Métodos de Conteo Bacteriano

 

Métodos De Conteo Bacteriano

Jeisson Steven Hernandez Bedoya

Corporación Universitaria Minuto de Dios Ingeniería Agroecológica IV Microbiología Zipaquirá, Colombia 2016

 

Justificación

El presente documento tiene como fin realizar una investigación teórica sobre los métodos de conteo bacterianos existentes, ya que es fundamental tener conocimiento previo sobre el tema  para que al momento de su ejecución practica se posea conocimiento del que hacer, como hacerlo y analizar su resultado, esto nos permitirá reducir el margen de error de los datos arrojados en las prácticas de siembra de cultivos bacterianos, lo cual nos llevara un análisis  preciso de lo que se está investigando.

Objetivo General Dar a conocer los diferentes métodos teóricos de conteo microbiano que existen, para aplicarlo a la práctica en el laboratorio donde se estudiaran diferentes microorganismos, utilizando los métodos investigados, obtenidos de varias fuentes.

Objetivos Específicos

 

En qué casos se aplican

 

Como debe ser el procedimiento

 

Análisis e interpretación de datos







 

Marco Teórico El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el número de las células, en la cantidad de algún componente de las mismas (por ejemplo, proteína) o en el peso total de las células. Existen varios métodos de contar el número de células o de determinar la masa celular, adecuados para diferentes organismos o diferentes situaciones (Madigan, Martinko, & Parker, 2004, pág. 145)

1. Métodos Rápidos para Conteo de Microorganismos Alonso Nore & Poveda Sanches (2008) afirman que realizar un análisis microbiológico suele ser una tarea que consume gran cantidad de tiempo y trabajo, se ha presentado la necesidad de desarrollar métodos rápidos y fáciles para cuantificar y detectar microorganismos. Los métodos rápidos ofrecen la posibilidad de evitar algunos pasos; pero no siempre se dispone de estos métodos y a veces demandan altos costos. Se puede decir que un método rápido es aquel que proporciona resultados de un tiempo menor al método convencional y que además es sencillo y confiable (pp. 44-45).

1.1 Placas Petrifilm Están diseñas por una película rehidratable cubierta con nutrientes y agentes gelificantes. Proporciona resultados en tres pasos: inoculación, incubación y recuento. Están disponibles para la mayoría de las necesidades de pruebas microbiológicas incluyendo: recuento de aerobios, coliformes, E.coli, coliformes, Enterobacterias, alta sensibilidad de coliformes, rápido de coliformes, Staphylococcus aureus, mohos, levaduras y Listeria (Alonso & Poveda, 2008, p.45).

 

  Figura 1. Placa Petrifilm. Fuente: 3M Colombia

1.2 Rida®count

Es una prueba de lámina con medio de listas para usar, diseñadas para la detección cuantitativa de microorganismos en alimentos y ambientes que consiste en una película deshidratada de medios generales o selectivos en las cuales se deposita 1 ml de muestra, la cual rehidrata el medio, posee una cubierta transparente que evita la contaminación indeseada. Este  producto está

diseñado para el recuento de Mesofilos Arobios, coliformes totales,

Enterobacterias, Staphylococcus aureus, Ecoli, Salmonella, hongos y levaduras. (Corporación Chisso, 2003).

Figura 2. Rida Count Fuente: rapidmicrobiology

 

 

1.3 Medios Cromogenicos Son medios diseñados a partir de sustratos cromógenos para la identificación de diferentes microorganismos en alimentos. Estos medios están fundamentados en la actividad enzimática sobre los sustratos, los cuales al ser degradados generan una coloración especial en la colonia (Alonso Nore & Poveda Sanches , 2008, pág. 54)

Figura 3. Medios Cromogenicos Fuente: Rubilabor

2. Métodos de Conteo Directos Al Microscopio 2.1 Método de Breed Se extiende un volumen determinado de la muestra (generalmente 0.01 ml) sobre un  portaobjetos normal en una superficie conocida. Se examina en un microscopio calibrado, donde se conoce el diámetro del campo microscópico. Se cuentan las células en diversos campos. Se obtiene el valor medido de células por campo y se multiplica por el número de campos microscópicos comprendidos en la preparación. El resultado corresponde al número de células en el volumen extendido (0.01 ml). Multiplicando este valor por 100 se obtiene el número total de organismos por ml o por gramo de muestra mu estra (Olivas E. & Alarcon, 2004, pág. 30)

 

2.2 Cámara de Petroff-Hausser Es una placa de vidrio con una cuadricula en depresión donde se deposita la muestra medida. Es posible relacionar el número de células observadas en la superficie de un cuadro, con el volumen de esa área, considerando estos volúmenes se puede calcular la concentración de microorganismos por ml (Olivas E. & Alarcon, 2004, pág. 30)

Figura 4. Recuento m microscópico icroscópico directo de bacterias con una cámara Petroff-Hausser   Fuente: Introducción a la microbiología

 

  3. Contadores Electrónicos Se hace pasar un volumen conocido de la muestra con microorganismos a través de un orificio de 5 a 10 mm de diámetro, mediante manipulación con una micropipeta de mercurio. La resistencia eléctrica a través del orificio está normalizada y se altera cada vez que un microorganismo pasa a través de él. La modificación de la resistencia se amplifica y se registra electrónicamente (Olivas E. & Alarcon, 2004, pág. 30)

4. Métodos Directos 4.1 Recuentos en Placa El método utilizado con más frecuencia para la medición de poblaciones bacterianas es el recuento en placa, se basa en la suposición de que cada bacteria crece y se divide para producir una sola colonia. Esto no siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas en cadenas o como grumos. Por consiguiente, a menudo una colonia no se produce como resultado de una única bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o de un agregado bacteriano. Para reflejar esta realidad los recuentos en placa suelen informarse como unidades formadoras de colonias (UFC). Cuando se realiza el recuento en placa es importante que crezca solo un número

limitado de colonias en la placa. Cuando hay demasiadas colonias algunas células se encuentran apiñadas y no pueden desarrollarse; esta situación es causa de inexactitudes en el recuento. Para asegurar que algunos recuentos estén dentro de estos límites el inoculo original se diluye varias veces en un proceso denominado dilución seriada (fig. 5) (Tortora, Funke, & Case, 2007, pág. 178)

 

  Figura 5. Recuentos en placa y diluciones seriadas Fuente: Introducción a la microbiología

4.1.1 Diluciones Seriadas

Ejemplo, una muestra de leche contiene 10 000 bacterias por mililitro. Si se sembrara 1 ml de esta muestra se formarían en teoría 10 000 colonias sobre el medio de la placa de Petri. Obviamente, sería imposible contarlas en la placa. Si se transfiriera 1 ml de la muestra a un tubo que contuviera 9 ml de agua estéril cada mililitro del líquido resultante tendría 1 000 bacterias. Si el número de colonias potenciales todavía es excesivo, se podría realizar otra dilución seriada (Tortora, Funke, & Case, 2007, pág. 178)

4.1.2 Placa Vertida y Diseminación en Placa El recuento en placa se efectúa con el método de la placa vertida o con el método de diseminación en placa. Se inocula 1.0 ml o 0.1 ml de disoluciones de la suspensión bacteriana en una placa de Petri. El medio nutritivo, en el que el agar se mantiene líquido en un baño de agua a

 

cerca de 50°C, se vierte sobre la muestra, que luego se mezcla en el medio con una agitación suave de la placa. Cuando el agar se solidifica la placa se incuba. Con esta técnica las colonias crecerán dentro del agar nutritivo así como en la superficie del agar (Tortora, Funke, & Case, 2007, pág. 178)

Figura 6. Métodos para la preparación de placas para el recuento. (a) Método de placa vertida. (b) Método de la diseminación en placa. Fuente: Introducción a la microbiología

 

 

4.2 Filtración Cuando la cantidad de bacterias es muy baja, como en lagos y ríos con corrientes relativamente limpias, las bacterias se pueden contar con métodos de filtración. En esta técnica se hacen pasar al menos 100 ml de agua a través de un filtro consistente en una membrana delgada cuyos poros son demasiados pequeños como para permitir el paso de las bacterias entonces son tamizadas y retenidas en la superficie del filtro. Este filtro se transfiere después a una placa de Petri que contiene una almohadilla embebida en un medio nutritivo líquido, donde las colonias surgen de las bacterias presentes en la superficie del filtro. Este método se aplica con frecuencia para la detección y cuantificación de bacterias coliformes, que son indicadoras de la contaminación fecal de los alimentos o el agua (Tortora, Funke, & Case, 2007, pág. 179)

Figura 7. Recuento de bacterias por filtración. Fuente: Introducción a la microbiología

 

6. Método del Número Más Probable (NMP) Esta estimación estadística se basa en el hecho de que en cuanto mayor sea el número de  bacterias en una muestra mayor será la dilución necesaria para reducir la densidad hasta el punto en el cual no se desarrolle ninguna bacteria en los tubos de una serie de disoluciones. El método del NMP es el más útil cuando los microorganismos por contar no crecen en medios sólidos. También es útil cuando se utiliza el crecimiento en un medio líquido diferencial para identificar el microorganismo. El NMP es solo un informe de que existe un 95% de probabilidades de que la  población bacteriana disminuya dentro de ciertos límites y de que el número NMP es el numero estadísticamente más probable (Tortora, Funke, & Case, 2007, pág. 179)

Figura 7. Método del Número más Probable. Fuente: Introducción a la microbiología 

 

5. Métodos Indirectos 5.1 Conteo Turbidimetrico En una suspensión microbiana la cantidad de células está directamente relacionada con la turbiedad o densidad óptica de la misma e inversamente relacionada con la cantidad de luz que  pasa a través de ella. Esto permite determinar con bastante exactitud la cantidad de microorganismos en la suspensión mediante la determinación de la turbiedad mediante un nefelómetro o un espectrofotómetro (Olivas E. & Alarcon, 2004, pág. 30). Tortora, Funke, & Case (2007) dicen que la absorbancia se utiliza para graficar el crecimiento  bacteriano. Cuando las bacterias estan en fase logaritmica de crecimiento o de declinacion la representacion de la absorbancia frente al tiempo forma una linea recta. Para que puedan visualizarse las primeras trazas de turbidez debe haber mas de d e un millon de celulas por mililitro y se precisan de 10 a 100 millones por mililitro para que la sunpension se vuelva lo baste turbia como para ser medida en un espectrofotometro (p.182).

Figura 8. Espectrofotómetro Fuente: Wikipedia

 

  Figura 9. Turbidez (turbidimetría) (turbidimetría) Fuente: Introducción a la microbiología

5.2 Actividad Metabólica En este método supone que la cantidad de cierto producto metabólico, como el ácido o el CO2 es directamente proporcional a la cantidad de bacterias presentes. Un ejemplo de aplicación  práctica de la prueba metabólica es el ensayo microbiológico en el que se utiliza la producción de ácido para determinar la cantidad de vitaminas (Tortora, Funke, & Case, 2007, pág. 182). 5.3 Peso Seco En el caso de las bacterias filamentosas y los mohos los métodos habituales de medición son menos satisfactorios. En los recuentos en placa de d e los actinomicetos y los hon hongos gos filamentosos se cuenta el número de esporas asexuales. Esta no es una buena medida del crecimiento. Una de las mejores formas de medir el crecimiento de los organismos filamentosos es por el peso seco. En este procedimiento se extraen los hongos del medio de crecimiento, se los filtra para eliminar el material extraño y se los seca en un desecador para luego pesarlos. En el caso de las bacterias se sigue el mismo procedimiento básico (Tortora, Funke, & Case, 2007, págs. 182-183)

 

 

Conclusiones Actualmente se encuentran varios métodos de conteo para cultivos de microorganismos,  puesto que sean venido requiriendo análisis microbianos con el fin avanzar en temas como, la inocuidad de los alimentos, la salud pública, la industria y desde un tiempo para acá el manejo en agricultura. En los métodos de conteo se encuentran varias clasificaciones, según, el tipo de microorganismo, estructura, metabolismo, síntesis química, tamaños, crecimiento entre otras más y también se puede clasificar según los métodos, directos, indirectos, rápidos, rápidos,

equipos,

fluorescencia y otros. Aunque todos pueden variar en las unidades medida tienen el mismo fin de conocer la cantidad en unidades o en masa del microorganismo.

Bibliografía Alonso Nore, L. X., & Poveda Sanches , J. A. (2008). ESTUDIO COMPARATIVO EN TECNICAS DE RECUENTO RAPIDO EN EL MERCADO Y PLACAS P LACAS PETRIFILM 3M PARA EL ANALISIS DE ALIMENTOS. BOGOTA, BOGOTA D.C, COLOMBIA. CO LOMBIA. Madigan, M., Martinko, J., & Parker, J. (2004). Brock: Biologia de los Microorganismos  (10 ed.). Madrir, España: Pearson . Olivas E., E., & Alarcon, L. R. (2004). Manual de Practicas de Microbiologia Basica y  Microbiologia de Alimentos: Programa de Nutricion. Juárez, Chihuahua, Mexico: Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Olivas, E. (2004). Manual de Practicas de Microbiologia I, II y Parasitologia: Programa de  Medicina. Juárez, Chihuahua, Mexico: Universidad Autonoma de Ciudad Juárez . Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introducción a la Microbiología (9 ed.). Buenos Aires, Argentina: Panamericana.