METODOS CROMATOGRAFICOS

Professora Cláudia Sampaio de Andrade Lima Departamento de Biofísica e Radiobiologia - UFPE

Recife - 2009

INTRODUÇÃO Cromatografia é um processo físico de separação, no qual os componentes a serem separados distribuem-se em duas fases: fase estacionária e fase móvel. Em sua expressão mais simples, podemos definir a cromatografia como um processo de análise imediata por migração diferencial dos componentes de uma mistura, dentro do sistema cromatográfico. As origens da Cromatografia estão muito relacionadas com o estudo de produtos naturais e as dificuldades em relação à purificação desses compostos levaram à melhoria na performance dos processos de extração e isolamento. Para resolver problemas de análise, é indispensável a escolha da técnica cromatográfica mais apropriada, em função da natureza das substâncias a separar. Uma grande parte dos problemas de separação de compostos orgânicos são resolvidos com o conhecimento dos fenômenos de adsorção e partição, porém a cromatografia, nas suas várias versões, é um método de escolha na separação de biomoléculas. Somente na área de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) encontram-se aplicações na indústria farmacêutica, biotecnologia, investigação biomédica e bioquímica, energia, alimentação, cosméticos, meio ambiente e vitaminas. Com o crescente interesse no descobrimento de novos metabólitos de várias fontes (vegetal, de microrganismos e organismos superiores marinhos e terrestres) existe a necessidade de separação de misturas em pequenas quantidades, de maneira rápida, eficaz e econômica.

HISTÓRICO Em 1906, um botânico russo, chamado TSWETT, estudava os pigmentos dos vegetais. Ele queria filtrar uma solução de pigmento de folhas verdes em éter de petróleo, com a ajuda de um tubo de vidro cheio com carbonato de cálcio. Ele observou a formação de uma série de bandas horizontais coloridas, amarelas e verdes,

correspondentes aos diferentes constituintes da mistura, que se encontravam assim fracionados. Desta forma foi lançada a base da técnica cromatográfica. Vinte e cinco anos passaram-se até que, em 1931, KUHN e LEDERER mostram a importância da técnica de TSWETT, na separação de a e β-carotenos. Em 1941, MARTIN e SYNGE, estudando a solubilidade de aminoácidos acetilados em diferentes solventes, descobriu a cromatografia de partição, cromatografia líquido-líquido (contra-corrente). CONDSEN e CORDON foram os precursores da cromatografia de partição sobre papel, utilizando uma coluna de vidro cheia de rodelas de papel de filtro superpostas, para a separação de amino-ácidos não acetilados. Em 1938, IZMAILOW e SCHRAIBER, descreveram um método onde utilizavase camadas finas de alumina sobre placas de vidro. Onze anos depois, MEINHARD e HALL introduziram a utilização do amido, como ligante do adsorvente (alumina) distribuído sobre as placas de vidro. Mas, foi STAHL, a partir de 1958, que padronizando o método da cromatografia em camada fina, mostrou sua utilidade geral e fez com que ela adquirisse considerável importância na maioria dos laboratórios. A cromatografia em fase gasosa, utilizada na prática por JAMES e MARTIN em 1952, é uma aplicação da cromatografia de adsorção e da cromatografia de partição. É destinada a separar compostos gasosos. Esta técnica foi idealizada desde o início por MARTIN e SYNGE. Um dos últimos princípios utilizados foi o da cromatografia por troca iônica. Um trocador de íons é um composto que porta íons relativamente móveis, que podem, em presença de uma solução, serem trocados pelos íons livres da solução. Em 1856, THOMPSON colocou este fenômeno em evidência. Depois, em 1907, GANS preparou trocadores de íons artificiais. Em 1976, foi introduzido o conceito de cromatografia a média pressão para a separação de diastereoisômeros de oxazolidinas.

PRINCÍPIOS

Sistema cromatográfico é o conjunto formado pela mistura a ser analisada, pela fase fixa e pela fase móvel. A fase fixa, também chamada fase estacionária, é o meio constituído ou suportado por um sólido poroso, cuja função é reter os solutos. A fase

móvel é o solvente, neste caso chamado de eluente, que flui através da fase fixa, e tem como função deslocar os solutos. Neste sistema, a mistura de solutos é levada a migrar através da fase fixa, por meio de fluxo constante da fase móvel, sendo a diferença de velocidade de migração (migração diferencial) provocada por processo de competição pelo soluto, entre as duas fases.

Tipo de Natureza da fase cromatografia estacionária Adsorção Sílica gel

Partição Troca de íons Exclusão

Bioafinidade

Natureza dos compostos a separar

A maior parte dos compostos orgânicos simples. As moléculas contendo vários grupos polares, as substâncias com caráter eletrofílico e as substâncias com baixo peso molecular, em geral. Óxido de alumínio As vitaminas solúveis, os alcalóides, os corantes alimentares, os plastificantes, etc. As substâncias com caráter nucleófilo. Líquido imiscível com a Açucares e compostos anfotéros fase móvel (normalmente (aminoácidos) de alta polaridade)a Resinas trocadoras de Compostos cuja carga elétrica depende do íons: pH (nucleotídeos, ácidos carboxílicos, etc) Ex.: Amberlite, Dowex Gel com propriedades Grupos de substâncias com similaridade elásticas, que permitem a físico-química e pequenas diferenças no passagem de substâncias tamanho molecular. até um determinado tamanho molecular Matriz de ancoragem, Técnica exclusiva de purificação de ligada a um suporte substâncias que contém especificidade neutro molecular, a exemplo de antígenos, hormônios, vacinas, enzimas, etc.

CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO

Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido (adsorvente) fixa em sua superfície um líquido ou um gás, por meio de interações semelhantes às “forças de Van Der Waals”. Chama-se coeficiente de adsorção à relação k a =

N a  N n

onde  N a e  N n são respectivamente o número de moles adsorvidos e não adsorvidos de uma determinada substância. Compostos diferentes possuem diferentes valores de k a, estes variando com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vários componentes é forçada a passar através de um tubo contendo um adsorvente (coluna cromatográfica), cada componente necessitará de um intervalo de tempo

diferente para transpor a coluna. Esse intervalo de tempo é denominado tempo de retenção (Tr ). A Figura 2.1a ilustra um processo de Cromatografia por Adsorção . A substância mais fortemente adsorvida é mais dificilmente arrastada pela Fase Móvel.

Figura 1: Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição

CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO

Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos não miscíveis, ela se dissolverá parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a relação C 1 / C 2, onde C 1 e C 2 são as concentrações da substância em cada um dos dois líquidos. Denomina-se coeficiente de partição à relação k  p =

C 1 C 2

A separação de substâncias contidas em uma amostra através do método da Cromatografia por partição se dá através dos coeficientes de partição de cada substância.

Coeficiente de partição : é a razão das concentrações de um soluto em presença de dois solventes não miscíveis, em equilíbrio. O conhecimento do coeficiente de partição nos permite estudar o fenômeno que ocorre na cromatografia de coluna.

SUPORTES PARA CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO: Terras de diatomácea - A fase estacionária é também constituída por gotículas microscópicas, retidas nas carapaças da diatomita. O fenômeno de adsorção neste caso é bastante reduzido e trata-se de uma partição líquido-líquido típica. O solvente fixo é muito acessível pelo soluto, o que permite separar moléculas bem grandes, tais como as proteínas.

Amido de batata - O amido pode reter até 35% de água e constitui um bom suporte para uma fase estacionária. Entretanto, não possui uma grande capacidade de separação, mas o emprego de colunas grandes, permite a preparação de quantidades relativamente grandes. Os fenômenos de adsorção são de certa forma, intensos, quando as colunas são utilizadas para separar diferentes substâncias (por exemplo, misturas simples de aminoácidos), observa-se que a adsorção é praticamente o único fenômeno envolvido.

Celulose - Nas colunas por partição a celulose é bastante utilizada, sobretudo sob a forma de pós. A celulose é um suporte hidrofílico, porém , existe a possibilidade de preparação de celuloses hidrofóbicas para a cromatografia de fase inversa.

CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em termos analíticos. Este é um método de extensão da cromatografia de partição sobre colunas de celulose, idealizado por CONSDEN, GORDON e MARTIN. Podemos considerar que o papel constitui um suporte inerte, que retém uma fase estacionária aquosa. A partição é efetuada entre a fase aquosa fixa e a fase orgânica móvel A aparição de novas técnicas utilizando papéis como trocadores de íons, de celuloses hidrofóbicas, de celuloses adsorventes, transformou este método em uma técnica universal de micro-análise. Na cromatografia de papel, empregam-se quantidades de amostra na ordem de microgramas ou miligramas. A resolução depende da concentração e do diâmetro da mancha aplicada. As substâncias hidrofílicas são separadas com facilidade, enquanto as hidrofóbicas requerem tratamento especial do papel. As fases móveis devem estar saturadas com água. Utilizam-se cubas vedadas e de preferência com saturação do solvente antes do início da separação cromatográfica. O desenvolvimento pode ser ascendente, descendente, circular ou horizontal.

Fase móvel - A fase móvel em cromatografia sobre papel é variável e possui maior efeito nas separações dos componentes de uma mistura. Considerando um par de líquidos, o menos polar funciona como fase móvel e o mais polar, como fase estacionária.

CROMATOGRAFIA CIRCULAR

O papel é recortado em forma de um círculo. No centro deste é feito um pequeno orifício. As substâncias são colocadas sobre uma circunferência em torno do centro. O círculo de papel é então colocado em uma cuba circular, o solvente é derramado a partir da parte inferior da cuba e conduzido por capilaridade até a porção central do papel. As substâncias se apresentam ao final da migração como arcos em torno do centro.

OS PAPÉIS PARA CROMATOGRAFIA . Papéis simples - Os primeiros ensaios foram conduzidos sobre papéis de filtro comuns. Porém a sua qualidade era inadequada, levando à necessidade de preparação de papéis especiais, que conduzissem a resultados reproduzíveis, sendo necessário uma certa regularização na sua fabricação e os papéis deviam apresentar um certo grau de pureza. Atualmente, os diferentes papéis se destacam pela sua eficiência, sua durabilidade e pelo seu grau de pureza.

Papéis especiais - São papéis com propriedades adsorventes. Eles foram criados para adaptar as vantagens da cromatografia de papel à cromatografia de adsorção. Para tal, fixa-se sobre o papel (entre as fibras de celulose) uma substância dotada de propriedades adsorventes, principalmente a alumina e a sílica.

REVELAÇÃO Quando está terminada a migração do solvente, é conveniente que o cromatograma seja submetido a um tratamento, de forma a colocar em evidência as substâncias separadas. A revelação não apenas torna visíveis as substâncias incolores, mas também facilita a identificação destas substâncias. Isto é possível pela pulverização de reativos específicos ou de procedimentos físicos convenientes.

CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA OU CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Podemos subdividir a CCD em três gupos: a)Análise qualitativa, que permite determinar o número dos constituintes de uma mistura desconhecida e qual a fase móvel e estacionária, ideais para a separação cromatográfica. b) Análise preparativa, que permite, após separação de pequenas quantidades de substâncias para estudos químicos ou físico-químicos, purificação de pequenas quantidades dos constituintes. c) Análise quantitativa, que consiste em determinar as proporções exatas de cada um dos constituintes da mistura.

TÉCNICA: Um adsorvente, selecionado de acordo com as características da amostra, é disposto sob a forma de uma camada fina sobre uma placa de vidro. Após ativação pelo calor, seguida do depósito das substâncias a analisar. A placa é colocada em uma cuba fechada contendo o solvente. Terminada a migração, os resultados serão observados utilizando diferentes métodos de revelação. A Figura 2. ilustra o processo. O líquido ascende (por capilaridade ) e arrasta seletivamente os componentes de uma mistura binária (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicação). Quando o solvente se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta é removida da cuba que contém o solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posição vertical e a um nível abaixo do ponto de aplicação. As razões de frente, Rf A = d1  / d3 e Rf B = d2 / d3 são características de cada substância, dependendo da natureza da fase móvel e da fase estacionária. A Cromatografia em Camada Delgada é a mais empregada em Análise qualitativa ou semi-quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra utilizada, é menos indicada para fins preparativos. quando é necessário se obter uma quantidade maior das substâncias puras, emprega-se a cromatografia em coluna.

Fig. 2 - Cromatografia em Camada Delgada. Neste exemplo, a amostra contém dois componentes, A e B, que são identificados pelos respectivos valores de R f 

CÁLCULO DO R f : Se a amostra é uma mistura, cada constituinte possuindo um coeficiente de adsorção próprio e uma afinidade própria, quando arrastado pelo solvente, progride com uma velocidade que lhe é característica, sendo simbolizada por seu Rf . Este é expresso pela relação : distância percorrida por uma molécula Rf  = ---------------------------------------------------distância percorrida pelo front do solvente Substituímos também esta expressão, pela expressão mais reprodutível : distância percorrida por uma molécula de referência Rf  = --------------------------------------------------------------distância percorrida por uma molécula X

VANTAGENS - Optimização fácil e rápida - Duração curta de desenvolvimento da placa - O adsorvente pode suportar a ação enérgica do revelador - Separações mais claras - Utilização de quantidades muito pequenas - Vasto domínio de aplicação

DESVANTAGEM - Difícil reprodutibilidade do Rf 

CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA CENTRÍFUGA

A técnica de cromatografia em camada fina centrífuga foi desenvolvida para resolver alguns problemas da cromatografia preparativa em camada fina, nas quais o tempo de migração e a remoção das bandas das substâncias não é fácil ou eficiente. Esta técnica baseia-se na ação da força centrífuga para acelerar o fluxo da fase móvel através de uma placa circular. Caronna (1955) introduziu a cromatografia centrífuga, que é um método em que um rotor formado por duas placas circulares sustentavam uma folha de papel cromatográfico, também circular. Após varias tentativas de optimização do método, Heftmann et al. (1972) conseguiram separações mais eficientes. Eles utilizaram uma mistura de purinas, cafeína, teobromina, teofilina e xantina que puderam ser rapidamente em sílica gel, em quantidades de 5 mg. Mesmo com o desenvolvimento de outros protótipos de cromatografia centrífuga (Hostettmann, 1988), esta técnica não alcançou grande sucesso, até o lançamento de aparelhos chamados cromatotrons. O cromatotron (figura 5) possui um rotor inclinado, ao contrário, ao contrário dos seus antecessores que possuíam um rotor plano. O coração do aparelho é uma placa de cristal circular de 24cm de diâmetro, que é coberta com o adsorvente adequado, a fim de proporcionar uma camada delgada para as separações preparativas.

A placa preparativa é colocada no centro de um motor elétrico e colocada para girar a 800 rpm. O eluente é introduzido no centro da placa (que não contém adsorvente), por uma bomba a pistão capaz de proporcionar um fluxo de 1 – 10 mL/min, que vai atravessar a camada delgada por força centrífuga. A amostra é então inserida e adiciona-se o eluente, mantendo-se um fluxo isocrático ou introduzindo um gradiente de concentração até a purificação dos constituintes da amostra, a um fluxo de 3 – 6 mL/min. Observa-se a formação de bandas concêntricas e as substâncias são então separadas e coletadas na periferia, através de um tubo de saída. As frações obtidas podem ser analisadas através de CCD.

OS REVELADORES

São substâncias capazes de complexar alguns compostos incolores em placas cromatográficas. Esta complexação pode ocorrer de forma inespecífica ou específica. É importante que as placas sejam borrifadas uniformemente para que haja uma perfeita visualização dos compostos a serem revelados. A visualização pode ser efetuada inclusive através de métodos físicos, o que permite a revelação de alguns compostos sem alterar a sua estrutura química. É o caso da exposição das placas à luz ultravioleta ou a vapores de iodo. Muitos são os agentes cromogênicos empregados tanto na cromatografia de papel como na cromatografia em camada fina, sendo que em geral são bem mais sensíveis na segunda. Uma das vantagens da CCD sobre o papel é permitir a utilização de reveladores enérgicos ou que necessitem aquecimento posterior à borrifação. Em geral os métodos químicos de revelação são destrutivos e utilizados apenas em separações analíticas. A seguir apresentamos um quadro com alguns exemplos de reveladores utilizados na cromatografia em camada fina analítica.

Exemplos de Reveladores Químicos:

Classes de compostos

Reveladores

Aminoácidos

Ninhidrina

Fenóis em geral

FeCl3

Taninos

FeCl3

Alcalóides

Reativo de Dragendorff  Reativo de Mayer Reativo de Hagen

Esteróides

H2SO4

Triterpenóides

H2SO4

Flavonóides

Reativo de Neu

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

A cromatografia em coluna aberta convencional, é universalmente etuilizada pela sua simplicidade de operação. Neste tipo de processo, a fase estacionária é colocada em um tubo de vidro (coluna cromatográfica) colocado na posição vertical. A coluna é dotada de uma torneira na extremidade inferior (Fig. 3), que é utilizada para controlar a vazão da fase móvel, que desce por gravidade.

Figura 3- Cromatografia em coluna O ponto A’ indica o nível da fase estacionária e o ponto A indica o nível da fase móvel. A diferença A’ - A deve ser o menor possível, para evitar a diluição do material a ser cromatografado, o que resultaria em zonas (na Fig. 2.3, as faixas 1, 2 e 3) mais largas.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA SOB PRESSÃO (FLASH)

A expressão cromatografia líquida sob pressão refere-se a qualquer tipo método que envolva aplicação de pressão em uma coluna cromatográfica, como forma de se distinguir das separações cromatográficas por gravidade. Como resultado, podemse incluir todas as categorias desde cromatografia líquida “flash” (2 bar) até a CLAE preparativa (100 bar), e as quantidades de amostras de µg até Kg. A diferença entre a cromatografia preparativa e a analítica é que, enquanto a última (empregada para separação, identificação e determinação) não se preocupa com a recuperação da amostra, a cromatografia preparativa é uma processo de purificação e permite o isolamento de substâncias puras contidas em uma mistura. O termo preparativa refere-se a qualquer tipo de separação que não seja para fins analíticos. A quantidade de material puro requerido depende da finalidade para o qual será empregado:

•

Quantidades entre µg a mg para identificação espectroscópica, como o isolamento de produtos naturais;

•

Quantidades em mg para identificação posterior, reações químicas e ensaios biológicos;

•

Quantidades em g para ensaios biológicos posteriores, trabalhos de síntese e semi-síntese e isolamento de produtos de referência.

A figura 4 representa os limites de aplicação aproximados dos diferentes métodos.

CLAE analítica CLAE preparativa CL baixa pressão CL “flash” CL média pressão + µg

1 mg

+ 10 mg

+ 100mg

+ 1g

Quantidades de material a separar Figura 4 – Divisão aproximada dos métodos de cromatografia líquida sob pressão, de acordo com a escala preparativa requerida.

OUTROS EXEMPLOS DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS: CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO

A cromatografia por exclusão, também conhecida como filtração gel, permeação em gel e peneira molecular, é um método que promove uma seletiva e dinâmica distribuição das moléculas do soluto entre duas fases líquidas separadas, e dependentes de uma estrutura estacionária, contendo poros de tamanho controlado.

Fase estacionária O termo gel, refere-se a um material elástico que contém água. Este possui uma estrutura tridimensional, cuja estabilidade mecânica é dada pelo material contendo espaços (poros) que contém líquido. Partículas pequenas dão melhor resolução e eficiência. O aumento do tamanho das partículas resulta em espalhamento da zona nos interior dos poros. O gel quimicamente definido, deve permitir variações para o fracionamento em diferentes intervalos de massa molecular.

TIPOS DE GÉIS Géis de dextrano (SEPHADEX) - É um tipo de polissacarídeo com unidades de glicose, obtido por fermentação de sacarose. Os diferentes tipos são caracterizados por ligações cruzadas entre as cadeias polissacarídicas que quando entram em contato com a água, incham e produzem um gel com estrutura tridimensional..

Géis de poliacrilamida (BIO-GEL) - O polímero de poliacrilamida é constituído a partir de ligações cruzadas entre as cadeias de moléculas de acrilamida (H2C=CH-CO-

NH2). As matrizes do bio-gel se assemelham àquelas do sephadex, como os intervalos de fracionamento e as propriedades de resistência à pressão, para os géis que apresentam o mesmo grau de absorção de água.

Géis de ágar e agarose - As propriedades cromatográficas do ágar fazem com que estes géis sejam compmplementares aos géis de sephadex e poliacrilamida. O ágar é obtido de algas e se constitui de polissacarídeos lineares de lactose e dioxi-L-galactose. Considera-se que o tamanho dos poros e a estabilidade dos géis de ágar sejam conseqüência da formação de microcristais.

Tamanho da amostra Para uma boa resolução, a zona em que está a amostra deve ser pequena em relação ao comprimento da coluna (1 a 5% do tamanho da coluna) e possuir uma baixa viscosidade, para não ocasionar uma vazão irregular entre as zonas do gel.

FASE MÓVEL O sucesso do processo cromatográfico, depende, entre outras coisas, do comportamento dos solutos e das características destes e da fase móvel dentro da coluna. Durante uma separação cromatográfica, a concentração das substâncias separadas, pode ser determinada no líquido por diferentes métodos. Pela retenção do soluto na fase estacionária, cada zona se movimenta com uma velocidadde característica . O eluente deve apresentar uma relação de viscosidades em relação ao soluto de até duas vezes. As soluções tampão são normalmente os eluentes de escolha pra cromatografia por exclusão.

APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO GEL Este método permite estudar particularmente, os pesos moleculares de proteínas, em condições variadas de pH, temperatura e força iônica. Outros usos compreendem a determinação da massa molecular de polímeros naturais e sintéticos, possibilidade esta que atualmente é primordial para o controle de qualidade destes compostos.

CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA

A cromatografia de troca iônica, que geralmente é chamada de cromatografia iônica, refere-se a métodos modernos e eficientes de separação e determinação de íons com base em resinas trocadoras de íons. A cromatografia iônica foi desenvolvida em meados dos anos 1970, quando foi mostrado que misturas de cátion e ânion podem ser facilmente resolvidas em colunas cromatográficas. A cromatografia iônica foi conseqüência de troca iônica, desenvolvida durante o projeto Manhattan para a separação de cátions de terras raras de propriedades semelhantes entre si, com resinas trocadoras de cátions. Esse trabalho monumental, que forneceu a base teórica das separações de troca iônica, após a Segunda guerra Mundial, foi estendido para muitos outros tipos de materiais. Em ultima analise, levou aos métodos automáticos para separação e detecção de aminoácidos e outras espécies iônicas em misturas complexas.

APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA: •

Purificação de proteínas

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Purificação de antibióticos (caldos . de fermentação)

•

CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE

É um tipo de cromatografia que baseia-se nas propriedades biológicas das macromoléculas biológicas e permite o isolamento seletivo destas, através da utilização das propriedades dessas substâncias de unirem-se reversivelmente a ligantes específicos que se encontram imobilizados covalentemente à matriz ou suporte. A eluição das moléculas ligadas pode ser feita por al;teração do pH e/ou força iônica do meio, que tornam o complexo molécula-ligante menos estável, levando à dissociação do mesmo, o que conduz à sua purificação. O método da cromatografia de bioafinidade assemelha-se ao tipo de ligações que ocorrem entre os antígenos e os anticorpos.

Fase Estacionária- É de extrema importância a escolha das matrizes de ancoragem, utilizadas na cromatografia de bioafinidade. Estas matrizes devem apresentar estabilidades mecânica e química nas condições de acoplamento. Devem ser uniformes, esféricas, rígidas e porosas, e que permitam boas condições de vazão, mesmo após o acoplamento. As substâncias comumente usadas como matrizes são a agarose, o dextrano, a poliacrilamida e outros polímeros, partículas porosas de alumina, vidro de porosidade controlada e algumas associações destes.

Acoplamento do ligante à matriz - O acoplamento de ligantes específicos pode ser realizado diretamente na matriz ativada ou em grupos funcionais disponíveis. A eficiência do processo de acoplamento, geralmente aumenta com a concentração do ligante. Estas reações ocorrem normalmente em meio levemente alcalino (pH 8 - 9), utilizando-se tampões borato ou bicarbonato.

MÉTODOS DE ELUICÃO A eluição do material ligado à fese estacionária é realizada tanto com agentes específicos como com agentes não específicos. A utilização de agentes de eluição específicos é baseada na ligação preferencial dessa substância com o agente específico ao invés da fase estacionária. Geralmente os agentes de eluição específicos possuem estrutura química semelhante ao ligante da fase estacionária. Na utilização de agentes de eluição não específicos há a formação de complexos entre a substância alvo com o ligante específico, o que envolve ligações fracas como interações eletrostáticas e hidrofóbicas, ou pontes de hidrogênio isoladas ou em conjunto, onde a variação do pH e/ou força iônica do tampão são os recursos utilizados para provocar alterações no complexo formado ou modificam e estrutura química deste.

APLICAÇÕES A cromatografia de bioafinidade é aplicada para a purificação de enzimas como a catalase e a celulase, antibióticos, antíigenos, ácidos nucléicos, drogas ou receptores hormonais, e pequenas moléculas como peptídeos sintéticos e naturais.