Metodo Horizontal para La Deteccion de Las Salmonela SPP

 

METODO HORIZONTAL PARA LA DETECCION DE LAS LAS SALMONELA SPP ISO 6579:2002 Cor. 1:2004 (E)

1.  OBJETIVO Determinar la presencia de salmonella spp. en un alimento. 2.  ALCANCE Esta técnica aplica para los siguientes productos: Productos cárnicos

(crudo, cocido, madurado) ; Aves ( crudo , cosido ) ; pescados y productos alimenticios marinos (crudos, cocidos ); productos de frutas frutas y a base de vegetales ( crudos) productos lácteos (crudos, congelados , secos , procesados ); productos de chocolate y panadería ; misceláneos(salsa, huevos y derivados , enriquecidos, precocidos , deshidratados ).

3.  DEFINISIONES Y ABREVIATURAS

Salmonella: El género salmonella pertenece a la tribu salmonelleae de la familia Enterobacteriaceae. Los microorganismos del genero salmonella son bacilos Gramnegativos, no esporuladas, móviles (excepto S.Gallinarum y S.pollorum) mesolíticos, anaeróbicos facultativos, están distribuidos ampl ampliamente iamente en la naturaleza, se encuentran en el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, en humanos puede haber un estado de portador asintomático. En la taxonomía actual el género salmonella salmonella se clasifi clasifica ca utilizando antígenos somáticos (AgO), antígenos flagelares (Ag H) y antígenos capsulares (Ag K), en dos especies: salmonella entérica y salmonella bongori La especie salmonella entérica comprende 6 subespecies: Salmonella entérica subespecie entérica (I); Salmonella entérica subespecie salamae (II); Salmonella entérica subespecie arizonae (IIIa); Salmonella entérica subespecie diarizonae (IIIb); Salmonella entérica subespecie houtenae (IV); Salmonella entérica subespecie indica ( VI). La puerta de entrada en humanos y en animales es la vía oral, a través del consumo de alimentos contaminados con excretas y orina o por contaminación de los alimentos debido a malas prácticas higiénicas de manipuladores que son portadores asintomáticos, por contaminación cruzada de productos crudos a cocidos o por deficiencias en buenas prácticas de manufacturas. Las infecciones por salmonella son de distribuciones mundial, la tasa de prevalencia de la infección es mayor en lactantes y en e n niños de corta edad. El periodo de incubación es de 12 a 36 horas manifestando síntomas como nauseas, dolor abdominal, somnolencia, diarrea, fiebre, septicemia - 

 

  ATCC = Aype culture collection 4.  REFERENCIAS

ISO 6579:2002 Cor.1:2014 (E)-Método horizontal para la detección de salmonella spp ISO 6887-1 Microbiología de alimentos y piensos animales- preparación de muestras para análisis, suspensión inicial y suspensiones decimales para el e l examen microbiológico ISO 6887-4:2003 (E). Microbiología de alimentos y piensos animales- preparación de muestras para análisis, suspensión inicial y suspensiones decimales para el examen microbiológico. Par. 4. Normas específicas para la preparación de productos leche y productos lácteos, carne y productos cárnicos y pescado y productos de la pesca 5.  RESPONSABILIDADES Sera responsabilidad del profesional asignado, según cronograma de análisis de muestras, Verificar que este procedimiento se lleve a cabo según esta consignado en este documento 6.  CONDICIONES PREVIAS

6.1 Toma y almacenamiento adecuado de la muestra. 6.2 Preparación y esterilización del material y medios de cultivos requeridos en el procedimiento 7.  PROCEDIMIENTO

7.1 MARERIALES Y EQUIPOS -Incubadora 37° C ± 1°C -Incubadora a 41,5 °C ± 1°C. -Refrigerador a 4 ± 2°C. -Cabina de flujo laminar -Homogeneizador -Balanza de capacidad inferior a 2.500 g de sensibilidad 0.1 g -Cajas de Petri estériles de tamaño pequeño (diámetro 90 mm a 100 mm) -Pipetas graduadas de capacidad nominal 10 y 1 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,5 ml a 0,1 ml -Gradillas -Pipeteador -Tubos tapa rosca estériles -Frascos estériles con capacidad de 500 ml -Bolsas de plásticos estériles -Asas de inoculación

 

-Instrumentos para preparar las muestras: -Cuchillos, tenedores, pinzas. Tijeras, cucharas, espátulas, morteros con sus respectivos pistilos estériles. 7.2 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS - Agua de peptona tamponada - Agua de peptona tamponada de doble concentración - Agua de peptona tamponada con Skin Milk y verde brillante - Caldo Rappaport-Vassiliadis con soya (caldo RVS) - Caldo Muller – Kauffmann Tetractionato con novobiocina (MKTn) - Agar Xilosa lisina desoxicolato (agar XLD) - Agar Hektoen - Agar TSAYE - Agar Sulfito Bismuto según Wilson Blair - Agar verde Brillante lactosa – sacarosa, con novobiosina (BPLS) Medios para identificación Bioquímica - Agar hierro triple azúcar (agar TSI) - Agar lisina  – hierro descarboxilasa -Agar UREA -Agar Citrato de Simmons -Agar Motilidad GI -Caldo Glucosa -Caldo de lactosa -Caldo sacarosa -Caldo Dulcitol -Caldo Sorbitol -Caldo Xilosa -Caldo Arabinosa -Caldo malonato -Caldo L-Lisina -Caldo L- Arginina

 

-Caldo L- Ornitina - Caldo Indol Otros:

-  Kit comercial para identificación Bioquímica de bacterias entéricas 

7.3 PATRONES Y MATERIALES DE REFERENCIA: Cepas de referencia: -E.coli ATCC 25922 -Salmonella Typhimurium ATCC 14028

7.4 CONDICIONES AMBIENTALES La muestra se debe analizar en cuarto de siembra y cabina de bioseguridad

7.5 PREPARACION DE LA MUESTRA Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado

7.6 DESTRICION DEL PROSEDIMIENTO La detección de salmonella spp incluye 4 etapas: I. Enriquecimiento no selectivo II.

Enriquecimiento selectivo

III. Siembra en placa en medios de de agar selectivo y diferencial. IV. Identificación. I.Pre-enriquesimiento en medio liquido No selectivo

1.

Pesar en la bolsa para homogenización de muestras previamente tarada 25 g representativos de la muestra total (tomando de la superficie como de su inferior)

2.

Adicionar en caso generar 225 ml de agua peptona da tamponada a temperatura ambiental (medio de pre enriquecimiento no selectivo)

NOTA: Para cierto comestible es necesario el uso de otros procedimientos de preenriquecimiento. (Ver. Preparaciones Específicas)

 

  3.

Homogenizar de 1 a 3 minutos 4.  Incubadora a 37°C ± 1° C por por 18 ± 2h

Preparaciones específicas específicas de la suspensión inicial para ciertos alimentos

Cacao y producto que contienen cacao cac ao (ej. Más del 20%) Añadir a 225 ml de agua peptonada tamponada 22,5 g de Skin Mil estéril y después de 2 Horas de incubación agregar, 0,004 g de verde brillante, pues es probable, que el producto Alimenticio este muy contaminado con flora Gram-positiva. Precalentar el diluyente a 40° C Pesar y agregar la muestra al diluyente. diluyente. Mesclar inmediatamente a mano.

Dejar la mescla a temperatura tem peratura ambiente por 20 minutos a 30 minutos hasta que se licue. Mesclar usando el homogeneizador.

Producto alimenticio Ácidos y acidulantes. Emplear agua peptonada tamponada doble concentración para mayor estabilidad del pH en Los productos alimenticios ácidos y acidificantes.

 AVEZ ISO 6887-1: Agregar 500 5 00 ml de agua peptonada tamponada por 30 segundos para hacer el Lavado, sacar el diluyente y colocarlo en bolsa estéril. e stéril.

II. En requisamiento Selectivo 1. Trasferir 0,1 ml del cultivo obtenido en el pre- enriquecimiento a un tubo que contenga 10 ml de caldo RVS Incubar a 41,5° C± 1°C POR 24 h ±3h

Trasferir 1 ml del cultivo obtenido en el pre- enriquecimiento a un tubo que contenga 10 ml de caldo MKTTn

 

Mesclar con vortex Incubar a 37°C± 1° Cpor 24 h ±h

III.Siembra en placa con medios selectivos y diferenciales: Se deben utilizar mínimo dos medios selectivos por cada c ada caldo de enriquecimiento no Selectivo y selectivo, para el aislamiento del microorganismo. El primer primer medio de cultivo Recomendado debe ser agar XLD, y el segundo medio puede ser escogido por el laboratorio, Como: Agar Hektoen, Agar Sulfito Bismuto y Agar Vede brillante brillante lactosa sacarosa con Novobiocina. 1. Aislar por agotamiento el cultivo obtenido en caldo RVS utilizando dos placas pequeñas (90 mm a 100 mm) de XLD.Use la mis misma ma asado para sembrar las dos cajas una después de la otra, de modo que se obtengan las colonias bien aisladas. Repetir el procedimiento con Hektoen (segundo medio selectivo)

2. Aislar por agotamiento el cultivo obtenido en el caldo MKTTn y repetir el procedimiento descrito en el punto 1, con los dos medios selectivo en placas (XLD y Hekten)

3. Incubar a 37°C±1° C: XLD24 ±3n Hektoen 18 – 24 n

4. Después de la incubación, examinar las placas para ver la presencia de colonias típicas y atípicas de salmonella (ver nota). Marcar la posición posición en el fondo de la placa.

NOTA: Las colonias típicas de salmonella crecen en agar XLD con el centro negro y unas Zona ligeramente trasparente de color rojizo debido al cambio de color del indicador.

 

  Las colonias atípicas de salmonellas (lactosa  – positivas) crecen en agar XLD amarillas con 0 sin ennegrecimiento.

5. selección de colonias para confirmación Para la confirmación, se toma de cada placa, de cada medio selectivo por los menos una Colonia que sea considerada típica o sospechosa y cuatro colonias más, si las primeras son Negativas. Sembrar las colonias aisladas y purificadas en placas de agar TSAYE.

6. Incubar las placas inoculadas a 37°C±1°C por 24 n ±3 n

7. proceder a su identificación. Utilizando cepas puras para la confirmación bioquímico.

IV. Identificación de salmonella spp. La identificación de cultivos sospechosos de pertenecer al género salmonella spp incluye las Siguientes etapas: -  Prueba de Screening para colonias sospechosas

  Reacción en agar TSI   Reacción en agar LIA   Reacción en agar Urea







-  Si se obtienen los resultados correspondientes a las reacciones de salmonella spp. se Continua la identificación mediante pruebas bioquímicas. Puede utilizarse también kits comerciales. Se recomienda el uso de aquellos que hayan sido aprobados y validados por AOAC u otros organismos internacional reconocido que garantice la validez de los resultados. Usar los kits de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. -La identificación definitiva de salmonella, como perteneciente a un determinado Serotipo, requiere el envió de las cepas al laboratorio de Microbiología de Alimentos del INVIMA para que sea ser tipificada. 7.7 VERIFICACIONES 7.7.1 ASEGURAMIENTO DE CALIDAD DEL METODO

 

Para comprobar la capacidad del laboratorio de detectar salmonellas con los métodos y los medios distritos en este Estándar Estándar internacional, intr introducir oducir las muestras de referencia en los frascos del del control del medio de de pre enriquecimiento. Proceder con el frasco del control, igual que con los cultivos de prueba. 7.7.2 CRITERIOS DE ACEPTACION O RECHAZO Verificar el crecimiento en el control (±) observando que el crecimiento sea adecuado y las colonias características. El control (-) no debe presentar crecimiento. Las colonias no deben poder diferenciarse claramente si los medios utilizados son selectivos. La prueba de esterilidad de los medios utilizados, no debe presentarse crecimiento de ningún tipo. 7.8 EXPRESION DE RESULTADOS De acuerdo con la interpretación interpretac ión de los resultados, indicar la presencia de salmonellas x g o ml, como positivo o negativo.

8. ANEXOS Flujograma

Anexo 1 Medios de cultivos Anexo 2

 

 

 

 

ANEXO 2

MEDIOS DE CULTIVOS

1. AGUA DE PENTONA PENTONA TAMPONADA Peptona Cloruro de sodio Hidrogeno ortofosfato ortofosfato disodico (Na2HPO4) Dihigrogeno ortofosfato potámico (K H2PO4)

Preparación Disolver los ingredientes por calentamiento. Ajusta el pH final a 7,0 ± 0,2.Distribuir en frascos de 225 mL y esterilizar ester ilizar en autoclave a 121° C durante 15 minutos.

2. AGUA DE PEPTONA TAMPONADA CON SKIN MILK Y VERDE BRILLANTE Agua de peptona Tamponada

225 ml

Skin Milk

22,5g

Verde brillante

0,004g

Preparación Disolver 22,5 g de Skin Milk en 22,5 mL de agua destilada, esterilizar a 110 °C durante 12 Minutos. Añadir a 225 mL de agua de peptona Tamponada el Skin Milk en el momento de Su uso.

Preparar verde brillante, 0,004 g por ml de aguas aguas destilada estéril. Agregar 1 ml después de 2 Horas de incubación, si es probable, que el producto alimenticio este muy m uy contaminado con Flora Gram-positiva.

 

3. AGUA DE PEPTONA TAMPONADA DOBLE CONSENTRACION Peptona

20,0g

Cloruro de sodio

10,0g

Hidrogeno ortofosfato disodico (Na2HP04)

18,0g

Dihigrogeno ortofosfato potásico (K H2P04)

3,0g

4. CALDO RAPPAPORT VASSILIADIS SOJA (RVS) Formula

g/ litros

Peptona de soja

4,2

Cloruro sódico

7,2

Tampón fosfato (KH2PO4 + K2HPO4)

1,44

Cloruros magnésicos 6 H20

28,6

Oxalato de verde malaquita

0,036

PH 5,2

5. CALDO MULLER  – KAUFFMANN (MKTTN-T) Formula

g / litro

Digerido enzimático de extracto de carne (bovino o porcino)

4,23

Digerido enzimático de caseína (bovino)

8,45

Cloruro sódico

2,54

Carbonato cálcico

38

Hiposulfato sódico anhidro Sales biliares (ovino o bovino ) Lodo Lodurode potasio Verde brillante Noviovisina