda „E test”), valoarea CMI se raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai scăzută a agentului antimicrobian de pe banda „E test”; · în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe care îl notăm va fi valoarea cea mai mare; · raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verificăm rezultatul obţinut pentru tulpina de referinţă (control de calitate); · rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (Figura nr. 17 - Tabel NCCLS pentru enterobacterii). 7. 1. 1. 8. Alte tehnici de testare clasice · Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe o metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice, dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă 92

o se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii în mediu lichid, teste pentru producerea de β-lactamază etc. · Testarea sensibilităţii mycobacteriilor o se efectuează respectând prevederile Programului Naţional de Control al Tuberculozei (care indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări) o se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc (Figura nr. 18). · Testarea sensibilităţii altor bacterii o există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare o spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină/meticilină se recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la antibiotice a streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge defibrinat de berbec etc. (4) · Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama) o ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru bacterii, mediul utilizat fiind mediul Sabouraud o se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid (Figura nr. 19). · Testarea producerii de β-lactamaze o este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor care pot produce βlactamază (ex.Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc) o se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine cromogene etc; există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de β-lactamaze cu spectru extins (ESBL) (Figura nr. 20). · Există şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex. ATB Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, utilizând criteriile de interpretare NCCLS (Figura nr. 21). 7. 1. 1. 9. Tehnici de biologie moleculară utilizate în testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a optimiza obţinerea unor rezultate corecte şi în timp cât mai scurt, cu privire la sensibilitatea/rezistenţa microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Metodele care au la bază tehnicile de biologie moleculară pot fi foarte utile (chiar dacă costurile sunt mai ridicate). De ex. se cunoaşte că agentul etiologic al tuberculozei se multiplică lent pe medii de cultură şi în aceste condiţii rezultatele vor fi obţinute în circa 2 săptămâni prin metodele clasice. Se pot utiliza diferite tehnici şi în final hibridizarea moleculară pentru a studia diferite mutaţii care pot să dea informaţii cu privire la sensibilitatea/rezistenţa tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizează cu ajutorul unei truse comerciale puse la punct în USA. Metoda permite concomitent identificarea M. tuberculosis precum şi testarea sensibilităţii la rifampicină, după o amplificare genetică a unui material (ADN) provenit fie din culturi mycobacteriene, fie chiar din produse clinice (Figura nr. 22). Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplificare prin PCR (Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor linii (benzi) paralele, pe fâşii de nitroceluloză. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate (cuplate cu biotină). După hibridizare se adaugă streptavidină conjugată cu fosfatază alcalină, acest conjugat ataşându-se de produşii de hibridizare rezultaţi anterior. Incubarea în prezenţa unui reactiv cromogen conduce, în cazul existenţei hibridizării, la apariţia unor 93

benzi colorate, vizibile. În cazul testării rezistenţei la rifampicină, se urmăreşte apariţia unei/unor mutaţii la nivelul genei care codifică pentru subunitatea β a ARN polimerazei (gena rpoB). (5-6) Identificarea apartenenţei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificată cu ajutorul unei oligonucleotide specifice, situată în poziţia a 3-a, după linia care marchează fiecare fâşie-test şi respectiv linia care permite verificarea calităţii conjugatului (conjugate control). Produsul unei tulpini sensibile la rifampicină deţine fragmente amplificate, care hibridizează cu sondele specifice S1, S2, S3, S4 şi respectiv S5. Absenţa uneia sau a mai multor benzi demonstrează că tulpina este rezistentă la rifampicină (Figura nr. 23). Pentru tulpinile rezistente la rifampicină, trusa comercială INNO-LIPA permite suplimentar aprecierea locusului mutaţiei. De exemplu, o tulpină poate prezenta o mutaţie în regiunea R5 (serină-leucină) în timp ce altă tulpină prezintă o mutaţie în regiunea R4a (histidină), aceste mutaţii apărute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente şi pot fi identificate prin această metodă.

7. 1. 2. Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi de apreciere a eficienţei terapeutice Eficienţa terapeutică poate fi apreciată clinic, paraclinic şi prin teste de laborator. Există unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile în aprecierea eficienţei terapeutice, precum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH, proteina C reactivă etc. Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacităţii terapeutice sau pentru evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite, vom enumera: · determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori (Figurile nr. 2426 - Citirea NEI din hemocultură sub terapie cu ertapenem; Film nr. 3); · determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte umori; puterea bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant; se determină diluţia cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă (Figurile nr. 27-29); · utilizarea acestor metode a fost indicată în cazul endocarditelor bacteriene, osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacienţi cu variate grade de imunodepresie; produsele se recoltează de obicei la o oră după administrarea unei doze şi cu câteva minute înainte de administrarea următoarei doze de antibiotic; (Film nr. 4 – Citirea NEI, Efectuarea NEB) · determinarea nivelului de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori (prin metode microbiologice, enzimatice, HPLC etc).

7. 2. Povestiri adevărate 7.2.1. Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de S. aureus în România, comparativ cu EU În statele Uniunii Europene, serviciile de sănătate publică şi-au îndreptat atenţia în ultimii ani către stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA), incidenţa acestei specii microbiene fiind într-o permanentă creştere atât în infecţiile nosocomiale, cât şi în cele comunitare. Alături de alţi agenţi patogeni care stau la 94

baza declanşării de infecţii nosocomiale (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Aspergillus spp. etc.), MRSA este agentul etiologic izolat în aproximativ 5% din totalul acestor infecţii. În vederea monitorizării în timp şi spaţiu a susceptibilităţii, dar şi a rezistenţei la antibiotice a diferitelor specii bacteriene cu potenţial patogen crescut, s-a pus la punct EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System) – un program de supraveghere a sensibilităţii la antibioticele folosite în practica medicală curentă a tulpinilor izolate de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus faecalis / faecium, K. pneumoniae şi P. aeruginosa). Supravegherea tulpinilor de S. aureus şi implicit a MRSA este realizată începând cu anul 1999. În anul 2006, 31 de state din Europa au raportat către EARSS efectuarea testării sensibilităţii la antibiotice pentru un număr de 29.552 de tulpini de S. aureus izolate. Dintre acestea, 7.037 (23,81%) au fost identificate ca fiind MRSA. Dintre cele 31 de state, 15 au raportat o incidenţă a infecţiilor cu MRSA mai mare de 25%. În ţări precum Croaţia, Grecia, Islanda, Malta, Turcia, MRSA s-a izolat cu precădere în unităţile de terapie intensivă (peste 60% din totalul tulpinilor de MRSA). Din raportul pe 2006 al EARSS reiese faptul că în statele din Europa Centrală, rata infecţiilor nosocomiale şi comunitare cu MRSA se situează între 7-22%, comparativ cu partea de nord a continentului, unde rata este sub 4%. Marea Britanie a raportat între 1.500 şi 4.000 de tulpini de MRSA pe an, Franţa între 1.700 şi 3.900 de tulpini pe an, Suedia între 1.300 şi 2.000 de tulpini pe an, Germania între 800 şi 1.300 de tulpini pe an, Slovenia între 150 şi 365 de tulpini pe an, iar Bulgaria a raportat între 100 şi 170 de tulpini pe an. În comparaţie cu aceste stateRomânia a raportat în perioada 2002-2006 un număr foarte scăzut de tulpini, variind între 78 şi 92 de tulpini pe an (circa jumătate din numărul de tulpini raportate de Slovenia şi de circa 16 ori mai puţine decât Suedia); în acest context, datele raportate la ECDC nu au valori statistic semnificative. În anul 2005 s-a efectuat în ţara noastră, la Institutul de Boli Infecţioase „Matei Balş”, un studiu al cărui obiectiv principal a fost stabilirea spectrului de sensibilitate la antibiotice pentru un număr de 589 de tulpini de S. aureus izolate. Peste jumătate din tulpini au fost izolate de la nivel faringian, dar s-au izolat tulpini şi din leziuni cutanate, prin hemocultură etc. Testarea sensibilităţii la antibiotice a fost efectuată prin E-test, evidenţiindu-se 92 (15,61%) tulpini de MRSA. Acest nivel redus al meticilino-rezistenţei poate fi corelat, printre altele, cu numărul mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la care nivelul de meticilino-rezistenţă este mai mic de 10%. Studiul a relevat faptul că macrolidele, ciclinele şi cotrimoxazolul constituie în prezent alternative terapeutice compromise, rămânând active (pentru tulpinile identificate în institut) în antibioterapie clindamicina, rifampicina şi aminoglicozidele. Procentul de tulpini de S. aureus penicilino-rezistente raportat a fost de 26% (şi nu de 100% cum ar putea părea că este sugerat atunci când, în relaţie cu o tulpină de S. aureus, penicilina este „uitată” complet). Tulpinile de MRSA constituie o problemă de sănătate publică pe tot cuprinsul Europei. Totuşi, faptul că în unele ţări (cum ar fi Cipru sau Turcia) incidenţa infecţiilor cu MRSA este în scădere, reprezintă o speranţă în încercarea de a controla rata infecţiilor nosocomiale şi respectiv a celor comunitare în care sunt implicate tulpinile de MRSA. 7.2.2. Este începutul sfârşitului erei antibioticelor? Conform unor studii recente s-a descoperit o nouă genă numită New Delhi metallo beta lactamază sau NDM 1. Această genă se găseşte la nivelul plasmidelor şi astfel poate fi copiată cu uşurinţă şi transmisă altor tipuri de bacterii. Pentru prima dată bacteria care purta gena NDM a fost izolată de la un pacient suedez de 95

origine indiană care a avut infecţie urinară în timp ce vizita New Delhi. Studiile arată că între 1 şi 4% dintre bacteriile Gram negative din sudul Asiei poartă gena NDM. NDM a fost identificată cu precădere la E.coli şi Klebsiella pneumoniae, tulpinile devenind înalt rezistente la toate antibioticele cu excepţia tigecycline şi colistin. Dar există cazuri în care nici aceste antibiotice nu sunt eficiente. În prezent nu există alte antibiotice pentru a distruge bacteriile purtătoare ale acestei gene. Pot apărea infecţii obişnuite precum infecţiile tractului urinar cauzate de microorganisme rezistente la antibiotice. O încercare pentru tratarea acestor infecţii ar putea fi administrarea unor ”cocktail-uri” de antibiotice în sparanţa că acestea vor avea un efect sau se pot folosi doze foarte mari dar există pericolul de intoxicaţie sau a altor reacții adverse. Din cauza turismului medical în general mai ales pentru proceduri precum chirurgia estetică această nouă superbacterie se poate răspândi în întreaga lume. În urma unui studiu s-a constat că NDM1 a fost identificată mai ales în Bangladesh, India şi Pakistan şi a ajuns în Marea Britanie prin intermediul unor pacienţi care s-au întors din aceste ţări după tratament. Rezistenţa la antibiotice trebuie considerată o problemă globală, mondială. (7)

8. Relaţiile microorganism - gazdă Fiinţa umană poate intra în contact cu microorganismele încă din perioada intrauterină, însă acest contact se realizează numai în cazuri patologice (infecţioase, traumatice etc). În perioada postnatală începe stabilirea relaţiilor operaţionale între fiinţa umană şi populaţia microbiană din mediul înconjurător, fie prin colonizare saprofitică, fie prin agresiune ce devine evidentă. Imediat după naştere, microorganismele se stabilesc treptat pe tegumente şi pe majoritatea mucoaselor. Este vorba în principal de microorganismele care vor alcătui microflora normală a organismului. Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană ulterioară, acţionând prin următoarele mecanisme: - competiţia faţă de aceiaşi nutrienţi (interferenţă); - competiţia pentru aceiaşi receptori de pe celulele gazdei (tropism); - producţia de bacteriocine (colicine, piocine); - producerea de acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi; - stimularea continuă a sistemului imun pentru a menţine un nivel scăzut (dar constant) al exprimării moleculelor din clasa a II a de histocompatibilitate (DR) pe macrofage şi alte celule prezentatoare de antigen; - stimularea producerii unor factori imuni de protecţie încrucişată, ca de exemplu aşa-numiţii anticorpi naturali. Cu alte cuvinte, trebuie avute în vedere toate aceste aspecte atunci când se utilizează antibiotice cu spectru larg, care vor scădea numărul microorganismelor la nivel intestinal şi vor permite multiplicarea fungilor şi a microorganismelor rezistente la aceste antibiotice. Ca urmare, la oprirea terapiei pot apărea fenomene de „rebound”, manifestate prin repopularea tractului digestiv în avantajul enterobacteriilor faţă de germenii anaerobi.

96

8. 1. Flora microbiană a organismului Flora microbiană a organismului poate fi divizată în două grupuri: - flora normal rezidentă, care se găseşte în mod regulat şi care dacă este perturbată se restabileşte prompt (sau destul de prompt) - flora tranzitorie care poate coloniza gazda pe o perioadă variabilă de timp, de la ore la săptămâni. Flora microbiană prezintă tropism pentru anumite regiuni anatomice. (Tabelul nr. 1) a). La nivelul tegumentului În funcţie de contactul cu mediul înconjurător, flora bacteriană prezintă un grad marcat de variabilitate. Mai frecvent, la nivel tegumentar se pot găsi Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp., Micrococcus spp., dar,temporar, tegumentul poate fi contaminat cu germeni coliformi, chiar stafilococi potențial patogeni precum Staphylococcus aureus, însă fără manifestări nete de agresivitate. b). La nivelul conjunctivei oculare Conjunctiva este puţin colonizată, deoarece secreţiile lacrimale conţin substanţe bactericide (ex. lizozim), iar clipitul asigură îndepărtarea mecanică a corpilor străini, inclusiv a bacteriilor. Pot fi totuși identificați Staphylococcus epidermidis,Propionibacterium spp., Corynebacterium spp. c). La nivelul mucoasei nazale În mod normal se pot găsi stafilococi aurii şi albi, streptococi, corynebacterii, pneumococi etc, floră supusă numeroaselor contaminări prin contacte şi traumatisme locale. d). La nivelul cavităţii bucale La nivelul cavităţii bucale flora conţine diferiţi coci şi bacili Gram-pozitivi şi Gram-negativi, aerobi şi anaerobi (de exemplu stafilococi, streptococi precumS. salivarius, S. sanguis, S. mutans, lactobacili, spirochete, neisserii saprofite, sau anaerobiiVeillonella spp., Actinomyces spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp.), de origine aeriană sau alimentară. Există o adevărată microbiologie orală, cu diferenţe în funcţie de localizare. Spre exemplu, pentru o celulă de la nivelul dosului limbii există aproximativ 100-150 bacterii, într-un ml de salivă sunt circa 100.000.000 bacterii, iar la nivelul plăcii dentare, circa 100.000.000.000 bacterii (aproximativ 35 de specii bacteriene diferite, cele dominante fiindStreptococcus sanguis şi Streptococcus mutans). Placa dentară, cariile şi boala parodontală sunt cauzate de bacteriile ce constituie flora normală bucală. e). La nivelul tractului respirator Mucoasa nazală este întotdeauna bogat colonizată, fiind supusă unor numeroase contaminări prin contacte şi traumatisme locale. În mod normal se pot găsi Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus (la aproximativ 20% din populaţie), streptococi, corynebacterii, pneumococi etc. Flora de la nivelul faringelui se aseamănă în compoziţie cu flora cavităţii bucale. Astfel se pot găsi streptococi, neisserii saprofite, bacili Gram-negativi-Lactobacillus spp, Bacteroides spp. Tractul respirator inferior este steril, fapt datorat și clearance-ului mucociliar. f). La nivelul tractului digestiv La acest nivel există o diferenţă evidentă în funcţie de segmentele acestuia, exprimate mai ales prin chimismul local. Luând ca exemplu colonul copilului mare şi al adultului, la acest nivel se găsesc o serie de bacili Gram-negativi (enterobacterii), precum şi foarte numeroşi germeni anaerobi (Bacteroides spp., 97

enterococi) etc, în total existând aproximativ 1011 bacterii la 1 g de materii fecale. Se va detalia mai jos (8.2) despre compoziţia şi funcţiile florei normale digestive. g). La nivel urogenital Urina este în mod normal sterilă, iar în timpul micţiunii bacteriile de pe tractul urinar inferior sunt cel mai frecvent îndepărtate. Totuşi, în uretra anterioară poate exista o floră care este cel mai frecvent alcătuită din fungi, staflococi, corinebacterii şi enterobacterii. Flora vaginală este dominată de lactobacili (flora Döderlein) asociaţi în proporţii diferite cu mycoplasme nepatogene, stafilococi, streptococi, enterococi, clostridii, Candida spp., Bacteroides spp. etc. Predominanţa lactobacililor menţine local un pH acid nefavorabil multiplicării altor germeni (în special patogeni). Mucusul cervical are în plus o acţiune bactericidă prin lizozim. La femeile fără activitate sexuală predomină lactobacilii, pe când la restul compoziţia florei este mixtă.

8. 2. Flora microbiană normală din sistemul intestinal Cea mai puţin înţeleasă parte a organismului îndeplineşte funcţii esenţiale fiziologice, nutriţionale şi de protecţie. Complexitatea acestui sistem ascunde mecanisme ce influenţează anatomia, fiziologia, cât şi patologia umană. Flora normală intestinală cântăreşte aproximativ 1 kg şi conţine o bună parte din celulele corpului uman. Speciile bacteriene ce colonizează sistemul intestinal sunt foarte variate. Flora normală este unică, variind semnificativ de la un individ la altul, iar compoziţia ei se menţine constantă lungi perioade de timp. Astfel a apărut noţiunea de „amprentă microbiană unică”.Aceste bacterii sunt de 10 ori mai numeroase decât celulele eucariote ale corpului uman. În colon există cele mai multe microorganisme comensale: 1011-1012 UFC/ml. Colonul este organul cel mai activ metabolic din întreg organismul. (Figura nr. 1) 8. 2. 1. Achiziţia florei normale Înainte de naştere, în condiţii fiziologice, fătul este „germ-free” (nu prezintă microorganisme). Apoi, întreg corpul uman și implicit şi tractul gastro-intestinal este colonizat de bacterii aerobe ce aparţin microflorei materne, de ex. Escherichia coli sauStreptococcus spp. După aproximativ o săptămână, încep să predomine bacteriile anaerobe. În cazul în care nou-născutul este hrănit cu lapte matern, vor exista mai multe bacterii Gram-pozitive, de tipulBifidobacterium spp. sau Lactobacillus spp. În cazul alăptării artificiale, situaţie nedorită şi nerecomandată pentru dezvoltarea sugarului, vor predomina bacteriile Gram-negative, iar flora microbiană intestinală va deveni foarte asemănătoare cu cea a adultului incluzând Enterobacteriaceae şi specii din genul Bacteroides. Flora normală a adultului conţine reprezentanţi din toate cele 3 domenii de viaţă: Eukaryota, Bacteria, Archaea, după cum urmează. Din domeniul Bacteria, regăsim microorganisme din genurile Bacteroides (care reprezintă circa 30% din flora normală),Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bifidobac terium, Escherichia şi Lactobacillus. Din domeniul Archaea, regăsim microorganisme din genul Methanobrevibacter. 98

Iar din domeniul Eukaryota, regăsim microorganisme din genurile Candida, Sacharomyces, Aspergillus şi respectivPenicillium. 8. 2. 2. Cultivarea în laborator Majoritatea speciilor bacteriene rezidente în intestin nu au putut fi cultivate pe medii standard de laborator. Acestea necesită condiţii speciale, cât mai asemănătoare celor din sistemul intestinal. Fiziologia acestui ecosistem este extrem de complexă: interacţiunile dintre factorii secretaţi de bacterii nu sunt înţelese complet, iar efectele per ansamblu ale substanţelor proprii organismului asupra florei microbiene sunt, de asemenea, puţin cunoscute. Prin metode moderne ale biologiei moleculare, se poate studia, în timp util şi într-un mod foarte eficient, ADN-ul bacterian. Dintre toate structurile moleculare studiate, ARNr este cea mai puţin variabilă. S-a demonstrat că anumite porţiuni ale secvenţei ADNr a diferitor organisme înrudite între ele sunt remarcabil de similare. Astfel, se poate deduce următoarea idee: secvenţierea genelor unor organisme apropiate filogenetic poate fi aliniată foarte precis, astfel obţinându-se o evaluare mult mai exactă a diferenţelor existente. Cum? Prin compararea zonelor hipervariabile ale ARNr, extrem de specifice unei anumite specii. Din acest motiv, genele care codifică pentru ARNr (ADNr) au fost utilizate pentru a determina taxonomia, filogenia şi pentru a specifica ratele de diferenţiere dintre speciile bacteriene. De asemenea, analiza după realizarea secvenţierii ARNr 16S oferă numeroase informaţii asupra evoluţiei bacteriene şi asupra relaţiilor dintre specii. Iniţiatorul acestor metode a fost Carl Woese, cel care a propus ulterior clasificarea microorganismelor în sistemul celor trei domenii Archaea, Bacteria şi Eucarya. Spre exemplu, într-un studiu s-a analizat prin secvenţierea ARNr 16 S (aparţine subunităţii mici 30 S ribozomale) acid nucleic bacterian provenit de la 50 tulpini. Astfel, s-au descoperit 1.250 secvenţe diferite, dintre care 85% nu au putut fi identificate. Majoritatea nu aparţin grupurilor taxonomice cunoscute şi clasificate până în momentul de faţă, în timp ce mai mult de jumătate nu au mai fost descoperite în nici un alt situs sau în afara organismului. Până în prezent au fost identificaţi aproximativ 420 membri ai florei normale, făcând parte din 117 genuri diferite. Se presupune că există peste 1.000 de specii bacteriene în sistemul nostru intestinal. Un exemplu de algoritm de diagnostic/identificare ar fi următorul: 1. Prelevarea de produs (materii fecale) 2. Depozitarea preparatului în una din următoarele variante: -procesare imediată sau - îngheţare la -80° C sau -depozitare într-un aparat de depozitare şi prelucrare special (PSP® Spin Stool DNA Plus Kit), la temperatura camerei 3. Purificarea acidului nucleic -există și kituri comerciale -liza celulară cu ajutorul unui kit 4. Amplificarea ADN prin tehnica PCR utilizând primeri ale căror ţinte sunt regiunile variabile ale genei ARNr 16S 5. Analiza şi interpretarea rezultatelor 99

8. 2. 3. Modificări ale florei intestinale normale Compoziţia florei microbiene normale este influenţată de numeroşi factori, precum stilul de viaţă, dieta, starea de sănătate versus starea de boală, vârsta. Astfel, dacă este urmărită evoluţia în timp a prezenţei speciilor de Bifidobacterium şiEnterobacteriaceae în sistemul intestinal, se vor observa diferenţe semnificative: Bifidobacterium spp. se află în cantitate maximă la copil, în cantitate medie la adult şi respectiv în cantitate minimă la persoanele în vârstă, în timp ce Enterobacteriaceaele se află în cantitate maximă tot la copil, în cantitate minimă la adult şi în cantitate medie la persoanele în vârstă. (Schema nr. 1; Factori ce determină modificarea compoziţiei florei normale) De-a lungul tractului gastro-intestinal se realizează o selecţie prin cooperarea dintre gazdă şi diferitele bacterii. O serie de factori locali determină o distribuţie neuniformă a florei, dintre aceştia putem aminti: -factori fizici: • temperatura; • gradientul de oxigen (majoritatea speciilor bacteriene sunt anaerobe); -factori chimici: • pH-ul (între mese, nu există microorganisme la nivel gastric); • procentul de H2O; • acizii biliari; • secreţia pancreatică; • nivelele diferiţilor nutrienţi; • secreţia locală de imunoglobuline; • diferitele substanţe produse tocmai de către bacterie; -factori mecanici: • peristaltismul intestinal (bacteriile se pot ataşa de mucoasă atunci când peristaltismul este scăzut; iată şi unul dintre motivele pentru care medicamentele anti-peristaltice nu sunt benefice în infecţiile digestive); (Tabelul nr. 2) • fenomenul de competiţie între diferitele specii bacteriene etc.

8. 3. Funcţiile florei microbiene normale din sistemul intestinal 8. 3. 1. Flora normală şi sistemul imun 8. 3. 1. 1. Dezvoltarea sistemului imunitar În studiul unor cercetători de la Harvard Medical School au fost urmărite efectele colonizării cu Bacteroides fragilis a unor şoareci „germ-free”(crescuţi în mediu steril). Dacă în lipsa bacteriilor animalele prezentau timusul şi splina incomplet dezvoltate şi un număr al limfocitelor T CD4+ naive foarte mic, după colonizarea cu Bacteroides fragilis toate defectele au dispărut. Mecanismul prin care flora determină o dezvoltare normală a sistemului imunitar se pare că este următorul: - bacteriile au la nivelul membranei externe un carbohidrat (PSA) cu o structură specială; - PSA este recunoscut şi cooptat de celulele dendritice din mucoasa intestinală; - celulele dendritice îl prezintă limfocitelor T naive şi determină proliferarea limfocitelor Th1, cu adoptarea unui răspuns imun de tip celular . 100

Dacă în lipsa florei, organismul tinde spre un răspuns imun de tip umoral, realizat prin limfocitele Th2, în prezenţa acesteia se echilibrează reacţia sistemului imunitar Th1-Th2. Astfel, flora microbiană normală „educă” sistemul imun şi contribuie la dezvoltarea şi funcţionarea normală a acestuia. Toleranţa faţă de bacteriile nepatogene, precum şi sensibilitatea faţă de bacteriile patogene se dezvoltă începând cu primele zile de după naştere, iar echilibrul dintre ele este esenţial. (Figura nr. 2) 8. 3. 1. 2. Flora microbiană intestinală ar putea reprezenta cheia în prevenirea unor stări de hipersensibilitate Conform acestor explicaţii, în lipsa florei, sistemul imun tinde „să se orienteze” spre un răspuns de tip umoral. Acest tip de răspuns imun poate fi implicat în apariţia stărilor de hipersensibilitate (ex. de tip I), printro secreţie excesivă de imunoglobuline. Într-un studiu al cercetătorilor de la University of Michigan Medical School, s-a observat o hipersensibilitate la nivel respirator, apărută faţă de ovalbumină (un cunoscut alergen) la şoarecii cu flora normală gastro-intestinală distrusă de antibiotice. Un alt argument al implicaţiilor florei normale asupra sistemului imunitar este diferenţa cunoscută dintre compoziţia florei normale a copiilor cu diversele forme de hipersensibilitate, comparativ cu flora intestinală la copiii sănătoşi; copiii din prima categorie prezintă un nivel crescut al speciilor de Clostridium difficile şi Staphylococcus aureus, în timp ce speciile din genurileBacteroides şi Bifidobacteria sunt în cantitate mică. 8. 3. 1. 3. Stresul produs de către sistemul imunitar pare să reprezinte un semnal de atac pentru bacterii S-a descoperit faptul că Pseudomonas aeruginosa, ce aparţine florei normale la 3% din oameni, deţine receptori pentru IFN-γ, mesager al sistemului imun, util în reglarea răspunsului imun, inclusiv în cazul activării răspunsului imun anti-infecţios. Această citokină este „recunoscută” drept o structură negativă şi, drept consecinţă, bacteria îşi activează genele de patogenitate. În aceste condiţii, Pseudomonas aeruginosa reuşeşte să eludeze răspunsului imun, se multiplică, selectează factori de rezistenţă la antibiotice, secretă toxine, sau poate penetra peretele intestinal (P. aeruginosa a fost izolată în sepsis, iar unica sursă posibilă era reprezentată de flora intestinală). În urma unor intervenţii chirurgicale majore a fost raportată o frecvenţă crescută a sepsisului cu implicarea Pseudomonas aeruginosa. Ipoteza foarte interesantă şi relativ recentă, care decurge din diversele studii realizate de cercetători din universităţile americane este că bacteriile nu „simt” nevoia şi nici nu „intenţionează” să descopere o oportunitate de atac, dar, atunci când se simt ameninţate, dezvoltă un plan de reacţie. 8. 3. 1. 4. Bacteriile au „propriul sistem imunitar” La întrebarea privind modul de răspuns al bacteriilor faţă de informaţia genetică externă sistemului în care se dezvoltă în mod obişnuit, cercetătorii au lansat o serie de ipoteze. Se pare că bacteriile au capacitatea de a recunoaşte ADN-ul străin. În materialul nuclear bacteriile deţin proteina H-NS care are funcţia unui receptor pentru moleculele de adenină şi timină din structura ADN-ului existent în mediul exterior. Această proteină previne activarea lui şi blochează exprimarea informaţiilor ce ar putea dăuna bacteriei. Se pare că microorganismele pot folosi ADN din surse externe pentru a exprima caractere de patogenitate. Cercetătorii sugerează un fapt foarte interesant: bacterii cunoscute în prezent drept patogene, în trecut au fost nepatogene (Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia pestis etc., ar fi devenit patogeneprin cooptarea de ADNului din mediul extern).

101

Aceste studii oferă şi o nouă viziune asupra evoluţiei bacteriilor dar şi asupra utilizării capacităţii unor bacterii (modificate genetic) de a produce proteine recombinate. La bacteriile lipsite de H-NS, care nu inactivează structurile genetice umane, producţia de proteine este mai eficientă. 8. 3. 1. 5. Diferenţierea bacteriilor comensale de cele patogene Mecanisme ale gazdei Organismul gazdă deţine sistemul PRR (pattern recognition receptor), care include familia TLR (toll-like receptors) de receptori extracelulari şi NOD/CARD (nucleotide binding oligomerization domain / caspase recruitment domain isoforms), familie de receptori intracelulari. (Figura nr. 3) Celule implicate în procesul de diferenţiere sunt: - enterocitele de suprafaţă; - celulele M din foliculii limfoizi şi - celulele intestinale dendritice. Enterocitele deţin receptori PRR, iar la contactul cu bacteriile patogene eliberează IgA, chemokine, citokine şi peptide antibacteriene. Celulele M transportă antigenele luminale către celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, macrofage etc.) care le prezintă în continuare limfocitelor T naive. Celulele intestinale dendritice deţin receptori PRR. Ele îşi trimit dendritele către suprafaţă, recunosc antigenele, le cooptează şi le transportă către ganglionul limfatic. Aici prezintă antigenele limfocitelor T naive. În ganglion este declanşat răspunsul imun care poate fi efector, prin intermediul limfocitelor T helper (Th1, Th2), sau reglator, prin limfocitele T cu rol în reglarea răspunsului imun. La contactul dintre bacteria comensală şi receptori nu apare răspuns inflamator sau chiar poate să apară un efect de protecţie, prin inhibiţia reacţiilor inflamatorii care ar putea fi declanşate de bacteriile patogene. Molecule precum TOLLIP (Toll interacting protein), SIGIRR (single Ig IL-1 R-related molecule) şi NOD2 determină toleranţa faţă de flora normală gastro-intestinală, prin inhibarea TLR sau prin blocarea cascadei inflamatorii. Limfocitele T reglatoare şi celulele intestinale dendritice deprimă la rândul lor reacţia inflamatorie. Mecanisme ale florei Toleranţa faţă de flora normală nu este determinată doar de structurile gazdei. Bacteriile comensale deţin mecanisme efectoare care le permit supravieţuirea în sistemul intestinal. Astfel, ele pot prezenta pe suprafaţă molecule asemănătoare cu cele ale gazdei (ex. Bacteroides spp.) sau pot secreta molecule care mediază eludarea mecanismelor de apărare ale gazdei. Recent s-a demonstrat că secreţia se realizează prin sisteme de secreţie de tip III (injectarea unor molecule în celulele eucariote, prin intermediul unui flagel) şi de tip IV (transportul ADN-ului sau a unor proteine în celulele eucariote, asemănător mecanismului de conjugare), mecanisme până acum descrise doar la bacteriile patogene. (Figura nr. 4) Flora normală limitează semnalele inflamatorii declanşate de bacteriile patogene prin următorul mecanism (Figura nr. 5): - NF-kB (transcription factor nuclear factor) este un factor prin care bacteriile patogene transmit semnale inflamatorii la nivelul celulelor epiteliale intestinale. Acest factor determină transcripţia genelor p55-p65, cu producţia de chemokine şi citokine. - flora microbiană intestinală activează PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) care exportă p65 în citoplasma enterocitului. Astfel transcripţia este blocată, de asemenea şi cascada inflamatorie. Spre exemplu, flora intestinală normală scade răspunsul inflamator faţă de Salmonella typhimurium. 8. 3. 2. Flora microbiană normală inhibă dezvoltarea bacteriilor patogene prin „efectul de barieră” sau fenomenul de competiţie 102

Într-un organism gazdă sănătos, flora normală realizează un „strat protector” de-a lungul sistemului intestinal. Bacteriile comensale ocupă situsurile de ataşare ale mucoasei şi consumă factorii nutriţionali produşi de enterocite. La rândul lor, celulele intestinale secretă produşi anti-bacterieni, chemokine, citokine şi IgA. (Figura nr. 6) În anumite condiţii, spre exemplu atunci când: - există o cantitate mai mare de tulpini din specii bacteriene patogene; - este urmat un tratament îndelungat cu antibiotice (mai ales dacă au spectru larg); - există factori care deprimă mecanismele de apărare ale gazdei (ex. o stare de imunosupresie, o modificare a tranzitului prin peristaltism scăzut etc.); - se exercită acţiunea unor factori externi (ex. radiaţii, arsuri, substanţe chimice etc.) flora microbiană este afectată, iar bacteriile patogene pot invada mucoasa intestinală. 8. 3. 3. Flora normală intestinală „determină” greutatea fiecărui individ Într-un studiu realizat în anul 2006 pe şoareci „germ-free”, hrăniţi cu alimente bogate în polizaharide, s-a observat că animalele colonizate doar cu Methanobrevibacter smithii şi cu Bacteroides thetaiotaomicron au prezentat o depunere semnificativ mai mare de grăsime în comparaţie cu animalele din alte grupuri de control. S-a demonstrat că: - Bacteroides thetaiotaomicron intervine în dezvoltarea vascularizaţiei intestinale; induce formarea reţelelor capilare şi stimulează absorbţia şi procesarea carbohidraţilor; în timp ce - Methanobrevibacter smithii deţine funcţia unui reglator caloric în intestinul distal şi prin sinergie cu B. thetaiotaomicronstimulează digestia zaharurilor şi creşte absorbţia caloriilor. Mai recent, s-au descoperit numeroase mecanisme prin care flora microbiană normală intervine în reglarea greutăţii corporale şi a depunerilor adipoase. (Figura nr. 7) Primul dintre acestea ar fi influenţarea metabolizării nutrienţilor şi a reglării energetice. S-a demonstrat faptul că bacteriile metabolizează polizaharide nondigerabile transformându-le în produşi digerabili, astfel crescând extracţia energetică. O altă ipoteză stabileşte o legătură între flora normală intestinală şi homeostazia metabolică. O dieta bogată în lipide modulează populaţiile bacteriene dominante la nivel intestinal: cresc bacteriile Gram negative şi scad bifidobacteriile, eubacteriile şi Bacteroides spp. Această modificare determină creşterea nivelului plasmatic al lipopolizaharidelor (LPZ) care induce un răspuns inflamator cronic de mică intensitate la nivelul ficatului, al ţesutului adipos şi al hipotalamusului. Apare o creştere în greutate şi o acumulare excesivă a lipidelor la nivel hepatic. În timp, creşte riscul apariţiei rezistenţei la insulină şi al dezvoltării diabetului zaharat de tip 2. (Figura nr. 8) Un al treilea mecanism este acela prin care flora normală induce reglarea unor gene ale gazdei. Acestea sunt implicate în modularea depozitelor şi a consumului energetic. Aceste descoperiri ar putea să aibă o mare importanţă atât în tratamentul obezităţii cât şi în tratamentul celor subnutriţi. Ar putea explica de ce oameni care consumă aceeaşi cantitate de hrană, prezintă modalităţi diferite de depunere a grăsimilor. Totuşi ar rămâne un semn de întrebare: diferenţele observate în flora normală a pacienţilor obezi este cauza sau consecinţa obezităţii? 8. 3. 4. Fermentarea şi absorbţia polizaharidelor în colonul proximal Corpul uman nu deţine enzimele necesare fermentării polizaharidelor. Flora normală îndeplineşte această funcţie. Prin fermentare zaharolitică, bacteriile produc acizi graşi cu lanţ scurt de carbon şi gaz. 103

Microorganismele florei normale stimulează şi controlează dezvoltarea celulelor intestinale (epiteliale şi ale ţesutului limfoid), prin furnizarea factorilor nutriţionali necesari. Bacteriile previn lezarea mucoasei, aceasta constituind o posibilă funcţie anti-cancerigenă. Acizii graşi cu lanţ scurt de carbon, produşi de floră, au ca efect scăderea pH-ului în lumenul intestinal. Astfel este redus numărul bacteriilor patogene, deoarece acestea au o rezistenţă scăzută la pH acid. Prin fermentarea zaharolitică, flora are o importantă funcţie energetică, creşte reabsorbţia apei, precum şi absorbţia unor nutrienţi (Ca, Mg, Fe). 8. 3. 5. Alte funcţii 8. 3. 5. 1. Fermentarea proteolitică în colonul distal - importanţa dietei reduse în proteine Prin fermentarea proteolitică flora normală intestinală produce o serie de toxine şi substanţe cu posibil rol în carcinogeneză. Cantitatea acestor substanţe este în relaţie directă cu cantitatea de proteine ingerate. 8. 3. 5. 2. Conversia acizilor biliari în cocarcinogeni Bacterii precum Streptococcus faecalis, Veilonella spp. metabolizează prin deconjugare sau hidroliză acizii biliari dezoxicolic şi litocolic, cu producţie de cocarcinogeni. Lactobacillus bifidus blochează acidul colic intracelular şi astfel împiedică formarea de cocarcinogeni. 8. 3. 5. 2. Biosinteza vitaminei K Flora normală produce 50% din necesarul zilnic de vitamină K. Bacteroides fragilis şi Escherichia coli participă la sinteza vitaminei K2. 8. 3. 5. 3. Absorbţia vitaminei B12 A fost dovedit rolul florei intestinale normale în absorbţia de vitamină B12. 8. 3. 6. Flora microbiană normală - partenerul silenţios în manifestarea bolii Boala inflamatorie intestinală (boala Crohn şi colita ulcerativă) reprezintă un exemplu care trebuie luat în discuţie şi aflat în relaţie cu flora intestinală normală. (Figura nr. 9) Boala inflamatorie intestinală include: - boala Crohn, în care procesele inflamatorii apar în principal la nivel intestinal, dar şi la nivelul altor organe. Cel mai frecvent sunt afectate segmentele terminale ale intestinului subţire; în cazul afectării colonice pot apărea fistule şi abcese în regiunea anală. - colita ulcerativă include răspunsul inflamator la nivelul mucoasei ce căptuşeşte interiorul rectului (proctita) sau la nivelul întregului colon (colită ulcerativă). În momentul actual, nu a fost stabilită cu exactitate cauza apariţiei acestei entităţi patologice. Totuşi, s-a observat că există anumiţi factori declanşatori, prezenţi la persoanele afectate: - o predispoziţie genetică; - lipsa alăptării la sân în perioada de sugar şi nou-născut; - „igiena excesivă”în copilărie, cu o insuficientă dezvoltare a răspunsului imun; - excese în consumul de grăsimi animale şi carbohidraţi; - tratament cu antibiotice utilizat frecvent. Se pare că unul dintre elementele de luat în consideraţie ar fi pierderea toleranţei faţă de flora normală intestinală, cu apariţia unui răspuns imun aberant, cu stări de hipersensibilitate şi reacţii autoimune. Apare o permeabilitate intestinală crescută. Compoziţia florei normale este modificată (de ex. specii din genul Clostridium apar în proporţie mai mare faţă de normal), dar nu s-a putut demonstra dacă aceasta determină boala sau dacă este doar un efect al inflamaţiei intestinale. 104

Se pare că există şi o serie de alte boli în care este implicată flora normală, spre ex. neoplazii (digestive sau în afara sistemului digestiv), infecţii produse în alte sisteme după modificarea habitatului (ex. Escherichia coli în momentul în care ajunge la nivelul tractul urinar), obezitate, stări de hipersensibilitate, autism, depresie etc. 8. 3. 7. Farmabioticele Reprezintă orice formă de „exploatare farmaceutică” a florei normale (probiotice, prebiotice, sinbiotice). Probioticele sunt suplimente alimentare care conţin microorganisme vii (bacterii, fungi) cu efecte benefice asupra corpului uman; bacteriile folosite sunt în general cele producătoare de acid lactic (scad pH şi împiedică dezvoltarea bacteriilor patogene). (Figura nr. 7) Genurile utilizate sunt Lactobacillus şi Bacteroides. Prebioticele reprezintă ingrediente alimentare non-digerabile care afectează în mod pozitiv gazda, stimulând în mod selectiv creşterea şi/sau activitatea unei sau a unui număr limitat de bacterii din colon; majoritatea sunt carbohidraţi iar bacteriile stimulate sunt Bifidobacteria sau bacteriile producătoare de acid lactic. Sinbioticele sunt produse care conţin atât probiotice, cât şi prebiotice. Există dovezi ce susţin rolul terapeutic al probioticelor în boala inflamatorie intestinală, infecţii, cancer, artrită.

8. 4. Relaţii microorganism-gazdă Cu o parte din microorganismele întâlnite organismul stabileşte relaţii de simbioză, convieţuirea fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care participă unii coliformi intestinali). Foarte multe din microorganismele care alcătuiesc microflora normală se află în relaţii de comensualism cu organismul, germenii depinzând nutriţional de gazdă, căreia nu îi creează prejudicii. Această convieţuire exprimă însă un echilibru instabil, care poate fi uşor tulburat. Diferiţi factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica aceste relaţii, astfel încât unele microorganisme din flora normală pot manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele condiţionat patogene. Relaţia de parazitism tipic apare însă doar atunci când microorganismele se dezvoltă în detrimentul gazdei, cu manifestări clinice mai mult sau mai puţin evidente. Astfel, în cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta decât în organismul gazdei (de exempluMycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putând trăi şi libere în natură, dar o dată pătrunse în organism stabilesc cu acesta relaţii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).

8. 5. Povestire adevărată Rolul şi importanţa florei microbiene normale a organismului, sunt mai mult decât bine stabilite. Rolul infecţionistului este, ca pe durata tratamentelor cu antibiotice pentru diverse afecţiuni, să afecteze cât mai puţin această floră. O primă idee este utilizarea de antibiotice cu spectru cât mai „ţintit” (îngust), cu efect asupra patogenului respectiv. Pe de altă parte „piatra de încercare” a medicilor, credem, o reprezintă evitarea tratamentelor antibiotice inutile. Câţi dintre medici nu recomandă scheme după scheme de medicamente antistafilococice doar pentru că la exsudatul faringian se izolează un stafilococ, fie el chiar şi „auriu”? Mai toţi. Încercăm „sterilizarea” de acel stafilococ, doar dacă pacientul urmează să primească un transplant (ex. medular sau hepatic) sau dacă va primi un tratament intens imunosupresor, altfel nici nu trebuie căutat! Iar pe 105

de altă parte, rămâne o întrebare pe care o punem tuturor generaţiilor de studenţi cu care lucrăm: în câte dintre cazurile de infecţii stafilococice întâlnite şi raportate în foile de observaţie pe care le vor vedea este menţionat şi testul coagulazei? Însă, revenind la subiectul acestui capitol, nu trebuie să uităm niciodată că utilizarea medicamentelor antibiotice şi chimioterapice, în special a celor cu spectru larg, afectează uneori decisiv flora microbiană normală a cărei utilitate este în momentul de faţă binecunoscută.

8. 6. Ştiaţi că ... ....Gregor Reid, director al Centrului Canadian petru Cercetarea şi Dezvoltarea Probioticelor a afirmat: “Lactobacilul este doar o bacterie. Să spui că un produs conţine lactobacil este ca şi cum ai spune că îl aduci pe George Cloney la o petrecere. Poate fi actorul sau poate fi doar un tip de 85 de ani din Atlanta pe care întâmplător îl cheamă George Cloney. În cazul probioticelor există diferenţe importante între tulpini”? ....atunci când doriţi să achizionaţi produse ce conţin probiotice ar trebui să le căutaţi pe acelea pe a căror etichetă este specificată tulpina conţinută şi care oferă cititorilor acces liber la studiile ştiinţifice de suport? O sursă bună pentru informarea asupra efectelor variatelor tulpini probiotice este www.PubMed.gov. ....puteţi să vă faceţi singuri iaurt cu probiotice? Aveţi nevoie de 1l lapte steril-orice tip, chiar şi de soia, un iaurt-sursa de probiotice şi de un recipient în care doriţi să faceţi iaurtul. Cuptorul se încalzeşte timp de 15 minute la 180 grade, se lasă să se mai răceasca timp de 10 minute. Se aşează în cuptor recipientul şi compoziţia pentru iaurt. Se închide uşa de la cuptor şi se lasă 12 ore, peste noapte. Dacă dimineaţă observaţi că nu a ajuns la consistenţa dorită mai lăsaţi-l în cuptor timp de 12-24 ore.

9. Patogenitate şi Virulenţă 9. 1. Agenţii infecţioşi Agenţii cauzali ai bolilor infecţioase (microorganismele condiţionat patogene, dar mai ales germenii patogeni) sunt foarte numeroşi. Ei se pot împărţi în următoarele grupe mari: - virusuri = agent patogen care se reproduce numai în interiorul celulelor vii şi care provoacă boli infecţioase numite viroze; - chlamydii = bacterii Gram-negative, strict parazite, imobile, care se multiplică în citoplasma celulelor gazdă printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic; - mycoplasme = cele mai mici microorganisme care pot trăi liber în natură şi care se pot dezvolta pe medii artificiale îmbogățite; - rickettsii = microorganisme care au dimensiuni mai mici decât bacteriile; de regulă nu se pot cultiva în afara celulelor vii; - bacterii propriu-zise; 106

- fungi; - protozoare = grup de organisme unicelulare, din grupul protistelor; - metazoare. În ultimii 25-30 de ani se discută din ce în ce mai mult despre rolul jucat de prioni, constituiţi dintr-o particulă de natură proteică având caracter infecţios, lipsită de acid nucleic, cu potenţial patogen destul de subtil exprimat. Prionii rezistă la acţiunea a numeroşi factori fizici şi chimici care inactivează virusurile. Sunt capabili de a se reproduce. Afectează atât oamenii cât şi mamiferele. Sunt implicaţi etiologic în maladii cu evoluţie lentă, precum encefalopatia spongiformă transmisibilă care include spre exemplu boala CreutzfeldtJacob, insomnia fatală familială etc, afecţiuni în care sunt prezente leziuni degenerative la nivelul SNC. Pornindu-se de la encefalopatia spongiformă bovină, începând cu anul 1996 au fost descrise afecţiuni umane, după consumul de carne de vită; maladia poartă numele de „Creutzfeldt-Jacob noua variantă”. Principalele manifestări sunt reprezentate de: depresie, anxietate, alterarea ritmului somn-veghe. La o treime din pacienți, manifestările oculare pot masca demența. Deteriorarea mentală este rapid progresivă, de la descoperirea simptomelor până la deces trecând în medie 7-9 luni. (1) Microorganismul patogen este capabil să colonizeze diferite zone ale gazdei, producând un proces infecţios în primul rând prin invazia şi penetrarea barierelor dermice şi ale mucoaselor, multiplicarea ducând la distrucţia tisulară şi invadarea arborelui limfatic şi vascular (sepsis). Aceste aspecte sunt influenţate în largă măsură de: - factorii de patogenitate ai microorganismului; - factorii de apărare ai gazdei.

9. 2. Patogenitate şi virulenţă. Caracterele de patogenitate ale bacteriilor Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanşa în organismul gazdă fenomene morbide, patogene, modificări locale, generale şi „functio laesa”. Patogenitatea este un atribut de specie şi este determinată genetic. Virulenţa reprezintă gradul diferit de patogenitate exprimat în cadrul unei specii. Este un atribut al tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea în exprimarea patogenităţii depinde de condiţiile în care trăieşte microorganismul respectiv (de exemplu, o populaţie bacteriană care a pierdut virulenţa în condiţii nefavorabile poate redeveni virulentă în anumite condiţii, aşa cum se întâmplă cu tulpina vaccinală BCG la pacienţii cu infecţie HIV / SIDA). Virulenţa poate fi cuantificabilă de ex. prin numărul de microorganisme necesare în condiţii standard pentru a omorî 50% dintr-un grup de animale (acest număr este numit DL50, adică doza letală 50%). Factorii care condiţionează patogenitatea şi virulenţa unei specii (tulpini) microbiene pot fi: - multiplicarea şi invazivitatea manifestată de germenii patogeni; - multiplicarea şi elaborarea de toxine de către germenii toxigeni (în general „exotoxine”).

9. 2. 1. Multiplicarea şi invazivitatea Germenii patogeni se multiplică la poarta de intrare şi invadează organismul prin formarea de abcese şi prin propagarea din aproape în aproape în „pată de ulei”, dar pot trece şi direct în circulaţia generală. În acest caz produc infecţii la distanţă. Pentru a avea loc această succesiune a evenimentelor, germenii trebuie să 107

poată rezista reacţiilor de apărare nespecifică a gazdei (de exemplu fagocitozei) şi să poată adera de celulele mucoaselor (prin adezine) sau de anexele dermului. Există o aderenţă nespecifică, de fapt un proces chimic şi fizic, reversibil, cu implicarea atracţiei hidrofobe, electrostatice dar şi a mişcării browniene şi a existenţei biofilmului de polimeri. Aderenţa specifică poate fi la rândul său reversibilă dar, dacă implică suficient de mulţi factori (structurali, diferite forţe de legătură), poate deveni ireversibilă. Biofilmul include populaţii bacteriene aparţinând uneia sau mai multor specii, înconjurate de polimeri extracelulari (EPS -extracellular polymeric substances). Microorganismele aderă între ele, dar şi la suprafeţe, formându-se o structură asemănătoare unui sistem circulator ce permite accesul nutrienţilor şi eliminarea substanţelor reziduale, precum şi comunicarea interbacteriană. Dezvoltarea biofilmului cuprinde 5 etape (Figura nr. 1): · ataşarea reversibilă, · ataşarea ireversibilă, · maturarea 1, · maturarea 2 şi · dispersia. Industrial, biofilmele sunt responsabile de ancrasarea rezervoarelor de stocare şi de înfundarea conductelor de apă. Din punct de vedere medical, se pot observa în cazul endocarditei (pe valve), otitei medii, plăcii dentare şi pot reprezenta o problemă pentru pacienţii cu fibroză chistică. Biofilmele se dezvoltă şi pe implanturi sintetice cum ar fi: catetere intravasculare, valve, pacemakere, instrumente ortopedice, lentile de contact etc. O caracteristică foarte importantă a biofilmelor este reprezentată de rezistenţa crescută la antibiotice, de până la 500 de ori mai mare. Responsabile de aceasta sunt atât EPS, care acţionează ca o barieră sau care pot chiar inactiva antibioticele, cât şi faptul că în cadrul biofilmului bacteriile cresc mult mai greu, astfel încât o activitate metabolică scăzută va conduce la o asimilarea mai lentă a antibioticelor. Dintre bacteriile implicate în producerea de biofilme amintim: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, streptococi α şi β hemolitici etc. (2) Poate fi luat în discuţie şi „tropismul”, care poate fi specific pentru anumite structuri ale gazdei [ex. tulpinile de E. coliuropatogene aderă cu ajutorul unei adezine papG (pyelonephritis-associated pili), numai la anumiţi receptori situaţi la suprafaţa celulelor epiteliale renale] sau ar putea fi specific de specie (de ex. streptococul piogen din grupul A, meningococul sau gonococul infectează numai gazda umană). 9. 2. 1. 1. Factori somatici care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor - pilii comuni (fimbriile), cu rol în aderare. Bacteriile pot produce unul sau mai multe tipuri de pili, astfel că cele care produc pili specifici, vor fi asociate cu capacitatea de a infecta un anumit tip de ţesut. De exemplu, E. coli uropatogenă prezintă pili de tip P sau Pap, având tropism pentru tractul urinar. (3) - lectinele (proteine care au tropism pentru carbohidraţi); - liganzii (molecule care realizează legături specifice cu anumite molecule complementare de la nivelul substratului); - glicocalixul (componentă structurală externă a polizaharidului de la suprafaţa celulei bacteriene); - „noroiul” (un mediu vâscos peribacterian, constând dintr-o subclasă de substanţe polimerice extracelulare ce conţin în general polizaharide şi mediază ataşarea nespecifică a bacteriilor într-un strat vâscos); 108

- capsula (are proprietăţi antifagocitare şi uneori este implicată în aderare, spre ex. în cazul Streptococcus mutans, cu efecte cario-genetice); - adezinele (de fapt, toţi factorii enumeraţi mai sus pot fi definiţi drept „adezine”); - substanţe componente ale peretelui bacterian - proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A (Figura nr. 2); Proteina M este un dimer ancorat în membrana citoplasmatică, ce va proemina la suprafaţa peretelui bacterian, măsurând de la acest nivel 50-60 nm. Aceasta are rolul de a împiedica fagocitoza sau opsonizarea de către PMN, în lipsa anticorpilor specifici; anticorpii se vor lega la capătul variabil N-terminal al dimerilor. - antigenul Vi de suprafaţă al unor bacili Gram-negativi (de exemplu, Salmonella typhi etc). Antigenul Vi este un polizaharid capsular ce are capacitatea de a împiedica acţiunea anticorpilor, are proprietăţi antifagocitare şi creşte rezistenţa la peroxid. Serotipurile care prezintă acest antigen sunt: Typhi, Paratyphi C şi Dublin. Unele tulpini de Citrobacter freundii produc un compus asociat bacteriei identic cu Vi al primelor două serotipuri, fiind sursa ideală de antigen Vi, necesar preparării antiserului. - polizaharidul A al S. aureus (un acid teichoic); - antigenul O al bacteriilor Gram-negative (Figura nr. 3); Antigenul O face parte din lipopolizaharid/lipooligozaharid (LPZ/LOZ), structură ce are rolul de a proteja bacteria de enzime ce au capacitatea de a degrada peptidoglicanul (de exemplu, lizozimul) şi oferă rezistenţă împotriva sărurilor biliare, complementului (diminuând activitatea MAC – membrane attack complex) şi fagocitozei; prezintă şi activitate mitogenă, stimulând diferenţierea policlonală şi multiplicarea limfocitelor B, determinând astfel secreţia de imunoglobuline, precum IgM şi IgG. LPZ cuprinde 3 regiuni: lipidul A (regiunea I), o porţiune centrala rugoasă polizaharidică (regiunea II) şi polizaharidul O / antigenul O (regiunea III). - antigenele de tip K (cu structură polizaharidică sau polipeptidică - pentru Bacillus anthracis) etc. În ceea ce priveşte procesul aderenţei, se cunoaşte faptul că orice obiect aflat în imersie atrage particulele suspendate, inclusiv microorganismele, la suprafaţa lui. Teoria coloidală DLVO (după numele autorilor) menţionează că la nivelul suprafeţei de imersie există 2 poziţii de stabilitate termodinamică, prin intervenţia gravitaţiei, chemotaxiei, forţelor de tip van der Waals, forţelor electrostatice şi tensiunii superficiale (Schema nr. 1). Contrabalansarea forţelor de atracţie şi repulsie conduce la împingerea dezordonată a particulelor spre un „minim secundar”, poziţie ce se situează la suprafaţa de imersie. Acest „minim secundar” corespunde fenomenului de adsorbţie sau reţinere (docking), proces reversibil. Ulterior sunt implicate şi alte forţe de legătură (covalente, de hidrogen, ionice, hidrofobe) care vor duce la atingerea „minimumului primar”, când particulele devin legate ireversibil de substrat. Aderenţa se produce atunci când particulele părăsesc „minimumul secundar” şi intră în „minimumul primar”. Pentru unele bacterii (ex. V. cholerae, unele tulpini de E. coli, B. pertussis, Helicobacter pylori) ataşarea este destinaţia finală, în timp ce pentru altele (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia) reprezintă doar o etapă, urmând penetrarea tisulară şi / sau diseminarea în organism. 9. 2. 1. 2. Factori solubili care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor (agresine) (Tabelul nr. 1) - coagulaza liberă şi/sau legată a S. aureus care transformă fibrinogenul în fibrină şi pe de o parte poate „masca” bacteria înconjurată de structuri asemănătoare cu ale gazdei, pe de altă parte poate preveni fagocitarea sau chiar împiedica ajungerea antibioticelor şi chimioterapicelor la sediul infecţiei; - leucocidina secretată după ce stafilococul a fost fagocitat şi care transformă leucocitul în piocit (se inseră în membrana leucocitului şi produce pori sau degradează enzimatic fosfolipidele de la nivelul membranei); 109

- producerea unor substanţe care cresc concentraţia intracelulară de AMPc până la concentraţii ce inhibă fuzionarea fagozom-lizozom (de exemplu la Mycobacterium tuberculosis); - producerea de catalază (de exemplu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium fortuitum), glutation peroxidază, superoxid dismutază, citocrom oxidază (Vibrio spp., Pseudomonas aeruginosa, Neisseria spp.) care inhibă sau inactivează radicalii activi de oxigen; - producerea unor factori care conferă rezistenţă la enzimele lizozomale, după fuzionarea fagozom-lizozom (Salmonella enteritidis, Mycobacterium leprae etc); - producerea de enzime litice: 1. colagenaza (este produsă de Clostridium histolyticum şi Clostridium perfringens şi distruge colagenul prezent în muşchi facilitând răspândirea procesului infecțios), hialuronidaza (scindează acidul hialuronic, o componentă a ţesutului conjunctiv), fibrinolizina (determină liza cheagului prin convertirea plasminogenului în plasmină) etc (streptococ, stafilococ, unele clostridii); 2. lecitinaza (distruge lecitina din structura membranei celulare, de exemplu Clostridium perfringens, Bacillus anthracis); 3. fosfolipaza (toxina a) (realizează hidroliza fosfolipidelor din membrana celulară, prin îndepărtarea capetelor polare, de exemplu Clostridium perfringens); 4. neuraminidaze (degradează acidul sialic, de exemplu V. cholerae, Shigella dysenteriae); 5. proteaze, nucleaze ( DN-aze, RN-aze – cu activitate endo- şi exonucleazică asupra ADN şi ARN, generând 3’-nucleotide), carbohidraze, lipaze etc; 6. hemolizine sunt enzime ce lizează hematiile din mediile de cultură cu sânge (streptococ, stafilococ, unele clostridii) etc. - producerea unor substanţe care inhibă sau modifică răspunsul imun 1. IgA proteaza (clivează IgA în regiunea balama, de exemplu gonococ, meningococ, H. influenzae); 2. proteina A stafilococică (inhibă opsonizarea); 3. endotoxina care creşte sinteza de IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α etc; 4. inducerea apariţiei unor reacţii autoimune; 5. producerea superantigenelor (de exemplu S. aureus prin producerea toxinei implicată în sindromul de şoc toxic, TSST-1), molecule care pot activa independent celulele T4 (sunt printre cei mai puternici mitogeni ai limfocitelor T); stimularea datorată lor poate determina atât anergie, cât şi hiperactivarea sistemului imun. (Figura nr. 4) Rezultă o secreţie în exces de IL-2 care interferă cu sinteza altor citokine (TNF-α, IL-1, IL-8 etc). Alte exemple de superantigene ar fi: toxina pirogenică streptococică (produsă de tulpinile lizogenizate), enterotoxinele stafilococice (S. aureus), subtanţe cu efecte asemănătoare hormonilor (ex. toxina stabilă termic produsă de E. coli enterotoxigen) etc. Fiecare din substanţele de mai sus are un rol bine definit în evoluţia reacţiei inflamatorii locale.

9. 2. 2. Multiplicare şi toxinogeneză Germenii se multiplică la poarta de intrare şi elaborează exotoxine care produc alterări celulare şi distrucţii tisulare la distanţă, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote şi prin „functio laesa” („toxikon” era otrava în care erau înmuiate săgeţile luptătorilor greci). Din punct de vedere didactic trebuie menţionate următoarele noţiuni: 9. 2. 2. 1. Exotoxinele 110

Exotoxinele sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi lizogenizaţi (de exemplu bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar şi de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2) Au structură proteică, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legării de receptorii celulei gazdă şi internalizării ulterioare a porţiuni enzimatice A (active). Exotoxina nu îşi exercită efectele toxice decât după ce porţiunea A este eliberată din structura iniţială. Sunt secretate în timpul vieţii germenilor. Sunt difuzibile la distanţă. Toxicitatea lor este foarte mare, doza letală fiind de circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg corp în cazul toxinei botulinice). Au afinitate diferită în funcţie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC, rinichi în cazul bacilului difteric). Manifestările clinice apar după o perioadă de latenţă (când toxina este deja fixată pe celulele ţintă). Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecţii şi reprezintă urgenţe medicale, toxina putând fi neutralizată numai dacă este liberă în circulaţie. Au putere antigenică mare, faţă de ele apărând anticorpi antitoxină. Un alt exemplu important privind exotoxinele se referă la Tcd A şi Tcd B, produse de Clostridium difficile și care acţionează asupra celulelor intestinului gros, fiind responsabile de o boală diareică uşoară, până la colită fulminantă. Ele produc la acest nivel leziuni microscopice, dar şi leziuni mari, asemănătoare unor plăgi; endoscopic, se vor identifica noduli. Prin degradarea proteinelor Rho, Rac şi Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor structurale dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic alterarea microfilamentelor de actină, rezultând marginalizarea nucleului, schimbări în morfologia citoscheletului, dar şi alte modificări (alterarea suprafeţei celulare şi rearanjarea microvililor). (Figura nr. 5) Astfel, modificările produse de toxinele Tcd A şi Tcd B sunt: inflamaţia, creşterea permeabilităţii ţesutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine şi citokine, acumularea de neutrofile, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea mastocitelor, producerea substanţei P, distrugerea directă a mucoasei intestinale, ruperea joncţiunilor strânse (Zonula occludens), degradarea actinei F. Substanţa P este responsabilă de: activarea neuronilor din submucoasă, eliberarea TNF-α, activarea macrofagelor din lamina propria; este implicată în diareea inflamatorie. 9. 2. 2. 2. Antitoxinele Având structură proteică, exotoxinele sunt imunogene şi determină apariţia de anticorpi specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxică prin cuplare specifică cu toxina. (Tabelul nr. 3) Se pot obţine astfel seruri imune utile în seroterapia specifică. De regulă aceste seruri sunt preparate pe cal şi sunt utile în neutralizarea exotoxinelor (ex. în tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului). Administrarea antitoxinelor trebuie făcută cu precauţie datorită faptului că anticorpii preparaţi pe cal reprezintă în acelaşi timp şi antigene pentru gazda umană, dar în acelaşi timp cât mai curând posibil. Tratamentul acestor entităţi clinice este complex şi nu reprezintă subiectul acestui manual. Administrarea antitoxinelor trebuie făcută după o testare a unei eventuale hipersensibilităţi şi în cazul că aceasta există se recurge la desensibilizare şi abia ulterior la seroterapie (administrarea de antitoxină). O alternativă ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dacă acestea sunt disponibile. 9. 2. 2. 3. Anatoxinele 111

Exotoxinele pot fi detoxifiate într-un anumit interval de timp sub acţiunea conjugată a temperaturii şi formolului. Prin acest procedeu îşi pierd puterea toxică, dar îşi menţin puterea imunogenă şi devin anatoxine. Anatoxinele se utilizează în profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (în cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum şi pentru hiperimunizarea animalelor în scopul obţinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc). 9. 2. 2. 4. Endotoxinele Endotoxinele au fost evidenţiate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt elaborate de aceştia şi apoi incluse în peretele bacterian, eliberându-se în urma distrugerii germenilor. Au structură lipopolizaharidică (LPZ sau LOZ), în constituţia lor intrând acizi graşi, un lipid A şi lanţuri de polizaharide. (Figura nr. 6) Au efecte toxice la nivelul celulelor majorităţii mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de specia bacteriană care le eliberează. Toxicitatea lor este ceva mai redusă (în comparaţie cu exotoxinele), dar pot acţiona la mai multe nivele inducând apariţia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilităţii vasculare, hipotensiunii arteriale până la colaps, sindromului de coagulare intravasculară diseminată etc. Sunt implicate între altele în apariţia şocului endotoxic (se eliberează o cantitate de endotoxină proporţională cu numărul germenilor distruşi). Studiile arată că mortalitatea în şocul endotoxic este în relaţie destul de directă cu cantitatea de endotoxină / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identifică 100 unităţi endotoxină / ml de plasmă. Aşa cum am menţionat în capitolul privind structura bacteriană, componenta toxică este reprezentată de lipidul A; totuşi, şi polizaharidul O (structură antigenică) contribuie la patogenitate – s-a dovedit că bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uşor distruse prin mecanisme care implică sistemul complement. LPZ aflat în circulaţie se cuplează cu proteine plasmatice (LPS-binding plasma proteins) şi apoi este recunoscut prin intermediul receptorilor CD14 de către monocite şi macrofage. Se activează răspunsul inflamator, coagularea intravasculară, apariţia de hemoragii şi în final poate rezulta şocul. Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 şi TNF-α care la rândul lor stimulează „cutia Pandorei” şi respectiv producţia de leucotriene şi prostaglandine (cu efect de creştere a fenomenelor inflamaţiei). Sunt activate atât sistemele de coagulare cât şi sistemul complement iar cascadele de reacţii care apar sunt rareori reversibile în urma tratamentului. Puterea antigenică şi imunogenă este mai redusă faţă de exotoxine. LPZ în calitate de mitogen stimulează o activare policlonală a LB, cu secreţia de IgG şi IgM. În afara LPZ sau LOZ, mai sunt şi alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive: - delta endotoxina prezentă la Bacillus thuringiensis, toxină care nu afectează omul, deoarece acesta nu prezintă enzime şi receptori care să o proceseze; - Listeria monocytogenes produce o substanţă “endotoxin-like” etc.

9. 3. Apărarea organismului faţă de infecţii Apărarea organismului faţă de infecţii se realizează prin diferite mijloace nespecifice şi specifice. Acestea exprimă împreună capacitatea normală de păstrare a homeostaziei organismului prin rezistenţa faţă de aderarea microorganismelor de celulele ţesuturilor expuse, faţă de colonizarea şi multiplicarea germenilor în organism, prevenind invazia agenţilor patogeni. Principalele componente ale apărării antiinfecţioase sunt reprezentate de: 9.3.1. bariera anatomică cutaneo-mucoasă, care acţionează prin: 112

- Integritatea sa anatomică: Pielea este o barieră în fața invaziei microorganismelor deoarece este formată din straturi de celule strâns unite între ele, dar şi datorită stratului de keratină. Descuamarea continuă a straturilor pielii are rol în eliminarea microorganismelor. În general bacteriile nu pot penetra pielea. Procesul infecțios poate debuta în urma unor traumatisme, intervenţii chirurgicale, utilizarea de catetere iv, intervenției unor vectori. (3) - Sinteza unor peptide cu rol dezinfectant: dermicidină, β-defensină. Acestea au şi rol de chemokine, favorizând migrarea celulelor cu rol în fagocitoză. - Mucoasele sunt umede şi deţin mai multe bacterii decât pielea. Majoritatea celulelor epiteliale secretă aceleaşi peptide ca şi cele ale pielii. În plus conţin salivă, mucus, lacrimi, cu rol antimicrobian. Lacrimile au rol protector şi prin conţinutul crescut de lizozim. - Prezenţa de: · IgA secretorii (sunt secretate IgA şi IgG cu rol în aglutinarea, dar şi blocarea competitivă a receptorilor celulelor. Cantitatea de IgA la nivelul fluidelor mucoaselor este mai mare decât IgG datorită rezistenţei acesteia la proteoliză prin cuplarea cu un polipeptid. IgA se poate lega de bacteriile patogene intracelulare împiedicând pătrunderea acestora în celule.), · lactoferină (proteină cu rol în legarea fierului. Fierul este un element important pentru supravieţuirea bacteriilor. Cu toate acestea, bacteriile care colonizează pielea şi mucoasele au mecanisme de achiziționare a fierului chiar în prezenţa acestor proteine), · alfa 1 antitripsină, lizozim (joacă unul din rolurile cele mai importante, având efect antimicrobian asupra bacteriilor gram pozitive prin hidroliza aminoacizilor din componenţa peptidoglicanilor) etc.; - pH-ul acid al unor secreţii locale: pH-ul acid şi flora bacteriană au rol în inhibarea invaziei bacteriilor patogene. Zonele inflamate au susceptibilitate crescută la colonizare. - Prezenţa microflorei normale, ce constituie nişa ecologică pe care germenii nou veniţi tind să o ocupe. Flora comensală este un ecosistem cu rol în apărarea împotriva invaziei microorganismelor patogene. Mecanismele competitive sunt: competiţia pentru aceleaşi substanțe nutritive, competiţia pentru aceiasi receptori. Secretă şi bacteriocine, fiind toxice pentru alte bacterii, dar de obicei din aceeaşi specie, acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi toxici. 9.3.2. barierele de organ - Bariera hematoencefalică: este o barieră fiziologică între sistemul sangvin și sistemul nervos central (SNC). Aceasta servește la menținerea unei homeostazii constante în SNC. Această barieră are rolul de filtru, împiedicând pătrunderea în creier a unor substanțe toxice, germeni patogeni, care se pot afla în sânge. În același timp bariera permite pătrunderea din sânge a substanțelor nutritive necesare SNC. - Tractul respirator: particulele inhalate pot supravieţui filtrării în tractul respirator superior şi traheobronșic. Fluxul turbulent determină depunerea particulelor de dimensiuni mari la nivelul mucusului tractului respirator, iar sistemul mucociliar le îndepartează din plămani. Efortul de tuse ajută la eliminare. Secreţiile bronşice conţin substanţe precum: lizozim, β-defensine, lectine. Când particulele inhalate ajung la nivelul alveolelor îndepărtarea este realizată de macrofage şi histiocite. Toate aceste mecanisme de apărare pot fi învinse de microorganisme prin cantitatea acestora sau prin expunere îndelungată. Poluarea aerului, prezenţa traheostomei, agenţii ”alergici”, defectele genetice etc. pot diminua mecanismele de apărare ale tractului respirator. 113

- Tubul digestiv: Bariera acestuia este reprezentată de aciditatea gastrică şi rolul antibacterian al diferitelor enzime (pancreatice, intestinale, biliare). Peristaltismul şi descuamarea celulelor epiteliale au şi ele rol în apărarea antimicrobiană.Salmonella spp. şi M. tuberculosis produc infecţii la persoanele cu aclorhidrie, iar peristaltismul încetinit favorizează infecţia cuShigella spp. Pierderea joncţiunilor strânse dintre enterocite poate favoriza translocarea bacteriilor în circulaţie. - Tractul genitourinar: urina este în mod normal sterilă. Factorii care împiedică colonizarea bacterienă sunt pH-ul, ureea, hipertonicitatea, glicoproteina Tamm-Horsfall (produsă de rinichi şi excretată în cantitate mare în urină). Glicoproteina Tamm-Horsfall acţionează ca un burete, bacteriile leagându-se de aceasta şi astfel împiedicând colonizarea ţesuturilor. Tractul urinar inferior este spălat de fluxul urinar de 4-8 ori pe zi, eliminând organismele patogene. Retenţia urinară este una dintre principalele cauze ale infecţiilor urinare. 9.3.3. ganglionii limfatici de pe traiectul vaselor limfatice; Link Capitolul 10 9.3.4. sistemul fagocitar: Fagocitoza este mecanismul de înglobare şi distrugere a microorganismelor de către celulele dendritice, PMN, macrofage etc. Macrofagele se găsesc în toate ţesuturile corpului, iar celulele PMN şi monocitele circulă prin sânge şi sistemul limfatic. Chemokinele au rol în iniţierea migrării celulelor fagocitare spre ţesuturi, având rol în inflamaţie. Când o bacterie este internalizată într-un fagozom, este distrusă de radicalii de oxigen, şi de diverse peptide. Microorganismele sunt digerate, iar peptidele se cuplează cu moleculele complexului major de histocompatibilitate, fiind ulterior prezentate limfocitelor T, determinând multiplicarea acestora şi activarea răspunsului imun celular şi umoral. Fagocitoza este mai eficientă în spaţiile intratisulare înguste (alveolele pulmonare), decât la nivelul suprafeţelor întinse (sinovială) sau în sânge. Opsonizarea favorizează fagocitoza. 9.3.5. sistemul complement; Link Capitolul 15 (Sistemul complement) 9.3.6. citokinele: Link Capitolul 13 (Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi) - interferonii (alfa, beta, gamma); - interleukinele; - colony-stimulating factor (CSF); - citolizinele-factorul de necroză al tumorilor (TNF) alfa şi beta; - poliperforinele; - factorii de creştere, de exemplu transforming growth factor (TGF) alfa şi beta; - factorii supresori şi inhibitori ai multiplicării. 9.3.7. sistemul imun (umoral şi celular); 9.3.8. alţi factori: - complexul major de histocompatibilitate (MHC); Link Capitolul 12 - imunitatea de specie (naturală, înnăscută); - factorii nutriţionali (vitamine, fier, zinc etc): Scăderea fierului seric poate fi rezultatul răspunsului inflamator. Bacteriile necesită fier pentru creștere. Transferina are rol în legarea fierului şi transportarea sa în macrofage, scăzând astfel, cantitatea de fier pe care o pot folosi bacteriile. Nivelul de zinc scade în timpul inflamaţiei. Acesta grăbeşte vindecarea rănilor, are rol în sinteza proteică şi creşte responsivitatea limfocitelor. Persoanele malnutrite sunt predispuse la infecţii severe. Cele mai importante vitamine (din acest punct de vedere) sunt vitaminele A şi D. Anecdotic, anterior descoperirii ”tuberculostaticelor”, tuberculoza se trata prin dietă; pacientul consuma până la 30 de ouă zilnic. 114

- factorii endocrini: vasopresina, insulina, glucagonul cresc cantitativ. Catabolismul proteic produce aminoacizi care ulterior vor fi folosiţi la sinteza celulelor de apărare şi a proteinelor. Estrogenii au rol în protecţie la nivel vaginal. Activitatea limfocitelor T este inhibată în timpul sarcinii, astfel pot apărea infecţii severe cauzate de virusul poliomielitei, streptococii β hemolitici de grup A, N. gonorrhoeae mai ales până în trimestrul al III-lea de sarcină. - factori genetici: Susceptibilitatea, mortalitatea şi morbiditatea legate de infecţie sunt influenţate de bagajul genetic. Cauzele pentru această susceptibilitate crescută sunt polimorfismul genetic, defecte ale componentelor complementului, citokinelor, chemokinelor sau ale receptorilor acestora. - stresul: Stresul creşte susceptibilitatea organismului la infecţii. - sistemul nervos central.

9. 4. Povestiri adevărate 9. 4. 1. LPZ și CID Coagulare intravasculară diseminată în cadrul unei enterocolite ulceronecrotice la un prematur cu nutriţie parenterală totală (Punct de plecare: LPZ-ul germenilor Gram-negativi) În primăvara anului 2007, într-o maternitate din Bucureşti s-a născut pe cale naturală un prematur cu vârsta de gestaţie de 30 săptămâni şi greutate de 1.600 g, cu scorul Apgar 7 (la 5 minute de la naştere). Mama copilului a prezentat în cursul sarcinii infecţii urinare recidivante cu Escherichia coli. Cu circa 12-14 ore înainte de naştere a avut loc ruperea prematură a membranelor (travaliul cu membrane rupte peste 12 ore implică riscul producerii de infecţii). Prematurul a prezentat de la naştere o detresă respiratorie, pentru care a necesitat ventilaţie cu presiune pozitivă continuă şi nutriţie parenterală totală (având, în plus, intoleranţă digestivă). Nutriţia parenterală continuă a presupus cateterizarea venoasă centrală a copilului. Întrucât această cateterizare, asociată cu ventilaţia asistată cresc riscul infecţios al nou-născutului, s-a instituit antibioterapia empirică de protecţie cu ampicilină şi gentamicină. Evoluţia copilului a fost iniţial favorabilă timp de o săptămână, pentru ca ulterior acesta să dezvolte o patologie digestivă manifestată prin abdomen meteorizat (mărit de volum), vărsături bilioase şi scaune sanguinolente, asociate cu febră (39°C). S-a pus diagnosticul clinic şi radiologic de enterocolită ulceronecrotică (necroză intestinală de etiologie incertă) şi sepsis neonatal. Testele de laborator efectuate (procalcitonină, proteina C reactivă) au fost intens pozitive. Culturile din aspiratul gastric şi materii fecale au evidenţiat prezenţa E. coli. Hemocultura a fost negativă, ceea ce nu este surprinzător în contextul în care nou-născutul a primit tratament cu antibiotice anterior recoltării probelor. Pe parcursul următoarelor zile, copilul a dezvoltat simptome clinice şi paraclinice de CID (coagulare intravasculară diseminată): sângerări la locurile de injectare, hemoragie pulmonară, trombocitopenie, timp parţial de tromboplastină şi timp de protrombină crescute, hipofibrinogenemie, prezenţa în cantitate mare a produşilor de degradare ai fibrinei). S-a instituit terapia de urgenţă cu imipenem şi gentamicină (la care E. coli se dovedise a fi sensibil), cu plasmă proaspăt congelată şi cu concentrat trombocitar. Starea copilului nu sa ameliorat sub tratament, hemoragia pulmonară agravându-se. S-a efectuat, ca ultimă alternativă, o transfuzie de sânge izogrup şi s-a recurs la ventilaţie asistată în sistem IPPV – Intermittent Positive Pressure

115

Ventilation. Evoluţia copilului a fost în continuare nefavorabilă, hemoragia pulmonară continuând să se agraveze şi ducând în final la stop cardiorespirator ireversibil la manevrele de resuscitare. Nou-născutul a decedat după 10 zile din cauza sindromului de CID. Discuţii Sursa infecţiei cu E. coli nu a putut fi precizată cu certitudine (medicii au suspicionat, totuşi, ca sursă cea mai probabilă, lichidul amniotic infectat al mamei). Detresa respiratorie, ventilaţia asistată şi cateterizarea venoasă centrală au constituit factori de risc major în producerea enterocolitei ulceronecrotice. Necroza ţesutului intestinal a favorizat diseminarea pe cale sanguină a E. coli existent la acel nivel. Astfel, s-a instalat sepsisul neonatal, care s-a complicat ulterior cu CID. Complexitatea cazului, prin multitudinea complicaţiilor apărute, a fost un factor de gravitate care a condus în final la decesul copilului. 9. 4. 2. Infecțiile cu Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent la pacienții transplantați renal Tânăr de 32 ani, afro-american, cu hipertensiune și diabet zaharat tip 1, transplantat renal în urmă cu 28 luni se internează pentru febră, durere în flancul stâng, și o scădere în greutate de peste 10 kg în ultima lună. De aproximativ 6 luni pacientul acuză dureri intermitente în flancul stâng. În ultimul an, pacientul a avut multiple episoade de furunculoză și celulită fesieră. Culturile efectuate evidențiază un Stafilococ auriu meticilino-rezistent, cu următoarele rezultate la antibigramă: rezistent la oxacilină, eritromicină, dar sensibil la vancomicină, biseptol, tetraciclină, rifampicină, linezolid. Leziunile au fost incizate și drenate, iar apoi a primit tratament cu cefalexin, augmentin, biseptol și a efectuat decolonizarea nazală cu mupirocin. (4) În cursul anamnezei, pacientul relatează raporturi sexuale cu persoane de același sex și i se efectuează serologia HIV, rezultatul fiind negativ. Cura posttransplant a fost efectuată fără complicații cu tacrolimus, micofenolat mofetil și prednison. La examenul obiectiv: temperatura 36,9˚C, puls 74/min, TA 100/68 mmHg, frecvența respiratorie 19/min. Analizele de laborator evidențiază o leucocitoză (20.200 cel/mm3) cu neutrofilie, VSH de 107 mm/h, Proteina C reactivă 21,5 mg/dl, creatinina 1,8 mg/dl. Examenul CT abdomino-pelvin evidențiază un abces la nivelul iliopsoasului de 6,6 pe 8,5 cm, iar pe IRM-ul de coloană lombară se observă osteomielită la nivelul corpului vertebral L5 și a procesului stâng transvers. Abcesul a fost drenat, iar în culturi a crescut Staphylococcus aureus meticilino-rezistent. Culturile în anaerobioză au fost negative. Hemoculturile nu s-au pozitivat. A efectuat 6 săptămani tratament parenteral cu vancomicină, urmată 2 săptămâni de tratament cu linezolid per os datorită dorinței pacientului de a merge la muncă. A primit apoi Biseptol încă 8 săptămâni. După terminarea tratamentului VSH-ul a scăzut la 14 mm/h, cu o Proteină C Reactivă 0,7 mg/dl. La 6 luni nu s-au înregistrat recăderi. În afară de identificare bacteriei și antibiogramă s-a efectuat și latex aglutinare pentru evidențierea PB2 (protein binding 2). Cu ajutorul tehnicii PCR a fost detectată fracțiunea genică responsabilă de sinteza leucocidinei Panton-Valentine. (5) Discuţii: Infecțiile reprezintă complicațiile cele mai frecvente la pacienții transplantați. Infecțiile cu Stafilococ auriu meticilino-rezistent sunt predominant infecții intraspitalicești și au devenit o problemă de sănătate publică. (6) Un alt factor de risc important pentru infecția cu Stafilococ este și diabetul zaharat. 116

Leucocidina Panton–Valentine este un factor solubil, care permit multiplicarea şi invazivitatea stafilococului. Determină liza polimorfonuclearelor și monocitelor. Este considerată un factor de virulență, care determină creșterea severității bolii atât în afecțiunile cutanate, cât și în osteomielită sau pneumonii necrotizante.

9. 5. Evaluarea cunoștințelor 1. Prionii sunt constituiţi din: A. ADN-înveliş proteic B. ARN-înveliş proteic C. o particulă proteică D. miez glucidic + înveliş proteic 2. A. B. C. D.

Lactoferina are capacitatea de legare a: fierului zincului cuprului magneziului

3. Biofilmul: A. reprezintă o populaţie bacteriană aparținând unei specii B. cuprinde bacterii ce aderă doar între ele C. se poate dezvolta pe un cord transplantat D. cuprinde bacterii sensibile la penicilină E. cuprinde bacterii și polimeri extracelulari 4. Sunt factori solubili care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor: A. coagulaza, glicocalixul, capsula B. superoxid dismutaza, proteina M, antigenul Vi C. leucocidina, catalaza, hemolizine D. antigenul K, pilii, capsula 5. Una dintre următoarele reprezintă o substanţă ce modifică răspunsul imun: A. neuramidaza B. Ig A proteaza C. pilii D. “noroiul”

Noţiuni de imunologie Imunologia este o ştiinţă care a apărut relativ recent, iniţial ca un domeniu al Microbiologiei, studiind mecanismele de apărare a organismelor (uman şi animal) faţă de agresiunea din cursul procesului infecţios. În Imperiul Roman „immunitas” însemna scutirea de anumite obligaţii. 117

În primul secol după Iisus Christos, descriind rezistenţa la veninul unor şerpi veninoşi, Lucanus a considerat că „immunitas” înseamnă „scutit de a te îmbolnăvi”. Observaţiile medicului englez Edward Jenner privind faptul că o parte dintre persoanele care mulgeau vacile nu s-au îmbolnăvit în cursul epidemiei de variolă, dar şi faptul că pustulele care apăreau pe ugerul vacilor, ca şi pe tegumentul mâinii persoanelor care mulgeau se asemănau, au dus la concluzia că între aceste fenomene există o legătură. În 1796, Jenner a realizat una dintre primele experienţe pe om (a inoculat secreţie din pustulele de la vaci la un copil; ulterior a inoculat secreţie de la pacienţi cu variolă, iar copilul se pare că nu s-a îmbolnăvit de variolă). Cu toate acestea, reacţiile în „mass-media” vremii nu au întârziat să apară. (Figura nr. 1) –vacile din poza de la RM Imunologia a fost fundamentată de studiile realizate de către marii cercetători Pasteur şi Metchnikoff. Louis Pasteur a „vaccinat” găini împotriva holerei aviare, a „vaccinat” oi împotriva antraxului şi a reuşit prevenirea infecţiei cu virusul rabic. Pasteur a decis să denumească procedeul de inoculare cu germeni atenuaţi, urmat de protecţia faţă de boală, vaccinare(probabil pentru că Jenner a obţinut primele sale rezultate recoltând şi inoculând produsul obţinut de la vaci). Ilia Metchinikoff a descoperit fagocitoza. Emil von Behring şi S. Kitasato au studiat fenomenul prin care se obţin antitoxinele şi ulterior au realizat experimentele care au stat la baza seroterapiei. Despre hipersensibilitate a început să se discute în 1902, iar termenul de histocompatibilitate este cunoscut din 1946. Aceste studii şi multe altele, care ar merita dedicarea unui volum întreg, mult amplificate în deceniile care au urmat sunt mai departe „în continuă mişcare”, cu numeroase descoperiri chiar şi în prezent. Relaţia între organismul gazdă şi sistemul imun (organe, celule, anticorpi, citokine etc) ar putea fi asemănată cu relaţia stabilită între o ţară şi armata ţării respective, cu sisteme de control, sisteme de comandă, reacţii „la nevoie” (uneori în „regim de urgenţă”) în care există implicare importantă şi din partea altor sisteme (nervos, endocrin). Mai mult decât în exemplul privind situaţia la nivelul unei ţări, „soldaţii” din sistemul imun (de ex. LT citotoxice, celulele NK) pot avea atât o activitate efectoare cât şi de control şi retrocontrol (îşi „depăşesc” limitele de „simpli soldaţi”). S-ar putea ridica o întrebare şi anume: de ce avem nevoie de un sistem imunitar? Să nu uităm faptul că în fiecare zi organismul nostru se întâlneşte cu nenumărabile microorganisme: bacterii, virusuri, paraziţi etc. Unele microorganisme nu ne afectează în nici un mod, altele au efecte benefice faţă de organismul nostru, în timp ce o mare parte dintre microorganisme pot duce la apariţia unor îmbolnăviri. În acest context, sistemul imun „a fost nevoit” să găsească modalităţi prin care să „lupte” împotriva microorganismelor patogene şi condiţionat patogene. Mai mult decât atât, chiar şi substanţe străine (non-self) neinfecţioase dar şi structuri proprii modificate pot duce la un răspuns imun. S-a demonstrat şi faptul că mecanisme care în mod normal protejează organismul de eventualele infecţii pot fi implicate în determinarea unor leziuni tisulare sau de organ. Având în vedere toate aceste aspecte (dorim să subliniem faptul că realitatea este cu mult mai complexă), o definiţie a imunităţii ar putea fi următoarea: imunitatea reprezintă o reacţie faţă de orice structură non-self (fie microorganism sau o substanţă străină de tipul unei macromolecule proteice, glicoproteice etc) sau faţă de o celulă sau structură proprie care a suferit modificări. Informaţiile privind sistemul imun sunt prezentate în cadrul mai multor catedre şi discipline. Având drept ţintă o cât mai bună înţelegere a capitolelor pe care ne-am gândit să le introducem în „Manualul de Microbiologie” dorim să facem o scurtă „trecere în revistă” a organelor, celulelor, moleculelor şi mecanismelor implicate în imunitate. 118

Menţionăm faptul că nu veţi găsi aici toate definiţiile şi explicaţiile; pentru aceasta cititorul va trebui să parcurgă fiecare capitol în parte. Etapele pe care le descriem au doar scop didactic; în realitate fenomenele se petrec simultan şi sunt mult mai complexe decât pot fi explicate într-un „simplu manual” sau chiar şi decât ar putea fi acestea explicate de oamenii de stiinţă, în acest moment. Ceea ce noi cunoaştem este, de fapt, „o picătură într-un ocean”. Astfel, ne propunem să luăm ca exemplu un microorganism oarecare - un antigen. în cazul în care acesta reuşeşte să depăşească barierele naturale ale organismului (piele, mucoase etc) şi să pătrundă în ”gazdă”, următoarea linie de apărare este reprezentată de imunitatea înnăscută. Fagocitele reprezentate spre exemplu de macrofage şi granulocite recunosc microbii de orice fel (recunoaşterea nu este specifică) şi încep procesul de fagocitoză. Apare şi răspunsul inflamator. Ulterior intră în acţiune imunitatea adaptativă care se manifestă cu ajutorul limfocitelor. Aceasta din urmă este specifică deoarece dezvoltă în timp (cateva zile) celule şi molecule specifice pentru a „lupta” strict împotriva acestui antigen. O altă deosebire majoră între cele două tipuri de imunitate este reprezentată de capacitatea limfocitelor de a se transforma în limfocite cu memorie după întâlnirea cu un anumit antigen. Astfel, spre deosebire de macrofage şi granulocite, la o a doua întâlnire cu acelaşi antigen, limfocitele îl vor recunoaşte iar procesul de apărare se va declanşa mult mai rapid. Explicând puţin mai în în profunzime (menţionăm că explicaţii mai detaliate vor fi furnizate în capitolul 11 şi în alte capitole care urmează) avem în vedere faptul că antigenul pătruns în organism este captat de către celulele prezentatoare de antigen (APC) (macrofage, celule dendritice, limfocite B etc). Antigenul nu poate fi recunoscut ca atare de către sistemul imun deoarece doar o anumită parte a lui numită epitopprezintă proprietatea de imunogenicitate la valoare maximă şi poate declanşa un răspuns imun. Antigenul este endocitat de către APC, prelucrat în lizozomi iar epitopii rezultaţi vor fi prezentaţi limfocitelor în complex cu moleculele sistemului major de histocompatibilitate (MHC). MHC include molecule prezente pe celulele organismului uman (vezi capitolul 12). Limfocitele vor declanşa un răspuns imun. Există două tipuri principale de limfocite şi anume limfocitele T şi limfocitele B, după cum există două tipuri de răspuns imun, umoral şi celular. Limfocitele T secretă citokine care pot activa oricare din cele două tipuri de răspuns imun iar limfocitele B (după proliferare şi blastizare) secretă imunoglobuline (anticorpi) implicate în răspunsul imun umoral. Antigenele pot fi clasificate în mai multe grupe: exogene/endogene, timodependente/ timoindependente etc. Răspunsul imun umoral este declanşat de antigene exogene timodependente şi independente prezentate pe MHC II, iar răspunsul imun celular este declanşat de antigene endogene timodependente prezentate pe MHC I. În cazul în care ne întrebăm: cine produce aceste celule şi unde se desfăşoară răspunsul imun? O parte a explicaţiei ar include existenţa organor limfoide primare precum măduva osoasă hematogenă (sediul producerii limfocitelor T şi B şi maturării limfocitelor B) şi timusul (sediul maturării limfocitelor T) şi organe limfoide secundare precum pulpa albă a splinei unde se desfăşoară răspunsul imun umoral şi este iniţiat cel celular care se desfăşoară apoi la locul infecţiei şi ganglionii limfatici (vezi şi capitolul 10). Sistemul imun se poate confrunta cu o mare problemă, şi anume, aceea de a menţine balanţa între un răspuns imun eficace şi limitarea apariţiei de leziuni tisulare (în cadrul unui RI exagerat). Când această balanţă „se rupe” apar bolile autoimune şi stările de hipersensibilitate. 119

Povestire adevărată: Povestea vaccinului Edward Jenner s-a născut pe data de 17 mai 1749 în Berkeley, Gloucestershire. Înca de mic el a fost interesat de ştiinţe şi natură. Pe atunci circula zvonul cum că lăptăresele sunt protejate de variolă, zvon pe care l-a auzit şi el. La 21 ani a plecat în Londra şi a devenit studentul lui John Hunter, cel mai renumit chirurg din Anglia şi un respectat şi cunoscut biolog şi anatomist. Între cei doi s-a închegat o prietenie adevărată. Jenner a studiat geologia şi a făcut mai multe experimente cu sânge uman. A câştigat experienţă în biologie şi bineînţeles, în chirurgie. De-a lungul anilor, Jenner a tot auzit zvonul că lăptăresele erau protejate de variola. Punând lucrurile în balanţă, Jenner a concluzionat că forma de ”variolă” făcută de vaci ar putea avea o oarecare legătură cu un posibil mecanism de protecţie. În mai 1796 a găsit o tânără lăptăreasă, Sarah Nelms, care avea leziuni nou apărute datorită ”variolei vacilor” pe mâini şi braţe. Pe data de 14 mai 1796 a inoculat material din leziunile ei la băiatul unui servitor în vârstă de 8 ani, James Phipps. Ulterior, băiatul a prezentat febră şi discomfort în zona axilară. La 9 zile a prezentat simptomele unei răceli şi şi-a pierdut apetitul dar ziua următoare era iar bine. În iulie 1796 Jenner l-a inoculat iar pe băiat, de data aceasta cu material dintr-o leziune nou apărută de variolă umană. Baiatul nu a dezvoltat boala aşa că Jenner a concluzionat că acesta era protejat complet. În 1797, Jenner a trimis un scurt comunicat spre Societatea Regală descriind experimentul şi observaţiile sale. Totuşi, lucrarea a fost respinsă. În 1798, după ce a mai experimentat pe câţiva oameni, Jenner a publicat o mică carte numită “O incursiune în cauzele şi efectele vaccinului antivariolic, o boală descoperită în unele din ţările vestice ale Angliei, mai ales înGloucestershire şi cunoscută sub numele de variola vacilor”. Cuvântul latin pentru vacă este “vacca” iar pentru variola vacilor este “vaccinia”. Jenner a decis să denumească această nouă procedură vaccinare. În 1798 publicaţia avea trei părţi. În prima parte Jenner prezintă viziunea sa legată de variola vacilor ca o boală a cailor transmisă la vaci. Teoria a fost infirmată în timpul vieţii lui Jenner. Apoi a prezentat ipoteza că infecţia cu variola vacilor protejează de infecţia cu variolă umană. În cea de-a doua parte sunt continuate observaţiile critice relevante pentru testarea ipotezei sale. A treia parte a fost o discuţie lungă, în parte polemică, legată de descoperirile şi problemele variate legate de variolă. Reacţiile la această publicaţie au fost din cele mai diverse. Jenner a plecat la Londra în căutare de voluntari pentru vaccinare. După trei luni nu găsise nici măcar unul singur. El a pornit un studiu la nivel naţional în căutarea persoanelor care prezintă rezistenţă la variolă în rândul celor care făcuseră variola vacii. Rezultatul acestui studiu i-a confirmat teoria. În ciuda erorilor şi controverselor nenumărate folosirea vaccinării s-a răspândit rapid în întreaga Anglie şi până în 1800 a atins majoritatea ţărilor Europene (Jenner a vaccinat în 1801 populaţia din Cluj şi Târgu Mureş, apoi această procedură s-a extins în întreaga ţară în următorii 31 de ani (1). Deşi a fost apreciat la nivel mondial şi i s-au acordat multe onoruri, Jenner nu a avut intenţia să se îmbogăţească. În 1802, Parlamentul Britanic i-a oferit suma de £10,000 pentru descoperirea sa, iar cinci ani ulterior i-a oferit înca £20,000. Pe de alta parte, el a fost şi subiectul ridiculei şi atacurilor, nu doar al onorurilor. În ciuda acestor lucruri el şi-a continuat activităţile în slujba vaccinării. Lucrarea lui Jenner reprezintă prima încercare ştiinţifică de control a bolilor infecţioase prin folosirea deliberată a vaccinării. Totuşi, nu el este cel care a descoperit vaccinarea, dar a fost primul care a oferit un status ştiinţific acestei proceduri. Benjamin Jesty este cel care a vaccinat primul împotriva variolei. La sfârşitul secolului XIX s-a descoperit că vaccinarea nu conferă imunitate pentru toată viaţa şi de aceea este nevoie de revaccinare. Mortalitatea datorată variolei era în scădere, dar epidemiile arătau că boala încă nu 120

era ţinută sub control. În 1950 s-au implemantat mai multe măsuri de control şi variola a fost eradicată în mai multe zone ale Europei şi America de Nord. Procesul de eradicare la nivel mondial al variolei a fost discutat atunci când Adunarea Mondială a Sănătăţii a primit un raport, în 1958, legat de consecinţele catastrofale ale variolei în 63 de ţări. În 1967 s-a început o campanie globală condusă de Organizaţia Mondială a Sănătăţii care a dus la eradicarea variolei în 1977. În data de 8 mai 1980 Adunarea Mondială a Sănătăţii a anunţat că lumea nu mai are variolă şi a recomandat ca toate ţările să înceteze vaccinarea. (2) Nu am dorit să povestim totul legat de vaccinare în cadrul acestui capitol, ci doar să vă introducem puţin în povestea acestei tehnici pentru a arăta evoluţia lucrurilor şi efectul benefic pe care l-a avut această descoperire în întreaga lume. Aşa cum se ştie, vaccinarea rămâne momentan singura metoda cu cel mai bun raport cost-eficienţă. Pe această cale dorim să sensibilizăm studenţii la medicină şi cititorii acestei cărţi în ceea ce priveşte vaccinarea şi să infirmăm teoriile greşite care au circulat și continuă să circule în ultimul timp.

10. Organele cu rol în imunitate 10. 1. Organele suşă (stem) 10. 1. 1. Sistemul hematopoietic şi celulele stem Sistemul hematopoietic cuprinde organele stem cu funcţie dublă, hematologică şi imunologică. Celula multipotentă, primordială („suşă”, „stem”, „matcă”) se formează iniţial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior în ţesutul hematopoietic din ficatul embrionului. Celula „stem” se află la originea tuturor liniilor hematopoietice (vezi şi 11.1.). Din celulele stem multipotente rezultă celulele liniei limfocitare (din care iau naştere limfocitele B şi T) şi celulele liniei mieloide (precursoare pentru liniile eritrocitară, megakariocitară, monocito-macrofagică şi granulocitară). 10. 1. 2. Mezodermul embrionar şi ficatul fetal Organele care conţin celulele stem hematopoietice sunt active de-a lungul vieţii embrionare şi fetale, într-o anumită succesiune. În primele săptămâni de viaţă, ele sunt situate în mezodermul intra-embrionar şi extraembrionar (sacul vitelin). La făt, celulele stem migrează şi se localizează la nivel hepatic. În cea de-a zecea săptămână de viaţă intrauterină, apar primele celule stem în os. după cea de-a 20-a săptămână, la fătul uman, hematopoieza devine exclusiv medulară. 10. 1. 3. Măduva osoasă Teritoriul hematopoietic (MOH) se reduce odată cu vârsta: la copil, toate oasele au funcţie hematopoietică; la adult, teritoriul hematopoietic se restrânge la oasele trunchiului şi bazinului, atingând un volum de circa 5 litri la un subiect de 60 kg; la persoanele vârstnice, funcţia hematopoietică se menţine la nivelul sternului, vertebrelor şi al oaselor coxale.

10. 2. Organele limfoide primare organele limfoide primare, numite şi centrale, sunt situate în afara căilor de acces şi circulaţie antigenică. În aceste organe diferenţierea apare precoce, în viaţa embrionară, înaintea celor secundare. Proliferarea limfocitară este intensă şi independentă de stimularea antigenică. Organele limfoide primare au următoarele roluri: · permit multiplicarea limfocitelor T (timodependente) şi B (dependente de măduva roşie hematogenă / bone marrow - la mamifere). 121

· găzduiesc primele stadii de diferenţiere, până la limfocitele T sau B mature, apte să recunoască structurile antigenice şi să fie stimulate de antigene. · efectorii imuni „învaţă” la acest nivel să recunoască şi să tolereze constituenţii propriului organism (auto-recunoaştere şi toleranţă faţă de „self”). Un limfocit T sau B matur care a părăsit timusul, respectiv măduva osoasă hematogenă, nu mai revine niciodată la acest nivel, cele două organe fiind în afara căilor de recirculare a limfocitelor antigen-specifice din organele limfoide secundare. 10. 2. 1. Timusul Timusul se formează în perioada de dezvoltare a celui de-al treilea arc branchial. Încă din stadiul de dezvoltare fetală, timusul este prezent în cavitatea toracică, fiind dispus retrosternal, ca un organ bine diferenţiat, deja funcţional. Agenezia acestei regiuni duce la apariţia unui deficit congenital rar, sindromul Di George (aplazia congenitală timică sau boala „pipernicirii”), caracterizat prin tulburări ale imunităţii celulare şi implicit prin susceptibilitate crescută la infecţii (respiratorii, digestive şi cutanate, produse în special de fungi şi virusuri şi mai rar de către bacterii), tetanie neonatală (datorată absenţei paratiroidelor) şi malformaţii congenitale diverse (arc aortic dublu, tetralogie Fallot, micrognatism, atrezie de esofag etc). Timusul este un organ situat în mediastinul anterior şi superior, retrosternal, format din doi lobi uniţi printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentaţi de septuri derivate din capsula organului. Lobulul timic este alcătuit din 2 zone: corticală (la exterior) şi medulară (la interior). Iniţial se dezvoltă zona corticală. Greutatea sa variază cu vârsta (este bine dezvoltat la făt, greutatea creşte până la pubertate - dezvoltarea maximă se realizează la vârsta de 10-12 ani, apoi suferă o involuţie lentă, fără să dispară total). În zona corticală, trama de-a lungul căreia se plasează protimocitele (sosite în timus de la MOH) cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice şi macrofage. Limfocitele mici, denumite şi timocite corticale, sunt numeroase, grupate în grămezi, în jurul celulelor epiteliale. Ele se divid activ, dar nu se structurează în noduli limfatici. În zona medulară, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formând corpusculii lui Hassal (formaţiuni de celule epiteliale care degenerează, fiind mereu înlocuite cu alte celule similare), caracteristici timusului. Se consideră că au rol fagocitar. Cresc atât numeric cât şi ca dimensiuni, probabil datorită contactului cu microorganismele din flora normală, dar şi contaminării cu alte microorganisme. Medulara mai conţine şi celule dendritice, macrofage şi timocite. Timocitele medulare sunt mult mai dispersate decât cele din zona corticală. La acest nivel are loc selecţia negativă a timocitelor. Timusul are capacitatea de a elimina prin selecţie pozitivă celulele care, odată eliberate în circulaţie, nu ar fi putut produce efectul scontat, deoarece nu ar fi recunoscut structurile non-self şi prin selecţie negativă celulele care ar fi dat reacţii autoimune. Populaţia limfocitară aflată în proces de multiplicare în timus, este foarte sensibilă la acţiunea corticosteroizilor, 95% din limfocite fiind distruse. Restul de 5% din limfocitele cortico-rezistente sunt cele care, la finalul maturaţiei, trec în circulaţie. Se pare că iniţial are loc distrugerea a 80% dintre limfocite, 20% ajung la nivel medular şi dintre acestea supravieţuiesc cele 1-5% limfocite cortico-rezistente. Timocitele ajunse în zona medulară sunt mai rezistente la acţiunea cortizolului decât cele din zona corticală. (Figura nr. 1) Rolul timusului se manifestă local şi la distanţă: · rolul local, constă în transformarea limfocitelor nediferenţiate în limfocite T mature, cu achiziţia de receptori pentru antigene (TCR). Procesul de multiplicare şi diferenţiere are loc, în principal, în regiunea 122

corticală. Celulele achiziţionează progresiv markeri ai limfocitului T adult: molecule CD2, CD3, CD4, CD8 şi TCR. Urmează o dublă selecţie, pozitivă şi negativă. Înselecţia pozitivă, timocitele care recunosc antigenele străine fixate pe moleculele MHC pot prolifera (timocitele CD4+ recunosc moleculele MHC clasa II, timocitele CD8+ recunosc moleculele MHC clasa I), în timp ce acele limfocite care nu şi-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt distruse. În selecţia negativă, timocitele care recunosc structurile self sunt distruse, eliminându-se astfel timocitele puternic autoreactive, care ar conduce la apariţia unor fenomene autoimune imediat după naştere. În timus are loc multiplicarea, diferenţierea şi selecţia limfocitelor T. Tot la nivel timic are loc producerea celulelor de control, cu rol în prevenirea bolilor autoimune (experienţele realizate prin înlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sănătoase a dus, pentru un timp, la dispariţia semnelor de boală, dovedind astfel existenţa acestor celule timice). (Figura nr. 2) · rolul la distanţă se realizează prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina, timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceşti factori au funcţii diverse, unii dintre ei influenţând diferenţierea limfocitelor T în ariile timodependente din organele limfoide periferice. Acţionează atât la nivelul timusului cât şi la distanţă. Câteva informaţii despre factorii timici: Timozina are efecte asupra limfocitelor T, stimulându-le activitatea citotoxică şi crescând sinteza de IL-6. In vivo, stimulează LH şi GnRH, iar in vitro Prolactina şi GH. Timostimulina necesită Zn pentru a acţiona. Are efect asupra dezvoltării protimocitelor în MOH. Factorul umoral timic induce producerea de IL-2 (are potenţial antiviral). Timopoietina intervine în procesul de diferenţiere a limfocitelor T. 10. 2. 2. Măduva osoasă hematogenă la mamifere La mamifere, se menţine divizarea funcţională în limfocite T şi B, dar nu există bursa lui Fabritzius. Transformarea celulei stem în limfocit B matur are loc în măduva osoasă hematogenă (bone marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat atât de măduva din oasele late cât şi din oasele lungi; ulterior, măduva de la nivelul oaselor lungi este înlocuită cu ţesut adipos, care mai târziu se fibrozează, iar măduva activă rămâne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Cazurile cu deficit imunitar selectiv pentru limfocite B (ex. maladia Bruton), confirmă existenţa unei autonomii a acestei populaţii. Transplantul de măduvă osoasă hematogenărestaurează imunitatea umorală, ducând la dispariţia perturbărilor. Dintre funcţiile măduvei osoase hematogenă în imunitate amintim: 1. menţinerea unui procent de celule stem cu diferenţiere spre linia limfocitară şi primele stadii ale seriei T şi B; 2. maturarea şi diferenţierea completă a limfocitelor B în celule B mature, apte să colonizeze organele limfoide secundare. La nivelul măduvei există mai multe tipuri de celule: celule „cap de serie” şi celule tinere care derivă din acestea, celule din seria granulocitară, celule din seria megakariocitară, celule din seria eritrocitară, celule din seria monocito-macrofagică, celulele din seria limfoidă (dar nu există LT, ci doar protimocite, limfocite T nediferenţiate).

10. 3. Organele limfoide secundare Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite şi periferice sau efectoare, este tardivă faţă de cea a organelor limfoide primare, atingând dezvoltarea deplină numai după stimularea antigenică. Amintim ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii limfatici, splina şi organele limfoide ataşate sistemului 123

digestiv (apendice, amigdale, plăci Peyer) etc. La nivelul acestor organe se cantonează limfocitele T provenite din timus şi limfocitele B provenite din măduva osoasă hematogenă, migrate pe calea torentului circulator. În organele limfoide secundare, aceste celule se vor activa în urma contactului cu antigenele. În anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici sau din splină, se găsesc grupuri de celule, constituite în special din limfocite B, denumite foliculi sau noduli limfatici. Înaintea stimulării antigenice, aceşti foliculi primari sunt în repaus, cu limfocite mici apropiate unele de altele, determinând un aspect dens, caracteristic. Aceste limfocite mature sunt denumite „naive”, deoarece nu au avut contact cu antigenul. După circa 3-6 zile de la stimularea antigenică, foliculii primari se transformă în foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, înconjurat de o zonă mai întunecată. În jurul foliculului există o zonă marginală puţin vizibilă, constituită din limfocite B cu memorie. Foliculul secundar persistă câteva săptămâni după care redevine folicul primar. Organele limfoide secundare cuprind următoarele grupe: 10. 3. 1. Ganglionii limfatici Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezintă structuri imune, organizate, situate la „intersecţiile” traseelor limfatice. Au următoarele roluri: · colectează structurile antigenice care traversează teritoriul vaselor limfatice aferente (libere sau captate de macrofage şi/sau de celulele dendritice); · induc un răspuns imun faţă de antigenele de tip celular, în regiunea paracorticală (dând naştere la limfocite T specifice) sau faţă de antigene de tip umoral, în foliculii limfatici cu limfocite B active, maturate în măduva osoasă hematogenăşi · stochează informaţiile imune datorită limfocitelor cu memorie dar au rol şi în diseminarea răspunsului imun prin circulaţia limfocitelor pe calea traseelor limfatice eferente, către torentul circulator şi ulterior spre alte teritorii ganglionare, splenice, digestive sau respiratorii. În secţiune anatomo-patologică transversală remarcăm la exterior o zonă corticală (cuprinde în special limfocite B, „instruite” la nivel medular, aglomerate sub formă de noduli limfatici. În mijlocul nodulilor se află centrii germinativi. Foliculii cresc mult în dimensiuni după infecţie, iar ganglionii limfatici devin palpabili şi dureroşi. Sub zona corticală se află zona paracorticală (cuprinde în special limfocite T). În mijloc se află zona medulară, în care se găsesc atât limfocite B cât şi limfocite T. În ganglionii limfatici se mai găsesc macrofage, celule dendritice etc. (Figura nr. 2) 10. 3. 2. Splina Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, având însă şi alte funcţii: · joacă rolul unui „filtru” care în mod nespecific îndepărtează/elimină complexele antigen-anticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp., Babesia microti); · are o eficienţă remarcabilă în îndepărtarea/eliminarea microorganismelor slab opsonizate precum şi celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Capnocytophaga spp.); · eliminarea hematiilor degradate, îmbătrânite; · reglarea volumului sângelui etc. Pe secţiune, splina are o culoare roşie, cu formaţiuni albe diseminate, numite corpusculii Malpighi (foliculi splenici). 124

Splina este compusă din două tipuri de ţesuturi: pulpa roşie implicată în distrugerea hematiilor şi pulpa albă, corespunzătoare ţesutului limfoid. Aceasta din urmă este organizată sub forma unor grupări de limfocite T dispuse în imediata vecinătate a arteriolelor (manşoane de limfocite T - teaca limfatică periarterială), iar spre periferia acestora se găsesc cordoane de limfocite B (zona marginală). Se consideră că zona bogată în limfocite T este zona timo-dependentă, în timp ce zona cu limfocite B este zona medulo-dependentă. Vascularizaţia splinei are o serie de particularităţi. Artera splenică intră prin hilul splenic iar ramificaţiile sale, arterele trabeculare, urmează cloazoanele conjunctive. Din aceste artere se nasc ramificaţii, arterele centrale înconjurate de manşoane de limfocite T, vase care asigură irigaţia foliculilor limfatici şi artere penicilate care intră direct în contact cu sinusurile venoase ale pulpei roşii. Din arteriole se nasc capilarele, apoi venulele postcapilare situate în zona sinusului marginal. (Figura nr. 3) la nivelul zonei marginale are loc captarea antigenelor de către celulele reticulare. După 24 de ore, antigenul se regăseşte la nivelul centrului germinativ al foliculului sau în zona timo-dependentă. La periferia foliculilor splenici se găsesc plasmocite. La acest nivel are loc sinteză de anticorpi (în special după stimuli antigenici „solubili”, veniţi pe calea torentului circulator). După sinteză, moleculele de anticorpi sunt antrenate sanguin şi pot ajunge în tot organismul. Splina reprezintă un organ în care are loc sinteza anticorpilor de tip IgM şi diferenţierea spre LB cu memorie în cadrul RI primar. Splina are şi rol în sinteza unei enzime care desprinde tuftsina (tetrapeptid rezultat din clivarea enzimatică a porţiunii Fc din molecula de IgG) de pe molecula de IgG (tuftsina la rândul ei are rol în creşterea funcţiei fagocitare a PMN şi în chemotactism). Hipofuncţia splenică şi în special splenectomia favorizează apariţia unor infecţii grave, inclusiv sepsis, cu microorganisme capsulate şi microorganisme care parazitează eritrocitele. Este necesară aplicarea unei strategii de prevenire a infecţiilor, incluzând vaccinarea şi uneori profilaxia cu antibiotice şi chimioterapice. 10. 3. 3. Sistemul limfoid asociat mucoaselor (MALT - mucous associated lymphoid tissue) Căile respiratorii, tractul digestiv şi cel uro-genital sunt înconjurate pe toată lungimea lor de ţesut limfoid difuz (sau nodular), bogat în limfocite B şi plasmocite care secretă sIgA. Datorită particularităţilor funcţionale, MALT se subdivide în: · Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue) reprezentat de inelul lui Waldeyer cu diferitele amigdale (palatine, faringiană, linguale) şi structuri adenoide. Amigdalele sunt constituite din foliculi limfoizi agregaţi şi ţesut limfoid difuz în strânsă asociere cu epiteliul faringian. Amigdalele sunt lipsite de vase limfatice, la fel ca şi splina. Amigdalele au un rol protector important în regiunea esofagiană, faringiană şi a arborelui traheobronşic, constituind un prim obstacol împotriva infecţiilor. Cu toate că după amigdalectomie nu rezultă infecţii severe, decizia privind această operaţie trebuie luată numai după o analiză critică, punând în balanţă atât beneficiile cât şi posibilele urmări negative. Structurile adenoide se inflamează frecvent în timpul copilăriei (după diferitele şi frecventele infecţii respiratorii) şi deseori, crescând în dimensiuni, trebuie extirpate; · Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue) cuprinde plăcile Peyer şi formaţiunile limfoide ale apendicelui (secretă IgA), limfocitele intra-epiteliale şi limfocitele subepiteliale. Plăcile Peyer reprezintă aglomerări de celule limfoide (la nivelul jejunului, duodenului şi ileonului). După infecţii bacteriene se măresc şi se pot uni în adevărate „cordoane” limfoide. Nu au vase limfatice proprii; · Sistemul imunitar asociat arborelui bronşic (BALT - bronchus associated lymphoid tissue); · Sistemul imunitar asociat căilor uro-genitale, prezent în special la nivelul vaginului; · Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid tissue). 125

Laptele matern conţine IgA secretorie (sIgA) cu rol protector pentru noul născut faţă de infecţiile digestive. IgA nu poate trece prin bariera hemato-placentară, dar sIgA poate fi primit în timpul alăptării, asigurând protecţia nou-născutului şi sugarului faţă de o serie de patogeni, în primele luni de viaţă. În organele limfoide secundare, distribuţia limfocitelor şi a celorlalte celule imune este controlată de citokine şi chemokine. Membrii familiei TNF (tumour necrosis factors) (citokine implicate în reacţii inflamatorii) au un rol deosebit de important în dezvoltarea normală a organelor limfoide. Celulele imune au receptori pentru aceşti mediatori, acest lucru fiind demonstrat pe cobai la care s-au distrus o serie de receptori pentru a se pune în evidenţă care este rolul lor. Molecula MIP-3β face parte din categoria chemokinelor pentru care limfocitele T prezintă receptori. Datorită acestei substanţe, limfocitele T se localizează cu stricteţe în zonele timodependente. Receptorul pentru MIP-3β se numeşte CCR7, iar la cobaii la care receptorii CCR7 au fost distruşi s-a observat absenţa marcată a zonelor timodependente şi un răspuns imun primar extrem de slab. Celulele dendritice interdigitate produc chemokina MIP-3β şi pentru că sunt prezente în zonele timodependente, atrag acolo limfocite T mature. Receptorul CCR7 este prezent în proporţie mică şi la nivelul limfocitelor B, lucru care explică migrarea acestora prin zonele timodependente către foliculii limfatici.

10. 4. Povestire adevărată Apendicele vermiform, o prelungire a cecumului, reprezintă un organ ce aparţine GALT (Gut Associated Lymphoid Tissue). Rolul GALT este de a interveni în apărarea mucoasei tractului digestiv, având în alcătuire ţesut limfoid abundent organizat în structuri specializate (amigdale, apendice, plăci Peyer) sau distribuit difuz în submucoasa peretelui tubului digestiv. La scurt timp după naştere, apendicele, fiind un segment al intestinului gros, devine colonizat de flora enterică ce populează cecumul şi colonul. Este presupusă ideea că un contact îndelungat al ţesutului limfoid din componenţa apendicelui cu flora comensală a intestinului, contribuie la menţinerea toleranţei imune faţă de populaţiile bacteriene. Aşadar, funcţia apendicelui diferă de cea a plăcilor Peyer sau a amigdalelor prin faptul că nu apără organismul de microorganisme potenţiat patogene nou-pătrunse în organism, ci favorizează desfăşurarea relaţiei simbiotice între gazdă şi germenii saprofiţi. Inflamarea apendicelui (apendicită) este o afecţiune frecvent întâlnită în secţiile de chirurgie, iar apendicectomia a devenit o procedură de rutină, având puţine riscuri (în general datorate efectelor anesteziei). Studii recente afirmă că apendicectomia (desfăşurată în cazul unei apendicite acute şi nu atunci când nu există de fapt această afecţiune) are efecte benefice în scăderea incidenţei dezvoltării colitei ulcerative. S-a constatat că la pacienţii suferinzi de apendicită la vârste tinere care au fost supuşi operaţiei, a scăzut riscul de apariţie a colitei ulcerative cu până la două treimi. Se pare că efectul este dat de o stimulare a limfocitelor T supresoare ce survine în urma procedurii chirurgicale. Însă apendicectomia nu reprezintă o soluţie în cazul celor la care boala s-a instalat deja. Colita ulcerativă este o boală inflamatorie a intestinului caracterizată prin apariţia ulceraţiilor în peretele colonului, diaree cu sânge şi crampe abdominale. Cauzele instalării bolii sunt multiple, de natură genetică, cauză autoimună, alimentaţie necorespunzătoare. Un parcurs de 10 ani netratat poate degenera în cancer de colon sau cancer rectal. 126

Chiar dacă apendicectomiile au devenit „floare la ureche” pentru mulţi medici chirurgi iar pacienţii nu se tem de o operaţie „uşoară”, este de reţinut faptul că diagnosticul trebuie instaurat corect de către medic care adesea uită că durerea la nivelul zonei inghinale drepte nu este semnul patognomonic pentru apendicită şi nu se mai oboseşte să mai facă alte teste, realizând uneori o operaţie inutilă şi netratând până la urmă suferinţa pacientului.

10. 5. Verificaţi-vă cunoştinţele La întrebările următoare, alegeţi un singur răspuns corect. 1. Care este diferenţa dintre organele limfoide primare şi cele secundare? 1.

localizarea lor: cele primare au localizare viscerală, cele secundare se localizează în mucoase;

2. în organele limfoide primare nu apare răspunsul imun faţă de un antigen, pe când în cele secundare da; 3.

nu există diferenţe între cele două tipuri de organe;

4. organele limfoide secundare sunt sediul formării şi diferenţierii limfocitelor, iar organele limfoide primare sunt destinaţiile la care ajung limfocitele mature. 2. Care este organul care pe lângă funcţia limfoidă, are şi funcţie hematoformatoare în ansamblu? 1.

splina;

2.

ganglionul limfatic;

3.

timusul;

4.

măduva osoasă hematogenă.

3. Ce este fenomenul de selecţie a limfocitelor? 1. un mecanism prin care se generează un răspuns imun împotriva unei substanţe non-self; 2. un proces generalizat ce are loc în toate organele limfoide, având ca rezultat limfocite B şi T mature; 3. un fenomen prin care sunt alese limfocitele T cele mai potrivite să intre în circulaţia sanguină (5% din limfocitele T totale); 4. totalitatea reacţiilor prin care trece un limfocit B pentru a deveni plasmocit (celulă secretoare de anticorpi). 4. Care dintre aceste roluri i se atribuie splinei? 1. rol în distrugerea hematiilor îmbătrânite; 2.

rol hematoformator, fiind un organ limfoid primar;

3.

rol în apărarea mucoaselor, aparţinând MALT;

4.

rol în selecţia şi maturarea limfocitelor T.

5. Care este afirmaţia adevărată? 1. un folicul secundar prezintă, din punct de vedere histologic, o zonă periferică şi un centru germinativ; 127

2.

plăcile Peyer sunt agregate de foliculi limfatici prezente în timus;

3.

ganglionii limfatici sunt relee pe calea circulaţiei sanguine;

4.

în măduva osoasă hematogenă se maturează atât limfocitele T, cât şi limfocitele B.

11. Celulele imunităţii 11. 1. Celula „stem” Celula multipotentă, primordială, „suşă”, „stem”, „matcă”, se formează la circa 3 săptămâni de la nidaţia zigotului, iniţial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior în ţesutul hematopoietic din ficatul embrionului. După naştere, celula „stem” ar mai putea fi pusă în evidenţă în măduva oaselor late şi lungi (la copii) şi în măduva oaselor late (la adulţi); un număr foarte mic de celule „stem” mai pot fi identificate în circulaţie. Primul derivat al celulei „stem” este hemocitoblastul (hematopoietic progenitor), care seamănă foarte mult cu celula „stem” dar deţine probabil un „semnal de orientare” către măduva roşie hematogenă sau către timus. Există și un alt derivat, limfoblastul (lymphoid progenitor). Celula „stem” se află la originea tuturor liniilor hematopoietice. În funcţie de gradul de potenţialitate există celule „stem” totipotente (CFU-LM), pluripotente, multipotente (CFU-M, GEMM), bipotente, unipotente (CFUEo, CFU-Baso, CFU-Mega). Prezintă capacitate de autoîntreţinere („self-renewal”) şi generează descendenţi în lipsa stimulilor antigenici. Răspunde la diferite mecanisme de control complexe. Din punct de vedere morfologic se aseamănă foarte mult cu limfocitul imunocompetent. Este foarte uşor de distrus de către radiaţii dar nu şi de către chimioterapice. Descoperirea metodelor de izolare şi cultivare a celulelor stem (1998) a creat o nouă speranţă: tratamentul cu celule stem ar putea ajuta la vindecarea unor boli grave (considerate astăzi ca fiind incurabile). Celulele stem fiind progenitori nediferenţiaţi se pot divide şi dezvolta într-o multitudine de alte tipuri de celule, putând duce la formare de ţesuturi şi organe. Cercetătorii estimează că aceste celule ar putea fi folosite, în viitor, pentru repararea diferitelor structuri distruse sau în suferinţă, dar chiar şi pentru „sinteza” de organe. Totuşi, sunt încă destul de multe probleme tehnice care trebuie surmontate. (Figura nr.1 – Evoluţia celulei „stem”)

11. 2. Celulele implicate în răspunsul imun Toate celulele sistemului hematopoietic intervin, în diferite măsuri, în imunitate. Aşa cum am menţionat anterior, aceste celule acţionează ca nişte adevăraţi „soldaţi” (de ex. LT citotoxice, celulele NK), care pot avea atât o activitatea efectoare cât şi de control şi retro-control („depăşindu-şi condiţia” de „simpli ostaşi”). Limfocitele T şi B suntelementele centrale alerăspunsului imun specific. Celulele NK sunt celule fundamentale (alături de fagocite) în imunitatea înnăscută. Monocitele / macrofagele, neutrofilele, eozinofilele, bazofilele şi mastocitele acţionează în diferite momente ale răspunsului imun.

128

Plachetele sanguine intervin în lupta anti-parazitară iar globulele roşii participă la eliminarea complexelor imune. Celule pot reacţiona în mod nespecific, indiferent de natura agentului agresor (ex. granulocitele PMN, eozinofilele, bazofilele, mastocitele, monocitele, macrofagele, celulele dendritice etc) sau pot participa la o reacţie specifică, condiţionată de structura moleculelor antigenice, prin intermediul receptorilor (ex. limfocitele). Termenul generic de limfocite, include o multitudine de celule distincte, imposibil de diferenţiat morfologic (în microscopia obişnuită sau chiar şi în microscopia electronică). Pe baza caracterelor morfologice, este totuşi posibilă identificarea a două tipuri de limfocite: - limfocitele mici (small lymphocytes), cele mai numeroase (circa 85% din numărul total al limfocitelor); aici se încadrează majoritatea limfocitelor T, limfocitelor B, celulelor dendritice şi rarelor celule stem hematopoietice aflate în circulaţie. - limfocitele mari cu granulaţii (large granular lymphocytes), reprezentând circa 5-15% din totalul limfocitelor. Dintre acestea amintim celulele NK (ucigaşe în mod natural / „natural killer”) şi limfocitele T citotoxice. Aspectul morfologic nu ne permite să apreciem care este starea de activare celulară. Dacă folosim culturi celulare, în prezenţa unor agenţi mitogeni nespecifici [ex. fitohemaglutinină, concavalină A, lipopolizaharide, lectine cum ar fi PWM (pokeweed mitogen) etc] sau a unor antigene specifice, limfocitele T sau B aflate anterior „în repaus” cresc în dimensiuni, prezintă modificări la nivelul nucleului (cromatină fină, citoplasmă mai abundentă şi mai albastră pe frotiu), fiind denumiteimunoblaste.

11. 3. Clasificarea limfocitelor Clasificarea limfocitelor se realizează pe baza: · funcţiilor şi · identificării markerilor celulari. Funcţiile limfocitelor. S-a demonstrat că pe lângă limfocitele B, există o mare varietate funcţională de limfocite T [ajutătoare (helper, LTh), supresoare, citotoxice sau „responsabile” de imunitatea celulară]. Funcţionalitatea limfocitelor este dificil de studiat în practica curentă, mai ales că o singură celulă poate avea mai multe funcţii. Una dintre tehnicile de cercetare curentă, citometria în flux, utilizează anticorpi monoclonali obţinuţi în urma imunizării şoarecilor cu limfocite umane normale sau patologice. Markerii celulari sunt înregistraţi cu prefixul CD, termen derivat din „cluster of differentiation” (clasă de diferenţiere), nomenclatură stabilită în anul 1982. De atunci au fost identificaţi peste 300 markeri sau sub-markeri CD. Celulele stem hematopoietice şi diferitele celule cu rol în imunitate pot fi împărţite în grupe şi subgrupe. Pentru activarea limfocitelor este nevoie de două semnale: · unul care provine de la antigen · altul provenit de la moleculele accesorii de pe suprafața APC (B7/CD80) pentru LT sau de pe LTh (CD40L) pentru LB. Limfocitele care sunt stimulate doar de primul semnal devin neresponsive la alte semnale antigenice și nici nu se activează pentru a reacționa față de primul semnal antigenic. Etapele activării limfocitelor: 129

· sinteza de citokine dar și de receptori pentru acestea de către limfocitele naive dar mature · proliferarea limfocitară (expansiunea clonală) - în unele infecții numărul LT poate crește de 50.000 ori, iar al LB de 5.000 ori · transformarea limfocitelor naive în limfocite efectoare cu rol în eliminarea antigenului · diferențierea limfocitelor efectoare în limfocite cu memorie. Așadar, avem de-a face cu trei tipuri de limfocite: · naive – mature dar care nu au avut contact cu antigenul; acestea urmează să fie distruse în cazul în care într-o perioadă de 1-3 luni nu au contact antigenic · efectoare · cu memorie - care vor reacționa mai rapid la a doua stimulare cu același antigen.

11. 3. 1. Limfocitele T (LT) (Figura nr. 2 – Maturarea limfocitelor) Limfocitele T sunt majoritare în circulaţia sanguină, reprezentând circa 70% din totalul limfocitelor [2/3 sunt LT4 (CD4+) şi1/3 sunt LT8 (CD8+)]. Limfocitele T sunt localizate la nivelul organelor limfoide secundare în zone speciale: zona paracorticală a ganglionilor, manşonul limfoid în jurul arterelor centrale splenice. Limfocitele T sunt implicate în principal în imunitatea mediată celular. Pe de o parte participă la eliminarea structurilor străine dar şi a structurilor proprii modificate (prin îmbătrânire, în urma unei infecţii, cu multiplicare neoplazică) iar pe de altă parte cooperează cu limfocitele B în răspunsul imun umoral. De fapt, funcţiile exercitate de LT sunt mult mai complexe. Cea mai importantă funcţie a limfocitelor T este inducerea unui răspuns sau a unei reacţii imune specifice la antigene, prin recunoaşterea unor peptide antigenice fixate pe moleculele MHC (complex major de histocompatibilitate). În acest scop pe limfocitul T există un receptor pentru antigen (TCR), asociat întotdeauna cu un complex molecular transductor CD 3. Linia limfocitară T se maturează în două organe: (a) măduvă osoasă şi (b) timus. Din celula stem hematopoietică multipotentă (CD34+, CD38-), prima diferenţiere conduce la apariţia CFUL (colony forming unit-lymphocyte) comună limfocitelor T şi B (CD34+, CD45RA+, CD10+) din care rezultă protimocitul. Protimocitul părăseşte măduva roşie hematogenă şi se cantonează în corticala timică. Maturizarea timocitelor nu a putut fi studiată la om, astfel încât datele se obţin prin extrapolarea informaţiilor obţinute experimental, la animale de laborator. Protimocitele şi apoi timocitele imature se găsesc în corticala timică (subcapsular), în contact cu celulele epiteliale şi cu macrofagele (rare) de la acest nivel. Aceste celule tinere au o capacitate foarte mare de multiplicare. Se deplasează prin cortex spre joncţiunea cortico-medulară şi vin în contact cu celulele dendritice şi cu macrofagele. La acest nivel are loc o nouă multiplicare relativ intensă. Este de remarcat faptul că în cursul acestui proces, doar 1-5% din celulele tinere ajung limfocite T mature. Restul, de cel puţin 95% din celule, mor prin apoptoză. Activarea unui limfocit T specific se face printr-un mecanism dublu: 1. contactul (direct) celulă - celulă, cu o celulă prezentatoare de antigen (APC); 2. stimularea (indirectă) de către citokine: IL-1, IL-6, IFN-g şi IL-2. Limfocitul produce la rândul său atât IL-2 cât şi lanţul a al receptorului Il-2, contribuind la activarea altor LT specifice.

130

LT sunt activate doar de către antigenele timodependente (vezi Cap. 16, paragraf 16.1.2.); procesul se desfășoară la distanță de locul de pătrundere al antigenului, și anume în organele limfoide secundare unde o APC îi prezintă structurile antigenice. Consecința activării LT este transformarea acestuia în limfoblast T. Tipuri de limfocite T Limfocitele T ajutătoare (T helper, CD4+) (LTh/Th) Limfocitul Th este un veritabil „coordonator”, orientând răspunsul imun (RI) către RI celular sau către RI umoral. Există cinci subtipuri de LTh (Th0, Th1, Th2, Th3 și Th17): limfocitele Th0 sunt limfocite tinere (sub influenţa unor stimuli moleculari, ex. IL-4, IL-12, se vor transforma în limfocite Th1 sau în limfocite Th2); limfocitele Th1 sintetizează limfotoxină, IL-2, IFN-γ, TNF-α și TNF-β o au rol foarte important în apărarea anti-virală, şi anti-neoplazică (dar și în apărarea anti-fungică și antibacteriană), o sunt implicate mai ales în RIC, o stimulează switch-ul izotipic spre IgG2 și IgG3, o amplifică rolul citotoxic al macrofagelor și stimulează proliferarea LTc; limfocitele Th2 sintetizează IL2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13; o au rol mai ales în RIU, o sunt implicate în reacţiile de hipersensibilitate, o stimulează proliferarea LB și secreția de anticorpi; o sunt stimulate de semnale venite de la bazofile și eozinofile (papaina duce la sinteza de IL-4 de către bazofile care duce la stimularea răspunsului Th2) (1). limfocitele Th3 (limfocitele T reglatorii) deprimă funcția altor limfocite (CD4+, CD8+, LB, NK); secretă Il-10 (inhibă Th1 și Th2, deci RIU și RIC) și TGF- β (inhibă răspunsul imun); sunt CD4+ și CD25+; relativ recent au fost identificate limfocitele Th17; acestea se găsesc la interfaţa dintre mediul extern şi mediul intern (ex. la nivelul tegumentului, de-a lungul tractului gastro-intestinal); sintetizează IL-6, IL-17 și TNF-α; o au rol de protecţie la nivelul acestor suprafeţe, o studii recente au aratat că sunt implicate în inducerea și exacerbarea autoimunității și inflamației (datorită IL-17), o activează RIC (importante în RI prin recrutarea neutrofilelor și macrofagelor la locul infecției), o sunt în relație cu LT reglatorii care previn fenomenele inflamatorii și mediază toleranța imună (2), o secreția lor este stimulată de IL-23, o LTh-17 cu memorie reacționeaza față de antigenele Candida albicans (3). Limfocitele T citotoxice (Tc, CD8+) Se referă în principal la LT CD8+, cu toate că această proprietate a fost observată şi la unele LT CD4+, cu următoarele diferențe: · LTc CD8+ pot liza oricare dintre celulele organismului care exprimă molecule HLA I (HLA - human leukocyte antigen system) · LTc CD4+ îşi limitează funcţia la celulele care exprimă molecule HLA II. Au mai multe roluri, de ex. realizează „supravegherea imunologică” prevenind multiplicarea anarhică a celulelor. Dacă de ex. apar antigene tumorale, LTc au capacitatea de a le recunoaşte, de a se multiplica/activa şi de a le distruge. În această „supraveghere”, LTc sunt ajutate de celulele NK. 131

Distrugerea antigenelor este indusă prin două mecanisme: · inducerea apoptozei prin intermediul unui receptor al ”morții celulare”, ceea ce duce la fragmentarea ADN-ului celulei țintă; · ”atacul” asupra celulei țintă prin perforine (proteine ce rup membrana plasmatică sau lizozomală) și granzine(serin proteaze care lizează substraturi sau activează diverse proteaze) sintetizate și eliberate de către LTc. LTc au un rol important în apărarea împotriva celulelor infectate viral. Activitatea lor este intensificată de IFN-g. Importanța activității litice a LTc a fost demonstrată atât experimental (pe modele animale) cât și la pacienți care prezentau defecte ale citotoxicității. Există sindroame genetice transmise autozomal recesiv în cadrul cărora este afectată citotoxicitatea sau prezentând mutații la nivelul genei ce codifică informația pentru sinteza de perforine. Aceste sindroame au fost asociate cu imposibilitatea controlării infecțiilor virale, mai ales cu CMV, EBV și HSV (4). Limfocitele T inductoare ale hipersensibilităţii întârziate Sunt celule care secretă IL-2 şi în acelaşi timp IFN-g, activatoare pentru alte limfocite T, macrofage şi celulele NK. Limfocitele T supresoare (Ts, CD8+) Limfocitul T supresor este o celulă CD8+, ca şi LT citotoxic. Limfocitele Ts au rol în reglarea răspunsului imun, menţinându-l în limite normale. În lipsa Ts, orice stimul antigenic ar putea fi urmat de o proliferare anarhică a unei clone de limfocite (acele limfocite dotate cu receptorul specific pentru respectiva structură antigenică). În mod normal, între populaţiile de limfocite Th şi Ts există un echilibru, care se cuantifică prin raportul Th/Ts, raport care trebuie să fie supraunitar. Exemplul cel mai cunoscut în care valoarea raportului devine subunitară este infecţia HIV / SIDA. O parte dintre limfocitele T nu au funcţie efectoare şi se transformă în LT cu memorie. Limfocitele T γδ (γδ T cells) Limfocitele T γδsunt sechestrate la nivelul barierelor epiteliale sau la nivelul focarului inflamator și manifestă citotoxicitate față de diverse ținte. Sunt activate direct de antigen (non-peptide de dimensiuni mici) fără a fi necesară prezentarea în conjuncție cu MHC. Reacționeaza față de extractele mycobacteriene. Sunt stimulate de grupările fosfat din diverși compuși precum NTP (nucleotid trifosfat din ADN și ARN). Teste efectuate pe animale de laborator care au fost infectate cu Listeria spp., Leischmania spp., Mycobacterium spp., Plasmodium și Salmonella spp. au arătat un nivel de protecție mediu realizat de aceste limfocite. Se acumulează la nivelul focarului inflamator în boli cu implicare imună precum artrita reumatoidă sau sarcoidoza (cauza nu este cunoscută). Sunt implicate atât în imunitatea înnăscută cât și în cea adaptativă, prin · secreția de citokine și chemokine · abilitatea de a ajuta LB să se transforme în limfocite cu memorie. Limfocitele T NK (NKT cells) Limfocitele T NKintervin în RIP și produc cantități crescute de IL-4. ”Împrumută” proprietăți atât de la LT cât și de la NK. 132

11. 3. 2. Limfocitele B (LB) (Figura nr. 2 – Maturarea limfocitelor) Limfocitele B reprezintă 5% până la 15% din limfocitele din sânge (300 până la 600 elemente/mm3) şi constituie majoritatea celulelor din foliculii limfatici, ganglioni şi splină. Rolul lor esenţial este sinteza anticorpilor, în cursul RIU specific. Au fost denumite astfel deoarece s-a descoperit că la păsări LB se dezvolvă în bursa lui Fabricius. La om LB se dezvoltă în măduva osoasă hematogenă (bone marrow). Limfocitele B provin (la om şi la mamifere) din celulele stem hematopoietice (CD34+, CD38-). Toată linia limfocitară B (celule imature sau mature) are markeri specifici de suprafaţă CD19 şi CD20, utilizaţi pentru identificarea celulelor B (ex. în citometria în flux); identificarea prin aceeaşi metodă a markerului CD10 permite încadrarea în stadiul de limfocit matur. Limfocitul B părăseşte măduva osoasă şi trece în „zonele B” din organele limfoide secundare (ganglioni limfatici, splină etc). LB „naiv” (virgin) este pregătit pentru a răspunde stimulului antigenic, deşi se găseşte în stare de repaus, în aşteptarea primei stimulări antigenice. În acest stadiu, LB are următoarele caracteristici: · exprimă la nivelul membranei imunoglobuline din clasele IgM şi IgD; · exprimă receptori pentru interleukinele IL-1 şi IL-4; · exprimă receptori pentru complement CR1 (CD35) şi CR2 (CD21). Ultimul recunoaşte fragmentul C3d, component degradat al fragmentului C3 al complementului. Acesta contribuie la activarea limfocitului B. · exprimă receptori pentru anumite lectine (ex. PWM) utilizate in vitro pentru transformarea limfoblastică a limfocitelor B, dar şi receptori pentru endotoxine bacteriene (LPZ). Transformarea unui LB naiv într-un LB activ şi apoi în plasmocit necesită intervenţia succesivă a citokinelor (ca într-o „cascadă”). Activarea are loc datorită recunoaşterii antigenice dar şi datorită secreţiei de IL-1 de către celula prezentatoare de antigen (APC) şi respectiv secreţiei de IL-4 de către Th2. Limfocitul B activ exprimă receptori pentru alte interleukine, în special IL-5 şi IL-6 şi lanţul a al IL-2. LB se va divide şi va da naştere la numeroase celule identice în foliculul limfoid secundar. Limfocitul B se diferenţiază progresiv într-un limfoblast sau imunoblast care secretă IgM. Sub acţiunea diferitelor citokine are loc comutarea izotipică (isotypic switch) de la IgM la IgG, IgA sau IgE; în urma acestei comutări plasmocitul va secreta IgG, IgA sau IgE. De exemplu, sub acţiunea IL-4 are loc comutarea izotipică a IgM în IgG sau IgE iar sub acţiunea IL-5 în IgA. Există şi limfocite B active care nu se transformă în plasmocite ci persistă sub formă de limfocite B cu memorie, cu o durată de viaţă lungă (asigurând spre exemplu protecţia faţă de o nouă îmbolnăvire, de ex. după scarlatină/infecție cu streptococul piogen de grup A, lizogenizat). Limfocitul B are următoarele funcţii: 1. Prezentarea antigenelor către LT; 2. Sinteza imunoglobulinelor (anticorpilor). În cazul antigenelor timo-dependente, are loc trecerea de la răspunsul primar cu secreţie predominentă de IgM, la un răspuns secundar cu predominenţa IgG sau mai rar a IgA sau IgE. În cazul antigenelor timo-independente, se menţine sinteza anticorpilor din clasa IgM. Limfoblastul (lymphoid progenitor) dă naștere la trei linii celulare (LT, LB și NK). Există o genă (Pax5) care este esențială pentru maturarea LB (5).

11. 3. 3. Celulele NK (Natural killer cells) 133

Numele de celule NK a fost dat acestei populaţii celulare datorită puterii lor citotoxice spontane, fără a avea nevoie de un stimul imun sau de prezenţa MHC (complexul major de histocompatibilitate). Numite iniţial celule de clasa a III-a (nefiind LB sau LT), ulterior celule nule (pentru că pe suprafaţa lor nu fuseseră, încă, puşi în evidenţă receptori), în final au fost numite celule NK („ucigaşe în mod nativ”, „natural killer”).Fac parte dintre limfocitele mari cu granulaţii (large granular lymphocytes). Se găsesc în măduva osoasă hematogenă, splină și în sângele periferic. Celulele NK reprezintă o linie primordială de apărare a organismului (imunitatea înnăscută), pe care îl ajută să elimine celulele modificate datorită unor infecţii, sau celulele modificate neoplazic, în special în neoplazii hematologice (ex. leucemie). Spre deosebire de limfocitele Tc · celulele NK nu au TCR (au însă, de ex., receptori pentru molecule de IgG), · în cazul celulelor NK nu există răspuns imun secundar (de memorie).

11. 4. Celulele prezentatoare de antigen (antigen presenting cells) Capacitatea de a prezenta antigene limfocitelor Th, iar prin aceasta de a induce un RI specific, este asigurată de două categorii de celule prezentatoare de antigen (APC): - celulele profesionale / specializate · celulele dendritice, · monocitele / macrofagele și · limfocitele B; - celulele ocazionale (îndeplinesc funcţia doar în anumite condiţii de activare celulară) · neutrofilele, · celulele endoteliale şi · celulele epiteliale. Celulele prezentatoare de antigen (APC) au următoarele funcții (Figura nr. 3): · recunosc antigenele T dependente prin receptorii membranari, le endocitează și prelucrează, · transportă antigenele native de la țesuturi la organele limfoide secundare, · prezintă antigenele native LT urmând selecția clonei de limfocite specifice acelui antigen, · activează fie LTc fie LTh. Celulele dendritice se găsesc în aproape toate țesuturile organismului, incluzând sângele și organele limfoide. La nivelul țesuturilor periferice formează o rețea care se extinde și în spațiile dintre celulele parenchimatoase astfel încât pot detecta orice microorganism aflat în acea zonă. Celulele dendritice posedă două sisteme de supraveghere imunologică: · macropinocitoză (în fiecare oră ingeră echivalentul volumului lor; nu așteaptă pasiv apariția antigenului care să le stimuleze), · au pe membrană mai multe tipuri de receptori pentru mai multe tipuri de particule. Sunt clasificate, în funcţie de distribuţia în organism şi de particularităţile fenotipice, în trei mari clase și şase tipuri: a). Celule dendritice tisulare 134

· celule Langerhans – CDL, care la nivel cutanat formează un strat continuu între derm și epiderm (dar le găsim și la nivelul tubului digestiv și organelor genitale), · celule interstiţiale - CDI, care se găsesc în interstițiul țesuturilor; b). Celule dendritice limfoide (din organele limfoide secundare) · celule interdigitate - CDID, în ariile T dependente din organele limfoide secundare, · celule foliculare - CDF, în ariile B dependente din organele limfoide secundare; c). Celule dendritice circulatorii · celule sanguine - CDS, în vasele sanguine, aflate în tranzit, · celule limfatice, „văluroase” - CDV, în vasele limfatice, aflate în tranzit. Toate celulele dendritice au origine medulară, provenind din aceeaşi entitate celulară - CDS (o parte dintre CDS pătrund în ţesutul cutanat şi mucoase, iar altă parte în interstiţiu). Pot să îndeplinească funcţia de APC deoarece prezintă receptori de tip CR, FcγR şi sintetizează molecule MHC II (cu excepţia CDF). Așadar, celulele dendritice sunt eliberate în circulație din măduva osoasă hematogenă și se transformă în CDS. De aici pot urma două căi: · în țesutul cutanat se transformă în CDL (captează antigenele opsonizate), apoi iau calea vaselor limfatice transformându-se în CDV, ajung la nivelul organelor limfoide secundare unde se transformă în CDID care prezintă pe membrana epitopi în conjuncție cu MHC II. · în interstițiu se transformă în CDI, apoi fie iau calea vaselor limfatice (și urmează drumul de mai sus), fie trec în circulație, se transformă din nou în CDS și ajung în splină unde fie o ajung periarteriolar (zona cu LT) și se transformă în CDF care reprezintă filtre pentru antigenele solubile, o ajung în jurul zonei periarteriolare (zona cu LB) și se transformă în CDID. Subliniem că este vorba despre aceeași celulă dendritică, în circulație prin organism; în funcție de locul în care ajunge are alte caracteristici structurale și funcționale. Celulele dendritice tipice (CDL, CDI, CDID) au formă neregulată, cu prelungiri numeroase, lungi şi efilate (de unde vine şi denumirea lor). În citoplasma celulelor dendritice se găsesc numeroase mitocondrii. CDF nu au atât de multe prelungiri și se dispun în grămezi. CDS au aspect rotund ovalar iar CDL sunt celule văluroase. Au rol important în maturizarea precursorilor LT. Induc toleranța LT, eliminând LT autoreactive (cele care la nivel timic au interacționat cu MHC și ar putea să reacționeze la fel de puternic și cu celulele somatice normale din organismul uman și să genereze autoimunitatea). Astfel, CD elimina LT care au scăpat selecției negative (vezi Cap. 10, paragraf 10.2.1.). Se pare că aceste celule intervin în declanşarea RI înaintea macrofagelor. Monocitele / macrofagele pot fagocita exo-antigenele într-o vacuolă numită endozom primar. Fuziunea endozomilor secundari cu lizozomii permite degradarea antigenelor în peptide imunogenice. Moleculele MHC II, produse la nivelul reticulului endoplasmic, pot „încărca” aceste peptide. Fago-lizozomii fuzionează cu membrana plasmatică şi astfel, peptidul de pe MHC II se exprimă la suprafaţa externă a macrofagelor. Macrofagele reprezintă APC majoritare în organism, însă nu toate pot îndeplini funcţia de APC, respectiv: · cele care nu au capacitatea să funcţioneze ca APC vor rămâne implicate în răspunsul inflamator, · celelalte vor funcţiona ca APC în cinci etape 1. captarea Ag (proces imunologic nespecific, mediat de receptori); 2. endocitarea Ag captate (realizată doar de către macrofagele activate metabolic); 135

3. prelucrarea Ag native captate (are loc la nivel lizozomal iar la finalul ei, rămâne un epitop, format dintr-o haptenă cu specificitate maximă şi o proteină „carrier”); 4. conservarea epitopilor în anumite sectoare subcelulare (în acest fel este asigurată autoîntreţinerea RI în timp); 5. prezentarea epitopilor pe membrana APC, cuplaţi în permanenţă cu molecule MHC. Sistemul MM exprimă molecule MHC II, mai ales după activarea prin interferonul gamma (IFN-g). După contactul cu limfocitul T, macrofagele secretă IL-1 şi IL-6 şi TNF-a; TNF-a activează RI şi procesul inflamator local. Limfocitele B pot funcţiona ca APC profesionale numai în condiţii de activare metabolică. Au capacitatea de a recunoaşte epitopii conformaţionali ai antigenelor şi de a-i prezenta limfocitelor T (de peste 30 de ani a fost dovedit faptul că RI la antigenele timo-dependente necesită cooperarea LB-LT). Prezintă pe suprafaţa lor receptori de tip CR şi FcγR şi pot sintetiza molecule MHC II. LB recunosc şi prezintă numai Ag solubile. Există studii care afirmă faptul că LB au o mai mare eficienţă în procesul de prezentare al antigenelor în comparaţie cu macrofagele. LB naive dar mature (încă nu au avut contact cu antigenul, dar au fost maturate în măduva osoasă hematogenă) sunt stimulate de antigen. Ag este captat prin intermediul BCR (receptor pentru antigen de pe LB). LB captează antigenul, îl procesează, prezintă apoi epitopii în complex cu molecule MHC II spre LTh CD4+. Acesta din urmă trimite semnale către alte LB prin citokine şi molecule de suprafaţă iar LB încep să prolifereze, se transformă în limfoblaste B, apoi în plasmocite care vor secreta anticorpi.

11. 5. Sistemul mononuclear fagocitar (sistemul MM) Monocitele / macrofagele reprezintă o linie celulară cu funcţie importantă în imunologie, prin intervenţia lor în imunitatea naturală, în prezentarea antigenică şi în reacţia imună specifică. Principalele funcţii ale sistemului MM sunt reprezentate de: · recunoaşterea structurilor străine (non-self) sau modificate, · fagocitarea, prelucrarea şi prezentarea acestora (în context MHC), · citotoxicitate, citostatism, · secreţie a diferitelor molecule (ex. IL-1, TNF-α) şi · reglarea reacţiilor în cadrul răspunsului imun. Macrofagele, alături de celulele dendritice şi celulele epiteliale, formează sistemul reticulo-histiocitar (SRH). Macrofagele pot fi observate în toate ţesuturile. Se formează în măduva osoasă hematogenă, dintr-un precursor comun monoblast-mieloblast şi când devin mature poartă numele de monocite. În acest stadiu, moleculele MHC II fie nu există fie sunt slab exprimate, ca semn al unui status funcţional redus (devin foarte bine reprezentate după stimulare). Monocitele circulă în sânge 6-8 ore, după care migrează în ţesuturi unde iau nume diferite şi îndeplinesc funcţii diferite: histiocite în ţesutul conjunctiv; celule gliale (microglii) în ţesutul nervos; osteoclaste; macrofage alveolare pulmonare; celule Kuppfer în ficat; macrofage splenice; macrofage peritubulare în rinichi; macrofage ganglionare, în măduva osoasă şi timus (macrofagele din aceste organe nu trebuie confundate cu celulele dendritice, care pot avea, la rândul lor, o capacitate fagocitară faţă de limfocitele în apoptoză). Monocitele / macrofagele prezintăreceptori pentru carbohidraţi, receptori pentru M-CSF, receptori pentru imunoglobuline şi complement. 136

În cadrul procesului de recunoaştere, fagocitare şi prelucrare a structurilor străine sau a structurilor proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile fagocitate, sistemul MM produce un anumit grad de distrugere, cu conservarea grupărilor specifice, necesare stimulării răspunsului imun. Citotoxicitatea exercitată de macrofage poate fi · directă (în cursul procesului de fagocitoză), · în urma contactului cu membrana celulei ţintă sau · prin citotoxicitate mediată celular, dependentă de anticorpi (ADCC) (în acest caz, anticorpii se fixează cu capătul Fab pe epitopii celulei ţintă şi cu fragmentul Fc de macrofag). Macrofagul produce substanţe litice cu care perforează membrana celulei ţintă (asemănător cu acţiunea ADCC a celulelor NK). Macrofagele secretă un număr foarte mare de substanţe: · cea mai mare parte a factorilor sistemului complement, · enzime proteolitice (ex. colagenaze, serinproteaze, hidrolaze), · proteine cu rol în adeziunea celulară (ex. fibronectină), · factori de coagulare, · interleukine (IL-1, IL-6, TNF-a, factorul de creştere al trombocitelor/fibroblastelor, factorul de stimulare al coloniilor de granulocite/granulocite-macrofage, endorfine etc) etc. Etapele fagocitozei (Schema nr. 1): 1. Migrarea macrofagelor la locul infecției, 2. Aderarea macrofagelor la celula țintă, 3. Ingestia celulei țintă, 4. Formarea fagolizozomului, 5. Inactivarea intracelulară a celulei țintă, 6. Digestia intracelulara a celulei țintă. Iată câteva studii interesante legate de funcţiile macrofagelor și modul în care acestea interacționează cu diferitele microorganisme. Lipoarabinomananul (LAM) este considerat unul din factorii de virulență ai Mycobacterium tuberculosis. Sa demonstrat că LAM este incorporat în plutele lipidice din interiorul membranei macrofagelor prin intermediul glicozil-fosfatidil-inozitolui ducând la reducerea maturării fagozomilor şi protejând astfel celula fagocitată (6). Toxina pertusis (TP) produsă de Bordetella pertussis este implicată în tusea convulsivă. S-a studiat interrelația dintre TP și macrofagele alveolare în cursul procesului infecțios. La un lot de șoricei s-au ”eliminat” macrofagele alveolare ceea ce a condus la intensificarea manifestărilor procesului infecțios, cu toate că imediat s-a produs un influx de neutrofile la locul infecției. Mai mult decât atât, lipsa macrofagelor a dus la declanșarea procesului infecțios chiar și cu tulpini care erau deficitare în sinteza TP (7). Endocardita poate fi cauzată de streptococii orali. Mecanismul nu este complet elucidat, dar se pare că monocitele au un rol important. Deși celulele monucleare din sângele periferic sintetizează titruri crescute de IL-12, monocitele tind să dispară. Acest lucru scoate în evidență faptul că monocitele infectate streptococic se transformă în celule dendritice secretoare de IL-12 și nu în macrofage. Celule sanguine mononucleare periferice de la subiecți sănătoși au fost infectate cu șase tulpini de streptococi orali. S-a observat că monocitele stimulate de aceste antigene exprimă fenotipul și funcția celulelor dendritice (8).

137

Mai multe studii au arătat că M. leprae activează puține macrofage și celule dendritice. S-a demonstrat că la nivelul monocitelor naive M. leprae induce niveluri crescute de citokine ce inhibă monocitele. M. leprae este implicat atât într-o stimulare cât și într-o inhibare a monocitelor (9).

11. 6. Alte celule implicate în răspunsul imun Neutrofilele Sunt cele mai abundente granulocite din circulația periferică. Neutrofilele intervin în: · imunitatea naturală prin fagocitoză şi · imunitatea specifică, datorită receptorilor proprii pentru imunoglobuline şi complement, în colaborare cu limfocitele şi alte APC. Principalii factori care atrag PMN la nivelul focarului infecţios sunt: · complexele Ag-Ac, · subcomponenta C5a a sistemului complement, · derivaţii acidului arahidonic (ex. leucotriena B4). După fagocitare, PMN utilizează pentru degradarea structurilor străine diferite enzime precum: lizozim, proteinaze neutre (ex. elastaze), hidrolaze acide (ex. glicerofosfataze). Sunt generaţi şi radicali activi de oxigen. S-a studiat relația între neutrofile și macrofage în cadrul infecției cu Mycobacterium tuberculosis. După infectarea experimentală a cobailor, neutrofilele au fagocitat microbul și au secretat IL-8 și TNF-α (cu rol activator asupra macrofagelor). Neutrofilele și macrofagele au fost prelevate și cultivate împreună și separat, apoi infectate. IL-8 a fost detectată la nivele mult crescute în culturile care conțineau atât macrofage cât și neutrofile în comparație cu situația în care culturile conțineau separat macrofage, respectiv neutrofile. S-au folosit mai multe tehnici de cultivare și s-a ajuns la concluzia că și TNF- α este la un nivel mai înalt în culturile ce conțineau ambele tipuri de celule. Ulterior, cultura a fost tratată cu anticorpi policlonali anti TNF-α iar răspunsul macrofagelor la stimularea neutrofilelor infectate a fost complet anulat. Acest studiu demonstrează că TNF-α produs de neutrofilele infectate ar putea fi responsabil de activarea macrofagelor alveolare (10). Eozinofilele Eozinofilele reprezintă în mod normal între 1% şi 3-5% din leucocitele sanguine. Procentul eozinofilelor creşte în alergii sau în infecţiile parazitare. Funcţia lor fagocitară, prin receptorii de IgG şi IgE şi mecanismul ADCC, este relativ limitată. Totuşi, eozinofilele pot fagocita fungi, complexe Ag-Ac, bacterii. Granulele lor conţin produşi toxici pentru diferiţi paraziţi. Pe de altă parte, eozinofilele produc histaminază şi arilsulfatază care inactivează histamina şi respectiv leucotrienele produse de mastocite. Prin aceşti factori se reduce răspunsul inflamator şi migrarea leucocitelor în focarul infecţios. Mai multe studii au demonstrat rolul eozinofilelor în cadrul imunității înnăscute și adaptative îndreptate împotriva infecțiilor cu paraziți. Nu a fost dovedit că eozinofilele ar iniția răspunsul imun față de paraziți. Plecând de la ipoteza că eozinofilele ar putea fi celule prezentatoare de antigen în infecțiile parazitare, eozinofilele au fost expuse la un anumit parazit și s-a examinat expresia diferiților markeri de suprafață 138

implicați în activarea celulară. S-a remarcat o creștere de 6 ori a CD69 și MHC II, de 4 ori a CD86 (molecula costimulatoare pentru LT). Abilitatea eozinofilelor de a prezenta antigenul a fost explorată și prin cultivarea lor împreună cu LTCD4+. Eozinofilele au avut capacitatea de a transforma LT naive în LTh2 producătoare de IL-5 (11). Bazofilele şi mastocitele Conţin granule metacromatice şi receptori pentru IgE. Au rol în reacţia de hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalul mediator în declanşarea HS de tip I este histamina. Ambele sunt implicate în apărarea anti-parazitară. Mastocitele nu se găsesc în cantitate mare în sânge, dar sunt întâlnite la nivelul țesuturilor conjunctive în apropierea vaselor sanguine și limfatice, aproape de sau în interiorul nervilor și sub epiteliile organelor care vin în contact cu mediul extern (plămân, intestin, piele). Bazofilele se diferențiază și maturează în măduva osoasă hematogenă, apoi circulă prin sânge. Atât bazofilele cât și mastocitele secretă citokine dar spre deosebire de mastocite, bazofilele secretă și IL-4. A fost studiat un eventual rol în diferențierea limfocitelor helper spre linia Th2 (proces care necesită IL-4) (12). A fost demonstrată prezența bazofilelor în ganglionii limfatici, în apropierea LT ca și faptul că secreția de IL-4 poate fi declanșată de un stimul independent de IgE (13). Mastocitoza (Figura nr. 4) - Mastocitoza) este o boală în care apare hiperplazia mastocitelor cu exces de mediatori la nivelul pielii, tractului gastrointestinal, măduvei osoase hematogene, ficatului, splinei și ganglionilor limfatici. Incidența bolii este de 3-7/1.000.000 locuitori. Poate apărea la orice vârstă (valorile cele mai mari sunt înregistrate în primii doi ani de viață și în decada a treia și a patra). Se datorează mutației genei ce activează factorul de creștere pentru mastocite. Plachetele Plachetele au un rol accesoriu în reacţia imună. Ele conţin serotonină şi exprimă receptori pentru IgG şi IgE. Plachetele aderă la endoteliul vascular, se agregă şi eliberează substanţe care cresc permeabilitatea capilară şi activează sistemul complement. Datorită Ig fixate pe membrana lor, plachetele pot adera la paraziţi şi pot elibera radicali liberi ai oxigenului cu efect toxic pentru aceştia. Globulele roşii Alături de rolul principal de a transporta oxigenul la ţesuturi şi bioxidul de carbon la plămâni, globulele roşii deţin receptori pentru sistemul complement, facilitează transportul complexelor imune din sânge la celulele Kuppfer din ficat, prin fixarea lor pe receptorii pentru complement.

11. 7. Evaluarea cunoștințelor 1.

Una din următoarele afirmaţii legate de celula stem este adevărată: A. Se formează la circa 3 luni de la nidaţia zigotului; B. Dă naştere hemocitoblastului şi limfoblastului; C. Poate fi găsită în măduva spinală; D. Se află la originea unor linii hematopoietice. 2. Legat de limfocite, o afirmaţie este falsă: A. LT sunt majoritare în sânge; B. LT se găsesc în paracorticala ganglionilor şi manşonul limfoid din jurul arterelor centrale splenice; C. LT induc o reacţie specifică antigenică; 139

D.

LB au rol esenţial în sinteza anticorpilor în cursul RIC specific. 3. LTh: A. LTh1 stimulează switch-ul izotipic spre IgM; B. LTh0 sunt limfocite tinere care dau naştere celorlalte tipuri de limfocite; C. LTh2 sunt implicate în apărarea antineoplazică; D. LTh17 duc la reacţii de hipersensibilitate; E. LTh0 generează inflamaţie tisulară. 4. Una din următoarele celule nu este APC: A. Celula Langerhans; B. Celula dendritică; C. Monocitul/macrofagul; D. LT 5. Eozinofilele: A. Procentul lor creşte în alergii sau infecţii parazitare; B. Sunt majoritare în infecţiile bacteriene; C. În mod normal reprezintă 50% din leucocitele sanguine; D. Pot duce la o boală numită mastocitoză.

12. Complexul major de histocompatibilitate 12. 1. Definiţie şi istoric Complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman, sau sistemul HLA, corespunde unor moleculele exprimate pe membrana celulară. Au fost descoperite ca alloantigene (alloantigen = antigen ce există în forme alternative = alele în cadrul unei specii;alloantigenul induce răspuns imun atunci când este transferat la indivizii din aceeaşi specie, cărora le lipsește respectiva formă a antigenului; exemplu: sistemul ABO al grupelor sangvine) de care depindea compatibilitatea grefelor cutanate sau de organ. Un fragment de ţesut recoltat de la o gazdă şi grefat la un receptor diferit, chiar dacă face parte din aceeaşi specie, este de regulă eliminat. Dacă după eliminare se încearcă o nouă grefare, cu acelaşi tip de ţesut, eliminarea este mai rapidă. Pornind de la aceste observaţii s-a pus numele de antigene de histocompatibilitate [primul rol identificat pentru acestea (dar existenţa lor nu este legată doar de fenomenul de compatibilitate/respingere a grefelor de ţesut sau organ]. Eliminarea ţesuturilor este controlată genetic, de mai multe gene care codifică pentru sinteza de proteine diferite la subiecţi diferiţi (gene de histocompatibilitate). Există antigene majore de histocompatibilitate (MHC) şi antigene minore (situaţie în care eliminarea grefelor are loc, de regulă, tardiv). Înţelegerea acestor fenomene este legată de 3 descoperiri succesive: 140

· Complexul major de histocompatibilitate. Cercetările lui Gorer (1963) pe grefe tumorale prelevate de la un şoarece şi grefate la altul, au arătat că grefa este respinsă în caz de histo-incompatibilitate sau tolerată în caz de histo-compatibilitate. Rejetul sau toleranţa sunt dictate genetic. Aceasta a dus la descoperirea sistemului major numit H2 la şoarece şi a mai multor sisteme minore. Ulterior, existenţa MHC a fost confirmată la toate mamiferele, regiunea fiind denumită în funcţie de specie (ex. H2 la şoarece, ChLA la cimpanzeu). · Sistemul HLA. În 1958 se pune în evidenţă, în serul unui pacient cu aplazie medulară şi politransfuzat, un alloanticorp care aglutinează leucocitele altor subiecţi. Aceasta stă la originea descoperirii sistemului allotipic HLA (human leucocyte locus A), evidenţiat la nivelul leucocitelor, apoi la majoritatea celulelor. Există o împărţire a sistemului HLA pe mai multe gene HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP şi HLA-DQ. Studiul supravieţuirii grefelor cutanate, între donor şi receptor HLA identic sau diferit a dovedit că sistemul HLA corespunde genetic şi funcţional cu MHC uman. · Răspunsul imun. Rolul fiziologic a fost descoperit ulterior. Proprietatea de a răspunde la un anumit antigen depinde de genele MHC, numite din acest motiv gene ale răspunsului imun. Doherty şi Zinkeragel au demonstrat în 1974 că răspunsul imun este limitat de complexul major de histocompatibilitate (MHC) individual.

12. 2. Structură şi clasificare Sistemul HLA cuprinde un ansamblu de gene localizate pe un segment al braţului scurt al cromozomului 6 (Figura nr. 1). Genele HLA posedă trei caracteristici importante: 1. polimorfismul - fiecare genă este polialelică (cu excepţia HLA-DRA), fiind evidenţiate peste 50 de alele în sistemulMHC uman; aceasta este principala caracteristică a HLA ce face ca organismul uman să fie capabil de recunoașterea a miliarde de antigene din natură prin arsenalul de MHC cu conformație specifică fiecărui antigen. 2. codominanţa - la un subiect heterozigot, sunt exprimate două alele diferite; 3. legătura strânsă -toate genele situate pe acelaşi cromozom se transmit în bloc descendentului, sub formă de haplotip. Moleculele HLA aparţin superfamiliei imunoglobulinelor, modelul lor structural de bază fiind motivul imunoglobulinic cu o punte disulfidică intramoleculară. Sistemul HLA este împărțit în două grupe principale: HLA clasa I și HLA clasa II, denumirea respectând cronologia descoperirii lor, și nu organizarea pe cromozom. Există și HLA clasa III (nu este implicată în histocompatibilitate). Moleculele HLA clasa I Aceste molecule sunt heterodimeri formaţi prin legătură noncovalentă între un lanţ greu polimorf a şi un lanţuşor nonpolimorf β2m (Figura nr. 2) · lanţul greu a (44 kDa) este o proteină transmembranară cu polimorfism alelic, codată de o genă a sistemului HLA; cuprinde 3 domenii extracelulare, o porţiune transmembranară şi o parte intracitoplasmatică scurtă; · lanţul β2m (11,5 kDa) este codat de o genă de pe cromozomul 15 şi cuprinde un singur domeniu; este extracelular, legat noncovalent de lanţul a. 141

Moleculele HLA-I sunt prezente pe majoritatea celulelor organismului, formând pe suprafața acestora un receptor constitutiv. Dintre celulele anucleate, aceste molecule sunt adesea absente la nivelul globulelor roşii dar prezente în cantitate mare la nivelul plachetelor sanguine. Expresia lor pe celulele nucleate este variabilă, în funcţie de tipul celular: pe limfocitele T sau B şi polimorfonucleare sunt exprimate 1045´105 molecule/celulă în timp ce pe hepatocite sunt slab exprimate iar pe celulele nervoase şi spermatozoizi aproape lipsesc. Pentru HLA-I există 3 gene ce codifică antigene majore de histocompatibilitate: HLA-A, HLA-B, HLA-C și 3 gene pentru antigene minore: HLA-E, HLA-F, HLA-G. Moleculele HLA clasa a II-a Aceste molecule sunt heterodimeri cuprinzând un lanţ polipeptidic a şi un lanţ polipeptidic β (Figura nr. 3) · lanţul greu a (33-34 kDa) cuprinde două domenii externe a1 şi a2, o porţiune transmembranară şi o terminaţie carboxilică scurtă intracitoplasmatică; · lanţul uşor β (28 kDa) are o structură asemănătoare, cu două domenii externe β1 şi β2. Moleculele clasei a II-a au o distribuţie mult mai restrânsă în comparaţie cu moleculele clasei I. Ele sunt exprimate pecelulele prezentatoare de antigen (APC): · celule dendritice (celule Langerhans din piele, celule interdigitate ganglionare şi din timus, celule dendritice din epiteliul căilor respiratorii), · monocite / macrofage şi · limfocite B. Limfocitele T nu exprimă astfel de molecule decât după activare. Moleculele clasei a II-a au fost descoperite şi la nivelul endoteliului vascular şi al celulelor epiteliale ale intestinului gros. În cazuri patologice, moleculele clasei a II-a au fost depistate la nivelul celulelor β din insulele lui Langerhans în diabetul insulinodependent, al canalelor biliare în ciroza biliară primitivă şi al celulelor tiroidiene în afecţiunile tiroidiene autoimune. Expresia moleculelor este indusă de mediatori precum: IFN-g, TNF-a şi β, IL-4, IL-13 şi GM-CSF cu rol esențial în răspunsul imun. Prostaglandina E2 inhibă sinteza lor pe monocite / macrofage. Regiunea HLA-II conține gene ce codifică HLA-DR, DQ, DP, DM, și pe lângă acestea, câteva molecule accesorii: PSMB8, PSMB9, TAP1, TAP2, BTNL2. Moleculele HLA-III nu sunt implicate în histocompatibilitate. Sunt total diferite de cele de clasele I și II. Nu se află atașate pe membranele celulare și nu intervin în recunoașterea peptidelor antigenice.

12. 3. Roluri Limfocitele T protejează organismul uman de 2 mari categorii de agenţi patogeni: virusurile, care preiau comanda celulei pe care o infectează (devenind astfel antigene endogene) și bacteriile care se replică autonom, majoritatea extracelular. Cele 2 clase ale MHC sunt esenţiale în recunoaşterea şi răspunsul imun față de peptide derivate din „agresori”. În ”lupta” dintr-o infecţie virală, virusul este eliminat de către LT CD8+ care recunoaşte peptide virale endogene ataşate de MHC-I. În schimb, o bacterie e eliminată prin fagocitare de către macrofage sau neutrofile. 142

LT CD4+ recunoaşte peptidele bacteriene legate de MHC-II şi direcţionează răspunsul imun către activarea macrofagelor şi producţia de anticorpi care opsonizează bacteria. Moleculele de histocompatibilitate au așadar un rol fundamental în prezentarea peptidului antigenic către: · limfocitul T helper - HLA-II sau · limfocitul T citotoxic - HLA-I. În această comunicare intercelulară intră în contact 3 molecule: · HLA · peptidul antigenic · TCR. Rolul moleculelor HLA clasa I Au rol în principal în reacţia imună care implică intervenţia LTc. Moleculele HLA I prezintă un peptid endogen sintetizat de o celulă contaminată de o bacterie/un virus/un parazit cu dezvoltare intracelulară sau un peptid endogen rezultat din degradarea unor celule self tumorale sau îmbătrânite către receptorul de antigen (TCR) al limfocitului T CD8+. Se va obţine astfel un răspuns imun celular prin activarea şi multiplicarea LTc având ca rezultat liza celulelor ţintă ce au prezentat antigenul prin HLA-I. (Figura nr. 4) Rolul moleculelor HLA clasa a II-a Ele intervin în principal în răspunsul imun în care sunt implicate APC şi LTh. Moleculele HLA II prezintă limfocitului Th CD4+ peptide de origine exogenă, provenite din proteinele endocitate şi degradate de APC. (Figura nr. 5) Etape: a) Legarea antigenului exogen de molecula HLA clasa II: 1. Endocitoza - particulele antigenice (bacterii, proteine străine) sunt internalizate nespecific de monocite / macrofage sau specific de limfocitele B prin IgM. Ele urmează calea endocitozei; 2. Generarea peptidelor antigenice - prin fuzionarea endozomilor cu lizozomii, proteinele sunt degradate în peptide prin activarea proteazelor lizozomale la un pH acid; 3. Asocierea cu HLA II - moleculele HLA clasa II-a sintetizate în reticulul endoplasmic sunt asociate, sub forma unui complex, cu o proteină accesorie, lanţul invariabil II. Aceasta împiedică legarea peptidelor endogene de HLA-II prin blocarea situsului de legare în timpul sintezei sale și permite legarea peptidelor exogene prin distrugerea lanţului după terminarea sintezei; 4. Trecerea prin membrana celulară - ansamblul HLA-II-peptid exogen este exprimat la suprafaţa APC. (Figura nr. 6) b) Interacţiunea între APC şi limfocitul T helper: Peptidele antigenice sunt recunoscute de către LTh prin TCR numai dacă sunt prezentate de către APC pe MHC-II. Pe de alta parte, limfocitul helper CD4+, prin TCR-ul său nu poate interacţiona cu o APC decât dacă recunoaşte antigenele cuplate cu moleculele MHC ale individului (restricţie allogenică). Molecula accesorie CD4 a limfocitului helper interacţionează cu domeniul β2constant al HLA-II declanșând astfel primul semnal către limfocit pentru activarea sa. În urma unor reacţii în cascadă LT va intra în mitoză, va secreta o serie de citokine şi va colabora cu LB spre producţia de anticorpi având ca scop eliminarea antigenelor exogene. Specificitatea reacţiei este datorată asocierii trimoleculare TCR, HLA, peptid antigenic.

143

O parte din moleculele codificate de regiunea HLA-II sunt implicate în procesarea şi încărcarea peptidelor pe HLA-I. Astfel, PSMB8 şi PSMB9 sunt subunităţi ale proteozomului iar TAP1 şi TAP2 transportă peptidele endogene din citoplasmă în RE. BTNL2 este implicată în susceptibilitatea la sarcoidoză Moleculele HLA-III sunt împărţite în două categorii în funcţie de rol: a.) cu rol în imunitate şi inflamaţie: componentele complementului C2 şi C4, TNF, HSP (proteina de şoc termic); b.) cu rol enzimatic: CYP21

12. 4. Povestiri adevărate 12.4.1. Polimorfismul HLA Orice celulă care prezintă un tip de HLA diferit de cel al organismului este considerată non-self, un „invadator”, iar rezultatul este acela de rejecţie a ţesutului compus din respectivele celule. Din cauza importanţei HLA în transplant, locusurile HLA sunt printre cele mai frecvent serotipate sau analizate prin PCR faţă de oricare alte alele autozomale. În diferite studii, s-a analizat importanţa compatibilităţii HLA în transplantul de inimă, rinichi, celule stem hematopoietice. Polimorfismul sistemului HLA este foarte mare şi de aceea probabilitatea ca organele donoare să fie potrivite primitorului este foarte mică. În transplanturi a existat practica de a se aloca organe fără a se lua în considerare compatibilitatea HLA donor-receptor. De aceea, în trecut, nu a fost posibilă analizarea corespunzătoare a ratei de succes a transplantului cu organe compatibile HLA. Într-un studiu realizat pe 8.331 de pacienţi, internaţi în 104 centre din 24 state din USA, doar 128 subiecţi au primit câte o grefă cardiacă compatibilă HLA (A, B sau DR) sau doar cu o singură incompatibilitate. S-a observat supravieţuirea ţesutului pe o durată de 3 ani, iar rezultatele au fost dependente de sistemul HLA. Astfel, au avut succes: la compatibilitate maximă 83±4% transplanturi faţă de 76 ±2% transplanturi la 2 nepotriviri. Aşadar, supravieţuirea grefei în transplantul de cord este semnificativ influenţată de compatibilitatea HLA. Există două tipuri de incompatibilitate: a antigenelor (detectabilă serologic) şi a alelelor (detectabilă prin metode de analizare a ADN-ului). Într-un studiu s-a testat ipoteza conform căreia incompatibilitatea alelelor este mai puţin imunogenă decât incompatibilitatea antigenelor şi, astfel, este mai puţin asociată cu rejecţia de transplant cu celule stem hematopoietice. Peste 450 de pacienţi cu leucemie mieloidă cronică au primit transplant de măduvă de la donori diferiţi. Prin secvenţierea ADN, s-au analizat alelele clasei I HLA (A, B, C) şi s-au observat ratele de respingere a grefei la transplanturile fără nici o incompatibilitate, la cele cu o singură incompatibilitate a alelelor sau a antigenelor sau la transplanturile cu 2 sau mai multe nepotriviri. Rezultatele au confirmat ipoteza şi, astfel, riscul rejecţiei de transplant a fost semnificativ mai mare la cei cu o incompatibilitate antigenică HLA, faţă de cei cu o incompatibilitate alelică. Riscul a fost de asemenea crescut la cei cu mai multe nepotriviri HLA şi la primitorii homozigoţi HLA în locusul de incompatibilitate. În concluzie, transplanturile de la donori cu o singură incompatibilitate a alelelor HLA au un risc scăzut de rejecţie şi pot fi realizate cu succes. În schimb, incompatibilitatea de antigene HLA, detectabilă serologic, creşte riscul de respingere a ţesutului. 12.4.2. Asocierea subtipurilor HLA cu susceptibilitatea la boli 144

Studii epidemiologice au demonstrat că peste 40 de boli se întâlnesc mai frecvent la indivizi purtători ai anumitor alele HLA I sau II decât la populaţia generală. Importanţa acestor efecte este extrem de mare, deşi nu vor fi probabil niciodată demonstrate ca absolute. De exemplu, între 90% şi 95% din pacienţii caucazieni cu spondilită ankilozantă posedă HLA-B27 (1), iar 30%-50% din pacienţii caucazieni cu diabet zaharat tip I sunt HLA-DQ2/DQ8 heterozigoţi. Interesant este faptul că HLA-DQ6 pare a fi responsabilă de protecţia împotriva diabetului zaharat de tip I. Majoritatea bolilor care au legătură cu anumite gene HLA au un caracter autoimun. Baza moleculară a acestei legături este necunoscută din cauza lipsei identificării autoantigenului primar care reprezintă „triggerul”. (2) Cu toate că mecanismele prin care genotipurile HLA controlează susceptibilitatea la aceste boli sunt încă incomplet definite, se crede că participarea moleculelor MHC în stabilirea toleranţei imunologice şi în recunoaşterea antigenelor stă la baza acestor fenomene. Alelele HLA ce oferă protecţie pot media eliminarea în timus a LT potenţial patogene responsabile de autoimunitate, în timp ce alelele HLA susceptibile pot eşua în eliminarea LT patogene. Pe de altă parte, genotipurile HLA pot guverna receptivitatea la anumite vaccinuri. Spre exemplu, subiecţii care au alela HLA-DR3 sunt, într-o proporţie crescută substanţial, nereceptivi la vaccinarea cu antigenul de suprafaţă al hepatitei B. Totodata, indivizii cu HLA-DRB1*03 sau HLA-DQA1*0201 au o incidenţă crescută de seronegativitate la vaccinarea împotriva pojarului. (3) Un studiu realizat de curând pe cetăţeni americani caucazieni certifică faptul că homozigoţii HLA-DR13DQ6 prezintă risc crescut de asociere a distoniei cervicale. (4) O altă boală cu caracter autoimun şi conexiuni certe cu sistemul HLA este scleroza multiplă. (5-6) 12.4.3. Prezentarea de antigene independent de MHC Recent s-a fundamentat ideea conform căreia există o clasă nouă de LT care recunosc antigene prezentate de molecule ce nu sunt MHC-I sau MHC-II. Una dintre aceste clase de LT foloseşte un receptor pentru antigen ce recunoaşte antigene lipidice prezentate pe molecule CD1. CD1 sunt asemănătoare structural cu MHC-I, însă lanţurile CD1 formează un situs ce poate acomoda componente glicolipidice ale patogenilor microbieni. Astfel, complexele CD1-glicolipide servesc drept ţintă pentru recunoaşterea de către LT ce au un tip special de receptor: γδ TCR. Această prezentare a glicolipidelor microbiene pe molecule CD1 pare să fie responsabilă de recunoaşterea independentă de MHC a mycobacteriilor. (3)

12. 7. Verificați-vă cunoştinţele 1. Principala caracteristică a sistemului HLA este: A. codominanţa B. specificitatea C. polimorfismul D. histocompatibilitatea E. imunogenicitatea. 2. Moleculele MHC-II se află pe: A. majoritatea celulelor din organism B. numai pe celulele nucleate C. numai pe macrofage 145

D. toate APC E. limfocite 3. Colaborare intercelulară există între: A. HLA-II şi LTc B. HLA-I şi LTc C. APC şi HLA-I D. HLA-I şi LTh E. HLA-I şi HLA-II 4. Moleculele HLA-II prezintă către limfocite în situsul lor: A. imunoglobuline B. sfingolipide C. peptide exogene D. TCR E. peptide endogene

13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi Interacţiunile între celulele imunitare se realizează prin două mecanisme complementare: · contactul celular strâns, care necesită prezenţa moleculelor de adeziune (direct); · prezenţa factorilor stimulatori, citokine, secretate de una din cele două celule aflate în contact sau, uneori, de o celulă aflată la distanţă (indirect). Rezultatul va fi activarea sau inhibarea funcţiei celulare, ca urmare a transportului informaţiei prin mesagerii secunzi spre organitele intracitoplasmatice, membrana celulară sau genele nucleare.

13. 1. Moleculele de adeziune Contactul între două celule nu se face spontan. Rolul moleculelor de adeziune este complex şi nu se limitează la procesele imunologice. Legăturile intercelulare asigurate de liganzi sunt reacţii chimice clasice specifice, saturabile şi reversibile. Clasificarea moleculelor de adeziune se poate face în două moduri, structural şi funcţional.

13. 1. 1. Clasificarea structurală a moleculelor de adeziune 146

Clasificarea structurală a moleculelor de adeziune se bazează pe caracteristicile chimice ale moleculei care permit legarea sa de o anumită superfamilie sau familie de proteine. Expresia lor pe suprafaţa celulei poate fi constitutivă sau indusă în urma activării celulare. Selectinele (LECAM-family, leucocyte-endothelial cell adhesion molecule) Selectinele sunt glicoproteine transmembranare cu un domeniu N-terminal lectinic-calciu-dependent şi domenii reglatoare pentru sistemul complement. Selectinele au rol în adeziunea intercelulară; joacă un rol important în amorsarea procesului inflamator. · L-selectinele sunt exprimate constitutiv pe suprafaţa leucocitelor, în timp ce expresia E-selectinelor pe endoteliu este indusă de către TNF-a, IL-1 şi lipopolizaharidele bacteriene iar a P- selectinelor de către C5b, histamină şi trombină. · L-selectinele joacă un rol important pentru LT imature şi APC (celule dendritice) care sunt astfel direcţionate către situsuri cu rol imunologic important, precum nodulii limfatici sau GALT. · P-selectinele formează împreună cu factorul Willebrand granule denumite corpusculii WeibelPalade. P-selectinele sunt primele expuse pe versantul circulator, fiind stocate în vezicule.

Integrinele Familia integrinelor cuprinde peste 20 de membri, glicoproteine transmembranare cu structură heterodimerică (a, β). Iniţial au fost caracterizate 3 subfamilii, cu lanţul β comun şi lanţul a diferit, pentru ca în prezent să se cunoască faptul că lanţul a se poate asocia cu mai multe lanţuri β (β 1-8). Localizarea integrinelor este ubicuitară (cel puţin un membru al acestei familii pe toate celulele nucleate). Leucocitele pot exprima cel puţin 13 astfel de receptori. Celulele epiteliale exprimă la rândul lor o serie de integrine, constitutiv sau indus, în urma procesului inflamator. Integrinele intervin în legarea intercelulară şi între celulă şi substrat, prin care contribuie la organizarea tisulară şi migrarea celulară, alături de superfamilia imunoglobulinelor; subfamilia β2-integrinelor stimulează proliferarea limfocitelor T, la contactul cu celulele dendritice; cresc sinteza de citokine (β1 şi β2-integrinele stimulează producţia de TNF-a şi β a celulei T; β2-integrinele stimulează producţia de IL-1β a monocitelor, la contactul cu limfocitul T). Integrinele au două stadii conformaţionale, cu specificitate diferită faţă de substrat (Figura nr. 1). Acestea sunt influenţate de procese celulare interne de fosforilare ce induc schimbări conformaţionale, ca răspuns la factori din mediu (vezi secţiunea de integrare a cunoştinţelor: recrutarea celulelor din torentul sangvin). Superfamilia imunoglobulinelor (imunoglobulin-like) Moleculele de adeziune din această clasă au o structură „imunoglobulin-like” prin expresia extracelulară a unor domenii repetitive de tip imunoglobulinic. Sunt clasificate în trei subfamilii: · ICAM (intercellular adhesion molecule), · VCAM (vascular cell adhesion molecule) şi · PECAM (platelet-endothelial cell adhesion molecule). Moleculele de adeziune din această clasă intervin în legarea intercelulară, mai ales în interacţiunea leucocit-endoteliu. Prin cuplarea lor cu liganzii de selecţie (integrine) intervin în legarea leucocitară şi prin aceasta în controlul infiltratului inflamator local. Expresia lor pe suprafaţa celulară este constitutivă sau indusă de citokine. Caderinele Caderinele sunt formate dintr-un singur lanţ polipeptidic şi sunt exprimate constitutiv pe suprafaţa celulelor. Au rol în legarea intercelulară prin aderarea unora de altele, pe celulele adiacente, printr-un 147

mecanism calciu-dependent. Prin funcţia lor asigură integritatea epiteliilor. Caderinele sunt clasificate în patru subfamilii: · E-caderine (pe epitelii), · V-caderine (pe endoteliu), · P-caderine (placentare), · N-caderine (în sistemului nervos central şi ochi). adresine vasculare Sunt glicoproteine exprimate pe suprafaţa celulelor endoteliale şi intervin în „homing-ul” limfocitar, respectiv în direcţionarea limfocitelor spre ganglionii limfatici şi ţesuturile extraganglionare. Carbohidraţii Reprezintă liganzii specifici pentru selectine şi nu constituie o clasă distinctă de molecule de adeziune.

13. 1. 2. Clasificarea funcţională a moleculelor de adeziune 13. 1. 2. 1. Moleculele accesorii asociate cu TCR · molecula CD4 Această moleculă este exprimată pe suprafaţa a 2/3 din LT mature circulante, definind subsetul de LT CD4+. Molecula CD4 este prezentă şi pe suprafaţa celulelor dendritice cutanate şi pe monocitele/macrofagele activate. Este o moleculă de 55-67 kDa, cu o parte extracelulară compusă din 4 domenii din superfamilia Ig, care recunoaşte o parte constantă situată la nivelul domeniului β2 a moleculei HLA II. · molecula CD8 Această moleculă este exprimată pe suprafaţa a 1/3 din LT mature circulante. Defineşte subsetul de LT cu activitate citotoxică şi unele celule NK (în proporţie mai mică) (Figura nr. 2). Molecula CD8 este homodimerică (CD8a/CD8a) sau heterodimerică (CD8a/CD8b). Rolul său primordial este să asigure interacţiunea cu o parte monomorfă a moleculei HLA I, pentru recunoaşterea domeniului a3 al acestei molecule. Molecula CD8, ca şi molecula CD4, este asociată cu tirozinkinaza. NB. Pentru mai multe informații despre apoptoză, vezi capitolul Toleranţă Imunologică. 13. 1. 2. 2. Moleculele de adeziune necesare costimulării între celulele prezentatoare de antigen şi limfocitele T În permanenţă, între APC şi LT se stabilesc cupluri de adeziune intercelulară. Este nevoie de prezenţa APC dar şi de o „colaborare bidirecţională” („crosstalk”) între APC şi LT (trebuie să existe o dublă activare a celor două tipuri de celule, în sens anterograd şi retrograd), întrucât în lipsa acestora, limfocitul T nu este capabil să capteze şi cu atât mai mult, să prelucreze Ag native T-dependente (Figura nr. 3). Cuplurile de adeziune stabilesc un efect de „fermoar” între membrana APC şi LT, legătura având loc înainte ca TCR să vină în contact cu epitopul (cuplul se formează chiar dacă APC prezintă un epitop pentru care LT nu are receptori specifici). Se descriu trei cupluri:

Cuplul B7-CD28 · Molecula B7 se exprimă pe suprafaţa majorităţii APC (celule dendritice în repaus, macrofage activate şi LB activate). Deşi este absentă pe macrofagele şi LB în repaus, în urma costimulării acestora, molecula B7 se exprimă pe suprafaţa lor, pentru a asigura o cooperare celulară pozitivă. 148

· Molecula CD28, care recunoaşte receptorul B7, este prezentă pe toate LT, cu excepţia LT supresoare şi permite costimularea între APC şi LT. · Rezultatul este transcripţia unor factori antiapoptotici precum Bcl-x şi IL-2.

Cuplul B7-CTLA-4 (CD80) Molecula CTLA-4 nu este exprimată decât de LT CD4+ sau T CD8+, într-o proporţie mai mică decât molecula CD28 dar cu o afinitate de 20 de ori mai mare pentru molecula B7. Interacţiunea cu APC poate induce inhibiţie şi chiar apoptoză . NB. CTLA-4 competiţionează cu CD28 pentru legarea moleculei B7, exprimată pe membrana APC. Datorită efectelor discrepante – activatoare/inhibitoare – se pune problema înţelegerii modului în care LT va traduce semnalul primit. 1). Dacă APC este activat de prezenţa în mediu a citokinelor pro-inflamatorii (ex. IL–2), va prezenta un număr mai mare de molecule B7, favorizând legarea CD28, iar semnalul transmis va fi activator (Figura nr. 4). 2). În cazul în care APC este puţin activat, va exprima pe membrana sa puţine molecule B7. Acest fapt va oferi un avantaj de legare moleculelor cu afinitate mai mare, aşa încât majoritatea moleculelor legate vor fi de tip CTLA-4 (CD80), iar semnalul transmis va fi inhibitor (Figura nr. 5). Raportul semnalului activator/inhibitor transmis de aceste cupluri moleculare este modulat de factorii de mediu şi decide comportamentul ulterior al LT (vezi capitolul „Toleranţă Imunologică” pentru mai multe detalii).

Cuplul CD40 şi CD40L · Molecula CD40 se exprimă pe toate celulele prezentatoare de antigen în repaus - celule dendritice, LB şi monocite/macrofage dar şi pe progenitorii hematopoietici şi celulele epiteliale. · Molecula CD40L (L pentru ligand) nu se exprimă decât pe LT activate CD4+ sau CD8+ şi nu pe cele în repaus. Este de asemenea prezentă pe bazofile şi mastocite. Sindromul hiper-IgM, X-linkat se caracterizează prin absenţa moleculei CD40L funcţionale. · Mecanismul prin care interacţiunea CD40-CD40L stimulează răspunsul LT pare a fi reprezentat de intensificarea secreţiei de IL-12 şi creşterea numărului de molecule B7 de pe membrana APC („APC licensing”), ducând la recrutarea mai multor celule prezentatoare de antigen şi potenţarea semnalului costimulator transmis de aceste celule. 13. 1. 2. 3. Moleculele de adeziune necesare costimulării între celulele prezentatoare de antigen şi limfocitele T helper sau limfocitele T citotoxice şi ţintă. Aceşti liganzi cuprind următoarele două cupluri:

Cuplul LFA2 (CD2) şi LFA3 (CD58) (LFA - leukocyte function - associated antigen) · Molecula LFA2 (CD2) permite formarea rozetelor E (E pentru eritrocite) între LT umane şi eritrocitele de oaie. Fenomenul se datorează prezenţei LFA3 pe eritrocitele de oaie. · Molecula LFA3 (CD58) are o distribuţie largă, care cuprinde celulele endoteliale vasculare, fibroblaştii, limfocitele şi macrofagele.

Cuplul LFA1 şi ICAM 1, 2 şi 3 · Molecula LFA1 corespunde integrinei aL/β2 (CD11a/CD18). Prezenţa sa este relativ difuză la nivelul diferitelor leucocite (neutrofile, monocite, LT, LB şi LT de memorie). 149

· ICAM1 (CD54), ICAM2 şi ICAM3 sunt puternic exprimate la nivelul LT citotoxice şi permit activarea lor. ICAM1 se găseşte pe neutrofile în repaus, celule endoteliale, monocito/macrofage şi LB activate. Aceste două cupluri de adeziune permit recunoaşterea şi interacţiunea între LT CD4+ şi APC sau între LT CD8+ şi celula ţintă, proces completat de specificitatea TCR. Conexiunea constituită între LT CD4+ şi APC a fost numită „sinapsă imunologică”, subliniind transferul informaţional implicat în recunoaşterea epitopului exprimat pe moleculele MHC II de către TCR

13. 2. Citokinele (Interleukinele) Citokinele sunt substanţe proteice, solubile, cu greutate moleculară mică, 8-70 kDa. cel mai frecvent sunt sintetizate de către celule după activare prealabilă, acţionând ca mediatori asupra altor celule sau asupra lor însăşi, în cantităţi foarte mici, de ordinul pico sau nanogramelor. În momentul de faţă au fost identificate peste 100 de molecule diferite de citokine. O parte dintre citokine au în special efecte „chemotactice” şi din acest motiv au fost numite chemokine. Termenii de limfokine (substanţe sintetizate de limfocite) sau de monokine (provenind din monocite) nu se mai folosesc deoarece citokinele sunt sintetizate de o gamă mult mai largă de celule. Termenul de interleukine, care indică o acţiune între două leucocite, a persistat şi continuă să persiste în denumirea prescurtată, de la IL1 la IL-35. Termenul de citokine pare să fie cel mai adecvat. În unele cazuri, denumirea provine de la una din activităţile care au permis descoperirea citokinei: TNF (tumor necrosis factor), IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte/monocyte-colony stimulating factor), G-CSF (granulocyte-CSF), M-CSF (monocyte-CSF), TGF (transforming growth factor). În afara sistemului imun şi hematopoietic au fost descoperiţi şi alţi factori de creştere: NGF (nerve growth factor), FGF (fibroblast growth factor), EGF (epithelial growth factor) etc. Citokinele acţionează datorită prezenţei receptorilor specifici, desemnaţi prin denumirea lor engleză: IL-1R, IL-2R, TNF-R etc. Ei sunt prezenţi uneori pe aceeaşi celulă care a sintetizat citokina (efect autocrin) sau pe alte celule (efect exocrin). O clasificare atotcuprinzătoare a citokinelor este foarte dificilă, din punct de vedere funcţional, pentru motivele prezentate (şi care reprezintă un „punct” din „cutia Pandorei” la care se face uneori referire, atunci când sunt luate în discuţie aceste structuri). Din punct de vedere didactic (şi funcţional), vom încerca să prezentăm în continuare o grupare a celor mai cunoscute dintre citokine.

13. 2. 1. Citokine pro-inflamatorii În cadrul procesului infecţios, diferitele microorganisme care au sau dobândesc prin variabilitate un efect de agresiune faţă de organismul gazdă, antrenează un răspuns la nivelul endoteliului vascular; una dintre primele reacţii este reprezentată de mobilizarea leucocitelor polimorfonucleare neutrofile (PMN). În această etapă intervin şi o serie de citokine. · TNF-α şi TNF-β TNF-α este produs de monocite / macrofage dar şi de diverse alte celule (limfocite T, limfocite B, celule NK, fibroblaste, mastocite, bazofile, celule gliale etc), ca reacţie la contactul cu diferite bacterii sau lipopolizaharidele din peretele germenilor Gram-negativi. Sursa cea mai importantă pentru TNF-α rămâne însă sistemul monocito-macrofagic. TNF-α favorizează expresia moleculelor de adeziune la nivelul endoteliului vascular şi al monocitelor; atrage către sediul procesului infecţios alte monocite şi leucocitele PMN. Are o 150

activitate anti-virală, anti-parazitară şi anti-tumorală. Stimulează lipoliza, glicoliza musculară şi reabsorbţia osoasă prin care poate antrena apariţia caşexiei (TNF a fost numit iniţial caşexină). Induce formarea altor mediatori ai inflamaţiei (leucotriene, PAF). Formarea sa este la rândul său indusă de IFN, IL-1, factori de creştere sintetizaţi de monocit, endotoxinele bacteriilor Gram-negative, diferite virusuri, bacterii, unele componente ale sistemului complement, leucotriene şi prostaglandine. Eliberarea TNF-α este inhibată de glucocorticoizi, α2-macroglobuline, α2-antitripsină etc. TNF-β este sintetizat de LT activate şi celule NK şi are acţiuni identice cu TNF-α, acţionând pe acelaşi tip de receptori. În momentul de faţă este clasificat între limfotoxine (LT-α). · IL-1 şi IL-6 Sunt două citokine cu rol asemănător. Sunt produse de numeroase celule: monocite, macrofage, LT, LB, celule endoteliale vasculare, keratinocite (din piele), astrocite şi celule gliale (din creier) etc. IL-1 se găseşte sub două forme: IL-1a fixată la membrană şi IL-1β secretată. Experimental a fost demonstrat că stimularea cu orice structură microbiană a celulelor care în mod potenţial sintetizează IL-1 va duce la sinteza acestor molecule (IL-1a şi IL-1β). Ele sunt codificate de gene diferite dar recunosc aceeaşi receptori: primul receptor IL-1R1 induce transducţia informaţiei la nivel celular, în timp ce IL-1R2 nu induce un semnal celular. IL-1α are funcţie imunologică, activând la nivel superior LTh, care se vor divide mitotic şi se vor diferenţia în diverse clase. IL-1β, eliberată în spaţiul extracelular şi în sânge, exercită o puternică acţiune proinflamatorie. Celulele care sintetizează IL-1 produc câteva ore mai târziu un antagonist al receptorului de IL-1, numit IL-1Ra, care face ca acţiunea IL-1 să fie tranzitorie. IL-1 induce creşterea expresiei moleculelor de adeziune; activează limfocitele T şi B; creşte sinteza proteinelor de fază acută la nivel hepatic; creşte catabolismul celulelor musculare şi al osteoclastelor (rezorbţie osoasă); activează sistemul nervos central cu febră, anorexie şi insomnie. Fiind şi prima interleukină numită ca atare, IL-1 a fost considerată iniţial drept o moleculă piretogenă. Inocularea de IL-1 la subiecţi umani conduce la apariţia febrei şi frisonului. Concentraţia de IL-1 din plasmă poate să crească şi în condiţii fiziologice (ex. în stres nepatologic, exces de vitamină A, în timpul menstruaţiei). IL-6 are o acţiune atât asupra sistemului imun cât şi asupra unor celule care nu aparţin acestuia, asemănătoare cu aceea a Il-1, cu o singură diferenţă: ea acţionează mai ales pe maturaţia terminală a LB în plasmocite şi pe diferenţierea LT citotoxice. Ca şi IL-1, produce proteoliză endogenă, induce sinteza proteinelor inflamatorii la nivel hepatic (fibrinogen, haptoglobină, α1-antitripsină, proteină C reactivă etc) şi activează sistemul nervos central conducând la apariţia febrei, anorexiei, somnolenţei etc. IL-6 induce sinteza de imunoglobuline; are şi rol în maturarea celulelor pe linia megakariocitară. Sinteza IL-6 este stimulată de IL-1. · Limfotoxinele Limfotoxina (LTx) a fost identificată în urma efectului citotoxic exercitat de limfocitele activate, ulterior a fost sintetizată şi caracterizată, dar s-a dovedit că nu există un singur factor de acest tip, ci o serie de substanţe care ar putea fi grupate într-o „superfamilie”. Iniţial LT-α, o limfotoxină solubilă, a fost definită drept factor de necroză tumorală (TNF-β). Dintre numeroşii membri ai superfamiliei limfotoxinelor menţionăm LT-α şi LT-β, sintetizate în special de LT şi LB activate, dar şi de către celulele NK sau celule LAK (lymphokine activated killer cells). Au rol în etapele de iniţiere a inflamaţiei şi se pare că au un rol în realizarea unei protecţii faţă de agresiunea microbiană. · IFN-g 151

Dintre efectele pro-inflamatorii ale IFN-γ amintim activarea macrofagelor (acest interferon este probabil cea mai importantă substanţă care produce „trecerea” macrofagelor de la o stare „în aşteptare” la starea activă, bactericidă) şi astfel intervine în fazele iniţiale ale inflamaţiei dar şi în diferenţierea clonelor de limfocite care reacţionează faţă de structurile bacteriene agresoare (Figura nr. 7). Alte efecte vor fi prezentate în următoarele subpuncte. · IL-10 Acţionează atât asupra celulelor hematopoietice cât şi asupra altor celule. Dacă iniţial s-a considerat că are efecte pro-inflamatorii, în momentul de faţă se cunoaşte faptul că, prin efectele inhibitorii asupra monocitelor, neutrofilelor, celulelor dendritice, este de fapt o interleukină cu efect anti-inflamator. A fost numită şi „factor de inhibare al macrofagelor”. · IL-11 Sinteza IL-11 poate avea loc la nivelul fibroblastelor, condrocitelor, sinoviocitelor, keratinocitelor, celulelor endoteliale, celulelor epiteliale etc. Administrarea de IL-11 stimulează sinteza unor reactanţi de fază acută, la fel ca şi IL-6. Totuşi, efectul esenţial al IL-11 se adresează creşterii trombocitare. Are şi efecte anti-inflamatorii la nivelul adipocitelor şi osteoclastelor. Relativ recent, a fost avizată utilizarea IL-11 în tratamentul asociat chimioterapiei din cancer, pentru a preveni apariţia unei trombocitopenii severe la pacienţii care primesc medicaţie citotoxică, anti-tumorală. · IL-12 Cunoscută drept o substanţă care induce sinteza de IFN-γ, IL-12 are şi alte efecte de stimulare a răspunsului inflamator al gazdei, în urma unui proces infecţios. Sursa cea mai importantă de IL-12 este reprezentată de celulele dendritice. · IL-16 Iniţial a fost considerată o chemokină pentru LT Helper (CD4 +), dar poate exercita astfel de activităţi şi faţă de alte celule implicate în procesul infecţios şi în inflamaţie. Sursa principală de IL-16 este reprezentată de LT CD8+. · IL-17 (A, B, C, F) Au efecte proinflamatorii şi de stimulare a hematopoiezei. · IL-18 A fost considerată drept o moleculă care induce sinteza de IFN-γ. Ulterior s-a dovedit că singură, nu duce la o stimulare eficientă, dar în asociere cu IL-12, efectul de stimulare al sintezei de IFN-γ demonstrează sinergism. IL-18 este sintetizată în special de macrofagele activate şi de către celulele dendritice, dar există şi alte celule producătoare de IL-18 (monocite, keratinocite, celule epiteliale intestinale etc). Are efecte proinflamatorii, efecte în procesul infecţios declanşat de o serie de bacterii (ex. Listeria spp.), paraziţi (ex. Cryptococcus neoformans) sau virusuri (ex. virusul gripal), efecte anti-tumorale şi intervine în patogenia unor boli în care există inflamaţie cronică sau în boli autoimune. · IL-22 Este o citokină înrudită cu IL-10, dar cu puternice proprietăţi pro-inflamatorii. Într-un studiu pe celule pulmonare, s-a demonstrat un răspuns semnificativ IL-22 mARN la 6 ore de la debutul infecţiei cu Klebsiella pneumoniae. Răspunsul indus în celule cultivate în prezența aceastei citokine, este de exprimare a moleculelor defensive în celulele epiteliale traheale. Unul din efectele induse de această citokină este exprimarea moleculei lipocalin-2, cu rol în sechestrarea fierului. Într-un model de infecţie colonică s-a demonstrat că lipsa IL-22 duce la instabiltatea barierei epiteliale şi diseminare bacteriană. 152

· IL-23 Are efecte asemănătoare cu IL-12, exercitate în combinaţie cu IL-12. Este sintetizată mai ales de celulele dendritice. · HMGB1 (high mobility group box chromosomal protein 1) Iniţial a fost caracterizată ca o proteină non-histonică cu rol în arhitectura cromozomilor. S-a demonstrat că această citokină cu totul particulară are rol pro-inflamator, fiind eliberată din celulele necrotice (şi doar în mică măsură de cele apoptotice), jucând rol de DAMP (Damage Associated Molecular Pattern) dar şi secretată activ de macrofage stimulate. Receptorul membranar specific, numit RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products) mediază efectele sale. Această proteină are un rol patogenic important în sepsis şi medierea efectelor de fază târzie ale LPZ-ului. Astfel, s-a demonstrat experimental, la animale, că mortalitatea în sepsis a fost redusă prin administrarea pasivă de anticorpi anti-HMGB1.

13. 2. 2. Citokine cu acţiune anti-virală şi anti-proliferativă În această categorie sunt cuprinse mai multe interleukine. · Spre exemplu interferonul a şi β. IFN-a este produs de monocite şi celulele hematopoietice iar IFNβ este produs de alte celule de tipul fibroblaştilor şi al celulelor endoteliale. Cele două citokine prezintă acţiune anti-virală şi anti-proliferativă; stimulează celulele NK; cresc expresia moleculelor MHC I; activează producţia de IL-2 de către monocite/macrofage şi celule dendritice; induc sinteza de IFN-g, cu acţiune anti-virală şi antiproliferativă. · IL-2, cu efect autocrin şi paracrin, a fost prima interleukină utilizată în terapia cancerului (administrarea pe cale intravenoasă a fost asociată, din nefericire, cu efecte toxice severe; datorită acestor efecte, dar şi descoperirii unor efecte similare prin administrarea altor molecule în alte situaţii clinice, în momentul de faţă a intrat între noţiunile medicale clasice şi definirea „sindromului de toxicitate al citokinelor”). Mai recent, se încearcă administrarea IL-2 la pacienţii cu infecţie HIV / SIDA, în speranţa că efectele proliferative asupra LT CD4+ vor îmbunătăţi istoria naturală a bolii. O analiză recentă a datelor din două mari studii clinice a arătat un efect neutru al terapiei. (1) · Prin potenţarea activităţii citotoxice a LT şi a celulelor LAK, IL-12 ar putea avea utilitate clinică în inhibarea procesului infecţios determinat de virusuri dar şi în diferite forme de neoplazii. · IL-18 are sau induce efecte împotriva virusului Epstein-Barr, virusului gripal, virusului herpes simplex etc dar are şi efecte anti-tumorale.

13. 2. 3. Citokine activatoare ale răspunsului imun celular Citokinele cu rol în răspunsul imun celular au ca sursă de provenienţă limfocitele Th1. În această categorie sunt incluse următoarele citokine. · IL-2 este produsă în special de LT CD4+ de tip Th0 şi Th1 (cu rol în RIP de tip celular) activate şi într-o mai mică măsură de celulele NK şi de celulele dendritice. Şi LT Th2 (cu rol în RIP de tip umoral) pot 153

sintetiza IL-2. IL-2 acţionează asupra diferitelor celule cu rol în imunitate [asupra limfocitelor T acţionează printr-un mecanism autocrin, antrenând proliferarea şi activarea spre subsetul Th1 dar şi Th2; transformă celulele Nk în celule LAK (lymphokine activated killer cells); antrenează proliferarea limfocitelor B]. Acţionează sinergic cu IL-12 şi IFN-γ stimulând activitatea citotoxică a celulelor NK. IL-2 a fost prima dintre interleukine care a fost caracterizată până la nivel structural. Este o interleukină cu 133 aminoacizi, o greutate moleculară de 15,5 kDa; gena care codifică sinteza de IL-2 se găseşte pe cromozomul 4. · IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esenţială pentru această interleukină este reprezentată de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor, cu producerea speciilor reactive ale oxigenului şi NO, cu efect bactericid asupra microorganismelor intracelulare. Prin acţiunea sa antiTh2, reduce răspunsul imun umoral. IFN-γ controlează funcţii imune implicate în apărarea antibacteriană, antivirală şi antiparazitară.

13. 2. 4. Citokine activatoare ale răspunsului imun umoral Aceste citokine sintetizate de ex. de către limfocitele Th2 şi unele mastocite, orientează răspunsul imun umoral spre diferitele clase şi subclase de imunoglobuline. · IL-4 acţionează în etapa iniţială a răspunsului imun umoral, permiţând trecerea LB din stadiul G0 la stadiul G1. Stimulează producerea şi maturarea intramedulară a LB. Acţiunea sa este întărită de IL-1. De asemenea, stimulează producerea de IgG, specifică RIU secundar şi blochează producerea de IgM, specifică RIU primar. Mecanismul are loc la nivel de genom şi se numeşte izotipic switch (comutare izotipică) (Figura nr. 8). Citokina este totodată un factor de creştere pentru bazofile şi mastocite. Are de asemenea rol în hematopoieză. Acţionează sinergic cu IL-3 în cursul diferenţierii mastocitelor şi limfocitelor. Dacă există o sinteză crescută peste normal a IL-4 de către LT Th2, se înregistrează o creştere semnificativă a sintezei de IgE iar din punct de vedere clinic apariţia manifestărilor hipersensibilităţi de tip umoral (tip I). · IL-5 stimulează RIU la nivelul mucoaselor. Intră în acţiune mai târziu, alături de IL-2, permiţând multiplicarea LB. IL-5 are rol de factor de creştere pentru leucocitele polimorfonucleare eozinofile dar are efecte stimulatoare şi asupra bazofilelor. La fel ca şi IL-4 şi IL-5, are rol hematopoietic. Stimulează sinteza de Ig A de către limfocitele B. Datorită efectelor menţionate, un tratament novator al afecţiunilor datorate hipersensibilităţii de tip I ar putea să se adreseze tocmai IL-5 (medicamente anti- „alergice” care să aibă drept ţintă molecula IL-5). · Printre numeroasele sale activităţi, IL-6 este o citokină proinflamatorie, cu acţiune tardivă în procesul de maturaţie a imunoblastelor în plasmocite. · IL-10 induce diferenţierea iniţială a liniei de celule B. IL-10 inhibă citokinele proinflamatorii şi sinteza de IFN-g, comportându-se ca o citokină reglatorie negativă pe subsetul Th1. Are de asemenea şi rol stimulator, în cazul maturării mastocitelor, în cazul apărării antivirale şi antitumorale, precum şi rol chemoatractant pentru limfocitele T (CD8+). · IL-13 este produsă de LT Th2 activate (dar există şi clone de LT Th1, Th0 sau LT CD8+ care pot sintetiza această moleculă). IL-13 inhibă sinteza citokinelor proinflamatorii şi, ca şi IL-4, stimulează sinteza IgE.

13. 2. 5. Chemokine 154

Aceste molecule de adeziune cuprind aproximativ 50 de membri divizaţi în mai multe familii (CC, CXC, XC, CX3C). Denumirea familiilor şi moleculelor aferente a fost standardizată în raport cu structura chimică, pe baza numărului şi poziţionării grupărilor de cisteină. Numele receptorilor chemokinelor (citokine cu rol în chemotaxie) se stabileşte pornind de la grupul de litere prezentat, la care se adaugă litera R şi un număr, în timp ce liganzii conţin litera L şi un număr. Ele prezintă o activitate chemotactică faţă de limfocite, monocite, eozinofile etc. Neutrofilele, de exemplu, exprimă receptori CXCR1 şi CXCR2, în timp ce eozinofilele, bazofilele şi monocitele exprimă receptori CCR1, CCR2, CCR3 şi CCR5. Aceste structuri există în permanenţă pe suprafaţa celulelor normale circulante şi pot fi detectate prin metode de laborator. Majoritatea liganzilor sunt molecule solubile, ce se secretă în torentul circulator, în timp ce unii liganzi (CX3CL1, CXCL16) conţin o porţiune transmembranară, permiţând ancorarea celulelor de endoteliul vascular în condiţii de flux fiziologic. Prin intermediul acestor receptori, celulele menţionate vor reacţiona la stimulul primit de la celulele endoteliale sau de la alte celule agresate de toxine bacteriene; un alt stimul este reprezentat de citokinele pro-inflamatorii (ex. IL-1, TNF, IFN etc). Trebuie menţionat că studiile arată tot mai des rolul chemokinele în procese patologice, precum ateroscleroză, scleroza multiplă etc.

13. 2. 6. Hematopoietine Hematopoieza este controlată de către un sistem fiziologic autoreglabil, prin care se menţine un compartiment de celule stem şi un compartiment de diferenţiere pentru toate liniile sanguine. Sistemul necesită un echilibru între sinteza osoasă şi menţinerea unui spaţiu hematopoietic medular graţie echilibrului între osteoblaste şi osteoclaste. În procesul de proliferare şi diferenţiere a celulelor stem intervin numeroase citokine: · SCF (stem cell factor) provine în principal din celulele stromale ale măduvei osoase. SCF este produs atât în formă solubilă cât şi într-o formă legată de membrana citoplasmatică. · IL-3 sau multi-CSF (multi-colony stimulating factor) este un polipeptid cu greutatea moleculară 2030 kDa, cu 133 aminoacizi. Sinteza IL-3 este apanajul LT activate în urma stimulării antigenice dar şi al mastocitelor sau eozinofilelor. Gena care codifică pentru sinteza IL-3 se află pe cromozomul 5. Rolul său este de-a stimula proliferarea şi diferenţierea celulelor stem spre diferitele linii. · IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-11 şi IL-15:

- IL-4 stimulează diferenţierea şi creşterea bazofilelor şi mastocitelor; - IL-5 are acelaşi rol faţă de eozinofile; - IL-7 este un factor de creştere produs de celulele stromale medulare şi timice care induce proliferarea L pre T şi pre B; - IL-10 favorizează dezvoltarea megacariocitelor; - IL-11 este un factor de creştere pentru linia trombocitară, dar are şi efect pro-inflamator; - Il-15 permite diferenţierea celulelor stem spre NK. Factorii de creştere ai liniilor hematopoietice: factorii de creştere stimulează celulele hematopoietice deja diferenţiate, respectiv progenitorii, permiţând creşterea şi evoluţia lor spre stadiile ulterioare, până la maturizare. Se cunosc GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) pentru linia monoblastică şi mieloblastică, G-CSF (granulocyte CSF) pentru linia mieloblastică, M-CSF (macrophage GSF) pentru linia monoblastică, alături de interleukinele menţionate anterior, în special IL-3.

155

13. 3. Mesagerii secunzi Stimularea celulară debutează prin interacţiunea unui număr mare de receptori membranari celulari. Alături de moleculele de adeziune şi receptorii de citokine, mai trebuie amintiţi receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (FcR) şi receptorii pentru complement (CR). Aceştia au o importanţă sporită în recunoaşterea patogenilor şi reprezintă startul procesului de procesare antigenică în cadrul răspunsului imun înăscut. Transducţia semnalului primit necesită intervenţia mesagerilor secunzi, care transmit informaţia printr-o reacţie în cascadă, până la nivelul membranei celulare, al organitelor intracitoplasmatice sau al nucleului. În acest ultim caz, este vorba de o acţiune asupra unor gene, care va antrena sinteza unor proteine sau activarea ciclului celular (modificări transcripţionale). Întregul mecanism este complex şi necesită interacţiunea între partea intracitoplasmatică a receptorilor membranari şi mesagerii secunzi. În unele cazuri, molecula receptor membranar care primeşte semnalul extracelular comunică direct cu mesagerii secunzi printr-un motiv intracelular (de exemplu, motivul activator ITAM). În alte cazuri, molecula receptor cu o parte intracelulară limitată la câţiva aminoacizi, este asociată la alte molecule, fomând adevărate domenii de amplificare a semnalului (molecular scaffolds). Partea intracelulară astfel dezvoltată poartă motivul de interacţiune cu mesagerul secund. În acest sens pot fi citate diverse exemple: complexul CD3 al TCR, moleculele Iga şi Igβ ale BCR, moleculele gc ale receptorilor membranari pentru interleukine. (Figurile nr. 9-10)

Recrutarea leucocitelor circulante – Molecule de adeziune şi Citokine Primii mediatori ai inflamaţiei sunt molecule preformate, cu caracter nespecific ce apar ca rezultat al agresiunii tisulare (reflex axonal – epinefrină, activarea mastocitelor rezidente – histamină, sau ca urmare a activării cascadei coagulării – trombină). Aceşti mediatori sunt responsabili de modificările reologice specifice inflamaţiei şi de recrutarea leucocitară prin activarea celulelor endotelialiale adiacente. Consecinţele sunt permeabilizarea patului vascular şi expunerea pe versantul circulator a moleculelor de adeziune. P- şi E-selectinele sunt primele expuse, având rol în marginalizarea leucocitelor din torentul sangvin (Figura nr. 11). Un antigen glicozilat de pe leucocite joacă rol de ligand (Sialyl-Lewis X) pentru cele două selectine, ducând la contactul celulelor cu endoteliul, cu rol în încetinirea leucocitelor – rolling leucocitar (adeziunea este insuficient de puternică pentru a constitui o legătură fermă). Citokinele (IL–1 şi TNF–a) duc la exprimarea pe endoteliul activat a moleculelor immunoglobin–like (ICAM1). Acestea sunt liganzi pentru integrine aflate pe suprafaţa leucocitelor (LFA-1 şi Mac-1). Chemokine solubile din focarul inflamator (ex: IL-8) leagă receptori specifici de pe membrana leucocitară (IL-8R). Ca urmare a semnalizării intracelulare determinată de citokine, se induc schimbări conformaţionale în structura integrinelor (semnalizare „inside-out”). Integrinele trec astfel de la stadiul conformaţional cu afinitate redusă la cel cu afinitate crescută pentru ligandul lor. Rolul integrinelor este de a stabili o adeziunea fermă a leucocitelor la endoteliu. Urmează reorganizarea scheletului celular şi diapedeza leucocitară mediată tot de integrine (semnalizare „outside-in”).

156

Integrinele mediază şi ataşarea leucocitară la componentele matricei extracelulare, conducând la exocitoza enzimelor de clivare a matricei pentru a permite înaintarea leucocitelor spre focarul de inflamaţie. Procesul de dirijare a migrării leucocitare se bazează pe emiterea de prelungiri membranare în direcţia dictată de gradientul de concentraţie a mediatorilor chemotactici.

13. 4. Povestire adevărată Povestirea adevărată este preluată din literaură şi subliniază mai multe principii care merită însuşite încă din anul al 2-lea de studenție. Introducerea în practica medicală curentă a unui nou medicament reprezintă concomitent un maraton (întrucât durează în jur de 15 ani) cât şi un concurs (între companii farmaceutice, echipe de cercetare). Există însă un proces riguros de testare ce trebuie urmat cu strictețe. Studiile sunt coordonate astfel încât se efectuează studii de siguranţă şi de eficacitate, pe modele celulare, apoi animale de laborator, iar abia în final pe oameni (voluntari). De multe ori însă, rezultatele foarte promiţătoare ale studiilor preclinice sunt ”dărâmate” de ineficienţa noilor substanţe în clinică. Aceste date conflictuale trebuie foarte bine investigate şi trebuie efectuat un bilanţ riguros care să aibă drept scop binele pacienţilor. Toate aceste faze trebuie foarte bine documentate şi supervizate. Prima etapă a studiilor clinice, o reprezintă validarea siguranţei de administrare la tineri voluntari sănătoşi. Asemănător terapiilor cu anticorpi anti-CTLA4 sau cu IL-2 pentru activarea limfocitelor T, investigaţiile preclinice au arătat un potenţial beneficiu în folosirea anticorpilor direcţionaţi anti-CD28, cu acţiune de superagonişti şi rol de a activa şi expansiona numărul de limfocite T in vivo, independent de stimularea receptorului TCR. În modelul murin, s-a demonstrat că un anticorp cu aceeaşi specificitate a expansionat preferenţial sectorul CD4+CD25+, de limfocite reglatoare, având un profil bun de siguranţă. Noul anticorp, numit TGN1412, fost administrat la 6 voluntari tineri, sănătoşi. În decursul a 90 de minute, voluntarii au suferit evenimente adverse sistemice, polimorfe, ce au fost atribuite unei descărcări masive de citokine (furtună citokinică/ ”cytokine storm”). Fenomene asemănătoare au fost identificate într-un număr impresionant de patologii, existând în continuare destul de multe necunoscute. Toţi pacienţii au prezentat răspuns inflamator sistemic caracterizat prin eritem, hipertermie, scădere a tensiunii sistolice cu cel puţin 20 mmHg şi tahicardie compensatorie. Majoritatea pacienţi au dezvoltat o suferinţă pulmonară însoțită de permeabilizare vasculară şi infiltrare a spaţiilor alveolare cu lichid, ducând la suferinţă severă. Toţi pacienţii au necesitat tratament suportiv cu intubaţie, tratament de stabilizare hemodinamică şi dializă, iar tratamentul „specific”, imunomodulator, a constat în administrarea de anticorpi anti-IL2 şi corticoterapie. Conform protocolului de studiu, s-au monitorizat limfocitele şi citokinele circulante. S-a constatat o creștere dramatică a TNF-α la o oră de la infuzia anticorpului cât şi a IL-2, IL-4, IL-10 şi IFN-γ în decurs de 4 ore. Pacienţii cu evoluţia cea mai gravă au avut nivele ridicate de citokine circulante pentru o durată mai lungă de timp. Toţi voluntarii au supravieţuit sindromului de răspuns inflamator sistemic (Systemic Inflammatory Response Syndrome -SIRS). Analiza acestor reacții precum şi publicarea rezultatelor a contribuit la o mai buna înţelegere a patofiziologiei furtunii citokinice. Mai mult, urmărirea acestor fenomene, ca evoluţie naturală şi sub tratament a contribuit la înţelegerea tratamentului. Merită admirat faptul că o poveste „de eşec” pentru o moleculă candidat a fost publicată şi a contribuit, în felul acesta, la „viitorul succes” în domeniu.

157

13. 5. Verificaţi-vă cunoştinţele La întrebările următoare, alegeţi răspunsul corect. 1. Rolling-ul leucocitar este mediat de interacțiunea: a. Receptorii pentru chemokine (CXCR) - Chemokine b. Selectine – Antigen Lewis X c. Integrine – Receptori de integrine d. Integrine – Fibrină 2. Inducerea comutării izotipice IgM – IgG este realizată de: a. TNF alfa b. IL-1 c. IL-4 d. HMGB-1 3. Descrieţi cuplurile moleculare componente ale sinapsei imunologice. 4. Enumerati rolurile Interferonului Gamma. 5. Au efect imunoinhibitor (răspuns multiplu): a. TLR b. IL-4 c. IL-10 d. CTLA-4 e. IL-13

14. Imunoglobulinele Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele există în plasmă, lichid interstiţial şi secreţii şi au capacitatea de a recunoaşte şi de a se combina specific cu antigenul inductor al răspunsului imun. Lor li se adaugă proteinele patologice cu aceeaşi structură dar fără activitate de anticorpi. De exemplu, în mielomul multiplu sau în macroglobulinemia Waldenström's a fost identificată proteina patologică BenceJones (poate fi identificată în sânge sau în urină; este vorba de o sinteză anormală de lanţuri uşoare; a fost descrisă de H. Bence Jones în 1847). Termenul de imunoglobuline (Ig) îl înlocuieşte pe cel de gama-globuline. Acest termen nu este corect, deoarece nu toţi anticorpii migrează electroforetic în regiunea „gama”. Toţi anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot fi anticorpi, dar au şi alte roluri. Denumirea de anticorp se pare că a fost dată pentru substanţele „împotriva corpilor” bacterieni, ceea ce nu este corect, deoarece există anticorpi şi faţă de alte structuri (inclusiv împotriva structurilor proprii, în bolile autoimune) sau chiar şi în cazul bacteriilor, pot exista anticorpi diferiţi faţă de structuri diferite ale aceleaşi bacterii (ex. anticorpi faţă de cele peste 90 de tipuri capsulare ale Streptococcus pneumoniae). Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice: - recunosc şi reacţionează specific cu structura antigenică din cauza căreia au apărut;

158

- au funcţie de anticorp, dar dacă sunt inoculate la un individ dintr-o specie diferită vor avea rolul de antigene pentru respectivul individ; - sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate după un stimul antigenic; - pot activa sistemul complement etc. S-a reuşit sinteza de anticorpi monoclonali „himerizaţi”, alcătuiţi dintr-o parte de moleculă umană şi alta animală; fiind de izotip uman nu vor mai apărea ca şi structuri antigenice şi nu vor mai fi „respinşi”.

14. 1. Structura generală Structura de bază a unei Ig monomer (ex. IgG1) cuprinde două lanţuri grele identice şi două lanţuri uşoare identice, legate între ele prin punţi disulfurice: două punţi între cele două lanţuri grele (în cazul IgG1) şi o singură punte între fiecare lanţ greu şi uşor. Această schemă structurală a fost identificată în urma mai multor experimente (reducere şi alchilare, acţiunea papainei, acţiunea pepsinei). Pepsina poate de ex. să degradeze enzimatic o moleculă de imunoglobulină, acţionând la nivelul aminoacidului Leucină din structura lanţurilor grele. Duce astfel la apariţia unui fragment cu greutate moleculară destul de mare format la rândul său din 2 fragmente Fab unite [acest fragment poartă numele de F(ab)2]. Fragmentele unei Ig sunt următoarele: - Fab: prima jumătate a lanţului greu şi întregul lanţ uşor, legate între ele printr-o punte disulfurică, obţinute sub acţiunea papainei, prin scindarea înaintea regiunii balama, cu un singur situs de legare; - F(ab’) 2: cele două fragmente Fab şi regiunea balama, care rezultă după acţiunea pepsinei, constituie un fragment superior celor două fragmente Fab şi conţine două situsuri de legare; - Fc: jumătăţile terminale ale celor două lanţuri grele unite prin punţi disulfurice la nivelul regiunii balama; - pFc’: cuprinde fragmentele peptidice rezultate după acţiunea pepsinei, cu întregul domeniu CH3 situat după aminoacidul 333 al lanţului greu; - Fd: corespunde primei părţi a lanţului greu după acţiunea papainei, cu formarea fragmentului Fab, şi după reacţia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanţul uşor; - Fv: corespunde părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor (VH+VL). Pentru Ig, noţiunea de domeniu se regăseşte la lanţurile grele în 4 exemplare (IgG, IgA, IgD) sau 5 exemplare (IgM, IgE) şi la lanţurile uşoare în 2 exemplare. Terminologia utilizată este următoarea: · Lanţurile grele: - VH - pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comună tuturor claselor şi subclaselor cu aceeaşi specificitate. - CH 1, CH 2, CH 3 şi CH 4, - pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care conţine diferenţele pentru fiecare clasă şi subclasă; de exemplu pentru IgG1 există fragmentele Cg11 , Cg12 şi Cg13 şi pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4. · Lanţurile uşoare: - VL pentru fragmentul uşor variabil (variable light), diferit pentru lanţurile kappa şi lambda: Vk şi Vl. - CL pentru fragmentul uşor constant (constant light), cu un singur lanţ Ck şi patru Cl funcţionale. Domeniile variabile VL şi VH formează locul unde anticorpul se cuplează cu determinantul antigenic (epitop). Faţa interioară a situsului anticorpului (situs combinativ) vine în contact direct cu epitopul şi se numeşte paratop. Faţa exterioară a situsului combinativ se numeşte idiotip. 159

14. 2. Structura particulară a fiecărei clase sau subclase de Ig IgG IgG (prototipul de Ac) reprezintă circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser şi are o distribuţie aproximativ egală în vase şi ţesuturi. Există patru subclase de IgG (molecule cu termorezistenţă mai mare), cu structură asemănătoare, o masă moleculară de 146.000 (excepţie făcând IgG3 cu o masă de 170.000), 3 domenii constante pentru lanţul greu şi un procentaj de hidraţi de carbon de 2-3 %. Concentraţia sanguină a IgG este de ordinul 11 g/l, din care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% şi IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru sistemul complement. Poate trece prin bariera hemato-placentară (după a 20-a săptămână de viaţă intra uterină). Apare în RI secundar. IgM Sunt anticorpi aglutinanţi şi reprezintă cei mai eficace activatori ai complementului. Ac IgM sunt caracteristici pentru RI primar, producţia lor fiind stimulată de către IL-4, care nu activează mecanismul de switch izotipic. IgM membranară (IgMm) este exprimată pe suprafaţa LB. Are structură monomerică şi se termină prin aminoacizii 556-597, cuprinzând în mod particular o parte intramembranară hidrofobă şi 3 aminoacizi intracitoplasmatici. Fiecare moleculă de IgMm este asociată cu 2 lanţuri Iga şi 2 lanţuri Igβ. Ansamblul formează BCR (B cell receptor), comparabil cu TCR-ul limfocitului T. IgM serică (IgMs) cuprinde un lanţ greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii constante Cm1 - Cm4 şi un procent ridicat de hidraţi de carbon (12 %). Molecula însăşi este un pentamer cu un prim inel al punţii disulfurice la sfârşitul lui Cm3, un al doilea la terminarea lui Cm4 şi un lanţ J (joining chain). Masa moleculară este foarte mare (circa 970.000 D), cu un coeficient de sedimentare de 19 S. Concentraţia serică este de 1,2 g / l. Reprezintă circa 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative dintre care numai 5 sunt funcţionale. IgM are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hematoplacentară. Apare în RI primar. IgA IgA serică. Sub forma IgA1 (80%) şi IgA2 (20%), ea se găseşte ca monomer (GM 160.000, 7 S) sau ca dimer sau trimer, ultimele două forme cu lanţul J de joncţiune. IgA2 are o structură originală. Lanţurile uşoare unite între ele printr-o punte disulfurică nu sunt legate printr-o legătură covalentă cu lanţurile grele. Concentraţia sanguină a IgA este de 2,4 g / l. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentară. Nu participă la aglutinarea, precipitarea sau liza antigenelor corpusculare. Are activitate bactericidă mai mare decât IgG şi decât IgM. IgA exocrină sau secretorie cuprinde două subclase IgA1 şi IgA2. Masa moleculară este de 400.000, cu coeficient de sedimentare de 11 S. Molecula cuprinde două unităţi de IgA reunite printr-un lanţ J. Acest ansamblu este înconjurat de unitatea secretorie sintetizată de celulele epiteliale ale tubului digestiv. Au rol important în apărarea la nivelul mucoaselor (digestivă, respiratorie etc) şi în reglarea ”compoziţiei” florei microbiene de la suprafaţa acestora. Este important ca nou-născutul să primească de la mamă colostrul şi apoi să fie alimentat pe cale naturală pentru a primi IgA (sinteza proprie începe după circa 1 lună de la naştere). IgD 160

Are un nivel seric scăzut iar rolul său încă nu este pe deplin cunoscut. IgD se află, mai ales, la suprafaţa limfocitului B în asociere cu IgMm unde ar putea juca rolul de receptor activ de diferenţiere celulară şi memorie. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate traversa bariera hemato-placentară. Concentraţia de IgD creşte în ser de la naştere şi până la vârsta de 15 ani. Creşte în serul femeilor însărcinate. IgE Deşi concentraţia lor serică este infimă (0,0001 g/l), fixarea pe bazofile şi mastocite le conferă un rol important în inflamaţie şi hipersensibilitatea de tip imediat. posedă, ca şi IgM, un al patrulea domeniu constant, care îi conferă o masă moleculară de 190.000 D şi un coeficient de sedimentare 8S, superior IgG. IgE se fixează pe receptor prin intermediul domeniilorCe2 şi Ce3,într-o poziţie aproape orizontală. Lanţurile uşoare Acestea sunt în proporţie de 2/3 lanţuri kappa şi 1/3 lanţuri lambda, excepţie făcând IgD la care lanţurile lambda sunt majoritare.

14. 3. Determinanţii antigenici ai imunoglobulinelor Imunoglobulinele inoculate la o specie diferită vor avea rol de antigene şi în această „calitate” prezintă 3 tipuri diferite de determinanţi sau markeri antigenici. Izotipia Determinanţii izotipici sunt prezenţi la toţi indivizii aceleiaşi specii. Ei iau naştere în cursul diferenţierii speciei. Anticorpii anti-izotip sunt obţinuţi prin injectarea Ig umane policlonale sau monoclonale la animal (ex. iepure). Anticorpii anti-IgA apar uneori la subiecţii cu deficit de IgA după transfuzia de sânge şi stau la originea şocului cu hipotensiune arterială. Ei pot fi consideraţi anticorpi anti-izotip. Allotipia Caracterele antigenice prezente la unii indivizi dintr-o anumită specie, bazate pe deosebirea a 1-3 aminoacizi, corespund variaţiei apărute în cadrul respectivei specii. În mod natural (în lipsa unei injectări prealabile de sânge sau plasmă), se pot găsi anticorpi anti-allotipici la subiecţii care nu au allotipurile corespunzătoare, la 1% din subiecţii normali şi la 3-5% dintre bolnavii cu poliartrită reumatoidă. Diferitele sisteme cunoscute se notează folosind litera clasei de Ig şi litera K pentru kappa, urmate eventual de numărul subclasei şi în final litera m pentru marker (ex. sistemul Gm, sistemul A2m, sistemul Km).

Idiotipia În definiţia iniţială, acest caracter antigenic era propriu unei imunizări, la un animal care a produs anticorpi. Oudin a obţinut primii anticorpi anti-idiotipici în modul următor: într-o primă etapă a imunizat un iepure împotriva Salmonella spp. şi a obţinut un prim tip de anticorpi numiţi Ab1 împotriva acestei specii. Apoi un al doilea iepure a fost imunizat cu acest imunoser şi s-au obţinut anticorpi numiţi Ab2 sau anticorpi antianti-Salmonella sau anti-idiotip Ab1. Aceşti anticorpi nu recunosc decât serul primului animal imunizat şi nu serul dinaintea imunizării sau serul unui alt animal imunizat pentru aceeaşi Salmonella. Un anticorp Ab2 poate recunoaşte mai mulţi Ab1 de la animale diferite, recunoscând anticorpii cu aceeaşi specificitate antiSalmonella. Pornind de la Ab2 se poate imuniza un alt animal care sintetizează anticorpi Ab3, anti-idiotip Ab2, aşa-zişi anti-anti-idiotip. Pentru anticorpii Ab2 se disting Ab2-a care nu inhibă reacţia antigen-Ab1 şi Ab2-β care, dimpotrivă, inhibă această reacţie. Anticorpii Ab2-β sunt numiţi „imagine internă“ a epitopului de plecare E1, 161

ceea ce înseamnă ce au o structură imunologică asemănătoare, recunoscută de Ab1. Determinanţii antigenici idiotipici se găsesc la nivelul părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor, şi uneori sunt constituiţi din cele două lanţuri. Ei pot corespunde segmentelor hipervariabile, respectiv paratopilor imunoglobulinelor.

14. 4. Proprietăţi fizico-chimice 14. 4. 1. Ig policlonale Termenul de clonă a fost împrumutat din bacteriologie, unde toate microorganismele care derivă dintr-o bacterie sunt identice între ele şi cu prima bacterie. În imunologie, aceasta desemnează toate celulele derivate dintr-un limfocit (cu o specificitate imunologică). Un răspuns imun „obişnuit” corespunde unui răspuns policlonal cu imunoglobuline: · de diferite clase şi subclase de imunoglobuline: IgM, IgG1 etc.; · cu două allotipuri, dacă subiectul este heterozigot; de ex. Gm (1,2,17) / Gm (3); · cu lanţuri uşoare kappa şi lambda; · cu diferite specificităţi faţă de antigen, în recunoaşterea diverşilor determinanţi antigenici iar pentru fiecare determinant antigenic, prezenţa unor epitopi diferiţi; · cu diferite afinităţi. Ansamblul sintezei determină o hipergamaglobulinemie difuză datorată heterogenităţii Ig prezente, corespunzătoare numărului de clone limfocitare diferite, şi se traduce prin molecule cu încărcătură electrică diferită. 14. 4. 2. Ig monoclonale au următoarele caracteristici: · o singură şi subclasă de Ig, de exemplu IgA2; · un singur lanţ uşor, de exemplu lambda; · un singur allotip prezent, de ex. A2 m2 la un subiect heterozigot A2 m1/ A2 m2; · o specificitate unică, ce recunoaşte un anumit epitop; · afinitate unică. Acest aspect poate rezulta din proliferarea benignă (imunoglobulină monoclonală benignă) sau malignă (mielom multiplu, boală Waldenstrom) a unui LB matur. Toate Ig secretate de clonă au o structură chimică identică, cu mobilitate electroforetică unică, astfel încât electroforetic proteinele prezintă un vârf cu bază îngustă, iar imunoelectroforetic se caracterizează prin apariţia celei de-a doua curburi a arcului normal, având următoarele 3 caracteristici: linie groasă, curbă foarte marcată, poziţie mai apropiată de imunoserul revelator.

14. 5. Ontogenia imunoglobulinelor Fătul este capabil să sintetizeze, din a zecea săptămână, cantităţi foarte mici de IgM şi cantităţi importante din a 12-a săptămână. IgG materne nu traversează bariera placentară decât după a 20-a săptămână. în absenţa unei infecţii congenitale (toxoplasmoză, sifilis etc), în sângele nou născutului se găseşte o cantitate de IgM fetală care nu depăşeşte 10% din valoarea adultului. Nivelul IgG la nou-născut este de 110% din nivelul adultului normal, ca urmare a transferului activ, de la mamă la făt. După scăderea nivelului IgG materne (care pot persista până în lunile 3-6 de viaţă şi chiar până la 18 luni) se observă o sinteză activă a diferitelor clase: IgM are nivel normal la 1 an; IgG ajunge la valori normale la 3 ani; IgA şi IgE au un nivel normal la 14 ani. 162

14. 6. Funcţii Proprietăţile fragmentului Fab Fragmentul Fv participă singur la formarea situsului de legare al anticorpilor, cu intervenţia egală a domeniului VH al lanţului greu şi al domeniului VL al lanţului uşor. Aminoacizii celor 3 regiuni hipervariabile ale fiecărui lanţ, situaţi la distanţă în structura primară, dar apropiaţi în structura cuaternară, contribuie la formarea acestuia. Legătura antigen-anticorp se realizează prin legături non covalente, reversibile. Proprietăţile fragmentului Fc Unele dintre aceste proprietăţi nu apar decât dacă anticorpul a fixat antigenul sau a fost alterat de căldură, formând agregate. Acest aspect este valabil pentru fixarea complementului şi recunoaşterea factorului reumatoid. În cazul subclaselor de IgG ordinea reactivităţii este următoarea: IgG3 > IgG1 > IgG2 > IgG4. Viteza de catabolizare depinde de regiunea CH 2 a diferitelor clase şi subclase de Ig. IgG (cu excepţia IgG3) au un timp de înjumătăţire de 21 de zile. Toate IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) traversează activ placenta, IgG1 trecând cel mai uşor. Aşa cum am arătat mai sus, nou-născutul are o concentraţie a IgG de 110% faţă de cea maternă, ceea ce indică prezenţa unui transfer foarte activ. IgM şi IgA materne nu traversează placenta, Ig din aceste clase găsite la nou-născut fiind de origine fetală. Cunoaşterea acestor aspecte este foarte utilă pentru evidenţierea unei afectări intrauterine sau a unui simplu transfer de Ig materne. În caz de suspiciune de toxoplasmoză congenitală, se indică dozarea IgM şi IgA anti-toxoplasma în serul nou-născutului (au existat, din nefericire, recomandări de întrerupere a sarcinii în cazul în care la mamă au fost identificaţi anticorpi anti-toxoplasma de tip IgG). Fixarea complementului poate avea loc în calea clasică; IgG1, IgG2 şi IgG3 şi IgM au un receptor ascuns în stare nativă pentru C1q, care va fi activat în timpul fixării anticorpului pe antigen. Acest receptor se află în regiunea CH2 a IgG şi în domeniul CH4 al IgM. Teoretic, o singură moleculă de IgM pentamerică este suficientă pentru activarea complementului, datorită celor două situsuri apropiate. ştiind că IgG sunt de 1.000 de ori mai puţin eficace decât IgM, pentru activarea complementului sunt necesare două molecule IgG, apropiate una de cealaltă. Calea alternă poate fi activată de IgG sau IgA, prin fixarea pe C3b. Receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (Fc receptor, FcR) sunt molecule membranare specifice pentru fiecare clasă de Ig, care induc o activare a celulelor purtătoare. Se disting receptori cu mare afinitate Fc RI, care fixează un monomer de Ig şi sunt activaţi când antigenul se leagă de anticorp formând o punte între doi receptori cu slabă afinitate Fc R II şi Fc R III, care nu pot fixa decât complexe antigen-anticorp multivalente, formate în prealabil. Celulele purtătoare de receptori pentru Ig sunt: · macrofagele, monocitele şi neutrofilele au următorii receptori: Fc g RI, Fc g RII, Fc g RIII, care permit fagocitarea complexelor imune, a celulelor sau microorganismelor acoperite cu anticorpi IgG; · celulele NK cu receptori Fc g RIII, care permit inducerea unei citotoxicităţi faţă de celula ţintă sau un microorganism, prin citotoxicitate anticorp dependentă (ADCC) (antibody dependent cellular cytotoxicity). În acest mod celulele NK se pot fixa pe celula ţintă şi o pot liza; · bazofilele circulante şi mastocitele au receptori pentru IgE (Fc e RI şi Fc e RII), inductoare ale hipersensibilităţii imediate; · eozinofilele şi plachetele au receptori de slabă afinitate Fc e RII. Plachetele au şi receptori Fc g care le conferă o activitate antiparazitară; 163

· limfocitele au diverşi receptori de slabă afinitate. Receptorul numit poly Ig R (receptor Ig polimeric) permite fixarea de IgA dimerică sintetizată pe plasmocite şi facilitează intrarea lor într-o vacuolă care traversează citoplasma celulelor epiteliale intestinale. Este prezent şi la nivelul canalelor secretorii ale glandelor exocrine.

14. 7. Povestiri adevărate Apariţia unor infecţii respiratorii severe la persoane cu deficit de IgA Cele 2 cazuri prezentate demonstrează importanţa existenţei unor valori normale a imunoglobulinelor, discutându-se ca şi exemplu concret situaţia IgA. În ambele cazuri, deficitul imun congenital a fost diagnosticat tardiv, la 2 ani şi jumătate şi respectiv la 5 ani, cu ocazia unor infecţii respiratorii joase. În nici unul dintre cazuri nu a fost posibilă stabilirea etiologiei, pentru că s-au administrat antibiotice şi chimioterapice înainte de a se recolta produse patologice pentru începerea diagnosticului bacteriologic, direct. Primul caz Un copil de sex masculin, în vârstă de 5 ani, se internează într-o clinică de pediatrie, datorită faptului că în cursul internării într-un spital de nivel inferior nu s-a obţinut vindecarea pneumoniei de care suferea. Motivele internării au fost: stare generală alterată, lipsa evoluţiei favorabile în cursul internării precedente. Istoricul bolii a arătat că este vorba de un copil care a făcut în fiecare an mai multe infecţii respiratorii joase (3-5 / an, în fiecare an) şi mult mai numeroase infecţii acute ale căilor respiratorii superioare (IACRS). Boala a debutat în finalul anului precedent, cu simptome respiratorii pentru care părinţii au administrat paracetamol şi picături cu un decongestiv nazal. După 2 săptămâni, datorită intensificării semnelor respiratorii, medicul de familie recomandă internarea în cel mai apropiat spital, diagnosticul la internare fiind pneumonie cu pleurezie. În spital s-a administrat o asociere de ceftriaxonă cu gentamicină, dar semnele respiratorii s-au menţinut, apărând în plus semne de insuficienţă respiratorie; în aceste condiţii copilul se transferă în clinica de pediatrie. Examenul clinic la camera de gardă relevă o stare generală foarte alterată, dificultăţi în respiraţie, respiraţii frecvente, tiraj intercostal, lipsa murmurului vezicular la baza hemitoracelui stâng, submatitate la percuţie şi raluri crepitante însoţite de frecătură pleurală la auscultaţie în treimea medie a hemitoracelui stâng. În clinica de pediatrie s-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi lichid pleural, produsele fiind trimise pentru diagnosticul bacteriologic, direct. Hemoculturile au fost negative. Cultura din lichidul pleural a fost negativă. Valorile celorlalte analize de laborator au fost următoarele: VSH = 85 mm/oră, număr de leucocite = 28.000/mm3 (dintre care, peste 20.000/mm3 neutrofile, 72%), proteina C reactivă=9,8 mg/dL. Dozarea imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.800 mg/dL), o valoare de 242 mg/dL pentru Ig M, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl). Fracţiunea C3 a complementului a fost dozabilă, în cantitate de circa 10 ori mai mare decât valorile normale, cu complexe imune circulante dozabile, la valori mari. Diagnosticul de pneumonie stângă cu pleurezie, probabil de etiologie bacteriană, în condiţiile unui deficit absolut de IgA, a condus la instituirea tratamentului cu o asociere de medicamente antibacteriene (ceftriaxonă, amikacină şi teicoplanină) alături de dezobstruante, menţinerea permeabilităţii căilor respiratorii şi administrare de oxigen. S-au administrat de asemenea imunoglobuline pe care intravenoasă. Datorită faptului că în ciuda unei evoluţii favorabile din punct de vedere clinic, semnele fizice de la nivel pulmonar s-au menţinut iar temperatura nu a coborât sub 38,1ºC, s-a administrat suplimentar un medicament antifungic evoluţia fiind favorabilă. Tratamentul a fost continuat timp de 3 săptămâni, după care copilul a fost externat cu recomandarea de a reveni la control clinic, radiologic şi bio-umoral. La controlul efectuat s-a 164

constatat că deficitul de IgA nu a fost corectat şi s-a menţinut şi după vindecarea pacientului, fiind probabil o cauză a patologiei şi nu un rezultat al acesteia. Al doilea caz Un copil de sex feminin, se internează la vârsta de 2 ani şi 6 luni într-o clinică de pediatrie, prin transfer dintr-un spital de nivel inferior, datorită evoluţiei nefavorabile a unei pneumonii. S-a născut prematur, după 8 luni de gestaţie, cu greutate de 1.100 g, Apgar 7. A fost îngrijită în maternitate până la vârsta de 2 luni şi jumătate. Până la vârsta de 2 ani şi jumătate a făcut repetate infecţii acute ale căilor respiratorii inferioare (IACRI) (minim 4 episoade / an). Motivele internării au fost: febră, tuse şi dispnee. Din discuţia cu părinţii s-a aflat că tusea şi febra au apărut cu 10 zile anterior internării; ulterior copilul a început să respire din ce în ce mai dificil. A primit în ambulatoriu ampicilină (pe cale orală), apoi cotrimoxazol (biseptol). Pentru că evoluţia a fost nefavorabilă, mama a fost sfătuită să se prezinte pentru internare, la spital. S-au prezentat la primul spital. Examenul clinic la internare a evidenţiat: febră (38,3°C), paloare, număr ridicat de respiraţii/minut, tiraj (deprimare a structurilor suprasternale în timpul inspirului) şi sindrom de matitate în treimea inferioară a hemitoracelui drept (la inspecţie, auscultator şi la percuţie). La examenul radiologic s-a văzut opacifierea neomogenă a jumătăţii inferioare a hemitoracelui drept. Din rezultatele celorlalte investigaţii se amintesc: VSH= 120 mm/oră, leucocitoză (12.400 / mm3) cu neutrofilie (75%), hipoxemie (cu scăderea presiunii de oxigen). Imediat după internare s-a administrat ceftriaxonă, apoi amoxicilină-acid clavulanic în asociere cu ciprofloxacină, fără ca evoluţia să fie pozitivă. În aceste condiţii, s-a recomandat transferul într-o clinică de pediatrie, de nivel superior. Diagnosticul la internare în clinica de pediatrie a fost: pneumonie dreaptă, sepsis bacterian. Examenul clinic la internare a revelat o stare generală profund alterată, prezenţa unui facies suferind, foarte palid, hipertermie (39ºC), deficit al stării de nutriţie (greutate = 10,7 kg), cianoză peri-oro-nazală accentuată la plâns şi alte eforturi, polipnee (80 respiraţii / minut), bătăi ale aripioarelor nazale, matitate cu absenţa murmurului vezicular în două treimi inferioare ale hemitoracelui drept, raluri crepitante la baza hemitoracelui drept, ficat la 2,5 cm sub rebordul costal, dureros la palpare. Radiografia pulmonară efectuată la internare a evidenţiat opacifierea omogenă a hemitoracelui drept. Celelalte investigaţii de laborator au avut următoarele valori: VSH = 75 mm/h, hemoglobină = 8,2 g/dL, leucocitoză (L = 24.800/mm3) cu neutrofilie (peste 15.600 neutrofile/mm3, 63%), modificări ECG. S-a pus diagnosticul de pneumonie cu pleurezie dreaptă importantă, insuficienţă respiratorie acută, insuficienţă cardiacă, anemie, hipotrofie ponderală. S-a realizat puncţia pleurală (atât pentru a elimina această cauză de presiune mecanică asupra arborelui cardiovascular cât şi pentru punerea diagnosticului etiologic şi stabilirea sensibilităţii la antibiotice a agentului sau agenţilor etiologici). S-a recoltat şi sânge pentru hemoculturi, înainte de administrarea altor medicamente antibiotice sau chimioterapice. Lichidul pleural era „sub presiune”; s-au extras cu uşurinţă peste 375 mililitri de lichid opac, tulbure. Produsele au fost trimise imediat către laboratorul de bacteriologie. Frotiul colorat Gram a pus în evidenţă rare PMN (2-5 / câmp) şi rari coci Gram-pozitivi, aşezaţi unul câte unul sau în diplo. Coloraţia Ziehl-Nielsen nu a pus în evidenţă bacili acid-alcoolo rezistenţi. Atât culturile din lichidul pleural cât şi cele hemoculturi au rămas sterile. Prin reacţii antigen-anticorp s-a încercat punerea în evidenţă a prezenţei antigenelor capsulare în lichidul pleural (pneumococ, H. influenzae, meningococ), dar reacţiile au fost negative. 165

Dozarea imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.400 mg/dL), o valoare de 160 mg/dL pentru IgM, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl). Fracţiunea C3 a complementului a fost dozabilă, în cantitate mai mare decât valorile normale. În condiţiile obţinerii acestor date clinice, paraclinice şi de laborator, s-au administrat antibiotice în asociere [iniţial o combinaţie între un glicopeptid şi o cefalosporină de generaţia a III-a (pentru 2 săptămâni), apoi o combinaţie între vancomicină şi amikacină (pentru încă 2 săptămâni)], în afară de drenajul lichidului pleural (sub control clinic şi paraclinic), administrare de oxigen, administrare de lichide, electroliţi şi substanţe nutritive intravenos. Avându-se în vedere rezultatul dozării imunoglobulinelor, s-au administrat şi imunoglobuline intravenos. Lent, evoluţia din punct de vedere clinic a fost favorabilă. Pe partea dreaptă, radiologic s-a constatat organizarea unui proces pahipleuritic. Copilul a fost spitalizat pentru o lună, iar înainte de externare valorile bio-umorale au fost următoarele: VSH =12 mm/oră, număr de leucocite= 6.500/ mm3 (fără neutrofilie), hemoglobină = 10.2/dL, hematocrit = 34%, IgA = 0 mg/dL. Discuţii Cu excepţia vârstei, au existat o serie de asemănări între cele două cazuri. Ambii copii au avut în antecedente episoade de IACRS şi IACRI, mai multe / an, în fiecare an, fără diagnostic etiologic, pentru care au primit tratament la domiciliu, de regulă incluzând antibiotice sau chimioterapice. Episodul infecţios discutat, datorită evoluţiei grave, a condus la recomandarea de internare şi în fiecare dintre cele două cazuri internarea a fost realizată, succesiv, la două nivele spitaliceşti. În ambele cazuri, la spitalul de nivel inferior, copii au primit tratament antibiotic înainte de recoltarea produselor pentru punerea unui diagnostic etiologic. În aceste condiţii nu a fost posibilă nici stabilirea sensibilităţii microorganismelor implicate şi tratamentul anti-infecţios a fost condus „empiric”, ceea ce ar fi putut reprezenta un important factor de risc, inclusiv pierderea pacientului. În primul caz nu s-a putut emite nici o ipoteză privind etiologia (alta decât „bacteriană”) iar în al doilea caz, elementele observate la studierea frotiului din lichidul pleural au permis suspicionarea unei pneumonii de etiologie pneumococică. Tratamentele conduse în ambulatoriu, auto-tratamentele stabilite de părinţi (în baza „amintirii” unor recomandări medicale anterioare), lipsa unei culturi medicale care să ridice suspiciunea privind o „cauză de bază” care să explice un număr de infecţii respiratorii, repetate, mai numeroase decât în mod obişnuit, ne fac să realizăm motivele pentru care deficitul imun a fost descoperit relativ tardiv (cu toate că în ambele cazuri a existat un deficit absolut în sinteza de IgA, foarte probabil un deficit primar). Pe de o parte, din aceste prezentări sesizăm, foarte concret, importanţa bunei funcţionări a sistemului imun şi una dintre situaţiile care pot apărea în cazul existenţei unor deficienţe, iar pe de altă parte este de subliniat că tratamentul bolilor infecţioase ar trebui realizat numai după diagnosticul etiologic, cu testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, singura variantă corectă, care poate veni în sprijinul pacienţilor pe care trebuie să îi îngrijim.

15. Sistemul complement Complementul, un complex multienzimatic format din circa 30 de componente, reprezintă unul dintre principalii constituenţi ai apărării naturale, ai imunităţii umorale şi respectiv un element important al reacţiei 166

imune survenite ca urmare a formării complexelor antigen-anticorp (are rol esenţial în răspunsul inflamator). Sistemul complement (C') reprezintă o componentă normală a serului. Sistemul complement are o serie de funcţii importante: apărarea nespecifică împotriva infecţiei (liza virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor străine, favorizarea prin opsonizare a fagocitozei, chemotactism pentru PMN şi sistemul MM etc); eliminarea complexelor imune şi a celulelor apoptotice; reglarea fiziologică a RI, dar participă şi la creşterea permeabilităţii capilarelor, stimularea contractilităţii musculaturii netede etc. În cele mai multe împrejurări, sistemul complement are efecte benefice; totuşi sunt de menţionat şi unele efecte negative (ex. participă la reacţiile anafilactice, este implicat în hipersensibilitatea citolitică-citotoxică etc). Sistemul complement cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice. Componentele sale suntsintetizate de hepatocite, macrofage, celule epiteliale intestinale etc. Substanţele activatoare reprezintă 5% din suma proteinelor serice (circa 3 g/l); componenta C3 este componenta care se găseşte în cantitatea cea mai mare (circa 1,3 g/l). (Tabelul nr. 1) Sistemul C' se poate activa pe trei căi, respectiv calea clasică, calea lectinică şi calea alternă. Activarea pe calea clasică este declanşată în primul rând de formarea complexelor imune (Ag-Ac), dar şi de apariţia celulelor apoptotice, anumite virusuri sau de proteina C reactivă cuplată cu anumiţi liganzi (Figura nr. 1). Calea lectinică poate fi activată de lectina care leagă manoza de pe suprafaţa bacteriilor (MBL, MannanBinding Lectin), dar şi de alte proteine asemănătoare. · Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ce nu au origine imună şi prezintă cel puţin două situsuri identice de legare specifică a unor structuri glucidice; · MBL este o proteină din clasa colectinelor, având domenii lectinice prin care se ataşază glucidelor şi un domeniu colagen-like. MBL se găseşte în cantitate mică în serul indivizilor sănătoşi, însă în cazul infecţiilor acute, concentraţia acesteia creşte semnificativ. S-a constatat că persoanele care au deficit de MBL dezvoltă în copilărie mult mai multe infecţii decât copiii normali, lucru ce atestă importanţa apărării organismului prin activarea complementului pe calea lectinică la vârste la care sistemul imun nu s-a constituit în totalitate din punct de vedere funcţional. Interacţiunea acestora formează un complex asemănător celui format în primele subetape ale căii clasice (C1qrs) şi activează calea clasică fără a necesita prezenţa complexelor antigen-anticorp. · Pe lângă MBL, alte trei proteine pot, prin legarea lor de anumite structuri antigenice, să declanşeze activarea complementului pe calea lectinică. Aceste proteine sunt ficolina-1, ficolina-2 şi ficolina-3. Pot lega zaharuri sau compuşi acetilaţi prezenţi pe suprafaţa microorganismelor. Dintre MBL şi ficoline, cea mai abundentă în plasmă şi cea care intervine cel mai adesea în declanşarea căii lectinice, este ficolina-3, numită şi antigenul Hakata sau β-2 macroglicoproteina termolabilă. (1) Calea alternă poate fi activată de bacterii, fungi, virusuri, paraziţi, venin de viperă, produşi de coagulare, celule tumorale etc. Calea clasică şi calea alternă (alternativă) converg către C3, apoi urmează o cale efectoare comună, implicând ultimele componente ale sistemului complement (Figura nr. 3). În fiecare dintre etape, intervin proteine activatoare, inhibitoare sau reglatoare precum şi receptorii pentru complement. Aceste elemente se găsesc fie în plasmă fie la nivelul peretelui celulelor autologe sau omologe. În mod curent, sistemul complement este desemnat prin litera C. Pentru fiecare componentă studiată şi bine delimitată în cadrul „cascadei de activare” se adaugă o cifră, de la C1 la C9, care este eventual urmată de o literă (care reprezintă o anumită subdiviziune; spre exemplu, pentru C1 există C1q, C1r şi respectiv C1s). 167

Ca urmare a activării sistemului C', unele componente (C4, C2, C3, C5), sunt fragmentate, aceste fragmente fiind desemnate printr-o literă ataşată componentei iniţiale (exemplu C3a şi C3b). În general componenta b este de dimensiuni mai mari (excepţie C2a, fragment înglobat într-un complex proteolitic şi care are dimensiuni mai mari decât C2b) şi se fixează la nivelul structurii ţintă, în timp ce componenta a este mai mică, este solubilă şi posedă o activitate anafilactoidă sau chimiotactică. Anafilatoxinele sunt polipeptide mici, eliberate în cursul cascadei de activare a complementului, care prezintă receptori pe mastocite, monocite, macrofage, neutrofile, trombocite şi au efect proinflamator. Cea mai puternică dintre anafilatoxine este C5a. Acţiunile anafilatoxinelor sunt de tipul: · contracţie a musculaturii netede, · creştere a permeabilităţii vasculare, · degranulare bazofilică şi mastocitară, · chemotactismul şi activarea granulocitelor care vor conduce la eliberarea enzimelor litice şi a radicalilor liberi. Compusul b poate fi mai departe fragmentat (exemplu C3c şi C3d). Un compus inactivat este indicat prin litera i (exemplu: C3bi sau iC3b). Componentele sistemului complement sunt prezentate în tabelul nr. 1.

15. 1. Calea clasică Activarea sistemului complement Componentele C' se găsesc în ser, în stare inactivă. Pentru a declanşa activarea lor este necesar un stimul. Pentru calea clasică, punctul de pornire este reprezentat de către complexele antigen-anticorp (Figura nr. 1), unde anticorpii sunt de tip IgM (domeniul CH4) sau de tip IgG (domeniul CH2) corespunzând subclaselor IgGl, IgG2 sau IgG3. Complementul poate fi activat de o singură moleculă de IgM sau de către două molecule de IgG apropiate una de alta. Activarea este posibilă şi în cazul unor molecule de IgG agregate. În mod asemănător, calea clasică poate fi activată şi de către unele microorganisme sau diferite substanţe chimice: bacterii Gram-negative (Salmonella spp., E. coli, Neisseria spp.), retrovirusuri, glicoproteina anvelopei HIV, complexe heparină-protamină etc. În cursul activării intervin următoarele proteine: C1. În sângele circulant există un complex plurimolecular ce conţine o moleculă de C1q (moleculă ce aparţine familiei colectinelor, precum MBL), două molecule de C1r şi două molecule de C1s, situate în jurul ionilor de calciu şi asociate inhibitorului C1, denumit C1inh. La persoanele cu deficit congenital de C1 inh, complementul se activează cronic în mod spontan, provocând episoade severe şi recurente de edem – edem angioneurotic. Compusul C1q, cu o greutate moleculară de 400.000 Da, a fost comparat cu un buchet de 6 lalele. Fiecare „floare” este la rândul său compusă din 3 lanţuri de proteine alipite şi terminate în mod globular. Fixarea C1q prin mai puţin de două părţi globulare periferice pe fragmentele Fc ale imunoglobulinelor permite activarea sa cu eliberarea C1inh din complexul plurimolecular. Acest fenomen antrenează pe de altă parte autoactivarea moleculelor C1r şi C1s. Componenta C1s are o activitate serinesterazică, prin care poate să cliveze următoarele 2 componente: C4 şi C2. C4 este fragmentat în C4a, moleculă mică, cu activitate anafilactoidă şi respectiv C4b, de dimensiuni mai mari, care se leagă printr-o legătură covalentă fie de fragmentul Fab al anticorpului fie la nivelul peretelui 168

bacterian sau la nivelul unor celule (străine, proprii modificate, infectate etc). Ansamblul formează complexul C1-C4b, notat pe scurt C14b. C2. Aceeaşi esterază (C1s) împreună cu fragmentul C4b, clivează o moleculă de C2 în C2b (o moleculă mică, cu activitate de tip kinină) şi în C2a (molecula de dimensiune mai mare, care se leagă de structura ţintă). Ansamblul necesită prezenţa Mg2+şi formează C3 convertaza căii clasice sau C4b2a. În acest moment, anticorpii şi respectiv componenta C1 pot să se detaşeze de structura ţintă, iar procesul poate continua. C3 este clivată în C3a şi C3b de către C4b2a. C3a este o moleculă mai mică şi are, în mod primordial, o activitate anafilactoidă şi chimiotactică, în timp ce subcomponenta C3b se fixează pe structura ţintă datorită unei punţi realizate între un radical tioester şi o grupare (-OH) sau (-NH2) de pe suprafaţa celulară acceptoare. Pe de altă parte, C3b poate fi inactivat de factorul I (rezultând C3bi), iar apoi clivat într-o moleculă mare C3c (liberă) şi o moleculă C3dg restantă pe structura ţintă, care poate apoi să se transforme în C3d. C3b format permite constituirea C5 convertazei (C4b2a-C3b) pe calea clasică. (Figura nr. 1) Calea clasică de activare a complementului poate fi amplificată foarte mult. Fiecare complex antigenanticorp leagă o moleculă de C1, iar C1s în stare activă clivează până la 100 molecule de C4. Din acestea, doar 20 de fragmente C4b se ataşază complexelor antigen-anticorp. C3 convertaza căii clasice clivează mii de molecule de C3. Aceste lucru dovedeşte imensa capacitate de amplificare a acestui lanţ de reacţii biochimice.

15. 2. Calea alternă şi calea de amplificare Calea alternă constituie una dintre primele linii de apărare a organismului față de un agent patogen, înaintea constituirii răspunsului imun. Această cale poate fi activată de către diferite microorganisme, de componente ale acestora, de numeroase substanţe neimune, spre exemplu: · bacterii Gram-pozitive (ex. Streptococcus pneumoniae) sau Gram-negative, virusuri (dar şi celule infectate sau transformate de către virusuri), fungi (ex. Candida albicans), paraziţi (ex. Schistosoma mansoni, Trypanosoma cruzi), · endotoxine bacteriene, · alte substanţe (insulină, hemoglobină, zymosan, fibre de azbest, gluten, prafuri, unele substanțe de contrast utilizate în radiologie, venin de viperă sau veninul altor şerpi etc.). Calea alternă poate fi activată de complexele imune care cuprind IgG sau IgA. Printre componentele căii alterne se numără: C3. În plasmă, prin proteoliza spontană a C3, sunt formate în permanenţă mici cantităţi de C3b. Moleculele de C3b se fixează de suprafeţele acceptoare, în particular de peretele microorganismelor sau de celulele infectate şi alterate. Câteva bacterii, a căror structură este bogată în acid sialic, pot evita acţiunea sistemului complement. La rândul său, C3b acţionează asupra factorului B. Factorul B. Element al căii de amplificare, factorul B este clivat în Ba şi Bb. Complexul C3bBb, format în prezenţa ionilor de Mg2+, constituie C3-convertaza alternativă, care clivează noile molecule de C3 în C3b. Acest clivaj accelerat de C3, dă naştere C5-convertazei (C3bBb)n. Factorul D, factor prezent sub formă activă în ser înainte de activarea C’, clivează factorul B, ceea ce facilitează formarea complexului C3bBb.

169

Ansamblul factorilor activatori ai căii clasice şi alternative realizează o buclă de amplificare, care permite transformarea numeroaselor molecule de C3 în C3b astfel încât C3b să acopere (opsonizeze) peretele bacterian. (Figura nr. 2)

15. 3. Calea finală comună Calea finală comună mai este numită şi calea efectoare sau calea litică. Activarea începe de la C5convertaza căii clasice (C4b2a-C3b)n şi respectiv de la (C3bBb)n în cadrul căii alternative. Activarea cuprinde de fapt complexul de atac al membranei (Membrane Attack Complex), MAC): C5. Convertazele-C5 pentru calea clasică şi respectiv pentru calea alternă clivează C5 în C5a, molecula mică, liberă şi C5b, molecula mare care se fixează pe structura ţintă. Atât C5a, cât şi molecula care rezultă în urma transformării sale în C5-dezarginină, acţionează la nivelul receptorului C5a-R al mastocitelor şi bazofilelor. C6, C7, C8. C5b antrenează legătura dintre C6 şi C7, formând un complex C5b67 notat prescurtat C5b7. Complexele C5b7 se leagă de o moleculă de C8 care se implantează în membrană apoi mai multe molecule de C9 vor forma un complex membranar C5b9m. C9. Această proteină are două proprietăţi: 1. de a se insera la nivel membranar, graţie unei feţe hidrofobe; 2. de a polimeriza, formând astfel peretele unei soluţii de continuitate de circa 10 nm în diametru la nivelul membranelor celulelor ţintă (limfocitul T utilizează o substanţă numită perforină, cu efect asemănător cu cel produs de C9). Formarea sau fixarea complexului C5b9 în cantităţi sublitice la suprafaţa celulelor antrenează sinteza şi eliberarea mediatorilor inflamaţiei (leucotriene, IL-1 etc). (Figura nr. 3) Există o serie de mecanisme de reglare a activităţii sistemului complement, acestea fiind mediate de proteine reglatoare care intervin la un moment dat în cursul cascadei de activare, având capacitatea de a o limita sau chiar opri. (Tabelul nr. 2) În general, aceste proteine inhibă formarea C3 convertazei sau promovează disocierea ei (când aceasta deja s-a format).Decay Accelerating Factor (DAF) – „Factorul de accelerare a disocierii C3 convertazei” este o proteină care poate dezactiva C3 convertaza căii clasice, dar are şi rolul de a inhiba formarea ei, nepermiţând elementelor C2a şi C4b să interacţioneze. Împreună cu CR1 (complement receptor 1), DAF competiţionează cu factorul B la legarea de C3b, prevenind astfel constituirea C3 convertazei căii alterne. Acest complex DAF-CR1 poate să disloce Bb din compusul C3bBb, disociind C3 convertaza căii alterne. Factorul H are acţiune similară. Tot din categoria proteinelor reglatoare face parte şi Factorul I, o protează din plasmă care clivează C3b în mai multe situsuri, inactivându-l. Iniţial rezultă C3bi, apoi C3c şi C3dg (fragment ce rămâne ataşat membranei celulare). Properdina (factorul P), în contrast cu toţi compuşii enumeraţi anterior, intervine în reglarea sistemului complement prin stabilizarea C3 convertazei căii alterne. Deficienţele de properdină au fost asociate cu creşterea susceptibilităţii faţă de infecţiile provocate de Neisseria spp.

15. 4. Receptorii pentru complement (CR) Cei mai importanţi receptori recunosc C3b sau derivaţii săi C3bi şi C3d. CR1 (CD35) sau receptorul pentru C3b 170

CR1 sau receptorul pentru C3b şi C4b este prezent pe hematii, trombocite, neutrofile, eozinofile, monocite şi macrofage, limfocite B şi T4 precum şi la nivelul podocitelor glomerulare. Acest receptor permite transportul complexelor imune prin intermediul globulelor roşii spre macrofagele hepatice sau celulele Kuppfer. Pe de altă parte, fenomenul de aderenţă imună realizat prin intermediul macrofagelor de particulele încărcate cu C3b, permite fagocitoza complexelor şi eliminarea lor. Dacă sunt prezenţi şi anticorpii, această acţiune este decuplată, graţie acţiunii conjugate a receptorilor de Ig. Ar mai fi de menţionat că CR1, prezent pe celulele dendritice intrafoliculare, permite prezentarea antigenului situat în cadrul complexului imun acoperit de componente ale complementului. CR1 acţionează drept cofactor al factorului I, fiind una dintre componentele ce intervin în reglarea acţiunii complementului. (2) Variaţiile expresiei genetice a CR1 se corelează direct cu apariţia lupsului eritematos şi formelor severe de malarie. În prezent este speculat scopul terapeutic pe care îl are CR1 solubil. (3) CR2 (CD21) sau receptorul pentru C3d Receptorul pentru C3dg sau C3d, este prezent pe limfocitele B, pe celulele foliculare dendritice şi pe celulele mucoase din orofaringe. C3d antrenează stimularea şi proliferarea limfocitelor B prin intermediul complexelor imune acoperite de C3d sau permite prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice. Spre ex. penetrarea la nivel faringian şi respectiv infectarea ulterioară a limfocitelor de către virusul EpsteinBarr se realizează prin intermediul acestui receptor. CR2 este implicat direct în inducerea răspunsului imun umoral primar. CR3 (CD11b/CD18) sau receptorul pentru C3bi CR3 sau receptorul C3bi se găseşte pe monocite, macrofage, neutrofile şi pe celulele foliculare dendritice. El permite fenomenele de aderenţă imună precum şi fagocitoza particulelor acoperite de C3bi sau citoliza bacteriei prin fenomenul de ADCC (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity). CR3 permite de asemenea prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice. Are un rol important în stabilirea adeziunii dintre leucocite şi endoteliu, fiind presuspus faptul că CR3 este ligand pentru ICAM (Intercellular Adhesion Molecule) exprimat pe celula endotelială. (4) CR3aR, C4a, C5a, C1q, HR Există, de asemenea, receptori pentru fragmentele mici C3a (C3aR), C4a (C4aR) şi C5a (C5aR) la nivelul mastocitelor, monocitelor, macrofagelor, neutrofilelor şi trombocitelor. Aceşti receptori activaţi antrenează fenomene inflamatorii, activând aceste celule şi permiţând eliberarea substanţelor inflamatorii sau atragerea neutrofilelor. Receptorul pentru C1q (C1qR) precum şi receptorul pentru factorul H (HR) permit fagocitoza particulelor opsonizate.

15. 5. Rolul biologic al sistemului complement Sistemul complement prezintă numeroase activităţi biologice: 15. 5. 1. În inflamaţie sunt implicaţi diferiţi compuşi solubili de talie mică. C3a şi C4a au o masă moleculară apropiată de 10.000 Da şi sunt numite anafilatoxine. Ele pot să se fixeze pe bazofile şi pe mastocite atrăgând eliberarea de histamină precum şi vasodilataţie, unul dintre primele elemente ale răspunsului inflamator. C2b (kinina-C2) este capabilă să crească permeabilitatea vasculară. C5a posedă o activitate chimiotactică pozitivă faţă de neutrofile şi conduce la agregarea polinuclearelor, în urma activării 171

complementului. Complexul C5b7 fixat pe membrane sau pe complexele imune are de asemenea acţiune chimiotactică pentru polinucleare. 15. 5. 2. În apărarea anti-infecţioasă. Agenţii infecţioşi extracelulari pot fi acoperiţi de componente ale sistemului complement fie în urma activării directe (calea alternativă activând direct C3), fie prin intermediul anticorpilor care fixează complementul. În final, complexele de atac ale membranei (componentele C5-C9) lizează diferite microorganisme: bacterii, virusuri sau paraziţi. Aceasta reprezintă o activitate citolitică directă a complementului cu sau fără prezenţa anticorpilor. Prin mecanisme asemănătoare, agenţii infecţioşi pot fi acoperiţi de C3b sau C3bi care sunt recunoscuţi de diferiţi receptori, prezenţi la nivelul diferitelor celule fagocitare esenţiale: neutrofile şi macrofage. După aderare, acestea vor fagocita microorganismele. Diferite microorganisme au dezvoltat mecanisme de rezistenţă la acţiunea complementului: ex. prezenţa unei capsule care împiedică activarea căii alternative (S. pneumoniae, Haemophilus influenzae), sintetizarea unor substanţe care fixează C3b sau antrenează o rezistenţă la inserţia complexului de atac al membranei. 15. 5. 3. În metabolismul complexelor imune. Curăţarea (clearance-ul) complexelor imune este facilitată în mare măsură de către sistemul complement. Simpla fixare a complementului inhibă formarea complexelor imune de talie mare (calea clasică) şi le solubilizează. Totuşi complexele circulante acoperite de C3b pot adera la hematii, iar apoi pot fi transportate până la nivelul celulelor Kuppfer hepatice, pentru a fi fagocitate. C1q are proprietatea de a precipita complexele imune in vitro. Această proprietate stă la baza diverselor metode de detectare a complexelor imune circulante. 15. 5. 4. În reglarea răspunsului imun.Pe limfocitele B se găsesc receptori pentru C3d sau C3dg (CR2). 15. 5. 5. În inducerea secreţiei de citokine de către monocite şi macrofage prin intermediul receptorilor C3. (5) Sistemul C' poate acţiona în sistem heterolog (C' recoltat de la animale, de ex. nurcă, cobai se poate folosi în reacţii de diagnostic în microbiologia medicală, sistemul indicator provenind de la un alt animal de ex. oaie, bou) şi din această cauză a fost şi este încă folosit în foarte multe situaţii. Trebuie însă reţinut faptul că sistemul C' se degradează rapid la temperaturi mai mari de 56ºC şi din această cauză reactivii care conţin C' trebuie menţinuţi la rece (0ºC) inclusiv pe timpul transportului.

15. 6. Povestiri adevărate 15. 6. 1. Infecție gravă cu SGB în cazul deficitului de complement Streptococii de grup B (Streptococcus agalactiae) reprezintă o cauză frecventă a infecţiilor grave la nounăscuţi şi copiii mici. Prognosticul cel mai nefavorabil îl au sepsisul şi infecţiile localizate la nivelul sistemului nervos central. În special în sepsis, dar şi în cazul meningitelor, evoluţia poate fi către şoc şi insuficienţă multiplă de organ (eliberarea sistemică a TNF-α, de către monocite şi macrofage este corelată cu gravitatea şi riscul evoluţiei către deces). Gravitatea infecţiilor este însă dependentă şi de imaturitatea mecanismelor de apărare la vârste mici. Se poate constata o insuficientă producţie de PMN neutrofile, o activitate mai scăzută a sistemului complement, un procent mai însemnat de limfocite T „naive”. Deşi sinteza elementelor care formează sistemul complement începe relativ repede, în perioada fetală (între săptămânile 6 - 14 de viaţă intrauterină), concentraţia acestora la naştere nu depăşeşte jumătate din cea de la adult.

172

Dintre efectele necesare ale sistemului complement, opsonizarea reprezintă o etapă esenţială în cadrul unei fagocitoze eficiente. Componenta C3 a sistemului complement reprezintă „punctul de convergenţă” între calea clasică şi calea alternativă (alternă). C3 favorizează fagocitoza prin structuri care se ataşează suprafeţei bacteriene şi sunt recunoscute de anumiţi receptori. Pe suprafaţa neutrofilelor sunt expuşi receptorii CR1 (CD35) - care se leagă de componenta C3b. Neutrofilele prezintă şi receptori CR3. Comparativ cu configuraţia receptorilor la adult, neutrofilele nou-născuţilor sunt deficitare în exprimarea CR3. Un studiu recent a demonstrat că blocarea (la adult) receptorilor CR3 împiedică buna desfăşurare a proceselor de opsonizare şi fagocitoză. Acelaşi studiu a emis ipoteza că depozitarea unor anumiţi compuşi de clivare ai C3 pe suprafaţa streptococului de grup B ar fi un factor important în apărarea gazdei împotriva agravării infecţiei. Alte experimente au arătat că la şoriceii cu deficit de C3 eliberarea de TNF-α indusă de streptococ este semnificativ redusă. În concluzie, calea alternă a complementului şi factorul C3 ar putea reprezenta cheia eliberării de TNF-α. Abilitatea streptococului de grup B de a activa sistemul complement a fost demonstrată în vitro. Deşi se ştie că nou-născuţii prezintă concentraţii relativ mici ale complementului, în mod aparent calea alternă este suficient de activă încât să amplifice eliberarea de TNF-α în cazul infecţiilor streptococice. Acest fapt a fost demonstrat de diferite studii care au certificat creşterea marcată a eliberării TNF-α de către monocitele nou-născuţilor. Având în vedere că eliberarea de TNF-α ca răspuns la infecţiile grave cu streptococ de grup B pare să aibă o strânsă legătură cu fiziopatologia acestor infecţii, se consideră că terapia adjuvantă imunomodulatoare administrată cu scopul de a reduce activitatea pro-inflamatorie a streptococului ar putea fi eficientă. O astfel de terapie ar include şi modularea căii alterne a complementului. 15. 6. 2. Consecințe ale deficitului de properdină Sistemul complement este un complex de molecule care face parte din ansamblul imunităţii nespecifice. De-a lungul timpului, s-au descoperit o serie de afecţiuni corelate cu deficienţe ale acestor compuşi dintre care şi boli autoimune, dar şi reacţii de hipersensibilitate. Un subiect îndelung studiat îl reprezintă deficitul de properdină şi predispoziţia persoanelor care posedă această carenţă faţă de infecţiile cu specii din genul Neisseria. Properdina este o glicoproteină reglatoare a căii alterne de activare a complementului, singura care reglează pozitiv cascada enzimatică prin stabilizarea C3 şi C5 convertazei căii alterne. Concentraţia serică fiziologică de properdină este de 5-15 μg/ml, fiind un amestec de monomeri, dimeri, trimeri şi tetrameri în raport de 1:2:1. În 1982, într-o familie suedeză, a fost descris primul caz de carenţă de properdină în asociere cu o infecţie meningococică cu debut fulminant. Ulterior, studiindu-se această problemă, s-a ajuns la concluzia că există 3 tipuri diferite de deficit de properdină (observate clinic la indivizi diferiţi). Primul tip se caracterizează prin absenţa proteinei în plasmă. Cel de-al doilea se manifestă printr-un titru foarte scăzut al properdinei, iar cel de-al treile tip presupune o concentraţie serică normală, dar o variantă nefuncţională a proteinei. Detectarea unei astfel de condiţii la un pacient este foarte dificil de făcut. Pe lângă testele de laborator care sunt foarte laborioase, este necesar un istoric infecţios al pacientului şi al familiei acestuia. Din pricina diagnosticului greu de stabilit, deficitul de properdină este rar întâlnit, însă prezent în fază „ocultă” (nediagnosticată) în special în cadrul rasei caucaziene, nefiind reportate cazuri la nici o altă populaţie. Formele 173

de deficit de properdină sunt maladii genetice transmisibile, X-linkate. Se cunoaşte deja, în toate trei tipurile bolii, care sunt mutaţiile ce survin şi unde sunt acestea localizate. Predispoziţia faţă de infecţiile cu Neisseria meningitidis apare ca manifestare clinică în toate tipurile deficitului de properdină. Serotipurile cel mai des implicate în astfel de infecţii sunt W-135 şi Y, mai puţin serotipul B, faţă de care s-a constatat că organismul uman şi-a dezvoltat metode mai eficiente de apărare prin mecanisme de fagocitoză. Indivizii cu deficit de properdină au un risc mai crescut de 250 de ori de a dezvolta o infecţie meningocociă decât restul populaţiei sănătoase. Dacă la o persoană normală, şansele cele mai mari de a face infecţie cu meningococ sunt la vârsta de 6 ani, la un individ cu deficit de properdină, vârful riscului dezvoltării infecţiei este în jurul vârstei de 14 ani. Mortalitatea în astfel de cazuri este de până la 75%. Infecţiile recurente sunt extrem de rare în condiţiile date, fapt ce atestă că probabil apărarea umorală devine mai eficientă la aceste persoane. Pacienţii cu deficit de properdină au un răspuns umoral adecvat la vaccinul tetravalent antimeningococic (care conţine antigene din serotipurile A, C, Y, W135), organismul generând anticorpi anticapsulari ce devin eficienţi în combaterea instalării infecţiei. Partea bună este că nu la toţi pacienţii la care este detectat deficitul de properdină se dezvoltă infecţii meningococice. Acest lucru a sugerat că există şi alţi factori adiţionali care favorizează predispoziţia către aceste infecţii. S-a constatat astfel că la o parte dintre indivizii cu deficit de properdină, lipsea alotipul G2m(n) (alotipul reprezentînd o secvenţă aminoacidică de pe lanţul g al moleculei de IgG2 specifică fiecărui individ). Se speculează că această combinaţie: deficit de properdină – lipsa alotipului G2m(n) este un temei relevant care explică de ce indivizii afectaţi prezintă un risc net superior de a se imbolnăvii de infecţii meningococice.

15. 7. Verificați-vă cunoștințele Urmatoarele întrebări au un singur răspuns corect. 1. C3 convertaza: A. este o enzimă proteolitică, cu activitate anafilactoidă B. se poate constitui pe două căi, rezultând 2 compuşi diferiţi structural, dar cu aceeaşi funcţie C. scindează componenta C5 în C5a şi C5b D. sub acţiunea sa, în membrana celulei atacate se formează MAC (Membrane Attack Complex) E. nici un răspuns nu este corect. 2. Afirmaţia adevărată este: A. sistemul complement este una dintre componentele implicate în apărarea nespecifică B. nu există nici o bacterie care să poată scăpa de acţiunea sistemului complement, întrucât toate bacteriile reprezintă structuri non-self care generează un răspuns imun C. calea clasică de activare a complementului presupune interacţiunea componentei C1q cu paratopii (Fab) anticorpilor din complexele antigen-anticorp D. componentele sistemului complement se găsesc permanent în ser în stare activă, pregătite pentru a interveni ori de câte ori apare un agent patogen E. răspunsurile de la punctele A și C sunt adevărate. 174

3. Receptorii pentru complement: A. sunt proteine circulante în ser care se pot combina cu structurile complementului pentru a fi transportate către splină B. se găsesc pe toate celulele din organism C. sunt proteine prezente în membrana celulelor imunitare care intervin în multiple roluri ale sistemului complement (cum ar fi transportul eritrocitelor senescente către splină sau ficat) D. sunt doar de două tipuri şi prin intermediul lor, moleculele de C3b pot opsoniza celula ţintă E. nici un răspuns nu este corect. 4. Calea comună de activare a sistemului complement: A. are ca rezultat formarea C3 convertazei B. poate fi inhibată de către properdină C. este amplificată sub acţiunea DAF (Decay Accelerating Factor) D. debutează prin scindarea componentei C5 sub acţiunea C5 convertazei E. toate răspunsurile sunt corecte. 5. Care dintre componente activează cel mai uşor calea clasică? A. complexele antigen-anticorp B. bacteriile care au un conţinut bogat în manoză la nivelul peretelui celular C. bacteriile încapsulate D. celulele tumorale E. sunt corecte răspunsurile A și D.

16. Antigenele Antigenul se defineşte drept o substanţă recunoscută specific de către sistemul imun. Alţi autori consideră că antigenul este o substanţă capabilă să inducă un răspuns imun (imunogenicitate) şi să fie recunoscută de către sistemul imun (specificitate). Răspunsul imun (RI) tinde să neutralizeze şi să elimine antigenul din cauza căruia s-a declanşat. Antigenele (Ag) care pot declanşa RI sunt definite drept substanţe imunogene. Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declanşa activarea limfocitelor (fără de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene numai dacă se combină cu macromolecule „carrier”. Aşadar, haptena este un antigen incomplet, are specificitate dar nu are imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic rezultat prin degradarea moleculei de penicilină este o haptenă. Pot apărea reacţii de hipersensibilitate după cel puţin al doilea contact cu această structură şi numai în condiţiile în care gazda întră în categoria persoanelor „atopice”, având structura genetică de codificare pentru o proteină „carrier”, care cuplează acidul penicilinoic stimulând astfel RI. 175

Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat activ, imediat. Orice bacterie trebuie văzută ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene (unele pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de apărare împotriva microorganismelor sunt diferite dar pot fi deduse în funcţie de structura şi caracterele de patogenitate ale respectivei bacterii. Acesta este un alt exemplu care demonstrează faptul că între capitole diferite există legături importante, iar noțiunile citite și înțelese ”la timpul lor” pot fi foarte utile, ulterior. Există 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip micobacterian și spirochetal) iar patogenitatea poate varia între 2 ”extreme” (toxicitate fără invazivitate și invazivitate fără toxicitate). (Figura nr. 1) Recunoaşterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun, preexistente introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de peptide antigenice diferite şi nu sunt specifice unui antigen în mod particular. Moleculele simple precum apa, sărurile minerale şi ureea sau comune majorităţii speciilor (ca acizii graşi, creatinina, mono- şi dizaharidele, fibrina) nu sunt antigene. Pe de altă parte, moleculele mici de tipul metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariţia hipersensibilității, sau medicamentele, pot deveni antigene după ce se asociază cu diferite macromolecule.

16. 1. Clasificarea antigenelor 16. 1. 1. În relaţie cu subiectul în care are loc RI Heteroantigenele sunt substanţe diferite de antigenele proprii animalului imunizat, provenite de la o altă specie. Imunizarea este cu atât mai uşor de obţinut cu cât între specii diferenţele sunt mai mari şi îndepărtarea filogenetică este mai importantă. Termenul izotip indică un caracter comun tuturor indivizilor unei specii, şi, în acelaşi timp, corespunde unuixenoantigen pentru celelalte specii. Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeaşi specie. Alloanticorpii sunt obţinuţi prin imunizarea intra-specie sau inter-specii, după absorbţia anticorpilor anti-izotip. Autoantigenele sunt substanţe recunoscute prin răspunsul imun şi prezente la animalul imunizat sau la om în contextul unei afecţiuni autoimune. În mod normal, un individ nu declanşează un răspuns imun împotriva structurilor proprii. Un răspuns autoimun se poate obţine prin imunizarea animalului cu substanţe proprii împreună cu adjuvanţi sau prin injectarea unor substanţe self uşor alterate. Idiotipul se referă la un caracter propriu părţilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau anticorpilor apăruţi după imunizarea faţă de un antigen dat.

16. 1. 2. În relaţie cu tipul de răspuns imun Antigenele timodependente 176

Răspunsul celular sau umoral timodependent nu se poate produce la un animal timectomizat în timpul vieţii intrauterine sau la naştere, la şoarecele nud, timectomizat sau la un subiect cu maladia di George, caracterizată prin absenţa congenitală a timusului. Antigenele timodependente sunt în general de natură proteică dar pot fi şi de natură glucidică. Ele induc un răspuns primar iniţial slab, de izotip IgM, cu memorie, urmat de un răspuns secundar specific, cu IgG, IgA sau IgE. Pentru obţinerea sa, sunt necesare 3 celule (o celulă prezentatoare de antigen, un limfocit T helper şi un limfocit B) sau 2 celule (atunci când LB joacă şi rolul de APC). Antigenele timoindependente Producerea de anticorpi faţă de antigenele timoindependente nu necesită prezenţa LT. Antigenele sunt în general glucide cu determinanţi antigenici repetitivi, cu o metabolizare şi o rată de degradare lentă.Cele mai importante exemple sunt polizaharidele bacteriene care au aceeaşi structură glucidică repetitivă dispusă de-a lungul peretelui celular. flagelina, antigen proteic cu determinanţi antigenici repetitivi, face parte din antigenele timoindependente.

16. 1. 3. În funcţie de repartiţia antigenelor în natură Existenţa anticorpilor „naturali” şi a celor apăruţi în urma unui răspuns imun face necesară divizarea antigenelor în două categorii: Antigene ubicuitare: Antigenele ABH ale grupului sanguin ABO sunt larg răspândite în natură. Prezenţa lor în bacteriile intestinale saprofite duce la imunizare în primele luni de viaţă. Răspunsul imun este de tip timoindependent. Anticorpii naturali anti-A şi anti-B sunt din clasa IgM, uşor adsorbabili de substanţele A sau B salivare. Aceşti anticorpi, consideraţi alloanticorpi în cazul transfuziilor sanguine, sunt de fapt heteroanticorpi. Antigene restrânse: Unele antigene sunt limitate la o singură specie şi la un singur tip celular (un exemplu fiind antigenele sanguine Rh). Anticorpii apăruţi în urma răspunsului imun nu apar decât după contactul cu hematiile unui subiect de grup diferit, după o transfuzie sau după pasajul hematiilor fetale în sângele femeii gravide.

16. 1. 4. În funcţie de natura chimică Polizaharidele ca şi partea glucidică a glicoproteinelor sunt în general antigene. Exemplele cele mai cunoscute sunt antigenele care definesc grupele sanguine (la acestea, specificitatea este dată de diferitele zaharuri) şi antigenele clasice ale diferitelor microorganisme. Antigenele lipidice îşi datorează antigenicitatea cuplării cu părţi glucidice sau proteice, aşa cum este cardiolipina, extrasă din mitocondrii, faţă de care apare reacţia imună în sifilis. Atunci când au o greutate moleculară mai mare de 4.000 Da, polipeptidele sau proteinele devin antigene şi imunogene. Cel mai mic imunogen cunoscut este vasopresina (greutate moleculară 1.000, cu doar 9 aminoacizi). Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ubicuitare; sunt antigene şi imunogene. Lipidele cuplate cu zaharuri formează lipopolizaharide/lipooligozaharide (LPZ/LOZ), de ex. în peretele bacteriilor Gram-negative (Neisseria spp., Salmonella spp., Vibrio spp., Brucella spp. etc). 177

Obţinerea de anticorpi anti-acizi nucleici după imunizarea unui animal este dificilă. În unele afecţiuni autoimune, de tipul lupusului eritematos diseminat, se observă diferite tipuri de anticorpi anti-acizi nucleici. Compuşii sintetici cu structura cea mai variată pot fi antigene dacă greutatea lor moleculară este suficient de mare sau dacă sunt legaţi de proteine purtătoare („carrier”). Compuşii sintetici au importanţă în determinarea imunogenicităţii şi specificităţii antigenice. Un posibil tip de antigene este reprezentat de medicamente, responsabile de reacţia „alergică” din patologia umană (ex. hipersensibilitatea de tip I faţă de beta-lactamine). Superantigenele sunt molecule care se leagă în exteriorul moleculelor MHC II şi de o secvenţă peptidică din familia TCR; aceste molecule, fără a fi recunoscute specific, acţionează pe numeroase clone celulare T cu structură comună. Această proprietate a fost observată la enterotoxinele stafilococice, la nucleocapsida virusului rabiei etc. Se consideră că superantigenele pot avea un rol în inducerea bolilor autoimune.

16. 1. 5. În funcţie de potenţialul de a stimula RI şi de a reacţiona cu Ac În funcţie de potenţialul de a stimula RI şi de a reacţiona cu Ac formaţi în cadrul acestui RI, antigenele pot fi: - Ag complete (majoritatea) care pot declanşa RI şi pot reacţiona cu Ac apăruţi; - Ag incomplete care nu pot declanşa RI dar pot reacţiona (in vitro) cu Ac; sunt de ex. epitopi izolaţi, nelegaţi de grupări purtătoare (pot fi haptene).

16. 1. 6. În funcţie de specia microorganismului implicat Antigenele bacteriene includ substanţe legate de corpul celular (proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A, polizaharidul A de la stafilococul auriu, antigenul O al bacteriilor Gram-negative, antigenul Vi de la Salmonella typhi, antigenele K şi de tip K de la bacteriile capsulate, antigenele H ale bacteriilor ciliate) sau eliberate sub formă de exotoxine sau enzime extracelulare (bacil difteric sau streptococ beta-hemolitic de grup A dacă sunt lizogenizaţi, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Vibrio cholerae, Shigella shiga, Bordetella pertussis etc). (vezi și capitolele 2 și 9) Antigenele virale sunt localizate la nivelul capsidei, fac parte din învelişul extern (ex. hemaglutinine) sau constituie proteine şi glicoproteine structurale. Antigenele parazitare au un caracter complex şi un aspect mozaicat, datorat de ex. marii diversităţi a ciclurilor biologice parazitare. La o singură specie parazitară pot fi evidenţiate mai multe tipuri de antigene (ex. 20 de antigene la Plasmodium falciparum). Antigenele parazitare pot fi somatice şi metabolice.

16. 2. Proprietăţile antigenelor 16. 2. 1. Specificitatea imunologică 178

Specificitatea unui antigen este proprietatea de a fi recunoscut prin RI pe care l-a declanşat şi nu prin RI declanşat de alte antigene, diferite. Toate tehnicile imunologice se bazează pe această proprietate fundamentală. Reacţia încrucişată Deşi specificitatea reacţiei imune este regula, există totuşi şi excepţii, reacţiile încrucişate, atunci când 2 antigene de origine diferită reacţionează cu acelaşi anticorp (datorită unei asemănări structurale). Epitopul este o parte bine definită din structura antigenului, care intră în contact cu situsul de combinare al anticorpului. Structura corespondentă sau receptorul de antigen al imunoglobulinei se numeşte paratop. Determinantul antigenic este un „punct cald” al antigenului, recunoscut în cadrul diferitelor răspunsuri imune. El corespunde mai multor epitopi centraţi pe acelaşi loc. Într-un Ag, determinanţii antigenici sunt situaţi frecvent la extremităţi sau în unghiurile moleculei. Un Ag prezintă în general mai mulţi determinanţi antigenici, fie sub forma aceleiaşi structuri glucidice repetitive, fie sub forma mai multor motive proteice diferite, recunoscute de către sistemul imun. Numărul determinanţilor antigenici care pot fi recunoscuţi de către sistemul imun constituie repertoriul imun. Pe baza cunoştinţelor asupra structurii părţii variabile a imunoglobulinelor, genomul uman codifică pentru aproximativ 107-108 tipuri posibile de anticorpi diferiţi. În plus, mutaţiile frecvente în linia B aduc posibilităţi suplimentare, lărgind repertoriul imun. Acelaşi Ac poate recunoaşte mai mulţi determinanţi antigenici diferiţi, cu afinităţi variabile. Pe de altă parte, o moleculă de antigen are mai mulţi epitopi (10-20), valenţa antigenului fiind dată tocmai de numărul acestora (de ex. dacă există 16 epitopi, valenţa este 16 şi ar putea fixa 8 molecule de anticorpi din clasa IgG, fiecare cu câte 2 situsuri combinative). Fiecare epitop este recunoscut şi declanşează un RI şi sinteza de anticorpi care îl recunosc doar pe el.

16. 2. 2. Imunogenicitatea Imunogenicitatea este capacitatea unui Ag de a induce un răspuns imun umoral sau celular. O haptenă este o moleculă mică (naturală sau artificială), incapabilă să inducă singură un răspuns imun dar care poate fi recunoscută de componentele sistemului imun. Termenul a fost introdus de Landsteiner în 1930. Haptena are specificitate dar nu are imunogenicitate. Termenul de haptenă nu este sinonim cu cel de determinant antigenic: haptena poate fi mai mică, egală sau mai mare ca epitopul. Purtătorul(carrier-ul) este partea Ag cu structură proteică, în general, care prin cuplare cu haptena face ca aceasta să devină imunogenă.

16. 2. 3. Alergenicitatea Unele antigene sunt capabile să inducă producţia de anticorpi IgE şi prin aceasta să provoace o reacţie de hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalele alergene cunoscute sunt polenul, veninul de viperă, praful de acarieni şi unele fragmente sau produse de origine animală.

16. 2. 4. Asocierea cu factorii adjuvanţi Un adjuvant poate creşte intensitatea răspunsului imun faţă de un antigen la care acesta este asociat. Adjuvanţii pot fi utili atunci când antigenele sunt eliminate rapid şi nu există timpul necesar pentru stimularea 179

RI. Pentru ca Ag să persiste cât mai mult, ele sunt asociate cu aceste substanţe numite generic adjuvanţi (ex. hidroxid de aluminiu, saponină, adjuvant Freund etc).

16. 2. 5. Răspunsul la mitogene Pe lângă răspunsul imun specific, antigenele pot antrena o hipergamaglobulinemie globală, stimulând diviziunea limfocitelor B. Aceasta se observă frecvent în cursul infecţiilor sau inoculării de lipopolizaharide enterobacteriene.

16. 2. 6. Alte efecte ”datorate” antigenelor Pot apărea şi alte modificări în organismul gazdă, care ţin de răspunsul imun. Persistenţa activării macrofagelor într-un focar poate determina formarea granuloamelor. Acestea sunt formate (concentric, dinspre interior spre exterior) din structuri proprii și antigene fagocitate sau nu de macrofage, celule gigante multinucleate numite și ”celule epitelioide” (formate din fuziunea macrofagelor activate), acumulare periferică de celule T, neutrofile și celule dendritice printre fibrele de colagen. Ȋn cazul tuberculozei (TB) centrul granulomului este reprezentat de cazeum. În cazul persoanelor diabetice, a persoanelor cu SIDA sau cu alte stări de imunodepresie procesul de formare a granuloamelor poate fi afectat, infecţia nu trece în stadiu latent ci rămâne activă. Un alt argument poate fi reprezentat de următoarea constatare: adminstrarea de anticorpi blocanți ai TNF (de exemplu, ca tratament simptomatic în artrita reumatoidă) reactivează rapid tuberculoza. Răspunsul organismului la agresiunea bacteriană se poate solda și cu alte afectări și chiar distrugeri la nivel tisular, şoc toxico-septic sau reacții de tip Schwartzman. Şocul toxico septic este provocat de o producere excesivă de citokine în cursul sepsisului, în special în infecțiile cu germeni Gram negativi și respectiv cu eliminare importantă de LPZ. Apar febră înaltă, colaps circulator, CID (coagulare intravasculară diseminată), necroză hemoragică și eventual afectare multiplă de organ (MOF -multiple organ failure). În mod paradoxal, pacienţii care îşi revin după acest tip de şoc pot dezvolta ”paralizie imună”, fiind susceptibili unei infecţii secundare. Reacția Schwartzman (Sanarelli-Schwartzman) poate să apară experimental atunci cȃnd, injectând subcutanat o doză mică de endotoxină, rezultă inflamaţie uşoară; ulterior, la injectarea intravenoasă după 24 de ore a endotoxinei, zona anterior inflamată devine hemoragică în cȃteva ore. Această reacție poate apărea după infecții cu bacterii Gram negative, streptococi, mycobacterii, Corynebaterium diphteriae etc. O a doua injectare după încă 24 de ore de la prima injectare intravenoasă a endotoxinei/bacteriei poate determina colaps circulator şi necroză bilaterală a cortexului renal. Mai pot apărea necroze la nivelul pancreasului, epifizei, corticosuprarenalelor, tubului digestiv, tromboze și CID. La nivel microscopic apar modificări endoteliale, depozite de fibrină, acumulare de neutrofile și degranularea acestora. Titrul interferonului se corelează cu distrugerile tisulare, iar titrul TNF se corelează cu manifestările sistemice. Aceasta reacţie Schwartzman ar putea să se afle la originea rash-ul ce apare la copii cu meningita meningococică sau a şocului septico-toxic. Organismul uman reușește, de obicei, să mențină o balanţă și nu apar agresiuni (auto-agresiuni) evidente în cursul infecțiilor bacteriene. Principalele citokine imunoregulatoare sunt IL-10 si TGFβ. Există și bacterii care profită tocmai de această balanţă a organismului. Hemaglutinina şi adenilat ciclaza (factori de virulenţă ai B. 180

pertussis) favorizează secreţia de Il-10, ceea ce conduce la favorizarea persistenţa bacteriene în organism prin inhibarea TH1. O perturbare a acestei balanţe o poate determina omul prin tratament antibiotic (autoadministrat sau nu) soldat cu distrugerea masivă a bacteriilor. Poate rezulta un răspuns inflamator sever cu distrugeri tisulare.

16. 3. Factorii de care depinde imunogenitatea 1. Structura chimică trebuie să fie cât mai diferită (provenind de la o specie cât mai îndepărtată) faţă de structurile proprii [noţiunea de „structură străină” este de fapt o noţiune chimică; modificarea unui singur aminoacid din structura primară a unei molecule proteice va fi „sesizată” ca atare şi va duce la un RI, ca şi cum ar fi vorba de o structură „nouă” (diferită, străină, modificată)]; cu cât structura chimică antigenică provine de la o specie mai îndepărtată filogenetic, cu atât RI va fi mai puternic; 2. Structura trebuie să aibă un grad de „rigiditate” (să se menţină ca atare); 3. Structura trebuie să persiste suficient de mult în organism (în cazul în care respectiva structură este rapid epurată, nu va duce la apariţia unui RI); în acest sens pot fi date ca exemplu anumite structuri antigenice care sunt necesare pentru prevenirea unor îmbolnăviri (vaccinuri), dar care nu persistă suficient de mult în organismul gazdă, motiv pentru care au fost asociate cu substanţe adjuvante (sărurile de aluminiu au fost folosite în calitate de adjuvanţi pentru prima dată în 1950, în vaccinul Salk; diferite substanţe adjuvante sunt utilizate în vaccinul DTP, vaccinurile anti-HBV, anti-Haemophilus influenzae tip b etc); 4. Greutatea moleculară trebuie să fie cât mai mare (de regulă peste 4-5.000 Da); antigenele cu moleculă mică pot stimula răspunsul imun după cuplarea cu o „proteină carrier”; 5. Structura chimică trebuie să fie cât mai complexă (cele mai imunogene sunt proteinele iar cele mai puţin imunogene sunt lipidele şi acizii nucleici); 6. Doza de antigen, calea de administrare, momentul administrării antigenului etc. sunt alţi factori de care depinde imunogenitatea. Toţi aceşti factori sunt valabili „în contextul CMH al gazdei” care urmează să reacţioneze faţă de respectivul antigen.

16. 4. Povestiri adevărate 16.4.1. Antigene ... reacții ... apărare ... Dar care ar fiutilitatea clasificării antigenelor? Diferite categorii de antigene vor ”dirija” diferit răspunsul imun şi vor încearca să îl ”păcălească”, fiecare in stil propriu. Prima linie de apărare a organismului este reprezentată de piele şi mucoase, de acizii graşi secretaţi la nivel dermic (toxici pentru majoritatea bacteriilor), de mişcările cililor traheali, de fluxul urinar, de pH-ul acid stomacal sau vaginal etc. Bacterile comensale pot limita invazia bacteriana prin producerea unor proteine antibacteriene numite colicine. A doua linie de apărare este reprezentată de răspunsul imun înnăscut (innate), fără intervenţia LT sau LB. Acțiunea este îndreptată împotriva aşa-ziselor Ag microbiene comune, reunite sub denumirea de PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) şi cuprinde molecule ce în literatura anglo-saxonă sunt grupate sub denumirea de „patern recognition molecules” (ex: colectine, ficoline, TLR-Toll like 181

receptor, receptorul manozei, proteinele NOD, proteina A din surfactantul pulmonar, complementul, PCR proteina C reactivă). Spre exemplu, LPZ-ul bacteriilor Gram negative este unul dintre cei mai importanți reprezentanți ai PAMPs. LPZ se cuplează cu TLR4, activȃnd astfel raspunsul imun, cu stimularea secreției de TNF alfa, Il-1, creşterea adezivităţii celulare, secreţia de peptide şi amine vasoactive și scăderea consecutivă a tensiunii arteriale. Bacteriile Gram pozitive posedă acid lipotechoic şi peptidoglicani (polizaharidele nu au suficient potenţial imunogen). TLR-urile implicate sunt de data aceasta 1, 2 si 6. Ȋn recunoaşterea lipoproteinelor mycoplasmelor, mycobacteriilor şi spirochetelor intervin LBP și TLR4. TLR4 se mai numește şi CD14. Cum se prezintă aceste pattern recognition molecules? Majoritatea sunt exprimate la suprafaţa celulelor organismului (in special de la nivelul porţilor de intrare) și sunt îndreptate împotriva patogenilor extracelulari. Dar există și molecule pentru patogenii care au pătruns în celulă, care se află nu la nivelul membranei celulare ci la nivelul fagozomilor (TLR 9) sau solubili în citosol. (Figura nr. 2). Listeria spp., Helicobacter pylori şi Salmonella spp. generează PAMPs intracelulare. (Film nr. 1) http://www.youtube.com/watch?v=2LchUweyRx0 16.4.2. Răspuns imun nespecific ... specific ... Răspunsul nespecific presupune: -activarea complementului pe calea alternativă (bacteriile Gram negative sunt succeptibile la liza iniţiată de complexul C5b-9) -eliberarea de citokine proinflamatorii, care cresc proprietăţiile adezive ale sistemului endotelial (C5a, eliberat în cadrul formării complexului litic, funcţionează pe post de chemoatractant pentru neutrofile şi mastocite), şi leucotriene care vor crește permeabilitatea. Macrofagele eliberează TNF și Il-1, care împreună cu chemokinele CCL2, CCL3 şi CXCL8 direcţionează recrutarea de populaţii leucocitare. TNF, IL-1 și IL-6 iniţiază răspunsul inflamator acut și cresc producţia de componente ale complementului. PCR opsonizează bacteriile favorizând fagocitoza acestora. IL-12 și IL-18 stimulează NK sa produca IFN gama, care va activa macrofagele) -generează semnale care influențează si răspunsul imun specific (Celulele dendritice joacă un rol crucial în activarea LT. Activarea acestora în periferie induce migrarea lor la nivelul nodulilor limfatici, unde creşte exprimarea MHC, a moleculelor co-stimulatoare: CD40, CD80, CD86 şi a citokinelor ce induc diferenţierea LT. Contactul PAMPs-TLR creşte producţia locală de IFN gama, IL-12 și IL-18 care vor stimula diferenţierea LT, în special a TH1) Răspunsul specific se bazează pe activitatea LB şi a LT. Are loc un proces complex de interacţii celulare cu rol de amplificare a semnalizării iniţiale și de evitare a răspunsului imun la un semnal fals. LB au în principal rolul de a secreta Ac și de a păstra o memorie a agresiunilor infecţioase. Anticorpii pot fi suficienţi numai dacă patogenitatea este indusă de o singură toxină sau moleculă de adeziune iar Ac produşi sunt directionaţi împotriva acestei molecule cu rol patogen. Anticorpii opsonizanţi sunt importanţi pentru rezistenţa împotriva bacteriilor extracelulare. Bacterile patogene pot eluda răspunsul în anticorpi, aşa cum se petrece în cazul Neisseria gonorrhoeae, de aceea omul se poate infecta în mod repetat cu acest microorganism, însă în sȃngele său să nu se găsească dovezi ale imunităţii protective. (Film nr. 2) 182

http://www.youtube.com/watch?v=23lSlwzXnKM 16.4.3. Dar alte modalități de eludare a răspunsului imun? Antigenul O, avȃnd un lanţ polizaharidic lung, poate fixa complementul la distanţă de bistratul lipidic, astfel încât acesta nu işi poate exercita acțiunea litică. E. coli, Salmonella spp. și Pseudomonas aeruginosa fixează complementul dar îl ”taie” rapid de pe suprafaţa celulară. Alte microorganisme exploatează mecanismele fiziologice ale organismului gazdă pentru a ”păcăli” sistemul imun. Cȃnd C3b s-a ataşat de o membrană celulară poate interacţiona cu factorul B, care va amplifica activarea complementului sau poate interacţiona cu factorii H şi I, care vor inhiba complementul. Prezenţa acidului sialic favorizează interacţia complementului cu factorii H şi I iar celulele organismului uman reprezintă un mediu bogat în acid sialic. Prin acest mod se apără Neisseria meningitidis, E. coli K1 dar şi streptococii beta hemolitici de grup B. Proteina M a steptococcilor de grup A funcţionează ca un acceptor al factorului H (să nu uităm că acești streptococi posedă şi o genă ce codifică sinteza unei C5a proteaze). 16.4.4. Leucocite ... macrofage ... fagocitoză ... Totuşi, împotriva majorităţii bacteriilor este neapărat nevoie de intervenţia fagocitelor. Fagocitele elimină cea mai mare parte a bacteriilor prin chemotaxie, adeziune, internalizare şi apoptoză. Activarea optimă a macrofagelor este dependentă de TH1 (CD4+). Macrofagul este principala celulă prezentatoare de antigen, dar are şi rolul de a secreta citokine, enzime, molecule ale complementului, are efect procoagulant, produce specii reactive de oxigen şi NO care sunt foarte toxice, şi endocitează bacterii şi fungi. Rolul său în ansamblu este de a iniţia, propaga, preveni, supresa şi finaliza răspunsul imun. Macrofagele se dezvoltă din monocitele circulante (ca şi celulele dendritice mieloide şi osteoclastele) şi pot exista sub formă ciculantă sau sub formă tisulară. Citokinele eliberate de TH1 stimulează inflamaţia şi activitatea antimicrobiană a macrofagelor, în timp ce citokinele eliberate de TH2 induc o prezentare antigenică eficientă către LB. TGF beta, corticosteroizii şi IL-10 induc un fenotip antiinflamator. Macrofagele internalizează patogenii, utilizȃnd o varietate de receptori (receptorul pentru LPZ, TLR, betaglucanR, manoseR, receptorii pentru complement CR1, CR3, CR4). (Film nr. 3) http://www.youtube.com/watch?v=CHrk0ofcLDo Ataşarea de antigenele bacteriene a macrofagelor se poate face direct, prin intermediul TLR, manose receptor (MR),scavenger receptors și dectin-1b sau indirect, după opsonizarea bacteriei cu Ac, fibronectină, vitronectină sau complement, prin intermediul CR1, CR3, CR4, MBL, integrine, FcγRI, FcγRII, FcγRIII. Macrofagele tisulare (alveolare, celulele Kupfer etc.) oferă o oarecare protecţie, însă necesită intervenţia altor fagocite (leucocite, neutrofile) care vor fi atrase în focarul inflamator de componente bacteriene, de componenta C5a a complementului, de chemokine şi citokine sintetizate de macrofagele din ţesutul respectiv și de unele celulele epiteliale. Streptococcus pyogenesva determina leziuni acute şi atragerea la nivelul focarului infecţios în special a neutrofilelor, în timp ce Mycobacterium tuberculosis determină leziuni cronice şi va atrage macrofage, LT şi celule multinucleate derivate din macrofage. După cum știți, macrofagele produc specii reactive de oxigen (foarte toxice pentru microorganism, dar şi pentru celulele organismului gazdă). O specie reactivă de oxigen se formează în principal pe calea anionului superoxid. O astfel de substanţă are adăugat un electron, care o va face instabilă şi care va determina un şir de reacţii în lanţ în organism. Studii recente pe neutrofile au demonstrat că speciile reactive de oxigen sunt bactericide şi indirect (prin inducerea unui flux de K în fagozomi)activează producerea de proteaze. NO se 183

formează din L-arginină sub acţiunea NO-sintetazei, care poate fi indusă de IFNγ și TNFα, NO fiind tot o specie reactivă de oxigen, formată pe altă cale decȃt a anionului superoxid. Dar există şi metode oxigen-independente prin care fagocitele pot distruge bacteriile, de exemplu, prin intermediuil proteinelor cationice. Defensina din granulele neutrofilelor se inseră între lipidele membranei bacteriene şi crează un canal transmembranar care va duce la liza respectivului microorganism. Microbii sensibili la defensină sunt Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Cryptococcus neoformans. Catepsina G şi azurocidina sunt active pe bacteriile Gram negative. Fierul este foarte important pentru dezvoltarea bacteriilor intracelulare, neutrofilele îngreunȃnd accesul microorganismelor la acest element. Ȋnsă, organismul gazdă are nevoie crescută de fier de vreme ce este co-enzimă pentru generarea NO şi pentru lanţul respirator. E foarte important de reţinut că neutrofilul are o viaţă scurtă dar este foarte agresiv cu bacteriile, în timp ce macrofagul are o viață mai lungă, însă neactivat, este un ... prieten al bacteriilor. Cel mai important factor de activare a macrofagelor este IFNγ, iar acesta este produs în cele mai mari cantităţi de TH1 (CD4+). Există diferite metode prin care patogenii ”păcălesc” apărarea fagocitară. Listeria monocytogenes, Shigella spp. şiBurkholderia pseudomallei eliberează enzime care distrug membrana fagozomilor, împidedicând asfel unirea cu lizozomii şi formarea complexului fago-lizozom. M. leprae şi Salmonella spp. se îndreaptă spre celulele Schwann, hepatocite şi celulele epiteliale, care au o capacitate mai redusă de apărare. Streptococcus pneumoniae şi C. neoformans au un înveliş protector, care inhibă ataşarea macrofagelor de aceste bacterii. Stafilococii posedă catalază, care scade stresul oxidativ. M. leprae se înconjoară cu un glicolipid care absoarbe radicalii liberi. Micobacteriile, în general, eliberează lipoarabinoman, care scade eficienţa IFN în activarea macrofagelor. Celulele gazdei infectate cu Salmonella enteritidis, M. tuberculosis sau Chlamydia trachomatis nu işi exercită corespunzător funcţia de prezentare a antigenelor. Yersinia spp. induce apoptoza celulei gazdă. După internalizarea anumitor antigene urmează expunerea acestora la suprafaţa APC. Recunoaşterea de către TCR (T cell receptor) a Ag impune ca acest Ag să fie legat de o moleculă MHC (major histocompatibility complex). Ag endogene (peptide) vor fi prezentate pe MHC I, iar Ag exogene (peptide derivate din proteine extracelulare, care au ajuns la nivelul APC prin fagocitoză sau endocitoză, aşa cum este cazul antigenelor bacteriene) pe MHC II. Genotipic, MHC I sunt codificate de genele HLA-A, HLA-B, iar MHC II, de HLA-DP, HLADQ, HLA-DR. CD1 este o moleculă asemănătoare MHC I care prezintă antigene lipidice (M. tuberculosis, H. influenzae). (Film nr. 4) http://www.youtube.com/watch?v=m0ShUtbPllY 16.4.5. Intervenția LT ... LTc (CD8+) pot elibera microorganismele care s-au „ascuns” la nivelul celulelor gazdă. S-a demonstrat că prăbușirea sistemului MHC I la şoareci duce la lipsa de răspuns din partea LTc şi consecutiv, aceşti şoareci devin susceptibili la infecţia cuM. tuberculosis. Tendinţele actuale sunt de a găsi un vaccin care să stimuleze formarea LTc (Figura nr. 3). S-a mai observat că pe lȃngă dependenţa activării LTc de prezentarea MHC I-Ag, mai există şi o dependență de activitatea litică a fagozomilor. TCR (fie ei situaţi pe LT CD4+ sau CD8+) sunt de 2 tipuri: cu lanțuri αβ şi cu lanțuri γδ. Aceste 2 tipuri diferă prea puţin ca structură şi mai mult ca distribuţie. Consecutiv, cele 2 specii de receptori vor avea funcţii diferite. TCR αβ se găsesc la nivelul sȃngelui periferic şi a timocitelor, iar TCR γδ la nivelul pielii, mucoaselor, aparatului digestiv şi reproducător. De aceea s-a ridicat ipoteza conform căreia LT în care predomină TCR γδ 184

să nu aibă neaparat nevoie de prezentare MHC-Ag pentru activare (Unele LT γδ recunosc fosfoliganzi derivaţi din M. tuberculosis care le determină activarea). Superantigenele activează direct LT, fără a mai fi nevoie de prezentarea lor de către un APC pe un MHC. Stafilococcii şi streptococcii posedă 21 de superantigene, probabil cu rol adaptativ. S-ar putea ca motivul să fie o cât mai rapidă depleţie de LT a gazdei și inhibarea producerii de anticorpi. Certa e însă toxicitatea determinată de eliberarea masivă de citokine. TSST-1 (toxic shock syndrom toxin-1) aparţinȃnd stafilococcilor este un exemplu de superantigen. Și proteina M a Streptococcus pyogenes formeză un complex cu fibrinogenul, complex care se leagă de integrinele de pe neutrofile, determinȃnd eliberarea în cantităţi mari a mediatorilor inflamatori. Dacă un antigen convenţional activează 0,01-0,1% LT, superantigenele activează 530% din populaţia LT. 16.4.6. TSS ... HSP ... utilitatea antigenelor ... Datele din USA referitoare la TSS (toxic shock syndrome) publicate într-un articol în 2010 relevă o incidenţa a infecţiilor GAS (group A streptococci) de 1,5-5,2o/oooo/an, din care 8-14% au dezvoltat TSS, cu o mortalitate de 30-70%. O epidemie de varicelă creşte riscul de TSS la 62,74o/oooo. La 50% din pacienţii cu TSS au avut afectări severe de ţesuturi moi, precum fasciita necrozantă, miozită, celulită. (1) HSP (Heat shock proteins) sunt proteine comune atȃt organismelor umane, cȃt si bacteriilor şi au fost denumite astfel datorită faptului că s-a remarcat creşterea expresiei acestora în condiţii de temperaturi ridicate sau față de alţi factori de stres (ex. un proces infecţios). HSP au rol în asamblarea, formarea structurii cuaternare a proteinelor şi în transportul altor molecule. Ȋn timpul unei invazii bacteriene, sistemul imun se îndreaptă şi împotriva HSP, atȃt a celor autohtone, cȃt şi a celor bacteriene. HSP activează sistemul imun prin intermediul CD91, CD40, CD14 şi anumiţi TLR. Datorită asemănării structurale între cele 2 tipuri de HSP se presupune că aceste proteine ar avea un rol important în generarea bolilor autoimune. Tot timpul ne aflăm sub influenţa antigenelor bacteriene. Unele asigură sau înlesnesc procese fiziologice, aşa cum se întȃmplă la nivelul intestinului gros, altele, prin competiţie ne protejează de germeni virulenţi, aşa cum se întȃmplă de ex. la nivelul foselor nazale. Dar există şi ”teoria igieniei”, neconfirmată şi nu neapărat adevarată sau aplicabilă tuturor microorganismelor, conform căreia şi infecţia uşoară şi tranzitorie (nu boala) cu bacterii patogene este de folos. ”Alergiile” (stările de hipersensibilitate), bolile inflamatorii ale intestinului subțire şi bolile autoimune ar fi generate de un dezechilibru imun generat de igienă, vaccinuri și antibiotice. Ideea este nu de a elimina aceste 3 modalități clasice de apărare împotriva infecțiilor, ci de a afla cum, cȃnd și cȃt trebuie folosită fiecare ”armă” şi de a cunoaște cȃt mai bine adversarul împotriva căruia o folosim. 16.4.7. Şoc toxico septic sau alergie? Streptococ sau Stafilococ? Pacienta în vȃrstă de 25 ani, se prezintă la camera de gardă după 2 zile de rash cutanat şi o durere surdă difuză în cadranul stȃng inferior al toracelui. Ȋn urmă cu o săptămȃnă a fost diagnosticată cu faringita streptococică şi a primit amoxicilină. S-a prezentat după 3 zile la serviciul de dermatologie datorită rash-ului, unde i s-a pus diagnosticul de alergie la amoxicilină. Prin urmare, a fost întrerupt tratamentul cu amoxicilină şi s-a recomandat prednison. Este corectă atitudinea dermatologului? Argumentaţi. La efectuarea anamnezei pacienta acuză greață, vărsături, febră, fatigabilitate, dezorientare și durerea surdă menţionată mai sus. Neagă să fi avut sȃngerări (melenă, hemoptizie, hemoroizi). Examen și analize: TA=65/35 mmHg, AV=110-120bpm, FR=20/min, T:39,7°C, SO2=93%. 185

La examenul fizic: pacienta este palidă, cu starea generală alterată. Orofaringele clar, fără exsudate sau eritem, crepitaţii difuze la auscultaţia pulmonară, fără sufluri supraadăugate sau zgomote patologice cardiace, abdomen suplu, mobil cu respiraţia. În tabel sunt listate determinările biochimice şi hematologice anormale (comparativ, valorile normale). (Tabelul nr. 1) Se efectueaza o radiografie (Rx) cardio-pulmonară, care este în concordanţă cu explorările paraclinice şi cu examenul clinic, punȃndu-se diagnosticul de etapă, ARDS (adult respiratory distress syndrome). (Figura nr. 3) La întoarcerea de la radiologie, pacienta devine iar hipotensivă, tahicardică, tahipneică; febra se menţine în ciuda adminitrării de acetaminofen. Se decide intubarea pacientei datorită insuficienţei respiratorii ce se agravează, se recoltează probe de sȃnge, urină, exsudat faringian şi se face o puncție lombară. Se solicită titrul ASLO și TSST-1. Se iniţiază tratament cu clindamicină, vancomicină și meropenem iar pacienta este transferată în serviciul de ATI. Comentarii explicative Ȋn 1993 s-a ajuns la un consens privind TSS produs de streptococi, care presupune stabilirea diagnosticului pozitiv dacă sunt îndeplinite concomitent următoarele condiţii: 1) Izolarea streptococcilor de grup A (GAS) dintr-o zonă în mod normal sterilă (sȃnge, fluid cerebrospinal, pleural, peritoneal) 2) Hipotensiune 3) 2 sau mai multe dintre următoarele: · Insuficienţă renală (creatinina>2mg/dL sau valori de 2 ori mai mari decȃt în mod normal la pacienţii cu boală renală) · Coagulopatie · Enzime hepatice crescute · ARDS (adult respiratory distress syndrome) · Rash maculo-eritematos · Necroză de ţesut moale. Introducerea vaccinurilor antivaricelă a scăzut incidenţa TSS de la 27% în 1993-1995 la 2% 1995-2001. Utilizarea de medicamenteantiinflamatorii nesteroidiene (AINS) se pare că favorizează TSS. Un articol din 1995 a Chuang șsi colab. arată că 92% din pacienţii cu TSS folosiseră anterior AINS. Mai mult, AINS pot masca simptomatologia şocului toxico-septic. Diferenţierea între TSS stafilococic şi steptococic este greu de făcut. Pacienţii cu infecție stafilococică pot prezenta diaree, vomă, eritrodermie generalizată, insuficienţa conjunctivală, mialgie severă. Pacienţii cu infecție streptococă pot prezenta necroză de ţesut moale (celulită, fasciită, abces, miozită), simptomatologie influenza-like, varicelă în antecedente în cazul celor nevaccinaţi. Ȋn cazul TSS stafilococic, se pare că toxina TSST-1 este responsabilă de 75% din cazuri. Pentru TSS steptococic, proteina M este responsabilă de 75% cazuri iar SPEs A, B, C sunt responsabile de circa 13% (SPEs = Streptococcus pyogenes exotoxins). Specificitatea determinării Ac anti TSST-1 este de 90%, în timp ce pentru determinarea titrului proteinei M nu există teste fiabile. Se poate folosi în schimb titrarea ASLO în dinamică. Ȋn ciuda ambiguităţii privind etiologia, tratamentul rămȃne acelaşi: · cristaloizi şi agenţi inotrop pozitiv contra şocului hipovolemic, cu monitorizarea TA şi a PVC 186

· antibiotice: penicilină, vancomicină şi clindamicină (penicilină sau alte beta-lactamine pentru streptococ; vancomicină sau peniciline sintetice pentru stafilococ; clindamicina s-a introdus pentru că are un efect mai îndelungat după administrare, facilitează fagocitoza bacteriei, inhibă liza celulelor bacteriene cu eliberarea consecutivă suplimentară de citokine în circulaţie). · terapii adjuvante (încă în stadiu de cercetare): =imunoglobuline administrate intravenos, O2 hiperbar, Ac antiTNF. Evoluţia pacientei: Statusul respirator s-a îmbunătăţit, cu detubare la 48 de ore. Titrul Ac anti TSST-1 s-a pozitivat după 2 săptămȃni, ASLO a rămas normal. S-a trecut pe antibiotice orale, funcţia renală şi WBC au revenit uşor la normal, s-au efectuat radiografii toracice zilnice, care au confirmat şi rezolvarea ARDS. Pacienta a fost externată după 14 zile de spitalizare. Diagnosticul final: Şoc toxico-septic stafilococic, probabil post-pneumonic.

16. 5. Verificați-vă cunoștințele La întrebările următoare, alegeţi răspunsul corect. 1. Care dintre următoarele microorganisme au toxicitate dar nu şi invazivitate? a) Klebsiella pneumoniae şi Vibrio cholerae b) Corynebacterium diphteriae şi Vibrio cholerae c) Escherichia coli şi Salmonella typhi d) Corynebacterium diphteriae şi Mycobacterium tuberculosis 2. Care este răspunsul corect? a) Administrarea îndelungată de antibiotice nu afectează flora intestinală. b) Administrarea de antibiotice fără realizarea şi respectarea antibiogramei, fără a ţine cont de CMI şi CMB nu determină fenomenul de rezistenţă la antibiotice. c) Cȃnd flora normală este distrusă pot apărea infecţii cu Candida spp. sau Clostridium difficile. d) Este mai corect să administrăm probiotice (de exemplu lactobacilii) şi o doză foarte mare de antibiotic în cazul unei infecţii localizate, decȃt să drenăm chirurgical respectivul abces sau flegmon. 3. Ce este un granulom? a) o marcă a RIC împotriva bacteriilor intracelulare b) un tip de modificare anatomo-patologică acută c) o marcă a RIU împotriva bacteriilor extracelulare d) o marca a RIC împotriva bacteriilor extracelulare. 4. Găsiţi afirmaţia greşită a)Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declanşa activarea limfocitelor b) Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat activ, imediat. c) Idiotipul se referă la un caracter propriu părţilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau anticorpilor apăruţi după imunizarea faţă de un antigen dat

187

d) Autoantigenele sunt substanţe diferite de antigenele proprii animalului imunizat, provenite de la o altă specie. 5.Iată 3 afirmaţii: (1) „cu cât structura chimică antigenică provine de la o specie mai îndepărtată filogenetic, cu atât RI va fi mai slab”; (2) „structura chimică trebuie să fie cât mai simplă” și (3) „greutatea moleculară trebuie să fie cât mai mare (de regulă peste 4-5.000 Da)”. Alegeţi varianta corectă dintre urmatoarele: a) (1) și (3) sunt false b) (1) și (2) sunt adevărate c) doar (3) este adevărată d) doar (2) este falsă

17. Răspunsul imun umoral şi celular 17. 1. Definiţia şi caracteristicile răspunsului imun Răspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc după introducerea unui Ag, și anume: · activarea limfocitelor, · eliberarea a diverse molecule, · multiplicarea celulelor specifice, · producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili să se fixeze pe Ag şi să participe la · eliminarea acestuia (direct sau indirect). După acest prim contact (ca şi în cursul imunizării consecutive), sistemul imun produce limfocitele T şi B de memorie, capabile să reacţioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei reintroduceri ulterioare a aceluiaşi antigen. Aşa cum a fost menţionat anterior, principala caracteristică a imunităţii este specificitatea. Pentru a sugera cât de specific este răspunsul imun, o modalitate este de a discuta despre „potrivirea dintre cheie şi broască”, între structurile Ag şi Ac. Acest exemplu are un grad de sugestivitate, dar este incomplet în comparaţie cu realitatea. O altă modalitate de a sugera specificitatea răspunsului imun ar fi „potrivirea dintre mâna aşezată în faţa oglinzii şi imaginea din oglindă”. Probabil, o modalitate şi mai sugestivă ar fi cea discutată la cursurile de imunologie din INCDMI ”Cantacuzino”: răspunsul imun este atât de specific, încât dacă ne-am închipui că Ag este reprezentat de o pagină dintr-un manual, dacă am schimba nu o frază, un rând, un cuvânt ci chiar o singură literă într-un cuvânt de pe o anumită pagină, această schimbare ar fi sesizată de sistemul imun iar Ac produşi se vor „potrivi” cu această pagină în care a fost schimbată o singură literă. Totuşi, aşa cum am menţionat la punctul 16. 2. 1., există şi reacţii încrucişate.

188

O altă caracteristică foarte importantă a RI, în condiţii fiziologice, este capacitatea de a discerne între self şi non-self şi de a reacţiona numai faţă de moleculele care îndeplinesc definiţia de antigen (vezi şi MHC/CMH). Răspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat de către celule. În cazul antigenelor timodependente (cea mai mare parte a antigenelor), se dezvoltă un răspuns imun celular specific prin LT citotoxice şi unul umoral specific prin anticorpi. Diferite citokine pot activa sau inhiba, în mod preferenţial, unul sau ambele tipuri de răspuns. În cazul antigenelor timoindependente, răspunsul imun este umoral. În continuare vor fi prezentate în mod schematic aceste două tipuri de răspuns imun umoral şi celular.

17. 2. Răspunsul imun de tip umoral Răspunsul imun umoral (RIU) constă în producerea de Ac specifici şi este transferabil pentru o perioadă de timp (3-6 săptămâni), prin ser, la un alt animal. Imunitatea umorală intervine în distrugerea bacteriilor extracelulare, neutralizarea virusurilor, inhibarea toxinelor. Natura antigenelor faţă de care se dezvoltă un răspuns imun umoral include poliozide, proteine, substanţe sintetice, rareori lipide şi acizi nucleici sau anticorpi (în cazul proceselor autoimune). Unele antigene („alergenii”) determină un RI cu anticorpi de tip IgE. Introducerea antigenului pe cale subcutană, intramuscular sau intravenos determină un RIU cu producerea de IgM și/sau IgG iar administrarea pe cale orală determină un răspuns preferenţial cu IgA. După o primă administrare intravenoasă, la un subiect care nu a mai venit în contact cu respectivul antigen, Ag molecular parcurge următoarele etape succesive: 1. descreşterea cantitativă rapidă, datorată difuziei în spaţiile extravasculare; 2. dispariţia lentă, datorată catabolismului propriu al antigenului; 3. descreşterea rapidă după 8-10 zile, ca urmare a eliminării formaţiunilor imune (complexele imune) rapid fagocitate. În cazul antigenelor particulate (celule, bacterii, virusuri) sau al antigenelor sub formă de agregate, eliminarea este mult mai rapidă, prin procesul de fagocitoză (care antrenează o imunizare mai precoce). În cazul utilizării căii subcutanate, antigenul rămâne, în parte, la locul de inoculare. Adăugarea unui adjuvant menţine antigenul în acest loc şi favorizează o stimulare imunologică de durată (eventual şi formarea unui granulom inflamator). În următoarele ore, antigenul migrează în sinusurile subcapsulare ale ganglionilor corespunzători anatomic, apoi în zona medulară şi în final (24 de ore) ajunge în regiunea corticală, la periferia foliculilor primari. În interiorul organelor limfoide, antigenul se regăseşte în celulele fagocitare. În prezenţa anticorpilor preformaţi şi a sistemului C', unele antigene se localizează la suprafaţa celulelor dendritice intrafoliculare din centrii germinativi. Contactul cu antigenul antrenează importante modificări histologice ale organelor limfoide: centri germinativi se dezvoltă în foliculi şi persistă mai multe săptămâni; în paralel apar atât imunoblaştii şi plasmocitele, cât şi limfocitele de memorie; după 3-4 zile se pot detecta limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizează anticorpi serici.

17. 2. 1. Răspunsul imun primar (RIP)

Înaintea primului contact cu un anumit antigen, nu există anticorpi „potriviţi” față de acesta. Stimulul antigenic primar „selectează” LB care au receptori pentru respectivul Ag. După primul contact cu Ag se dezvoltă RIP, cu următoarele caracteristici: 189

· Latenţa: reprezintă perioada de la contactul cu Ag până la prezentarea structurilor Ag către LB (în conjuncţie cu moleculele MHC); variază în funcţie de natura antigenului, calea de administrare şi doza administrată; durează între 2 şi 3 zile; · Creşterea logaritmică: (sinteză activă de Ac, de către plasmocite) durează circa 3 zile; în timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacţii Ag-Ac; urmează o fază de stagnare (câteva zile), timp în care titrul anticorpilor serici se menţine relativ constant; · Ulterior are loc scăderea progresivă a titrului anticorpilor serici. De regulă, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac după 5-14 zile de la stimulul antigenic primar. Natura anticorpilor: · examinarea claselor de anticorpi produşi arată că primii anticorpi care apar sunt de tip IgM (cei din clasa IgG apar câteva zile mai târziu iar nivelul lor creşte pe măsură ce nivelul IgM scade); · în următoarele 2-3 săptămâni, în ser predomină anticorpii de tip IgG; · în următoarele luni, eventualii anticorpi care persistă sunt de tip IgG.

17. 2. 2. Răspunsul imun secundar (RIS) Răspunsul imun secundar apare după al doilea contact cu acelaşi antigen (sau după contacte ulterioare). RIS are următoarele caracteristici: · poate apărea chiar şi după administrarea unor doze destul de mici de antigen; · latenţa este redusă la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de creştere logaritmică; · anticorpii sunt de tip IgG; · titrul Ac produşi este mult mai înalt; · persistenţa acestora este mai lungă (Ac produşi se menţin timp mai îndelungat, luni de zile). Diferenţa dintre RIP şi RIS este datorată în primul rând existenţei limfocitelor cu memorie. După eliminarea Ag, în organism continuă să „circule” celule cu memorie, reacţia imună la al doilea contact cu acelaşi Ag având caracteristicile de mai sus. Memoria imună se stabileşte din timpul RIP şi este specifică. Determinarea claselor IgM şi IgG are o dublă importanţă practică: · face posibilă distincţia între o afecţiune recentă şi una mai veche şi · permite recunoaşterea unei infecţii congenitale (cu anumite excepţii). Cunoașterea caracteristicile RIP şi RIS are importanță practică. Ne permite să înţelegem şi motivul pentru care reacţiile Ag-Ac trebuie făcute, de regulă, „în dinamică”.

17. 2. 3. Succesiunea de evenimente în producerea anticorpilor După pătrunderea antigenului şi recunoaşterea acestuia ca non-self urmează fagocitarea şi prelucrarea de către celulele prezentatoare de antigen care sunt reprezentate în principal de celulele dendritice foliculare, macrofage și limfocitele B. APC, prin IgM şi IgD membranar, posedă tot ce este necesar pentru recunoaşterea epitopilor antigenici (diversitatea rearanjării genice demonstrează un repertoriu bogat de limfocite B, estimat la 107 posibilităţi; mutaţia somatică conduce la posibilităţi mult mai mari de diversificare). Pentru majoritatea antigenelor (în special cele de natură proteică), activarea şi etapele următoare ale RIU necesită prezenţa limfocitelor Th CD4+ (cu intervenţia TCR, APC cu expunerea pe MHC II de peptide antigenice, molecula CD4 şi moleculele de aderenţă).

190

După contactul cu antigenul și activarea completă, LTh se vor numi LThp (primitive), care ulterior vor începe proliferarea și sinteza de IL2. Prin stimulări autocrine repetate LThp se vor diferenția în LTh0 și apoi în LTh1 sau LTh2 în funcție de mediul citokinic din jur și de citokinele produse (vezi și 11.3.1.). Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU (Figura nr. 1). LTh2 secretă IL-2, IL-4, IL-5 şi IL-6, care activează LB și stimuleaza mecanismul de „switch” izotipic în genomul LB. Acest „switch” se realizează prin rearanjarea ADN-ului, pentru sinteza Ac diferiți structural, dar cu aceeași specificitate pentru antigen. Limfocitele B pot fi activate şi direct, în cazul antigenelor timoindependente de origine polizaharidică, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizează prin formarea unor punţi între receptorii de suprafaţă şi determină redistribuţia Ig pe suprafaţa membranei celulare. În lipsa interleukinelor produse de LT, activarea LB este limitată la sinteza de IgM, fără „comutarea” spre IgG. Prima etapă constă în activarea limfocitelor B din stadiul G0 al ciclului celular spre stadiul G1 (celula sintetizează ARN şi creşte în volum); stimulul este reprezentat de contactul cu antigenul. IL-4, secretată de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G0 şi G1 şi creşte expresia moleculelor MHC. În acest stadiu LB activat exprimă molecule noi: CD23, CD34 şi CD40. Al doilea timp corespunde proliferării policlonale a celulelor B activate, care trec din stadiul G1 în fazele S şi M. Această fază necesită prezenţa IL-2 şi IL-5. Ultima fază constă în diferenţierea în celule producătoare de anticorpi - plasmocite; secreţia de IL-6 ajută procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea izotipică spre sinteza unei clase particulare de imunoglobuline. Așadar, există o intensă colaborare între LB, LTh și APC atât prin contact direct cu ajutorul unor molecule de adeziune, cât mai ales prin intermediul citokinelor, adevărați mesageri (”hormoni”) ai imunității.

17. 2. 4. Teoria selecţiei clonale

Teoria selecţiei clonale a fost propusă în jurul anului 1950 de către McFarlane Burnet. Această teorie afirmă că la nivelul sistemului imun există un număr imens de „capi” de clone de limfocite, fiecare dintre aceşti „capi de serie” corespunzând unei structuri antigenice (unui anume epitop); în cadrul aceleaşi teorii, Burnet a făcut estimarea că în lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferiţi. Clona, aşa cum se cunoaşte, este o populaţie de celule identice din punct de vedere genetic, descendente ale unei singure celule „mamă”. Toate celulele unei anumite clone au la suprafaţă, molecule identice cu structură imunoglobulinică; aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice (pentru fiecare antigen diferit există un receptor diferit). Structurile antigenice „selectează” din acest număr imens de limfocite „cap de serie” pe acelea care au receptori complementari (configuraţie spaţială etc) şi astfel determină proliferarea şi diferenţierea lor în celule producătoare de anticorpi. Celulele unei clone au aceeaşi specificitate pentru structura antigenică datorită căreia au proliferat. Clonele de limfocite care ar putea să producă anticorpi faţă de structurile proprii („self”) sunt reprimate în timpul vieţii intra-uterine şi numai celelalte clone pot ajunge la maturitate. În lipsa acestei represii apar boli autoimune grave, potenţial fatale.

17. 3. Răspunsul imun de tip celular 191

Imunitatea celulară presupune în special dezvoltarea unui răspuns imun faţă de celulele infectate cu virusuri, celulele infectate cu microorganisme cu multiplicare intracelulară (mycobacterii, Listeria spp., Brucella spp. etc), paraziţi intracelulari, allogrefe, celule tumorale. Un microorganism cu dezvoltare intracelulară penetrează în diverse celule şi în particular în macrofage (aflate în stare de repaus şi neactivate) şi se poate divide fără ca acest proces să inducă o reacţie imună celulară naturală şi specifică. Macrofagul care a fost infectat cu un microorganism secretă o serie de citokine (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-a şi TNF-β) care la rândul lor vor acţiona după cum urmează (Figura nr. 2): · TNF-a va activa macrofagul infectat; · TNF-a, TNF-β vor activa macrofagele neinfectate încă; · TNF-a, IL-10, IL-12 vor activa celulele NK. Această primă fază va pune în mişcare celulele imunităţii celulare specifice şi astfel limfocitele Th0 vor fi activate şi se vor diferenţia în Th1, datorită IL-12, secretată de macrofage şi a IFN-g, secretat de celulele NK activate. Antigenele proteice sunt transformate de către APC în peptide de 12-20 aminoacizi. Acest tip de antigene induce o dublă imunizare celulară şi umorală. Nu a fost încă demonstrat, complet, RIC faţă de antigenele neproteice.

17. 3. 1. Etapele răspunsului imun celular

Imunitatea celulară intervine în mai multe etape succesive. Răspunsul celular presupune ca antigenul prezentat limfocitelor să fie degradat în peptide şi asociat cu molecule MHC II. Dintre APC menţionăm celulele dendritice (cele mai bune prezentatoare de antigen), celulele Langherhans, macrofagele şi limfocitele B (eficiente numai după stimulare). Recunoaşterea peptidelor antigenice de către LT helper şi activarea lor necesită contactul direct între APC şi limfocitele Th, interacţiunea fiind trimoleculară: TCR, peptide antigenice şi MHC clasa II. moleculele CD4 şi moleculele de adeziune consolidează această interacţiune. Toate aceste contacte duc la activarea şi multiplicarea limfocitelor T CD4+. Drept rezultat, LT CD4+ activate sintetizează IL-2 şi lanţul a cu rol de receptor pentru IL-2 (IL-2R), ceea ce permite o acţiune autocrină şi exocrină; multiplicarea limfocitelor T antigen-specifice duce la formarea de clone celulare specifice antigenului. Generarea limfocitelor T citotoxice LT CD8+ sunt selecţionate după specificitatea lor faţă de antigen şi activate de diferitele citokine (IL-2, IFN-g) secretate de limfocitele Th1 activate în prealabil. Recrutarea altor celule pentru cooperare Prin citokinele secretate, imunitatea celulară permite recrutarea şi activarea unor celule care nu sunt specifice antigenului: ¨ IL-2 - produsă numai de LT (în principal CD4+ şi numai într-o mică măsură de către CD8+), are o acţiune autocrină asupra LT dar şi asupra monocitelor, macrofagelor, LT CD8+ şi a celulelor NK; ¨ IFN-g - produs în principal de LT (CD8+ şi mai puţin din CD4+) dar şi de celulele NK, activează macrofagul, creşte sinteza de molecule MHC II, recrutează celule NK şi le activează funcţia citotoxică sub efectul TNF-a şi împiedică infectarea celulelor cu virusuri (acţiune antivirală).

17. 4. Povestire adevărată 17.4.1. Tratamentul în imunosupresie 192

În stabilirea şi aplicarea tratamentului unui anumit pacient, nu trebuie niciodată uitat rolul răspunsului imun (nici în plus şi nici în minus). De exemplu, pacientului imunodeprimat trebuie să-i administrezi antibiotice bactericide și nu bacteriostatice. Pacientul imunodeprimat, fiind sub tratament etiologic eficient, dar la care din diverse motive se restaurează imunitatea, poate face reacţii cu impact fatal asupra evoluţiei. O infecţie cronică cu VHB la un pacient cu tratament imunosupresor în diverse situaţii, nu ridică probleme deosebite hepatice. Reducerea imunosupresiei, creşterea răspunsului imun, „găseşte” pacientul într-o situaţie în care viremia este „înaltă”. Reacţia imună, recent restaurată, poate induce leziuni hepatice severe, hepatită fibrozantă colestatică cu mortalitate uneori până la 90%. Un alt exemplu ar fi pacientul cu infecţie HIV, aflat la debutul unui tratament antiretroviral. Acesta, datorită aceluiaşi proces de restaurare imună, poate să dezvolte afecţiuni nemanifeste până atunci, numite sindrom de reconstrucţie imună, cu mortalitate foarte mare. Aşadar, este necesară o atenţie deosebită atât în ceea ce priveşte imunodepresia cât şi în cazul revenirii imunităţii. 17.4.2. Stresul și răspunsul imun Stresul este cunoscut ca având efect inhibitor al răspunsului imun, crescând astfel susceptibilitatea la infecții și cancer. Paradoxal, stresul este învinuit pentru exacerbarea astmului și a bolilor inflamatorii și autoimune, deși astfel de boli ar trebui să fie ameliorate de un anumit grad de imunosupresie. Mai mult, răspunsul de tip „fightor-flight” este unul dintre mecanismele naturale de apărare care prin activarea aparatelor cardiovascular si musculoscheletal promovează supraviețuirea, și de aceea este puțin probabil ca acest răspuns la stres să suprime funcția imună, în momentul în care este esențială pentru supraviețuire. Fără acest răspuns un tigru nu poate prinde o căprioară, în timp ce căprioara nu ar avea nici o șansă de supraviețuire. Aceste observații sugerează că stresul poate suprima funcția imună în anumite condiții și o poate întări în altele. Așadar, efectele stresului pot fi atât benefice cât și dăunătoare. Studiile au demonstrat că o serie de factori influențează direcția efectelor stresului: 1. durata stresului (acut vs. cronic): stresul acut exprimat în timpul activării imune stimulează atât imunitatatea înnăscută cât și pe cea adaptativa; stresul cronic suprimă răspunsul imun scăzând numărul celulelor și/sau potențând mecanismele imunosupresoare (limocitele T reglatorii). Stresul cronic poate perturba RI și prin promovarea răspunsului proinflamator. 2. distribuția leucocitelor: compartimentele cu un număr crescut de leucocite în timpul stresului acut determină imunostimulare; 3. concentrația fiziologică vs. farmacologică a glucocorticoizilor și structura endogenă vs. sintetică a acestora: hormonii endogeni în concentrație fiziologică au efect imunostimulant, în timp ce hormonii endogeni în concentrații farmacologice și hormonii sintetici au efect imunosupresor. 4. corelația timp de acțiune al agentului stresor – timp de activare a răspunsului imun: imunostimularea se observă când agentul stresor acționează în stadii incipiente ale activării imune, iar imunosupresia este asociată cu stadiile tardive ale RI. Se consideră că stresul pe termen scurt induce o redistribuție a celulelor imune în organism, funcția imună fiind semnificativ stimulată în organe pe unde leucocitele trec în timpul stresului acut. Un exemplu interesant este cel al unor parașutiști cărora li s-au măsurat nivelul plasmatic al cortizolului și al celulelor LT și NK cu 2 ore înainte, și la 1 oră după săritură. Rezultatele arată o creștere semnificativă în numărul celulelor imune înainte de săritură, urmată de o scădere dramatică la 1 oră după, modificări concomitente cu creșterea catecolaminelor, respectiv creșterea cortizolului plasmatic. (2) 193

Așadar, imediat după debutul unui stres (minute) sau în timpul unui stres de intensitate ușoară, sau efort fizic catecolaminele determină ieșirea „soldaților” (leucocite) din tranșee (splină, plămâni) și intrarea pe” bulevarde” (vase sangvine și limfatice). Ulterior, cortizolul induce trecerea leucocitelor din sânge la „locurile de luptă” (piele, plămâni, tract gastrointestinal, mucoase, ganglioni limfatici). Stresul cronic, numit și distres are drept mecanism fiziopatologic persistența RI după încetarea acțiunii agentului stresor sau activarea repetată. Răspunsul la stresul acut are rol critic în adaptarea organismului, hormonii de stres pregătind sistemul imun pentru eventuale provocări (ex. rănire, infecție). 17.4.3. Interacțiunea somn – răspuns imun Deși deprivarea de somn este considerată un factor de risc pentru sănătate, asocierea consecințelor a fost dificilă, întrucât semnele clinice măsurabile, specifice acesteia, lipsesc. S-a constatat însă că peste 64 de ore fără somn la persoane sănătoase au consecințe cognitive marcate, dar numai câteva semne fiziologice și neurologice minore. Similar, 9 zile de deprivare de somn au ca rezultat colapsul iarspitalizarea devine obligatorie. Se știe că există o relație între somn și sistemul imun, însă natura acesteia nu este foarte clară. Unele studii au sugerat că deprivarea de somn determină un dezechilibru cronic energetic, deteriorarea graduală a sănătății, cu scăderea activității răspunsului imun, accelerarea catabolismului, malnutriție putând conduce la deces, în cele din urmă. Cauza morții șobolanilor deprivați de somn (3 săptămâni) a fost sepsisul cu bacterii facultativ anaerobe, prin multiplicare excesivă (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae și Corynebacterium jejikum). Translocarea bacteriilor și a toxinelor extraintestinal, sangvin, reprezintă trigger-ul unei stări hipermetabolice și inflamatorie sistemice având ca rezultat sepsisul fără a se putea pune în evidență un focar septic. Semnele care certifică prezența unui status de imunosupresie includ absența abceselor în ciuda colonizării cu S. aureus, absența febrei și bacteriemia primară indusă de microorganisme oportuniste, similar cu patogenia sepsisului la pacienții imunocompromiși.

17. 5. Tipuri de imunitate Imunitatea poate fi moştenită (trăsătură de specie, se transmite ereditar) şi dobândită. Imunitatea poate fi dobândită activ, după contactul cu un anumit antigen (ex. bacterian). Evenimentul imunologic poate apărea după o infecţie (natural) sau după administrarea unor vaccinuri (artificial). Avantajul imunităţii dobândite activ este faptul că, de regulă, protecţia este de durată. Dezavantajul principal este reprezentat de faptul că instalarea răspunsului imun are loc lent, mai ales în cazul RIP. Imunitatea poate fi dobândită şi pasiv, preluând anticorpi produşi de către o altă gazdă. Spre exemplu, administrarea de anticorpi anti toxină difterică / tetanică / botulinică (artificial) pune la dispoziţia gazdei infectate, imediat, o cantitate importantă de antitoxină, în vederea neutralizării cât mai rapid a toxinei implicate patogenic. În mod natural, fătul şi nou născutul beneficiază de protecţie prin intermediul anticorpilor (IgG transplacentar, IgA prin colostru, lapte) proveniţi de la mamă. Avantajul imunităţii dobândite pasiv este rapiditatea, în timp ce dezavantajul este reprezentat, pe de o parte, de timpul scurt pentru care este oferită protecţia iar pe de altă parte, de riscurile unei hipersensibilizări, atunci când sunt utilizaţi anticorpi provenind de la o altă specie (ex. în cazul administrării de ser recoltat de la cal hiperimunizat).

194

Există şi posibilitatea dobândirii unei imunităţi activ - pasiv, atunci când se administrează concomitent (dar în locuri diferite) ser imun şi un vaccin (ex. în suspiciunea infecţiei cu Clostridium tetani). Mult timp s-a considerat că cele 2 tipuri de imunitate acționează independent, imunitatea înnăscută oferind prima linie de apărare împotriva microbilor invadatori, iar imunitatea dobândită intervenind mai târziu, pentru a elimina infecția. Însă,interacțiunea dintre cele 2 tipuri de imunitate este evidentă: imunitatea adaptativă profită de abilitatea imunității înnăscute de a distinge între agenții patogeni, microbii benefici și factorii de mediu. Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, în strânsă colaborare (un adevărat exemplu pentru studenți, medici sau orice membru al sistemului sanitar). Existența celulelor NK întărește aceste considerente. Conform unor descoperiri recente, celulele NK au o proprietate esențială, atribuită numai celulelor imunității – memoria; în plus, au fost identificate celule NK în locuri atribuite în mod clasic imunității adaptative: timus și ganglionii limfatici. (4)

17. 6. Definiţia vaccinurilor Pornind de la observaţiile şi experimentele lui Edward Jenner, Louis Pasteur a fundamentat ştiinţific vaccinurile alcătuite din corpi microbieni. Gaston Ramon a pus la punct metodele de neutralizare a toxinelor şi a identificat utilizarea lor ca „anatoxine”. Vaccinul este 1. o suspensie de microorganisme (bacterii, virusuri) vii atenuate sau inactivate sau 2. cuprinde fracţiuni din microorganisme (subunităţi), în vederea stimulării mecanismelor de răspuns imun, de regulă pentru prevenirea apariţiei unor infecţii. Vaccinarea este definită drept o metodă profilactică, care urmăreşte creşterea rezistenţei specifice a unei gazde, printr-o imunizare activă, cu stimularea răspunsului umoral sau celular, după caz. De fapt, vaccinările incluse în programele naţionale de vaccinare (conform recomandărilor Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, OMS) reprezintă metodele profilactice cu cel mai bun raport între cost şi eficienţă, în comparație cu orice altă metodă cunoscută. Strategiile de vaccinare au în vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al gazdei respective (imunocompetentă sau imunodeprimată). Unele vaccinuri se pot administra şi în timpul unei izbucniri epidemice („outbreak”) sau a unei epidemii, pentru prevenirea apariţiei de cazuri noi şi scurtarea duratei epidemiei. Există şi posibilitatea administrării unor vaccinuri în scop curativ, gazda fiind deja infectată în momentul inoculării (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatită cronică, cu HBV).

17. 7. Clasificarea vaccinurilor În funcţie de infecţia care se doreşte a fi prevenită, vaccinurile pot fi bacteriene sau virale. În funcţie de modul de preparare există: · Vaccinuri corpusculare (bacteriene, virale), incluzând, după caz, corpi vii atenuaţi sau distruşi (inactivaţi) prin acţiunea unor factori fizici (ex. căldură) sau chimici (ex. mertiolat de sodiu). Vaccinul BCG conţine bacterii vii atenuate, stimulează RIC şi se administrează pentru a preveni tuberculoza. Vaccinurile poliomielitic (Salk) sau hepatitic A includ virusuri omorâte. Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos, rubeolos conţin virusuri vii, atenuate şi stimulează RIU şi răspunsul imun la poarta de intrare. 195

· Vaccinurile subunitare, preparate prin inginerie genetică, au un grad superior de siguranţă (vaccin hepatitic B, vaccin pertussis acelular). · Vaccinurile care conţin anatoxine bacteriene, purificate şi adsorbite pe suport mineral (DTP conţine anatoxină tetanică şi difterică plus corpi de Bordetella pertussis omorâţi, DT, dT, ADPA, ATPA/VTA). În funcţie de numărul componentelor antigenice există: · Vaccinuri monovalente (rujeolos/VVR, rubeolos, hepatitic A, hepatitic B, pertussis acelular, BCG etc), · Vaccinuri asociate, care conţin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-rubeolos etc). Date privind schema de vaccinare aflată în uz în ţara noastră la acest moment, precum şi câteva informaţii privind substanţele imuno-modulatoare (ex. Cantastim) sunt prezentate în anexa nr. 4.

17. 8. Povestire adevărată Ianuarie 1993 ... un articol semnalează faptul că difteria, o boală practic eliminată în Europa de Vest, capătă proporţiile unei epidemii, în Rusia. Situaţia a fost de asemenea periculoasă în Ucraina, unde mai mult de 1.300 de cazuri au fost raportate în primele zece luni ale anului 1992. Ameninţarea extinderii în alte state, foste membre URSS, a fost reală. Eforturile uriaşe de a vaccina atât copiii cât şi adulţii au făcut, până la urmă, posibil controlul epidemiei. Totuşi, în perioada 1990-1998, peste 150.000 de cazuri de difterie au fost raportate, din toate statele foste membre ale URSS, înregistrându-se şi un foarte mare număr de decese. Dar care a fost motivul şi de ce a apărut o epidemie de difterie după 1990 ? Incidenţa difteriei în Rusia era foarte mare în prima jumătate a secolului 20; peste 750.000 de cazuri au fost raportate doar în Rusia în anii ’50 (imunizarea împotriva difteriei a început în anumite zone ale Uniunii Sovietice în 1920, însă abia în 1958 a fost statuată imunizarea universală a copiilor, în toată Uniunea Sovietică). Este adevărat că în 1977, au început să fie din nou raportate cazuri de difterie, în URSS, atingând o valoare maximă în 1984 (1.609 cazuri). Din 1978, pentru prima dată, majoritatea cazurilor au apărut la adulţi. Mass-media a avut un rol extrem de negativ prin atitudinea adversă faţă de imunizare. Multe dintre bolile prevenite de vaccin aveau o incidenţă scăzută şi în acest context a apărut o „mişcare anti-imunizare” în presă, în contextul unei perioade (1985-1990) de profundă neîncredere în guvern. După 1990, părinţii nu mai erau de acord să permită imunizarea copiilor cu vaccinuri produse în Rusia fiind făcuţi să creadă că acestea le fac rău şi îi îmbolnăvesc. Chiar şi membri ai comunităţii medicale au avut „ieşiri în presă” în care au exprimat părerea că aceste vaccinuri dăunează. În plus, o parte din părinţi considerau că amânarea (nerespectarea schemelor de vaccinare, neprezentarea la medic atunci când erau invitaţi să o facă) sau evitarea vaccinării copiilor sunt o nou-descoperită libertate, în cadrul democraţiei instaurate odată cu dizolvarea URSS. Epidemia apărută în anii ’90 a îngrijorat comunitatea medicala internaţională în legătură cu vaccinul produs în Rusia. Contrar opiniilor anecdotice, studiile realizate au demonstrat că vaccinul era eficient [este totuşi posibil ca vaccinul să fi fost transportat în condiţii improprii şi astfel să fi avut, în mod real, o eficacitate mai mică (presupunere care nu a fost demonstrată)]. Este adevărat că şi schemele de vaccinare din URSS au suferit în anii '80 unele modificări, diferind de schemele recomandate de OMS (ex. conţinut mai mic de antigen, creşterea intervalului între vaccinări,

196

renunţarea la administrarea DT la intrarea în şcoală) iar preocuparea pentru sănătatea publică a scăzut, din diverse motive. Rata vaccinării la copii a scăzut în anii ’80, la mai puţin de 70% (mult sub recomandările OMS). Reacţia faţă de această epidemie s-a concentrat iniţial asupra vaccinării a cât mai multor copii dar şi a adulţilor din grupele de risc. Vaccinarea tuturor adulţilor a fost aprobată abia în 1993. S-au făcut vaccinări la locul de muncă dar şi vizite la domiciliu pentru vaccinarea şomerilor. Pentru a creşte rata imunizării la copii s-a diminuat lista contraindicaţiilor şi a început să se folosească schema completă de vaccinare. În octombrie 1994, s-a reintrodus vaccinarea copiilor la intrarea în clasa I. În 1995 - 1996, epidemia a început să fie controlată. Dar care au fost pierderile umane şi materiale, reale, probabil că nu vom cunoaşte, vreodată. În timp ce apariţia epidemiei a fost unul dintre cele mai spectaculoase exemple ale intervenţiei negative a mass-media în problemele de sănătate publică, controlul epidemiei de difterie a fost unul dintre cele mai spectaculoase succese ale intervenţiei de sănătate publică în secolul 20.

18. Reacţiile de hipersensibilitate 18. 1. Definiţie, clasificare Reacţia imună este un răspuns normal fiziologic faţă de microorganisme sau celule tumorale. Totuşi, RI poate îmbrăca şi aspecte patologice, de tipul hipersensibilităţii (HS) sau al autoimunităţii. Primele observaţii privitoare la reacţiile de hipersensibilitate au fost făcute de Charles Richet în urmă cu un secol, observaţii care vor acoperi tipul I din clasificarea Gell şi Coombs de mai tȃrziu. Pornind de la diferite tipuri de reacţii observate, Gell şi Combs (1968) au propus o clasificare folosind termenul de hipersensibilitate de tip I-IV. În 1974, Roitt adaugă hipersensibilitatea de tip V, stimulantă (pornind de la anticorpii stimulanţi ai funcţiei tiroidei, prezenţi în hipertiroidia primitivă, boala Basedow). În mod clasic, HS reprezintă o stare de reactivitate crescută a organismului, pe baza unui mecanism imunologic, indusă de expunerea (repetată) la anumite structuri antigenice (sau haptene). Cuvȃntul alergen a fost pentru prima oară utilizat de Riquet; desemnează un antigen care dă naştere unei reacţii de hipersensibilitate. HS este specifică şi include · un contact sensibilizant, · o perioadă de latenţă şi · un nou contact, contactul declanşator, cu acelaşi antigen care a fost implicat în contactul sensibilizant. HS se poate clasifica în funcţie de tipul de răspuns imun în: · HS mediată prin mecanism imun umoral (rol primordial LB şi anticorpii) -HS de tip I (anafilactică, atopică), aşa cum se înregistrează în cazul şocului anafilactic, edemului Quincke, conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic, urticariei, eczemei atopice etc; -HS de tip II (citotoxică), aşa cum se întâmplă în liza celulară prin anticorpi, complement dependentă sau în citotoxicitatea anticorp dependentă, complement independentă (mecanisme ce pot fi implicate de ex. în patogenia reumatismului articular acut, în anemii hemolitice inclusiv după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae, reacţii posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc); 197

-HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aşa cum se înregistrează în reacţia Arthus, boala serului, boala plămânului de fermier, glomerulonefrita extramembranară, lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă, glomerulonefrita şi periarterita poststreptococică etc. · HS de tip IV mediată prin mecanism imun celular (rol primordial LT şi citokinele), spre exemplu în -HS tuberculinică sau -HS în testările intradermice care utilizează lepromină, candidină, histoplasmină, tricofitină etc şi -HS în multe dintre infecţiile virale.

18. 2. Hipersensibilitatea de tip I (anafilactică) Reacţia imună anafilactică se poate instala rapid (în mai puţin de 15-30 minute) după un nou contact cu un antigen la care organismul este sensibilizat. În această reacţie intervin celulele (mastocite, bazofile) acoperite de „reagine” (în principal IgE), care eliberează mediatori chimici (histamina fiind cel mai important şi cel mai cunoscut dintre aceştia). Anafilaxia este un fenomen general, obţinut ca răspuns la antigene variate: toxine, proteine, medicamente, alloantigene de transplant. Codeina, morfina, vancomicina şi substanţele de contrast folosite în imagistică pot determina şoc anafilactoid, cu aceleaşi manifestări ca în şocul anafilactic, însă fără participarea IgE. Anticorpii anafilactici (reaginele) sunt anticorpi care se fixează prin fragmentul lor Fc pe receptorii specifici exprimaţi la suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor. Controlul producerii de IgE este realizat de LT. LTh2 stimulează producerea IgE (sunt implicate IL-4, IL-5, IL-10). LTh1 inhibă producerea IgE (fiind implicate IFNγ și IL-12). Th2 (Figura nr. 1) are o acţiune autocrină, secretă IL-4 cu acțiune atât asupra LB cât şi asupra celulei secretoare. Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează de aceeaşi populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate foarte apropiat una de cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine independentă de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea juca Il-10. Efectele diferite induse de cele 2 tipuri de imunoglobuline se datorează structurii diferite. IgE prezintă faţă de IgG4 un domeniu constant suplimentar, o zonă balama diferită şi zone de recunoaştere pentru ambele tipuri de receptori: FcεRI (afinitate înaltă) şi FcεRII (afinitate joasă). IgE au un timp de viaţă mai scurt (10mm diametru) este urmat şi de un răspuns tardiv, caracterizat prin eritem şi induratie. Răspunsul tardiv apare la 2-3 ore după injectarea intradermica a antigenului, ţine pȃnă la 24 ore şi este sugestiv pentru inflamaţie cronică la nivelul foselor nazale, plămȃnului, pielii, datorându-se:  efectelor directe ale prostaglandinelor, leucotrienelor şi citokinelor eliberate de mastocite,  infiltrării cu limfocite, eozinofile, bazofile şi neutrofile şi  produşilor de secreţie ai acestor 4 tipuri de celule.

Răspunsul tardiv se întȃlneşte în cazul administrării de tuberculină, candidină şi tricofitină.

Testele ”patch” reprezintă aplicarea cutanată a 10μg alergen şi realizarea unei biopsii din zona respectivă după 24 sau 48 ore. Există 3 moduri de aplicare a antigenului în cazul patch-test: injecţii intradermice locale, plasture sau godeu. Ultima metodă are avantajul că se pot lua probe repetate fără traumatizarea suplimentară a pielii la fiecare prelevare. (Figurile nr. 7 și 8) Un test patch pozitiv înseamnă prezenţa eczemei cu spongioliza epidermului (formarea de vezicule pline cu lichid între cheratinocite) la nivel macroscopic şi prezenţa unui infiltrat celular dermic la nivel microscopic (eozinofile, bogate în MBP-major basic protein, bazofile, limfocite). S-a reuşit clonarea de LT specifice împotriva acarienilor din pielea persoanelor cu eczemă (produsă în mod natural, nu prin aplicarea unui patch), lucru care nu este posibil şi din pielea persoanelor alergice dar care nu dezvoltă eczemă, ceea ce sugerează nu doar rolul de helper, ci chiar pe cel de celulă efectoare, al LT in hipersensibilitatea tip I. Se pare că rolul LT ca efector în HSI nu se limitează doar la nivel cutanat, dar şi la nivelul mucoasei nazale şi conjunctivei în rinita alergică şi a epiteliului bronşic în astm. 203

(Figura nr. 9) Un alt test care se poate folosi este testul de provocare prin nebulizarea antigenului, cu răspuns rapid în 20 minute constȃnd în bronhospasm şi cu un raspuns tardiv în 4-8 ore, constȃnd în eliberare de mediatori de novo şi infiltrat celular. Răspunsul tardiv pozitiv se poate pune în evidenţă prin LBA (lavaj bronho-alveolar), cȃnd se identifică nu celulele, ci produşi ai acestora (histamina, prostaglandine, leucotriene, MBP, ECP) sau prin biposie, cȃnd se pot identifica toate modificările patologice care pot să apară în astm (celule inflamatorii, depunere de colagen, subţierea peretelui bronşiolelor), reunite sub denumirea de remodelare bronşică. Pentru demonstrarea hiperreactivităţii bronşice nespecifice se fac teste de provocare cu histamină, metacolină sau aer rece. Teoriile spun că evaporarea crescută de apă, care va răci epitelilul, ori stimulează direct terminaţiile nervoase, ori stimulează eliberarea de mediatori din celulele locale (histamină din mastocite). Pe frotiul de sânge periferic se remarcă eozinofilie, iar în secreţiile nazale ale unui astmatic, titrurile de ECP şi CXCL8 (IL-8) vor fi crecute. pH-ul vaporilor de apă în criză va fi acid. Examenul CT al sinusurilor nazale poate arăta opacifierea acestora, situaţie întȃlnită la o treime din astmatici. Ca și în cazul oricărei alte patologii nu se poate rămȃne doar la stadiul de observare, nici la cel de diagnostic, ci trebuie să se meargă la următorul nivel, identificarea unui tratament. Imunoterapia sau hiposensibilizarea prin injectarea alergenului în cantităţi mici pentru o perioadă de cȃteva luni, a fost încercată în 1911 de Noon şi Freeman. Acum se foloseşte împotriva reacțiilor față de veninul de albine, viespi şi pentru tratamentul rinitei alergice. Doza iniţială este de 1-10ng şi creşte progresiv cu cȃte 10μg alergen/doză. O formă mai nouă de imunoterapie e cea folosind, nu structura naturală a alergenilor, ci un fragment conținȃnd numai primii 20 aminoacizi din structura primară a alergenului. De asemenea, se pot sintetiza forme recombinate genetic, cu o capacitate de legare de IgE scăzută. Însă şi acestea ar putea provoca şoc anafilactic aşa că administrarea lor se va face după luarea tuturor precauţilor necesare. Sunt în studiu şi vaccinuri ADN, cu introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vectorîin celulele gazdei, cu modificarea răspunsului imun al acesteia. Experimente s-au facut pe şoareci, unde expresia tisulară de CpG a facut să crească activitatea TH1 şi să scadă cea a TH2. Anticorpii monoclonali anti-IgE umanizaţi se ataşează de Fab a IgE circulanţi, şi astfel îi îndepărtează din circulaţie. Ȋnsă, pot şi scădea producţia de IgE prin ataşarea de receptorii situaţi pe LB, care nu vor mai semnaliza pentru producerea de reagine (Ac anti-IgE). Şi-au dovedit eficacitatea în cazul astmului alergic şi al rinitei alergice, şi urmează să se stabilească dacă au efect benefic în cazul alergiei alimentare, dermatitei atopice sau alergiei la medicamente.

204

18. 4. Verificați-vă cunoștințele Alegeți răspunsul corect. Întrebarea 1 1). Anafilaxia apare după un contact nou cu un antigen la care organismul nu era sensibilizat. 2). Ȋn HS de tip I intervin mastocite, bazofile cuplate cu Ac anafilactici care se mai numesc şi reagine. 3). mediatorul mastocitar principal este histamina, care este un mediator sintetizat de novo. Dintre cele 3 afirmaţii de mai sus, care este adevărată/care sunt adevărate? A) 2 B) toate C) nici una D) (1) si (3) Ȋntrebarea 2 Alegeți afirmațiile care sunt amândouă corecte și se află în relație de cauză-efect. a). Activarea bazofilelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun pentru că necesită prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). b). Histamina determină bronhoconstricţie la nivelul plămȃnului pentru că acţionează pe receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-bronşice c). Şocul anafilactic la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm pentru că în lipsa tratamentului poate evolua către deces d). Polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci nu pot determina leziuni la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii deoarece ei nu pot declanșa un raspuns imun. Intrebarea 3 Care dintre următoarele nu reprezintă un test diagnostic al hipersenibilității tip I a). prick-test b). dozarea IgE c). patch test d). dozarea IgG Intrebarea 4 Nu se folosește ca tratament al hipersensibilității tip I a). hiposensiblizarea prin injectarea alergenului în cantităţi mici pentru o perioadă de cȃteva luni b). un fragment antigenic conţinȃnd numai primii 20 aminoacizi din structura primară a alergenului caruia i s-a crescut şi capacitatea de legare de IgE c). introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vector în celulele gazdei, cu modificarea răspunsului imun al acesteia d). anticorpii monoclonali anti-IgE umanizaţi Intrebarea 5 Pentru a găsi afirmaţia corectă ajutaţi-vă de povestirea adevărată 205

a).La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne recente de astm, nu ar trebui să ridice niciodată suspiciunea anafilaxiei. b). Cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie prevenită c). Ȋn cazul HS tip I se evită adrenalina, antagoniştii receptorilor histaminici H1 şi H2, oxigenul, albuterolul şi corticosteroizii d). Pentru că aproximativ 90% din răspunsurile bifazice apar în primele 4 ore de la reacţia anafilactică iniţială, pacienţii pot fi externaţi din camera de urgenţă înainte de atingerea a 4 ore de la prezentare.

18. 5. Hipersensibilitatea de tip II (citotoxică) Reacţia imună citotoxică reprezintă unul dintre mecanismele importante de apărare a organismului gazdă faţă de microorganisme. Rolul acestei reacţii este multiplu: distrugerea bacteriilor extracelulare şi intracelulare, eliminarea celulelor infectate cu virusuri dar şi distrugerea unor paraziţi sau fungi. Pentru îndeplinirea acestor funcţii sunt utilizate mecanismele „imunităţii naturale” (implicând PMN, macrofage, celule NK). Imunitatea specifică completează imunitatea naturală, adăugând aderenţa celulelor fagocitare şi a celulelor NK la antigene prin intermediul anticorpilor şi complementului. Un rol aparte în imunitatea specifică îl deţin limfocitele Tc cu efect litic faţă de celulele infectate viral. HS de tip citotoxic apare după cuplarea anticorpilor cu antigene fixate pe membrana celulară. Spre deosebire de hipersensibilitatea de tip I, Ac implicaţi în acest tip de răspuns imun sunt IgG sau IgM. Ei sunt ataşaţi celulelor gazdei sau se găsesc în matricea extracelulară (în HS III, Ac sunt în ser, cu formarea de complexe circulante care se vor depune nespecific în ţesuturi). (Figura nr. 10) Se cunoaște faptul că un neutrofil recunoaşte și fagocitează fagocita bacteria opsonizată cu Ac, formează fagolizozomi urmând distrugerea produsului fagocitat.Receptorii pentru complement sunt necesari pentru că bacteria poate fi opsonizată şi de fragmente ale sistemului complement. A fost demonstrat experimental (pe șoareci) că rolul esenţial nu revine C3R, ci FcR. Ȋn loturile cu deficit de sinteză a lanţului γ al FcR, HS de tip II nu apare, în timp ce la şoarecii cu deficit al componentelor sistemului complement, nu s-a constatat nici o diferenţă faţă de lotul de control. Ȋn cazul HS de tip II, în locul endocitozei bacteriei, are loc o exocitoză a enzimelor lizozomale asupra celulei/matricei tapetate cu Ac. După formarea complexului antigen-anticorp este activat sistemul complement, se generează complexul de atac al membranei cu lezarea membranei celulare. Odată cu liza celulei gazdă are loc eliberarea de tromboxan, precursor al prostaglandinelor şi leucotrienelor. Alături de neutrofile participăşi macrofagele, trombocitele, celulele K, eozinofilele datorită prezenţei FcR pe membrana lor. Macrofagele, eozinofilele şi neutrofilele au un răspuns mai puternic datorită prezenţei şi a C3R pe membrana celulară. Amplitudinea fenomenelor la nivel celular depind de cantitatea de Ac dar şi de rezistenţa celulelor ţintă la liză. De exemplu, în cazul eritrocitelor este suficient un singur MAC, în timp ce pentru celulele nucleate există o capacitate mai mare de a se reechilibra ionic precum şi mecanisme de apărare anti-complement. Liza mediată de C' este implicată în anemiile hemolitice, reacţiile postransfuzionale în incompatibilitatea ABO sau Rh etc. Leziunile membranare sunt accentuate de atragerea fagocitelor şi eliberarea locală a enzimelor litice. 206

Organismul uman posedă în mod normal în sȃnge anticorpi față de Ag sistemului ABO pe care nu le deține. În aceste condiții, Ac nu se vor întȃlni niciodată cu fără o intervenţie din afară. Ȋn cazul unei transfuzii cu sȃnge incompatibil simptomele vor fi reprezentate de febră, hipotensiune, vomismente, dureri la nivelul toracelui (anterior și posterior), datorită hemolizei intravasculare. Este de menționat că o femeie însărcinată poate păstra sarcina în cazul unui făt cu o altă grupă de sȃngepentru că Ac formaţi împotriva Ag eritrocitare sunt de tip IgM (pentameri) care nu vor trece bariera fetoplacentară. Sistemul Rh, însă, poate provoca sindromul hemolitic al nou-născutului. Mama, sensibilizată împotriva Ag Rh fetale, produce Ac anti Rh fetal de tip IgG, care vor trece bariera feto-placentară. Manifestările sindromului hemolitic al nou-născutului constau în hepatosplenomegalie, icter şi peteșii apărute de exemplu la nivel facial. Primul copil Rh incompatibil cu mama sa, nu va suferi, însă, următorii, da. Situaţia caracteristică este: mama, Rh- iar fătul, Rh+. Ac anti Rh+ rămân ”in amonte” de placentă. Pornind de la aceste constatări s-a imaginat un tratament care şi-a dovedit eficienţa. Se administrează mamei imediat post- partum Ac anti RhD, care vor distruge hematiile Rh+ materne. Alte sisteme sangvine implicate în reacţiile posttransfuzionale, în afară de sistemele ABO şi Rh, sunt MN, Duffy şi Kell. Formarea de IgG vor induce o reacţie hemolitică mai puţin accentuată. Eritrocitele transfuzate vor fi preluate de fagocitele de la nivelul ficatului şi splinei, şi nu vor da o hemoliză intravasculară sistemică. Ȋnsă poate apărea şi în acest caz necroza acută tubulară datorită eliberării masive a componentelor eritocitare. Pot apărea reacţii postransfuzionale îndreptate şi împotriva altor componente celulare sangvine, însă consecinţele nu sunt la fel de pregnante ca în cazul eritrocitelor. Reacţiile de respingere de grefă se manifestă la nivelul ţesuturilor vascularizate direct (un exemplu de țesut care nu suferă reacţii de respingere este corneea). Cele mai severe manifestări se datorează tot sistemului ABO, cu activarea complementului, liza eritrocitelor, recrutare de neutrofile şi trombocite. Ȋnsă frecvente sunt şi manifestările datorate incompatibilităţii MHC. Alte exemple: - anemia hemolitică după ataşarea de proteinele de suprafaţă a hematiilor a unor medicamente (penicilină, fenacetină, chinidină etc) şi iniţierea producerii şi cuplării unor anticorpi de tip IgG. HS de tip II la medicamente se poate produce în 3 modalități diferite: · prin ataşarea medicamentului la membranna celulară cu producerea ulterioară de Ac (cazul penicilinei, quininei, sulfonamidelor), · prin formarea de complexe imune circulante medicament-anticorp care se ataşează pe membrana celulară şi · prin inducerea producerii de autoanticorpi (alfa metildopa). (Figura nr. 11) - trombocitopenia şi tendinţa la hemoragie după administrarea de chinină, care se ataşează de trombocite şi stimulează producerea de autoanticorpi; - apariţia unui sindrom asemănător lupusului eritematos după administrarea de hidralazină care stimulează producerea de autoanticorpi anti-ADN; - anemia hemolitică după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae, datorită stimulării producerii de anticorpi care se fixează pe hematii;

207

- cardita reumatismală din reumatismul articular acut (anticorpii faţă de streptococul beta-hemolitic de grup A reacţionând încrucişat cu ţesutul cardiac); - sindromul Goodpasture (după apariţia de Ac care se fixează pe membrana glomerulară renală sau la nivel pulmonar, se activează C', rezultând leziuni grave ale membranelor celulare). Studiul mecanismului de producere a HS de tip II a stat la baza imaginării unor tratamente ce folosesc Ac citotoxici: Trastuzumab (antihuman epidermal growth factor receptor 2) în terapia cancerului de sȃn; Infliximab (Ac anti-TNF) în boala Crohn; Rituximab (Ac anti-CD20) în limfoamele non-Hodgkin, trombocitopenie autoimună, artrită reumatoidă şi lupus eritematos sistemic; Alemtuzumab (Ac anti CD25) în leucemii şi pentru inducerea imunosupresiei la pacienţii ce suferă un transplant de celule stem.

18. 6. Povestire adevărată (Cardita reumatismală, entitate a hipersensibilităţii tip II ce nu trebuie subestimată) În urmă cu 30-40 de ani, reumatismul articular acut (RAA) (febra reumatică) reprezenta un subiect foarte frecvent dezbătut în publicaţiile ştiinţifice, mai mult chiar decât infarctul miocardic acut, de ex. Atunci existau atât de mulţi copii cu această boală, încât spitale întregi erau dedicate tratamentului RAA. În prezent, majoritatea medicilor din ţările dezvoltate nu au mai văzut cazuri de RAA (profilaxia primară şi secundară a atacului reumatismal realizându-se în mod corespunzător); experienţa în ţările occidentale este astăzi limitată la constatarea prezenţei leziunile de valvă mitrală la pacienţi care au fost afectaţi de RAA în tinereţe. În ţările dezvoltate, populaţia cumulată este mai mică de 20% din populaţia globului; pentru restul populaţiei (peste 80%), RAA şi cardita reumatismală continuă să reprezinte o problemă importantă. Se estimează că la nivel mondial există 15,6 milioane de persoane cu RAA, în fiecare an apar peste 450.000 de cazuri noi, iar circa 230.000 decese sunt provocate fie de RAA fie de diferitele complicaţii ale RAA. Este posibil ca numărul real de cazuri să fie mai mare. O consecinţă negativă a scăderii interesului faţă de RAA în ţările dezvoltate este reducerea cercetării în acest domeniu şi singurele progrese din ultima jumătate de secol au fost realizate în domeniul tratamentului medical şi chirurgical al RAA. Principala modalitate de control al RAA rămâne tratamentul corect al faringitelor cu streptococ β-hemolitic de grup A şi administrarea de injecţii cu penicilină retard (varianta „depozit” cu intervalul cel mai lung între 2 administrări poate fi administrată la 3-4 săptămâni), de-a lungul unei perioade lungi de timp, la persoanele cu o istorie de RAA pentru a preveni episoadele recurente (profilaxie secundară). Ambele strategii au fost publicate încă din anii 50, în SUA. În prezent se încearcă şi obţinerea unui vaccin, pentru profilaxie primară (se estimează că în 10-20 ani va putea fi obţinut un vaccin sigur şi eficient). În lipsa unor cercetări realizate în ţările dezvoltate, se încearcă obţinerea unor date în statele în care RAA are o frecvenţă crescută. Spre exemplu, studii realizate în Mozambic, Cambodgia, Franţa şi Australia, au demonstrat utilitatea ecocardiografiei în detectarea pacienţilor cu boală cardiacă reumatică (copii cu vârstă şcolară), detectându-se astfel cu 90% mai multe cazuri decât prin metoda clasică, de diagnostic clinic. S-a descoperit că 2-3% dintre copii cu vârstă şcolară din Cambodgia şi Mozambic sufereau de boală cardiacă reumatică, majoritatea nefiind diagnosticaţi în cursul acestui studiu. Aceste date confirmă faptul că RAA şi 208

cardita reumatismală au o suficient de mare importanţă pentru a atrage atenţia publicului internaţional şi a comunităţilor de cercetare.

18. 6. Verificați-vă cunoștințele Alegeți răspunsul corect. Ȋntrebarea 1 Printre rolurile hipersensibilităţii de tip II se numără: a). distrugerea bacteriilor extracelulare şi intracelulare b). eliminarea celulelor infectate cu virusuri c). distrugerea unor paraziţi sau fungi d). toate cele de mai sus Ȋntrebarea 2 Care dintre următoarele afirmaţii este incorectă? a). Ȋn HS de tip II limfocitele Tc cu efect litic faţă de celulele infectate viral. b). Ȋn HS de tip II sunt utilizate atȃt mecanismele „imunităţii naturale” (implicând PMN, macrofage, celule NK) cȃt și ale imunităţii specifice. c). Imunitatea specifică presupune, printre altele, formarea de Ac care vor forma ulterior complexe imune circulante. d). Complexele imune circulante sunt rapid epurate din organism, ele neavȃnd posibilitatea de a se depune la nivelul ţesuturilor.

18. 7. Hipersensibilitatea de tip III (prin complexe imune circulante) Fenomene experimentale

Patologia umană HS de tip III se poate datora: - unei infecţii persistente (ex. lepră, malarie, hepatită virală, endocardită stafilococică); - unei boli autoimune (ex. artrită reumatoidă, lupus eritematos sistemic, polimiozită); - inhalării de material antigenic (ex. actinomicete în cazul plămȃnului de fermier, antigene aviare în cazul plămȃnul crescătorilor de păsări). Complexele imune activează o serie de căi ale răspunsului imun. Aminele vasoactive eliberate în cadrul activării acestor căi determină retracţia celulelor endoteliale, ceea ce are ca efect creşterea permeabilităţii vasculare, depunerea complexelor imune, dar şi expunerea colagenului, care va stimula agregarea trombocitelor şi formarea de microtrombi.

209

Se intră într-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazală continuă să genereze C3a şi C5a (anafilatoxine). Astfel, complementul, iniţial cu rol protectiv, determină ulterior creşterea suplimentară a permeabilităţii capilare. Polimorfonuclearele sunt atrase şi îşi exocitează conţinutul în loc să endociteze complexele imune (acestea nu pot fi desprinse de pe membrana bazală vasculară). Enzimele inhibitoare serice împiedică enzimele lizozomale să acţioneze la nivel sistemic, însă nu şi local, de aceea se vor genera leziuni tisulare locale. Eritrocitele primatelor conţin receptori pentru C3b, importanţi pentru preluarea complexelor imune şi transportul lor către splina şi ficat, unde vor fi fagocitate. Ȋn HS de tip III, sistemul este suprasaturat, ceea ce îi scade eficienţa. Complementul menţine complexele Ag-Ac solubile pe calea clasică şi resolubilizează complexele Ag-Ac agregate pe calea alternă, de aici putȃndu-se deduce rolul depleţiei de componente ale complementului sau a unor boli ereditare (deficit C2) în patologia HS de tip III. Este importantă şi dimensiunea complexelor imune. Cele mari sunt repede preluate de ficat şi eliminate, în timp ce complexele mici rămȃn în circulaţie o perioadă mai lungă de timp. Un defect genetic ce determină sinteza de Ac cu afinitate joasă, va favoriza producerea de complexe Ag-Ac mici şi deci, leziunile caracteristice HS de tip III. Depunerea complexelor imune Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagonişti ai aminelor vasoactive) reduce considerabil depunerea complexelor imune prin scăderea permeabilităţii vasculare. Depunerea complexelor mai este dependentă de regimul presional crescut şi de prezenţa turbulenţelor. Ȋn capilarele glomerulare presiunea sȃngelui este de 4 ori mai mare decȃt în restul capilarelor. Turbulenţe se întȃlnesc în zonele de bifurcaţie a arterelor şi în zonele de filtru vascular (plexurile coroide şi corpii ciliari). Preferinţa pentru un ţesut sau altul poate fi dependent de sarcina electrică a complexului imun, de gradul de glicozilare a Ac. Fenomene experimentale

Reacţia Arthus a fost descrisă în 1903 de Maurice Arthus şi Nicholas Breton, după injectarea subcutanată de ser de cal la un iepure hiperimunizat. Leziunile au fost maxime după aproximativ 6 ore. Boala serică acută, descrisă în 1911 de von Pirquet, a fost studiată din nou în anii 1960, descriindu-se zece modele de glomerulonefrite experimentale (Dixon). Deoarece complexele imune circulante (CIC) se depozitează în ţesuturi, apare conceptul de antigen in situ. După ce complexul imun se formează în locul respectiv sau este fixat secundar, se iniţiază (așa cum am menționat anterior) o cascadă de evenimente: · activarea complementului şi a factorilor anafilactoizi chimiotactici C3a şi C5a; · afluxul de neutrofile, care produc leziuni prin enzimele lizozomale şi · afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboză. Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, şoarece etc, dar şi la om. Experimentul a fost efectuat pe iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumină) de la altă specie, asociat cu un adjuvant imun. După unele rapeluri, necesare uneori pentru obţinerea de anticorpi circulanţi IgG precipitanţi, reacţia Arthus poate fi obţinută prin injectarea subcutanată a antigenului. Manifestările apar după 2 ore, atingând maximum la 6 ore şi dispar după 24-48 ore. Constau în edem, eritem indurat, peteşii şi uneori purpură necrotică sau chiar necroză. Leziunile de la locul injectării antigenului duc la fixarea de igG şi C3b cu sediul perivascular sau în peretele vascular. Boala serului

210

a) Boala serului acută. Înaintea erei antibioticelor, multe boli infecţioase erau tratate prin injectarea de ser de cal hiperimunizat. În 1911, von Pirquet descrie complicaţiile acestei terapii sub termenul de boală serică (febră, artralgii, vasculită cutanată), survenită la unii bolnavi după 8-12 zile de la prima injecţie. Injectarea unică, pe cale intravenoasă, a unei substanţe netoxice, ca serumalbumina bovină (BSA), în cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmată de apariţia bolii serice acute (experimentală) cu 3 faze: 1. faza anterioară imunizării (durează 5-8 zile. BSA marcată radioactiv, scade, iniţial brutal prin difuziune în spaţiile extravasculare, apoi după 24 de ore, lent, corespunzător propriului catabolism); 2. faza complexelor imune (corespunde prezenţei concomitente de BSA şi a anticorpilor anti-BSA); este boala serică cu glomerulonefrită. În jurul zilei a 5-a, concentraţia sangvină de BSA scade rapid. Anticorpii anti-BSA liberi nu sunt decelabili decât după dispariţia BSA liberă. Detectarea complexelor imune corespunde acestei perioade, ca şi scăderea complementului seric. Manifestările patologice nu sunt datorate anticorpilor anti-BSA liberi şi nici complexelor imune circulante. Ca şi în reacţia Arthus, leziunile sunt datorate acţiunii complementului, care este urmată de un aflux de neutrofile. La animalul fără complement apare o simplă albuminurie fără glomerulonefrită); 3. faza de restitutio ad integrum (nu mai există antigen liber sau conjugat decelabil; anticorpii anti-BSA sunt crescuţi; manifestările clinice, în special glomerulonefrita, regresează rapid). b) Boala serică cronică. Este dificil de reprodus la animal. Totuşi administrarea repetată a antigenului (din 2 în 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice extramembranare proliferante. Patologia umană Principalele afecţiuni umane sunt: · bolile comparabile cu reacţia Arthus (în care antigenul induce o reacţie locală prin difuziunea anticorpilor IgG precipitanţi); un exemplu este boala plămânului de fermier [după contactul în timpul zilei cu fânul mucegăit (Actinomyces thermophylus), apare la începutul nopţii (după 6 ore) o stare de asfixie care dispare în următoarele ore]; · manifestări mai generale, cu atingerea rinichiului, articulaţiilor, pielii şi uneori a creierului; apar leziuni de tipul glomerulonefritei extramembranare, uneori proliferative. Afecţiunile mai frecvente sunt lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă, glomerulonefritele şi periarteritele poststreptococice etc. În 2/3 din cazurile de anemie hemolitică imuno-alergică medicamentoasă se formează anticorpi IgM anti-medicament. În aceste cazuri apar adesea manifestări generale: febră, frison, mialgii cu dureri lombare şi uneori anurie tranzitorie, prin necroză tubulară acută.

18. 8. Povestiri adevărate Vasculită necrozantă aparută în cadrul glomerulonefritei difuze postinfecţioasă Vor fi prezentate două cazuri de glomerulonefrită şi evoluţia lor clinică şi anatomopatologică. Biopsiile efectuate au evidenţiat aspectul de glomerulonefrită difuză acută postinfecţioasă, asociată cu necroză fibrinoidă şi infiltrat inflamator leucocitar în peretele arteriolelor şi arterelor interlobulare. Au fost observate proliferări celulare. În ambele cazuri a apărut insuficienţa renală acută (IRA) severă (în cazul celui de al doilea, evoluţia a fost nefastă, spre deces). Primul caz Un copil de sex masculin, 11 ani, a fost internat în spitalul din oraşul de reşedinţă. 211

Motivele internării au fost reprezentate de inapetenţă, edem facial, diaree, vomă şi hematurie macroscopică, constatate în ultimele 2 zile. La internare s-a constatat că pacientul era febril (38°C) şi prezenta hipertensiune arterială (TA = 220/120 mmHg). După o săptămână, în timpul internării, a apărut oligurie şi a fost trimis la un spital de un nivel superior. A evoluat spre anurie şi a necesitat dializă peritoneală. După 4 săptămâni de la internare, anuria a continuat să persiste, asociindu-se cu episoade de vomă; TA a putut fi controlată medicamentos. A fost transferat la spital de nivel superior. Examenul clinic la internare a arătat o stare generală relativ bună, edem prezent în pătrimea distală la nivelul membrelor inferioare, greutate = 78,4 kg, înălţime = 157 cm, TA = 100/70 mmHg, 26 respiraţii/minut, 76 bătăi cardiace/minut. A fost menţinut în dializă peritoneală continuă. Rezultatele analizelor de laborator la această internare au fost următoarele: hematocrit 28%, hemoglobină 9,2 g / dl, proteine totale 8,2 g%, albumină 2,9 g%, Na = 138 mEq/l, K = 4,3 mEq/l, Ca = 8,4 mg%, P = 8,6 mg%, Mg = 1,5 mg%, uree = 172 mg%, creatinină = 18,3 mg%; factor antinuclear negativ. Ecografia renală a fost în limite normale pentru vârsta lui. Datorită prezenţei vărsăturilor, s-a indicat efectuarea endoscopiei digestive (în a doua zi de la ultima internare), evidenţiindu-se hernie hiatală şi duodenită (la examenul microbiologic nu s-a identificat H. pylori). A primit tratament cu domperidonă şi omeprazol, în urma căruia greaţa şi vărsăturile au dispărut. În a 5-a zi de la internare s-a efectuat o biopsie renală, iar diagnosticul a fost: glomerulonefrită proliferativă difuză endocapilar exsudativă, cu 17% proliferări celulare. La examenul în imunofluorescenţă s-au observat depozite granulare difuze de C3 în structura capilarelor şi arteriolelor. Prin examenul cu ajutorul microscopului electronic s-au observat depozite electronodense mezangiale, subendoteliale şi subepiteliale. În ziua a 14-a de la internare s-a iniţiat tratament („puls-terapie” / doze mari administrate pentru perioade scurte) cu metilprednisolon 1g i.v. şi prednison, pe cale orală, 40 mg/zi. După a 3-a zi de corticoterapie s-a continuat cu prednison 40 mg/zi. În a 20-a zi de internare, datorită unei HTA acută, pacientul a primit propanolol şi minoxidil. Abia din a 26-a zi de internare, pacientul a prezentat diureză de 10 ml/zi, iar după încă trei zile diureza a ajuns la 120 ml/zi (cu hematurie macroscopică). Rezultatul analizelor de laborator în a 4-a săptămână de la ultima internare au fost: uree = 80 mg%, creatinină = 3,5 mg% (o valoare încă foarte mare, dar de circa 5 ori mai mică decât în momentul internării), clearance-ul creatininei = 13ml /min /1,73 m2 (suprafaţa corporală), ASLO = 974 UI/ml, C3 = 48,4 mg% (Normal = 0,5 - 1,5 mg%). În a 29-a zi de la internare diureza a ajuns la de 900 ml iar TA era fost ţinută sub control. În aceste condiţii, pacientul a fost externat, şi s-a recomandat să revină la control, săptămânal. După încă două săptămâni diureza s-a menţinut la de 900-1000 ml/zi, valoarea pentru uree a fost de 50 mg% iar pentru creatinină de 2,1 mg%; nu a mai fost necesară dializa, dar s-a menţinut tratamentul antihipertensiv. Al doilea caz O pacientă de sex feminin, în vârstă de 66 ani, a fost internată în spitalul Facultăţii de Medicină din localitatea de reşedinţă. Motivele internării au fost reprezentate de: anorexie, diureză scăzută şi hematurie macroscopică. La internare s-a văzut că pacienta este apatică şi prezintă tuse cu expectoraţie spumoasă. 212

Prin anamneză s-a aflat că în urmă cu circa o lună, pacienta a făcut o infecţie orofaringiană, pentru care a primit tetraciclină. Examenul clinic la internare a relevat o stare generală bună, absenţa temperaturii, greutate = 63 kg, înălţime = 147 cm, TA = 140/80 mmHg, 80 bătăi cardiace / minut, 20 respiraţii / minut, jugulare turgescente, raluri ronflante la nivelul bazelor pulmonare, ficat palpabil la 5cm sub rebordul costal. Au fost înregistrate următoarele valori pentru analizele de laborator efectuate: hematocrit 40,2%, hemoglobină 13,5 g/dl, număr leucocite = 15.600/mm3. Examenul de urină a arătat o densitate de 1025, pH = 5, proteinurie = 4+, fără glicozurie, hematurie = 3+, hemoglobinurie = 3+, leucocite, hematii şi cilindri numeroşi în sedimentul urinar iar urocultura a fost negativă. După 12 ore de la internare, proteinuria a crescut. Iar celelalte analize de laborator au avut următoarele rezultate: proteine totale = 6,4 g%, albumină = 3,6 g%, globuline = 2,8 g%, glicemie = 156 mg%, Na = 136 mEq/l, K = 4 mEq/l, Ca = 10 mg%, P = 8,2 mg%, acid uric = 10,6 mg%, uree = 174 mg%, creatinină = 1,84 mg%, proteina C reactivă = 100 mg%, C3 = 8,3 mg% (Normal = 0,5 - 1,5 mg%), C4 = 42,9 mg% (Normal = 400-500 µg/ml), ASLO = 833 UI/ml. Factorul anti-nuclear a fost absent. Examenul ecografic renal a fost în limite normale. Funcţia renală s-a deteriorat progresiv, şi în aceste condiţii, la 20 de zile de la internare, ureea a ajuns la valoarea de 223 mg%, creatinina la valoarea de 8,3 mg%, clearance-ul creatininei la 5,34 ml/min, iar proteinuria la 3,9 g/24 h. S-a efectuat o biopsie renală care a evidenţiat o glomerulonefrită proliferativă difuză endocapilar exsudativă, cu necroză tubulară acută (25% proliferări celulare). La imunofluorescenţă s-au observat depozite granulare difuze de C3 în capilare şi mezangiul arteriolelor. Prin ME s-au observat depozite voluminoase mezangiale şi subepiteliale. În acest context s-a pus diagnosticul de glomerulonefrită acută post-infecţioasă. Pacienta a primit un tratament în urma căruia funcţia renală s-a ameliorat progresiv, iar la 6 zile ureea a ajuns la valoarea de 122 mg%, creatinina = 2,85 mg% şi clearance-ul creatininei = 14 ml/min, moment în care a fost externată (la cerere). După aproximativ două săptămâni, pacienta a revenit, iar la acel moment valoarea diurezei era scăzută, prezenta proteinurie = 9,2 g/24 h, uree = 180 mg%, creatinină = 3,17 mg, clearance-ul creatininei = 9 ml/min; din punct de vedere clinic pacienta era dispneică şi prezenta fatigabilitate intensă. A doua biopsie a demonstrat înrăutăţirea tabloului anterior, cu 80% proliferări celulare şi 42% scleroză glomerulară şi necroză fibrinoidă pe arterele mici, cu depozite de C1q, C3, IgG şi fibrină. Pacienta a evoluat foarte rapid către IRA. După 3 săptămâni s-a început dializa. După 9 săptămâni, a prezentat erizipel la membrul inferior drept şi şoc septic, urmat de deces.

18. 9. Verificați-vă cunoștințele Alegeți răspunsul corect. Ȋntrebarea 1 Este corectă afirmaţia: a). Pentru HS de tip III apare conceptul de Ac „in situ” b). Complexul imun se formează în ţesuturi sau este fixat secundar 213

c). Reacţia Arthus a fost descrisă după injectarea subcutanată de ser de iepure la un cal hiperimunizat. d). Boala serică se caracterizează prin febră, artralgii, vasculită cutanată survenită imediat după injectarea de ser de cal hiperimunizat Ȋntrebarea 2 Care dintre următoarele nu este fază a bolii serice acute? a). faza leziunilor vasculare b). faza anterioară imunizării c). faza de restitutio ad integrum d). faza complexelor imune Ȋntrebarea 3 Următoarea afirmaţie „leziunile sunt datorate acţiunii complementului, care este urmată de un aflux de neutrofile” este valabilă: a). pentru reacţia Arthus b). pentru boala serului c). atȃt pentru reacţia Arthus cȃt şi pentru boala serului d). pentru nici una dintre ele. Ȋntrebarea 4 Printre principalele afecţiuni umane datorate HS de tip III nu se numără: a). boala plămânului de fermier b). lupusul eritematos diseminat c). cardita reumatismală d). glomerulonefritele şi periarteritele poststreptococice. Ȋntrebarea 5 Depunerea complexelor imune este dependentă de: a). permeabilitatea presională b). regimul presional crescut c). prezenţa turbulenţelor d). nici una dintre mențiunile de mai sus e). primele 3 afirmații sunt corecte.

18. 10. Hipersensibilitatea de tip IV (întârziată, mediată celular) Hipersensibilitatea de tip IV reprezintă o reacţie (mai) întârziată, care apare la 48-72 de ore după contactul cu antigenul şi se datorează limfocitelor Th1 specifice antigenului. HS de tip IV este un tip exagerat de răspuns imun celular. HS de tip IV poate fi considerată ca un martor al mecanismelor protective față de germenii intracelulari dar şi de alte substanţe chimice care se leagă puternic de membrana celulară. Totuşi, corelaţia protecţie214

hipersensibiltate nu e perfectă, în sensul că se poate ca un pacient cu HS de tip IV la un anumit germen să dezvolte infecţii progresive cu acel patogen (ex. situația din infecțiile cu M. leprae). Au fost descrise patru tipuri diferite de hipersensibilitate (de tip IV), dintre care ultimele trei sunt importante în patologia umană. - Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote (nu are echivalent la om); - Hipersensibilitatea de contact Este o reacţie epidermică, care corespunde la om cu eczema de contact / dermatita de contact. În experimentele pe animal se plasează pe piele diferite antigene, care penetrează uşor în epiderm şi se leagă solid de celule. Cel mai frecvent se utilizează DNCB (dinitroclorbenzen), DNFB (dinitrofluorbenzen), Oxazolina sau Clorura de picryl. DNCB este un exemplu de haptenă care sensibilizează aproape toţi contacţii, şi pe care o putem folosi ca să stimulăm imunitatea mediată celular. Un rol important în sensibilizare îl joacă keratinocitele şi celulele Langerhans. Reacţia de hipersensibilitate de contact survine după ce animalul a fost sensibilizat în prealabil. După o injecţie ulterioară intradermică sau după aplicarea antigenului pe tegument, urmează legarea haptenei de un carrier, complexul antigenic este fagocitat de o celulă Langerhans care se va activa, matura şi îşi va începe migrarea spre zona paracorticală a nodulilor limfactici sub acţiunea IL-1 şi TNF secretaţi de keratinocitele agresate. Corespunde unei infiltrări dermice şi epidermice, edemului epidermic şi eritemului apărut după 48-72 ore, care va persista câteva zile. Absenţa reacţiei se datorează unui deficit imun celular. Sensibilizarea prealabilă cu DNCB (ex. la fotografii) poate declanşa un şoc anafilactic la IgE. Primele modificări apar începând cu a 6-a până la a 8-a oră după contactul cu alergenul; LT activate şi cele cu memorie vor ajunge în circulatie şi ulterior în zona inflamată, alături de monocite, unde vor îndepărta complexul haptenă-carrier. Ele înconjoară vasele sanguine, glandele sudoripare, glandele sebacee, foliculii piloşi şi infiltrează epidermul. Infiltratul celular se accentuează progresiv şi ajunge maxim spre a 72-a oră. Infiltratul conţine celule T CD4+ (în majoritate), T CD8+, celule Langerhans, macrofage şi bazofile. Aceleaşi keratinocite, dar şi macrofagele, vor produce ulterior PGE, cu rol inhibitor al reacţiei inflamatorii. LTs intervin de asemenea în terminarea reacţiei de HS (la fel ca şi ultravioletele), prin scăderea producerii de IL-1. Ultravioletele inhibă direct şi celulele Langerhans. Ȋn concluzie, fenomenele apar în următoarea succesiune: celulele Langherhans activează LT CD4+ cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g şi GM-CSF. Celelalte celule sunt recrutate şi activează o reacţie inflamatorie în care predomină celulele mononucleare. - Hipersensibilitatea de tip tuberculinic (Figura nr. 12) Persoanele infectate cu unul din germenii (M. tuberculosis, M. leprae, Leishmania tropica etc.) / sau care vin în contact cu substanţele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot provoca hipersensibilitatea de tip tuberculinic au LT deja activate. În laborator, pentru sensibilizare se injectează la un animal Ag împreună cu adjuvantul complet Freund (pregătirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamidă permite şi utilizarea adjuvantului Freund incomplet). Această fază de sensibilizare începe cu 2-3 săptămâni înainte de testarea HS. După injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migrează în jurul vaselor sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreţia de interleukine care recrutează alte celule nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm şi atinge un maxim la 48-72 ore după injecţie. Celulele 215

observateiniţial sunt LT [predomină T CD4+ (raport CD4/CD8 - 2/1)], ulterior încep să se acumuleze macrofagele (atingând un maxim spre finalul celei de a treia zi de la inoculare). Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge şi epidermul; keratinocitele exprimă la suprafaţa lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore după apariţia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica răspunsul imun al gazdei), circulaţia aferentă şi eferentă a celulelor imunocompetente seamănă cu cea observată în hipersensibilitatea de contact; se poate observa o infiltrare uşoară cu bazofile; în timp se poate dezvolta o reacţie granulomatoasă. La om se practică intradermoreacţia cu tuberculină (PPD, derivat proteic purificat, un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea rezultatului se face după 72 ore, asigurând o bună iluminare a zonei examinate (de preferat lumina naturală). Se identifică existenţa unei eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma înţepăturii dermice. Apoi se apreciază tactil (prin repetate mişcări într-un sens şi altul deasupra zonei de reacţie) cu pulpa inelarului, limitele unei zone de induraţie (percepută ca fiind reliefată) şi care corespunde histopatologic infiltraţiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentând răspunsul imun faţă de antigenul injectat. Se măsoară şi se înregistrează „diametrul maxim” al zonei de infiltraţie (a se vedea şi anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermică de tuberculină se rezolvă în mod normal în 5-7 zile; persistenţa acestora face ca leziunea să se transforme dintruna tuberculinică într-una granulomatoasă. - Hipersensibilitatea granulomatoasă Este o formă mai gravă de hipersensibilitate (întârziată) de tip IV care survine atunci când antigenul persistă şi nu poate fi eliminat. Se caracterizează printr-o acumulare şi o proliferare de macrofage, care stau la originea granulomului care apare la 21-28 zile după sensibilizare şi poate să persiste mai multe săptămâni. Hipersensibilitatea granulomatoasă poate succeda diferite hipersensibilităţi întârziate precedente, în general după o perioadă de 3 - 4 săptămâni. Elementul distinctiv al hipersensibilităţii granulomatoase este formarea de celule epiteloide, celulele derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului endoplasmatic, cu rolul lor de a întreţine inflamaţia prin secreţia continuă de TNF. Persoanele cu deficit de IFN nu dezvoltă granuloame, însă nici nu se apără eficient împotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea celulelor epiteloide rezultă celule gigante. Mai sunt denumite şi celule Langhans. Atenţie, sunt diferite de celulele Langerhans! Aceste celule gigante au mai mulţi nuclei, însă periferici, reticulul endoplasmic este puţin dezvoltat, iar mitocondriile şi lizozomii sunt în degradare. Se pare ca aceste celule Langhans ar reprezenta etapa finală din diferenţierea macrofagelor. Reacţiile de hipersensibilitate de tip IV observate în patologia umană pot fi observate în trei grupe principale de afecţiuni: 1. Eczema de contact care poate apărea datorită bijuteriilor care conţin nichel, produselor din piele de animal, produselor cu săruri de crom, cremelor „solare”, compuşilor chimici de cauciuc, produselor farmaceutice (penicilină, streptomicină, neomicină) etc; 2. Maladii infecţioase în care agenţii patogeni se dezvoltă intracelular (tuberculoză, lepră, leishmanioză, listerioză, micoze profunde etc); Ȋn cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoasă conţine pe lȃngă macrofage, celule epiteloide, celule gigante şi LT dispuse centrifug, şi o zonă de necroză centrală, un fel de puroi numit cazeum. Ȋn jurul întregului ansamblu se află o zonă de fibroză şi o cantitate crescută de colagen. Ȋn cazul M. leprae, reacţia granulomatoasă se numeşte reacţia Mitsuda. 216

Apariţia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoză unei alte persoane cu sarcoidoză, constituie pozitivarea testului Kweim. 3. Alte maladii (sarcoidoză ciroză biliară primitivă, hepatitele cronice virale B şi C, SIDA, infecţia HIV, poliartrita reumatoidă, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).

18. 11. Povestire adevărată Un tuberculom, o tumoră malignă sau sarcoidoză? Tuberculoza sistemului nervos central se poate prezenta ca meningită tuberculoasă, sub formă de tuberculoame sau, rareori, sub formă de abcese. Examenul clinic este de obicei nespecific, în faza acută putând sugera o tumoră malignă (25-85% dintre pacienţi sunt asimptomatici). Localizările extracerebrale trebuie investigate sistematic. Cazul prezentat este cel al unui pacient de sex masculin, în vârstă de 53 de ani, internat pentru slăbiciune musculară la nivelul membrelor inferioare, cu deficit proprioceptiv. Investigaţiile de laborator au fost în limite normale, iar testul HIV a fost negativ. Examenul tomografic (CT) cranian a revelat o leziune masivă în lobul parietofrontal drept, cu zone omogene perilezionale relativ sugestive pentru un proces malign (cancer) cu localizare cerebrală; examenul RMN a confirmat existenţa şi dimensiunile leziunii. Datorită simptomatologiei şi valorilor crescute ale reactanţilor de fază acută, s-a început terapia cu corticosteroizi, pacientul prezentând o remisie a simptomelor. S-a efectuat biopsie din zona afectată, histologic descoperindu-se leziuni foliculare cu celule epitelioide dar fără necroză. S-au realizat frotiuri colorate Gram, Ziehl-Neelsen şi PAS; nu au fost evidenţiate microorganisme iar decizia a fost de a nu se trimite produsele recoltate spre laboratorul de bacteriologie. Pentru a se elucida motivul apariţiei acestei leziuni, au fost realizate şi o serie de investigaţii extracerebrale (CT toraco-abdominal, lavaj bronhoalveolar şi bronhoscopie) fără a se obţine date suplimentare pentru un diagnostic pozitiv. În aceste condiţii, medicul curant a pus diagnosticul de sarcoidoză localizată la nivelul SNC iar pacientul a fost externat, continuând la domiciliu tratamentul cu corticosteroizi, conform scrisorii medicale eliberată în spital. După 2 luni bărbatul a fost reinternat cu deficienţe motorii şi febră (38,2ºC). S-a indicat din nou examen CT; rezultatul nu a permis explicarea simptomatologiei. Recoltându-se produse din mai multe zone, examenul bacteriologic, complet, a permis punerea diagnosticului de tuberculoză diseminată. S-a continuat tratamentul cortizonic, dar s-a început tratamentul anti-tuberculos cu o asociere de 4 medicamente (izoniazidă, rifampicină, pirazinamidă şi etambutol). După 4 luni simptomele au reapărut şi s-a luat decizia intervenţiei chirurgicale, pentru excizia formaţiunii. Analiza anatomo-patologică a pus în evidenţă structura tipică pentru granulomul tuberculos (ceea ce prin biopsia „oarbă” efectuată cu câteva luni înainte, nu s-a reuşit). Tratamentul a continuat, dar a fost adăugată amikacina, penta-terapia anti-TB realizându-se pentru o durată de 6 luni. Pacientul nu a prezentat reacţii adverse. După un an, au fost scoase din asocierea medicamentoasă 3 medicamente iar pacientul a primit pentru încă 6 luni (durata totală a tratamentului anti-TB a fost de 18 luni) numai izoniazidă şi rifampicină. Discuţii Tuberculoza cerebrală are o rată de mortalitate care variază între 5 şi 60%. Tratamentul de elecţie este cel medicamentos, cu o durată de circa 18 luni, până la dispariţia leziunilor sau până la calcificarea acestora. O 217

creştere paradoxală în dimensiuni a leziunii, sub tratament, poate duce la recomandarea intervenţiei chirurgicale de excizie a tuberculomului, aşa cum s-a întâmplat şi în această situaţie.

18. 12. Verificați-vă cunoștințele Alegeți răspunsul corect. Ȋntrebarea 1 Alegeţi răspunsul greşit: a). HS de tip IV reprezintă o reacţie imediată; b). HS de tip IV apare la 48-72 de ore după contactul cu antigenul; c). HS de tip IVse datorează limfocitelor Th1 specifice antigenului; d). HS tip Jones-Motenu are echivalent la om; Ȋntrebarea 2 Alegeti dintre următoarele afirmaţii adevărate pe cea care nu se potriveşte în context (ca sens de desfăşurare a reacţiilor imune): a). Ultravioletele inhibă direct celulele Langerhans, care au un rol important în sensibilizare b). Persoanele cu deficit de IFN nu dezvoltă granuloame c). Absenţa reacţiei epidermice la contactul tegumentului cu DCNB se datorează unui deficit imun celular d). Keratinocitele exprimă la suprafaţa lor molecule HLA DR la 48-96 de ore după apariţia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica răspunsul imun al gazdei Ȋntrebarea 3 Alegeţi varianta care se potriveşte pentru spaţiile libere din următoarea afirmaţie: ”Intradermoreacţia la .................... presupune apariţia unei eventuale arii intens..................., circumscriind urma înţepăturii dermice, ...................... si reliefate, care corespunde histopatologic infiltraţiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentând răspunsul imun faţă de antigenul injectat” a). tuberculină; eritemato-violacee, indurate b). bacil Koch; eritemato-violacee; indurate c). tuberculină; cianotice; retractile d). bacil Koch; cianotice; indurate Ȋntrebarea 4 (aveți de stabilit asocierea corectă) 1). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermică de tuberculină se rezolvă în mod normal în........... 2). Citirea rezultatului se face după........... 3). Hipersensibilitatea de tip IV reprezintă o reacţie întârziată, care apare la............... a). 5-7 zile b). 48-72 ore c). 72 ore Care este asocierea corectă? a). 1-a; 2-b; 3-c b). 1-c; 2-b; 3-a 218

c). 1-a; 2-c; 3-b d). 1-b; 2-a; 3-c Ȋntrebarea 5 Care dintre următoarele tipuri de HS de tip IV nu are echivalent la om? a). Hipersensibilitatea tuberculinică b).Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote; c). Hipersensibilitatea de contact d). Hipersensibilitatea granulomatoasă

18. 14. Hipersensibilitatea de tip V În cadrul acestui tip de reacţie fiziopatologică, anticorpii nu se ataşează de structurile celulare de suprafaţă ci de receptori membranari, împiedică aderarea liganzilor specifici acelor receptori („mimează” efectul ligandului). În aceste condiţii, semnalizarea celulară este compromisă, iar funcţia celulei respective este alterată sau inhibată. Acest tip de HS este întâlnit în boala Graves (Basedow) şi miastenia gravis. Boala Graves, o afecţiune a glandei tiroide (guşă exoftalmică, tegument cu aspect de „coajă de portocală”, hipertiroidism) a fost considerată o boală autoimună, în care organismul produce autoanticorpi anti-receptor pentru hormonul tireotrop (TSH) şi autoanticorpi anti-tiroxină şi anti-tireoglobulină (mecanismul nu a fost elucidat complet). Celulele foliculare tiroidiene (prezintă pe suprafaţă receptori pentru TSH), sunt stimulate atât fiziologic de către hormonul hipozar, cât şi patologic, de către autoanticorpii (de tip IgG) care „imită” structura şi funcţiile TSH. Această dublă stimulare conduce la o hipersecreţie de hormoni tiroidieni (T3 şi T4), putând provoca tireotoxicoză. Simptomele din hipertiroidism pot fi, parţial, explicate de către aceste mecanisme. De exemplu, exoftalmia poate fi explicată prin faptul că atât glanda tiroidă şi muşchii externi ai globului ocular prezintă un Ag comun care este recunoscut de către auto-Ac; rezultă un proces inflamator retroocular şi protruzia globilor oculari. Aspectul de „coajă de portocală” al pielii se datorează infiltrării de Ac subcutanat, determinând un proces inflamator la acest nivel. Miastenia gravis este o boală neuromusculară caracterizată clinic prin hipotonie musculară intermitentă (accentuată în efort, ameliorată în repaus) şi oboseală musculară. Mecanismul de producere este autoimun, prin blocarea receptorilor de tip N (nicotinic) ai acetilcolinei de către auto-Ac circulanţi, care ajung la nivelul joncţiunii musculare post-sinaptice.

19. Reacţii antigen - anticorp utilizate în microbiologie 19. 1. Mecanism general 219

Reacţia antigen-anticorp este o reacţie între un antigen (Ag) şi un anticorp (Ac) şi constă în legarea grupării determinante de pe suprafaţa antigenului (epitop - o „proeminenţă”) cu situsul de combinare de pe suprafaţa anticorpului (paratop - o „adâncitură”). (Figura nr. 1) Reacţia Ag-Ac are 2 proprietăţi principale, specificitatea şi reversibilitatea. Specificitatea se referă la faptul că un antigen nu este recunoscut decât de anticorpii care au fost produşi în urma inoculării respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc decât antigenul faţă de care au apărut. Trebuie menţionat că specificitatea nu este absolută, întrucât un Ag cu reactivitate încrucişată, poate reacţiona cu un Ac format faţă de un alt antigen (reacţia încrucişată se explică prin aceea că anumite Ag posedă anumite grupări determinante comune). Reversibilitatea complexului Ag-Ac se datorează faptului că legăturile necovalente sunt reversibile la cald sau pH acid (20-24o C; b. Hiperglicemia; c. Hiperlipoproteinemia (în special chilomicronii); d. Hipofibrinogenemia; e. Policitemia; f. Leucocitoza; g. Prezenţa de eritrocite anormale: microcite, drepanocite, echinocite, poichilocite, stomatocite, acantocite, sferocite (prin scăderea suprafeţei necesare pentru agregarea hematiilor); h. Caşexia; i. Medicamentele: aspirină, aur, corticotropină, ciclofosfamidă, glucocorticoizi, hidroxiclorochină, metotrexat, antiinflamatorii nesteroidiene, penicilamină, sulfasalazină, tamoxifen, trimetoprim etc. Concomitent, macrofagele dezvoltă o serie de activităţi şi anume: pregătesc superantigenul, eliberează în circulaţie monokine şi îşi expun (la suprafaţa membranei) Ag HLA de clasa a II-a (vezi și capitolul 11). (Figurile nr. 4 și 5)

24. 2. Procesul infecţios Infecţia reprezintă un tip particular de relaţie între microorganismele condiţionat patogene şi patogene pe de o parte şi organismul gazdă pe de altă parte. Pentru ca să se declanşeze un proces infecţios şi să apară infecţia, microorganismele trebuie să pătrundă în organismul gazdă, să depăşească barierele şi mecanismele de apărare, să-l colonizeze, să se multiplice şi eventual să intre într-un lanţ de transmitere prin intermediul căruia poate contamina o nouă gazdă. Procesul infecţios defineşte ansamblul relaţiilor stabilite între microorganism şi gazdă, apărute după infecţie. Starea de boală (manifestă clinic sau fără ca modificările apărute să fie exteriorizate şi constatabile de către medicul clinician) se datoreşte interacţiunii dintre microorganism (bacterie, parazit, virus, fung, prion) - gazdă şi este urmată de apariţia unor simptome (de ex. temperatură peste 39ºC, cefalee, eliminarea unor scaune diareice etc.) şi de reacţii funcţionale din partea gazdei (de ex. stare generală modificată, senzaţie de febră, frisoane, creşterea numărului de respiraţii pe minut, creşterea numărului de bătăi cardiace pe minut etc). Infecţia nu este urmată obligatoriu de starea de boală, putând fi inaparentă, subclinică sau latentă. Poate apărea şi starea de purtător şi / sau eliminator de germeni. Datorită infecţiei pot apărea, sau nu, manifestări foarte variate în funcţie de: - agentul infecţios (factori de patogenitate, gradul de virulenţă); - organismul gazdă (rezistenţa specifică şi nespecifică); - mediul extern (factori geografici, climatici, sociali, economici etc). Manifestări subclinice a) Infecţia inaparentă nu se asociază cu semne sau simptome şi ar putea fi decelată numai prin examene de laborator. Spre deosebire de infecţia latentă, infecţia inaparentă este limitată în timp şi poate contribui la crearea unei stări de imunitate (ex. infecţia cu Neisseria meningitidis, infecţii cu Haemophilus influenzae etc). 248

b) Boala subclinică se deosebeşte de infecţia inaparentă prin apariţia unor tulburări funcţionale (febră, transpiraţii, dureri etc) şi chiar a unor leziuni organice (de multe ori fără o simptomatologie distinctă / specifică, dar există şi situaţii în care nu este decelat nici un simptom, de exemplu în formele subclinice de hepatită virală acută). c) Infecţia latentă este asimptomatică, agenţii patogeni putând persista timp îndelungat în ţesuturile gazdei. După un timp variabil, infecţia latentă poate deveni evidentă clinic, de obicei în urma acţiunii unor factori favorizanţi externi sau interni, proprii organismului (de exemplu infecţia cu Mycobacterium tuberculosis care este un microorganism condiţionat patogen, infectează circa o treime din populaţia globului dar produce tuberculoză la circa 8 milioane de persoane, pe an). d) Starea de purtător de germeni se referă la bolnavul cu o stare infecţioasă, la persoana aflată în convalescenţă, înainte de „eradicarea” infecţiei suferite dar şi la persoanele aparent sănătoase care adăpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la nivelul veziculei biliare, microorganismul putându-se „cantona” la acest nivel după o febră tifoidă). Starea de purtător reprezintă atingerea unui echilibru relativ între cele două verigi, de multe ori fiind însoţită de eliminarea în mediu a germenilor care au produs infecţia şi se află în diferite focare latente (precum în exemplul de mai sus, situaţie în care starea de purtător se elimină doar prin extirparea veziculei biliare). De exemplu, în ţara noastră apar din când în când izbucniri epidemice („outbreak”) de febră tifoidă, după inundaţii, dacă în zona respectivă există un purtător de S. typhi, iar condiţiile igienico-sanitare pentru prevenirea transmiterii pe calea fecal-orală nu sunt respectate. În cursul stării de purtător există teste biologice şi imunologice care pot certifica prezenţa microorganismelor (direct, de ex. după cultivare sau amplificare genică şi / sau indirect). Manifestări clinice a) Infecţia locală, în care agenţii patogeni rămân cantonaţi la poarta de intrare şi în vecinătatea acesteia, unde se multiplică (de exemplu în furunculul stafilococic, infecţia amigdaliană produsă de streptococul piogen). b) Infecţia de focar este o formă particulară a infecţiei locale. Evoluează cronic, cu manifestări locale minime (acestea putând chiar lipsi), adesea însă cu tulburări la distanţă (subfebrilitate, mialgii, artralgii etc.) a căror apariţie încă nu a fost complet explicată. c) Infecţia regională cuprinde un teritoriu mai extins, de obicei aferent porţii de intrare, prin afectarea vaselor limfatice şi a ganglionilor limfatici regionali (de exemplu, infecţia tuberculoasă, cu producerea de manifestări anatomo-clinice şi paraclinice relativ caracteristice). d) Boala infecţioasă cu manifestări clinice la nivelul întregului organism (sistemice), în care germenii patogeni diseminează pe cale circulatorie (bacteriemie) în diferite ţesuturi şi organe, la distanţă de poarta de intrare sau de focarul infecţios primar. Se descriu două forme: - boala infecţioasă ciclică, cu evoluţie regulată, în mai multe etape care se succed într-un timp limitat, de exemplu febra tifoidă produsă de S. typhi. - septicemia (conform nomenclaturii mai vechi) are evoluţie clinică neregulată, de obicei foarte gravă, fiind definită prin existenţa unei porţi de intrare, a unui focar septic (detectat sau suspectat), bacteriemiei şi a unor „metastaze” septice care pot deveni focare secundare; din focarele secundare au loc descărcări secundate de germeni în circulaţie. Drept bacteriemie definim prezenţa pasageră de germeni viabili în sânge. Bacteriemia nu duce, de regulă, la apariţia de metastaze septice şi nici la apariţia unui tablou clinic manifest. Bacteriemii pot apare de ex. după extracţii dentare sau intervenţii chirurgicale pe focare septice, ca şi în multe dintre bolile infecţioase (exemplu în pneumonia cu pneumococ, meningita cu meningococ etc; se explică astfel utilitatea recoltării de sânge 249

pentru hemocultură, cu toate că produsul patologic „principal” este reprezentat de spută în primul caz şi lichid cefalorahidian în al doilea caz). În momentul de faţă, s-a decis utilizarea noţiunii de sepsis, entitate care reuneşte existenţa unui proces infecţios şi respectiv existenţa răspunsului inflamator sistemic. Starea de sepsis include prin definiţie două sau mai multe din următoarele elemente: 

febră (peste 38°C) şi frisoane, sau hipotermie (sub 36°C);



tahicardie (bătăi cardiace peste 90/minut);



polipnee (peste 20 respiraţii / minut) cu hiperventilaţie sau Pa CO2sub 32 mmHg;

leucocitoză peste 12.000 / mm3sau leucopenie sub 4.000 / mm3, cu forme tinere în circulaţia periferică (peste 10%), respectiv deplasarea la stânga a formulei leucocitare. 

Sindromul septic reuneşte sepsisul şi modificările circulatorii şi funcţionale la nivelul diferitelor organe şi sisteme, care conduc la hipoxemie, oligurie, alterări psihice etc. Şocul septic evoluează cu hipotensiune (presiunea sistolică scade cu peste 40 mmHg faţă de nivelul bazal) şi sepsis sever. Sindromul de disfuncţie multiorganică (MODS, Multiorgan Dysfunction Syndrome) reprezintă ultimul şi cel mai grav stadiu evolutiv, cu letalitate mai mare de 80%; este un sindrom clinic, cu apariţia insuficienţei la 2 sau mai multe organe sau sisteme. Agresiunea microbiană declanşează un răspuns inflamator sistemic, care aşa cum a fost prezentat anterior, din mecanism de apărare poate deveni un fenomen de autodistrugere. După aspectul evolutiv, bolile infecţioase pot fi: - acute şi - cronice (persistente), atunci când agentul patogen persistă şi acţionează vreme îndelungată în ţesuturile gazdei, de exemplu în bruceloză. Poarta de intrare Pentru a produce infecţia (după parcurgerea etapelor menţionate anterior privind „definiţia” infecţiei) şi a invada organismul gazdă după multiplicare sau prin intermediul unor produse toxice specifice (ex. exotoxine), fiecare microorganism patogen utilizează una sau mai multe căi de pătrundere. Spre exemplu, vibrionul holeric (Vibrio cholerae) pătrunde pe cale digestivă (ex. consum de apă contaminată), se multiplică şi produce manifestările caracteristice la nivel intestinal (rolul esenţial revenind toxinei holerice) etc. Difuzarea în organism a microorganismului patogen de la poarta de intrare se realizează în diferite moduri şi pe mai multe căi: - extindere locală în suprafaţă, ex. în cazul erizipelului produs de streptococul beta-hemolitic de grup A; - extindere în profunzime, ex. în miozita produsă de Clostridium spp. (C. septicum, sporogenes, histolyticum etc.); - extindere regională; - diseminare sanguină, de exemplu în febra tifoidă (produsă de Salmonella typhi); - diseminare pe cale nervoasă, de exemplu în infecţia cu virusul rabic. Perioadele bolii infecţioase: - Incubaţia reprezintă intervalul de timp din momentul infectării până la apariţia primelor semne şi simptome 250

ale bolii; durata incubaţiei variază în limite relativ stabile (ex. 1-5 zile în dizenterie, circa 14 zile în febra tifoidă); - Invazia este de obicei concomitentă cu debutul bolii, care poate fi brusc (în plină stare de sănătate) sau lent progresiv; în momentul invaziei este posibil să „surprindem” prezenţa bacteriemiei (recoltăm sânge pentru hemocultură); - Perioada de stare se caracterizează prin manifestările esenţiale şi deseori caracteristice ale bolii; - Încheierea evoluţiei bolii, care se poate face prin: 1. convalescenţă, în care boala clinică a încetat şi organismul îşi recapătă treptat capacitatea de apărare şi revine la starea anterioară bolii infecţioase respective; 2. vindecare, urmată de stabilirea unui grad de imunitate; în unele cazuri imunitatea este de durată, chiar şi pentru tot restul vieţii; instalarea răspunsului imun, precum şi statusul imun în relaţie cu un anumit microorganism / produs al acestuia, pot fi dovedite prin teste de laborator (reacţii antigen-anticorp); pentru unele entităţi este stabilit nivelul de protecţie (de ex. prezenţa anticorpilor în valoare de 0.01 UAI/mLasigură protecţie faţă de apariţia tetanosului); 3. cronicizare (uneori prin atingerea unui echilibru microorganism şi gazdă; în alte situaţii cronicizarea poate crea probleme importante) sau 4. exitus, fie datorită agresivităţii (virulenţei) particulare a tulpinii bacteriene implicate, fie datorită incapacităţii organismului de a reacţiona în mod eficient.

24. 3. Povestiri adevărate 24. 3. 1. Artrita gonococică O pacientă în vârstă de 21 ani se prezintă la camera de gardă cu durere la nivelul articulaţiei mâinii drepte evoluând de circa 36 de ore. Anamneza nu a identificat existenţa unor traumatisme sau a unui efort fizic deosebit, care să justifice prezenţa acestor dureri. Medicul de gardă a indicat efectuarea unei radiografii a articulaţiei mâinii. Rezultatul radiografic nu a pus în evidenţă aspecte patologice. Concluzia medicului examinator a fost că este vorba de o entorsă (chiar şi în lipsa datelor anamnestice), a aplicat o faşă gipsată şi a indicat tinerei să ia un medicament antiinflamator (diclofenac), pe cale orală (2 × 50 mg / zi, timp de 5 zile) şi să revină, la nevoie, pentru reevaluare. La circa 48 de ore de la debutul durerii în articulaţia mâinii drepte, pacienta a decis să revină la camera de gardă pentru că prezenta lipsa poftei de mâncare, ameţeli şi senzaţie de febră. Termometrizarea a arătat că pacienta are, într-adevăr, febră (38,3°C). Discuţia cu pacienta şi examenul clinic au permis înregistrarea următoarelor date: pacienta nu a avut greţuri, vărsături, tulburări de tranzit intestinal şi nici semne care să poată fi încadrate într-un sindrom meningean; erau prezente edem (umflătură) de culoare uşor eritematoasă (roşiatică) al articulaţiei mâinii drepte, căldură la nivelul acestei articulaţii (în comparaţie cu articulaţia simetrică), dificultate în utilizarea mâinii; la nivel palmar, bilateral, a fost pusă în evidenţă o erupţie cu mai multe elemente de culoare violacee, dureroase spontan şi la palpare. De această dată, medicul clinician a luat în considerare mai multe variante de diagnostic. Totuşi, o parte dintre supoziţii au putut fi eliminate relativ uşor (reumatism articular acut, lupus eritematos diseminat) în timp ce datele obţinute în cadrul unei anamneze mai riguros realizate (dar şi în contextul în care pacienta, îngrijorată de condiţia fizică personală, a fost de acord să ofere date suplimentare) au permis restrângerea ipotezelor la o 251

reacţie în cadrul unei infecţii care a fost transmisă pe cale sexuală. Examenul ginecologic a evidenţiat congestie şi eritem la nivelul colului uterin şi leucoree (secreţie abundentă la nivel vaginal, cu aspect purulent). S-a recoltat secreţia vaginală dar s-a realizat şi o recoltare cu un tampon fin, de la nivelul endocolului (tamponul a fost introdus în endocol pe o distanţă de circa 1,5-2 cm). S-a administrat „tratamentul minut” recomandat în unele dintre infecţiile cu transmitere sexuală, respectiv ceftriaxonă (o doză, 250 mg, injectabil, intramuscular). Examenul microscopic a relevat numeroase leucocite PMN în secreţia genitală şi un număr mai mic de PMN pe frotiul din produsul recoltat de la nivelul endocolului. Pacientei i s-a recomandat o internare de scurtă durată, ceea ce a acceptat. După 36 ore, medicul de gardă din laboratorul de microbiologie clinică, examinând cultura din secreţia vaginală a realizat frotiuri, a executat textul oxidazei şi testul superoxol şi a început testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice. Diagnosticul microbiologic a fost infecţie cu Neisseria gonorrhoeae, iar diagnosticul final a fost cel de artrită gonococică. Rezultatul testării sensibilităţii la antibiotice (antibiograma difuzimetrică standardizată) a demonstrat o tulpină cu sensibilitate la majoritate antibioticelor şi chimioterapicelor testate, inclusiv la penicilină. Pentru mai multă siguranţă, deşi în literatură a fost descris faptul că „tratamentul minut” este eficient, s-a prescris penicilină G, 1 doză la 12 ore, timp de 10 zile. În a treia zi de la internare, starea generală a pacientei era bună, durerea articulară diminuase semnificativ, edemul şi erupţia erau abia perceptibile, curba febrilă a înregistrat valori normale iar pofta de mâncare a revenit. Comentarii cu privire la caz Există statistici în literatura de specialitate internaţională care consideră că artrita gonococică reprezintă una dintre cele mai frecvente cauze de artrită inflamatorie localizată la o singură articulaţie, la tineri. Nu există date statistice relevante la nivel naţional. În aceste condiţii, trebuie să luăm în seamă datele puse la dispoziţie cu generozitate de CDC (Center for Diseases Control and Prevention); pe site-ul CDC se discută că 3% dintre cazurile de infecţie gonococică sunt însoţite de diseminarea N. gonorrhoeae, mai frecvent la femei decât la bărbaţi. Infecţia gonococică se poate însoţi de diseminare, indiferent de calea de pătrundere. Ca şi în cazul meningitei produsă de meningococ, un factor de risc este reprezentat de deficienţe ale sistemului complement. Sindromul infecţiei gonococice diseminate include în mod clasic: dermatită, sinovită, artrită migratorie („prinzând” eventual mai multe articulaţii). În funcţie de localizare, diagnosticul microbiologic se poate pozitiva după cultivarea unor produse recoltate de la nivel genital, de la nivel articular sau poate fi vorba de sânge. O problemă care poate apărea este legată de tulpinile de gonococ rezistente la antibiotice şi chimioterapice, ceea ce nu a fost constatat în această situaţie. 24. 3. 2. Antibioterapia în unele afecţiuni fără etiologie microbiană - o eroare discutabilă? În anumite circumstanţe, abilitatea de a institui antibioterapia în scop profilactic poate fi considerată salutară. Un astfel de exemplu îl constituie administrarea de antibiotice locale în afecţiunile oculare acute de natură neprecizată (infecţioasă sau inflamatorie) care necesită intervenire de urgenţă, acest tratament salvând, de multe ori, vederea pacientului. Totuşi, de cele mai multe ori, antibioticele locale (topice) sunt folosite în scop preventiv sau profilactic în terapia oculară primară, fără ca acest lucru să fie necesar. 252

Este demonstrat statistic faptul că aproape toate keratoconjunctivitele la adulţi sunt de origine inflamatorie şi nu infecţioasă. Prin urmare, tratamentul local cu corticosteroizi reprezintă alegerea adecvată. În comunitatea medicală există tendinţa de a limita prescrierea antibioticelor topice, în speranţa încetinirii apariţiei fenomenului de rezistenţă la medicamentele antimicrobiene. În prezent, cea mai frecventă indicaţie pentru prescrierea unui antibiotic într-o afecţiune oculară acută este reprezentată de către secreţia mucopurulentă la acest nivel, cu recomandarea recoltării secreţiei respective şi realizarea diagnosticului microbiologic direct, înainte de administrarea oricărui alt medicament. Trebuie menţionat faptul că marea majoritate a presupuselor ulceraţii corneene nu sunt altceva decât infiltrate leucocitare sterile, care în nici un caz nu justifică administrarea de medicamente antimicrobiene. Este uimitor însă faptul că „tratamentul” cel mai frecvent al acestora se face cu antibiotice locale! 24. 3. 3. Urmări ale unei inflamaţii în legătură cu sepsisul bacterian Este luată în discuţie situaţia unei paciente cu endocardită infecţioasă în antecedente, la care, în urma unei intervenţii stomatologice (moment în care a primit profilaxie cu antibiotice) a apărut o osteită la nivel mandibular. Această descriere are relevanţă pentru mai multe aspecte care pot fi luate în discuţie, pornind de la sepsisul cu germeni Gram-negativi şi continuând cu utilizarea corectă a antibioticelor şi chimioterapicelor, inclusiv situaţia în care gestul chirurgical reprezintă alegerea optimă. De asemenea, este exemplificată o urmare a fenomenului inflamator. O pacientă în vârstă de 59 de ani s-a aflat în supravegherea unei clinici cu specific de boli infecţioase datorită unei afecţiuni valvulare pe care s-a grefat în urmă cu câţiva ani un proces infecţios. Într-o perioadă de câţiva ani, pacienta a necesitat mai multe controale sau intervenţii stomatologice şi în câteva dintre aceste cazuri a primit antibiotice, datorită faptului că intervenţiile au fost „sângerânde”. Cu toate acestea, în urma uneia dintre aceste intervenţii (timp în care a primit o cefalosporină cu spectru lărgit), la câteva zile de la intervenţie pacienta a început să prezinte febră (38,8ºC), transpiraţii, oboseală şi dureri la nivelul toracelui. Numai după încă o săptămână a decis să se adreseze spitalului (necăjită datorită prea multelor spitalizări din ultimii ani), iar la camera de gardă i s-a propus internarea, ceea ce pacienta a acceptat. Atitudinea a fost corectă şi susţinută de datele anamnestice, pentru că în urmă cu circa 3 ani pacienta mai fusese internată în spitalul de profil, iar diagnosticul la acea dată a fost cel de sepsis cu Enterobacterspp., ca urmare a unei extracţii dentare (şi de acea dată pacienta a primit antibiotice, dar tulpina izolată s-a dovedit a fi rezistentă la toate medicamentele beta-lactamice care au fost testate prin antibiogramă difuzimetrică standardizată, inclusiv la medicamentele administrate profilactic). La internare, tensiunea arterială era în limite normale, dar auscultator medicul de gardă a detectat suflu sistolic atât în focarul mitral cât şi în focarul tricuspidian, iar după câteva ore de la internare, la contravizită, au putut să fie auscultate frecături pericardice. Datele de laborator obţinute în regim de urgenţă au relevat leucocitoză (15.850/μl) cu neutrofilie (10.900 PMN/μl), valori crescute ale reactanţilor de fază acută (proteină C reactivă 6mg/l, VSH 112 mm/oră, fibrinogen 526 mg/dl) şi anemie (nr. hematii 3,1×106/μl). A fost recoltat sânge pentru trei hemoculturi incubate atât în aerobioză cât şi în anaerobioză. Prima hemocultură a fost recoltată imediat după internare. În două dintre cele trei hemoculturi a fost izolat Enterobacterspp., tulpină care s-a dovedit sensibilă la ampicilină, gentamicină, amikacină, ciprofloxacină, carbenicilină şi asocierea piperacilinătazobactam. S-a decis instituirea unui tratament cu ampicilină plus gentamicină, pentru o durată de 3 săptămâni. Nu a fost utilizată ampicilina în monoterapie, fiind cunoscut faptul că într-o astfel de eventualitate ar fi fost posibilă dezvoltarea rezistenţei nu numai faţă de acest antibiotic dar şi faţă de alte antibiotice (ex. 253

piperacilină). Temperatura a rămas ridicată, iar pacienta a menţionat că simptomele nu se ameliorează, în cursul primelor două săptămâni de terapie. Reactanţii de fază acută au diminuat ca valoare, menţinându-se însă peste valorile normale. Examenul clinic realizat (repetat) de către medicul stomatolog al unităţii nu a revelat o afecţiune care să pară a fi în legătură cu evoluţia insuficient de favorabilă, sub tratament. Totuşi, după ce mandibula a fost examinată radiologic, cu foarte multă atenţie, a fost remarcată o situaţie patologică şi s-a presupus existenţa unui granulom care nu era cunoscut anterior. Luând în calcul aceste noi informaţii şi solicitând un examen de specialitate la o clinică universitară cu profil stomatologic, s-a decis extracţia dintelui situat în vecinătatea granulomului respectiv, chiuretarea zonei şi asanarea presupusului focar de infecţie. Intervenţia stomatologică a avut rezultate foarte bune, după 14 ore de la aceasta constatându-se diminuarea temperaturii. În următoarele 2-3 zile simptomele s-au ameliorat semnificativ. S-a decis continuarea tratamentului antibiotic în aşa fel încât durata totală să fie de 4 săptămâni. După a treia săptămână de tratament probele biologice au revenit la valori normale, starea generală a fost considerată ca fiind bună iar după patru săptămâni de tratament pacienta a fost externată, vindecată. 24. 3. 4. Răspunsul tegumentului la injurii Când pielea este rănită, un Ag necunoscut îşi găseşte expresia în keratinocitele deteriorate. Celulele gammadelta T învecinate se grupează şi contribuie la vindecarea rănii prin producerea, pe plan local, de factori epiteliali de creştere şi citokine inflamatoare. Ȋn absenţa celulelor gamma-delta T ale pielii, vindecarea rănilor este împiedicată (5). În mod tradiţional, keratinocitele au fost considerate drept constituenţi inerţi ai epidermului cu mai multe straturi. Conceptul actual s-a modificat în mod fundamental. Keratinocitul este recunoscut azi ca un ”jucător activ” în reînnoirea epidermului şi având funcţii cheie în apărarea imună a pielii. În condiţii homeostatice, se presupune că celulele generatoare de keratinocite se divizează în mod simetric sau asimetric, ceea ce înseamnă că ele continuă să prolifereze sau continuă să se diferenţieze în formă definitivă constituind epiderma de suprafaţă. Procesul fin de reînnoire a epidermului se bazează pe o reţea extraordinară de cascade semnalizatoare care sunt guvernate de interacţiunile receptorului keratinocitului cu mediul înconjurător prin circuitele paracrine si autocrine. Opuse acestui proces homeostatic coordonat sunt semnalele de rănire şi inflamare. Ele modifică soarta keratinocitului şi răspunsul său la mediul înconjurător prin alterarea moleculelor de adeziune şi receptorii de suprafaţă, prin completarea declanşării unui răspuns inflamator imediat al keratinocitului, prin secreţia de citokine, chemokine şi peptide antimicrobiene. Dacă nu sunt controlate, modificările fundamentale impuse de rănire şi inflamare asupra programului homeostatic, pot conduce la leziuni severe ale pielii inclusiv disfuncţii inflamatorii cronice (6). De asemenea Factorul de creştere a hepatocitului (HGFA) este cunoscut a avea importanţă majoră în morfogeneza ţesuturilor, în regenerare şi în progresul tumorilor, prin receptorii săi, MET. În vivo, HGFA activează, de asemenea, proteina stimulatoare de macrofage, care prin receptorii săi RON, are roluri în recrutarea macrofagelor, declanşarea procesului infecţios, supravieţuirea celulelor şi vindecarea rănilor. Prin urmare, activitatea pericelulară a HGFA poate constitui un factor important de reglare a activităţilor citokinelor multifunctionale în vivo. (7) 24. 3. 7. Posibile terapii în şocul septic Șocul septic determină imunosupresie. De aici usurința unor suprainfecții cu germeni condiționat patogeni sau cu tulpini multirezistente, precum: Stenotrophomonas spp., Acinetobacter spp., Candida spp., Pseudomonas 254

spp., Enterococcus spp, citomegalovirusuri etc. Mecanismele prin care conduc la imunosupresie sunt variate: induc depleția celulelor sistemului imun prin apoptoza acestora, suprimă exprimarea MHC II, induc supraexpresia citokinelor antiiinflamatorii și a moleculelor co-stimulatoare negative, cresc numărul de LTs. Privind din acest unghi, prevenția imunosupresiei induse de sepis devine o prioritate în tratamentul acestei entitati. Vom parcurge acum câteva terapii propuse de oamenii de știință. PD-1 (programed death 1) este o proteină de origine macrofagică, co-stimulatoare negativă, a cărei sinteză creste în infecția HIV, concomitent cu a ligandului său, PDL-1. PD-1 scade capacitatea de apărare a organismului prin inducerea apoptozei, prin creșterea sintezei de IL-10 (antiinflamatoare), prin impiedicarea proliferării LT, pe care le face neresponsive. S-a încercat blocarea PD-1 cu rezultate promițătoare în cazul infecțiilor fungice și a sepsisului bacterian (în experimentele pe șoareci). Și-au dovedit eficiența și imunostimulatoarele, precum: IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte–macrophage colony-stimulating factor)și G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor). Au fost rezerve în legătura cu posibilitatea inducerii unei boli autoimune sau a hiperinflamației. Acest lucru se pare că nu se produce pentru că rezervele organismului sunt mult prea scăzute. Il-7 și Il-15 sunt citokine antiiapoptotice și imunostimulatoare care și-au demonstrat eficiența pe animale de laborator. Il-7 restaurează funcția limfocitelor și îmbunătățește migrarea limfocitară prin creșterea activității integrinelor. Folosirea IL-7 ca medicament este deja în fază de ”trialuri clinice” pentru cancer și infecție cu VHC și HIV. S-ar putea folosi flow-citometria pentru cuantificarea moleculelor co-stimulatoare sau proba de stimulare totală a secreției citokinice (rapid whole-blood stimulation assays of cytokine secretion). (8) 24. 3. 6. Farmacogenomică? Aţi mai auzit termenul acesta? Dar farmacogenetică? Credeţi că există vreo diferenţă? Si dacă da, ce legătură au ele cu inflamaţia? Să vedem. S-a estimat că genele sunt responsabile de 20-95% din variabilitatea interpersonală cu privire la răspunsul la medicamente. Primele investigaţii pe această latură au fost făcute în 1950, constituind baza farmacogeneticii, iar mai apoi, a farmacogenomicii. Termenii sunt parţial sinonimi. Farmagenomica studiază efectul unui medicament în relaţie cu întregul genom, în timp ce farmacogenetica, în relaţie cu o singură genă sau cu un anume set de gene. Principala ocupaţie actuală a farmacogenomicii şi a farmacogeneticii este detecţia unui „profil de risc”, ce va permite probabil, 2 eventualități: 

identificarea precoce a indivizilor susceptibili la o boală, cu aplicaţii în prevenţie şi tratament



dezvoltarea unor metode care să amelioreze progresia bolii.

Să luăm un caz ... alegem... boala Alzheimer. Bine, bine....dar ”Alzheimer-ul acesta” nu e o boală neurologică? Da, foarte bine. Ȋnsă, ca și în situația multor altor boli, astăzi i se recunoaşte şi o componentă inflamatorie. Iată cȃteva argumente pentru a susţine componenta de inflamaţie cronică a bolii degenerative Alzheimer: Unii se bazează pe dovezi terapeutice, respectiv pe faptul că AINS ameliorează evoluţia (în special AINS de tipul ibuprofen, indometacin, sulindac) 255

Alţii se bazează pe markeri biologici, arătând că PCR este crescută, cu valori în cele 3 quartile superioare ale valorilor, cu 25 ani înaintea diagnosticului bolii. Sunt luate în discuție și teste genetice, spre exemplu mutaţia genei M694 pentru gena Pyrin, care reprezintă un factor de risc pentru boala Alzheimer pentru populaţia reprezentativă >65 ani din Italia. Şi se pare că este factor de risc şi pentru alte boli, cum ar fi infarctul miocardic. Iată şi cȃteva exemple concrete ale farmacogeneticii/farmacogenomicii în cadrul bolii Alzheimer, luate ca exemplu (nu poate fi o abordare exhaustivă). Asocierea dintre genotipul ApoE şi boala Alzheimer reprezintă una din întrebările ştiintifice ridicate de dezvoltarea farmacogenomicii. Dar genotipul nu este numai „profil de risc”, ci şi indiciu terapeutic. Tacrina (inhibitor de acetilcolinesteraza) se pare că încetineşte progresia bolii pentru cei care nu sunt homozigoţi pentru ApoE4. Pe de altă parte, există şi studii cu rezultate negative privind valoarea predictivă a genotipului ApoE. Un al doilea exemplu relevant este cel al promotorului sintezei 5-LO. Ȋn urmă cu câţiva ani s-a observat că inhibitorii căii lipooxigenazei aveau efect numai pentru unii pacienţi, variabilitate în strȃnsă legatură cu polimorfismul 5-LO. S-a tras concluzia că putem stabili un tratament diferenţial, în funcţie de genotipul pacientului, concluzie extrapolată de la astm la boala Alzheimer. Un alt exemplu se referă la polimorfismul TLR4, receptor ce se pare că este implicat in fiziopatologia bolii Alzheimer şi care ar putea fi folosit pentru înţelegerea rolului profilaxiei cu antibiotice în acest caz. (9)

24. 4. Verificaţi-vă cunoştinţele Alegeți A dacă 1, 2, 3 sunt adevărate; B dacă 1, 3 sunt adevărate; C dacă 2, 4 sunt adevărate; D dacă 4 este adevărat, E dacă toate sunt adevărate (mențiunea este valabilă pentru primele 2 întrebări) Ȋntrebarea 1: Următoarele evenimente au loc în cazul declanşării unui răspuns inflamator: 1).Modificări la nivelul microcirculaţiei, cu creşterea calibrului vascular. 2).Creşterea permeabilităţii vaselor mici şi scăderea vitezei de circulaţie (stază). 3).Modificări ale hemostazei şi respectiv marginaţia, diapedeza, migrarea leucocitelor. 4).Creşterea vitezei de circulaţie şi scăderea riscului trombotic. Ȋntrebarea 2: Sunt false următoarele afirmaţii: 1).Febra este o dovadă a alterării sistemului imun. 2).Diferitele particularităţi structurale ale organismului gazdă sau ale unui anumit ţesut ar putea explica (parţial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de către acelaşi agent etiologic. 3).Rezultatul detectabil prin metode de laborator al etapei de vindecare este eliberarea unor factori chemotactici, a unor proteaze şi kinaze. 4).Modificările fiziopatologice apar independent de cauza inflamaţiei sau, cu alte cuvinte, indiferent de „agentul determinant”.

256

Alegeţi doar un răspuns corect: Ȋntrebarea 3: A).Hipertermia, spre deosebire de febră, nu presupune un nou punct de echilibru, ci depăşirea capacităţii de termoreglare. B).Persoanele mai în vȃrstă au o abilitate scăzutăde a genera caldură, astfel că o temperatură nu foarte crescutăne pune în situaţia de a sta liniştiţi, vȃrstnicul respectiv nu are sigur nici un proces inflamator în derulare în organism. C).Ȋn mare, vorbim de febră între 37-38°C şi de subfebră peste 38°C. D).Cel mai fidel loc de preluare a temperaturii corporale este axila. E).Infecţiile generalizate superficiale nu pot genera febră. Ȋntrebarea 4: A).Fibrinogenul va fi mereu normal într-o inflamaţie de orice etiologie. B).PCR este secretată de către adipocite și ficat în mod fiziologic, însă valori mai mari de 1mg/dL indică existenţa unui proces inflamator. C).VSH-ul este un test diagnostic pentru infecţie localizată sau generalizată. D).VSH-ul reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sȃnge coagulat, într-o oră. E).Ceruloplasmina şi amiloidul P seric nu sunt RFA (reactanţi de faza acută). Ȋntrebarea 5: A).Coccii piogeni, precum Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis nu pot provoca inflamaţii exsudative purulente. B).Inflamaţiile fibroase, care reprezintă acumularea de fibrinogen, cu apariţia fibrinei şi formarea de depozite care se organizează şi duc la apariţia „aderenţelor”, nu apar în pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, în dizenteria bacteriană, în miocardita difterică. C).Vindecarea propriu-zisă începe tardiv în cursul procesului inflamator. D).Inflamaţii proliferative, având ca formă particulară granulomul, de aspect nodular, apar în infecţia cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, infecția cu diferite specii de Brucella sau datorate prezenţei unui corp străin. E).Ȋn miocardita difterică sau în miozita produsă de Clostridium spp predomină procesele distrofice şi necrobiotice, care corespund inflamației seroase.

25. Toleranța imună 25. 1. Introducere Definiţie: Toleranţa imună reprezintă lipsa răspunsului imunologic indusă de prezentarea unui antigen la celulele imunologic competente. 257

Toleranţa imunologică reprezintă un proces complex, încă incomplet studiat, ce este intricat cu procesul de maturare a celulelor imunităţii adaptative. Pentru a menţine homeostazia imunologică, indivizii trebuie să fie aresponsivi faţă de antigenele proprii (numite self). Limfocitele activate de auto-antigene se distrug (inducţia apoptozei - proces cunoscut şi sub numele de "moarte celulară programată"), sunt inactivate (inducţia anergiei) sau îşi schimbă specificitatea (Figura 1.)

258

Figura 1. Schemă generală reprezentând posibilile mecanisme de inactivare a limfocitelor autoreactive, la nivelul organelor limfocitare centrale cât şi în periferie. Celulele sistemului limfocitar provin dintr-o populaţie suşă (stem), comună

259

limfocitelor T şi B, ce îşi are sediul în măduva hematogenă. Limfocitele T migrează în timus pentru a continua dezvoltarea. Ambele seturi limfocitare sunt expuse la antigene self, pentru care unele din aceste celule prezintă receptori. Acestea au potenţial auto-reactiv, astfel încât, fără mecanisme de reglare, ar putea duce la apariţia unor boli autoimune. Mecanismele implicate în reglarea răspunsului limfocitar sunt: apoptoza, anergia, editarea de receptori, generarea de limfocite reglatorii şi supresia de către acestea a răspunsului imunitar.

Toţi indivizii moştenesc, în mare, aceleaşi gene care codifică receptorii antigenici. Rearanjarea acestor gene duce la generarea unui imens repertoriu imunologic ce permite organismului să răspundă faţă de o paletă foarte largă de antigene. Pentru a ajunge la acest nivel de variabilitate, rearanjarea genelor codante are loc la întâmplare. (NB: Doar genele codante pentru receptorii antigenici suferă procesul de rearanjare, nu întreg genomul limfocitar.) Invariabil, unii din receptorii generaţi vor recunoaşte auto-antigene. Celulele ce poartă aceşti receptori trebuie eliminate, sau organismul riscă să iniţieze un răspuns împotriva propriilor ţesuturi. Rreactivitate faţă de auto-antigene se numeşte autoimunitate. Imunogenitatea antigenului este dictată de caracteristicile fizico-chimice ale antigenului cât şi de condiţiile în care acesta este prezentat sistemului imun. Deducem de aici că nu toate antigenele sunt capabile să inducă un răspuns imun. După acest criteriu, putem clasifica antigenele ca fiind: Antigene imunogene - antigene capabile să inducă un răspuns imun. Antigene tolerogene - antigene capabile să inducă toleranţă imunologică. Calităţile antigenice care dictează statul tolerogen sau imunogen sunt rezumate în Tabelul 1:

Favorizează stimularea răspunsului Favorizează toleranţa imunologică imun Cantitatea optimă diferă în funcţie de Doze înalte Cantitate antigen De scurtă durată Prelungită Persistenţă Subcutan, intradermic; Absenţa în organele Intravenos, oral; Prezenţa în organele limfoide Modul de limfoide primare* primare* pătrundere În lipsa adjuvanţilor, antigenele sunt nonPrezenţa Adjuvanţii stimulează celulele TH imunogene sau tolerogene adjuvanţilor Nivel scăzut de costimulare sau citokine în Nivel ridicat de costimulare Proprietăţile APC focar Factor

TH: T Helper. APC: Celulă Prezentatoare de Antigen (Antigen Presenting Cell)

25. 2. Mecanisme generale ale toleranţei Toleranţa rezultă din recunoaşterea antigenelor de către subseturi limfocitare specifice. Aceste limfocite, prezente şi la indivizii sănătoşi, recunosc antigene proprii de pe APC, dar reacţionează într-o manieră care induce toleranţa şi nu un răspuns imun. Toleranţa poate fi indusă în limfocite imature în organe limfoide centrale (toleranţă centrală), sau în limfocite mature în organe periferice (toleranţă periferică). 260

Toleranţa centrală reprezintă un proces intricat cu maturarea limfocitară. În cadrul acestuia, limfocitele imature din organele limfoide centrale devin incapabile sa răspundă la auto-antigene prezentate. Aceasta se referă la: antigene exprimate ubicuitar antigene circulante prin expunerea acestora pe celule specializate în timus (antigenele poartă numele de timo-dependente) sau captate direct de LB în măduva hematogenă (antigene timo-independente). Toleranţa centrală nu este un mecanism perfect şi necesită consolidare prin mecanismele toleranţei periferice (unele antigene sunt exprimate numai în ţesuturile periferice). Caracteristicele limfocitelor sine-tolerante sunt rezumate în Tabelul 2:

Caracteristică Locul principal al inducerii de toleranţă Faza de maturare sensibilă la toleranţă Stimuli ce induc toleranţa

Mecanismele pricipale ale toleranţei

Limfocite T

Limfocite B

Timus (cortex); Periferie

Măduva hematogenă; Periferie

Limfocite T CD4+CD8+ (dublu pozitiv)

Limfocite B imature (IgM+IgD-)

Central: aviditate ridicată a recunoaşterii Central: recunoaşterea antgenelor antigenelor în timus multivalente în măduva hematogenă Periferic: prezentarea antigenică de către Periferic: recunoaştere antigenică în APC ce nu prezintă molecule absenţa semnalelor de la LT sau costimulatoare costimulării Toleranţă centrală: deleţia (apoptoză), Toleranţă centrală: deleţia (apoptoză), dezvoltarea limfocitelor T reglatorii editarea receptorilor Toleranţă periferică: anergie, apoptoză, Toleranţă periferică: anergie, supresie excludere foliculară, apoptoză

25. 3. Toleranţa Limfocite T Procesul de distrugere a limfocitelor T imature reactive la auto-antigene este încă incomplet elucidat. Informaţiile disponibile momentan sunt în principal bazate pe dovezi in vitro.

25. 3. 1. Toleranţa LT Centrală Pe parcursul maturării în timus, limfocitele T trebuie să posede două caracteristici esenţiale, care stau la baza funcţionării sistemului imun. Astfel, reamintim conceptul de dublă selecţie necesar pentru maturarea LT şi migrarea lor din timus: - selecţie pozitivă – trebuie să recunoască receptorul MHC II, prezentat pe timocite - selecţie negativă – nu trebuie să recunoască antigene expuse în timus În timpul dezvoltării, toate limfocitele ce se dezvoltă în organele limfoide centrale trec printr-o fază în care sunt expuse doar la auto-antigene. Astfel că, în timus, limfocitele T care recunosc cu afinitate crescută un astfel de auto-antigen sunt distruse.

261

Pentru a asigura o selecţie cât mai bună a limfocitelor, este necesar ca în această etapă limfocitele să întâlnească cât mai multe antigene self. Pentru a facilita acest deziderat, timocitele exprimă antigene "periferice" după inducţia factorului de transcripţie AIRE – AutoImmune REgulator. Trebuie reţinut că (aproape) toate celulele din organism conţin molecule identice de ADN. Astfel, sub acţiunea promoterilor corecţi, celulele pot exprima orice antigen prezent în organism. În cazul în care limfocitele CD8+ nu satisfac condiţiile de selecţie, se induce fie apoptoza, fie anergia. Aceste mecanisme vor fi detaliate în cadrul secţiunii următoare, ele fiind comune toleranţei centrale şi periferice. Ca o consecinţă a recunoaşterii de antigene self, limfocitele CD4+ sunt transformate în limfocite reglatoare. Acestea îşi schimbă fenotipul imunologic (markerii de suprafaţă) şi funcţional (devin supresoare). În periferie, limfocitele reglatoare vor interacţiona cu limfocitele T, contribuind la supresia răpunsului imunologic prin secreţia citokine anti-inflamatorii (ex: IL-10).

25. 3. 2. Toleranţa LT Periferică Toleranţa LT Periferică reprezintă procesul prin care limfocitele mature, în organe limfoide periferice devin incapabile să răspundă la auto-antigene. Importanţa clară este reprezentată de toleranţa faţă de antigenele specifice ţesuturilor periferice ce nu sunt abundent exprimate în timus. Consolidează toleranţa indusă central. Am menţionat în alte capitole ale acestei cărţi, rolul critic al semnalelor costimulatoare pentru declanşarea răspunsului imun. (vezi capitolul 13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi.) Expunerea LT CD4+ la antigene, în absenţa costimulării APC, poate induce anergie. Astfel este posibil ca antigene periferice prezentate subseturilor LT autoreactive, în lipsa reacţiei imunităţii native (inflamaţiei) să inducă toleranţa. Experimentele au arătat ca în lipsa co-stimulării de către cuplul molecular B7-CD28, semnalul transmis de TCR nu este suficient pentru a induce răspunsul imun şi induce toleranţa prin anergie sau apoptoză (Figura 2).

262

Figura 2. Răspunsul în urma interacţiunii celulelor sistemului imun aflate în diferite stadii de activare. În lipsa unor semnale de activare date de inflamaţie, macrofagele şi limfocitele imature imunologic vor conduce la toleranţă.Celulele APC mature sunt caracterizate de prezenţa pe membrana lor a ligandului costimulator numit B7. Celulele LT mature prezintă pe membrană receptorul CD28, iar din interaţiunea lor, se transmit semnale stimulatoare, rezultând în activarea şi proliferarea LT. În absenţa uneia dintre cele două molecule, se induce anergia. LT imature prezintă, în loc de CD28, o moleculă inhibitoare, numită CTLA4. Funcţia moleculei CTLA4 este de fosfatază, cu rolul fiziologic de a contra-regla răspunsul imun. Anergia reprezintă o stare caracterizată de incapacitatea limfocitelor de a nu răspunde la stimuli. Aceasta este indusă în urma interacţiunii cu un auto-antigen şi inducerea toleranţei. S-au descris o serie de factori epigenetici şi morfologici (markeri de suprafaţă) caracteristici limfocitelor anergice, dar ne vom opri asupra caracterelor funcţionale: scăderea expresiei de molecule TCR, creşterea turn over-ului acestor molecule 263

recrutarea tirozin fosfatazelor cu rolul de a diminua semnalizarea TCR - semnale inhibitorii de la molecule de tip CTLA4 care competiţionează cu CD28 pentru legarea moleculelor stimulatoare B7. Este posibil ca celulele dendritice rezidente în organe limfoide sau organe periferice să se afle într-un stadiu imatur, exprimând puţine molecule B7. În lipsa semnalului costimulator, LT devin anergice. LT Reglatoare (LTR) au fost extensiv caracterizate fenotipic (CD4+, CD25+, foxP3+) şi totuşi incomplet funcţional. Sunt formate prin recunoaşterea antigenelor self in timus. Acţiunea lor este periferică, unde au rolul de a completa toleranţa centrală. Acţionează prinsecreţia de IL-10 si TGF-β, cu rol anti-inflamator. - secreţia acestor molecule blochează activarea şi functia celulelor LT efector şi a macrofagelor. unele experimente demonstrează inhibarea APC prin contact direct a LTR Deşi acest subset este cel mai bine studiat, s-au descris mai multe fenotipuri reglatoare. Se caută defecte de dezvoltare a LTR in boli autoimune precum DZ1 (Diabet Zaharat tip I) şi SM (Scleroză Multiplă). Apoptoza reprezintă, într-o definiţie simplistă, „moartea celulară programată”. Acest proces este rezultatul activării unor pachete enzimatice complexe care duc la fragmentarea ADN-ului şi digestia proteinelor celulare, cu menţiunea importantă cămembrana citoplasmatică rămâne intactă. Limfocitele T care recunosc molecule antigene proprii sau sunt expuse pentru lung timp la un anumit antigen mor prin apoptoză. Căile biochimice care induc apoptoza sunt:

-

Calea

Mitocondrială

(Bim)

Limfocitele T care recunosc antigene fără costimulare sau în absenţa inflamaţiei activează un răspuns proapoptotic, prin proteina Bim (membră a familiei Bcl-2). Molecule aflate in membrana mitocondrială, reglează stabilitatea acesteia. Aceste molecule au diverse roluri, fiind pro- si anti-apoptotice, cât şi molecule senzor pentru diverşi stresori. Citocromul C este sechestrat în mod normal în interiorul mitocondriei, iar eliberarea sa în citoplasmă este mediată de canale sensibile la moleculele pro-apoptotice de tip Bax/Bak. Citocromul C joacă un rol important, ca marker al destabilizării membranei mitocondriale şi activator al caspazelor. Molecule precum Bcl şi Bcl-XL au rolul de a stabiliza canalele mitocondriale, având astfel rol anti-apoptotic.

-

Calea

Receptorilor

Morţii

(Fas-FasL)

Stimularea repetată a LT conduce la co-expresia unor receptori care, activaţi, induc apoptoza. În LT CD4+, receptorul implicat în inducerea apoptozei este numit Fas (CD95). Acesta este membru a familiei TNF şi conţine, în porţiunea intracelulară domenii specializate care traduc semnale pro-apoptotice. De menţionat că FasL este o moleculă cvasi-ubicuitar exprimată, contribuind la menţinerea toleranţei – interacţiunea LT CD8+ cu MHC I de pe ţesuturi, în lipsa citokinelor de la LT CD4+ duce la dominanţa relativă a semnalelor transmise de Fas. Trimerizarea Fas duce la inducerea programului pro-apoptotic prin activarea unor serin-proteaze numite caspaze. Acestea induc degradarea proteinelor intracelulare şi fragmentarea ADN.

264

Deşi caspazele pot induce apoptoza separat, cele doua mecanisme se autopotenţează. Caspaza 8 activează molecula Bid care activează şi calea mitocondrială de apoptoză. (Figura 3)

Figura 3. Schema reprezintă cascadele intracitoplasmatice care conduc la activarea programului apoptotic şi punctul de intersecţie reprezetat de Caspaza 8 şi Bid.

25. 4. Toleranţa Limfocitelor B 25. 4. 1. Toleranţa LB Centrală Asemănător LT, toleranţa centrală a LB este indusă atunci când limfocitele imature, recunosc cu afinitate mare un antigen. Diferenţa constă în faptul că aceste antigene sunt de obicei circulante în sânge şi se leagă direct de BCR (B Cell Receptor). Editarea BCR reprezintă un mecanism specific de toleranţă a limfocitelor B. Mecanismul implică reactivarea unor enzime (RAG1 şi RAG2) ducând la rearanjarea genelor VJD şi formarea imunoglobuline cu o nouă specificitate. Acest proces este cu atât mai intens cu cât semnalul este mai puternic (legare multivalentă). Procesul de editare BCR este un important mecanism de prevenire a apariţiei de clone LB autoreactive. Dacă editarea dă greş şi LB continuă să recunoasca un antigen propriu, se induce apoptoza. Un semnal mai putin putenic duce la instalarea anergiei.

265

Figura 4. Schemă a mecanismelor implicate în toleranţa limfocitelor B, centrală şi periferică. Scopul unui răspuns imun bine-reglementat este să apere gazda de patogeni, fără a cauza distrugeri ţesuturilor organismului.

25. 4. 2. Toleranţa LB Periferică Mecanismele

implicate

sunt

asemănătoare,

fiind

reprezentate

de: Anergie Apoptoză – interacţiunea Fas FasL de pe LTh antigen-specifice - Excluzie foliculară – un alt mecanism LB-specific. Limfocitele B care recunosc un antigen propriu au puţine molecule CXCR5, care în mod normal ghidează limfocitele B în zona foliculară a nodulului limfatic. În mediu extrafolicular, LB nu primesc suficiente semnale de supravieţuire. Scopul unui răspuns imun bine-reglementat este să apere gazda de patogeni, fără a cauza distrugeri ţesuturilor organismului.

25. 5. Toleranţa imunologică în sarcină O condiţie specială o reprezintă inducerea toleranţei în cadrul perioadei gestaţionale. S-a demonstrat că, în trimestrul second, 20-25% din LT din splină au un fenotip TLR, iar nivelul de TGF-β este crescut. Aceste 266

populaţii Treg revin la normal la scurt timp după încheierea sarcinii. Controlul acestui status imun pare sistemic, întrucât pierderea sarcinii duce la revenirea la statusul imun normal [1]. Incubarea culturilor splenice cu alo-antigeni, a dus la o activare slabă [2]. În timpul sarcinii, timusul produce cantităţi mari de limfopoietină, ce face ca celulele dendritice placentare să transforme LT CD4+ în fenotip CD25+ foxP3+, capabile de secreţia IL-10 [3].

25. 6. Oprirea răspunsului imun Până acum am discutat despre mecanismele prin care sistemul imun devine neresponsiv faţă de autoantigenele expuse de ţesuturile proprii. Menţinerea relativ constantă a numărului de limfocite în faţa numeroaselor stimulări antigenice întâmpinate de individ este o componentă vitală pentru menţinerea homeostaziei. (Figura 5)

Figura 5. Schemă a fazelor răspunsului imun, cu expansiunea clonală şi contracţia limfocitară. Răspunsul imun este auto-limitat, scăzând în intensitate pe măsură ce antigenele implicate în declanşarea sa sunt eliminate. Astfel, se revine la un status de bază al sistemlui imun, care devine pregătit de o nouă încercare antigenică. Apoptoza şi inactivarea limfocitelor sunt mecanismele principale implicate în homeostazia răspunsului imun, astfel încât organismul poate să faţă la generarea expansiunea clonală din cadrul stimulării răspunsului imun. Proliferările anarhice ale limfocitelor sunt întâlnite în cadrul limfoamelor, cu consecinţe 267

grave. În urma eliminării antigenelor, limfocitele suferă o fază de contracţie, în care majoritatea celulelor care răspund la stimulul antigenic sunt pierdute. Faza de contracţie este în principal datorată morţii programate a limfocitelor, care, în lipsa semnalelor de supravieţuire din mediu, activează un program apoptotic. Antigenele, semnalele costimulatoarea şi citokinele dezvoltate în focarul inflamator au ca funcţie blocarea semnalelor proapoptotice şi permit supravieţuirea limfocitelor atâta timp cât provocarea antigenică există. Se consideră că majoritatea clonelor generate în faza de expansiune sunt sortite a deveni limfocite-efector, cu viaţă scurtă. Spre deosebire de limfocitele-efector, în cadrul răspunsului imun se generează şi limfocitelememorie. Acestea sunt silenţioase din punct de vedere funcţional şi au o viaţă lungă, fiind capabile să răspundă repede în cazul întâlnirii antigenului faţă de care sunt sensibile. CLTA-4 începe să fie exprimată în cantităţi mari după 3-4 zile de la activarea limfocitară. Astfel, este posibil ca CTLA-4 să joace rolul unui stimul fiziologic de oprire a sistemului imun. Această moleculă competiţionză direct cu CD28 pentru a se lega de B7 de pe APC (blocarea semnalului costimulator). Un alt mecanism de acţiune îl reprezintă recrutarea de fosfataze, care defosforilează regiunile ITAM ale CD3 şi δ, blocând semnalul TCR. Alte molecule de inhibare a răspunsului imun au fost descrise, dintre cele mai studiate fiind PD-1. (Figura 6)

Figura 6. Inhibiţia semnalelor B7 şi TCR prin exprimarea în număr mare a CTLA4 la câteva zile de la activarea limfocitară. 268

Antibody feedback Anticorpii IgG inhibă activarea limfocitelor B prin formarea de complexe antigen-anticorp (CAA) cu antigene polivalente. CAA se cuplează, prin porţiunea Fc a anticorpilor cu receptorul specific de pe limfocite B, FcγRIIB (sau CD32). Aceşti receptori conţin secvenţe care, odată fosforilate, recrutează fasfataze (SHIP). Prin legarea simultană

Figura 7. Inhibiţia semnalelor activatoare prin complexele antigen-anticorp formate de interacţiunea anticorpilor cu antigene polivalente şi receptori Fc speciali. Una din consecinţele inflamaţiei este fibroza tisulară. În lipsa unei controlări judicioase a semnalelor ce întreţin inflamaţia şi răspunsul imun, organismul ar suferi leziuni induse de aceste mecanisme de apărare. Ca urmare a citokinelor secretate în focarul inflamator, fibroblastele devin active metabolic, ducând la producţia şi secreţia de colagen. În cazul inflamaţiei moderate, ca cea întâlnită într-o stimulare normale a sistemului imun de către un agent patogen comun, fibroza este minimă iar citoarhitechtura şi fiziologia tisulară rămâne fără consecinţe – un astfel de grad de fibroză este fiziologică; în cazul inflamaţiei severe sau cronice, fibroza este importantă şi duce la disfuncţii organice profunde. Unul din mecanismele care rămân încă mult investigate sunt translaţia epitelio-mezenchimală prin care, tot sub influenţa produşilor inflamatorii, celulele epiteliale trec în fibroblaşti sau miofibroblaşti care sunt responsabile de fibroză [4]. Este lesne de înţeles că aceste modificări sunt cu atât mai importante în organele parenchimatoase ca plămânul, rinichiul şi ficatul în care epiteliile înalt269

specializate au rol foarte important. Pierderea masei epiteliale induce disfuncţii severe ale funcţiei acestor organe.

25. 7. Povestire adevărată Deşi nu reprezintă o metodă terapeutică utilizată în tratamentul bolilor infecţioase, trebuie recunoscută importanţa terapiei .Reţelele imunoreglatoare dezvoltate în decursul ontogenezei organismului sunt rezultatul unei istorii complexe, marcată de repetate interacţiuni cu factori microbiali, rezultând în comensalism de scurtă/lungă durată, sau infecţie acută/cronică/latentă. Această istorie a fost numită “biografia” sistemului imun, jucând un rol în sănătate şi boală. microclimatul tumoral are efect de supresie asupra sistemului imun. Totodată, tumorile care declanşează un răspuns limfocitic pronunţat au un fenotip mai blând şi un prognostic mai bun. Interacţiunile celulelor neoplazice cu sistemul imun sunt extensive. Trebuie readus în discuţie efectul carcinogen pe care îl poate avea inflamaţia cronică dar şi anergia pe care o prezintă pacienţii cu neoplasm activ. Căile reglatoare care inhibă răspunsul imunologic în cancer sunt caracterizate din ce în ce mai bine, iar studiul lor a dus la descoperirea unor noi ţinte terapeutice. Ipilimumab este un anticorp IgG1 monoclonal uman, care, datorită inhibării CTLA-4, are rol în activarea imunităţii anti-tumorale. Studii de faza 2 au fost deja efectuate, folosind Ipilimumab atât în monoterapie cât şi împreună cu alţi agenţi (inclusiv alte vaccinuri anticanceroase). Un studiu multicentric, randomizat publicat de curând, a implicat trei braţe de tratament – Ipilimumab+Gp100 / Gp100 monoterapie / Ipilimumab monoterapie. Gp100 este o proteină menlanosomală, ce şi-a dovedit eficacitatea prin îmbunătăţirea răspunsul în pacienţii trataţi cu doze mari de interleukină-2. S-a demonstrat astfel, pentru prima oară într-un studiu randomizat, că Ipilimumab, singur sau în combinaţie cu Gp100, a îmbunătăţit supravieţuirea pacienţilor cu melanom malign metastatic, comparând cu cei ce au primit monoterapie cu Gp100. Este pentru prima oară când o terapie îmbunătăţeşte supravieţuirea pacienţilor cu melanom metastazat. Datorită efectelor de derepresare a sistemului imun, această terapie poate părea relativ nespecifică. Efectele adverse serioase (inclusiv necroza hepatică fulminantă), deşi pot fi tratate cu doze mari de corticosteroizi, pun probleme. Succesul înregistrat de Ipilimumab dezvoltă un cadru conceptual pentru continuarea studiilor folosind imunomodulatoare (de orice formă) în boala neoplazică. Vaccinarea cu celule neoplazice întregi, sau antigene specifice, cu DC-uri încărcate cu antigene specifice sau autotransfuzia cu limfocite T anti-melanom activate şi expansionate in vitro, toate au potenţial de a fi folosite în arsenalul împotriva melanomului malign.

26. Diagnosticul în bolile infecţioase – prima parte 26. 1. Introducere. Relevanţa diagnosticului în bolile infecţioase 270

în bolile infecţioase (numite de către unii autori şi boli transmisibile; transmisibile sunt însă şi maladiile genetice, fără a fi în acelaşi timp şi infecţioase) diagnosticul are o importanţă considerabilă (uneori decisivă, influenţând în mod direct prognosticul). De stabilirea corectă şi precoce a diagnosticului pot depinde 

atât salvarea/vindecarea/îmbunătățirea stării de sănătate a bolnavului,

cât şi succesul măsurilor de prevenire/profilaxie care trebuie iniţiate cât mai rapid posibil, pentru a preîntâmpina dezvoltarea unui eventual focar epidemic (izbucnire epidemică, „outbreak”) sau chiar a unei epidemii. De exemplu, ignorarea primului caz al unei boli infecţioase grave (holeră, febră tifoidă, difterie, meningită meningococică etc.) poate avea consecinţe clinice şi epidemiologice foarte importante. 

În prima parte a manualului am prezentat datele de bază, necesare oricărui diagnostic microbiologic (direct sau indirect). Având la bază aceste cunoştinţe, în partea specială vom aborda fiecare gen în parte, urmărind o serie de noţiuni pe o schemă asemănătoare (de menționat că acest stil poate fi util indiferent de etiologia bacteriană, fungică, parazitară sau virală, cu anumite particularități). Dorim să subliniem că în ”viața reală”, pe măsura acumulării cunoștințelor și experienței în practica de zi cu zi, fiecare va putea să ajungă la o modalitate de abordare optimă. În fiecare capitol vom exemplifica modul în care se poate face diagnosticul de laborator, folosind o schemă generală de diagnostic (prezentată în capitolul 27) pentru infecţiile produse de principalele microorganisme studiate. Considerăm că utilizarea în mod repetat a unei scheme clare permite o mai bună fixare a cunoştinţelor precum şi atingerea obiectivului stabilit: reţinerea unor principii utile, indiferent de specialitatea care a fost / va fi aleasă ulterior. Microbiologia este, după părerea noastră, o ştiinţă cu foarte mare aplicabilitate practică. Elementele de bază ale microbiologiei sunt necesare şi utile pentru toţi cei implicaţi în sistemul sanitar; cunoaşterea acestor elemente de bază ar putea preveni o serie de anomalii şi erori care uneori sunt dezastruoase (aşa cum s-a întâmplat spre exemplu într-o maternitate în care o serie de nou-născuţi au decedat datorită unor infecţii de spital/nosocomiale).

26. 2. Contextul actual Dacă în urmă cu circa 40 de ani, la nivel internaţional a început să se considere (în mod absolut eronat) că problemele legate de bolile infecţioase sunt din ce în ce mai puţin importante (eroare carea creat şiîncă mai creează probleme în sănătatea publică la nivel naţional şi internaţional), în ultimii 13-14 ani (în special începând cu anul 1998) s-a dovedit, concret, că bolilor infecțioase trebuie să li se re-acorde importanţa cuvenită.

271

În opinia noastră, referința în domeniu este reprezentată de către DECIZIA 2119/98/CE A PARLAMENTULUI EUROPEAN ȘI A CONSILIULUI din 24 septembrie 1998, de creare a unei rețele de supraveghere epidemiologică și control al bolilor infecțioase/transmisibile în Comunitate, a cărei traducere în limba română poate fi examinată la http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:1998D2119:20071228:RO:PDF Pornind de la această DECIZIE au fost elaborate numeroase acte normative în domeniu iar fondurile alocate au sporit substanţial, încercând să se „vindece” situaţia la care se ajunsese datorită erorilor făcute anterior. Şi în ţara noastră, preocuparea faţă de sănătatea publică în general şi faţă de microbiologia în sănătatea publică în mod particular a crescut începând cu anul 1997, chiar înainte ca primele decizii și directive ale UE să apară şi să fie publicate în documentele oficiale. Astfel, activitatea desfăşurată în domeniul reformelor pentru sănătatea publică în România a fost în acea perioadă, din acest punct de vedere, destul de aproape de reforma care a avut loc în restul UE. Diferitele proiecte şi programe iniţiate în special în perioada 1997-2000 (iniţial în colaborare cu CDC, Atlanta, GA şi OMS, Copenhaga sau OMS, Geneva) și-au găsit concretizarea în aplicarea unor măsuri cu mare importanţă la nivel naţional: 

reabilitarea centrelor de referinţă pentru microbiologie,



reforma sistemului de supraveghere a tuberculozei,

adaptarea la standarde internaţionale a sistemului de diagnostic, prevenire şi control pentru bolile cu transmitere sexuală,  

menţinerea la un nivel corespunzător a imunizărilor pentru a preveni bolile prevenibile prin vaccinare,

includerea României în sistemul de pregătire în scopul supravegherii bolilor infecțioase la nivel european etc. 

Totuşi, dorim să subliniem faptul că prima încercare (reuşită) pentru reforma sistemului de supraveghere a bolilor infecţioase a fost înregistrată în perioada 1990-1991. Echipa formată atunci, echipă care a început adevărata supraveghere pentru sănătatea publică, a fost din păcate distrusă în anul 1992, arătând încă o dată influenţa negativă a politicului în sănătate. Din anul 1999 România face parte (ca membru fondator) din Reţeaua de supraveghere a bolilor transmisibile în Balcani. În anul 2000, a fost organizată una dintre cele mai importante întâlniri cu scopul armonizării supravegherii bolilor infecţioase în Europa (Consensus Meeting on Surveillance of Infectious Diseases, Grottaferrata, Italia, 7 aprile 2000). Prezentarea pe care unul dintre coordonatorii prezentului volum a făcut-o cu acest prilej, discuţiile care au urmat în „ateliere de lucru”, întâlnirile cu factori de decizie ai Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, iniţiativa organizării unei reţele de supraveghere a bolilor infecțioase/transmisibile în ţările din Europa Centrală şi de Est (întâlnire plenară pe care am organizat-o în decembrie 2000, la Bucureşti, prima şi singura de acest nivel în perioada 1990-2007, neegalată până în prezent) au dus la construirea unui proiect de reformă în domeniul supravegherii bolilor transmisibile cu sprijin european (Phare) pe care l-am gândit în perioada mai-octombrie 2000, l-am scris în perioada octombrienoiembrie 2000 (ajutat pentru finalizare de colegii de la Direcţia de Integrare Europeană şi Programe de Sănătate din Ministerul Sănătăţii) şi care a fost aprobat la „data istorică” de 14 noiembrie 2000. 272

Finanţarea a fost de circa 5 milioane EUR (circa 4 milioane EUR fonduri nerambursabile, Phare). Implementarea fondurilor pe care le-am câştigat în anul 2000 a avut loc în perioada 2003-2004, după opinia noastră mai târziu decât a fost cazul şi cu o performanţă mai scăzută în comparaţie cu cea care ar fi fost atinsă de echipa condusă (în perioada 1999-2000) de unul dintre coordonatorii prezentului manual, în acelaşi timp autorul proiectului. Chiar dacă reprezintă măsuri pentru prevenirea unor maladii virale (şi nu bacteriene sau fungice), vom mai aminti, dintre măsurile luate în ultimii ani, îmbunătăţirea programului de vaccinare împotriva infecţiilor cu virusul hepatitei B, în anul 1999. Vaccinarea nou-născuţilor avea deja o „vechime” de 4 ani, dar în 1999, prin politica dusă în domeniul sănătăţii publice, a fost inclusă şi vaccinarea copiilor din clasa a III-a, vaccinarea tuturor elevilor din anul I de la şcolile sanitare postliceale şi respectiv a studenţilor din anul I din facultăţile de medicină şi stomatologie. Ulterior, cohortele de copii vaccinaţi „apropiindu-se”, a început vaccinarea tinerilor aflaţi în clasa a XII-a şi astfel, nu numai viitorii medici sau asistenţi medicali au beneficiat şi beneficiază de această metodă profilactică. Politica de vaccinare a permis ca în numai câţiva ani, un mare număr de generaţii de copii şi tineri să fie vaccinate faţă de o infecţie care devenise endemică la nivelul anilor ’90. Dacă până în anii 2000 au existat foarte bune relații de colaborare cu OMS și CDC, Atlanta, acum principala colaborare are loc cu ECDC, Stockholm. Bazele relaţiilor cu ECDC au fost puse în perioada 20052007, atât în misiuni comune [investigarea izbucnirilor epidemice de gripă aviară, evaluarea epidemiei de rujeolă (datorată acumulării de persoane susceptibile în perioada 2001-2004), evaluarea sistemului de supraveghere al bolilor infecţioase în general şi al infecţiilor cu transmitere sexuală în particular etc.], cât şi prin participarea experţilor români la întruniri internaţionale pe teme microbiologice sau epidemiologice. Odată cu integrarea României în UE a devenit posibilă şi pregătirea specialiştilor români, prin includerea României în sistemul de pregătire în scopul supravegherii bolilor infecțioase la nivel european, participarea (începând cu anul 2007) ca membru cu depline drepturi în reţelele europene privind supravegherea bolilor infecţioase, în reţelele care discută viitorul microbiologiei sau epidemiologiei la nivel european etc. Începând cu anul 2007, cetăţenii români pot participa şi participă la modulul complet de pregătire în domeniul epidemiologiei, la nivel european (European Programme for Intervention Epidemiology Training, EPIET). Fiecare dintre aspectele menţionate are o strânsă legătură atât cu microbiologia, cât şi cu sănătatea publică şi merită a fi cunoscute atât de către medicii cât şi de viitorii medici care activează în sistemul sanitar românesc sau la nivel european.

27. Diagnosticul în bolile infecţioase – partea a 2-a 27. 1. Recomandări cu privire la diagnosticul integrat, în bolile infecţioase 273

Cu toate că în primii ani de studiu este abordată în mod special partea microbiologică (bacteriologică, virusologică, parazitologică, micologică) a diagnosticului, este strict necesar să menţionăm că examenul clinic îşi păstrează valoarea în totalitate. Orice investigaţie de laborator este precedată de studierea elementelor clinice, ulterior discuţiei cu pacientul sau aparţinătorii acestuia (anamneză). Fără un examen clinic aprofundat şi fără evaluarea zilnică a evoluţiei din punct de vedere clinic şi paraclinic a bolii, nici laboratorul de microbiologie modern nu poate fi utilizat la nivelul posibilităţilor actuale. Dorim să subliniem faptul că în scopul diagnosticării bolilor infecţioase au fost puse la punct numeroase tehnici de laborator, metode paraclinice, precise şi obiective, dar utilitatea lor este maximă atunci când rezultatele sunt interpretate în contextul clinic şi epidemiologic. Aşa cum am mai menţionat şi anterior, colaborarea şi stabilirea unei echipe interdisciplinare reprezintă un deziderat esenţial, ţinta finală fiind reprezentată de vindecarea pacientului şi prevenirea apariţiei unor cazuri secundare. Investigarea şi documentarea bolilor infecţioase ilustrează prin excelenţă principiul „trepiedului diagnostic”, datele de anamneză servind la orientarea examenului clinic obiectiv, care la rândul său direcţionează investigaţiile paraclinice de laborator, imagistice ş.a. astfel încât tabloul unitar necesar demersului diagnostic poate fi realizat prin coroborarea datelor extrase prin toate cele trei metode. În diagnosticul bolilor infecţioase trebuie respectate următoarele reguli: 1. Culegerea datelor reprezintă de multe ori o urgenţă; trebuie realizată cât mai curând posibil. Toate datele necesare diagnosticării unei boli infecţioase (clinice, paraclinice şi de laborator) trebuie obţinute cât mai rapid, chiar în prima oră după luarea în evidenţă a bolnavului. Anamneza şi „istoricul bolii” trebuie să fie realizate riguros, de fiecare dată (chiar şi atunci, sau mai ales atunci când situaţia pare să fie asemănătoare cu o situaţie „cunoscută” - interpretarea datelor sub formă de „şablon” reprezintă un mare risc!). Spre exemplu, succesul sau insuccesul terapeutic în meningitele sau în endocarditele bacteriene depinde de fiecare oră, câştigată sau pierdută. În cazul apariţiei unui caz de holeră, lipsa obţinerii informaţiilor necesare (anamnestice), lipsa orientării către ipoteza diagnostică, lipsa recoltării, examinării coprocitogramei (element esenţial = lipsa leucocitelor) şi însămânţării produsului patologic pe apă peptonată alcalină vor putea crea probleme atât pentru pacientul respectiv (evoluţia putând fi severă în lipsa instituirii rapide a măsurilor de reechilibrare hidro-electrolitică) cât şi din punct de vedere al diseminării infecţiei (1) (de ex. în cazul în care această situaţie ar apărea în Delta Dunării, în condiţii igienico-sanitare precare). 2. Datele obţinute în vederea diagnosticului trebuie privite ca un tot unitar; diagnosticul de boală infecţioasă trebuie să rezulte din totalitatea datelor clinice şi a celor de laborator considerate şi interpretate unitar. Nu pot fi absolutizate nici posibilităţile clinice şi nici cele ale laboratorului. Metodele de laborator, luate separat, nu permit punerea diagnosticului, dar executarea corectă a manoperelor de laborator reprezintă o condiţie sine qua non pentru un diagnostic corect şi util. Este deosebit de important ca, în momentul în care luăm în calcul un diagnostic din sfera bolilor infecţioase, să nu excludem şi alte etiologii posibile. De exemplu, o pacientă în vârstă de 51 de ani se prezintă pentru apariţia recentă a unor leziuni eritematoase (Figura nr. 1). Date din anameză (tratament cu etoricoxib) corelate cu lipsa decelării altor leziuni similare la examenul clinic obiectiv, au condus către diagnosticul de eritem fix – reacţie adversă rară la administrarea de etoricoxib (2). 274

Acest caz ilustrează ponderea datelor anamnestice în formularea unei ipoteze diagnostice. 3. Este indispensabil să se stabilească diagnosticul etiologic în toate maladiile infecţioase, însoţit de testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene pentru tulpina izolată, având în vedere utilitatea şi importanţa tratamentului antimicrobian, precum şi actualitatea problematicii referitoare la rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice (3). Anamneza trebuie realizată cu rigurozitate; aprecierea statusului imunologic poate avea o contribuţie esenţială; efectuarea unui examen clinic minuţios constituie o altă condiţie a unui diagnostic complet. Pentru medic (dar şi pentru pacient) contează toate datele obţinute prin examenul obiectiv; nici un element nu trebuie neglijat: - faciesul bolnavului (facies = aspect caracteristic, corelat cu boala de care suferă o anumită persoană), postura şi unele aspecte particulare; - febra/curba termică (cu toate caracteristicile ei); trebuie folosită termometrizarea şi nu „senzaţia de febră” (vezi și subcapitolul 24.1.); - modificările apărute la nivelul mucoaselor şi la nivel tegumentar; - semnele de insuficienţă respiratorie acută; - semnele care relevă un dezechilibru hidro-electrolitic şi acido-bazic; - modificările neurologice şi psihice etc. În interpretarea curbei termice, este important să evaluăm urmatoarele aspecte: 

magnitudinea febrei,



frecvenţa şi durata episoadelor febrile,



recurenţa acestor episoade (cu/fără periodicitate),



relaţia dintre puls şi temperatură şi patternul de remisie a episoadelor febrile (4) etc.

Administrarea de antibiotice şi/sau antipiretice poate altera aspectul curbei termice (5), dar cu toate acestea, în cazurile tipice, este important de decelat prezenţa unor pattern-uri febrile aşa-zise „clasice”. De exemplu, febra terţiară se suprapune peste ciclul de reproducere asexuată al Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale pe când febra cuaternară este înalt sugestivă pentru P. malariae(6). Totodată, febra continuă poate fi întâlnită în patologiile de etiologie rickettsiană iar un pattern bifazic poate semnala febra Dengue (5). 4. Folosirea corectă a datelor care pot fi oferite de către laborator constituie un alt aspect foarte important. Este necesar ca fiecare medic clinician să ştie ce analize să solicite, ce produse se recoltează de la bolnav, când şi cum să le recolteze, cum să le expedieze / pregătească pentru expediere către laborator. Sunt de menţionat şi reţinut următoarele reguli: - produsele se recoltează înainte de administrarea tratamentului antimicrobian; - se trimite laboratorului o cantitate suficientă de produs pentru examinat; - produsul trimis trebuie să fie reprezentativ pentru boala respectivă (de exemplu, spută şi nu salivă în infecţiile respiratorii inferioare); - produsul trebuie recoltat în perioada în care probabilitatea decelării agentului etiopatogen este maximă (de exemplu, recoltarea pentru hemoculturi se face, pe cât posibil, în timpul unui episod febril); - produsul examinat nu trebuie contaminat cu alţi germeni în cursul recoltării sau al transportului (recoltare şi transport în condiţii aseptice) (7); - expedierea către laborator se face în condiţiile de conservare cerute pentru fiecare produs în parte (trebuie să existe recomandări specifice, în detaliu, la îndemâna medicilor); 275

- se solicită examinarea imediată a produselor transmise către laborator; - se urmăreşte, în timp, apariţia rezultatelor şi „se ţine legătura” cu colegii din laborator. Însă, pentru ca datele de laborator să fie corecte este strict necesară respectarea unei anumite conduite în laborator, utilizarea judicioasă a diferitelor aparate şi echipamente de laborator şi implementarea controlului de calitate (intern şi extern) (a se vedea anexa nr. 5). 5. Trebuie să existe o colaborare strânsă şi continuă între clinician şi specialistul de laborator. Este necesară o informare (care să includă aspecte rezultate în urma anamnezei şi elemente clinice) a medicului de laborator făcută de către clinician (direct sau cel puţin prin telefon) pentru orientarea cercetărilor în laborator şi pentru alegerea celor mai bune metode de identificare a agentului etiologic. În acelaşi timp, laboratorul informează clinicianul pe parcurs în legătură cu datele preliminare obţinute. În cadrul examenelor de laborator, un loc prioritar este ocupat de diagnosticul microbiologic (bacteriologic şi / sau imunologic), care va fi prezentat în continuare. Pe scurt vor mai fi notate câteva alte date referitoare (examene paraclinice, utile în diagnosticul bolilor infecţioase). Diagnosticul citologic: constă în punerea în evidenţă a unor aspecte celulare caracteristice, utilizând un material prelevat de la bolnav (ex. din leziuni tegumentare sau amprente de la nivelul mucoaselor). Spre exemplu, citodiagnosticul revărsatelor pleurale şi al lichidului cefalorahidian poate aduce date preţioase pentru elucidarea etiologiei unei pleurezii şi respectiv a unei meningite. Diagnosticul histologic: prin biopsii (recoltate prin tehnică chirurgicală) sau prin puncţii-biopsii ale diferitelor organe (ficat, rinichi, plămân, ganglioni limfatici, fragmente vasculare, mucoasă digestivă sau respiratorie) se pun în evidenţă modificări structurale caracteristice, determinate de acţiunea agentului patogen. Metodele de laborator nespecifice: în diagnosticul bolilor infecţioase sunt utile informaţiile obţinute prin analiza valorii hemogramei, leucogramei (cu modificări destul de caracteristice în anumite situaţii), vitezei de sedimentare a hematiilor, testelor de disproteinemie, testelor enzimatice, proteinei C reactive (beta-globulină care nu se găseşte în serul normal, apărând numai în afecţiuni inflamatorii, neoplasme şi în procese necrotice), altor teste de inflamaţie (reactanţi de fază acută) etc. Alte metode paraclinice: examenul radiologic poate furniza date de valoare pentru bolile infecţioase cu participare pulmonară (pneumonii virale, febră Q, pneumonie pneumococică etc). Se mai pot folosi rectosigmoidoscopia, electroencefalografia, electrocardiografia, diferite determinări biochimice, examene oftalmologice, scintigrafia, ecografia, tomografia computerizată, rezonanţa magnetică nucleară.

27. 2. Schema generală a diagnosticului microbiologic Diagnosticul de laborator în microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic sau micologic (direct), un diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaţie a celor două variante menţionate. Aşa cum am menţionat, în continuare dorim să prezentăm etapele principale ale diagnosticului microbiologic (bacteriologic, micologic, imunologic), structură pe care urmează să discutăm, concret, diferite situaţii în cadrul capitolelor care urmează. În celălalt volum, atunci când vom discuta recoltarea şi transportul produselor, vom sintetiza pentru unele 276

dintre aceste produse situaţiile posibile în momentul în care nu avem „în faţă” un anumit gen sau o anumită specie ci produsul din care vom izola agentul etiologic, iniţial presupus.

27. 2. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic are mai multe etape, şi anume: 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, prelevând un anumit produs patologic în funcţie de manifestarea clinică în cazul respectiv, de exemplu urină în cazul unei infecţii urinare, materii fecale în cazul dizenteriei, spută în cazul tuberculozei sau aspergilozei, scuame în cazul unei micoze cutanate superficiale etc) (vezi anexa nr. 6). 2. Examinarea macroscopică şi microscopică a produsului patologic reprezintă de multe ori o etapă esenţială, care poate orienta paşii următori. Pentru examenul microscopic se vor realiza minim două frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa şi respectiv Gram. Este preferabil să avem întotdeauna cel puţin încă un frotiu (de rezervă), în special în cazul în care produsul patologic este „preţios” (LCR, produs recoltat prin puncţie-biopsie etc). în cazul suspicionării unei infecţii mycobacteriene este necesară realizarea unui al treilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examinează la microscopul optic, iniţial cu obiectivul 40× pentru o analiză mai generală, pentru stabilirea câmpului microscopic sau a zonei „de interes”, apoi cu obiectivul de imersie. Se notează prezenţa diferitelor celule (eventual modificate faţă de normal, „burate” de microorganisme), prezenţa celulelor inflamatorii (dovada reactivităţii organismului, ex. leucocite, surprinzând eventual fenomenul de fagocitoză), precum şi eventuala prezenţă a microorganismelor (bacterii, levuri, pseudofilamente, micelii), care va fi interpretată cu precauţie, în contextul dat. Chiar dacă examenul microscopic este de cele mai multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de fiecare dată, cu rigurozitate, în anumite situaţii putând fi foarte important şi foarte util. Atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de regulă nu se realizează frotiuri fixate şi colorate. Spre exemplu, în cazul materiilor fecale, se va face o coprocitogramă, un preparat proaspăt (nativ) între lamă şi lamelă, căutându-se în special prezenţa leucocitelor (dar şi a unor structuri care pot da anumite informaţii cu privire la funcţionalitatea tractului digestiv). În cazul suspicionării unei infecţii urinare, se va realiza un sediment urinar (după centrifugarea urinei), care se va examina între lamă şi lamelă în vederea aprecierii numărului de leucocite pe câmp microscopic, în cazul în care acestea există, în vederea aprecierii prezenţei unor cilindri leucocitari precum şi a altor celule normale sau patologice, a prezenţei unor elemente fungice etc., date care pot fi deosebit de utile în vederea unui diagnostic corect şi util pentru pacient. În cazul suspicionării unei infecţii micotice sunt utile atât preparatele proaspete (ex. preparatul montat în soluţie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraţii „negative” (tuş de India, nigrozină), precum şi frotiurile colorate May-Grünwald-Giemsa sau Gram. 277

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se va face în funcţie de situaţie (mediile şi condiţiile de incubare se vor alege în funcţie de presupusul microorganism pe care trebuie să-l izolăm; spre ex. în cazul în care infecţia este produsă de microorganisme strict anaerobe, în lipsa condiţiilor anaerobe de cultivare este imposibilă izolarea agentului etiologic). Pentru fungi trebuie utilizate mediile potrivite şi o temperatură mai mică decât cea utilizată în cazul bacteriilor. Cultivarea se va realiza în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate (tehnica „însămânţării în poligon”) şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolată, frotiu care se va fixa şi colora Gram sau Ziehl-Neelsen, după caz, şi se va examina microscopic. Prin examinarea frotiurilor se vor evidenţia numai microorganisme cu formă şi tinctorialitate similară (în cazul germenilor cu polimorfism important, ex. Proteus spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite (8), de la aspecte cocobacilare până la forme filamentoase). În cazul levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari. b) Caractere de cultură: se vor examina coloniile izolate apărute pe mediile de cultură solide şi care pot fi de tip S pentru majoritatea germenilor studiaţi inclusiv pentru levuri, de tip R în cazul Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosisşi Bacillus anthracis, de tip M în cazul bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae şi respectiv un aspect pufos în cazul mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor microbiene sunt prezentate în capitolele dedicate fiecărui gen în parte). c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbiană la alta şi pot fi foarte utile spre exemplu în cazul diferenţierii enterobacteriilor (introducerea în practică a „mediilor multi-test” permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API etc). În cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma. d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazându-ne pe structura şi antigenicitatea microorganismelor şi pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp. Vom utiliza anticorpi cunoscuţi pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacţii de aglutinare directă, pe lamă, se pot identifica antigenele şi respectiv speciile şi tulpinile din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc. e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora anumite substanţe cu rol în patogenitate (ex. coagulaza produsă de Staphylococcus aureus) sau infecţia experimentală a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie după inocularea sputei la şoarecele alb; în cazul în care în spută există pneumococi, animalul va muri în 24-48 de ore, iar din sângele lui se va izola o „cultură pură” de Streptococcus pneumoniae). f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie); g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode moderne) (vezi anexa nr. 7). 5. Antibiograma şi respectiv antifungigrama (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice antibacteriene şi antifungice, în vederea stabilirii tratamentului) se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În cazul unor infecţii grave, antibiograma difuzimetrică trebuie să fie completată de determinarea concentraţiei minime inhibitorii (CMI) şi respectiv bactericide (CMB). În infecţii grave, cu 278

potenţial fatal, poate fi necesară determinarea nivelului de eficienţă pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelului de eficienţă bactericidă (NEB) (vezi şi capitolul 7).

27. 2. 2. Diagnosticul de laborator imunologic poate fi serologic şi / sau imunobiologic. 27. 2. 2. 1. În cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezenţa (sau se va dovedi absenţa) anticorpilor, în serul pacientului investigat, utilizând antigene cunoscute. În diagnosticul serologic ne bazăm pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp şi utilizând diferite tehnici trebuie să putem răspunde la minim trei întrebări esenţiale, şi anume: - există anticorpi în serul pacientului investigat? - care este titrul anticorpilor? - cum evoluează în dinamică (în timp) acest titru; în acest sens se vor realiza minim două determinări diferite la un interval de 7-10 zile; această analiză ne va permite să diferenţiem situaţia unei afecţiuni acute (titrul anticorpilor este mai crescut la a doua determinare, în mod clasic de 4 ori), de situaţia în care pacientul este deja în convalescenţă (titrul anticorpilor la a doua determinare va fi mai scăzut) sau de situaţia unui pacient cu o afecţiune cronică (titrul anticorpilor va fi asemănător sau foarte apropiat la cele două determinări succesive). În vederea identificării unei infecţii acute, o variantă posibilă în majoritatea situaţiilor este determinarea anticorpilor specifici de tip IgM. 27. 2. 2. 2. În cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia, de exemplu, reactivitatea pacientului faţă de un anumit antigen inoculat. Intradermoreacţia la tuberculină (PPD, preparat proteic purificat) (9) sau la candidină (10) reprezintă exemple clasice, în acest sens. Tehnica intradermoreacţiei este folosită în mai multe scopuri şi trebuie să avem în vedere că în funcţie de scopul urmărit şi respectiv în funcţie de antigenul inoculat (şi de mecanismul implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit (vezi anexa nr. 3). Considerăm că pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe dintre principiile microbiologiei sunt foarte utile, merită să fie înţelese şi aplicate corespunzător. Pentru cei care se dedică microbiologiei sau bolilor infecţioase, aceste noţiuni reprezintă o bază obligatorie, care poate fi completată utilizând pe de o parte diferitele tratate medicale în domeniu dar şi experienţa personală dezvoltată atât din punct de vedere teoretic cât şi practic.

27. 3. Direcţii de cercetare Importanţa reală a promptitudinii şi a corectitudinii diagnosticului microbiologic este confirmată prin cercetări extensive în domeniu. Astfel, evaluarea performanţei actualelor metode de diagnostic şi elaborarea de noi tehnici de laborator constituie priorităţi în cadrul cercetării în domeniul microbiologiei şi al bolilor infecţioase. 279

Supravegherea epidemiologică, un proces de o importanţă colosală, depinde direct de efectuarea unui diagnostic microbiologic prompt şi corect. În acest domeniu, bacteriofagii sunt din ce în ce mai utilizaţi în laboratoarele epidemiologice de referinţă, servind la aşa-numitul „tipaj fagic” (11). Un mecanism central al patogenezei endocarditei infecţioase este considerat a fi reprezentat de legarea bacteriilor la trombocite. De exemplu, o variantă mutantă (SF100) de Streptococcus mitis aderă la trombocite prin intermediul unei lizine codificate de SM1, un bacteriofag lizogenic. Această lizină este o proteină multifuncţională ce aparţine unei clase recent descoperite de proteine ce leagă fibrinogenul (12). Precocitatea diagnosticului este unul dintre factorii de care depinde prognosticul unei boli. Astfel, un domeniu prioritar pentru cercetarea medicală este reprezentat de punerea la punct a unor noi teste diagnostice, care să poată fi utilizate cât mai precoce după momentul pătrunderii agentului patogen la nivelul organismului uman.De exemplu, un deziderat ar fi realizarea unui test urinar pentru identificarea antigenelor specifice bolii Lyme (cauzate de Borrelia burgdorferi). Până de curând, acest lucru nu a fost posibil din cauza concentraţiilor mici ale antigenelor la nivel urinar, sub limita de detecţie a testelor clasice. Recent, Douglas şi colaboratorii au demarat un studiu asupra rolului unui nou biomaterial (microparticule de tip hidrogel: Nizopropilacrilamida-acid acrilic) în capturarea şi implicit concentrarea biomarkerului urinar pentru Borrelia burgdorferi. Rezultatele preliminare au arătat că aceste microparticule au capacitatea de a concentra de 100 de ori biomarkerul de la nivel urinar, crescând sensibilitatea testelor antigenice urinare (13).

27. 4. Povestiri adevărate 27. 4. 1. Despre diagnostic şi tratament în infecţiile urinare Problema luată în discuţie este a unei colege mai tinere, studentă într-un „an mare” la medicină, dar de fapt, ca şi următoarea, poate fi considerată o problemă care poate fi a unui sistem şi nu a unui „caz particular”. În urmă cu mai mult de un an, colega noastră primeşte diagnosticul de litiază renală şi recomandarea de eliminare a calculilor prin litotripsie [manevră care constă în mărunţirea calculilor urinari, fragmentele fiind apoi eliminate în mod natural prin urină; accesul la calculi se face pe cale endoscopică şi sub control endoscopic; pulverizarea calculilor poate să fie realizată cu ajutorul unei pense (litotripsie mecanică), cu ajutorul ultrasunetelor (litotripsie ultrasonică), prin unde de şoc repetate (litotripsie electrohidraulică) sau cu ajutorul unei fibre laser (litrotripsie cu laser)]. Manevra este executată, cu succes (conform protocolului operator). După 5 luni, în anul următor, semnele clinice şi analizele de laborator (în special urocultura însoţită de testarea sensibilităţii la antibiotice) permit punerea diagnosticului de infecţie urinară (ITU) cu Escherichia coli. Viitorul medic primeşte norfloxacină, timp de 10 zile. Pentru că la 3 săptămâni de la primul diagnostic simptomatologia persistă, primeşte un nou tratament, de această dată cu amoxicilină + acid clavulanic. La încheierea celui de al doilea tratament, simptomatologia persistă şi colega ni se adresează solicitând un sfat, menţionând şi că medicul urolog i-a recomandat să înceapă un tratament cu cefuroximă (cefalosporină de generaţia a II-a) şi Uro-vaxom, timp de 20 de zile, apoi să refacă analizele. Tulpina de E. coli identificată la ultimul examen bacteriologic prezenta sensibilitate la: acid nalidixic, ceftazidim, cefuroxim, cotrimoxazol, fosfomicină, gentamicină, rezistenţă la: amoxicilină şi la amoxicilină + acid clavulanic şi era „intermediară” la norfloxacin (cu alte cuvinte, putem remarca „evoluţia sub tratament” a tulpinii, iniţial sensibilă la norfloxacin şi amoxicilină + acid clavulanic, rezistenţă „câştigată în trepte”). 280

La recomandarea noastră, colega se prezintă din nou la un control ecografic, conform căruia se pun în evidenţă „elemente litiazice”. Este cunoscut faptul că litiaza renală reprezintă unul dintre factorii de risc pentru apariţia şi persistenţa ITU. Opinia noastră a fost ca, în acest caz, analizele de laborator să se realizeze în INCDMI „Cantacuzino” şi pentru că era încă vacanţă iar reşedinţa nu era în capitală, colega noastră a respectat recomandarea în a doua jumătate a lunii septembrie. Din discuţiile pe cale „electronică” am aflat că medicul urolog a afirmat „că este vorba de o boală de tub renal” şi că în aceste condiţii trebuie să evite ITU, care pot fi factor de agravare. Colega noastră era deja îngrijorată datorită rezistenţei la tratament a infecţiei cu E. coli. După administrarea de Uro-vaxom, urocultura realizată la Bucureşti în luna septembrie a fost „sterilă”, situaţie conformă cu statusul clinic (lipsa semnelor sau simptomelor). Totuşi, după circa 2-3 săptămâni, semnele şi simptomele revin şi colega ni se adresează din nou, pentru un sfat, menţionând şi rezultatele obţinute la testarea sensibilităţii la antibiotice pentru tulpina de E. coli (menţionate mai sus) şi cerând să îi recomandăm unul dintre antibioticele din listă pentru a începe un nou tratament. Aşa cum nici diagnosticul şi prescrierea tratamentului la telefon nu reprezintă un bun exemplu în medicină, nici utilizarea „căii electronice” nu poate să substituie examenul clinic şi analizele de laborator. Având în minte aceste recomandări pe care le-am învăţat, la rândul nostru, în vremea studenţiei sau în timpul rezidenţiatului, singurul sfat pe care l-am putut exprima a fost: refacerea analizei de laborator, tot la INCDMI „Cantacuzino”. Sfatul a fost urmat iar diagnosticul a fost ITU cu Klebsiella pneumoniae, ceea ce a contrariat-o pe colega noastră (totuşi, rezultatul nu a fost surprinzător). Pentru că toată această discuţie se purta, din nou, pe „cale electronică” (colega noastră se întorsese în localitatea de reşedinţă) şi pentru că nu ştiam unde fusese realizat ultimul examen de laborator, în primul rând am solicitat această informaţie. Aflând atât laboratorul cât şi medicul care a pus diagnosticul, aceasta a reprezentat pentru noi o certitudine că ultimul diagnostic este şi el corect şi, în context, existau două posibilităţi „de primă intenţie”: 

infecţie cu un alt germen din flora proprie, în condiţiile litiazei renale;

infecţie dublă, atât la nivel urinar cât şi în alt sediu, care trebuie tratată simultan, urmând ca situaţia litiazei renale să fie rezolvată ulterior. 

Recomandarea a fost de realizare a unui nou examen bacteriologic. Apelând la unul dintre cei mai experimentaţi colegi, unul dintre puţinii şi adevăraţii profesori din catedra de microbiologie, în final a fost dovedită o dublă infecţie, ITU şi la nivel genital, cu Klebsiella pneumoniae. Tratamentul infecţiei la nivelul ambelor sedii a dus la vindecarea infecţiei, dispariţia semnelor şi simptomelor şi primirea mulţumirilor de rigoare, „prin email”. 27. 4. 2. Cu privire la lipsa diagnosticului microbiologic şi urmările acestei „lipse” Un alt coleg mai tânăr, de această dată în primii ani de studiu, a relatat după momentul în care am discutat şi rezolvat o situaţie particulară, medicală, că în vremea copilăriei a primit de foarte multe ori antibiotice, de regulă în cadrul unei „auto-medicaţii” stabilită în familie. Cele mai frecvente „probleme”, ca şi la mulţi alţi copii (dacă nu chiar la toţi) erau legate de nas-gât-urechi (ORL), iar medicamentele antimicrobiene primite s-au „repetat” anual şi de mai multe ori pe an până spre 281

vârsta de 13-14 ani. Se pare că un moment important a fost legat de o infecţie de acelaşi tip, cu manifestări ceva mai serioase, care au determinat familia să se prezinte împreună cu tânărul nostru la medicul de familie; acesta, analizând „auto-medicaţia” propusă a concluzionat că respectivul medicament în cantitatea propusă reprezenta un risc pentru pacient şi în acest context, pacientul a înţeles că nu trebuie să mai accepte medicaţia „ca atare” (chiar dacă era minor, la acea dată). Totuşi, colegul nostru a concluzionat: „oricum a fost suficient de mult timp să iau pastile aiurea”. Însă, toate aceste probleme s-au arătat a fi minore, faţă de ceea ce a urmat. Într-o toamnă, la început de liceu, într-o vineri (majoritatea problemelor importante/grave se pot petrece vinerea, în week-end, noaptea, „la sfârşit de program” etc), tânărul coleg a revenit acasă cu dureri foarte mari în zona articulaţiei coxo-femurale, după o lovitură aparent minoră, în cursul unui meci de fotbal. Una dintre erori a fost, probabil, faptul că prima reacţie acasă a fost o „baie fierbinte” (dar realmente fierbinte). După 36-48 de ore durerile s-au intensificat foarte mult şi copilul (avea totuşi numai 15 ani) nu s-a mai putut deplasa fără ajutorul unuia dintre părinţi sau a unui cadru metalic. Au început peripluri prin unităţi sanitare, iniţial la un spital cu profil de „urgenţe copii”, ulterior la un spital de urgenţă „pentru adulţi”, la o secţie de ortopedie (imaginile radiologice nu sugerau nimic, se pare). La cel de al doilea spital s-au administrat medicamente calmante, s-au efectuat noi radiografii plus recomandarea de a reveni luni, pentru noi analize. În timpul weekend-ului durerile s-au intensificat şi a fost înregistrată febra (peste 38,5ºC); copilul nu mai putea pune „pe pământ” membrul inferior drept. La recomandarea unor cunoştinţe, familia s-a îndreptat iniţial către cel de al treilea spital (cu profil „de copii”). La acest spital, în tot cursul dimineţii respective, nimeni nu a găsit timpul necesar pentru a îl consulta pe copil care menţionează, din amintiri: „nimeni nu s-a uitat la mine, eu mă ţineam de pereţi şi mama alerga...”, motiv pentru care au plecat de la al treilea spital şi s-au îndreptat spre cel de al doilea, cel cu profil „de adulţi”. Analizele efectuate au fost remarcabile prin intensitatea inflamaţiei (tradusă prin valorile înalte ale reactanţilor de fază acută) şi sugerarea unei infecţii. Medicul a luat legătura cu un coleg de la un al patrulea spital (cu profil „de copii”), suspicionând, se pare, un proces tumoral localizat osteo-articular. Din amintirile de copil am putea remarca «între timp trecuseră cam 5 zile, poate chiar o săptămână, urlam de durere când încercam să merg, abia mai puteam să mă dau jos din pat şi daca eram ajutat urlam de durere pentru că nu mai suportam să fiu atins; devenise un chin să merg la baie pentru că oricum dura mult şi acolo nu prea mai puteam să stau ... mi s-au făcut analize, radiografii; analizele indicau o „infecţie care creştea" în comparaţie cu analizele trecute ... radiografiile nu spuneau nimic». Medicii, după un timp, au indicat tratament cu oxacilină, 12g/zi, iar între diagnosticele diferenţiale luate în discuţie s-au aflat: cancer osos (cel mai frecvent discutat), tuberculoză osoasă, reumatism şi ... în cel mai bun caz, o infecţie (copilul, actualul nostru coleg, îşi aminteşte că după mult timp a aflat de la părinţi că a existat şi suspiciunea de cancer, dar părinţii au ştiut acest lucru de la început; şi îşi mai aminteşte şi alte aspecte, pe care nu le putem discuta în materialul de faţă). După circa 1 săptămână de la internare, pacientul se deplasa cu mare greutate, circa 15 metri în 30 de minute, ca să ajungă la baie („noroc cu nişte băieţi care stăteau cu mine în salon şi mă ajutau”). A primit în continuare oxacilină 12 g/zi, a fost examinat repetat, radiologic (se pare că s-au executat 20-25 de radiografii de bazin de la început şi până în timpul acestei internări), semnele de laborator (reactanţii de fază acută) au început să stagneze sau să evolueze pozitiv; durerile au continuat, la fel şi impotenţa funcţională. 282

La sfaturile unor prieteni, părinţii au decis să transfere pacientul în al cincilea spital, cu profil „de adulţi”, transfer care nu a fost realizat cu foarte multă uşurinţă, dar se pare că acest ultim transfer a fost salutar. Actualul nostru coleg poartă şi astăzi un deosebit respect celor care s-au ocupat de el în clinica de ortopedie a spitalului, atât şefului de clinică dar şi unui coleg, care la acea vreme era mai tânăr şi pe care avem plăcerea să îl cunoaştem şi noi. Datorită suspiciunii de cancer osos, au urmat alte analize, o tomografie computerizată şi o scintigrafie osoasă (din fericire infirmând respectiva suspiciune); tratamentul anti-infecţios a fost continuat iniţial cu oxacilină 2g/zi în asociere cu gentamicină 2mg/kg/corp (de 2 ori pe zi) timp de 2 săptămâni, urmat de tratament cu oxacilină 2g/zi. Tânărul nostru coleg îşi mai aminteşte că, înainte de transferul la al cincilea spital tratamentul a fost administrat intra-venos „când am plecat de la ... deja arătam ca un drogat; aveam pe mâini foarte multe vene sparte, cheaguri pe branule ...” iar în momentul în care a auzit pentru prima dată că a existat suspiciunea de cancer osos a slăbit circa 4 kg în 2 zile. În final, pacientul a fost externat, vindecat, după o lungă perioadă de suferinţă. Din discuţia cu tânărul nostru coleg şi din amintirile acestuia, nu am remarcat vreo încercare de diagnostic microbiologic, vreo recoltare de produs patologic care să fie transmis spre analiză (înainte de administrarea antibioticelor sau chimioterapicelor), vreo recoltare de sânge pentru hemoculturi. Nu putem menţiona toate impresiile pe care copilul, pacientul, tânărul coleg le-a acumulat pe parcursul acestei experienţe de viaţă. Totuşi, amintim o dorinţă exprimată de acesta „de fiecare dată când trebuie să merg la spital, mă rog să dau de un OM”. 27. 4. 3. Despre unele „teoreme” din timpul facultăţii sau rezidenţiatului Foarte mult timp, la cursuri în timpul studenţiei sau în timpul rezidenţiatului am fost învăţaţi că IDR cu PPD (vezi şi anexa nr. 3) „nu are nici o valoare, în România, pentru că toţi copiii sunt vaccinaţi la naştere, pentru că tuberculoza este endemică etc.; în aceste condiţii toţi cetăţenii români au IDR pozitiv şi o nouă testare nu va aduce nicio informaţie utilă.” Am suspicionat de mult timp că această „teoremă” nu are acoperire reală. În ultimii patru ani, prin colaborare cu o serie de studenţi entuziaşti (sigur, studiile trebuie continuate şi este necesară realizarea unor observaţii pe un lot semnificativ statistic), am început infirmarea acestor supoziţii, transmise, din păcate, multor generaţii de studenţi, rezidenţi etc. Din cei peste 60 de studenţi care au dorit să participe la studiu, în 40,9% dintre cazuri valoarea citirii la 48 şi 72 de ore a fost 0 (zero) milimetri în timp ce în 19,7% valoarea induraţiei a fost de peste 10 şi până la 22 milimetri. Într-un caz, consultul cu medicul de specialitate pneumo-ftiziolog a dus la recomandarea administrării de hidrazidă a acidului izonicotinic, pentru prevenirea unei tuberculoze manifeste, ceea ce probabil a fost salutar pentru respectivul, mai tânăr, coleg.

27. 5. Verificați-vă cunoștințele La următoarele întrebări se pot alege unul sau mai multe răspunsuri corecte (după caz): 1. Care dintre următoarele afirmaţii sunt corecte: A. anamneza este cea mai importantă componentă a demersului diagnostic B. anamneza, examenul clinic obiectiv şi investigaţiile paraclinice compun “trepiedul diagnostic” C. anamneza poate orienta examenul clinic obiectiv D. examenul clinic obiectiv poate suplini anamneza în cazul pacienţilor conştienţi şi cooperanţi 283

E. testele paraclinice se rezumă la tehnici de investigaţie imagistică 2. Următoarele afirmaţii sunt false, CU EXCEPŢIA: A. în bolile infecţioase, diagnosticul etiologic este doar un deziderat, necontribuind semnificativ la demersul terapeutic B. antibiograma nu mai este de actualitate în demersul diagnostic şi terapeutic în bolile infecţioase, cazurile de rezistenţă la antibiotice şi chimoterapice fiind din ce în ce mai rare C.recoltarea produselor patologice trebuie efectuată înainte de administrarea tratamentului antimicrobian D. saliva poate înlocui cu succes sputa ca şi produs patologic recoltat în infecţiile respiratorii inferioare E.în cadrul examenelor de laborator, diagnosticul microbiologic are doar semnificaţie istorică 3. În interpretarea curbei termice, este important să evaluăm următoarele aspecte: A.periodicitatea episoadelor febrile B.relaţia dintre puls şi temperatură C.administrarea de antibiotice şi/sau antipiretice D.pattern-ul de remisie a episoadelor febrile E.frecvenţa şi durata episoadelor febrile 4. În recoltarea produselor patologice trebuie ţinut cont de următoarele elemente: A.recoltarea pentru hemoculturi se face în timpul unui episod febril B.se solicită examinarea produselor transmise către laborator în termen de 7-10 zile de la recoltare C. este importantă alegerea momentului ideal pentru recoltare D.diagnosticul microbiologic ocupă un loc prioritar în cadrul examenelor de laborator E. în cursul recoltării, evitarea contaminării cu alţi germeni are doar caracter de recomandare, nefiind criteriu indispensabil 5. Următoarele afirmaţii legate de examinarea microscopică a produsului patologic sunt adevărate, CU EXCEPŢIA: A. se vor realiza minim două frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa şi respectiv Gram B. în cazul suspicionării unei infecţii urinare, sedimentul urinar se va examina între lamă şi lamelă C. prezenţa celulelor inflamatorii este un element frecvent decelat şi ca atare poate fi trecut cu vederea D. în cazul suspicionării unei infecţii mycobacteriene este necesară realizarea unui frotiu colorat Ziehl-Neelsen E.atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de regulă nu se realizează frotiuri fixate şi colorate

284

28. Prezentare generală a principalelor microorganisme studiate; necesitatea studierii microbiologiei Lumea microbiană este alcătuită dintr-un mare număr de ordine, familii, genuri, specii, subspecii, tipuri, subtipuri şi tulpini microbiene a căror prezentare face subiectul unor importante tratate în domeniu. În lucrarea de faţă vor fi incluse informaţiile considerate esenţiale şi care sunt organizate utilizând un stil, pe care îl considerăm folositor. O prezentare exhaustivă, a tuturor amănuntelor, ar putea conduce la neglijarea aspectelor care chiar nu trebuie să fie uitate, indiferent de specialitatea în care ne desfăşurăm activitatea. Considerăm că materialul redactat este util nu numai în scopul pregătirii unui examen (care nu ar trebui în nici un caz să fie considerat un scop în sine) ci este (ar trebui să fie) util reţinerii unor noţiuni şi principii microbiologice care pot permite ulterior (indiferent de specialitatea aleasă) o abordare corectă, ştiinţifică a procesului infecţios. Microbiologia medicală reprezintă o specialitate care poate asigura (în condiţiile în care colaborarea între clinică şi laborator funcţionează) date foarte precise, oferind suportul stabilirii unor atitudini, uneori decisive pentru evoluţia ulterioară a pacientului. În acest sens se pot da numeroase exemple, dar ne vom opri asupra a trei dintre acestea. În cazul în care un pacient se prezintă la medic şi afirmă că are o infecţie urinară, medicul va putea, prin efectuarea în mod corect a anamnezei (ex. discuţia cu pacientul respectiv) şi a examenului clinic, să realizeze un prim pas către diagnostic şi stabilirea tratamenului. Însă certitudinea diagnosticului şi stabilirea tratamentului corect vor rezulta numai prin examenul de laborator. Într-o suspiciune de infecţie urinară, urocultura cantitativă trebuie precedată de examenul microscopic al sedimentului urinar care necesită o dotare minimă (eprubete, centrifugă fără pretenţii, lame, lamele, microscop optic nesofisticat şi mai ales,dorinţa medicului de a face cât mai mult şi cât mai bine pentru pacienţii săi). Urina recoltată corect (adică aşa cum se cunoaşte încă din facultate) trebuie examinată macroscopic, centrifugată iar sedimentul urinar trebuie examinat microscopic. În circa 20 de minute (sau mai puţin) se va putea observa eventuala prezenţă a leucocitelor în sediment, amănunt care va permite (în contextul clinic respectiv) aprecierea corespunzătoare a situaţiei şi adoptarea atitudinii celei mai potrivite. Utilizarea corectă a datelor de laborator va permite nu numai o diminuare a risipei de medii de cultură şi reactivi (nu în ultimul rând a timpului celui / celor care procesează probele) ci şi o posibilă direcţionare spre un alt diagnostic decât cel al unei eventuale infecţii urinare, interpretată în mod mecanic sau la indicaţia / solicitarea pacientului. Un studiu pe care nu l-am publicat a arătat că într-unul dintre spitalele din Bucureşti, din peste 10.000 de uroculturi efectuate, s-au pozitivat mai puţin de 20%; examinarea sedimentului urinar ar fi putut contribui la selectarea situaţiilor în care urocultura „merita” să fie făcută. În cazul prezenţei unor dureri de cap intense (cefalee), a apariţiei fotofobiei, vărsăturilor fără efort, poziţiei caracteristice (antalgice) se ridică ipoteza unei meningite a cărei etiologii nu se poate preciza fără diagnosticul 285

de laborator. Acest diagnostic va permite diferenţierea unor meningite în funcţie de cauză [există meningite neinfecţioase şi meningite infecţioase (virale, bacteriene, parazitare sau fungice), iar examenul biochimic la LCR împreună cu diagnosticul de laborator microbiologic vor putea arăta care este etiologia]. Acest lucru este de maximă importanţă atât pentru evoluţia ulterioară, cât şi pentru prognosticul pacientului implicat deoarece este bine cunoscut faptul că în cazul meningitei există şi posibilitatea unei evoluţii nefavorabile, cu persistenţa unor sechele sau chiar apariţia decesului. În cazul unei meningite (inclusiv a unei meningite meningococice), recoltarea şi transportul lichidului cefalo-rahidian este esenţială. Este de preferat ca medicul să ştie care sunt manevrele necesare pentru a procesa produsul patologic "la patul bolnavului". Realizarea şi examinarea corectă a frotiurilor va permite nu numai ca în maxim 20 minute să se pună diagnosticul de meningită meningococică (prezenţa leucocitelor şi a cocilor Gram-negativi intra şi extra-leucocitari) dar şi să se instituie tratamentul (de ex. cu penicilină). În cazul în care pacientul prezintă febră, tuse şi expectoraţie nu este recomandată administrarea unor antibiotice doar pe baza existenţei acestor semne. Administrarea unui antibiotic cu spectru larg (ex. tetraciclină) ar putea crea probleme suplimentare. Dacă dorim să procedăm corect, după anamneză trebuie să urmeze examenul clinic complet, revenind cu minuţiozitate asupra examinării semnelor şi simptomelor în relaţie cu aparatul respirator. Dintre examenele paraclinice se realizează de obicei radiografia cardio-toracopulmonară. Alte examene de laborator (aşa cum am menţionat în capitolul precedent) sunt necesare şi trebuie efectuate. Din punct de vedere microbiologic, recoltarea corectă şi transportul sputei reprezintă elementul esenţial. În laborator sputa va fi prelucrată, vom realiza cel puţin trei frotiuri pe care le fixăm şi colorăm cu AM / Giemsa, Gram şi Ziehl-Neelsen. Din momentul recoltării produsului patologic şi până la obţinerea primelor informaţii prin examinarea frotiurilor, pot trece nu mai mult de 20-30 minute. În cazul în care nu parcurgem aceste etape şi de ex. administrăm direct tetraciclină, evoluţia pacientului ar putea fi nefavorabilă, chiar şi către deces, iar frotiurile realizate şi examinate post-mortem (pe produse recoltate anatomo-patologic) ar putea demonstra prezenţa de hife şi levuri, semnificând o infecţie fungică. Continuând cu etapa de identificare am putea stabili, de ex., că a fost vorba de o pneumonie provocată de Candida albicans. Decesul a fost precipitat de utilizarea iraţională a tetraciclinei, medicament care distrugând flora de asociaţie a permis multiplicarea „în voie” a fungului respectiv. Dacă am fi examinat sputa recoltată de la bolnav am fi putut detecta prezenţa elementelor fungice şi am fi ales medicaţia corespunzătoare. Bacteriile studiate pot fi grupate după mai multe criterii, dar o variantă utilă este cea în care avem în vedere structura peretelui bacterian şi respectiv afinitatea acestuia faţă de diferiţi coloranţi. Un prim grup important este cel care include cocii cu importanţă medicală, Gram-pozitivi (stafilococi, streptococi, pneumococi etc) şi respectiv Gram-negativi (meningococi, gonococi etc). Între bacteriile Gram-negative care au dimensiuni pe baza cărora nu pot fi încadrate drept coci sau bacili se află parvobacteriile,cocobacilii Gram-negativi (H. influenzae, B. pertussis, Brucella spp. etc). Bacilii Gram-pozitivi care vor fi incluşi în prezentările din acest manual se pot grupa în bacili nesporulaţi (Corynebacterium diphteriae, Listeria spp.) şi respectiv bacili Gram-pozitivi sporulaţi (Bacillus anthracis, Clostridium spp.). Totuşi, nu trebuie să uităm că există şi alţi bacili Gram-pozitivi. Bacilii Gram-negativi studiaţi fie aparţin familiei foarte numeroase a enterobacteriilor (E. coli, Salmonella spp., Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp. etc), fie sunt incluşi în genuri separate precum V. cholerae din genul Vibriosau Ps. aeruginosa din genul Pseudomonas. 286

Microorganismele din genul Mycobacterium se pot colora (cu destul de mare dificultate; uneori nu se colorează şi apar sub aspectul unor zone necolorate, „fantome” bacteriene) prin metoda Gram, dar în mod caracteristic se colorează prin metoda Ziehl-Neelsen. O adaptare a tehnicii Ziehl-Neelsen este medoda de colorare Kinyoun. Specia principală studiată este M. tuberculosis. Există şi alte specii de mycobacterii dar şi bacterii aparţinând altor specii şi genuri, care se pot colora prin aceste tehnici. O serie de bacterii spiralate (Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.) nu se colorează prin metoda Gram datorită structurii particulare a peretelui. Pot fi studiate microscopic fie în preparate proaspete (utilizând tehnici microscopice speciale) fie utilizând coloraţii particulare (ex. impregnarea argentică). Până în urmă cu o perioadă de timp microorganismele aparţinând genurilor Rickettsia, Chlamydia şi Mycoplasma erau incluse în categoria virusurilor. Totuşi, proprietăţile lor fundamentale fac să le studiem astăzi între bacterii. În obiectul de studiu sunt încadraţi şi fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici aparte. Noţiunile legate de micologie sunt reluate în cadrul dermatologiei iar diagnosticul micologic este prezentat mai pe larg în diferite tratate de specialitate. Pentru fiecare microorganism studiat am abordat aspecte legate de încadrarea într-un anumit gen, caracterele generale mai importante (habitat, caractere morfo-tinctoriale, caractere de cultură, caractere biochimice, rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici, structura antigenică şi răspunsul imun realizat în organismul gazdă, precum şi caracterele de patogenitate). Legat de caracterele distinctive ale microorganismului studiat am prezentat, în general foarte succint, date cu privire la patogenia principalei afecţiuni clinice produse (cu enumerarea mai multor entităţi clinice, de la caz la caz). Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganismele avute în vedere este axat pe datele microbiologice (diagnostic bacteriologic şi respectiv diagnostic imunologic) urmând schema care a fost deja prezentată. Utilizarea în mod repetat a unei scheme clare permite o mai bună fixare a cunoştinţelor precum şi atingerea obiectivului stabilit: reţinerea unor principii de către mai tinerii colegi, indiferent de specialitatea care va fi aleasă ulterior, sau de către medici. Microbiologia este, după opinia noastră, o ştiinţă cu foarte mare aplicabilitate practică. Elementele de bază ale microbiologiei sunt necesare şi utile pentru toţi partenerii implicaţi în sistemul sanitar. Cunoaşterea acestor elemente de bază ar putea preveni o serie de anomalii şi erori care uneori pot avea consecinţe dezastruoase (aşa cum s-a întâmplat de ex. într-o maternitate în care o serie de nou-născuţi au decedat datorită unor infecţii nosocomiale contractate după naştere, în anul 2004). În final vom oferi, pe scurt, unele noţiuni legate de tratament, modalităţile de transmitere şi respectiv de prevenire a transmiterii germenului discutat. În privinţa datelor epidemiologice, pentru unele dintre microorganisme / boli vor fi prezentate date concrete (în cazul acelor maladii pentru care există un sistem de supraveghere şi datele sunt disponibile). Exemplele vor fi redactate comparativ, pentru sistemul de sănătate american şi cel românesc. Motivaţia alegerii datelor din USA este reprezentată de faptul că sistemul american de sănătate publică şi supraveghere epidemiologică pentru sănătatea publică poate fi privit ca un model, iar aceste date sunt publicate în mod periodic, fiind puse la dispoziţia autorităţilor sanitare, unităţilor sanitare, medicilor şi oricărei persoane care doreşte să obţină aceste informaţii (http://www.cdc.gov). Recomandăm, de 287

asemenea, consultarea site-ului http://ecdc.eu.int, site al Centrului European de Prevenire şi Control al Bolilor Infecţioase („communicable diseases”), mai recent înfiinţat, dar cu o evoluţie rapidă şi pozitivă. În ceea ce priveşte tratamentul, este util să reţinem că pentru majoritatea situaţiilor este necesară izolarea microorganismului implicat, identificarea acestuia şi testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice (de ex. utilizând cel puţin antibiograma difuzimetrică).

29. Genul Staphylococcus 29. 1. Definiţie. Încadrare Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulaţi, catalază-pozitivi. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele dintre aceste grupuri incluzând mai multe specii). S. aureus este şi specia recunoscută cel mai de mult (Rosenbach, 1884), în timp ce una dintre speciile recunoscute mai recent,S. succinus, se estimează că ar avea o „existenţă” de mai multe milioane de ani. Numărul speciilor din acest gen a ajuns la 35, însă numărul este şi mai mare dacă luăm în consideraţie şi subspeciile (de ex. S. aureus subspecia aureus şi S. aureussubspecia anaerobius). Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de: - S. aureus; - S. epidermidis (produce un pigment alb); - S. saprophyticus (produce un pigment citrin). S. aureus reprezintă specia cel mai frecvent implicată în clinică, în timp ce celelalte două specii sunt de obicei nepatogene. În funcţie de capacitatea de a elabora coagulază, toţi stafilococii coagulazo-pozitivi sunt grupaţi ca S. aureus.

29. 2. Caractere generale 29. 2. 1. Habitat S. aureus se poate multiplica la nivelul tegumentelor şi mucoaselor (în special în zonele piloase şi la nivelul vestibulului nazal). Există o serie de factori care determină şi/sau influenţează starea de purtător pentru S. aureus. O parte dintre aceşti factori sunt legaţi de apărarea la nivel de gazdă, o parte sunt corelaţi cu anumite proprietăţi ale bacteriei. Dintre acestea, menţionăm formarea de biofilm (caracteristică tulpinilor care se pretează portajului nazal, dar nu şi celor care nu determină stare de portaj) (1), care pare să faciliteze nu numai creşterea supravieţuirii bacteriilor în contextul tratamentului antibiotic, dar şi evitarea mecanismelor de apărare specifice gazdei, care pot fi de tip peptide antimicrobiene precum: lizozimul, lactoferina, SLPI (secretory leukoprotease 288

inhibitor), catelicidine, alfa şi beta defensine (2), inclusiv beta defensina umană 3 (HBD-3), cea mai eficientă dintre beta defensine în ceea priveşte rolul în infecţiile cu S. aureus (3). Deoarece unele studii arată că circa 20% dintre persoanele sănătoase sunt purtătoare în mod permanent de S. aureus iar în circa alte 50-60% dintre cazuri este discutată situaţia portajului temporar, s-a intuit că există un anumit grad de influenţă genetică privind starea de purtător de S. aureus. Într-un studiu transversal recent la care au participat în mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studenţi au fost purtători de Staphylococcus aureus, nazal şi/sau faringian. Un studiu similar, transversal, efectuat în 2010 în Brazilia, pe un lot comparabil de voluntari (incluzând studenţi aflaţi în finalul anilor 1 şi 2 de facultate în domeniile: farmacie, medicină dentară şi medicină generală), a decelat un procent de portaj nazal de 40,8% (102/250), un CMI (50) la meticilină de 0,5 µg/mL şi un CMI (90) de 1 µg/mL. Datele obţinute de noi în România sunt comparabile cu cele obţinute în Brazilia, cu atât mai mult cu cât există similitudini şi la nivelul loturilor de voluntari incluse în studiu. Stafilococii coaguloază-negativi (SCN) formează microcolonii la nivelul foliculilor piloşi (4) şi la nivelul glandelor sebacee. Habitatul principal pentru S. epidermidis este reprezentat de vestibulul nazal. Deoarece au un tropism special pentru derm, stafilococii pot fi implicaţi în infecţii la nivelul tegumentelor şi anexelor pielii (infecţii însoţite de puroi), dar pot fi implicaţi şi în infecţii localizate la nivelul oricărui alt ţesut sau organ.

29. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm. Pe frotiul realizat din cultura pe medii solide se poate remarca o dispoziţie în grămezi neregulate. În frotiurile realizate din culturi pe medii lichide sau din produse patogene, se pot dispune în lanţuri scurte, perechi sau coci izolaţi. În culturile cu o vechime mai mare de 2 zile, stafilococii pot apărea ca şi Gram-variabil sau chiar şi Gram-negativi „la limită”.

29. 2. 3. Caractere de cultură Se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Coloniile au aspect de tip S, au diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate în funcţie de specia izolată. Pigmentarea devine mai pronunţată după menţinerea plăcii cu mediul de cultură încă 24-48 ore la temperatura camerei. Pe mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară (β-hemoliză), dar S. aureus poate produce mai multe tipuri de hemolizine. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl (exemplu mediul Chapman).

29. 2. 4. Caractere biochimice 289

Stafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât şi fermentativ. Fermentează glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de diferenţiere între S. aureus (manită-pozitiv) şi SCN (manită-negativ). Stafilococii sunt catalază-pozitivi.

29. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici Stafilococii sunt relativ rezistenţi faţă de agenţii din mediul extern. În culturi (bulion, geloză), rezistă la temperatura frigiderului câteva luni; în puroi uscat pot supravieţui 2-3 luni. Sunt relativ rezistenţi la anumite antiseptice şi dezinfectante (de exemplu, rezistă peste 30 minute la alcool 70°şi peste 10 minute în fenol 2%). Sunt distruşi în 60 minute la o temperatură de 60°C.

29. 2. 6. Structură antigenică 29. 2. 6. 1.Structuri antigenice legate de corpul celular a). Capsula este prezentă la un număr mic de tulpini de S. aureus; este alcătuită din acid glucozaminuronic. „In vivo“ pare a fi mai frecventă decât s-ar crede (examinând la microscop tulpinile cultivate). Tulpina încapsulată prototip de S. aureus (tulpina Smith) dă naştere spontan la variante necapsulate. b). Polizaharidul A a fost identificat la S. aureus, în timp ce la S. epidermidis s-a pus în evidenţă un polizaharid B. Ambii sunt acizi teichoici. Astăzi se cunoaşte structura ambilor acizi teichoici, precum şi a grupărilor răspunzătoare de specificitatea antigenică a fiecăruia. c). Proteina A apare ca o componentă de suprafaţă la toate tulpinile de S. aureus (proteina Cowan). Are o greutate moleculară de 42 kDa şi poate induce apariţia de anticorpi specifici (este imunogenă). Este de menţionat faptul că proteina A interacţionează nespecific cu porţiunea Fc a imunoglobulinelor de la practic toate speciile de mamifere. Ca urmare a interacţiunii dintre proteina A şi fragmentul Fc, apar o serie de efecte biologice precum: anafilaxie locală şi sistemică la animale, reacţii urticariene la om, activarea complementului pe calea clasică şi alternativă urmată de generarea de factori chemotactici, inhibarea activităţii opsonizante a anticorpilor (prin competiţie cu receptorii pentru Fc de pe fagocite), proliferarea limfocitelor B umane etc. Proteina de suprafaţă A este unul dintre factorii determinanţi ai virulenţei şi ai formării de biofilm (5), iar un studiu recent (2) a sugerat şi o asociere a statusului de purtător nazal de S. aureus cu un nivel crescut al expresiei acestei proteine. d). Majoritatea tulpinilor necapsulate de S. aureus aglutinează atunci când sunt suspensionate în plasmă sau în soluţii de fibrinogen. Factorul răspunzător de această reacție este o coagulază legată („clumping factor”; factor de aglutinare/agregare) la nivelul suprafeţei celulei bacteriene. Acest factor poate fi prezent şi la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. În cazul în care în testul coagulazei pe lamă se foloseşte plasmă umană, rezultatul poate fi pozitiv şi pentru S. lugdunensis şi S. schleiferi(subspecia schleiferi). e). Adezinele sunt proteine de suprafaţă specifice, prin care stafilococii se fixează pe proteinele matriciale de la suprafaţa celulelor gazdei (ex. laminină, fibronectină, elastină, colagen, proteina A etc). Par a fi implicate în colonizarea matricei intercelulare, în invazia ţesuturilor şi în rezistenţa la fagocitoză. 290

29. 2. 6. 2.Structuri antigenice extracelulare produse de stafilococi a). Stafilococii, mai ales S. aureus, produc o mare varietate de exoproteine imunogene. Majoritatea sunt proteine accesorii care, în condiţii de creştere optime, sunt sintetizate la sfârşitul perioadei de creştere exponenţială sau la începutul fazei staţionare. În condiţii suboptime (de exemplu deficit de Mg2+), condiţii care se pot întâlni şi în ţesuturile infectate, aceste proteine pot fi sintetizate în tot cursul fazei exponenţiale. b). Filtratele culturilor de S. aureus coagulează plasma recoltată de la o serie de specii animale sub acţiunea coagulazei, care este cel mai important marker pentru S. aureus. S-au descris mai multe coagulaze antigenic distincte. Există totuşi şi tulpini de stafilococ implicate patogenic care sunt coagulază-negative. Unele tulpini coagulază-negative produc o metaloproteinază care are o activitate asemănătoare cu cea a coagulazei, ceea ce poate crea probleme în identificare. Coagularea necesită prezenţa unui factor coagulazo-reactant (FCR), care este probabil un derivat de protrombină. Complexul coagulazei realizat cu FCR converteşte fibrinogenul în fibrină. Procesul diferă de coagularea normală prin faptul că nu sunt necesari o serie de factori (ex. Ca2+) iar cheagul care se formează este mai friabil şi nu se retractă. Studii recente demonstrează că TFPI (inhibitorul căii factorului tisular), prin secvenţa sa C-terminală, joacă un rol antimicrobian împotriva S. aureus şi împotriva altor bacterii Grampozitive (Bacillus subtilis), Gram-negative (Escherichia coli şi Pseudomonas aeruginosa) şi chiar împotriva fungilor Candida albicans şi Candida parapsilosis (6). c). Stafilococii pot produce o serie de hidrolaze cu structuri antigenice diferite, precum: - stafilokinaza, care determină liza cheagului (prin convertirea plasminogenului în plasmină) sub controlul unui material genetic fagic; - nucleaza (termonucleaza), cu activitate endo- şi exonucleazică asupra ADN şi ARN, generând 3'-nucleotide; - diferite lipaze evidenţiabile prin opacifierea agarului cu gălbenuş de ou sau prin scindarea substanţei numită Tween; contribuie la supravieţuirea stafilococului la nivel dermic; - hialuronidaza; - ureaza; - diferite proteaze (serin protează, cistein protează, metaloprotează). d). În momentul se faţă se cunosc patru hemolizine produse de stafilococi. O tulpină anume poate produce mai multe hemolizine. Unele dintre hemolizine distrug şi alte celule, ducând la o necroză locală şi pot avea efecte letale asupra animalelor de experienţă. Principalele caractere ale hemolizinelor sunt următoarele: 1. a-hemolizina (a-toxina) este principala hemolizină produsă de S. aureus. Are activitate maximă asupra hematiilor de iepure; hematiile de om nu sunt susceptibile. Afectează trombocitele şi celulele umane în cultură. Are efect dermonecrotic asupra animalul de experienţă (injectată local) şi efect letal (injectată intravenos). Efectul ei principal este reprezentat de producerea de spasme ale muşchilor netezi vasculari. S-a identificat receptorul de pe suprafaţa membranei eritrocitului, o sialoglicoproteină. Este secretată sub forma unui monomer hidrosolubil de 34.000 Da, care se rearanjează în contact cu un receptor de membrană, formând un hexamer cilindric care străpunge membrana celulei şi proemină la suprafaţa ei, generând un por cu un diametru de 23 nm (există asemănări cu complexul litic C5b-C9 al C'). 2. β-hemolizina este produsă de majoritatea stafilococilor identificaţi la animale, dar numai de 10-20% dintre stafilococii umani. Produce o hemoliză de tip „cald-rece“. Este de fapt o sfingomielinază C, activată de Mg2+, nu însă şi de Ca2+. Efectul (în ordine descrescătoare) se exercită asupra hematiilor de oaie, om, cobai 291

(ceea ce corespunde cu concentraţia de sfingomielină a hematiilor). Este citotoxică pentru diferite culturi de celule. În doze mari, este toxică pentru animalele de experienţă. 3. g-hemolizina este un complex de două proteine bazice care acţionează în cooperare. Hematiile susceptibile sunt cele de iepure, om, oaie, nu şi cele de cal sau pasăre. Efectul ei este inhibat de agar şi de diferiţi polimeri sulfataţi. Nu are efect atunci când se utilizează plăci cu agar-sânge. Acţiunea este inhibată de colesterol şi de alte lipide. 4. d-hemolizina este produsă de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus. Constă din agregate heterogene de subunităţi de circa 5.000 Da. Acţionează pe diferite celule (hematii, leucocite, celule de mamifere cultivate) şi nu are specificitate de specie. e). Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene, un grup de toxine cu mai multe activităţi patogene, spre exemplu cu efecte imunosupresoare, cu un efect mitogen mai pronunţat la nivelul limfocitelor T supresoare (au capacitatea de a activa policlonal toate celule T); cresc toxicitatea endotoxinelor germenilor Gram-negativi (blochează funcţia de clearance a sistemului reticuloendotelial); produc eritrodermie prin mecanisme de hipersensibilitate de tip întârziat. Efectul piretogen se realizează cel puţin în parte prin stimularea producerii de IL-1. Din acest grup fac parte exotoxinele piretogene A şi B, enterotoxinele stafilococice (cu cinci tipuri serologice) şi respectiv TSST-1, cauza sindromului de şoc toxic stafilococic. Circa 50% din tulpinile de S. aureus izolate produc una sau mai multe enterotoxine. Aproximativ 15% produc TSST1. Mai rare sunt tulpinile care produc exotoxine piretogene A şi B. f). Leucocidina este produsă de majoritatea tulpinilor de S. aureus şi acţionează numai asupra polinuclearelor şi macrofagelor de om şi iepure. Are două componente, F şi S. Componenta S se fixează pe gangliozidul GM1 (receptor pentru toxina holerică) şi activează o fosfolipază endogenă, legată de membrană. Produşii acesteia se fixează apoi pe componenta F, inducând apoi un canal ionic pentru K+şi conducând astfel la citoliză. g). Exfoliatina (toxina epidermolitică) produce o varietate de leziuni dermatologice. Este o proteină termolabilă şi acid-labilă, cu greutatea moleculară de 24.000 Da, produsă de circa 5% din tulpinile de S. aureus. S-au descris două variante antigenice, ETB (codificată de un plasmid) şi respectiv ETA (codificată cromozomial). Multe tulpini produc ambele exfoliatine. Toxina acţionează prin clivarea stratului granular al epidermului, probabil prin scindarea desmosomilor care unesc celulele acestui strat. 29. 2. 6. 3.Bacteriocine S. epidermidisproduce epidermina (stafilococina 1580) şi Pep5, care sunt lantibiotice. S. gallinarum produce galidermina. Aceste lantibiotice au efecte în special asupra bacteriilor Gram-pozitive, chiar şi asupra unor tulpini de stafilococi din altă specie decât cea producătoare.

29. 2. 7. Răspuns imun Imunitatea postinfecţioasă este specifică faţă de produşii extracelulari (toxine, enzime) şi faţă de antigenele legate de corpii bacterieni. Titrul anticorpilor antistafilococici este scăzut (creşte, eventual, în cursul unor infecţii generalizate, dar nu influenţează evoluţia spre vindecare) şi nu are utilitate practică în diagnostic. Există un însemnat potenţial de producere a unui vaccin stafilococic care să poată fi acceptat în Uniunea Europeană (deocamdată nici un astfel de produs nu are licenţă la nivelul UE). 292

S. aureus are posibilitea de a îşi modifica fenotipul, prezentându-se sub forma de SCV (small colony variants), pentru a scăpa sistemului imun şi pentru a genera o infecţie cronică. Un studiu pe modele celulare a arătat că printre tehnicile de persistenţă se află modificarea expresiei factorilor de virulenţă, auxotrofismul (inabilitatea unui microorganism de a sintetiza un compus organic necesar procesului de creştere) dar şi această diversitate fenotipică, care s-a dovedit a fi un proces extrem de dinamic, fenotipurile SCV transformându-se rapid înapoi în fenotipurile sălbatice complet virulente în momentul părăsirii localizării intracelulare (7).

29. 2. 8. Caractere de patogenitate Atât S. aureus cât şi o parte dintre SCN sunt incluşi în categoria microorganismelor condiţionat patogene.

S. aureus apare mai frecvent implicat în producerea unor infecţii, de obicei la nivelul tegumentelor şi mucoaselor, însoţite de formarea de puroi, dar cu potenţial de generalizare. Tulpinile de S. aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, în special datorită prezenţei acidului lipoteichoic, proteinei A şi altor adezine. După aderare şi multiplicare, în cursul infecţiilor pot fi produse o serie de substanţe cu rol în patogenitate (enzimele şi toxinele elaborate au fost prezentate la punctul 29. 2. 6). De menţionat şi faptul că stafilococii reprezintă unele dintre primele microorganisme pentru care s-a descris fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice. Rezistenţa la penicilină (mediată de o β-lactamază) a fost evidenţiată încă din anul 1947. Ulterior, pe măsura utilizării în infecţiile stafilococice a unor diferite antibiotice (inclusiv a „penicilinelor penicinilazo-rezistente“), s-au selectat tulpini rezistente la meticilină, oxacilină, tetraciclină, cloramfenicol, macrolide, aminoglicozide etc. Un studiu recent a evaluat prevalenţa portajului de MSSA şi de MRSA în departamentele de urgenţă din SUA, la pacienţi în principal fără manifestări sugestive pentru infecţia stafilococică. Prevalenţa portajului MSSA a fost estimată la 39% iar prevalenţa colonizării cu MRSA a fost de 5%. Dintre pacienţii colonizaţi MRSA, 80% au prezentat şi cel puţin o colonizare extranazală, pe când 45% au prezentat colonizare exclusiv extranazală (8). Până în anul 1996, vancomicina reprezenta tratamentul de elecţie al infecţiilor cu S. aureus rezistent la alte antibiotice şi chimioterapice. Au fost raportate tulpini stafilococice intermediare sau rezistente la vancomicină. În privinţa sensibilităţii/rezistenţei la vancomicină au fost descrise trei variante de S. aureus, respectiv: 

S. aureus cu un nivel intermediar de rezistenţă la vancomicină (VISA),



S. aureus cu hetero-rezistenţă la vancomicină (hVISA) şi



S. aureus rezistent la vancomicină (VRSA).

În mod clasic era considerat că o tulpină de S. aureus intră în categoria VISA în cazul în care CMI este ≥ 6 μg/ml (determinare prin „E test”) şi în categoria VRSA în cazul în care CMI este ≥ 32 μg/ml. Conform EUCAST (2010), o tulpină de stafilococ este rezistentă la vancomicină în cazul în care CMI este > 2 μg/ml. Opţiunile de tratament în infecţiile cu VRSA sunt limitate. O clasă de antimicrobiene care poate fi utilizată în 293

tratamentul VRSA este reprezentată de streptogramine (quinupristin/dalfopristin, pristinamicina, virginiamicina, NXL 103, etamycin). Cu toate acestea, a fost identificată rezistenţă şi la streptogramine (9), existând totuşi posibilitatea tratării S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalenţa acestui fenotip fiind însă redusă, de 60,3%, spre deosebire de prevalenţa de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide şi streptogramina B (10).

29. 3. Patologie specifică şi principalele afecţiuni produse Stafilococii pot deveni patogeni şi se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare şi invazivitate, fie prin multiplicare şi toxinogeneză (fiind posibilă şi îmbinarea acestor mecanisme). Determinanţii patogenităţii stafilococului includ produsele toxice şi enzimatice, care au fost prezentate la punctul 29. 2. 6. Spre exemplu, a-toxina are rol în generalizarea infecţiilor şi respectiv apariţia sepsisului; dhemolizina şi leucocidina explică de ce S. aureus este mai dificil de distrus prin fagocitoză în comparaţie cu SCN; lipaza este importantă în mecanismul de producere a furunculelor; coagulaza contribuie la localizarea şi persistenţa infecţiei; hialuronidaza contribuie la invazivitate etc. Ar fi de menţionat că tulpinile izolate de la nivelul unor furuncule sunt mai bogate în lipază şi mai sărace în hialuronidază faţă de cele izolate din impetigo bulos. Tulpinile capsulate sunt mai virulente (împiedică fagocitoza); frecvenţa lor pare a fi mai mare „in vivo”, deci rolul capsulei pare a fi mai important decât se credea anterior. Datorită faptului că nici unul din caracterele enumerate nu pare a fi decisiv în virulenţa stafilococilor, tulpinile de S. aureus nu pot fi clasificate net în patogene şi nepatogene, aşa cum se poate face de ex. în cazul tulpinilor de Corynebacterium diphteriae, tox+sau tox-.

S. aureus este implicat ca agent etiologic într-o mare varietate de infecţii supurative (cu puroi), începând cu infecţiile superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor şi continuând cu panariţii, furuncule, abcese profunde, infecţii ale diferitelor organe interne cu sau fără generalizarea infecţiei. Pe de altă parte, ar fi de menţionat toxinozele (datorate în special toxinelor elaborate) şi anume toxiinfecţiile alimentare, necroliza toxică a epidermului, sindromul de şoc toxic etc. Toxiinfecţiile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente în alimente în care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Simptomele principale sunt reprezentate de greţuri, crampe abdominale, vărsături, diaree care apar la 1-4 (1-6) ore după ingestia alimentelor contaminate. Se vindecă în general în circa 24 de ore. Alimentele sunt contaminate în general de către cei care le manipulează (de exemplu bucătarul prezintă un panariţiu). Alimentele mai frecvent incriminate sunt cremele, brânza, îngheţata, carnea şi produsele din carne (acestea pot constitui adevărate medii de cultură pentru bacterii). Enterotoxinele stafilococice sunt termostabile (rezistă 30 minute la 100°C), ceea ce impune păstrarea alimentelor la frigider, atât înainte cât şi după preparare. Dermatitele exfoliative includ dermatita exfoliativă generalizată (boala Ritter) care poate apărea la nou născut; epidermonecroza toxică (întâlnită la copii şi eventual la adulţi); impetigo bulos şi „scarlatina stafilococică” (spre deosebire de cea streptococică, nu afectează limba şi palatul). Leziunile apărute sunt extinse, de multe ori 294

impresionante, dar este posibilă vindecarea fără cicatrici deoarece sediul leziunilor este în stratul granular al pielii (sub ele rămânând un strat suficient de gros pentru evitarea unor pierderi masive de lichid şi pentru a proteja straturile profunde de infecţii supraadăugate). În mod frecvent, stafilococii care au produs toxinele implicare patogenic nu sunt izolaţi de la nivelul leziunii. Sindromul de şoc toxic cuprinde un complex de simptome provocat ca urmare a unor infecţii locale cu S. aureus producător de TSST-1 (toxina 1 a şocului toxic). Principalele semne şi simptome sunt reprezentate de apariţia stării de şoc, febră mare, greţuri, vărsături, diaree, trombocitopenie, insuficienţă renală şi hepatică acută, rash (erupţie) scarlatiniform urmat de descuamare (mai ales a palmelor şi plantelor). Mortalitatea în cazurile necomplicate este de circa 2%. În formele complicate, mortalitatea poate ajunge la 50%. Un procent important (circa 80%) dintre cazuri apar la femei. Unele mărci de tampoane destinate igienei intime feminine s-au dovedit a stimula producţia de TSST-1 de către tulpini „proprii“ de stafilococ. Deoarece s-a demonstrat că TSST-1 creşte toxicitatea endotoxinei germenilor Gram-negativi, cazurile cele mai grave au apărut atunci când infecţia stafilococică locală s-a asociat cu o infecţie cu germeni Gram-negativi. Stafilococii coagulază-negativi sunt implicaţi în infecţii apărute după manevre medico-chirurgicale care penetrează bariera cutaneo-mucoasă (cateterisme, implante, protezări intravasculare etc). Ar mai fi de amintit infecţiile tractului urinar şi genital cuS. saprophyticus (la femeile tinere). O infecţie gravă produsă de SCN este enterocolita postantibiotice a nou născutului (mai ales a prematurului, situaţie în care administrarea necontrolată / abuzivă a antibioticelor poate produce disbacteriemii cu consecinţe grave). În etiologia enterocolitei postantibiotice sunt recunoscute mai multe specii de stafilococi, S. aureus ocupând primul loc.

29. 4. Diagnostic de laborator Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi este doar bacteriologic (direct) şi respectă etapele clasice ale acestui tip de diagnostic, începând cu recoltarea şi transportul produsului patologic, de obicei reprezentat de puroi (fie dintr-o leziune deschisă, superficială, fie din leziuni închise, profunde). Cultivarea în vederea obţinerii de colonii izolate se continuă cu identificarea în care pe lângă caracterele morfologice, de cultură şi biochimice se face testul coagulazei pe lamă şi/sau în tub. Antibiograma completează în mod necesar diagnosticul de laborator al unei infecţii stafilococice. Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi vom alege drept reprezentative infecţiile purulente ale tegumentelor şi mucoaselor şi ne vom referi numai la Staphylococcus aureus. Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu următoarele etape. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În funcţie de maladia provocată se pot recolta următoarele produse patologice: secreţii purulente (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecţii ale plăgilor şi arsurilor), lichide (de puncţie sinusală, otică, mastoidiană, articulară, peritoneală, pleurală, pericardică), exsudat nazal sau exsudat faringian, sânge, LCR, spută, urină, secreţie vaginală, tampoane vaginale, lichid de vomă, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaţa cateterelor şi a 295

inserţiilor iv. ale acestora. În continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat de puroi (vezi anexa nr. 6; A. 6. 1.). De menţionat că din anul 2002 a fost pusă la punct o tehnică PCR pentru identificarea S. aureus rezistent la meticilină, direct în produsul patologic (vezi „Direcţii de cercetare”). 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate faţă de normal), prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi prezenţa cocilor Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are în vedere locul de unde a fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dacă se recoltează de ex. prin puncţie-aspirare dintr-o colecţie purulentă profundă şi este foarte probabil contaminat cu floră de asociaţie dacă a fost recoltat dintr-o leziune superficială). 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează cât mai rapid (pentru a diminua riscul modificărilor ce ar putea apărea în structura microbiană) şi în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Stafilococii se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul cuprins între 13 mm şi sunt pigmentate în funcţie de specia izolată (ex. pigment auriu). Pe mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). În cazul în care produsul este recoltat de la nivel nazal (existând certitudinea că produsul conţine mai multe specii de microorganisme) este recomandată utilizarea mediilor hiperclorurate. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,6-1,5 mm, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate. 

Caractere de cultură: produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu sânge pot produce hemoliză. 

Caractere biochimice: stafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât şi fermentativ. Fermentează glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharozaetc. cu producere de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de diferenţiere între S. aureus (manită-pozitiv) şi SCN (manită-negativ). S. aureus este catalază-pozitiv (vezi anexa nr. 2) (la fel ca și ceilalți stafilococi). De importanță egală taxonomică și recomandat drept al doilea test de confirmare a apartenenței la specia S. aureus este testul dezoxiribonucleazei termostabile. Se poate face şi testul fosfatazei (poate fi pozitiv și la unele specii coagulază-negative). Există sisteme multitest care se pot procura comercial (API, Micro Scan, Minitek, Vitek etc). 

Caractere antigenice: Pentru diferențierea S. aureus de SCN se pot utiliza teste comerciale care includ fibrinogen şi IgG care cuplează coagulaza legată şi proteina A (tehnici de aglutinare indirectă). Se pot utiliza şi truse cu anticorpi monoclonali faţă de endo-β-N-acetil-glucozaminidazei stafilococice. 



Caractere de patogenitate:

296

Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi anexa nr. 2); factorul care produce coagularea pe lamă poate fi prezent la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. În cazul în care în testul coagulazei pe lamă se foloseşte plasmă umană, rezultatul poate fi pozitiv pentru S. lugdunensis şi S. schleiferi (subspecia schleiferi). o

Pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnică de tip ELISA sau aglutinarea pasivă inversată (vezi şi capitolele 20 şi 23). o

Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la acţiunea litică a bacteriofagilor a fost sistematizată pentru tulpinile de S. aureus într-un sistem care se poate utiliza la nivelul centrelor de referinţă. Există un set de bază de bacteriofagi, care permit încadrarea S. aureus în unul din grupele I, II, III sau V. Lizotipia este actualmente evaluată comparativ cu capacitatea „discriminatorie” a testelor care au ca mecanism biologia moleculară (ex. ribotiparea). 

Alte caractere / teste utilizate în identificare: Se pot utiliza (în centre de referinţă) teste care se bazează pe proprietăţi fenotipice moleculare (studiul acizilor graşi celulari, al unor enzime sau al unor polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricţie ale materialului genetic, hibridarea moleculară, ribotiparea etc.). S-au dezvoltat tehnici rapide utilizând truse de identificare şi instrumenteautomatizate pentru evidenţierea unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legată), a enzimelor elaborate în aliment sau lichidul de hemocultură (testul pentru termonuclează) şi a toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Există metode care utilizează markeri moleculari pentru evidenţierea prezenţei MRSA (stafilococ rezistent la meticilină, de ex. amplificarea genică, PCR pentru gena mecA, dar şi pentru genele femA, femB) şi/sau pentru diferenţierea intraspecifică la S. aureus şi SCN. 

5. Antibiograma (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În cazul unor infecţii grave trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul 7). Pentru a identifica tulpinile rezistente la meticilină (MRSA) se poate detecta prezenţa genei mecA (după amplificare genică, prin PCR).

29. 5. Tratament Multe persoane sunt purtătoare de stafilococi la nivel tegumentar, nazal sau faringian. Chiar dacă stafilococii ar fi eliminaţi complet de la nivelul vestibulului nazal, recolonizarea s-ar produce foarte rapid (4). Totuşi, în anumite situaţii (ex. pacienţi supuşi dializei peritoneale sau hemodializei, pacienţi infectaţi cu HIV sau la personalul medical care lucrează de ex. în secţii de arşi) încercarea de eliminare a stării de purtător are justificare. Se poate utiliza tratamentul local cu mupirocină. Este încă în studiu utilizarea lizostafinei în acest scop (lizostafina este o enzimă litică produsă de o tulpină de S. simulans; atacă puntea pentaglicinică de la nivelul lanţurilor de peptidoglican ai S. aureus; au fost făcute experimente pe animale de laborator obţinânduse rezultate promiţătoare) (11). Tratamentul unei stafilococii, în cazul în care este necesară antibioterapia, se va face conform antibiogramei.

297

Principial, dacă un stafilococ este sensibil la penicilină (majoritatea tulpinilor au devenit rezistente prin producerea de beta-lactamază, dar nu toate), atunci tratamentul ar trebui să includă acest antibiotic. Din experiența centrului de referință din INCDMI ”Cantacuzino”, procentul tulpinilor sensibile la penicilină este de circa 5%. Datorită rezistenței la penicilină au fost produse peniciline rezistente la acțiunea beta-lactamazelor (penicilinele M – de la ”meticilină”), de ex. oxacilina, cloxacilina și derivații acestora. Tulpinile meticilino-rezistente pot deveni destul de rapid multi-rezistente. Ca şi principiu de tratament, MRSA răspunde potențial la tratamentul cu vancomicină. VRSA poate răspunde la streptogramine (de exemplu etamycin). Cu toate acestea, a fost identificată rezistenţă şi la streptogramine (9), existând totuşi posibilitatea tratării S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalenţa acestui fenotip fiind însă redusă, de 60,3%, spre deosebire de prevalenţa de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide şi streptogramina B (10). În cazul colecţiilor purulente reamintim şi considerăm că este de reţinut ca fiind de primă importanţă utilizarea inciziei şi drenajului, fără de care antibioterapia nu are nici un sens. De multe ori, incizia şi drenajul sunt suficiente.

29. 6. Epidemiologie Stafilococii sunt ubicuitari. Sursa de infecţie cea mai comună este reprezentată de leziunile stafilococice de la nivelul tegumentului. De menţionat posibilitatea răspândirii infecţiei cu stafilococi rezistenţi la antibiotice (de spital), atunci când persoanele purtătoare sunt reprezentate chiar de personalul medical şi auxiliar. Referitor la sindromul de şoc toxic stafilococic (SSTS), în SUA s-au raportat 157 de cazuri în 1997, 138 de cazuri în 1998 şi 113 cazuri în 1999, cu o incidenţă anuală de 0,050/0000. În anul 2005 au fost raportate numai 90 de cazuri (incidenţa fiind 0,040/0000). Tot în anul 2005 s-au raportat 2 cazuri de infecţie cu S. aureus cu sensibilitate intermediară la vancomicină (VISA) şi 3 cazuri de infecţie cu S. aureusrezistent la vancomicină (VRSA). În România nu sunt disponibile (la nivel naţional) date privind SSTS sau rezistenţa la vancomicină a tulpinilor de S. aureus. Din datele laboratorului de referință pentru stafilococ din INCDMI ”Cantacuzino”, inclusiv cele provenite din supravegherea microorganismelor izolate din infectii invazive pe baza protocoalelor EARSS (2002-2009), respectiv EARS.Net (din 2010), în România nu au fost semnalate tulpini de S. aureus rezistente la vancomicină. Laboratorul de referință pentru stafilococ din INCDMI ”Cantacuzino” poate detecta prin metode moleculare prezenţa genelor pentru enterotoxine, leucocidina Panton Valentine, TSST1, în culturi de S. aureus.

29. 7. Profilaxie Prevenirea transmiterii infecţiei are la bază metodele de igienă, asepsie şi antisepsie. În spital, secţiile cu risc sunt cele de neonatologie, terapie intensivă, sălile operatorii şi saloanele unde se află pacienţi cu cancer aflaţi sub chimioterapie / sau cu alte cauze de imunodepresie. În aceste situaţii, personalul medical trebuie investigat prin metode de laborator şi este de preferat ca persoanele purtătoare de stafilococi coagulază298

pozitivi să nu aibă acces în aceste incinte şi să nu aibă contact direct cu pacienţii în cauză. Ca alternativă trebuie să se pună accentul pe proceduri adecvate, care să evite contaminarea pacienților. Utilizarea substanţelor antiseptice şi încercarea de eradicare cu ajutorul antibioticelor a portajului nazal (ex. lizostafină, mupirocină) ar putea fi utile. (11) Utilizarea vaccinului stafilococic poate să amelioreze starea clinică în anumite situaţii, de ex. la pacienţi care necesită hemodializă, prezenţa de catetere etc. Din păcate la nivel internaţional (EU) nu există un vaccin stafilococic care să fi primit autorizaţie de utilizare. În ţara noastră vaccinul stafilococic produs de INCDMI ”Cantacuzino” a avut autorizație de utilizare până în anul 2010.

29. 8. Direcţii de cercetare 29.8.1 Tratamentul infecţiei cu S. aureus Antibioticele convenţionale acţionează în general pe bacteriile aflate în cursul ciclului de multiplicare (12). În cursul evoluţiei clinice a unei infecţii, acestea coexistă cu cele aflate în afara ciclului de multiplicare, motiv pentru care este aproape imposibil ca întreaga populaţie bacteriană să fie distrusă simultan. Astfel, rămân viabile o serie de bacterii care au fost deja expuse antibioticului şi care au avut timpul necesar pentru dezvoltarea mutaţiilor de rezistenţă. Terapia ţintită pe bacteriile non-multiplicative este un concept nou, existând o serie de astfel de antibiotice în curs de dezvoltare şi cercetare. Unul dintre acestea este HT61, un derivat quinolonic, a cărui eficacitate a fost demonstrată (pe culturi celulare şi pe modele murine de colonizare cutanată) împotriva MSSA, MRSA şi chiar şi MRSA rezistent la mupirocină. Acest medicament acţionează prin depolarizarea membranei celulare şi prin distrucţia peretelui bacterian, în decurs de 2 ore. Pe parcursul unui an de studiu, în cadrul a 50 de culturi seriate, nu a fost decelat niciun fenotip de rezistenţă la HT61. Acest tip de terapie reprezintă promisiunea unui tratament de durată mai scurtă, eficienţă mai ridicată şi cu un risc scăzut de instalare a rezistenţei. Un antibiotic cunoscut din clasa streptograminelor B, etamycin, şi-a demonstrat recent eficienţa asupra MRSA (atât tulpinile comunitare cât şi cele spitaliceşti) pe modele murine cu infecţie sistemică letală MRSA (13). Etamycin a fost izolat de la actinomicete marine descoperite recent (CNS-575), ceea ce a atras atenţia asupra mediului marin – privit ca potenţială sursă pentru identificarea altor antibiotice eficiente asupra tulpinilor rezistente ale diverselor specii bacteriene. Etamycin a demonstrat de asemenea o eficienţă experimentală asupra mai multor patogeni Gram-pozitivi sau Gram-negativi, fiind ne-citotoxic la concentraţii de 20 de ori mai mari decât CMI-ul (care a fost de 1-2 mg/L pentru MRSA comunitar sau spitalicesc).

29.8.2 Detecţia directă a rezistenţei la meticilină Printre metodele de detecţie directă a rezistenţei la meticilină a S. aureus se numără şi testele de latex aglutinare. Un tip particular de astfel de test a fost descris în 2010, de Qian et al. (14) în Journal of Clinical Microbiology. Ei propun efectuarea acestui test de latex aglutinare (pe mediu de tip geloză-sânge) prin utilizarea unei proteine de legare a penicilinei (Penicillin Binding Protein 2a). Acest test (PBP-LA) şi-a demonstrat o sensibilitate de 94,1% şi o specificitate de 97,5%, valori doar cu puţin mai scăzute faţă de sensibilitatea şi specificitatea efectuării tehnicii PCR. Dintre avantajele utilizării acestei 299

metode menţionăm: obţinerea de rezultate rapide, tehnică uşor de utilizat, preţuri scăzute ale reactivilor utilizaţi. În vederea creşterii sensibilităţii testului, acesta poate fi utilizat în combinaţie cu alte teste de identificare rapidă, precum: DNA-aza termostabilă, API Rapidec, şi FISH (peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization).

29. 9. Povestire adevărată „Super-bug” ... Acesta este numele dat de „U.S. Department of Health” S. aureus meticilino rezistent (MRSA). Această „denumire” a fost preluată de reprezentanţii mass-media şi în momentul de faţă acest nume a devenit de notorietate în Statele Unite şi nu numai. Având în vedere faptul că numai pe o perioadă de un an s-au raportat în SUA circa 20.000 de pacienţi care au fost internaţi cu acest diagnostic, „definiţia” şi numele par a fi potrivite şi este strict necesar ca sistemul de raportare să se ocupe cu atenţie de această situaţie. Din păcate, şi în acest caz, trebuie să ne bazăm în special pe datele din literatura de specialitate internaţională, datele publicate în România fiind fie puţine, fie irelevante. Din evenimentele care au avut loc recent (octombrie 2007) în legătură cu acest subiect, amintim decizia luată de Guvernatorul Statului Virginia, care a promulgat în regim de urgenţă o lege, prin care toate unităţile sanitare erau obligate să raporteze cazurile suspecte şi confirmate de infecţie cu Staphylococcus aureus meticilino rezistent (MRSA), contribuind la stabilirea unui sistem activ de raportare, pentru a se putea astfel demonstra care este evoluţia infecţiilor cu MRSA în contextul unei campanii speciale de control a acestor infecţii. Toate aceste reacţii, inclusiv măsura fără precedent de închidere a peste 20 de unităţi de învăţământ pentru „dezinfecţie şi sterilizare” au fost instituite în contextul în care un tânăr de 17 ani a decedat prin sepsis stafilococic. Decesul lui O.R. a condus la o campanie în care au participat în colaborare unităţile de învăţământ, elevii din aceste unităţi, sistemul medical (inclusiv centrul de prevenire şi control al bolilor, mass-media, reprezentanţii autorităţilor locale şi o serie de politicieni). După cum am discutat în prezentul capitol, dar şi în alte capitole ale acestui manual, stafilococii sunt prezenţi în mod normal pe tegumente şi mucoase. Totuşi, stafilococii pot fi implicaţi şi în patologie. Pot fi vizate persoane imuno-competente, copii, adolescenţi, tineri. De suficient de multe ori, cei care consideră că nu sunt vulnerabili sau cred că au un risc foarte scăzut de îmbolnăvire, de ex. sportivii (mai ales cei care practică sporturile mai dure, însoţite de contact direct şi care se consideră „indestructibili”) pot fi printre cei mai expuşi la infecţie şi chiar la o evoluţie gravă a acesteia. La universitatea din Virginia, întreg lotul de lupte greco-romane s-a infectat venind în contact cu o saltea de luptă contaminată de un coleg care s-a rănit în timpul antrenamentului. De multe ori, simpla respectare a unor reguli de igienă generală şi personală pot contribui semnificativ la prevenirea apariţiei infecţiilor stafilococice. Pentru restul cazurilor studiul individual, cercetarea bazelor de date şi experienţa câştigată cu fiecare caz consultat, investigat, analizat şi discutat ne ajută să ajungem la cea mai bună ipoteză diagnostică, la cel mai bun diagnostic diferenţial, la cel mai potrivit tratament în vederea celui mai bun prognostic pentru pacientul sau pacienţii pe care îi vom examina de-a lungul întregii cariere medicale sau medico-chirurgicale.

300

30. Genul Streptococcus. Streptococcus pyogenes 30. 1. Definiţie. Încadrare Streptococii sunt coci sferici Gram-pozitivi care formează perechi sau lanţuri în cursul diviziunii celulare. Sunt larg răspândiţi în natură. Unii fac parte din flora umană normală; alţii sunt asociaţi cu afecţiuni umane importante datorate parţial infecţiei streptococice şi parţial răspunsului imun al gazdei. Nu există încă un sistem perfect pentru clasificarea tuturor speciilor de streptococi. Totuşi, pentru a contura o imagine legată de numărul acestora, NCBI a creat un browser taxonomic unde putem găsi speciile cunoscute până în acest moment. (1) Dintre numeroasele specii, unele au importanţă medicală (în patologia umană) şi dintre acestea amintim Streptococcus pyogenes (grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care aparţine florei normale), S. pneumoniae (pneumococul) etc. Streptococii sunt imobili, nesporulaţi şi pot avea sau nu capsulă. În anul 1906 a fost descris Streptococcus faecalis iar în 1919, Streptococcus faecium. Împreună cu o a treia specie, S. durans(foarte asemănătoare cu S. faecium), în 1937 a fost definit grupul enterococilor, incluşi în grupul D al genului Streptococcus. Din 1984, pe baza studiilor de hibridizare moleculară s-a decis că aceste specii fac parte dintr-un gen separat, genul Enterococcus(vezi 30. 9). Enterococii pot fi izolaţi din flora enterică normală. Sunt nonhemolitici (ocazional alfa-hemolitici); dau o reacţie pozitivă la bilă-esculină. Tolerează NaCl în concentraţie de 6,5%. Sunt rezistenţi la multe antibiotice şi chimioterapice. Tratamentul infecţiilor cu enterococi poate reprezenta o problemă foarte serioasă.

30. 1. 1. Sisteme de clasificare O perioadă de timp, clasificarea streptococilor s-a bazat pe o serie de observaţii privind: a). Morfologia coloniilor şi hemoliza produsă pe agar sânge; b). Specificitatea antigenică a substanţelor specifice de grup (clasificarea Lancefield) şi de tip; c). Reacţiile biochimice; d). Rezistenţa la factori fizici şi chimici; e). Diferite caracteristici ecologice. După 1980 s-au introdus teste biochimice adiţionale precum şi studiile de genetică moleculară. În funcţie de hemoliza produsă pe agar sânge, streptococii se împart în trei grupe: cei care produc α hemoliză, β hemoliză şi streptococii γ hemolitici. (Figura nr. 1, Fotografia nr. 1) Clasificarea Lancefield împarte streptococii în grupe serologice (A-H şi K-U), în funcţie de polizaharidele din compoziţia peretelui, în timp ce proteina M subîmparte streptococii din grupul A în tipuri serologice. (Tabelul nr. 1) Specificitatea antigenică a polizaharidelor capsulare este folosită pentru a clasifica S. pneumoniae în peste 90 de tipuri şi pentru tipizarea streptococilor de grup B (S. agalactiae). 301

30. 1. 2. Streptococi de interes medical 30. 1. 2. 1.S. pyogenes. Cei mai mulţi dintre streptococii care conţin antigenul de grup A sunt streptococi piogeni. Ei sunt beta-hemolitici (produc în mod caracteristic zone largi de hemoliză clară în jurul unor colonii de dimensiuni mici, punctiforme). S. pyogenes este principalul microb asociat cu invazia locală sau sistemică şi cu tulburări imunologice poststreptococice. De regulă streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracină. Structura de tip capsular pe care unele tulpini o prezintă este chimic similară cu ţesutul conjunctiv al organismului gazdă (acid hialuronic), fiind ca atare neantigenică. Membrana sa citoplasmatică are antigene similare cu miocardul, muşchii scheletici şi muşchiul neted, fibroblaştii valvelor cardiace şi ţesutul nervos. 

30. 1. 2. 2.S. agalactiae. Face parte din flora normală a tractului genital feminin şi poate reprezenta o importantă cauză de sepsis şi meningită neonatală. Sunt beta-hemolitici şi produc zone de hemoliză care sunt doar puţin mai extinse decât coloniile (1-2 mm în diametru). Streptococii de grup B hidrolizează hipuratul de sodiu şi dau o reacţie pozitivă în testul CAMP (folosind discuri impregnate cu toxină β stafilococică) (2). 

30. 1. 2. 3.Grupele C şi G. Aceşti streptococi sunt izolaţi uneori din nazofaringe şi pot cauza sinuzită, bacteriemii sau endocardită. Deseori formează colonii asemănătoare cu cele ale streptococilor piogeni şi sunt beta-hemolitici. Sunt identificaţi prin reacţii cu antiser specific pentru grupele C sau G. 

30. 1. 2. 4.S bovis. Face parte din streptococii de grup D. Aparţine florei normale. Ocazional produce endocardită sau bacteriemie la pacienţii cu carcinom de colon. Nu produce hemoliză şi dă o reacţie pozitivă la bilă-esculină. 

30. 1. 2. 5.S. pneumoniae.Pneumococii sunt alfa-hemolitici, creşterea lor este inhibată de optochin iar coloniile sunt distruse de bilă şi săruri biliare (vezi capitolul 31). În continuare reprezintă o cauză importantă de morbiditate și mortalitate (prin pneumonie comunitară). 

30. 1. 2. 6.S. viridans. Fac parte din flora normală la nivelul tractului respirator superior. În mod caracteristic sunt alfa-hemolitici, dar pot fi nonhemolitici. Creşterea lor nu este inhibată de optochin. Pot ajunge în torentul sanguin ca urmare a unei traume şi reprezintă o cauză importantă a endocarditei care survine la pacienţi cu valve cardiace patologice. Unii streptococi viridans (exempluS. mutans) sintetizează polizaharide care contribuie la geneza cariilor dentare. 

30. 1. 2. 7.Peptostreptococii. Cresc numai în condiţii anaerobe sau microaerofile şi produc în mod variabil hemolizine. Fac parte din flora bucală normală, flora tractului respirator superior, intestinal şi genital feminin. Participă, adesea în asociere cu alte specii bacteriene, în infecţiile anaerobe polimicrobiene abdominale, pelviene, pulmonare sau cerebrale. 

30. 2. Caractere generale ‹ 30. 1. 2. Streptococi de interes medicalsus30. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse ›

302

30. 2. 1. Submitted by Mircea Ioan Popa on Mar, 2012-03-27 18:36.

30. 2. 1. Habitat Streptococii piogeni se pot găsi la nivelul tractului respirator superior uman. Condiţiile în care ar trebui eliminaţi se stabilesc de la caz la caz. O parte dintre speciile de streptococi colonizează exclusiv suprafaţa dentară şi devin detectabile numai după erupţia dentară. Pentru alte specii de streptococi, datele referitoare la habitat au fost prezentate mai sus.

30. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1µm, imobili, nesporulaţi. Se divid într-un plan perpendicular pe axa lor lungă şi sunt aranjaţi în lanţuri (de până la 50 elemente bacteriene). Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factori de mediu. Unii streptococi elaborează o capsulă polizaharidică comparabilă cu cea pneumococică. Cele mai multe din speciile de grup A, B şi C produc capsulă din acid hialuronic. Capsulele sunt mai evidente în culturile tinere şi împiedică fagocitoza. Pilii streptococici sunt acoperiţi de acid lipoteichoic şi au rol în aderenţă.

30. 2. 3. Caractere de cultură Cei mai mulţi streptococi cresc pe medii solide şi formează colonii discoide, de tip S, cu diametrul de 1-2 mm. Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A formează colonii punctiforme. Speciile care produc material capsular adeseori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M). Cei mai mulţi streptococi sunt aerobi, facultativ anaerobi. Peptostreptococii sunt strict anaerobi. Necesităţile nutritive variază mult în funcţie de specie. Streptococii implicaţi în patologia umană sunt în general germeni pretenţioşi, necesitând o varietate de factori de creştere. Un mediu de cultură util (atât ca mediu îmbogăţit cât şi ca mediu diferenţial) este mediul geloză-sânge. Pe acest mediu streptococii se pot diferenţia în funcţie de capacitatea de a produce hemoliză. Distrugerea completă a eritrocitelor cu eliberarea de hemoglobină poartă numele de beta-hemoliză şi reprezintă un caracter util în identificarea streptococilor piogeni (colonii mici, de tip S, înconjurate de o zonă clară de hemoliză, cu un diametru mult mai mare decât diametrul coloniei). Liza incompletă a eritrocitelor cu formarea de pigment verde se numeşte alfa-hemoliză (sau hemoliză viridans). Hemoliza incompletă fără o nuanţă verzuie poartă numele de hemoliză alfa prim. În cazul în care streptococii nu produc hemoliză sunt clasificaţi drept streptococi gama. În funcţie de producerea hemolizei, mai frecvent implicaţi în patologia umană sunt streptococii beta-hemolitici, iar dintre aceştia în mod special streptococii beta-hemolitici din grupul A. Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A elaborează două hemolizine: 1) streptolizina O, o proteină antigenică având greutatea moleculară de 60.000 Da, hemolitic activă în stare redusă (grupări –SH disponibile), dar inactivată rapid în prezenţa oxigenului şi 2) streptolizina S care nu este imunogenă.

303

30. 2. 4. Caractere biochimice Unul dintre caracterele biochimice importante este reprezentat chiar de producerea hemolizei. Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi care necesită pentru dezvoltare adăugarea în mediul de cultură a vitaminelor, aminoacizilor, glucozei sau cel puţin utilizarea ca mediu de cultură a gelozei-sânge sau a bulionului nutritiv. Streptococii degradează glucoza pe calea glicolitică. O mare parte dintre specii pot fermenta şi alte tipuri de zaharuri şi alcooli zaharaţi utilizând o serie de enzime inductibile (sintetizate doar în prezenţa carbohidratului respectiv şi în absenţa glucozei). În mod uzual streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracină. Sunt catalază negativi.

30. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici Streptococul piogen este distrus în 30 de minute la 56ºC, dar poate supravieţui în secreţii uscate, la temperatura camerei şi întuneric timp de câteva săptămâni. Deoarece nu este sensibil la acţiunea coloranţilor de tipul trifenil-metan, cristalul violet poate fi utilizat în mediile de cultură selective.

30. 2. 6. Structură antigenică Streptococii hemolitici pot fi divizaţi în grupe serologice (peste 18 grupe serologice notate cu literele mari ale alfabetului, A-U), pe baza carbohidratului C, prezent în structura peretelui multor streptococi (grupele Lancefield). Specificitatea serologică a carbohidratului specific de grup este determinată de un zahar aminat, care pentru streptococii de grup A este ramnoză-N-acetil-glucozamină, pentru grupul B ramnoză-glucozaminăpolizaharid etc. Cele mai importante sunt grupele A, B, C, F şi G (includ streptococi β-hemolitici). Streptococii beta-hemolitici din grupul A prezintă la nivel parietal proteina M, cel mai important factor de patogenitate pentru acest grup streptococic. Anticorpii faţă de proteina M conferă imunitate specifică de tip. Deoarece există mai mult de 100 de tipuri de proteină M (dar nu toate au şi proprietăţi de prevenire a fagocitozei), o persoană poate face infecţii repetate cu S. pyogenes de grup A, de diferite tipuri. Proteina M a fost identificată şi la streptococi din grupul G. Alte structuri antigenice sunt reprezentate de către: - proteina asociată proteinei M (MAP); - substanţa T care permite diferenţierea anumitor tipuri de streptococi prin aglutinarea cu antiser specific; - peptidaza C5a (care clivează fragmentul C5a al sistemului complement); - proteina R, care este un antigen de suprafaţă; - proteina F, cu rol de adezină, ce interacţionează cu fibronectina; - nucleoproteine (substanţe P) care probabil alcătuiesc cea mai mare parte din corpul streptococic; - diferite toxine şi enzime: 1. streptokinaza (fibrinolizina) care transformă plasminogenul în plasmină; poate fi utilă în tratamentul administrat intravenos în embolia pulmonară, tromboza arterială şi venoasă şi în infarctul miocardic acut; este o structură antigenică; 2. streptodornaza (dezoxiribonucleaza) depolimerizează ADN-ul; după infecţii streptococice, în special după infecţii ale pielii, apar anticorpi anti-Dn-ază; 3. hialuronidaza scindează acidul hialuronic, o componentă importantă a substanţei fundamentale din ţesutul 304

conjunctiv; 4. toxina eritrogenă solubilă, distrusă prin fierbere într-o oră, stă la originea rash-ului (erupţiei caracteristice) care apare în scarlatină; toxina eritrogenă este elaborată numai de streptococii lizogenizaţi; există un singur tip de toxină eritrogenă; 5. difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi; 6. hemolizinele (streptolizinele); Semnificaţia biologică a streptolizinei O este încă neclară. Se ştie că administrată intravenos duce la animalele de laborator la deces în câteva secunde prin acţiunea sa directă la nivel cardiac. Totuși, nu este cert că streptolizina S ar fi produsă și in vivo. (2) În momentul de faţă se studiază modul în care SGB activează sistemul imun pe o altă cale, cale descoperită în ultimii ani şi încă insuficient studiată, inflamazomul NLRP3. S-a descoperit, prin studii efectuate pe şoricei, că celulele dendritice răspund la SGB prin secreţia de IL-1β şi IL-18. IL-1β necesită pentru a se forma pro- IL1β şi clivaj proteolitic dependent de caspaza 1. Aici intervine inflamazomul. Acesta, la rândul lui, pentru a fi activat are nevoie de secreţia de β-hemolizină de către SGB. S-a determinat şi faptul că atunci când inflamazomul cu toate compomentele sale lipseşte, şoriceii sunt mai susceptibili la infecţie. (Figura nr. 2) (3)

30. 2. 7. Răspuns imun Rezistenţa împotriva infecţiei streptococice are specificitate de tip. Imunitatea faţă de infecţia cu streptococi de grup A este legată de prezenţa anticorpilor specifici anti-proteină M. Pentru că există mai mult de 80 de tipuri de proteină M, o persoană poate face infecţii repetate cu S. pyogenes de grup A, de tipuri diferite. Structura şi funcţia proteinei M au fost mult studiate. Molecula are o structură de tijă încolăcită care separă domeniile funcţionale, permiţând astfel schimbarea unui număr mare de secvenţe în timp ce funcţia este menţinută. Au fost identificate două clase majore (I şi II) de proteină M. Anticorpii anti-proteină M pot fi identificaţi serologic. Deoarece există un singur tip de toxină eritrogenă, în cazul infecţiei streptococice care duce la scarlatină imunitatea după boală este durabilă, menţinându-se eventual chiar şi pentru toată viaţa. În cursul infecţiilor streptococice apar anticorpi anti-streptolizină O; aceştia pot fi identificaţi prin teste serologice (ex. reacţia ASLO). Titrul anticorpilor poate fi util în diagnosticarea bolilor streptococice şi poststreptococice.

30. 2. 8. Caractere de patogenitate Proteina F are rol de adezină (se leagă de fibronectina celulelor gazdei) şi are un rol în invazivitate. Proteina M reprezintă cel mai important factor antigenic şi de patogenitate pentru streptococul beta-hemolitic din grupul A. Proteina M apare ca o excrescenţă la nivelul peretelui celular. Proteina M formează structuri fibrilare care se extind cu 50-60 nm în afara celulei bacteriene, fiind ancorate cu cealaltă extremitate în membrana citoplasmatică (există un grad de omologie cu proteina A stafilococică). S-a dovedit experimental că atunci când proteina M este prezentă, streptococii sunt virulenţi. În absenţa anticorpilor specifici de tip antiproteină M, streptococii sunt capabili să reziste fagocitării de către leucocitele polimorfonucleare. Proteina M este implicată şi în aderarea la celulele epiteliale ale gazdei. Streptococii de grup A lipsiţi de proteina M sunt avirulenţi. Se pare că proteina M şi probabil şi alte antigene streptococice au un rol important în patogeneza „febrei reumatice” (reumatismului articular acut). Domeniile antigenice conservate din proteinele de clasă M (în 305

special clasa I) reacţionează încrucişat cu structuri ale muşchiului cardiac uman. Alte tipuri M au similarităţi cu miozina, keratina sau α-tropomiozina. Unele tulpini de S. pyogenes formează o structură capsulară compusă din acid hialuronic şi produc colonii mucoide pe geloză-sânge (materialul capsular nu este imunogenic); poate avea rol în virulenţa anumitor tulpini. Hialuronidaza facilitează răspândirea microorganismelor infectante. Difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi; această substanţă permite microorganismului să distrugă leucocitele. Toţi streptococii piogeni produc C5a peptidază, o serin-protează care scindează componenta C5a (rezultată în cascada sistemului C’). C5a este unul dintre principalii factori care atrag PMN la sediul procesului infecţios. Toxina eritrogenă, elaborată numai de către streptococii beta-hemolitici din grupul A lizogenizaţi, este implicată în patogenia erupţiei din scarlatina streptococică.

30. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse 30. 3. 1. Boli invazive datorate streptococilor piogeni Tabloul clinic este determinat de poarta de intrare. În fiecare caz poate apărea o extindere rapidă şi difuză a infecţiei de-a lungul căilor limfatice, însoţită de o supuraţie minimă. Infecţia se poate extinde la nivel circulator. În această categorie se pot include Erizipelul- apare atunci când poarta de intrare este reprezentată de tegument (formă particulară de celulită); este caracterizat prin leziuni „lucioase”, eritemtoase, indurate, sub forma unei plăci cu margini distincte; adesea este cauzat de streptococii de grup A şi mai rar de grupurile C sau G. (Fotografia nr. 2) 



Febra puerperalăse dezvoltă în cazul unei infecţii streptococice intrauterine.

Sepsisul streptococic - în 1992, American College of Chest Physicians şi Society of Critical Care Medicine (ACCP/SCCM) au elaborat câteva criterii care pot orienta medicul spre a pune diagnosticul de sepsis, criterii care au fost revizuite în 2001. (Tabelul nr. 2) (4) 



Infecţiile osoase şi articulare;

Fasciita necrotizantă- inocularea poate fi de la nivelul pielii sau de la nivel intestinal. Prevalenţă este mai ridicată la persoanele ce folosesc droguri pe cale intravenoasă. Este cunoscută și drept gangrena streptococică, streptococul primind (în mass-media) numele de „bacteria mâncătoare de carte”. Această entitate clinică poate avea determinare polimicrobiană, cu floră aerobă şi anaerobă, incluzând şi Clostridium perfringens, Bacteroides spp. Când infecţia se localizează la nivelul perineului se numeşte gangrena Fournier. Tabloul clinic include: febră, durere foarte intensă, eritem, tromboză la nivelul microvascularizației care conduce la necroză, gangrenă, şoc si insuficienţă renală. În multe dintre cazuri evoluția este nefastă, spre exitus. (Fotografia nr. 3) 

306



Meningita etc.

30. 3. 2. Boli localizate În acest grup sunt incluse: Faringita streptococică care este cea mai obişnuită infecţie datorată streptococilor beta-hemolitici. Streptococii virulenţi de grup A aderă la epiteliul faringian prin intermediul acidului lipoteichoic. Fibronectina glicoproteică de la nivelul celulelor epiteliale serveşte probabil ca ligand pentru acidul lipoteichoic. Extinderea la nivel amigdalian şi eventual la nivelul altor structuri poartă numele de angină streptococică. Boala se manifestă cu durere în gât, rinofaringită, amigdalită „roşie” şi purulentă (pultacee), ganglioni limfatici cervicali măriţi şi dureroşi, febră (39-40°C). Poate avea loc (în special la copiii mici) extinderea infecţiei către urechea mijlocie, mastoidă şi meninge. De menţionat că circa 10-20% din infecţii pot fi asimptomatice. (Figura nr. 4) 

Impetigo streptococic reprezintă o infecţie localizată la nivelul straturilor superficiale ale pielii, în special la copii. La majoritatea pacienţilor nu se găseşte o leziune predispozantă. Totuşi, amintim ca factori de risc generali mediul umed şi igiena deficitară. Clinic avem de-a face cu vezicule, pustule sau bule ce se rup şi formează o crustă gălbuie, durere uşoara sau disconfort şi prurit. (Figura nr. 5) 

Celulita streptococică (aşa cum știm, poate fi şi stafilococica) este o infecţie acută a pielii şi ţesutului subcutan. Clinic, pacientul se prezintă cu durere, eritem ce se extinde rapid, edem, febră, limfadenopatie regională. Cel mai adesea este cauzată de S. pyogenes (infecţie difuză, rapid progresivă datorată enzimelor secretate) dar la pacienţii diabetici este întâlnit şi S. agalactiae. Infecţia apare mai des la nivelul membrelor inferioare, tipic unilateral. Peteşiile sunt adesea întâlnite, se pot dezvolta vezicule şi bule ce se pot rupe. (Figura nr. 6) 

Pneumonia poate fi rapid progresivă şi severă; de obicei apare ca o complicaţie, în urma unei infecţii virale (de exemplu gripă, pojar etc.; infecţia cu virusul sinciţial respirator la copilul mic poate fi urmată de asemenea de o pneumonie streptococică). 

Endocardita infecţioasă poate fi acută sau subacută. În cazul endocarditei acute, în cursul bacteriemiei streptococii pot coloniza valvele cardiace normale sau lezate anterior. Distrugerea rapidă a valvelor, în lipsa tratamentului antibiotic corespunzător şi uneori a protezării valvulare, evoluează frecvent spre un deznodământ fatal în zile sau săptămâni. Endocardita subacută implică mai frecvent valvele anormale (malformaţii congenitale, leziuni reumatice sau aterosclerotice). 

30. 3. 3. Boli datorate producerii de toxine Sindromul de şoc toxic streptococic, foarte asemănător celui produs de către S. aureus, apărut datorită eliberării de toxine. Mortalitatea este mai ridicată ca în cazul sindromului stafilococic. În majoritatea cazurilor duce la sindrom de detresă respiratorie acută şi mai rar la o reacţie cutanată cum este cazul S. aureus. Are un debut brusc, febră 39°-40,5°C, hipotensiune, eritem difuz macular, coagulopatie, leziuni hepatice. 

Atunci când streptococii sunt lizogenizaţi (infectaţi cu un bacteriofag specific), produc toxină eritrogenă. Dacă pacientul nu are imunitate antitoxică apar erupţia caracteristică şi scarlatina. Antitoxinele faţă de toxina 

307

eritrogenă previn apariţia rash-ului (dispare la presiune, apare mai ales pe abdomen şi torace lateral, iniţial ca papule mici apoi ca linii ce durează 2-5 zile), dar nu interferă cu infecţia streptococică.

30. 3. 4. Bolile poststreptococice Bolile poststreptococice includ reumatismul articular acut (RAA), cardita reumatismală şi glomerulonefrita acută poststreptococică (GNA). După o infecţie acută cu streptococi beta-hemolitici de grup A urmează o perioadă de latenţă (circa 1-4 săptămâni), după care se pot dezvolta bolile poststreptococice. Perioada de latenţă sugerează faptul că boala poststreptococică nu se datorează efectului direct al diseminării bacteriene, ci reprezintă un răspuns în cadrul unei stări de hipersensibilitate care urmează unor infecţii repetate, netratate sau tratate necorespunzător, cu streptococi piogeni, beta-hemolitici, din grupul A. 30. 3. 4. 1.Glomerulonefrita acută poate apărea la circa 3 săptămâni după infecţia streptococică (adesea tegumentară), în special dată de tipurile 12, 4, 2, 49, 59-61. Glomerulonefrita se datorează unui mecanism de hipersensibilitate de tip III, prin producerea în exces de complexe imune antigen-anticorp, care circulă şi se depun la nivelul membranei bazale glomerulare. Toţi glomerulii sunt afectaţi, mari şi infiltraţi cu PMN, monocite şi eozinofile. În nefrita acută apar hematurie microscopică şi macroscopică, proteinurie pâna la sindrom nefrotic, edeme la nivelul feţei (ex. periorbitale), hipertensiune arterială, retenţie de uree, oligurie şi anurie, ascită, congestie sistemică (dispnee, tuse, stază în jugulare, cardiomegalie, galop, edeme); nivelul complementului seric este scăzut. 30. 3. 4. 2.Reumatismul articular acut (RAA) reprezintă cea mai serioasă sechelă a infecţiei streptococice (tegumentară dar mai ales respiratorie - la care par să fie predispuşi cei cu grupa de sânge A II), deoarece duce la afectarea valvelor şi a muşchiului cardiac. Anumite tipuri de streptococi de grup A conţin antigene care reacţionează încrucişat cu structuri din ţesutul cardiac uman sau cu structuri de la nivelul ganglionilor bazali. RAA este precedat de o infecţie streptococică. În patogenia RAA sunt incluse toate tipurile de hipersensibilitate, în special cele de tip II (citotoxică) şi de tip IV (mecanism celular / întârziat), dar şi fenomene autoimune. Semnele şi simptomele specifice din RAA includ febră, poliartrită migratorie şi semne legate de inflamaţia la nivel cardiac (cardita reumatismală). (Tabelul nr. 3) Nu dorim să intrăm în toate detaliile care vor fi studiate în cadrul modulului de cardiologie, dar dorim să punctăm câteva aspecte. RAA este o boală inflamatorie acută neinfecţioasă, nesupurativă. Apare în comunităţi aglomerate, nivel economic scăzut, igienă precară, alimentaţie defectuoasă, tulburări de imunitate. Incidenţa maximă a fost înregistrată la grupele de vârstă 5-15 ani. Nu există predispoziţie de sex dar leziunile cardiace sunt diferite în funcţie de sex.

308

30. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Streptococcus pyogenes Diagnosticul de laborator este în mod uzual bacteriologic (direct) şi include în mod necesar recoltarea şi transportul (în maxim 2 ore) produsului patologic, cu examinarea microscopică a acestuia, cultivarea de obicei pe geloză-sânge şi identificarea pe baza caracterelor morfologice, de cultură, biochimice şi antigenice a microorganismelor din coloniile izolate. Antibiograma nu este, în general, necesară deoarece streptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea la penicilină. Deşi cultivarea rămâne metoda standard în diagnostic, datorită faptului că rezultatul este obţinut abia după circa 18 ore, au fost puse la punct teste rapide, care pot identifica antigenele streptococice în circa 10 minute (extracţie enzimatică urmată de latex aglutinare în prezenţa anticorpilor specifici pentru grupul A). Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de streptococii piogeni alegem faringita streptococică. În vederea confirmării unei boli poststreptococice vom discuta reacţia ASLO (vezi şi capitolul 22).

30. 4. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic 30. 4. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct, în faringita streptococică. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic, secreţia purulentă de la nivelul faringelui, trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, recoltarea se face preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi fără să se fi spălat pe dinţi, fără să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii, iar dacă aceste condiţii nu au fost respectate, recoltarea se va face după minim 4 ore etc.) (vezi şi anexa nr. 6). Produsul recoltat trebuie prelucrat cât mai repede posibil, însă în nici un caz nu trebuie să treacă mai mult de 2-3 ore de la recoltare până la cultivare (preferabil 1-2 ore). În cazul în care se estimează depăşirea acestui interval de timp trebuie folosit un mediu de transport, ex. mediul Stuart (vezi şi anexa nr. 2). Chiar şi în această situaţie, nu ar trebui să treacă mai mult de 24 de ore până la prelucrarea p.p. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a două frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel faringian, prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi prezenţa cocilor Gram-pozitivi aşezaţi separat, în perechi sau în lanţuri, dar şi a altor tipuri de microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are doar un rol orientativ. 309

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi care nu se dezvoltă pe medii de cultură obişnuite. Mediul cel mai frecvent folosit este agar-sânge, pe care cultura apare în 18-48 ore, la 35-37°C. În cazul în care nu remarcăm apariţia de colonii caracteristice după 24 de ore, reincubăm placa Petri pentru încă o zi. Coloniile au aspect de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate de o zonă de β-hemoliză (zonă clară de hemoliză, cu un diametru mult mai mare decât diametrul coloniei). În cursul însămânţării, pe cel puţin una dintre laturile „poligonului” descris trebuie să realizăm şi o înţepare a mediului în aşa fel încât inoculul să ajungă mai în profunzime. Această manevră (există şi alte variante tehnice) este necesară pentru a permite activitatea hemolizinei O (hemolizina O este inactivată în prezenţa oxigenului). Speciile care produc material capsular, din acid hialuronic, adeseori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M). Se pot folosi pentru cultivare şi medii selective (de ex. agar-sânge plus trimetoprim-sulfametoxazol). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1µm. Se divid într-un plan perpendicular pe axa lor lungă şi se pot dispune în lanţuri (de până la 50 elemente). Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factori de mediu. 

Caractere de cultură: Produc colonii de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate de o zonă de β-hemoliză sau colonii de tip M. 

Caractere biochimice:



- Streptococii piogeni produc hemoliză de tip beta. - Prin testul PYR este identificată sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente există şi teste comerciale, rapide, pentru testul PYR). - Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic produs de Bacillus licheniformis). Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus pyogenes, mai puţin de 1% sunt rezistente la bacitracină (vezi anexa nr. 2). - Streptococii piogeni sunt rezistenţi la trimetoprim-sulfametoxazol. Caractere antigenice:



Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapidă a polizaharidului specific de grup A al streptococilor piogeni în p.p., după extracţie chimică sau enzimatică (ex. cu pronază). Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea indirectă (latex-aglutinare), coaglutinarea sau ELISA. o

Prin reacţii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lamă, sau precipitare se pot determina antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip. o o

S. pyogenes este împărţit în serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 100 de serotipuri)

prin reacţia de precipitare în tuburi capilare şi T (peste 28 serotipuri) prin reacţia de aglutinare pe lamă. Aceste testări se fac în centre de referinţă. Alte teste utilizate în identificare:



Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea directă a streptococilor de grup A în exsudatul faringian. 310 o

După amplificare genică (PCR) pot fi identificate secvenţele genetice care codifică pentru diferitele tipuri de proteină M (genele enm). Au fost descoperite peste 120 de secvenţe genetice diferite, această metodă fiind mai discriminativă în comparaţie cu metoda clasică, de tipizare a S. pyogenesşi tinde să completeze şi eventual să înlocuiască această metodă. o

o

Relativ recent a fost propusă tehnica MLST (multilocus sequence typing), accesibilă unorcentre

de referinţă. 5. Streptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea cunoscută la penicilină (au fost identificate în ultima perioadă tulpini „tolerante”, care sunt inhibate dar nu distruse de către penicilină, 2003). Pentru pacienţii cu hipersensibilitate ("alergici") la beta-lactamine se poate alege pentru tratament eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest medicament antimicrobian şi în acest caz antibiograma devine necesară. În general antibiograma se realizează în scop epidemiologic, pentru supraveghere şi cercetare.

30. 4. 2. Diagnosticul de laborator serologic 30. 4. 2. Diagnosticul de laborator serologic Diagnosticul imunologic al infecţiilor produse de streptococii β-hemolitici din grupul A ar putea consta din investigarea fie a răspunsului imun umoral (prezenţa şi titrul anticorpilor, în cadrul diagnosticului serologic), fie a răspunsului imun de tip celular. În continuare nu vom discuta decât diagnosticul serologic, care are importanţă practică. Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA), identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate, diagnosticul retrospectiv al unei infecţii streptococice, evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului. Pentru stabilirea diagnosticului pozitiv al RAA sau al GNA, criteriile de diagnostic sunt mai complexe, dar includ dovedireaprin metode de laborator a unei infecţii streptococice în antecedente. Diagnosticul serologic se realizează de obicei, în România, prin reacţia ASLO, care identifică titruri ale anticorpilor anti-streptolizină O (vezi şi capitolul 22). Testarea se face în dinamică, pe seruri recoltate la interval de 7-10 zile. Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi ASLO. Este strict necesară realizarea controlului intern şi extern de calitate. Tot strict necesară este evaluarea rezultatelor în contextul clinic. Există teste serologice pentru determinarea prezenţei şi titrului anticorpilor faţă de alte structuri antigenice (streptodornază, hialuronidază, streptokinază). Titrul anticorpilor anti-streptodornază este crescut la pacienţii cu infecţii tegumentare şi trebuie investigat dacă se suspicionează prezenţa unei glomerulonefrite acute. Se pot determina şi anticorpii anticarbohidrat (hemaglutinare pasivă) sau anti-MAP (prin latex aglutinare). 311

31. Streptococcus pneumoniae 31. 1. Definiţie. Încadrare Streptococcus pneumoniae se prezintă sub formă de coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în general în diplo pe axul longitudinal, încapsulaţi, nesporulaţi, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloză-sânge determină a-hemoliză, la fel ca Streptococcus viridans. Creşterea îi este favorizată în atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 37°C.Streptococcus pneumoniae este unul dintre principalele microorganisme implicate în etiologia otitei medii şi în alte infecţii respiratorii, incluzând pneumonia. Meningita pneumococică reprezintă însă o entitate nosologică redutabilă. Una dintre marile probleme terapeutice decurgând din dezvoltarea rezistenţei la antibiotice o reprezintă apariţia pneumococilor rezistenţi la penicilină şi alte medicamente antimicrobiene. Gravitatea acestei situaţii rezultă din incidenţa crescută a pneumoniilor pneumococice (40 - 50% din etiologia pneumoniilor comunitare) şi din valorile extrem de alarmante ale incidenţei tulpinilor de pneumococi penicilino - rezistenţi (20-40% din tulpinile izolate în Europa Occidentală sau în America de Nord), uneori cu multirezistenţă la antibiotice.

31. 2. Caractere generale 31. 2. 1. Habitat Pneumococii se pot izola de la persoane sănătoase, făcând parte din flora normală a tractului respirator superior (în special bucală, nazală şi faringiană). Cu toate că frecvenţa portajului orofaringian este estimată la 30-70%, în recentul studiu la care au participat în mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), nu am identificat nici un purtător de Streptococcus pneumoniae.

31. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în general în diplo, încapsulaţi (cu o capsulă comună), imobili, nesporulaţi. În coloraţia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou în jurul pneumococilor. Utilizând anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul patologic (de exemplu spută), prin reacţia de umflare a capsulei.

31. 2. 3. Caractere de cultură Pneumococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloză-sânge formează colonii de tip S sau de tip M, înconjurate de o zonă de a-hemoliză (la fel ca Streptococcus viridans). Multiplicarea este favorizată în atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 37°C. Glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi. Aceştia elaborează enzime zaharolitice, proteolitice şi lipolitice. În mediile de cultură lichide pneumococii tulbură omogen mediul.

31. 2. 4. Caractere biochimice

Glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi. Aceştia elaborează enzime zaharolitice, proteolitice şi lipolitice. Fermentarea inulinei reprezintă un caracter biochimic important, util în diferenţierea pneumococilor de S. VIRIDANS(ambele tipuri de streptococi producând pe geloză-sânge o hemoliză de tip viridans). 312

Produc enzime autolitice. Autoliza este indusă şi accelerată de bilă, săruri biliare, acizi biliari; testul este util în identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld). Sunt sensibili la optochin (etil-hidro-cupreină), sensibilitatea la această substanţă fiind de asemenea utilă în identificare şi diferenţierea de Streptococcus viridans.

31. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Pneumococii pot supravieţui câteva luni în spută uscată, la întuneric. În mediul extern rezistenţa lor este scăzută. În timp, microorganismele devin Gram-negative şi tind să se lizeze spontan.Autoliza pneumococilor este intensificată de agenţii tensioactivi de suprafaţă.

31. 2. 6. Structură antigenică

La nivelul peretelui există un polizaharid specific de grup, comun tuturor pneumococilor. Polizaharidul C include acidul teichoic (legat de peptidoglican). Cel mai important determinant antigenic şi patogenic este capsula polizaharidică (antigenul K), ce protejează pneumococul faţă de fagocitoză şi permite invazivitatea. Structura polizaharidului capsular este specifică fiecărui serotip în parte. Până în prezent au fost identificate peste 90 de serotipuri capsulare diferite, a căror structură a fost determinată pentru majoritatea serotipurilor. Există două sisteme diferite folosite pentru clasificarea tipurilor capsulare. Sistemul american a numerotat tipurile capsulare în ordinea descoperirii acestora. Sistemul danez grupează mai multe tipuri antigenic înrudite. Spre exemplu, grupul 19 din clasificarea Statens Serum Institute grupează tipurile 19A-C şi 19F, care în sistemul american de clasificare erau numerotate cu 19, 57, 58 şi respectiv 59. Au fost produse seruri specifice anticapsulare polivalente şi monovalente, utile în identificarea pneumococilor cu ajutorul reacţiei de umflare a capsulei. Este descris şi acidul lipoteichoic numit şi antigen F (Forsman); anticorpii faţă de antigenul F reacţionează încrucişat cu polizaharidul C de la streptococii piogeni. Fosfocolina (FC) se găseşte atât în acidul lipoteichoic, cât şi în acidul teichoic parietal. Prezenţa reziduurilor de FC este necesară atât în diviziune, în fenomenul de autoliză, cât şi în fenomenul genetic de transformare. FC are şi rol de adezină (se leagă de „choline-binding proteins” de pe suprafaţa celulelor gazdei). Toţi pneumococii secretă IgA1 protează (una dintre Zn-proteinazele produse de S. pneumoniae).

31. 2. 7. Răspuns imun

Imunitatea faţă de infecţia pneumococică are specificitate de tip şi depinde atât de anticorpii care apar împotriva polizaharidului capsular, cât şi de funcţia fagocitelor. Vaccinarea induce producerea de anticorpi faţă de polizaharidul capsular.

31. 2. 8. Caractere de patogenitate S. pneumoniae este un microb condiţionat patogen care, atunci când este implicat în patologia umană, se manifestă prin multiplicare şi invazivitate. Virulenţa pneumococilor depinde de capsulă, care conferă rezistenţa la fagocitoză. Un ser care conţine anticorpi împotriva polizaharidelor specifice de tip protejează împotriva infecţiei. Dacă un astfel de ser este absorbit cu polizaharide specifice de tip îşi pierde puterea protectoare. Alţi factori de patogenitate ar fi reprezentaţi de: - IgA1 protează; - hemolizina intracelulară (pneumolizina), eliberată prin autoliză (inhibă chemotactismul pentru PMN, inhibă proliferarea limfocitelor şi sinteza de anticorpi); - proteinele de suprafaţă (PspA) care au unele asemănări cu proteina M de la S. pyogenes; - neuraminidazele (NanA şi NanB) şi hialuronidaza. 313

Deoarece circa 30-70% din oameni pot fi la un moment dat purtători de pneumococi, mucoasa respiratorie normală are un grad important de rezistenţă naturală faţă de aceste microorganisme. Printre factorii care predispun la infecţie ar fi de menţionat: - anomalii constituţionale sau dobândite ale tractului respirator (infecţii virale, alergii locale, obstrucţii bronşice, afectări ale tractului respirator datorate unor substanţe iritante etc.); - intoxicaţia cu alcool sau droguri, care deprimă activitatea fagocitară şi reflexul de tuse; - consumul de tutun (fumatul); - malnutriţia, debilitatea generală, hiposplenismul sau deficienţele sistemului complement.

31. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse În majoritatea infecţiilor pneumococice există o fază iniţială bacteriemică, perioadă în care microorganismul ar putea fi izolat prin hemocultură. Pneumococul este patogen prin multiplicare şi invazivitate, conducând la apariţia unor variate infecţii ale tractului respirator superior şi inferior, ale urechii medii, ale sinusurilor, dar şi alte infecţii produse prin diseminare hematogenă (ex. meningită, endocardită, care pot fi foarte grave). Pneumonia pneumococică se însoţeşte de prezenţa edemului alveolar şi a unui exsudat fibrinos, urmat de apariţia de hematii şi leucocite. În exsudat se identifică prezenţa a numeroşi pneumococi. Debutul pneumoniei este adesea brusc, cu febră mare, frison, junghi toracic. Sputa caracteristică este ruginie (semn patognomonic). Aspectul radiologic este caracteristic atunci când este prins un singur lob şi constă într-o opacitate cu aspect triunghiular, cu baza la periferie şi vârful către mediastin (pneumonie francă lobară).

32. Genul Neisseria. Neisseria meningitidis. Neisseria gonorrhoeae 32. 1. Definiţie. Încadrare Familia Neisseriaceae include mai multe genuri, spre exemplu Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Kingella. În genul Neisseria, speciile importante pentru patologia umană sunt N. meningitidis (meningococul) şi N. gonorrhoeae(gonococul), dar se pot aminti şi N. lactamica, N. sicca, N. subflava, Neisseria bacilliformis etc. Există şi o specie (N. elongata) în care tulpinile au aspect cocobacilar şi sunt oxidază-negative (1). Pe baza studiilor filogenetice, speciile Neisseria au fost clasificate în cinci grupe şi anume: N. meningitidis, N. flavescens, N. cinerea, N. pharyngis şi N. elongata (12 specii în total).

314

Anterior, Moraxella (Branhamella) catarrhalis aparţinea genului Neisseria; studii de genetică moleculară au demonstrat că există diferenţe între aceste microorganisme.

32. 2. Caractere generale 32. 2. 1. Habitat. Caractere fiziologice N. lactamica a fost evidenţiată la nivel nazal sau faringian în cazul a 3-40% din purtătorii sănătoşi. Studii epidemiologice arată că prezența acestei bacterii poate avea efecte favorabile (înregistrându-se activitate bactericidă serică îndreptată împotriva N. meningitidis; studiul s-a efectuat iniţial pe şoricei, ulterior pe oameni). Cu toate că este improbabilă realizarea unui vaccin cu tulpini vii de N. lactamica, înţelegerea mecanismului inducerii unei imunitaţi încrucişate şi a activitaţii serice bactericide ar putea utilă pentru studiile legate de vaccin. (2, 3) Marea majoritate a speciilor din genul Neisseria sunt coci Gram negativi. În urmă cu caţiva ani se considera că N. elongataeste singura specie de origine umană cu aspect bacilar. Totuşi, un studiu publicat de Journal of Clinical Microbiology în 2006 raportează izolarea şi caracterizarea a 8 tulpini bacilare de Neisseria de la pacienţi cu infecţii localizate fie la nivelul cavităţii orale, fie la nivelul tractului respirator. Două dintre ele au fost izolate din sânge. Din punct de vedere genetic asemănarea era de