Métodos de separación de proteínas

Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Química Química Biológica Lic. Ciencias mención Química

Laboratorio Nº3

“Métodos de separación de proteínas”

Integrantes: Álvaro Etcheverry Matías Leal. Profesora: Mª Cecilia Rojas

INTRODUCCIÓN El objetivo de este laboratorio consiste en utilizar distintos métodos de separación de proteínas. Básicamente existen tres tipos: Filtración por exclusión molecular, en la cual se aprovecha los distintos tamaños y formas de las proteínas para separarlos mediante cromatografía. En la cromatografía de intercambio iónico, se aprovecha el hecho de cada proteína interactúa de distinta forma con un intercambiador iónico, para así separarlas mediante una cromatografía. Finalmente está la electroforesis en geles de poliacrilamida, el cual es uno de los métodos más poderosos, el cual consiste en colocar la solución con proteínas en un gel de poliacrilamida al que posteriormente se le aplica un campo eléctrico, de esta forma las proteínas pueden ser separadas de acuerdo a sus tamaños y cargas. En el caso de este laboratorio, sólo se realizó la filtración por exclusión molecular. MÉTODOS El método utilizado en esta sesión es el de filtración por exclusión molecular, el consiste en colocar a la solución de proteínas en una matriz que contiene numerosas cuentas porosas. De esta forma, aquellas moléculas lo suficientemente pequeñas como  para entrar en ellas quedan atrapadas y eluyen más lento através de la columna, siendo las moléculas más grandes las que eluyen en primer lugar. Los polímeros más usados son el dextrano, la agarosa y la poliacrilamida RESULTADOS Y ANÁLISIS DE DATOS En primer lugar se realizó una curva de calibración con una solución patrón de  proteínas cuya concentración es de 10 mg/mL. Para esto se tomaron distintos volúmenes del suero, se completaron 2 mL con una solución de NaCl 0,15 M y se analizó la muestra en un espectrofotómetro, de donde se obtuvieron los datos que se muestran en la Tabla N°1: Tabla N°1: Absorbancias obtenidas a distintas concentraciones de proteína. Volumen de suero (mL)

Cantidad de proteína (mg)

Volumen de NaCl 0.15 M (mL)

Absorban cia

0.2

2

1.8

0.190

0.4

4

1.6

0.369

0.6

6

1.4

0.499

0.8

8

1.2

0.662

1.0

10

1.0

0.790

Con estos datos se obtuvo el siguiente gráfico.

Gráfico N°1: Cantidad de proteínas versus absorbancia Mediante una regresión lineal obtuvimos una ecuación que nos permite calcular  la cantidad de proteínas presentes en una muestra al medir su absorbancia: 0,0541 = C proteína 0,07235

 A −

Donde A corresponde a la absorbancia. Gracias a esta ecuación es posible calcular la cantidad de proteínas que se encontraban en una muestra de cero y además se calculó la cantidad de proteínas totales, la cantidad de seroglobulinas y por diferencia la cantidad de seroalbúminas, como se muestra en la Tabla N°2: Tabla N°2: Concentraciones de proteínas en el suero Absorban cia Suero total Seroalbúm inas Seroglobul inas

Cantidad de proteínas (mg)

Volumen de suero (mL)

Concentración de proteínas (mg/mL)

0,333

3,74

2

1,87

0,103

0,66

2

0,33 1,54

Finalmente, para se tomó una muestra de suero al que se le agregó ácido acético hasta alcanzar el punto isoeléctrico donde la mayor parte de la proteína estaba insolubilizada. Posteriormente, se agregó una solución de NaCl 2 M, hasta solubilizar la  proteína nuevamente, gastándose un total de 0,18 mL.

CUESTIONARIO 1. ¿Por qué se utiliza sulfato de amonio para separar proteínas por salazón? Debido a que el sulfato de amonio es una sal divalente, son necesarias una mayor  cantidad de moléculas de agua para solvatar los iones de sal presentes. De esta manera existe una menor cantidad de moléculas de agua disponibles para interactuar con la  proteína y las interacciones proteína-proteína aumentan y la hacen precipitar. 2. ¿Qué entiende por suero sanguíneo y plasma? ¿Qué proteínas se encuentran en el suero sanguíneo? El plasma corresponde a la fracción líquida y desprovista de células de la sangre, que contiene iones, gases y proteínas en solución; dentro de las proteínas que posee se encuentran las albúminas, las globulinas y el fibrinógeno, el cual es el encargado de llevar a cabo los procesos que promueven la formación de los coágulos. Mientras que el suero corresponde a la fracción del plasma que queda después de que se han eliminado los componentes relacionados con la coagulación, es decir que sólo posee las proteínas albúminas y globulinas. 3. ¿Por qué es necesario agregar ácido y base a la solución de suero antes de estudiar el efecto solubilizante del cloruro de sodio? Al agregar ácido estamos buscando el punto en que la proteína se hace más insoluble, es decir, el punto isoeléctrico. Una vez que nos pasamos del punto isoeléctrico agregamos la base para volver al pH correspondiente al punto isoeléctrico, para finalmente agregar  la sal y observar el efecto que ésta tuvo. 4. Indique cuál es la ecuación correspondiente a la ley de Debye-Huckel. log(γ   ) = − A | Z ⋅ Z | I   Donde γ± corresponde al coeficiente iónico medio, A es una constante que depende del solvente, Z corresponde a la carga de los iones, e I que corresponde a la fuerza iónica, la cual corresponde a: 1 n I = ∑ ci ⋅ Zi   2i Donde ci corresponde a la molalidad y Z i corresponde a la carga del ión. ±

+

−

2

=1

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES •

Experimentalmente se obtuvo que la concentración de la proteína seroalbúmina en el suero sanguíneo es de 1,54 mg/mL. Por otro lado la concentración de la   proteína seroglobulina en el suero sanguíneo es de 0,33 mg/mL, con una concentración total de 1,87 mg/mL.

•

Las sales divalentes como el sulfato de amonio, pueden hacer precipitar por  salazón, con mayor eficiencia a las proteínas ya que hacen más importantes las interacciones proteína-proteína.

•

En cambio las sales monovalentes como el NaCl, estabilizan las proteínas, y no la hacen precipitar, si no que lo disuelven. Aquí lo observado fue una

disminución en la turbidez de la solución puesto que solubilizo en cierto grado la  proteína. Se gastaron 0,18 ml de NaCl 2 M en solubilizar la proteína. •

Los múltiples grupos ácido-base de una proteína determinan que sus propiedades de solubilidad dependan de la concentración de las sales disueltas, de la  polaridad del disolvente, del pH y de la temperatura. Ciertas proteínas precipitan de su disolución en condiciones en que otras permanecen completamente solubles. Esto fue observado en la precipitación de proteínas de suero sanguíneo con Sulfato de Sodio, donde sólo precipito la Seroglobulina y la Seroalbúmina quedo en el sobrenadante.

REFERENCIAS •

Guía de trabajos prácticos Bioquímica 2011