Métodos de Laboratorio - BAM - Detección y Enumeración de Listeria Monocytogenes

 

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BAM: Detección y enumeración de BAM: Listeria monocytogenes Marzo 2017

Manual analítico bacteriológico Capítulo 10 Detección de Listeria monocytogenes en alimentos y muestras ambientales, y Enumeración de Listeria monocytogenes en alimentos Autores: Anthony D. Hitchins (retirado) y Karen Jinneman (mailto:karen.jinneman@ (mailto:[email protected]) fda.hhs.gov) y Yi Chen Revisión histórica:

Marzo 2017: Adición de la matriz de muestras para muestras ambientales. Enero de 2016: Preparación de muestras más específicas e instrucciones de configuración analítica para la detección cualitativa o enumeración cuantitativa. Enero 2016: Reorganización y edición de todas las secciones. Febrero 2013: actualización a la Tabla 1; actualización para BAM Media M52 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064305.htm) : Caldo de enriquecimiento de Listeria tamponado (BLEB) en la sección Medios. Noviembre de 2011: adición de la confirmación de PCR para Listeria monocytogenes y Listeria spp.  Aislamientos distintos distintos de L. gr ayi  ayi  .  .  Abril de 2011: 2011: Sección E. Diagr Diagrama ama que describe e ell Sistema óptico He Henry nry para el examen d de e colonias agregadas; Referencias para Listeria monocytogenes Evaluación de riesgos y orientación actualizada actualizada..  Agosto de 2002: Sección Sección J. Enumeración: Enumeración: Se agregaron instrucciones instrucciones para un re resultado sultado positivo en todos los tubos tu bos NMP NMP..  Abril deweb. 2001: Sección Sección H. Prueba CAMP: se actualizó la dirección dirección de A ATCC TCC y se agregó un e enlace nlace a su página

El género Listeria contiene 6 especies: L. monocytogenes , L. innocua , L. seeligeri  , , L. welshimeri  , , L. ivanovii  y  y L. grayi  (Tabla  (Tabla 1). L. grayi   (( 28 , 40 ) y L. ivanovii  (  ( 13 , 27 ) contienen dos subespecies, que no necesitan ser  especificadas en este análisis. Una revisión taxonómica del género por Rocourt ( 41 ) en 1999 actualiza las revisiones anteriores ( 11 , 43). En los últimos años, se propusieron muchas especies nuevas. Sin embargo, estas nuevas especies no son ampliamente adoptadas adoptadas y el número de tipos de cepas para las nuevas especies propuestas es muy limitado. L. ivanovii  y  y L. monocytogenes son patógenos para ratones y otros animales. Sin embargo, solo L. monocytogenes se asocia comúnmente con la listeriosis humana. La infección asociada con listeriosis por L. ivanovii  , , e incluso por L. seeligeri  , , es extremadamente rara en humanos. La aparición universal de L. monocytogenes en los alimentos ( 42 ) y el riesgo de contraer la listeriosis transmitida por los alimentos ( 47 , 48).) han sido revisados a fondo recientemente. Este capítulo describe la detección y enumeración de L. monocytogenes en alimentos y la detección en el entorno de procesamiento de alimentos.

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Esta metodología estándar y metodologías alternativas rápidas están destinadas a la detección y el aislamiento de L. monocytogenes monocytogenes de alimentos y muestras ambientales. El tamaño de la muestra analítica para alimentos es generalmente de 25 g, y puede ser de unidades individu individuales ales o como parte de un compuesto de muestra.  Alternativamente, los kits de prueba ráp  Alternativamente, rápida ida con sus respecti respectivos vos medios de enri enriquecimiento quecimiento apro aprobados bados como Métodos de análisis oficiales de AOAC (OMA) se pueden usar condicionalm condicionalmente ente para detectar la presencia de contaminantes de Listeria . Los aislados de Listeria putativos en agares selectivos de enriquecimiento positivo estándar o de pantalla se purifican en agares no selectivos y se confirman mediante pruebas de identificación convencionales convencional es o mediante una batería de dichas pruebas en forma de kit. Los aislamientos pueden confirmarse rápidamente como L. monocytogenes no)losmediante de kits de pruebaseespecíficos procedimientos procedimiento s de PCR. Generalmente, se espera (o que aisladoseldeuso L. monocytogenes  subdividan,o lo que incluye la tipificación serológica y la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). Prueba de patogenicidad opcional deLos aislados de L. monocytogenes se describen en la Sección H. La enumeración de L. monocytogenes en muestras de alimentos positivas se realiza en una muestra de reserva mediante el recuento de colonias en agars selectivos diferenciales de L. monocytogenes junto con la enumeración de MPN utilizando enriquecimiento selectivo en BLEB con la posterior colocación en placa de agars selectivos diferenciales de L. monocytogenes monocytogenes como se describe a continuación.  A. Equipos y materiales La FDA no respalda específicamente ninguno de los productos comerciales enumerados. Productos equivalentes pueden estar disponibles. 1. Hisopo estéril: el siguiente o equivalente: Muestreador de hisopos (http://www.mmm.com) (http://www.mmm.com) 3M ™ en caldo neutralizador D / E de 10 ml (número de catálogo RS96010DE, www.mmm.com (http://www.mmm.com) (http://www.mmm.com) (http://www.fda.gov/AboutFDA/AboutThisWebsite/W (http://www.fda.gov/AboutFDA /AboutThisWebsite/WebsitePolicies/Disclaime ebsitePolicies/Disclaimers/default.htm) rs/default.htm) )

(poliéster). Hisopo de algodón seco puritano (Catálogo # 25-806 1PC, 25-806 2PC, www.puritanmedproducts.com www.puritanmedpr oducts.com (http://www.puritanmedproducts.com) (http://www.puritanmedproducts.com) ) (Algodón)

Muestreador de hisopos PUR-Blue ™ de World Bioproducts con (número de catálogo BLU-10DE) o sin (número de catálogo BLU-DRY, www.worldbioproducts.com (http://www.worldbioproducts.com) (http://www.fda.gov/AboutFDA/AboutThisWebsite/W (http://www.fda.gov/AboutFDA /AboutThisWebsite/WebsitePolicies/Disclaime ebsitePolicies/Disclaimers/default.htm) rs/default.htm) )

10 ml de caldo neutralizante D / E (poliuretano). Transportador Transpor tador de hisopo seco Healthlink® (Catálogo # 4159BX, www.hardydiagnostics.com (http://www.hardydiagnostics.com) (http://www.fda.gov/AboutFDA/AboutThisWebsite/W (http://www.fda.gov/AboutFDA /AboutThisWebsite/WebsitePolicies/Disclaime ebsitePolicies/Disclaimers/default.htm) rs/default.htm) ) (Poliéster). 2. Esponja estéril: la siguiente o equivalente: Muestreador de esponjas EZ Reach ™ de World Bioproducts con (Catálogo # EZ-10DE-PUR) o sin (Número de catálogo EZ-DRY-PUR, www.worldbioproducts.com (http://www.worldbioproducts.com) (http://www.fda.gov/AboutFDA/AboutThisWebsite/W (http://www.fda.gov/AboutFDA /AboutThisWebsite/WebsitePolicies/Disclaime ebsitePolicies/Disclaimers/default.htm) rs/default.htm) )

10 ml de caldo neutralizante D / E (Poliuretano). Sonda de esponja seca Nasco Whirl-Pak® (Número de catálogo B01475WA, B01475WA, www.enasco.com (http://www.enasco.com) (http://www.fda.gov/AboutFDA/AboutThisWebsite/W (http://www.fda.gov/AboutFDA /AboutThisWebsite/WebsitePolicies/Disclaime ebsitePolicies/Disclaimers/default.htm) rs/default.htm) )

(Celulosa). Palitos de esponja de 3M ™ con (Número de catálogo SSL10DE, www.mmm.com (http://www.mmm.com)

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(http://www.fda.gov/AboutFDA/AboutThisWebsite/W (http://www.fda.gov/AboutFDA /AboutThisWebsite/WebsitePolicies/Disclaime ebsitePolicies/Disclaimers/default.htm) rs/default.htm) )

o sin (Número de catálogo SSL100) 10 ml de caldo neutralizante D / E (celulosa). Si están disponibles, se pueden obtener muestreadores muestreadores secos y se puede agregar caldo D / E neutralizante más tarde, o se pueden obtener muestreadores prehumedecidos. No recomendamos menos de 10 ml de caldo D / E debido a la posible presencia de residuos de desinfectan desinfectante te en las superficies ambientales. 3. Balanza para pesar la muestra a 0.1 g. 4. Incubadoras, 30 y 35 ° C. 5. Baño de agua, 80 ° C ± 2 ° C 6. Microscopio de contraste de fases con objetivo de inmersión en aceite (100 ×) 7. Blender motor y frascos o Stomacher y bolsas 8. Mezclador Vortex B. Medios (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm055778.htm) 055778.htm) y reactivos (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm055791.htm)

La FDA no respalda específicamente ninguno de los productos comerciales enumerados. Productos equivalentes pueden estar disponibles. 1. Caldo de enriquecimien enriquecimiento to de Listeria tamponado (BLEB) ( M52 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064305.htm) )

2. Monohidrocloruro de acriflavina 3. Ácido Nalidíxico (sal de sodio) 4. Cicloheximid Cicloheximida a 5. Natamicina (Pimaricina) 6. Caldo Dey / Engley (D / E) ( M193 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064244.htm) )

7. Medio de Oxford (OXA) ( M118 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064232.htm) )

8. Agar PALCAM ( M1 M118a 18a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm0 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063488.htm) 63488.htm) ) 9. Agar MOX ( M103a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm06 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064024.htm) 4024.htm) ) 10. Cloruro de litio-feniletano litio-feniletanol-moxalactama l-moxalactama (LPM) agar ( M81 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064452.htm)  ) con esculina añadida y hierro ( M82 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm0 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064455.htm) 64455.htm) ) 11. Medio de recubrimiento cromogénico de R&F Listeria monocytogenes (Laboratorios R&F, Downers Grove, IL) ( M17a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm06 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063345.htm) 3345.htm) ) 12. Agar ALOA ( M10a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm06 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm062997.htm) 2997.htm) ) 13. Cromogénico Listeria Agar (Oxoid Ltd, Basingstoke, Inglaterra) ( M40B (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064552.htm) )

14. Rapid 'L. Mono (BioRad Laboratories Inc.) ( M131a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063558.htm) )

15. CHROMagar Listeria (CHROMAgar  (CHROMAgar,, París, Francia) ( M40a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064555.htm) )

16. Agar trypticase soy con extracto de levadura al 0,6% (TSAYE) (TSAYE) ( M153

(/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063785.htm) )

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17. Agar Sangre De Oveja ( M135 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm06 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063624.htm) 3624.htm) ) 18. Solución de peróxido de hidrógeno, 3% para prueba de catalasa ( R12 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm061210.htm) )

19. Kit de tinción de Gram 20. Medio de prueba de motilidad (MTM, Difco) ( M103 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064059.htm) )

21. Caldo de soja tripticasa con extracto de levadura al 0,6% (TSBye) ( M157 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063839.htm)  ) 22. Base de caldo de fermentación f ermentación de carbohidratos carbohidratos púrpuras ( M130 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063529.htm) ), que contiene soluciones al

0,5% de dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa 23. Solución salina fisiológica, 0,85% ( R63 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm062966.htm) )

24. Tampón de anticuerpos fluorescentes (FA) (Difco) 25. Sueros tipográficos de Listeria Tipo 1 (Difco cat. # 223031) y Tipo 4 (Difco Cat. # 223041) 26. Listeria Antisera Set (Denka Seiken producto # 294616) 27. Opcional: medio de reducción de nitrato ( M108 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm0641 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm0 64112.htm) 12.htm) ) y reactivos de detección de (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm062257.htm) 062257.htm) ) nitrato ( R48 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm Nota: Se pueden usar compañías alternativas cuando los productos son equivalentes.

C. Culturas de control 1. Listeria monocytogenes ATCC 19115 2. Listeria innocua ATCC 33090 3. Listeria seeligeri  ATCC  ATCC 35967 4. Listeria ivanovii  ATCC  ATCC 19119 5. Rhodococcus equi  ATCC  ATCC 6930 6. Staphylococcus aureus ATCC 25923 o ATCC 49444 D. Preparación de la muestra Las prácticas de transporte y almacenamien almacenamiento to de muestras deben mantener las condiciones de almacenamiento almacenamie nto recomendadas para el producto alimenticio. El análisis de la muestra debe iniciarse tan pronto como sea posible después de recibir la muestra. Si el análisis de la muestra debe retrasarse, almacene las muestras congeladas congeladas (-20 ° C ± 5 ° C); almacene alimentos no perecederos, enlatados o con poca humedad a temperatura ambiente, y almacene alimentos perecederos refrigerados, no congelados a 4 ° C ± 2 ° C hasta que se inicie el análisis de la muestra. Las opciones analíticas básicas incluyen: 1. Detección cualitativa (límite de detección BAM: Detección y enumeración de Listeria monocytogenes

como remojo y enjuague. Una porción de 50 g de la muestra debe reservarse para una posible enumeración de patógenos. patógenos. Almacénelo a 5 ° C si no está congelado o, si está congelado, en un congelador sin descongelación. descongelación. Consulte los documentos de guía de cumplimiento de muestreo aplicables para obtener instrucciones adicionales. b. Análisis de muestras compuestas: los compuestos se pueden usar para analizar varias subunidades de una sola muestra. Consulte los documentos de guía de cumplimiento de muestreo aplicables para procedimientos compuestos específicos. Generalmente, dos compuestos se preparan a partir de una muestra que consta de 10 submuestras (líquido, crema o alimentos sólidos). Para preparar un compuesto, se juntan porciones representativas de 50 g o ml de cada una de las 5 submuestras y se agregan 250 ml de BLEB basal sin agentes selectivos y luego se mezclan o se someten a estómago ( M52 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064305.htm)). Una porción de 50 g de esta mezcla compuesta (equivalente a 25 g de alimento más 25 ml de BLEB basal) se combina con 200 ml de BLEB basal. El compuesto se inocula luego como se describe en la sección E o F. Se debe retener una parte alícuota (100 ml) de la mezcla compuesta, preferiblemente preferiblemente a 5 ° C y no por debajo de 0 ° C, para una posible enumeración de patógenos. patógenos. c. Muestras ambientales: Al tomar muestras de superficies secas, los hisopos (algodón, poliéster o poliuretano) o las esponjas (celulosa o poliuretano) deben humedecerse previamente en 10 ml de caldo neutralizador Dey / Engley (D / E). Los hisopos generalmente generalmente se almacenan en contenedores de tubos y las esponjas generalmen generalmente te se almacenan en contenedores de bolsas.  Antes de tomar muestras, muestras, presione los hiso hisopos pos contra las paredes paredes del tubo interio interiorr o apriete las esponjas en bolsas para eliminar el exceso de caldo. Limpie las superficies ambientales con una presión firme y uniforme verticalmente (aproximadamente 10 veces), luego gire la muestra y use el otro lado para frotar horizontalmente (aproximada (aproximadamente mente 10 veces) y en diagonal (aproximadamente (aproximadame nte 10 veces). Cuando vuelva a colocar los muestreadores en el recipiente, asegúrese de que estén sumergidos en el caldo de neutralización D / E. Al muestrear superficies mojadas, Deben usarse hisopos o esponjas secas y colocarlas en el caldo neutralizante D / E inmediatamente inmediatamen te después del muestreo. Los hisopos que están hechos de algodón o que tienen puntas grandes parecen absorber el líquido mejor que otros. Para muestras que no son adecuadas para ser recogidas por hisopos / esponjas de tamaño regular mencionadas en la sección A, consulte los documentos de guía de cumplimiento de muestreo aplicables para obtener  instrucciones adicionales. adicionales. Después del muestreo, el hisopo / esponja se puede mantener en caldo D / E a 4 ° C hasta 48 h antes del análisis. El hisopo / esponja y el caldo neutralizante D / E se agregan luego a 90 ml (o más para sumergir completamente el hisopo o esponja) de piruvato que contiene BLEB sin aditivos selectivos ( Para muestras que no son adecuadas para ser recogidas por hisopos / esponjas de tamaño regular mencionadas en la sección A, consulte los documentos de guía de cumplimiento de muestreo aplicables para obtener instrucciones adicionales adicionales.. Después del muestreo, el hisopo / esponja se puede mantener en caldo D / E a 4 ° C hasta 48 h antes del análisis. El hisopo / esponja y el caldo neutralizante D / E se agregan luego a 90 ml (o más para sumergir completamente el hisopo o esponja) de piruvato que contiene BLEB sin aditivos selectivos ( Para muestras que no son adecuadas para ser recogidas por hisopos / esponjas de tamaño regular mencionadas en la sección A, consulte los documentos de guía de cumplimiento de muestreo aplicables para obtener instrucciones adicionales. Después del muestreo, el hisopo / esponja se puede mantener en caldo D / E a 4 ° C hasta 48 h antes del análisis. El hisopo / esponja y el caldo neutralizante D / E se agregan luego a 90 ml (o más para sumergir  completamente el hisopo o esponja) de piruvato que contiene BLEB sin aditivos selectivos ( M52 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064305.htm) ). La esponja y el caldo D / E también se pueden agregar a 225 ml de BLEB. Masajee a fondo o con el estómago para expulsar el caldo de recolección en caldo de enriquecimiento. Continuar el enriquecimiento como se describe en la sección E o F. d. Interpretar el resultado. La confirmación de uno o más aislamientos de L. monocytogenes a partir  de un enriquecimiento indica que L. monocytogenes está presente a ≥ 1 UFC por tamaño de

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muestra analizada o presente en una muestra de esponja o hisopo ambiental. 2. Determinación cuantitativa a partir de alimentos. La enumeración se realiza utilizando una combinación de NMP y enchapado directo. Consulte la sección J para más detalles. Las muestras de vigilancia generalmente generalmente se analizan primero por detección cualitativa y luego se enumeran las porciones de reserva de las muestras positivas. Para situaciones de respuesta a brotes, todas las muestras pueden ser enumeradas directamente. Consulte la sección J y los documentos de guía de cumplimiento de muestreo aplicables. E. Procedimiento de Enriquecimiento 1. Incubar muestras de alimentos o muestras ambientales homogeneizadas en BLEB con piruvato ( M52 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064305.htm) , 43 ) a 30 ° C, durante 4 h. 2. Agregue asépticamente los tres agentes selectivos esterilizados de filtro ( M52 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064305.htm) ) para lograr concentraciones finales de 10 mg / L de acriflavina, 40 mg / L de cicloheximida y 50 mg / L de ácido nalidíxico sódico en el BLEB con pre-enriqueci pre-enriquecimiento miento de piruvato. 3. Mezcle el enriquecimiento con aditivos y continúe la incubación a 30 ° C durante el resto del período de enriquecimiento de 24 a 48 h. F. Metodologías de selección alternativas Las siguientes metodologías de detección alternativas se pueden usar para detectar muestras de la presencia de Listeria . Siga el prospecto del fabricante para asegurarse de que no se hayan desviado de las versiones aprobadas protocolos Manual de Métodos Oficiales dede AOAC INTERNACIONAL (Sección de F1).losLos kits solo del están aprobados para las matrices alimentos especificadas, según el método OMA, que varían de un kit a otro. Para otras matrices de alimentos que no están validadas, es necesaria una validación de extensión de matriz. Los resultados negativos obtenidos con los productos se consideran definitivos y no se requieren más pruebas. Los resultados positivos presuntos con estos métodos de selección rápida deben confirmarse mediante la aplicación de rayas a los agares selectivos y la confirmación de los aislamientos a nivel de especie mediante los procedimientoss descritos en las secciones GI. procedimiento F1. Métodos rápidos de selección para Listeria spp. 1. Método Oficial AOAC 993.09. Listeria en alimentos seleccionados Método de hibridación de ácido desoxirribonucleico desoxirribonu cleico colorimétrico ( ensayo de Listeria GENE-TRAK ). ( 3 , 16 ) (Aplicable a productos lácteos, carnes y mariscos) Estudio colaborativo : leche (2%), queso brie, carne de cangrejo cocida, salchichas, carne asada, carne de cerdo cruda Pre-colaborativo : carne de cangrejo, camarones crudos, queso cheddar, requesón, helado, leche con chocolate, leche deshidratada, filete de pescado, carne de cerdo cruda molida, salchicha fermentada, pavo molido crudo. 2. Método Oficial AOAC 994.03. Listeria en alimentos selectos. Método de ensayo inmunoabsorbente inmunoabsorb ente ligado a enzima monoclonal colorimétrico ( Listeria -Tek) ( 4 , 17 , 31 ) (Aplicable a productos lácteos, mariscos, carnes). Estudio colaborativo : salchichas, carne asada envasada al vacío, queso brie, 2% de leche, camarones crudos congelados, cangrejo cocido congelado. Pre-colaborativo : carne de cangrejo, helado, leche, leche con chocolate, leche deshidratada, pescado crudo, carne cocida, carne asada, jamón curado, salchichas crudas, ostras crudas, pollo crudo, pavo crudo.

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3. Método Oficial AOAC 995.22. 2000. Listeria en alimentos selectos. Método de detección de inmunoensayo enzimático policlonal colorimétrico (TECRA Listeria Visual Immunoassay). ( 5 , 29 ) (Aplicable a productos lácteos, mariscos, aves de corral, carnes (no se trata del chuck), vegetales de hoja) Estudio colaborativo : filetes de pescado, helado, lechuga, pollo, pavo molido. Pre-colaborativo : carne de cangrejo, camarones, queso blando, leche con chocolate, leche deshidratada, carne cruda, carne asada, salchichas, bologna, ostras, pollo. 4. Método Oficial AOAC 2002.09. Listeria en alimentos selectos. TECRA Listeria Visual Inmunoensayo utilizando caldo de enriquecimiento TECRA Listeria . ( 32 , 5 , 29 ). (Aplicable a carnes crudas y procesadas, productos lácteos cultivados y no cultivados); Nota : El método se basa en 995.22 pero con enriquecimiento alterado, omisión de

ciclohexamida y alimentos adicionales. Estudio colaborativo: filetes de pescado, pavo, carne molida cruda, helado, lechuga. 5. Método Oficial AOAC 996.14. Listeria en ciertos alimentos Método de inmunoensayo de enzimas policlonales de garantía (EIA) ( 6 , 19 ). (Aplicable a productos lácteos, carnes rojas, carne de cerdo, productos avícolas, frutas, nueces, mariscos, pastas, verduras, queso, harina de animales, chocolate y huevos, harina de huesos y de superficies ambientales) Estudio colaborativo : leche deshidratada sin grasa, helado, aves crudas, camarones crudos, carne asada cocida, judías verdes Pre-colaborativo : carne de cangrejo, queso blando, huevo seco, líquido de huevo congelado, leche, leche con chocolate, pescado crudo, harina de huesos, carne de res cruda, carne de cerdo cruda, vieiras, chocolate, nueces, pasta, pollo crudo, ensalada de col 6. Método Oficial AOAC 997.03. Listeria en alimentos selectos Ensayo de inmunoprecipitación visual (VIP) ( 7 , 20 ). (Aplicable a productos lácteos, carnes rojas, carne de cerdo, aves y productos de aves de corral, mariscos, frutas, verduras, nueces, pastas, chocolate, huevos, harina de huesos y superficies ambientales. Estudio colaborativo : lecheverdes, deshidratada sin grasa. Helados, aves crudas, camarones crudos, carne asada cocida, judías superficies ambientales 7. Método oficial de la AOAC 999.06. Listeria en alimentos selectos. Ensayo de inmunofluorescencia ligada a enzimas (ELFA) Método de detección del ensayo VIDAS LIS ( 8 , 21 ). (Aplicable a productos lácteos, verduras, mariscos, carnes y aves crudas, y carnes y aves procesadas) Estudio colaborativo : helados, judías verdes, pescado, pavo, queso, roast beef. 8. Método Oficial AOAC 2004.06. Listeria en alimentos selectos. Método de selección del ensayo VIDAS LIS modificado ( 36 ). (Aplicable a la detección de Listeria en productos lácteos, verduras, mariscos, carnes crudas y aves de corral y carnes procesadas y aves de corral). Estudio colaborativo : queso brie, helado, pescado, judías verdes, rosbif.

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9. Método Oficial AOAC 2010.02. Listeria en alimentos selectos. Método de selección del ensayo VIDAS LSX ( 35 ). (Aplicable a productos lácteos, verduras, mariscos, carnes y aves crudas, y carnes y aves procesadas). Estudio colaborativo : helado de vainilla, queso cheddar cheddar,, carne molida cruda, judías verdes congeladas, pavo frito, camarones cocidos 10. Método Oficial AOAC 2013.10. Listeria en alimentos selectos y superficies ambientales. VIDAS 36 ). UP Listeria  (LPT) Kit de(25 ensayo (Aplicable a jamón y 125(g), pepperoni (25 g), salchichas (25 g), nuggets de pollo (25 g), paté de hígado de pollo (25 g), carne molida (125 g), pavo delicatessen (125 g), camarones cocidos (25 g), salmón ahumado (25 g), melón entero cantalupo, ensalada mixta envasada (25 g), mantequilla de maní (25 g), pimienta negra (25 g), helado de vainilla (25 g) g), queso fresco (25 y 125 g), acero inoxidable, plástico, cerámica y superficies ambie ambientales ntales de hormigón.) Consulte los datos complementarios, Tablas 2A – D, para obtener resultados detallados del estudio de colaboración sobre J. AOAC Int. sitio web, http://aoac.publisher.ingentaconnect.com/content/aoac/jaoac (http://aoac.publisher.ingentaconnect.com/content/aoac/jaoac) .

F2. Métodos de selección rápida para Listeria monocytogenes . Tenga en cuenta que estos métodos no detectan Listeria spp. y, por lo tanto, puede no ser adecuado para situaciones en las que la identificación de Listeria spp. es deseado. 1. Método Oficial AOAC 2003.12. Listeria monocytogenes en alimentos selectos. Sistema automatizado BAX® ( 9 ). (Aplicable a productos lácteos, frutas y verduras [excepto rábanos], mariscos, carnes crudas y procesadas y aves de corral.) Estudio colaborativo : salchichas, quesos blandos, salmón ahumado, carne molida, rábanos, guisantes. 2. Método Oficial AOAC 2004.02. Listeria monocytogenes en alimentos selectos. Ensayo de inmunofluorescencia inmunofluores cencia ligada a enzimas (ELFA) Método de detección del ensayo VIDAS LMO2 ( 33 ). (Aplicable a la detección de L. monocytogenes en productos lácteos, verduras, mariscos, carnes crudas y aves de corral y carnes procesadas y aves de corral.) Estudio de colaboración: helado de vainilla, queso brie, carne asada cocida, judías verdes congeladas, tilapia congelada. 3. Método Oficial AOAC 2013.11. Listeria monocytogenes en alimentos selectos. VIDAS Listeria monocytogenes (LMX) Kit de ensayo ( 37 ). (Aplicable a jamón (25 y 125 g), salchicha fermentada (25 g), paté de hígado (25 g), queso fundido (25 g), helado de vainilla (25 g), camarones cocidos (25 g), blanco ahumado) Pescado (25 g), espinacas congeladas (25 g), mantequilla de maní (25 g), pavo deli (25 y 125 g), queso fresco (125 g) y carne molida (125 g). G. Procedimiento de aislamiento 1. A las 24 y 48 h, extraiga los enriquecimie enriquecimientos ntos de BLEB en un agar selectivo basado en esculina y uno cromogénico de cada una de las categorías enumeradas en las secciones G.1.A y G.1.B. Incubar las placas hasta 48 h. Compruebe las placas tanto a las 24 h como a las 48h.  A. Listeria basada en esculina selectiva agars:

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a. Agar de Oxford (OXA) ( 18 ) ( M118 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064232.htm) ). Después de 24 h de incubación a 35 ° C, las colonias de especies típicas de Listeria son de aproximadame aproximadamente nte

1 mm de diámetro, colonias de gris a negro rodeadas por un halo negro. Después de 48 h de incubación, las colonias de especies típicas de Listeria son de aproximadamente 2-3 mm de diámetro, negras con un halo negro y un centro hundido. b. PALCAM ( 50 ) ( M138a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063488.htm) ). Las condiciones de incubación y la apariencia de las colonias de especies de Listeria son las mismas que para el

agar Oxford, excepto que el color de la placa de fondo es rojo. c. Agar de Oxford modificado (MOX) ( 46 ) ( M103a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064024.htm) ). Las condiciones de incubación y la apariencia de las colonias de especies de Listeria son las mismas que para el

agar Oxford. d. LPM ( 30 ) ( M81 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm06 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064452.htm) 4452.htm) ) 3+ fortificado con Esculi Esculin n y Fe . Incubar a 30 ° C. El aspecto de la colonia típica de especies de Listeria es similar al agar Oxford. (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064452.htm)

B. Cromogénico L. monocytogenes - L.ivanovii  agares  agares cromogénicos cromogénicos:: a. Medio de recubrimiento cromogén cromogénico ico de R&F Listeria monocytogenes (R&F LMCPM) ( 39 , 25 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm0 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063342.htm) 63342.htm) ) Las  ) ( M17a placas de incubación (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063342.htm) a 35 ° C, L. monocytogenes y L. ivanovii  producen  producen una colonia de 1-3 mm de diámetro, lisa, convexa, azul / verde y pequeña Halo azul / verde. Todas las demás especies de Listeria producen una colonia blanca, lisa y convexa, de 1-2 mm, sin halo. Aunque es raro, L. ivanovii  ha  ha sido aislado de alimentos previamente. Las colonias típicas de L. monocytogenes y L. ivanovii  se  se

pueden distinguir utilizando un medio de confirmación comercial (laboratorios R&F) o mediante los métodos de identificación descritos en la sección H. b. RAPID ' L. mono ( M131a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063558.htm) ): las placas de incubación (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm0 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063558.htm) 63558.htm) a 37 ° C, L. monocytogenes y L. ivanovii  producen  producen una colonia lisa, convexa, azul / verde de 1-3 mm de diámetro. Las colonias típicas aparecen azul oscuro / verde en el fondo rojo de RAPID ' L. mono agar y aparecen azul / verde cuando la flora de fondo cambia el color de fondo del agar  a amarillo. Además, un halo amarillo rodeará las colonias de L. ivanovii  .  . Sin embargo, el halo

amarillo puede ser obvio en áreas de al menos un crecimiento moderado. El gran crecimiento de L. ivanovii  podría  podría hacer que toda la placa se vuelva amarilla. Además, se debe tener  cuidado con L. monocytogenes-L. ivanovii diferenciación diferenciación porque la flora de fondo en algunos productos alimenticios puede puede cambiar el color de ciertas áreas de este agar a amarillo, y esto podría hacer que L. monocytogenes aparezca como L. ivanovii  . . Todas las demás especies de Listeria producen una colonia blanca lisa y convexa de 1-2 mm con o sin un halo amarillo. c. Agar Listeria según Ottaviani y Agosti (ALOA) ( 44 , 49 ) ( M10a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm062997.htm) ), o Agar de Listeria cromogénica oxoide (OCLA) ( M40b (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064552.htm) ). Incubar las placas a 37 ° C, todas las especies de Listeria aparecen como colonias azules / verdes de 1-3 mm

de diámetro. Además, L. monocytogenes y L. ivanovii  tienen  tienen un halo blanco opaco que rodea la colonia.

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d. CHROMagar Listeria ( 1 ) ( M40a (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064555.htm) ) - Las condiciones de incubación y el aspecto de Listeri  y  y colonias son las mismas que para ALOA, excepto que

el color de la placa de fondo es azul claro. Para los métodos rápidos aprobados, use el agar de aislamiento selectivo recomendado por  el fabricante, pero también se recomienda el uso auxiliar de L. monocytogenes cromogénicos - agares diferenciales de L. ivanovii  . . Nota : el cromógeno utilizado tanto en R&F LMCPM como en RAPID 'L. mono agars es indicativo

de la actividad de fosfolipasa C específica de fosfoatidilinositol (PI-PLC). En estos agars, las especies de Listeria con actividad de PI-PLC, L. monocytogenes y L. ivanovii  ,  , aparecerán de color azul verdoso y todas las demás especies de Listeria no desarrollarán el color azul-verde y permanecerán de apariencia blanca. En el caso de ALOA y CHROMagar, la presencia de una especie de Listeria basada en una actividad enzimática β-glucosiadase específica que es detectada por el cromógeno, por lo tanto, todas las especies de Listeria aparecerán de color azulverde en estos agares. La actividad de la fosfolipipasa específica para L. monocytogenes y L. ivanovii  Está  Está determinado por el halo blanco opaco adicional que rodea a la colonia. Para los métodos rápidos aprobados, use el agar de aislamiento selectivo recomendado por el fabricante, pero también se recomienda el uso auxiliar de L. monocytogenes cromogénicos agares diferenciales de L. ivanovii  . . 2. Seleccione hasta 5 colonias típicas de cada agar a base de esculina y raya por pureza a TSAYE ( M153 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm0 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063785.htm) 63785.htm) ) e incube las placas a 30 ° C durante 24-48 h. Seleccione hasta 2 colonias rayar siincubar usa L. monocytogenes  agars cromogénicos diferenciales de L. ivanovii  .  . Lastípicas placaspara se pueden a 35 ° C si las colonias no se utilizarán para observaciones de motilidad en montajes húmedos. 3. Si se dispone de colonias aisladas, utilice el crecimiento crecimiento restante de la colonia para apuñalar una placa de agar de sangre de oveja al 5% ( M135 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063624.htm) ). Incubar a 35 ° C durante 2448 h. H. Procedimiento de identificación Identifique los aislamientos purificados del crecimiento en la placa TSAYE mediante las siguientes pruebas clásicas (H.1.ae). Alternativamente, se pueden usar kits de pruebas bioquímicas rápidas o análisis de PCR para confirmar los aislamientos al nivel de la especie (sección H.2.ac). Examine las placas TSAYE en busca de colonias blancas convexas lisas típicas de 1-3 mm de diámetro. La observación con iluminación de transmisión oblicua de Henry ( 23 ) puede ser útil en esta etapa, pero no es obligatoria.

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Figura 1. Sistema óptico Henry para el examen de colonias. 1. Clasificación estándar  a. Hemólisis: Inocule fuertemente (de la colonia TSAye) 5% de agar de sangre de oveja al apuñalar las placas que se han vertido espesas y se han secado bien (verifique la humedad antes de usarlas). Dibuje una cuadrícula de 20-25 espacios en el fondo de la placa. Apuñalar una cultura por espacio de cuadrícula. Siempre apuñala los controles positivos ( L. ivanovii  y  y L. monocytogenes ) y el control negativo (L. innocua ). Incubar durante 24-48 horas a 35 ° C. Intentar apuñalar lo más cerca posible del fondo de la capa de agar, sin tocar realmente el fondo de la capa de agar y posiblemente fracturar el agar. Examine las placas de agar de sangre que contengan cepas de cultivo iluminadas desde detrás de la placa. L. monocytogenes y L. seeligeri  producen  producen una zona ligeramente despejada alrededor  de la puñalada. L. innocua no muestra una zona de hemólisis, mientras que L. ivanovii  produce  produce una zona clara bien definida alrededor de la puñalada. Si se observó un cultivo mixto en la placa TSAYE, repita la prueba de hemólisis con una colonia aislada. Prueba CAMP: resuelva las reacciones cuestionables mediante la prueba Christie-Atkins-MunchPeterson (CAMP) ( 15 ). Las cepas de prueba CAMP están disponibles en las colecciones de cultivos, incluida la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, http://www.atcc.org (http://www.atcc.org) (http://www.atcc.org)

i. Raya débilmente β-hemolítica S. aureus (FDA, cepa ATCC 49444 (CIP 5710; NCTC 7428) o  ATCC  ATCC 25923) y R. equi  (ATCC  (ATCC 6939; NCTC 1621) verticalmente en agar de sangre de oveja. ii. Separar por separado las cepas de prueba horizontalmente entre las rayas de S. aureus y R. equi  sin  sin tocarlas. Incubar la placa de 24 a 48 horas a 35 ° C. La figura 1 muestra la disposición de las rayas de cultivo en una placa CAMP. iii. iii. Examinar las placas para hemólisis en la zona de influencia de las rayas verticales. La hemólisis de L. monocytogenes y L. seeligeri  se  se potencia cerca de la racha de S. aureus ; La hemólisis de L. ivanovii  se  se mejora cerca de la racha de R. equi  . . Otras especies no son hemolíticas y no reaccionan en esta prueba (Tabla 1). iv. Alternativamente, un factor preparado fácilmente a partir de cultivos de S. aureus puede monocytogenes seeligeri  usarse mejorar la hemólisis por L.con  en placas  en de agar sangre para de oveja. Discos impregnados la β-lisina de  y S.L. aureus  (REMEL, Lenexa, KS).de a 1. Diferenciación de especies de Listeria.

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ecies

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Manitol

Ramnosa

Xilosa

Virulencia a

βhemólisis

Mejora de la hemólisis con

b

Staphylococcus aureus

Mejora de la hemólisis con Rhodococcus equi  (R)  (R)

(S) -

+c

-

+

+

+

-d

vanovii e

-

-

+

+

+

-

+

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-

V f 

-

-

-

-

-

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-

V

+

-

-

-

-

eeligeri 

-

-

+

-

+g

+

-

rayi h

+

V

-

-

-

nocytogenes

eba en ratón ñal de agar en sangre de oveja unas cepas del linaje III de L. monocytogenes , que se asocian principalmente con listeriosis animal, son menos  ramnosa. cepasde raras son S + y de R +. La reacción R + escomo menos pronunciada que de L. ivanovii  . de . ivanovii y ribosa cepas fermentación ribosa se clasifican L. ivanovii   subsp.  subsp. nolafermentadores o L. ivanovii  subsp.  subsp. Londiniensis Londiniensis.. iotipos variables, más del 10% de las cepas para este rasgo. cepas de L. seeligeri  débilmente  débilmente hemolíticas pueden aparecer aparecer no hemolíticas. uye dos subespecies - L. grayi subsp. murrayi reduce nitrato L. gris i subsp. El grayi no reduce el nitrato.

ra 2. Prueba CAMP para Listeria monocytogenes : patrón de inoculación de la placa de agar de sangre de oveja. líneas horizontales representan inoculaciones inoculaciones de rayas de 5 cepas de prueba. Las líneas verticales representan laciones de rayas de Staphylococcus aureus (S) y Rhodococcus equi  (R).  (R). Las líneas sombreadas indican (solo rma de diagrama) las ubicaciones de las regiones de mejora de la hemólisis. b. Motilidad: Elija la colonia típica de TSAYE y examine por montaje húmedo, usando solución salina al 0,85% para suspender el medio y el objetivo de inmersión en aceite del microscopio de

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contraste de fase. Elija una colonia con suficiente crecimiento para hacer una suspensión bastante pesada; emulsionar bien. Listeria spp. Son varillas delgadas y cortas con ligera movilidad giratoria o de volteo. Siempre comparar con la cultura conocida. Cocci  , , varillas grandes o varillas con motilidad de natación rápida no son Listeria spp. Alternativamente, tubo de puño de MTM ( M103 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm06 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064059.htm) 4059.htm) ) de TSAYE. Incubar hasta 7 días a temperatura ambiente (20-25 ° C). Observe diariamente hasta que el patrón de crecimiento aislado sea obvio. La Listeria es móvil, dando un patrón típico de crecimiento tipo paraguas. c. Catalasa: pruebe colonias típicas para catalasa colocando algo de crecimiento de colonias en una gota de peróxido de hidrógeno al 3%. Las especies de Listeria son catalasas positivas. d. Tinción de Gram: use un crecimiento de 16 a 24 h de las placas TSAYE. Todas las Listeria spp. Son barras cortas, grampositivas; sin embargo, con cultivos más antiguos, la reacción de la tinción de Gram puede ser variable y también las células pueden aparecer esferoidales. Las células tienen tendencia a palidarse en frotis de tinción espesa. Esto puede conducir a un rechazo falso como un diptheroide. e. Serie de fermentación de hidratos de carbono. Elija la colonia típica en un tubo de TSBYE para inocular la fermentación de carbohidratos carbohidratos y otros medios de prueba. Incubar a 35 ° C durante 24 h. Este cultivo puede mantenerse a 4 ° C durante varios días y usarse repetidamente como inóculo. i. Del cultivo de TSBYE, inocule los siguientes carbohidratos en soluciones al 0,5% en caldo de carbohidratos de color púrpura con tubos Durham: dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días a 35ºC. ii. Las reacciones positivas se indicarán por la producción de ácido y los medios que se vuelven de color amarillo sin producción de gas. Todas las especies de Listeria deben ser positivas para dextrosa, esculina y maltosa. Todas las Listeria spp. excepto L. grayi  debe  debe ser manitolnegativo. Si la pigmentación del aislamiento en OXA, PALCAM, MOX o LPM más esculina / Fe 3+ es inequívoca inequívoca,, se puede omitir la prueba de esculina. Consulte la Tabla 1 para las interpretacioness de los resultados. interpretacione f. Opcional: Prueba de reducción de nitrato : Sólo L. grayi  ssp.  ssp. Murrayi  reduce  reduce los nitratos. La prueba distingue a L. grayi  ssp.  ssp. murrayi  de  de L. grayi  ssp.  ssp. grayi  . . i. Use un cultivo TSAYE para inocular el caldo de nitrato ( M108 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm0 (/Food/FoodScienceResearc h/LaboratoryMethods/ucm0641 64112.htm) 12.htm) ). Incubar a 35 ° C

durante 5 días. ii. Añadir 0,2 ml de reactivo A, seguido de 0,2 ml de reactivo B (R48). Un color rojo-violeta indica la presencia de nitrito, es decir, el nitrato se ha reducido. Si no se desarrolla color, agregue zinc en polvo y manténgalo durante 1 h. Un color rojo violeta en desarrollo indica que el nitrato todavía está presente y no se ha reducido. iii. iii. Como procedimiento alterna alternativo, tivo, agregue 0,2 ml de reactivo A seguido de 0,2 ml de reactivo C. Un color naranja indica una reducción de nitrato. Si no se desarrolla ningún color, agregue zinc en polvo como se indicó anteriormente. El desarrollo de un color naranja indica nitrato no reducido. g. Opcional: Puesto que todas las Listeria especies de ensayo negativo para indol, oxidasa, ureasa, y H 2 producción S a partir de compuestos orgánicos de azufre (H 2 S se produce a p partir artir de tiosulfato en el kit de prueba MICRO-ID) y la prueba positiva para rojo de metilo y VogesProskauer , estas pruebas son discrecionales. discrecionales. Brochothrix  , , que está filogenéticamen filogenéticamente te estrechamente con Listeria  , se distinguedistintivas de Listeriade  por incapacidad para crecer 35 ° C y por su relacionada falta de motilidad. Las características lassubarras grampositivas no a formadoras de esporas , Erysipelothrix  y  y Kurthia , que aparecen raramente en el análisis de Listeria , se pueden encontrar en otros lugares (11 , 43 ).

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h. Opcional: Prueba de patogenicidad en ratones inmunocomprometidos: las pruebas clásicas para la patogenicidad de Listeria son la prueba de conjuntivitis de Anton (conejos), la inoculación de ratones y la inoculación de huevos embrionados. Se recomienda la prueba de ratón inmunocomprometido, inmunocompro metido, que usa inyección intraperitoneal (ip), debido a su sensibilidad enormemente mejorada ( 38 ). La confirmación de la patogenicidad animal de L. monocytogenes no es necesaria para los aislamientos clínicos y es opcional para los aislamientos de alimentos. Un aislado debe identificarse como L. monocytogenes si cumple con todos los otros criterios descritos en este capítulo. Vea el enlace para el protocolo detallado (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm474633.htm) . Los datos bioquímicos y de patogenicidad se resumen en la Tabla 1. Toda la recopilación de datos debe completarse antes de que se determinen las identidades de las especies y se realicen los subtipos posteriores. Existen cepas atípicas de Listeria que podrían confundir la identificación. Por ejemplo, hay referencias no documentadas ( 46 ) a aislamientos hemolític hemolíticos os de L. innocua . Algunos aislamientos de L. monocytogenes y L. welshimeri  son  son negativos a la ramnosa. Algunos aislados de L. seeligeri  tienen  tienen una reacción hemolítica muy débil y pueden confundirse con especies no hemolíticas. A veces se aíslan cepas de Listeria aberrantes que son extremadamente difíciles de especiar ( 26). (Véase la Guía para usuarios de BAM en Identificación de atípicos hemolíticas Listeria aislamientos (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm251688.htm) .) Si tal un aberrante Listeria aislar  se obtiene, póngase en contacto con Karen Jinneman (mailto:[email protected]) (mailto:[email protected]) . 2. Identificación rápida alternativa Los aislados purificados pueden identificarse rápidamente mediante el uso de kits comerciales o PCR en tiempo real. Siga las instrucciones del fabricante para la inoculación e interpretación. a. API Listeria (bioMerieux, Durham, NC) que requiere una prueba de hemólisis β adicional para la identificación del aislamiento final ( 12 ). La prueba CAMP es opcional. b. Sistema de identificación de Listeria Micro-ID (Remel, Lenexa, KS) que requiere una prueba CAMP adicional y una prueba de hemólisis β. ( 2 , 22 ). c. Tarjeta Vitek 2 Automatic Gram Positive (bioMerieux, Hazelwood, MO), que requiere una prueba CAMP adicional y una prueba de hemólisis β ( 38 ). d. PCR en tiempo real, que requiere una prueba adicional de hemólisis β. La prueba CAMP es opcional. Protocolo: Confirmación simultánea de especies de Listeria y L. monocytogenes aisladas por PCR en tiempo real (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm279532.htm) .  Anexo 1: Validac Validación ión de laboratorio único (SLV): valores de Ct individuales para cada aislado por cada mezcla de enzimas (/downloads/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/UCM279534.pdf) . (pdf,

58Kb)  Anexo 2: Validac Validación ión de laboratorio múltiple (MLV): valores de Ct individuales i ndividuales para cada aislamiento por laboratorio (/downloads/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/UCM279535.pdf) . (pdf,

60Kb) La identificación de especies de Listeria incluye L. monocytogenes , L. innocua , L. ivanovii  ,  , L. seeligeri   y y L. welshimeri  . . La identificación de L. grayi  no  no se ha verificado con este ensayo. Los aislamientos que se identifican como especies de Listeria pero no L. monocytogenes pueden

especificarse completamente completamente como se describe en los pasos H1.ae o H2. C.A. Se pueden usar métodos rápidos de AOAC OMA alternativos para la detección de L. monocytogene enumerados en la sección F2 para confirmar el cultivo puro. Dependiend Dependiendo o del kit, los aislados pueden identificarse en cultivo puro o de OXA o de otros agares de aislamiento selectivo. Los aislamientos

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purificados identificados como Listeria monocytogenes por estas pruebas deben conservarse como referencia reglamentaria. Para muestras ambientales, consulte los documentos de guía de cumplimiento de muestreo aplicables para determinar si la identificación a nivel de género es suficiente y si es necesaria una diferenciación adicional entre L. monocytogenes y otras especies de Listeria . I. Subtipo de aislados de L. monocytogenes (requerido) Los aislados de L. monocytogenes confirmados deben tipificarse t ipificarse serológicamente y genéticamente. 1. Mecanografía serológica. La serología es útil al abordar consideraciones epidemiológicas. epidemiológicas. La mayoría de los aislamientos de L. monocytogenes obtenidos de pacientes, alimentos y el medio ambiente son de tipo 1 o 4. Más del 90% de los aislamientos de L. monocytogenes pueden ser serotipados con sueros disponibles comercialmente. comercialmente. Sin embargo, todas las especies de Listeria no patógenas , excepto L. welshimeri  , , comparten uno o más antígenos somáticos con L. monocytogenes ( 43 ). Por  lo tanto, el serotipado solo sin una caracterización completa del aislamiento no es adecuado para la identificación de L. monocytogenes . Use sueros comerciales (Difco Type 1 cat # 223031 y Type 4 cat # 223041) para caracterizar  aislamientos como tipo 1, tipo 4 o no tipo 1 o 4 (tipos 3, 5, 6, etc.) como mínimo. Use un cultivo TSBye para inocular el caldo de triptosa. Incubar durante 24 horas a 35 ° C, a la que se reduce la expresión del antígeno flagella (H). Transfiera a inclinaciones de agar de Triptosa e incube durante 24 horas a 35 ° C. Lave ambas inclinaciones en un total de 3 ml de tampón de anticuerpo fluorescente (FA) (FA) Difco y transfiera a un tubo estéril de tapa de rosca de 16 × 125 mm. Calentar en un baño de agua a 80 ° C durante 1 h. Células de sedimento por centrifugación a 1600 g durante 30 min. Retire 2.2-2.3 ml de líquido sobrenadante sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en el resto del tampón. Siga las recomendaciones recomendacio nes del fabricante para la dilución y aglutinación de sueros. También se puede realizar una caracterización serológica completa (producto Denka Seiken # 294616). Los cultivos puros de aislados de L. monocytogenes se deben cultivar durante 24 horas a 35 ° C en agar no selectivo, como el agar BHI. El crecimiento de colonias luego se resuspende, se inactiva por calor y se prueba la aglutinación según lo recomendado por el fabricante de antisueros. 2. Subtitulación genética. La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) mediante protocolos estándar PulseNet de alimentos y aislamientos ambientales debe enviarse a PulseNet (CDC, Atlanta, GA). Retener todos los aislamientos, ya que también se pueden solicitar técnicas de subtipo adicionales. J. Enumeración (requerido) Si una muestra de alimentos da positivo para L. monocytogenes , use una porción de reserva de la muestra para la enumeración. La enumeración se realiza utilizando una combinación de NMP y enchapado directo. Procedimiento de MPN :

a. Prepare un homogeneizado de una cantidad de 25 g de muestra de alimento de reserva en 225 ml de BLEB precalentado con o sin piruvato y sin adición retardada de agentes selectivos). b. Prepare una MPN de 4 diluciones y 4 tubos utilizando diluciones que suministrarán equiv equivalentes alentes a 10, 1, 0.1 y 0.01 g de muestra por alícuota en cada dilución respectiva. c. Incubar las doce alícuotas como se describe en la sección E. d. A las 48 h raya cada alícuota como se describe en la sección G seguido de aislamiento y confirmación de acuerdo con las secciones GH. Alternativamente, cada uno de los enriquecimien enriquecimientos tos puede seleccionarse rápidamente rápidamente por uno de los métodos aprobados descritos en la sección F con la confirmación de todos los positivos presuntos mediante los pasos de aislamiento y confirmación descritos en las secciones GH.

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e. Interprete los resultados según el número de tubos con L. monocytogenes monocytogenes positivos confirmados utilizando las tablas del Apéndice 2 ( 14 ) de BAM . f. Si todos los tubos de MPN son positivos para Listeria , consulte el revestimiento directo para obtener  los resultados de la enumeración enumeración.. g. En situaciones que requerirían límites de confianza más estrechos, se podría aumentar el número de tubos replicados para ciertas diluciones. Un ml de homogeneizado de BLEB completo y la muestra se pueden agregar y diluir mediante una pipeta multicanal o mediante robot en placas de 96 pocillos. Si el número de tubos es superior a 3 o el número de tubos no es igual entre las diferentes diluciones, diluciones, se puede utilizar una calculadora de MPN validada por AOAC: ( http://www.aoac.org/imis15_ http://www .aoac.org/imis15_prod/Programs/07tra prod/Programs/07trad02LCFMPNCal d02LCFMPNCalculator culator.zip .zip ) Procedimiento de enchapado directo :

h. Para alimentos sólidos, prepare un homogeneizado de una cantidad de 25 g de muestra de alimentos de reserva en 225 ml de BLEB sin piruvato o agentes selectivos. Realizar otra dilución 10 veces. Ciertos alimentos pueden requerir diferentes procedimientos de configuración y dilución de la muestra, consulte los documentos de asignación de cumplimiento correspondientes. i. Placa directa 1 ml de alimento líquido o 1 ml de homogeneizado de alimento sólido preparado en el paso a sobre 3 a 5 platos de uno de los agares cromogénicos diferenciales de L. monocytogenes como se describe en la sección G.  j. Si las colonias en las placas placas son demasia demasiado do numerosas pa para ra contarlas, use una m muestra uestra de reserva, realice diluciones en serie adicionales de 10 veces y proceda con el recubrimiento directo. k. Confirmar 5 colonias representativas por placa. l. Alternativamente, el método de galvanoplastia en espiral descrito en el Capítulo 3 puede usarse para la galvanoplastia directa.

Notas : la Orientación para usuarios de BAM en la identificación de atípicos hemolíticas Listeria aislamientos (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm2 (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm251688.htm) 51688.htm)

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Compendio de métodos analíticos de laboratorio para la seguridad de alimentos y piensos (/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/AnalyticalLaboratory (/Food/FoodScienceResea rch/LaboratoryMethods/AnalyticalLaboratoryMethodsforFoodandFeedSafety MethodsforFoodandFeedSafety/default.htm) /default.htm)

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