Metodo de Bandeo Cromosomico

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Universidad Particular de Chiclayo Facultad de Medicina Escuela Profesional de Medicina Humana

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Métodos de bandeo cromosómico

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INTRODUCCION Se entiende el conjunto de bandas transversales de tamaño e intensidad de tinción diferentes que aparecen sobre cromosomas determinados según un modelo de distribución que depende del tinte utilizado. Como norma general se admite que el patrón de bandeo es el mismo para cualquier tejido dentro de una misma especie y que no cambie durante el desarrollo. El bandeo cromosómico es, esencialmente, un fenómeno del cromosoma fijado. Aunque las técnicas de bandeo son muy variadas, todas ellas pueden agruparse en seis clases principales. La clasificación inicialmente propuesta por la conferencia de parís, que presupone que en todos los casos hay una fijación con fluidos que contiene acido acético, es la siguiente: Bandas Q, G, C, R, T y feulgen. A estos tipos de bandas habría que añadir las bandas de replicación y las bandas de restricción.

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Objetivos



Conocer los métodos de Bandeos Cromosómicos



Identificar las nomenclaturas y grupos Cromosómicos.



El objetivo de esta ciencia ha sido el estudio de las bases citológicas que pudiesen explicar satisfactoriamente los fenómenos hereditarios.



También para poder saber en que podemos utilizar el método de bandeo y sobre todo que resultados podemos tener de ese método empleado..

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Bandeo Cromosómico

La heterogeneidad de la cromatina, las características químicas de la misma hacen que al aplicar tratamientos diferenciales se resalte uno u otro de los tipos de cromatina existente, lo que en citogenética se conoce como Bandeo cromosómico. El advenimiento de las técnicas de bandeo cromosómico, dotan hoy a la citogenética de una nueva herramienta otorgándole una mayor precisión en la individualización de los cromosomas, facilitando su agrupamiento y clasificación morfológica: la determinación de aberraciones cromosómicas de importante Incidencia en animales con problemas de reducción de la fertilidad: la localización de genes que confluyen al mapeo genético. Los bandeos cromosómicos hacen posible que se tenga un mayor conocimiento acerca de la estructura cromosómica y de los reordenamientos que se producen en las distintas alteraciones tales como: fusiones y fisiones céntricas, translocaciones recíprocas y en tandem; inverciones peri y paracéntricas; delecciones;

duplicaciones;

contricciones

secundarias.;

gapss,

fracturas

cromosómicas, etc. Por otro lado permiten realizar estudios evolutivos de especies relacionadas entre sí.

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Morfología de tres tipos principales de cromosomas humanos.

LOS GRUPOS CROMOSÓMICOS En Citogenética se conocen los términos de coloración selectiva y diferencial cada una de ellas es específica de un tipo de bandas. Las coloraciones selectivas colorean sitios específicos del mismo, se conocen las bandas C y NOR’s; las técnicas de coloraciones diferenciales producen bandas a lo largo de cada uno de los cromosomas de un complemento, en este tipo se encuentran las bandas G y R (Verma y Babu 1989 citado por Henao y Gomez, 1999).

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Los Bandeos Morfológicos: se obtienen basándose en técnicas inherentes a la heterogeneidad de la cromatina. Existe en ellos una relación con proteínas (histónicas y no histónicas) e interacciones ADN. Estos bandeos pueden ser a su vez clasificados en: técnicas de tinción diferencial, métodos de tinción selectiva, coloraciones con fluorocromos específicos aislados o combinados con colorantes no fluorescentes, y tinciones con anticuerpos fluorescentes.

Los Bandeos Dinámicos: Se obtienen basándose en: técnicas que implican la incorporación de una base análoga, bromo-desoxiuridina (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina también bandeo de replicación debido a la relación existente entre el tiempo de incorporación del BrdU y el patrón de replicación. Cuando se incorpora BrdU durante la fase de replicación temprana se obtiene un patrón de bandeo R destacándose las regiones ricas en G-C. Luego de realizada esta técnica, los cromosomas pueden visualizarse utilizando distintos métodos de tinción que emplean colorante tales como el Giemsa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos específicos. Métodos de bandeo cromosómico

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Por otro lado si se incorpora la base análoga durante la fase tardía de replicación se obtiene un patrón de bandas G, destacándose las zonas de predominio de secuencias A-T. Los cromosomas pueden ser visualizados utilizando diferentes métodos de tinción. En relación con la nomenclatura para descubrir los diferentes bandeos cromosómicos, se emplea un código de tres letras: la primera, indica el tipo de bandeo utilizado, la segunda, la técnica de detección empleada y la tercera, el tipo de tinción.

Nomeclatura De Bandeos Morfológicos. QFQ: Bandas Q por fluorescencia usando quinacrina.

GTG: Bandas G por tratamiento enzimático con tripsina utilizando Giemsa.

RFA: Bandas R por fluorescencia usando naranja de acridina.

RHG: Bandas R mediante desnaturalización térmica utilizando Giemsa.

THG: Bandas T por desnaturalización térmica empleando Giemsa.

CBG: Bandas C por hidróxido de bario utilizando Giemsa. Nomeclatura de bandeos dinámicos.

GBG: Bandas G por incorporación de BrdU utilizando Giemsa.

RBA: Bandas R por incorporación de BrdU empleando naranja de acridina.

RBG: Bandas R por incorporación de BrdU utilizando Giemsa.

GB-AAu: Bandas G por incorporación de BrdU empleando anticuerpos específicos unidos a partículas de oro coloidal. Métodos de bandeo cromosómico

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RB-AAu: Bandas R por incorporación de BrdU usando anticuerpos específicos unidos a partículas de oro coloidal.

En todas las disciplinas siempre existen procedimientos de mayor uso que otros, así que en este módulo sólo hablaremos de las más bandas cromosómicasmás utilizadas en el cotidiano del ejercicio de la Citogenética.

Banda C La técnica de Banda C fue descubierta por casualidad y originada en un experimento en donde ADN satélite marcado en ratón fue hibridizado in situ con cromosomas de raton. En este experimento, el ADN del cromosoma fue desnaturalizado con NaOH y renaturalizado en buffer SSC. Los sitios hibridizados fueron detectados por autoradiografía usando coloración de Giemsa para cromosomas. La prueba de hibridización preferencialmente fue en las regiones centromericas de los cromosomas. Sin embargo también se noto que el Giemsa coloreo otras regiones en otros cromosomas (Fukui y Nakayama, 1996) Esta banda se caracteriza por teñir aquellas regiones ricas en heterocromatina constitutiva que corresponden a secuencias de ADN altamente repetitivas; se encuentran principalmente en centrómero, telómeros y ADN satélite y en ocasiones constricciones secundarias como son los NOR’s. Después del descubrimiento de las técnicas de banda C se desarrolladas técnicas para cromosomas de mamíferos. Mientras en animales se utiliza NaOH para el paso de la desnaturalización, el Ba(OH)2 es usado para producir banda C en cromosomas de plantas siguiendo el método de Summer. Él fue el primero en sugerir que la coloración oscura del Giemsa coloreaba heterocromatina constitutiva causada por la preferencia del ADN altamente repetitivo durante la renaturalización Los sitios de los cromosomas que presentan heterocromatina constitutiva y que tiñen Banda C positiva son 1) en la región del centrómero 2) alrededor de la región organizadora nucleolar 3) cerca del sitio del RNA para 5S y 4) en la parte final de los cromosomas es decir la heterocromatina telomerica, en general estas Métodos de bandeo cromosómico

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localizaciones se conocen como centromerica e intercalar y la última categoría incluye todas las otras posiciones (Yunis y Yasmineh, 1972 citado por Maclean y Vaughan, 1978). En el campo de la investigación para aclarar qué tipo de elementos son los que se remueven dentro del tratamiento de esta banda, en un estudio en donde se analizó HCl 0.2 N el cual es una de las soluciones utilizadas para realizar tratamiento para banda C se encontró por medio de electroforesis la presencia de las 5 proteínas histónicas, la que presentaba una banda de mayor intensidad fue la H3 y H4, estando presentes también las otras pero en menor cantidad (Burkhoder&Duezek, 1980). Para cromosomas de plantas, la estandarización de las técnicas en Banda C han mejorado en su resolución y el método ha sido utilizado para la identificación de cromosomas. En plantas esta técnica identifica las secuencias que contienen gran cantidad de ADN repetitivo. Por ejemplo en cultivos de centeno Secalecerealeen hibridizaciónin situ es utilizada para detectar zonas de ADN altamente repetitivode las cuales solamente unas pocas colorean Banda C positiva (Fukui y Nakayama, 1996). Por su parte, en muchas especies de animales domésticos se han encontrado complementos cromosómicos que por las técnicas convencionales de coloración no pueden ser ordenados completamente, debido a la presencia de cromosomas con rasgos morfológicos muy similares. Esto sucede, por ejemplo: con los cromosomas 8, 9 y X del cerdo; con el 11 y el 12 de la misma especie; con los cromosomas 14, 15, 16, 17, 18 y 19 del equino; con los cromosomas 23, 24, 25, 26 y 27 también del equino; y con gran parte de los cromosomas del bovino, del ovino y del caprino. Lo anterior generó la necesidad de desarrollar técnicas de coloración denominadas de bandeo, o sea, aquellas que producen patrones constantes de bandas claras y oscuras, característicos de cada cromosoma que permiten identificar los cromosomas sin ambigüedades (Henao y Gómez, 1997).

Las técnicas de bandeo han permitido tanto en animales como en vegetales, también, la detección de un gran número de aberraciones cromosómicas, con la Métodos de bandeo cromosómico

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correspondiente definición de los componentes del complemento comprometidos en el problema.

Bandas Ag-NOR Se conoce como bandas Ag-NOR aquella que colorea las Regiones Organizadoras Nucleares ( de ahí la nomenclatura NOR) en ocasiones son también llamadas Banda N, su coloración es debido a la afinidad con el Nitrato de Plata. La Región Organizadora Nucleolar es el sitio en donde están localizados los genes de ADNr; el nucleoloesta compuesto por cinco componentes estructurales, el centro fibrilar, el componente fibrilar, el componente granular, el intersticio nucleolar, y la cromatina condensada asociada. (Goessens, 1984) En eucariotas el organizador nucleolar consiste de múltiples repeticiones arregladas en tandem, de las secuencias para ARN-r 18S y 28S intercalado con secuencias espaciadoras. Los espacios pueden ser transcritos, pero su transcripción nunca incluye un ribosoma maduro. Usualmente se refiere a ADN ribosomal (ADN-r) como una repetición de genes con secciones en tamdem arregladas y agrupadas dentro de uno o varias regiones del set de cromosomas (Champman y may, 1993) Este tipo de banda se debe específicamente a la presencia de las proteínas afines a la actividad transcripcional en los cistronesribosomales (Henao y Gómez, 1997).Durante la metafase estos están localizados generalmente dentro de laconstricción secundaria (Howell 1982) Citado por (Fakan y Hernández-Verdun, 1986). El comportamiento del nucleolo en proliferación celular es llamado ciclo nucleolar, se considera que el ciclo comienza en el momento en que en interfase este o no la decisión de entrar en proliferación o diferenciación, se considera que el ciclo comienza cuando el nucleolo se organiza nuevamente seguido de las fases de la mitosis, es decir el nucleolo no es una entidad nuclear individual (De la Torre y Jiménez-Martín, 1982) .

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Ante todo y de gran importancia es de anotar que esta banda es funcional, es decir, es positiva siempre y cuando las Regiones Organizadoras Nucleolares hayan estado en actividad la interfase inmediatamente anterior al momento de realizar la banda, es decir la banda se expresa en las metafases obtenidas cuando los genes de ADNr hayan sido transcritos.

Un análisis morfo-funcional de las Regiones Organizadoras Nucleolares teniendo en cuenta los ciclos circadianos demostró la relación directa de los centro fibrilares ( uno de los componentes del NOR) con la actividad nucleolar. (Fakan y Hernández-Verdun, 1986 . En un estudio sobre proteínas asociadas con los NOR’s se estableció que estas son no histonicas y son “argyrophilic” Las proteinas NOR están estrictamente localizadas dentro del centro fibrilar y el componente fibrilar denso del nucleolointerfasico (Fakan y Hernández-Verdun, 1986). En general, el nucleolo crece durante la interfase, algunas veces el volumen es proporcional al incremento tanto de el componente fibrilar y el granular, pero en mayor proporción de la acumulación del componente granular. La talla final del nucleolo maduro en el ciclo celular aparentemente no es una función estrictamente lineal del numero de genes ribosomales que el NOR posee (De la Torre y JiménezMartín, 1982). Son varias las aplicaciones de las bandas NOR entre otras se tiene que: (tomado de Camacho, 1999) “con la banda NOR se puede establecer el grado de variabilidad de los patrones inter e intra específicos entre especies y/o poblaciones, pues tanto los cromosomas portadores de NOR como la posición en el cromosoma son usualmente diversos entre especies (Disney y Wright, 1987; Takai y Ojima, 1986 citado por Oberdorff et al, 1990). La diferencia en talla entre NORs homólogos ha sido descrita en varias especies de vertebrados (Miller et al., 1977; Ruiz el al., 1981; Galetti et al., 1984 citados por Sanchez et al., 1990). Esta variación interespecífica ha sido utilizada para probar hipótesis filogenéticas e inferir otras, antes basadas principalmente en datos morfológicos (Amemiya yGold, 1990); parece ser que las alteraciones en los NOR ocurren normalmente Métodos de bandeo cromosómico

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con relación a la diferenciación y evolución de las especies (Oberdorff et al, 1990). La variación intraespecífica puede ser usada para averiguar el origen maternal y paternal de los cromosomas en un individuo (Mellink et al, 1994) constituyéndose la actividad del NOR como una propiedad heredable cuyo tipo de transmisión puede ser mendeliana (Jotterand y Van Melle, 1981); además los NOR activos muestran variación de generación en generación mientras los inactivos no (Zakharov et al, 1982 citado por Mellink et al, 1994)”.

En plantas se encontró también que el método servia no solo para localizar Regiones Organizadoras Nucleolares sino para identificar cromosomas en cereales, además de encontrar una relación entre bandas C y Namda N lo cual fue clarificado por Schlegel y Gill. También se realizo técnicas de una banda N secuencial con hibridación in situ para identificar cromosomas con las la posición especifica de ADN, la metafase primero es identificada en sus patrones de bandas y después se destina para hibridizaciónin situ así se puede recurrir a la misma célula en metafase, de esta manera se permite una asignación directa de los sitios de hibridización con cromosomas individuales (Fukui y Nakayama, 1996).

Bandas GTG Las bandas G deben su nombre al hecho de que en todas sus modalidades se emplea Giemsa para colorear los cromosomas. Esta técnica que, en términos generales, es la más usada en mamíferos, por permitir excelentes preparaciones permanentes sin requerir el uso de microscopio de fluorescencia, se basa en un tratamiento que altera la estructura de las proteínas cromosómicas seguido de una coloración. El método de denaturación térmica descrito por Sumner et al. (1971), es conocido como ASG (Acid-Saline-Giemsa) y se constituye en la primera técnica de bandas G conocida. En esta modalidad se logra la denaturación proteica mediante un tratamiento con 2XSSC (Solución Salina Citratada) caliente. Sin embargo, el método más usado en la actualidad es el conocido con el nombre de bandas GTC (bandas G por Tripsina usando Giemsa Métodos de bandeo cromosómico

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como colorante); fue introducido por Seabright en 1971, y como su nombre lo indica, se basa en una digestión enzimática con Tripsina. Se asume que el mecanismo por el cual se produce el patrón de bandeo G es porque el colorante interactua con las proteínas de cromosoma, al parecer ricas en grupos disulfuro en las bandas positivas (oscuras), y en grupos sulfhidrilo en las negativas (claras) (Verma y Babu, 1989). Se acepta, además, que la extracción

diferencial

de

proteínas

ocurrida

durante

la

fijación

y

los

tratamientosde denaturación, juega un papel muy importante en la obtención de estas bandas. Rooney y Czepulkowski (1987), consideran que las bandas G oscuras corresponden con las cromómeras del paquiteno, que se presentan en segmentos de DNA de replicación tardía, con alto contenido de Adenina y Timina, y con relativamente pocos genes activos (Henao y Gómez, 1999).

La banda G ha sido reportada en muchos grupos animales pero por ejemplo en varias especies de peces esta banda no resulta positiva pues al parecer muchos de ellos no poseen compartamentalizadión del ADN en isocoros quienes serian los responsables del bandeamiento. su parte en plantas los reportes son pocos, e inclusive su existencia se ha puesto en duda. Sin embargo en un análisis de centeno, S. cerealeal construir el cariograma después de tratamiento de banda G, se identificaron los cromosomas homólogos por los patrones de tipo de bandas oscuras y claras, se estableció diferencias con los patrones obtenidos en banda C, mientras banda C positiva produce grandes bandas telomericas y algunas intersticiales Banda G produce más intersticiales que banda C negativa. Aunque los resultados obtenidos son prometedores en este caso se hace necesario mejorar antes las técnicas antes de utilizarlas en la identificación de cromosomas en plantas (Fukui y Nakayama, 1996)

Bandas RHG:

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Este patrón de bandas es, en términos generales, el inverso (reverse) de las bandas G, o sea, las bandas G-positivas son R-negativas, y las G-negativas son R-positivas; se les denomina bandas RHG para significar que son bandas reversas obtenidas por calor usando Giemsa como colorante. La técnica original se basa en una denaturación térmica selectiva en buffers de diversa naturaleza, seguida por una coloración de cromosomas con Giemsa (Dutrillaux y Lejeune, 1971). Respecto al mecanismo de producción de este patrón de bandeo, se asume que depende de la denaturacióm selectiva que produce el calor en ciertas zonas del cromosoma, al parecer asociadas con segmentos de DNA ricos en Adenina-Timina; en este caso las bandas oscuras son las zonas ricas en Guanina-Citocina, o sea, las que resisten el calor. Verma y Babu (1989) describen el siguiente protocolo para estas bandas: (Henao y Gómez,1999).

Entre las múltiples técnicas de coloración diferencial conocidas hoy, es preciso resaltar la importancia de las bandas G y de las bandas R en la definición de los cariotipos de la mayoría de los animales de importancia zootécnica. Entre las técnicas selectivas, las de mayor importancia son las bandas C y las bandas NOR,por su aporte tanto a la identificación cromosómica como a los estudios de heteromorfismos.

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ALGUNAS ABREVIATURAS DE LA NOMENCLATURA CROMOSÓMICA

Ideograma del cromosoma 14 a distintos niveles de resolución (400, 550 y 850 bandas) ilustrando la nomenclatura de París de brazo, región, banda, subbanda y subsubbanda. Tomado de la revista Human Pathology, V 12, 6:495 (1981). W. B. Saunders Company. (modificado)

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Para designar una banda en particular se acordó poner primero el número del cromosoma seguido del símbolo del brazo, el número de la región, el número de la banda, subbanda, etc., todo seguido y sin dejar espacios. Ejemplo, 14q32.3 es la designación para la subbanda 3, de la banda 2, de la región 3, del brazo largo del cromosoma 14. Al leerlo de corrido, los números que corresponden a región, banda y subbanda deben decirse separadamente y no como decenas. Las bandas permiten también el mapeo de genes en el cromosoma, es decir la designación del locus (pl. loci). Muchos rearreglos cromosómicos han permitido la identificación de genes debido a los efectos fenotípicos de la disrupción de estos.

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INTERPRETACIÓN DE LA NOMENCLATURA DE BANDAS CROMOSÓMICAS.

Observación: 7q31.2 es el locus el gen de la Fibrosis Quística. Cuando de describe la composición cromosómica, o cariotipo, de un individuo además del número total de cromosomas y el par sexual se puede también indicar ganancia o pérdida de un cromosoma poniendo +13 o -16 y se interpreta como la presencia de un cromosoma 13 extra o la ausencia de un cromosoma 16 respectivamente, o lo que es lo mismo una trisomía 13 o una monosomía 16. Cuando ocurre una translocación recíproca entre dos cromosomas se pone t(8;14)(q24;q32) que indica que los cromosomas involucrados son el 8 y el 14 y los puntos de ruptura están en 8q24 y 14q32. Cuando hay aumento del bloque de heterocromatina en los cromosomas que normalmente lo contienen se usa colocar h+ junto al brazo del ese cromosoma, por ejemplo 9qh+, y se interpreta un polimorfismo ya que esta es una variación frecuente en la población normal.  Ejemplos del uso de la nomeclatura en algunas anomalías cromosómicas: a- 47,XX,+21: trisomía 21 en una mujer ( síndrome de Down). b- 47,XY,+18: trisomía 18 en un varón (síndrome de Edwards). c- 45,X:monosomía del X (síndrome de Turner) d- 47,XXY: trisomía de cromosomas sexuales (síndrome de Klinefelter)

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CONCLUSIONES



Se Conoció los diferentes métodos de Bandeo Cromosómico



Se identificación y reconocieron los diferentes tipos de nomenclatura y los grupos cromosómicos.



Pudimos identificar gracias a la ciencia de bases citológicos a los fenómenos hereditarios en los cromosomas .



Logramos saber que los métodos de bandeo cromosómico son importantes en lo que es citogenética .

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REFERENCIAS BIBLIGRAFICAS



Elsevier-

España-

Emery, elementos de genética médica.

Amazon.com. Pag. 33 

Juan ramón Lacadena- - citogenética. Editorial complutense. Pag 80 – 85



(http://www.geocities.com/ResearchTriangle/Lab/2513/bandeos.htm

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