Metodo de Determinacion de Actividad de Coagulacion de La Leche v 3

ME- M- D001 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE EN LECHE

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1. OBJETO Este método determina de forma visual y cuantitativa el tiempo de coagulación de la leche al comparar una muestra con un estándar microbiológico de actividad conocida. 2. DEFINICONES 2.1Coagulación: Proceso por el cual una sustancia pierde su liquidez, tornándose similar a un gel en primera instancia y luego sólida, sin experimentar un verdadero cambio de estado, mediante la intervención de proteínas específicas. 2.2 IMCU: unidades internacionales de coagulación de leche por gramo o mililitro. 3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Solución Stock de Cloruro de Calcio 500g/L ó 50 g/L 3.2 Solución de acido acético 1M. 3.3 Acetato de Sodio trihidratado. 3.4 Agua desmineralizada. 3.5 Estándar de Microorganismo o agente coagulante. 3.6 Leche desgrasada, sin calorías en polvo y estéril. 3.7 Pipetas volumétricas de 3ml y 0.5ml. 3.8 Beacker de 1000ml y 50ml. 3.9 Balón aforado de 2000ml, 1000ml y 50 ml. 3.10 Termómetro. 3.11 Cronómetro. 3.12 Estufa agitadora. 3.13 Baño de maría. 3.14 Balanza analítica. 4. DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO 4.1 Preparación de solución buffer pH 5.5 3.1.1 Tomar un balón aforado de 1000ml y pipetear 10 ml de acido acético 1M, posteriormente agregar 10 g de acetato de sodio trihidratado. 3.1.2 Aforar hasta la marca con agua desmineralizada. El pH de esta solución debe de ser 5.5.Esta solución deberá ser almacenada en un envase cerrado protegido de la luz directa y humedad bajo una temperatura de 15-25ºC. 4.2 Preparación de Solución de trabajo de Cloruro de Calcio 4.2.1 Pesar 2.70g de solución stock de cloruro de calcio de concentración 500g/L y agregarlo a un balón aforado de 2000ml y aforar con agua desmineralizada. La concentración final de esta solución deberá ser de 0.5g/L (esta solución debe ser preparada en fresco, es decir el día que será utilizada y podrá ser almacenada a 2º-18º C). 4.2.3 Si parte de una solución Stock de cloruro de calcio de concentración 50g/L, medir 10 mL en un balón aforado de 1000ml y aforar con agua desmineralizada. La concentración final de esta solución será de 0.5g/L (esta solución debe ser preparada en fresco, es decir el día que será utilizada y podrá ser almacenada 2º-18º C).

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4.3 Preparación de solución sustrato: 4.3.1 Pesar 110g de leche en polvo libre de grasa, calorías y estéril. 4.3.2 Disolverlo en 100ml de solución de trabajo de cloruro de calcio en un balón aforado de 1000ml. 4.3.3 Agregar 900ml de cloruro de calcio. 4.3.4 Agitar con agitador magnético por 30min evitando la producción de espuma. Posteriormente incubar a temperatura ambiente en cuarto oscuro por 30 minutos. 4.4 Preparación del Microorganismo Estándar: 4.4.1 Pesar 2.5g del estándar del microorganismo y diluirlo en 15 ml de solución buffer en un balón aforado de 50ml. 4.4.2 Posteriormente aforar el balón con solución buffer. 4.4.3 Pipetear 3ml de la solución anterior a otro balón aforado de 50ml y aforar nuevamente con solución buffer. 4.5 Preparación de la muestra a evaluar: 4.5.1 Servir 3ml (presentación liquida) o pesar de 3-5g (presentación solida). 4.5.2 Posteriormente aforar el balón con solución buffer. 4.5.3 Pipetear 3ml de la solución anterior a otro balón aforado de 50ml y aforar nuevamente con solución buffer. 4.5.4 Diluir la muestra con solución buffer hasta lograr obtener un tiempo de coagulación de la muestra similar al tiempo de coagulación de el microorganismo estándar (la diferencia de aparición de floculo entre el estándar y la muestra no deberá sobre pasar de ±40 segundos. Si ese fuera el caso se deberán realizar varios ensayos alterando la cantidad de volúmenes a analizar. 4.6 Determinación de actividad de coagulación o formación del cuajo: 4.6.1 Pipetear 25 ml del sustrato y calentarlo por 12minutos en baño de maría a 32ºc agitando sin producir espuma. 4.6.2 Agregar rápidamente 0.5ml de la solución estándar del microorganismo. Activar el cronometro al mismo tiempo sin dejar de agitar. 4.6.3 Observar la muestra y leer en el cronometro el tiempo exacto en el que es observado el primer floculo en el sustrato y anotarlo. 4.6.4 Realizar este procedimiento por duplicado. 4.6.5 Repetir este procedimiento sustituyendo los 0.5ml de la solución estándar por 0.5ml de la muestra problema. 4.6.6 Realizar este procedimiento por duplicado. (Si la muestra presenta diferencia en ±40 segundos, repetir el procedimiento aumentando o disminuyendo los volúmenes; puede emplearse 10ml del sustrato y 0.2 ml de solución estándar del microorganismo o 50ml del sustrato y 1.0ml de la solución

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estándar del microorganismo, sin embargo es necesario mantener siempre el radio de dilución de 50:1). 4.7 Realización de cálculos: Los cálculos de la actividad de coagulación o cuajado de leche, serán determinados mediante la siguiente formula: At= Tst* 0.003* D*Ar Tmx

Donde: At= actividad total de la muestra en IMCU/g ó mL. Tst= tiempo en segundos de aparición del floculo empleando el estándar 0.003= Constante de la ecuación derivada de una simplificación de la formula. D= dilución empleada en la muestra problema.** Ar=potencia del estándar del microorganismo empleado (IMCU/g o ml). Tmx= tiempo en segundos de aparición del floculo empleando la muestra problema. **Cálculo de Dilución de la muestra si se pesan 2.5 g: 50 x 50 = 333.33 2.5g 3ml 4.8 Reporte de resultados: Reportar resultados en RE-M-008 (Registro de análisis microbiológicos), en unidades internacionales de coagulación de leche por gramo (IMCU/g.) 5. DOCUMENTOS DE REFERENCIA 5.1 ISO 15174:2002 (E) 5.2 IDF 176: 2002 (E) 5.3 REM 008 Registro de análisis microbiológico. 5.4 Procedimiento para la elaboración y control de documentos escritos (PR-A-001).

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